CN112505232A - 防风色原酮对照提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种防风色原酮对照提取物及其制备方法和用途。所述制备方法包括：(1)将防风色原酮粗提取物的醇溶液与空白硅胶混合，得到拌样硅胶；(2)将拌样硅胶上样于硅胶柱中，然后用洗脱剂洗脱，得到洗脱后的硅胶柱；(3)将洗脱后的硅胶柱沿柱头到底部的方向平均分成N段，N为15～35之间的整数；然后将各硅胶柱段检测，将含有四种指标成分中至少一种的硅胶柱段合并，得合并段；用甲醇洗脱合并段，得到甲醇洗脱液，浓缩，干燥，得到所述防风色原酮对照提取物。本发明所得防风色原酮对照提取物中，升麻素、升麻素苷、5‑O‑甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量高于63wt％。

Description

防风色原酮对照提取物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种防风色原酮对照提取物及其制备方法和用途。
背景技术
中药对照提取物是指主要化学成分及含量明确、稳定性好、纯度较高的中药提取物，其各化学成分比例相对固定，指标性成分含量已标定，可以实现同时对多个组分进行定性和定量分析，其价格通常低于多个组分单体对照品的总和。中药对照提取物的物质成本较低，检测程序简化，则可大大节约检测成本。
防风为常用中药。防风中主要含有色原酮类、香豆素类、多糖类等成分。论文(防风色原酮部位化学成分及其相关研究，姜艳艳，北京中医药大学，2006年6月)公开了防风色原酮部位的提取纯化工艺和化学成分，并公开了作为指标性成分的升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷这四种成分的含量测定方法。
CN1998621A公开了一种从中药防风中提取得到的总色原酮提取物及其制备方法。该提取物可由溶剂萃取法、大孔吸附树脂法等多种方法制备获得。在该专利文献中，所制得的防风总色原酮提取物中各种色原酮类成分百分含量的总和为百分之六七十，其中，升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷四种成分的含量占全部总色原酮含量的百分之二三十。但该专利文献中，升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷四种成分的含量较低。
CN107903291A公开了一种从防风中提取的色原酮苷类化合物及其方法。以防风干燥根为原料，粉碎后用乙醇加热回流提取，再经过过过过减压浓缩后得到浓缩液体；将浓缩液体用乙酸乙酯萃取，萃取液用硅胶拌样，取硅胶拌样物进行正相硅胶柱层析，将含有目标化合物的收集液合并后，减压浓缩至浸膏；将所得浸膏用甲醇分散，经滤膜过滤、C18反相色谱填料高压制备分离后，收集相对应的色谱峰，再经减压浓缩至析出固体，过滤、干燥后得到色原酮类化合物。但该专利文献中未涉及升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷四种成分的含量。
CN102532220A公开了一种亥茅酚苷的分离纯化方法。该专利文献将防风色原酮提取物加入甲醇、乙醇、丙酮或它们的混合溶剂，加热回流溶解，回收试剂至总体积的1/10～6/10，加入大孔树脂柱吸附，水洗柱至糖反应为阴性，再以50～80％乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩成浸膏，依次以石油醚、乙酸乙酯萃取2次，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩至浸膏状，将浸膏通过凝胶柱层析分离纯化，甲醇、丙酮或乙醇水溶液洗脱，收集下注液，薄层检测，合并相同流分，低温干燥，丙酮重结晶，减压抽滤、冷冻干燥或冷喷雾得亥茅酚苷。该专利文献仅是涉及亥茅酚苷的分离纯化。
因此，需要提供一种升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷四种成分含量较高的防风色原酮对照提取物及其制备方法。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种防风色原酮对照提取物的制备方法，该制备方法所得的防风色原酮对照提取物中升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量明显提高。
本发明的另一目的在于提供所述防风色原酮对照提取物，其中含有升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷，且该四种组分的总含量高。
本发明的再一目的在于提供所述防风色原酮对照提取物的用途。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
本发明提供一种防风色原酮对照提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将防风色原酮粗提取物的醇溶液与空白硅胶混合，得到拌样硅胶；其中，防风色原酮粗提取物中，升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量小于20wt％；
(2)将拌样硅胶上样于硅胶柱中，然后用洗脱剂洗脱，得到洗脱后的硅胶柱；其中，所述洗脱剂为体积比为1:8～10:1.2～1.8的非极性溶剂、乙酸乙酯和甲醇的混合溶液；所述非极性溶剂选自环己烷、正己烷或石油醚中的一种或多种；所述洗脱剂的用量为1.2～1.7BV；
(3)将洗脱后的硅胶柱沿柱头到底部的方向平均分成N段，N为15～35之间的整数，得到N段硅胶柱段；然后将各硅胶柱段采用薄层色谱法检测，将含有升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷中至少一种的硅胶柱段合并，得合并段；用甲醇洗脱合并段，得到甲醇洗脱液，浓缩，干燥，得到所述防风色原酮对照提取物。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(2)中，所述非极性溶剂、乙酸乙酯和甲醇的体积比为1:8.5～9.5:1.4～1.6；所述洗脱剂的用量为1.3～1.5BV。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(2)中，硅胶柱的径高比为1:14～16；拌样硅胶中防风色原酮粗提取物与硅胶柱中所用空白硅胶的质量比为1:45～60。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(2)中，N为16～32之间的整数。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(2)中，N为18～28之间的整数。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(1)中，将所述防风色原酮粗提取物用甲醇或乙醇溶解，并固液分离，得到母液，将母液浓缩至浓度为0.05～0.3g/mL，得到浓缩后的醇溶液；将浓缩后的醇溶液与拌样中的空白硅胶按照1:1.25～1.35的质量比混合，得到拌样硅胶。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(1)中，所述防风色原酮粗提取物的制备步骤包括：将防风药材用65～75vol％的乙醇溶液回流提取2～3次，每次1.5～2.5h，合并提取液，然后浓缩，得到乙醇提取液浓缩物；加水稀释，得到上样液；将上样液上样于AB-8型大孔树脂，依次用8～12vol％乙醇溶液、65～75vol％乙醇溶液洗脱，并收集65～75vol％乙醇溶液洗脱液浓缩，干燥，得到防风色原酮粗提取物；其中，AB-8型大孔树脂的径高比为1:7～9；8～12vol％乙醇溶液的用量为1.5～2BV；65～75vol％乙醇溶液的洗脱流速为1.5～2mL/min，用量为3～6BV。
本发明还提供一种防风色原酮对照提取物，其采用上述制备方法制备得到。
根据本发明的防风色原酮对照提取物，其含有的升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量大于63wt％。
本发明还提供所述防风色原酮对照提取物用于控制防风药材质量的用途。
本发明的制备方法所得的防风色原酮对照提取物中的升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量较高，高于63wt％，且该四种组分的转移率高。进一步地，本发明的制备方法稳定可靠，重现性好。更进一步地，采用本发明的洗脱方法，特别是采用本发明的特定洗脱剂和洗脱体积，能够使防风色原酮粗提取物中升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷这四种指标性成分富集在硅胶柱中较窄的段中，从而从较窄的硅胶柱段洗脱即可将这四种成分充分提取出来，工作量小，指标成分损耗少，转移率高，且杂质少，纯度高，能够得到四种指标成分含量高的防风色原酮对照提取物，适合工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
防风是一味常用中药材，色原酮类成分是防风的主要有效成分。根据现有技术，中药材防风的色原酮类成分中，升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷这四种成分是指标性成分，可以用作防风药材、防风配方颗粒或防风色原酮提取物的定性和定量检测基准，因而制备含有较高含量的升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的防风色原酮对照提取物是十分必要的。
本发明的防风色原酮对照提取物的制备方法包括如下步骤：1)防风色原酮粗提取物的制备步骤；2)拌样步骤；3)柱层析洗脱步骤；4)洗脱后分离纯化步骤。
＜防风色原酮粗提取物的制备步骤＞
所述防风色原酮粗提取物的制备步骤包括：将防风药材用65～75vol％的乙醇溶液回流提取2～3次，每次1.5～2.5h，合并提取液，然后浓缩，得到浓度小于0.1g/mL乙醇提取液浓缩物；加水稀释，得到浓度为0.1～0.15g/mL的上样液；将上样液上样于AB-8型大孔树脂，依次用8～12vol％乙醇溶液、65～75vol％乙醇溶液洗脱，并收集65～75vol％乙醇溶液洗脱液浓缩，干燥，得到防风色原酮粗提取物；其中，AB-8型大孔树脂的径高比为1:7～9；8～12vol％乙醇溶液的用量为1.5～2BV；65～75vol％乙醇溶液的洗脱流速为1.5～2mL/min，用量为3～6BV。其中，所述的乙醇提取液浓缩物的浓度以及上样液的浓度均以生药量计。
根据本发明的一个具体实施方式，将防风药材用70％的乙醇溶液回流提取3次，每次2h，合并提取液，然后浓缩，得到乙醇提取液浓缩物；加水稀释，得到上样液，上样液的浓度为0.1g/mL；将上样液上样于AB-8型大孔树脂，依次用10vol％乙醇溶液、70vol％乙醇溶液洗脱，并收集70vol％乙醇溶液洗脱液浓缩，干燥，得到防风色原酮粗提取物；其中，AB-8型大孔树脂的径高比为1:8；10vol％乙醇溶液的用量为2BV；70vol％乙醇溶液的洗脱流速为2mL/min，用量为5BV。
本发明的防风色原酮粗提取物的制备步骤可以参照CN1998621A。
本发明的防风色原酮粗提取物中，升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量小于20wt％。
＜拌样步骤＞
本发明的拌样步骤中，将防风色原酮粗提取物的醇溶液与空白硅胶混合，得到拌样硅胶。
根据本发明的一个实施方式，将所述防风色原酮粗提取物用甲醇或乙醇溶解，并固液分离，得到母液，将母液浓缩至浓度为0.05～0.3g/mL，得到浓缩后的醇溶液；将浓缩后的醇溶液与拌样中的空白硅胶按照1:1.25～1.35的质量比混合，得到拌样硅胶。其中，母液的浓度以防风色原酮粗提取物量计。优选地，将所述防风色原酮粗提取物用甲醇溶解。
在本发明的拌样步骤中，甲醇或乙醇的用量为防风色原酮粗提取物的质量的45～55倍，优选为47～53倍，更优选为50～53倍。这样一方面保证防风色原酮粗提取物能够得到更好的溶解，另一方面可以去除相应的不溶杂质。
将所述防风色原酮粗提取物用甲醇或乙醇溶解时可以采用超声，促进溶解。
在本发明的拌样步骤中，所述固液分离优选为离心分离，离心分离可以为15min。离心后，取上清液。优选地，将离心后的沉淀再用甲醇或乙醇溶解，重复上述操作，得到上清液。将离心后的沉淀用甲醇或乙醇再重复萃取两次。合并上清液，得到母液。
将母液可以浓缩至浓度为0.05～0.3g/mL，优选为0.1～0.2g/mL，更优选为0.1～0.15g/mL，得到浓缩后的醇溶液。将浓缩后的醇溶液可以与拌样中的空白硅胶按照1:1.25～1.35的质量比混合，得到拌样硅胶。优选地，浓缩后的醇溶液与拌样中的空白硅胶的质量比为1:1.27～1.35。更优选地，浓缩后的醇溶液与拌样中的空白硅胶的质量比为1:1.3～1.35。拌样中的空白硅胶的粒径为200～300目。这样有利于下一步的洗脱纯化，提高防风色原酮对照提取物中的升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量。
＜柱层析洗脱步骤＞
本发明的柱层析洗脱步骤包括：将拌样硅胶上样于硅胶柱中，然后用洗脱剂洗脱，得到第一洗脱溶液和洗脱后的硅胶柱。
其中，洗脱剂可以为体积比为1:8～10:1.2～1.8的非极性溶剂、乙酸乙酯和甲醇的混合溶液。优选地，非极性溶剂、乙酸乙酯和甲醇的体积比为1:8.5～9.5:1.3～1.6。更优选地，非极性溶剂、乙酸乙酯和甲醇的体积比为1:8.5～9.0:1.5～1.6。所述非极性溶剂选自环己烷、正己烷或石油醚中的一种或多种，优选地，非极性溶剂选自环己烷、正己烷或石油醚中的一种，更优选地，非极性溶剂为环己烷。本发明经过大量研究和实验发现，本发明的特定比例的洗脱剂可以将防风色原酮粗提取物中的一部分杂质洗掉，并且能够将其中的升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷四种组分很好地与杂质分离。
根据本发明的一个具体实施方式，洗脱剂可以为体积比为1:9:1.5的环己烷、乙酸乙酯和甲醇的混合溶液。
在本发明的柱层析洗脱步骤中，为了提高上述四种组分的总含量，优选地，洗脱剂的用量为1.2～1.7BV，优选为1.3～1.5BV，再优选为1.3～1.4BV，更优选为1.3～1.35BV。这样所得的防风色原酮对照提取物中的升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量较高。
本发明的硅胶柱的径高比可以为1:14～16，优选为1:15～16，更优选为1:15。本发明人发现，随着径高比的不断增加，目标成分的总含量亦不断增加，但目标成分的转移率呈先上升后下降的趋势。上述的径高比有利于提高所得防风色原酮对照提取物中的升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量。
拌样硅胶中防风色原酮粗提取物与硅胶柱中所用空白硅胶的质量比可以为1:45～60，优选为1:45～55，更优选为1:45～50。若上样量过大，导致上样超载，从而不能够完全洗脱分离。上样量过小，则分离效率低，成本高。这样控制上样量，可以在确保四种组分的总含量较高以及转移率较高的基础上，提高分离效率，降低成本。
在本发明中，硅胶柱中所用空白硅胶的粒径为200～300目。
采用本发明的洗脱方法，特别是采用本发明的特定洗脱剂和洗脱体积，能够使防风色原酮粗提物中升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷这四种指标性成分富集在硅胶柱中较窄的一段中，从而从这段较窄的硅胶柱洗脱即可将这四种成分充分提取出来，工作量小，指标成分损耗少，转移率高，且杂质少，纯度高，能够得到四种指标成分含量高的防风色原酮对照提取物，适合工业化生产。
＜洗脱后分离纯化步骤＞
本发明的洗脱后分离纯化步骤是将洗脱后的硅胶柱沿柱头到底部的方向平均分成N段，N为15～35之间的整数，得到N段硅胶柱段；然后将各硅胶柱段采用薄层色谱法检测，将含有升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷中至少一种的硅胶柱段合并，得到合并段；用甲醇洗脱合并段，得到甲醇洗脱液，浓缩，干燥，得到所述防风色原酮对照提取物。这样有利于提高所得防风色原酮对照提取物中的升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量。
在本发明中，柱头指的是上样端。
根据本发明优选的一个实施方式，N为16～32之间的整数，得到N段硅胶柱段；然后将各硅胶柱段采用薄层色谱法检测，将含有升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷中至少一种的硅胶柱段合并，得到合并段；然后将合并段用甲醇洗脱，得到甲醇洗脱液，浓缩，干燥，得到所述防风色原酮对照提取物。
根据本发明另一个优选的实施方式，将洗脱后的硅胶柱沿柱头到底部的方向平均分成N段，N为18～28之间的整数，得到N段硅胶柱段；然后将各硅胶柱段采用薄层色谱法检测，将含有升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷中至少一种的硅胶柱段合并，得到合并段；用甲醇洗脱合并段，得到甲醇洗脱液，浓缩，干燥，得到所述防风色原酮对照提取物。
本发明发现，采用上述对洗脱后的硅胶柱的处理方式，尤其采用上述优选的处理方式，有利于提高产品中上述四个组分的总含量。
在本发明中，用甲醇洗脱时所用甲醇的量可以根据甲醇洗脱液中的升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的含量来确定。在此不做赘述。
采用本发明的制备方法所得防风色原酮对照提取物中，升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量大于63wt％，优选为大于64wt％，更优选为大于66wt％；且具有较高的转移率，转移率大于60％，优选为大于62％，更优选为大于66％。
采用本发明的制备方法所得防风色原酮对照提取物中的升麻素苷，升麻素，5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量较高，且工艺较稳定。
＜防风色原酮对照提取物＞
本发明还提供采用上述制备方法制得的防风色原酮对照提取物。该对照提取物含有较高含量的升麻素苷，升麻素，5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷。在防风色原酮对照提取物中，所述四种化合物的总含量在63wt％以上，优选为在64wt％以上，更优选为在66wt％以上。
根据本发明的防风色原酮对照提取物，其中升麻素苷的含量为28～38wt％；升麻素的含量为2.3～5.5wt％；5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量为22～30wt％；亥茅酚苷的含量为1～4wt％。根据本发明的实施方式，所述防风色原酮类对照提取物含有28～38wt％的升麻素苷、2.3～5.5wt％的升麻素、22～30wt％的5-O-甲基维斯阿米醇苷和1～4wt％的亥茅酚苷，且所述升麻素苷，升麻素，5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量高于63wt％。
本发明的防风色原酮对照提取物包含上述四种结构明确且含量确切的成分，纯度较高，指标成分含量稳定，可以实现同时对四个组分进行定性和定量分析，且制备成本远低于上述四个指标成分单体对照品的总和。
＜防风对照提取物的用途＞
本发明还提供所述防风色原酮对照提取物用于控制防风药材质量的用途。所述用途包括以升麻素苷，升麻素，5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷这四种含量已知的防风色原酮对照提取物为对照，对防风药材中升麻素苷，升麻素，5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的含量进行测定。
所述防风色原酮对照提取物可以预先以升麻素苷对照品、升麻素对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品和亥茅酚苷对照品为对照进行含量标定，以确定所述黄酮对照提取物中升麻素苷，升麻素，5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的含量。可以同时对多个批次的防风色原酮对照提取物进行标定。
以下通过具体实施例对本发明进行详细说明。
以下实施例和对比例中，防风色原酮粗提取物和终产品(防风色原酮对照提取物)等供试品中的升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的含量测定方法如下：
1.对照品溶液的制备
精密称取升麻素苷标准品5.284mg、升麻素标准品0.7mg、5-O-甲基维斯阿米醇苷标准品3.32mg、亥茅酚苷标准品0.56mg，置于25mL量瓶中，制成浓度分别为0.2112mg(升麻素苷)、0.0280mg(升麻素)、0.1328mg(5-O-甲基维斯阿米醇苷)、0.0224mg(亥茅酚苷)的混合标准品溶液。
2.样品溶液制备
取防风色原酮粗提取物4g，精密称定，加入50倍量甲醇，充分搅拌，超声分散，4000r/min，离心15min，取上清液。沉淀重复上述操作3次，合并上清液，减压浓缩至0.1g/mL，备用。
3.色谱条件
色谱柱：CAPCELL PAK C18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-0.3％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱条件：0～12min，32％(A)；12～40min，32％～50％(A)；40～50min，50％～70％(A)；50～52min，70％(A)。流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；柱温：25℃；进样体积：10μL。
本发明中，转移率用于表征药材经过处理后，所得中间品/终产品中某类(个)成分的质量占药材中该类(个)成分的质量的百分比。
Figure BDA0002836215600000121
n1指中间品/终产品中某类(个)成分的质量，n2指药材中该类(个)成分的质量。
制备例1-防风色原酮粗提取物的制备
采用70vol％乙醇水溶液作为溶剂，加热回流提取法提取防风药材112.7g，提取次数为3次，每次提取的溶剂用量为防风药材重量的10倍，每次提取时间为2小时，合并提取液，得到70vol％乙醇提取液；将所述70vol％乙醇提液减压浓缩，干燥，得到乙醇提取液浓缩物。向乙醇提取液浓缩物中加水稀释至浓度为0.1g/mL，得到上样液。将上样液上样于AB-8型大孔树脂，AB-8型大孔树脂的径高比为1:8，依次用10vol％乙醇溶液除杂，10vol％乙醇溶液的用量为2BV；用70vol％乙醇溶液洗脱，洗脱流速为2mL/min，并收集70vol％乙醇溶液洗脱液，减压浓缩，干燥，得到4g防风色原酮粗提取物。防风色原酮粗提取物中，升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量为17.5wt％。
制备例2～4-防风色原酮粗提取物的制备
与制备例1的区别仅在于，制备例2、制备例3和制备例4所采用的防风药材分别为1kg、1kg和2.5kg。分别制得防风色原酮粗提取物为35.5g、35.7g和88.9g。防风色原酮粗提取物中，升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量分别为17.8wt％，17.6wt％，17.9wt％。
实施例1-防风色原酮对照提取物的制备
将防风色原酮粗提取物用50倍质量的甲醇超声溶解，离心分离，得到母液，将母液浓缩至浓度为0.1g/mL，得到浓缩后的醇溶液；将浓缩后的醇溶液与拌样中的空白硅胶按照1:1.3的质量比混合，得到拌样硅胶。
将拌样硅胶上样于硅胶柱中(拌样硅胶中防风色原酮粗提取物为4g，且与硅胶柱中所用空白硅胶的质量比为1:50；硅胶柱的径高比为1:15)，然后用洗脱剂洗脱，得到第一洗脱溶液和洗脱后的硅胶柱；其中，所述洗脱剂为体积比为1:9:1.5的环己烷、乙酸乙酯和甲醇的混合溶液；洗脱剂的用量为1.3BV。
将洗脱后的硅胶柱沿柱头到底部的方向平均切割分成24段，得到24段硅胶柱段；然后将各硅胶柱段采用薄层色谱法检测，将含有升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷中至少一种的硅胶柱段合并(包括第8段和第12段之间的硅胶柱段；以及第20段和第24段之间的硅胶柱段)，得合并段；然后将合并段用甲醇洗脱，得到甲醇洗脱液，浓缩，干燥，得到所述防风色原酮对照提取物。
对比例1
与实施例1的区别仅在于，所用洗脱剂(环己烷、乙酸乙酯和甲醇)的体积为1.0BV。
对比例2
与实施例1的区别仅在于，所用洗脱剂(环己烷、乙酸乙酯和甲醇)的体积为1.8BV。
对比例3
与实施例1的区别仅在于，所用硅胶柱的径高比为1:17。
对比例4
与实施例1的区别仅在于，所用硅胶柱的径高比为1:13。
对比例5
与实施例1的区别仅在于，所述洗脱剂为体积比为9:1.5的乙酸乙酯与甲醇的混合溶液。
对比例6
与实施例1的区别仅在于，所述洗脱剂为体积比为2:9:1.5的环己烷、乙酸乙酯与甲醇的混合溶液。
对比例7
与实施例1的区别仅在于，所述洗脱剂为体积比为1:9:1.5的环己烷、乙酸乙酯与乙醇的混合溶液。
对比例8
与实施例1的区别仅在于，拌样硅胶中防风色原酮粗提取物为5g。
实施例2-防风色原酮对照提取物的制备
与实施例1的区别仅在于，将洗脱后的硅胶柱沿柱头到底部的方向平均分成16段，取第8段，以及第4段和第8段之间的硅胶柱；取第16段的硅胶柱，以及第12段和第16段之间的硅胶柱；将各段硅胶柱合并，得到合并段；然后将合并段用甲醇洗脱，得到甲醇洗脱液，浓缩，干燥，得到所述防风色原酮对照提取物。
实施例3-防风色原酮对照提取物的制备
与实施例1的区别仅在于，拌样硅胶中防风色原酮粗提取物为3g。
实施例4～6-防风色原酮对照提取物的制备
与实施例1的区别仅在于，实施例4、实施例5和实施例6分别采用制备例2、制备例3和制备例4所制备的防风色原酮粗提取物。
分别计算实施例1、对比例3～10的产品中升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的含量，并计算升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量和转移率。结果见表1。
表1
Figure BDA0002836215600000161
由表1中的实施例1、对比例3和对比例4的结果可知，随着径高比的不断增加，目标成分的总含量亦不断增加，但目标成分的转移率呈先上升后下降的趋势。
由表1中的实施例1、实施例2和对比例8的结果可知，当上样量过大时，导致上样超载，从而不能够完全洗脱分离。
由表1中的实施例1和对比例5～7的结果可知，本发明所采用的洗脱剂显著影响所得防风色原酮对照提取物中的升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量。
分别计算对比例1～2的产品中升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的含量，并计算升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量。结果见表2。
表2
Figure BDA0002836215600000171
由表2可知，要控制洗脱剂的用量，以避免因为洗脱剂的过多或过少影响所得防风色原酮对照提取物中的升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量。
按照实施例1的制备步骤采用同一批次的防风色原酮粗提取物为原料重复三次，所得结果如下表3。
表3
Figure BDA0002836215600000172
由表3可知，按本发明的制备方法制备得到的3批防风色原酮对照提取物的升麻素苷，升麻素，5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量和转移率均较稳定，表明该工艺稳定可靠、重复性良好。
分别计算实施例4～6的产品中升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的含量，并计算升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量。结果见表4。
表4
Figure BDA0002836215600000181
由表4可知，3批放大制备的防风色原酮对照提取物含量均在60wt％以上，表明本发明的防风色原酮对照提取物的制备工艺能够用于大批量制备生产，工艺较稳定。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (10)

1.一种防风色原酮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将防风色原酮粗提取物的醇溶液与空白硅胶混合，得到拌样硅胶；其中，防风色原酮粗提取物中，升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量小于20wt％；
(2)将拌样硅胶上样于硅胶柱中，然后用洗脱剂洗脱，得到洗脱后的硅胶柱；其中，所述洗脱剂为体积比为1:8～10:1.2～1.8的非极性溶剂、乙酸乙酯和甲醇的混合溶液；所述非极性溶剂选自环己烷、正己烷或石油醚中的一种或多种；所述洗脱剂的用量为1.2～1.7BV；
(3)将洗脱后的硅胶柱沿柱头到底部的方向平均分成N段，N为15～35之间的整数，得到N段硅胶柱段；然后将各硅胶柱段采用薄层色谱法检测，将含有升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷中至少一种的硅胶柱段合并，得合并段；用甲醇洗脱合并段，得到甲醇洗脱液，浓缩，干燥，得到所述防风色原酮对照提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述非极性溶剂、乙酸乙酯和甲醇的体积比为1:8.5～9.5:1.4～1.6；所述洗脱剂的用量为1.3～1.5BV。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，硅胶柱的径高比为1:14～16；拌样硅胶中防风色原酮粗提取物与硅胶柱中所用空白硅胶的质量比为1:45～60。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，N为16～32之间的整数。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，N为18～28之间的整数。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将所述防风色原酮粗提取物用甲醇或乙醇溶解，并固液分离，得到母液，将母液浓缩至浓度为0.05～0.3g/mL，得到浓缩后的醇溶液；将浓缩后的醇溶液与拌样中的空白硅胶按照1:1.25～1.35的质量比混合，得到拌样硅胶。
7.根据权利要求1～6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述防风色原酮粗提取物的制备步骤包括：将防风药材用65～75vol％的乙醇溶液回流提取2～3次，每次1.5～2.5h，合并提取液，浓缩，得到乙醇提取液浓缩物；加水稀释，得到浓度为0.1～0.15g/mL的上样液；将上样液上样于AB-8型大孔树脂，依次用8～12vol％乙醇溶液、65～75vol％乙醇溶液洗脱，并收集65～75vol％乙醇溶液洗脱液浓缩，干燥，得到防风色原酮粗提取物；其中，AB-8型大孔树脂的径高比为1:7～9；8～12vol％乙醇溶液的用量为1.5～2BV；65～75vol％乙醇溶液的洗脱流速为1.5～2mL/min，用量为3～6BV。
8.一种防风色原酮对照提取物，其采用权利要求1～7任一项所述的制备方法制备得到。
9.根据权利要求8所述的防风色原酮对照提取物，其特征在于，升麻素、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的总含量大于63wt％。
10.权利要求8或9任一项所述的防风色原酮对照提取物用于控制防风药材、防风配方颗粒或防风色原酮提取物的质量的用途。
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