CN110354155A - 一种赶黄草中黄酮类物质的提取方法 - Google Patents

一种赶黄草中黄酮类物质的提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种赶黄草中黄酮类物质的提取方法,该方法包括：1)将赶黄草粉碎成40目以上的细粉；2)将细粉在60℃‑80℃的环境下干燥4‑6小时；3)加入甲醇溶液，加入纳米金属材料，施加微波，混均后用回流装置在60℃‑80℃提取温度下水浴浸提1.5h，取出减压过滤得到滤液；4)称取预处理后的聚酰胺树脂和大孔树脂，加入步骤3的滤液，置于振荡器，在30℃下振荡12h，用溶剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩蒸干，得到提取物。

Description

一种赶黄草中黄酮类物质的提取方法
技术领域
本发明涉及赶黄草有效成份提取领域，具体是一种赶黄草中黄酮类物质的提取方法。
背景技术
赶黄草，也被称作扯根菜、水杨柳(四川)、水泽兰(贵州)，是虎耳草科扯根菜亚科扯根菜属植物的一种，为多年生草本植物。最早记载在明代《救荒本草》，现今《中药大辞典》、《全国中草药汇编》、《四川中药志》、《湖南药物志》、《内蒙古植物药志》均有记载。赶黄草生长地方较多，国内主要有云贵川、两广地区、河北、甘肃、湖南以及江西等；国外主要分布在韩国、日本、蒙古、俄罗斯、泰国、越南等，其中又以四川省古蔺县海拔1000m以上为集中地域，是赶黄草的道地产区。嫩苗能作为蔬菜食用，通常以整株为药用部位，性温、味甜、无毒，具备除热疗毒、祛除瘀血、利水退肿、去酶健脾、消黄平肝的作用，可用于经闭、水肿、血崩、跌打损伤的治疗。它是肝苏相关产品、赶黄草饮片、赶黄草茶等的主要原料，应用价值极大。
赶黄草含有丰富的黄酮类物质，溶剂提取法是获得黄酮类成分的常用方式。根据所需黄酮成分酸性强弱的差异，可以选用碱提取酸沉淀法；按照化合物极性的差别，使用水或者适当的有机溶剂完成提取。随着现代科技的进步，发展起来其他高效提取手段如超声波辅助提取、超临界流体萃取、酶解法、微波提取法等[50]。这就需要考虑提取效率、生产成本、工艺流程、产品纯度等问题并结合实际情况来选取适合的提取方法。
赶黄草总黄酮常用的提取方法有水浴浸提和超声浸提法，采用单因素实验、正交设计或者响应面法进行最后的优化。汪洪武等和曹桦等都运用正交设计实验，比较了水浴浸提和超声浸提两种方法，虽然得到的最优条件有所不同，但都得到超声浸提法要优于水浴浸提法的结论，这与超声波能破坏植物细胞、提高有效成分的溶出率有关。而邓锷等结合使用这两种方法，先将样品用超声波预处理，然后通过单因素和4因素3水平的正交实验确定了最佳提取工艺。徐秀泉等则采用响应面法优化赶黄草总黄酮的超声提取过程，建立的最优提取工艺是加入26倍原料的60％乙醇在50℃下提取20min。现有的水浴浸提还是无法达到较好的提取率。
同时，经过上述处理方法获得的提取液依旧含有许多杂质，要想得到有效部位或单体成分，还需继续精制纯化。常用的方法有液液萃取法、色谱法(层析法)、透析法、高速逆流色谱分离技术等。
色谱法是目前天然产物分离纯化过程中使用率较高的方式。色谱法有很多种，依据分离原理有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱；依据分离材料有氧化铝色谱、硅胶色谱、聚酰胺色谱、大孔树脂色谱等；依据使用方式有纸色谱(PC)、柱色谱(CC)和薄层色谱(TLC)；依据移动相种类有气相色谱(GC)和液相色谱(LC)。其中，分离效果好、可再生、选择性好、操作简便的聚酰胺色谱[65]和大孔树脂色谱[66]在黄酮类化合物的精制纯化中应用广泛。
发明内容
本发明的目的在于：针对上述存在的问题，公开了一种赶黄草中黄酮类物质的提取方法,其特征在于，该方法包括：
1)将赶黄草粉碎成40目以上的细粉；
2)将细粉在60℃-80℃的环境下干燥4-6小时；
3)加入甲醇溶液，加入纳米金属材料，搅拌，使得纳米金属悬浮在甲醇溶液当中，形成悬浮液，同时施加微波，混均后用回流装置在60℃-80℃提取温度下水浴浸提1.5h，取出减压微滤后得到滤液；
4)称取预处理后的聚酰胺树脂和大孔树脂，加入步骤3的滤液，置于振荡器，在30℃下振荡12h，用溶剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩蒸干，得到提取物。
其中施加微波一方面能够使得纳米金属碰撞植物细胞，使得溶解的更加充分，另一方面微波辐射会导致溶液温度过高，纳米金属能够在一定程度提高散热效果，防止溶液温度过高。在一些情况下，纳米铜能够改变溶剂对有效成份的提取性能，进一步的提高提取效果。相对于没有加纳米金属和微波辅助的情况下，本发明可将黄酮类物质的有效成份提取率提高20％以上。
在一些优选的实施例当中，所述的纳米金属为纳米铜，所述的纳米金属的粒径为20-100nm。
在一些优选的实施例当中，步骤3中的提取温度为70℃，甲醇溶液为75％甲醇、料液比为1:20。
在一些优选的实施例当中，所述的大孔树脂为HPD600、HPD826、HPD450、NKA-9的一种。
在一些优选的实施例当中，所述步骤4的预处理为：取一定量聚酰胺树脂和10种大孔树脂，加入无水乙醇，浸泡过夜，使其彻底溶胀，搅拌或超声除去气泡装柱，装柱时向柱内逐渐倾入树脂悬浮液，开启阀门让溶剂慢慢流下，过程中持续轻轻敲击柱壁，让树脂自由沉降和混合，确保吸附剂均匀平整和柱体无气泡，先用无水乙醇洗脱直到流出液滴入水中不出现浑浊，再以蒸馏水洗至无醇味，接着依次以5％NaOH溶液、蒸馏水和5％盐酸溶液冲洗，除去小分子杂质，最后蒸馏水洗脱至中性。
在一些优选的实施例当中，步骤4的上样量为10mL。
在一些优选的实施例当中，所述的步骤4的洗脱溶剂为80％的甲醇。
在一些优选的实施例当中，所述的步骤4的洗脱流速为6mL/min，柱体积为20mL。
在一些优选的实施例当中，所述的步骤4的洗脱PH为6-7。
在一些优选的实施例当中，微波频率为400-1000MHz，功率为200-1200w。
附图说明
图1为芦丁标准曲线；
图2为提取时间对提取效果的影响；
图3为溶剂浓度对提取效果的影响；
图4为提取温度对提取效果的影响；
图5为料液比对提取效果的影响；
图6上样量对吸附效果的影响；
图7水洗体积对解吸效果的影响；
图8洗脱溶剂用量对解吸效果的影响。
具体实施方式
一、赶黄草提取工艺
1材料
赶黄草(全草、茎、叶、花，产地四川省泸州市古蔺县)；
蒸馏水；
氢氧化钠(NaOH，分析纯，成都科龙化工试剂厂)；
亚硝酸钠(NaNO2，分析纯，成都科龙化工试剂厂)；
硝酸铝(Al(NO3)3，分析纯，成都科龙化工试剂厂)；
甲醇(工业级，成都科龙化工试剂厂)；
芦丁(HPLC＞98％，成都植标化纯生物有限公司)；
纳米铜粉(平均粒径80nm、纯度99.9％，比表面积14.5，体积密度0.25g/cm3，密度8.9g/cm3，宁波金雷纳米材料科技有限公司)
2制备方法
2.1溶液的配制
将60℃恒温干燥4小时的赶黄草粉碎成细粉(40目)，精确称取1.0g于50mL三角瓶中，加入20mL50％甲醇溶液，加入纳米铜粉，其中纳米铜粉和赶黄草粉碎成细粉的质量比为1:50，并施加微波，微波频率为1000MHz，功率为1200w，在微波作用下，纳米铜粉能够产生一定振动，进而对赶黄草颗粒施加微观振动，使得其有效成份能够充分的溶解在溶剂当中，混匀后用回流装置在60℃下水浴浸提1.5h，取出经减压过滤得到滤液。将滤液全部转入25mL容量瓶，加50％甲醇溶液定容至刻度，即得到溶液。
2.2方法学考察
2.2.1标准曲线的绘制
精密称取干燥芦丁20mg，用50％甲醇充分溶解，并于100mL容量瓶中准确定容至刻度线，得到对照品原液。依次精确吸取芦丁原液1、2、3、4、5mL加入25mL容量瓶，用蒸馏水补充至6mL，再加入1mL5％NaNO2溶液，摇匀静置6min；然后加入1mL 10％Al(NO3)3溶液，摇匀静置6min；加入10mL4％NaOH溶液，再用蒸馏水补足到刻度线，充分混匀后静置15min。以未加芦丁原液的混合试剂作空白对照调零，控制波长510nm测定吸光值。最后以芦丁浓度(mg/mL)为横坐标、吸光值(A)为纵坐标，经excel线性拟合，得到标准曲线。
2.2.2精密度试验
精确吸取2mL芦丁原液至25mL容量瓶中，参照2.2.1项重复检测5次吸光值，计算相对标准偏差(RSD)。
2.2.3稳定性试验
精确吸取3mL芦丁原液至25mL容量瓶中，按2.2.1项下操作反应，不同放置时间下测定各自的吸光值，计算RSD值。
2.2.4重复性试验
按2.1项下，使用批次相同的赶黄草药材平行制备5份样品溶液。各精确吸取每份样品0.5mL至25mL容量瓶中，按2.2.1项下测定各样品溶液的吸光值，求出RSD值。
2.2.5加样回收率试验
取含量已知的5份赶黄草药材，按2.1项处理方式得到样品溶液。按照0.5mL样品溶液中加入2mL芦丁原液，依据2.2.1反应测得各吸光值，计算加样回收率和RSD值。
2.2.6样品总黄酮含量的测定
取0.5mL样品溶液转移到25mL容量瓶中，按2.2.1项操作测得吸光值。参照如下公式求出样品中的总黄酮含量：
式中n为稀释倍数，C为待测液中黄酮浓度(mg/mL)，m为赶黄草药材质量(g)。
2.3单因素实验
2.3.1提取时间的考察
称取经粉碎的赶黄草样品(40目)1.0g，加入20mL50％的甲醇溶液，在60℃水浴条件下，分别提取0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，取出后抽滤，用甲醇将续滤液体积确定为25mL。取0.5mL加入25mL容量瓶中测定黄酮含量。
2.3.2溶剂浓度的考察
称取经粉碎的赶黄草样品(40目)1.0g，各自用20mL0％(水)、40％、50％、60％、70％、80％的甲醇溶液，在60℃水浴条件下，提取2h后，取出抽滤，滤液用甲醇准确补充至25mL。取0.5mL转移到25mL容量瓶中测定黄酮含量。
2.3.3提取温度的考察
称取经粉碎的赶黄草样品(40目)1.0g，加入20mL70％的甲醇溶液，在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的不同水浴条件下，提取2h，取出后抽滤，滤液用甲醇补足至25mL。取0.5mL转移到25mL容量瓶中测定黄酮含量。
2.3.4料液比的考察
称取经粉碎的赶黄草样品(40目)1.0g，分别加入5mL、10mL、15mL、20mL、25mL70％的甲醇溶液，控制70℃的水浴温度，分别提取2h，取出后抽滤，滤液用甲醇定容至25mL。取0.5mL转入25mL容量瓶中测定黄酮含量。
2.4正交试验设计
为了全面探究水浴温度、提取时间与次数、料液比和溶剂浓度这4个条件对提取过程和效果的影响，根据单因素实验结果，将测得黄酮含量作为比较依据，运用四因素三水平正交表继续考察，因素水平设置见表1。
表1因素水平表
2.5提取工艺验证
根据最佳参数组合，重复验证所选的实验参数，检验工艺的稳定性，最终得到最佳提取工艺过程。
3实验结果与分析
3.1方法学考察
3.1.1标准曲线的绘制
结合芦丁不同浓度和测得的对应吸光值，利用excel制作标准曲线如图1，得到的回归方程中R2＝0.9992，表明芦丁标准曲线拟合度较好，线性关系稳定。
3.1.2精密度试验
样品5次测得数据见表2，RSD为0.78％，提示该方法精密度良好。
表2精密度试验结果
3.1.3稳定性试验
样品放置不同时间吸光度检测数值如表3所示，RSD为1.25％，表明样品溶液在60min内无明显变化。
表3稳定性试验结果
3.1.4重复性试验
5份样品重复性试验结果见表4，显示RSD值为0.82％，说明该法具有较好的重复性。
表4重复性试验结果
3.1.5加样回收率试验
加样回收试验结果如下表所示，据此得到加样回收率平均水平在98.48％，RSD值是2.10％(小于3％)，表明该过程采用的方法可行性较好，符合检测需要。
表5芦丁加样回收率试验结果
3.1.6样品总黄酮含量的测定
表6中记录了赶黄草不同部位总黄酮的含量检测情况。比较可知，赶黄草四个部位总黄酮含量的高低顺序是花、叶、全草、茎，证明了花和叶的重要价值，采收过程应减少它们的损失，这也有助于对赶黄草资源的充分合理利用。
表6赶黄草不同部位总黄酮含量测定结果
上述过程
3.2单因素实验
3.2.1提取时间
由图2中清楚看到，伴随提取时间的延长，总黄酮提取率持续升高，但时间超出2h，浸提液得到的总黄酮却有所减少，这大概是因为时间过长引起杂质增多。因此，将提取时间定在2h即可。
3.2.2溶剂浓度
水适合应用在亲水性黄酮类物质的提取，且用作浸提液时成本低，但使用效率低，提取液含较多杂质，后期浓缩、精制纯化难度较大，因而使用不多。由图3可见，水的提取率最低，在0-70％范围内，总黄酮提取率与甲醇浓度呈正相关，随后则相反，这是由于增大甲醇比例使其他小极性物质大量溶出影响了黄酮的测定。故选择甲醇浓度为70％。
3.2.3提取温度
一般情况下，温度升高能够加快分子运动、渗透、扩散、溶解速度，促进有效成分从植物细胞到溶剂体系的转移。因此提取过程中辅以适当温度条件能够高效提取总黄酮。但是温度过高，可能会发生副反应，破坏黄酮物质结构以及促进杂质的溶出，影响目标组分的提取效果。70℃、80℃提取时观察到提取液明显的沸腾现象，经回流继续完成提取。综合考虑并结合图4结果，选取70℃的提取温度。
3.2.4料液比
不同料液比的提取液总黄酮含量测定结果如图5。当料液比为1∶5时，溶剂刚好浸湿赶黄草药材，完全不利于总黄酮的提取和后期结果的测定；在料液比1∶20的情况下，总黄酮含量几乎达到最高，接着增大溶剂用量也并未显著提高总黄酮含量，说明绝大多数黄酮成分都已溶出。最后，考虑到提取效果、溶剂用量、后期浓缩难度等问题，确定了1∶20的料液比。
3.3正交试验优化结果
表7正交试验结果
根据上表结果确定RA＞RD＞RB＞RC，即各工艺参数影响提取效果的主次顺序是提取温度＞溶剂浓度＞提取时间与次数＞料液比。考察指标总黄酮提取率越高越好，所以应该选择各个因素K1、K2、K3中值最大时对应的因素水平，得到操作工艺的优化组合为A2B2C2D3，即选用75％甲醇、按1:20的料液比、在70℃条件下提取2次(第1次2h，第2次1h)。
3.4提取工艺验证结果
以正交设计结果得到的最佳参数组合A2B2C2D3实验验证，结果见表8。重复三次结果显示，各次总黄酮提取率都高于正交表中的数据，且RSD值小于3％，确定了该工艺的优越性、稳定性和可行性。
表8验证试验结果
二、精制工艺
1实验材料
赶黄草(全草，产地四川省泸州市古蔺县)；
蒸馏水(实验室自制)；
氢氧化钠(NaOH，分析纯，成都科龙化工试剂厂)；
亚硝酸钠(NaNO2，分析纯，成都科龙化工试剂厂)；
硝酸铝(Al(NO3)3，分析纯，成都科龙化工试剂厂)；
盐酸(分析纯，成都科龙化工试剂厂)；
甲醇、无水乙醇(工业级，成都科龙化工试剂厂)；
大孔树脂(HPD600、HPD450、HPD5000、HPD826、HPD722、D101、AB-8、NKA-9、X-5、ADS-17，沧州宝恩吸附材料科技有限公司)；
聚酰胺树脂(30-60目，江苏长丰化工有限公司)；
芦丁(HPLC＞98％，成都植标化纯生物有限公司)。
2实验方法
2.1树脂的预处理及装柱
树脂中通常含有生产过程中的化学杂质，使用前需要预处理，否则会影响树脂的吸附效果。取一定量聚酰胺树脂和10种大孔树脂，加入无水乙醇，浸泡过夜，使其彻底溶胀。搅拌或超声除去气泡装柱，装柱时向柱内逐渐倾入树脂悬浮液，开启阀门让溶剂慢慢流下，过程中持续轻轻敲击柱壁，让树脂自由沉降和混合，确保吸附剂均匀平整和柱体无气泡。先用无水乙醇洗脱直到流出液滴入水中不出现浑浊，再以蒸馏水洗至无醇味。接着依次以5％NaOH溶液、蒸馏水和5％盐酸溶液冲洗，除去小分子杂质，最后蒸馏水洗脱至中性，备用。
2.2样品总黄酮含量的测定
2.2.1液体样品测定
准确量取一定量的液体样品转入25mL容量瓶，按第二章2.2.1项反应，测得吸光值，外标法求出液体样品的总黄酮浓度。
2.2.2固体样品测定
称取约0.15g固体样品至100mL容量瓶中，加入甲醇溶解至刻度线，摇匀。取1mL溶解液转移至25mL容量瓶中，按上述2.2.1项反应，外标法求出溶解液的总黄酮浓度。按照如下公式计算固体样品中总黄酮含量：
式中n为稀释倍数，C为待测液总黄酮浓度(mg/mL)，m为固体样品质量(g)。
2.3上样液的制备
称取一定量粉碎后的赶黄草药材(40目)置于锥形瓶中，按照上述得到的最佳条件(提取温度70℃、75％甲醇、料液比1:20、提取2次(第1次2h，第2次1h))提取。将过滤后的提取液旋转蒸发至无醇味制得上样液。测得上样液的总黄酮浓度，备用。
2.4精制树脂的筛选
2.4.1静态吸附及解吸实验
精确称取预处理后的聚酰胺树脂和10种大孔树脂各1.5g，向每份吸附材料加入12mL上样液，置于振荡器，30℃振荡12h。实验完成后，过滤各树脂溶液，分别吸取0.5mL滤液按2.2.1项测定总黄酮浓度，计算吸附率。向吸附实验后的上述各树脂中分别加入12mL80％甲醇溶液，30℃振荡12h。解吸结束后过滤，取各滤液0.5mL参照2.2.1项检测吸光值，测定总黄酮浓度，计算解吸率。其中吸附率和解吸率的计算公式如下：
式中C0代表上样液总黄酮浓度(mg/mL)，C1代表树脂吸附后溶液总黄酮浓度(mg/mL)C2代表解吸液总黄酮浓度(mg/mL)。
2.4.2动态洗脱实验
根据树脂的静态吸附与解吸实验，优选有研究意义的树脂进行动态洗脱实验的小试，分析检测其洗脱情况。分别称取适量处理好的聚酰胺、NKA-9、ADS-17、HPD450、HPD826、HPD600，湿法装柱(直径2cm，1BV＝20mL)，柱体经蒸馏水洗涤平衡。量取10mL上样液直接上样，然后先后用水、80％甲醇溶液各洗脱200mL，计算比较解吸液蒸干后得到的固体总黄酮含量及总黄酮收率。
2.5工艺参数优化实验
通过对各树脂性能的一系列考察，确定将HPD450型大孔树脂用于赶黄草总黄酮的分离过程。为了优化精制纯化效果，利用单因素实验考察各工艺参数，确定各参数最佳组合并重复实验进行验证。实验过程中将HPD450型大孔树脂按2.1方法装柱，柱体积为20mL。
2.5.1上样量
让树脂柱中柱面以上的平衡液流出至柱面，关闭阀门；量取不同体积的上样液轻轻加入柱体表面，使上样液均匀覆盖柱面；调节阀门，使上样液体以较小流速渗入柱体并流出。各取1mL流出液按2.2.1项完成总黄酮浓度的定量检测。
2.5.2水洗体积
为了将树脂柱中残留的样品冲洗干净并且去除部分水溶性杂质，首先用一定量的水并控制流速在4mL/min进行洗脱。根据柱体积收集流出液，依次各取1mL流出液按2.2.1项测定总黄酮浓度。
2.5.3洗脱溶剂
水洗完成后，分别用200mL20％、40％、60％、80％、100％甲醇溶液以4mL/min的速度解吸。收集各浓度洗脱液浓缩蒸干，按2.2.2项测定所得固体总黄酮含量，并计算总黄酮收率。
2.5.4洗脱溶剂用量
将吸附完成的树脂柱用80％的甲醇洗脱液以4mL/min的速度洗脱，根据柱体积收集解吸液。参照2.2.1项测定不同柱体积的各洗脱液中总黄酮浓度。
2.5.5洗脱流速
保持其他工艺参数相同的条件下，分别以不同的流速进行洗脱。收集各洗脱液浓缩蒸干，按2.2.2项测定所得固体总黄酮含量，并求出总黄酮收率。
2.5.6洗脱pH
用5％NaOH溶液和5％盐酸溶液调节洗脱溶剂的pH值，控制其他工艺参数不变，进行实验。最后收集各解吸液浓缩蒸干，按2.2.2项分析检测所得固体总黄酮含量，并计算总黄酮收率。
2.6精制工艺验证
根据各工艺参数优化结果，组合所选各工艺参数进行验证实验，平行实验3次，确定最佳精制工艺。
3结果与分析
3.1精制树脂的选择
3.1.1静态吸附及解吸实验
在筛选树脂的类型时，一般先根据静态吸附-解吸考察结果，初步判断各树脂针对赶黄草总黄酮的吸附情况，其测得数据如下表9所示(上样液总黄酮浓度26.86mg/mL)：
表9树脂的吸附性能与解吸性能研究
各类型树脂的极性、比表面积、孔径是特定的，因而对分离物质表现出相应的吸附能力、吸附量和吸附选择性，解吸的难易程度也有所差别。由结果可知，HPD600、HPD450、HPD826、NKA-9、ADS-17和聚酰胺树脂对赶黄草总黄酮的吸附率和解吸率相对较高，这可能是由于赶黄草黄酮中含有大量酚羟基和糖苷键结构，表现为较强的极性和亲水性，容易与这些树脂以氢键形成结合而被吸附，选用一定的解吸液也能将其很好地洗脱下来。比较之下，另外的弱极性、非极性树脂对赶黄草总黄酮吸附量则偏小。因此接下来的动态洗脱考察就围绕这6种树脂展开。
3.1.2动态洗脱实验
树脂精制分离过程是一个动态体系，所以仅仅依靠静态吸附-解吸实验就判断其对赶黄草总黄酮的吸附、解吸性能比较片面，有必要采用动态洗脱实验以便全面评估树脂性能。针对初筛得到的6种树脂作进一步动态洗脱过程考察，结果见表10。聚酰胺树脂对赶黄草黄酮的吸附率较高，但动态洗脱最后得到的样品中总黄酮含量和收率都很低，这与其容易产生死吸附、不易洗脱有关。无论是赶黄草纯化后样品总黄酮含量还是收率，HPD450大孔树脂都具有显著优势，因此确定这个型号的树脂作为纯化赶黄草总黄酮的材料。
表10 6种树脂动态洗脱实验结果
3.2工艺参数优化实验
3.2.1上样量
树脂对目标物质的吸附容量是有限的，上样量过小，吸附选择性较差，还会导致吸附材料的浪费；上样量过大，样品充斥柱体，阻碍样品的分离，甚至泄露下来，损失样品。所以，上样适量才能最大限度地利用吸附树脂完成样品的纯化。不同上样量下的实验结果见图6。可以看到，上样量超过10mL后，黄酮泄露显著，逐渐增加上样量，流出液中黄酮浓度也不断变大，造成样品的浪费。从经济高效考虑，应选择10mL左右的上样液(总黄酮浓度26.86mg/mL)。
3.2.2水洗体积
上样完成后，首先用一定量的水冲洗柱体中残留的提取液并去除部分水溶性杂质，结果如图7。实验过程中发现水洗体积达到8BV，流出液澄清，基本无色，测得的黄酮浓度也很低，所以采用8BV水洗。
3.2.3洗脱溶剂
根据待分离物质的性质和树脂类型选择合适的洗脱溶剂，具体原则为弱极性树脂选用小极性洗脱剂，大极性洗脱剂则作用于强极性树脂。丙酮、甲醇、乙醇或其水溶液使用较多，通常先以蒸馏水洗去多糖、蛋白质、鞣质等杂质，再以浓度不同的乙醇、甲醇溶液梯度洗脱。研究不同洗脱溶剂对赶黄草总黄酮解吸效果的具体影响时发现，不同甲醇浓度下得到的总黄酮含量和收率差异较大。当解吸液中甲醇比例达到80％，洗脱得到的样品总黄酮含量大于80％，收率也达到90％以上，继续增大甲醇用量，其他杂质一并被洗脱下来，反而会影响产品纯度，结果见表11。综上所述，洗脱溶剂选择80％的甲醇溶液即可。
表11洗脱溶剂对解吸效果的影响
3.2.4洗脱溶剂用量
为了确定洗脱终点，需要考察洗脱溶剂的用量。随着洗脱溶剂的不断加入，流出液颜色越来越浅，黄酮浓度也随之降低，洗脱体积增加到6BV，流出液里几乎没有黄酮物质，表明使用6BV的洗脱溶剂基本能将柱体上吸附的黄酮洗净，洗脱曲线如图8所示。
3.2.5洗脱流速
洗脱流速是影响树脂分离目标成分效果的重要因素。若流速太快，一方面样品未充分吸附就随洗脱液而下，另一方面目标成分解吸不完全，出现拖尾、洗脱带宽的现象；若流速过小，会造成整个周期的延长和成本的增加。依据具体的实验来选择适合的洗脱流速，从表12的结果中可以发现，解吸过程宜慢不宜快，但结合时间成本和具体数据考虑，选用6mL/min(柱体积为20mL)的洗脱流速就能得到不错的分离效果，总黄酮含量80％以上，收率90％以上。
表12洗脱流速对解吸效果的影响
3.2.6洗脱pH
天然药物中许多成分有一定的酸碱性，因而在不同pH值时的溶解性也存在差异。基本原理是碱性物质在碱性溶液、酸性物质在酸性溶液、中性物质在中性溶液中吸附，解吸则分别在酸性、碱性、中性溶液中进行。将洗脱溶剂的pH控制在一定值，能让吸附物形成容易洗脱的离子化合物，进而改善洗脱效果。所以针对不同的分离成分选择合适洗脱pH至关重要。根据表3-5实验结果，利用大孔树脂HPD450精制赶黄草总黄酮，洗脱溶剂pH控制在6-7即可，低于或高于该范围均可对分离效果产生较大影响。
表13洗脱pH对解吸效果的影响
3.3精制工艺验证
在确定的工艺参数组合下重复实验验证，结果如表14所示。选用HPD450大孔树脂作为精制赶黄草总黄酮的材料，在确定的此工艺条件下，最后得到样品中总黄酮含量可达82.58％以上，收率可达91.94％以上，二者的RSD值分别为0.70％、1.13％，证明了工艺的高稳定性和可重复性：
表14验证试验结果

Claims (10)

1.一种赶黄草中黄酮类物质的提取方法,其特征在于，该方法包括：
1)将赶黄草粉碎成40目以上的细粉；
2)将细粉在60℃-80℃的环境下干燥4-6小时；
3)加入甲醇溶液，加入纳米金属材料，施加微波，混均后用回流装置在60℃-80℃提取温度下水浴浸提1.5h，取出减压过滤得到滤液；
4)称取预处理后的聚酰胺树脂和大孔树脂，加入步骤3的滤液，置于振荡器，在30℃下振荡12h，用溶剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩蒸干，得到提取物。
2.根据权利要求1所述的赶黄草中黄酮类物质的提取方法,其特征在于，所述的纳米金属为纳米铁、纳米铜、纳米铝、纳米镍、纳米银的一种或多种的混合物，所述的纳米金属的粒径为20-100nm。
3.根据权利要求2所述的赶黄草中黄酮类物质的提取方法,其特征在于，步骤3中的提取温度为70℃，甲醇溶液为75％甲醇、料液比为1:20。
4.根据权利要求3所述的赶黄草中黄酮类物质的提取方法,其特征在于，所述的大孔树脂为HPD600、HPD826、HPD450、NKA-9的一种。
5.根据权利要求4所述的赶黄草中黄酮类物质的提取方法,其特征在于，所述步骤4的预处理为：取一定量聚酰胺树脂和10种大孔树脂，加入无水乙醇，浸泡过夜，使其彻底溶胀，搅拌或超声除去气泡装柱，装柱时向柱内逐渐倾入树脂悬浮液，开启阀门让溶剂慢慢流下，过程中持续轻轻敲击柱壁，让树脂自由沉降和混合，确保吸附剂均匀平整和柱体无气泡，先用无水乙醇洗脱直到流出液滴入水中不出现浑浊，再以蒸馏水洗至无醇味，接着依次以5％NaOH溶液、蒸馏水和5％盐酸溶液冲洗，除去小分子杂质，最后蒸馏水洗脱至中性。
6.根据权利要求3所述的赶黄草中黄酮类物质的提取方法,其特征在于，步骤4的上样量为10mL。
7.根据权利要求4所述的赶黄草中黄酮类物质的提取方法,其特征在于，所述的步骤4的洗脱溶剂为80％的甲醇。
8.根据权利要求5所述的赶黄草中黄酮类物质的提取方法,其特征在于，所述的步骤4的洗脱流速为6mL/min，柱体积为20mL。
9.根据权利要求6所述的赶黄草中黄酮类物质的提取方法,其特征在于，所述的步骤4的洗脱PH为6-7。
10.根据权利要求1-9任一项所述的赶黄草中黄酮类物质的提取方法,其特征在于，微波频率为400-1000MHz，功率为200-1200w。
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