CN102964327B - 豆粕中提取大豆异黄酮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种豆粕中提取大豆异黄酮的方法，首先用乙醇提取豆粕中的大豆异黄酮，然后利用乙酸乙酯进行萃取后用硅胶层析柱纯化，洗脱剂用氯仿：甲醇（体积比为5：1）、氯仿：丙酮（体积比为1：3）或乙酸乙酯：甲醇（体积比为7：1），最后经过重结晶得到大豆异黄酮。本发明豆粕中提取大豆异黄酮的方法能够较快的得到纯度大于60%大豆异黄酮，无需多次重结晶，其工艺简单，分离成本较低。
Description
技术领域
本发明属于保健食品技术领域，具体涉及一种豆粕中提取大豆异黄酮的方法。
背景技术
豆粕是大豆在用于食用油加工中产生的副产品，这些豆粕除少部分用于发酵酱油、生产大豆浓缩蛋白或分离蛋白外，绝大多数被用作饲料，大豆中含有的生理活性物质大豆异黄酮留在豆粕中未被利用。大量的试验研究表明，大豆异黄酮具有降低胆固醇、减少心血管疾病、预防骨质疏松及缓解更年期综合症的保健作用，而豆粕常作为饲料产量巨大，从豆粕中提取大豆异黄酮具有很大的开发前景。
在现有的提取方法中，发明专利《大豆异黄酮主要单体组分的分离方法》（申请号：03135952.3，公开号：CN1528758A）公开了以甲醇为提取液，以硅胶为吸附剂，以氯仿-甲醇溶液为洗脱体系，得到染料木黄酮、大豆苷元、染料木苷及大豆苷四种大豆异黄酮单体组分，该方法得到的是单体化合物，不能当作保健食品原料使用，另外，该方法要求原料中大豆异黄酮含量不低于40%。发明专利《提取大豆中异黄酮的方法》（申请号：98119864.3，公开号：CN1211573A）公开了全脂大豆粉经脱脂、溶剂提取、过滤、滤液水解、柱层析分离、减压浓缩和纯化精制7个步骤得到大豆异黄酮，其中滤液水解采用二步水解法，该方法分离步骤较繁琐，生产产生的废水对环境污染较大，成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种豆粕中提取大豆异黄酮的方法，解决了现有方法对原料中大豆异黄酮含量要求较高和分离步骤繁琐的问题。
本发明所采用的技术方案是豆粕中提取大豆异黄酮的方法，首先用乙醇提取豆粕中的大豆异黄酮，然后经过萃取、层析、重结晶，最终得到纯度大于60%的大豆异黄酮。
该方法的具体步骤如下：
（1）提取
豆粕中加入浓度为70～80%的乙醇，在60℃下提取2～3小时后经真空减压浓缩，回收乙醇，直至浓缩液中无乙醇气味为止；
（2）萃取
向步骤（1）得到的浓缩液中加入乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯相，经真空减压浓缩，得到大豆异黄酮浸膏；
（3）硅胶层析柱上样
步骤（2）得到的大豆异黄酮浸膏用乙醇溶解后与硅胶混合，搅拌均匀分散，干燥后加入装填有硅胶的层析柱；
（4）层析柱洗脱
步骤（3）中的层析柱用洗脱液洗脱后，薄层层析法254nm紫外灯下检测分析，合并收集254nm紫外吸收相同的部分，减压浓缩得到大豆异黄酮粗品；
（5）重结晶
步骤（4）得到的大豆异黄酮粗品用丙酮或者乙醇溶解，重结晶得到大豆异黄酮。
本发明的特点还在于，
其中，步骤（1）中豆粕与乙醇的重量体积比为1：3～1：5。
其中，步骤（2）中浓缩液与乙酸乙酯的体积比为1：1～1：3。
其中，步骤（3）中大豆异黄酮浸膏使用干法上层析柱，具体操作为大豆异黄酮浸膏用乙醇溶解后与适量80～100目硅胶搅拌，均匀分散，干燥后加入装填80～100目硅胶的层析柱。
其中，步骤（3）中层析柱中装填的硅胶与大豆异黄酮浸膏重量比为3：1～5：1。
其中，步骤（4）中层析柱洗脱液为氯仿：甲醇、氯仿：丙酮或乙酸乙酯：甲醇，其中氯仿：甲醇的体积比为5：1，氯仿：丙酮的体积比为1：3，乙酸乙酯：甲醇的体积比为7：1。
其中，步骤（4）中洗脱液在层析柱中的流速为1～5ml/min。
本发明的有益效果是，本发明经过乙醇提取、萃取、层析和重结晶，能够较快的得到纯度大于60%大豆异黄酮，其工艺简单，分离成本较低。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
豆粕中提取大豆异黄酮的方法，首先用乙醇提取豆粕中的大豆异黄酮，然后经过萃取、层析、重结晶，最终得到纯度大于60%的大豆异黄酮。
该方法的具体步骤如下：
（1）提取
豆粕中加入浓度为70～80%的乙醇，豆粕与乙醇的重量体积比为1：3～1：5，在60℃下提取2～3小时后经真空减压浓缩，回收乙醇，直至浓缩液中无乙醇气味为止；
（2）萃取
向步骤（1）得到的浓缩液中加入乙酸乙酯进行萃取，浓缩液与乙酸乙酯的体积比为1：1～1：3，得到乙酸乙酯相，经真空减压浓缩，得到大豆异黄酮浸膏；
大豆异黄酮纯化工艺中常用的萃取溶剂有石油醚和氯仿，由于大豆异黄酮极性较大，使用石油醚萃取率较低，只有乙酸乙酯萃取率的50%左右，另外石油醚在生产中易燃易爆，因此不建议使用；氯仿毒性较大，成本偏高，相比较而言，利用乙酸乙酯对大豆异黄酮进行萃取，不仅萃取率高，而且成本较低。
（3）硅胶层析柱上样
步骤（2）得到的大豆异黄酮浸膏用乙醇溶解后与粒度为80～100目的硅胶混合，搅拌均匀分散，干燥后加入装填有粒度为80～100目硅胶的层析柱，其中层析柱中装填的硅胶与大豆异黄酮浸膏重量比为3：1～5：1；
大豆异黄酮硅胶层析纯化工艺一般将样品用有机溶剂溶解后，直接加入硅胶柱，本发明是将样品先用乙醇溶解，再与硅胶混合干燥后，加入硅胶柱，与现有方法相比较，本发明中的样品处理方法层析分离效果好，得到的大豆异黄酮纯度一般达到40%以上，纯度提高了10%左右。另外，本发明层析柱中装填的硅胶与大豆异黄酮浸膏重量比最小可以达到3：1，一般大豆异黄酮硅胶层析纯化工艺中硅胶与大豆异黄酮浸膏重量比为5：1以上，明显减少了硅胶的使用量，有效地降低硅胶的使用成本。
（4）层析柱洗脱
步骤（3）中的层析柱用洗脱液洗脱，其中洗脱液为氯仿：甲醇（体积比为5：1）、氯仿：丙酮（体积比为1：3）或乙酸乙酯：甲醇（体积比为7：1），洗脱液在层析柱中的流速为1～5ml/min，薄层层析法254nm紫外灯下检测分析，合并收集254nm紫外吸收相同的部分，减压浓缩得到大豆异黄酮粗品；
（5）重结晶
步骤（4）得到的大豆异黄酮粗品用丙酮或者乙醇溶解，重结晶便得到大豆异黄酮。
一般大孔树脂纯化工艺得到的大豆异黄酮纯度不够，需要采用多次重结晶工艺才能使大豆异黄酮达到纯度60%以上，而本发明由于硅胶层析纯化效率高，只需要一次重结晶即可得到纯度大于60%的大豆异黄酮。
实施例1
（1）提取，1kg豆粕加入3L浓度为70%的乙醇，在60℃下提取2.5小时后，过滤得到提取液，真空减压浓缩回收乙醇，直至浓缩液中无乙醇气味为止；
（2）萃取，向步骤（1）得到的浓缩液中加入3L乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯相，经真空减压浓缩，得到大豆异黄酮浸膏；
（3）硅胶层析柱上样，步骤（3）得到的大豆异黄酮浸膏用乙醇溶解后与适量粒度为80～100目的硅胶混合，搅拌均匀分散，干燥后加入装填有粒度为80～100目硅胶的层析柱，层析柱中的硅胶与大豆异黄酮浸膏重量比为3：1；
（4）层析柱洗脱，步骤（3）中的层析柱用洗脱液氯仿：甲醇（5：1）洗脱，洗脱液在层析柱中的流速为1ml/min，薄层层析法254nm紫外灯下检测分析，合并收集254nm紫外吸收相同的部分，减压浓缩得到大豆异黄酮粗品；
（5）重结晶，步骤（4）得到的大豆异黄酮粗品用丙酮溶解，重结晶得到大豆异黄酮。
用紫外分光光度法对实施例1得到的大豆异黄酮进行纯度测定，测定所需要的材料、仪器和方法如下：
1.材料与方法
（1）材料
染料木素标准品（Sigma公司，纯度为98%），95%乙醇（分析纯），无水乙醇（分析纯），豆粕（榆林三丰油脂公司提供）。
（2）仪器
RE-2000A型旋转蒸发器；USHB-Ⅲ型循环水工真空泵；TGL-16GB高速台式离心机；BP211D十万分之一天平；KQ5200B型超声清洗仪；CH1030型恒温水浴锅；101-3-S型恒温干燥箱；UV-160A SHIMADZU紫外分光光度计。
（3）标准曲线的制作
精密称取染料木素对照品2.0mg，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制得浓度为200μg/mL的对照品母液。按照紫外分光光度法操作，于200～400nm波长范围内进行扫描测定，最大吸收峰在260nm处。精密吸取一定量母液，加甲醇定容配制成浓度分别为6、8、10、12、14、16μg/mL的系列对照品溶液，以甲醇为空白对照，在260nm波长处分别测定其吸光度（A），计算回归方程，A=0.0482C+0.0282，其线性范围为4～16μg/mL，相关系数（r）为0.9993。
2.样品溶液的测定
精密称取经提取、纯化后的大豆异黄酮样品1.1mg，置于250mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，以甲醇为空白对照，在260nm波长处测定其吸光度（A），代入回归方程，计算其纯度为68.2%。
实施例2
（1）提取，1kg豆粕加入4L浓度为75%的乙醇，在60℃下提取2小时后，过滤得到提取液，真空减压浓缩回收乙醇，直至浓缩液中无乙醇气味为止；
（2）萃取，向步骤（1）得到的浓缩液中加入5L乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯相，经真空减压浓缩，得到大豆异黄酮浸膏；
（3）硅胶层析柱上样，步骤（3）得到的大豆异黄酮浸膏用乙醇溶解后与适量粒度为80～100目的硅胶混合，搅拌均匀分散，干燥后加入装填有粒度为80～100目硅胶的层析柱，层析柱中的硅胶与大豆异黄酮浸膏重量比为4：1；
（4）层析柱洗脱，步骤（3）中的层析柱用洗脱液氯仿：丙酮（1：3）洗脱，洗脱液在层析柱中的流速为2ml/min，薄层层析法254nm紫外灯下检测分析，合并收集254nm紫外吸收相同的部分，减压浓缩得到大豆异黄酮粗品；
（5）重结晶，步骤（4）得到的大豆异黄酮粗品用丙酮溶解，重结晶得到大豆异黄酮。
大豆异黄酮的纯度测定方法同实施例1，测得其纯度为63.2%。
实施例3
（1）提取，1kg豆粕加入5L浓度为80%的乙醇，在60℃下提取3小时后，过滤得到提取液，真空减压浓缩回收乙醇，直至浓缩液中无乙醇气味为止；
（2）萃取，向步骤（1）得到的浓缩液中加入8L乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯相，经真空减压浓缩，得到大豆异黄酮浸膏；
（3）硅胶层析柱上样，步骤（3）得到的大豆异黄酮浸膏用乙醇溶解后与适量粒度为80～100目的硅胶混合，搅拌均匀分散，干燥后加入装填有粒度为80～100目硅胶的层析柱，层析柱中的硅胶与大豆异黄酮浸膏重量比为5：1；
（4）层析柱洗脱，步骤（3）中的层析柱用洗脱液乙酸乙酯：甲醇（7：1）洗脱，洗脱液在层析柱中的流速为5ml/min，薄层层析法254nm紫外灯下检测分析，合并收集254nm紫外吸收相同的部分，减压浓缩得到大豆异黄酮粗品；
（5）重结晶，步骤（4）得到的大豆异黄酮粗品用丙酮溶解，重结晶得到大豆异黄酮。
大豆异黄酮的纯度测定方法同实施例1，测得其纯度为65.5%。
Claims (4)
1.豆粕中提取大豆异黄酮的方法，其特征在于，首先用乙醇提取豆粕中的大豆异黄酮，然后经过萃取、层析、重结晶，最终得到纯度大于60％的大豆异黄酮；
该方法的具体步骤如下：
(1)提取
豆粕中加入浓度为70～80％的乙醇，在60℃下提取2～3小时后经真空减压浓缩，回收乙醇，直至浓缩液中无乙醇气味为止；豆粕与乙醇的重量体积比为1：3～1：5；
(2)萃取
向步骤(1)得到的浓缩液中加入乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯相，经真空减压浓缩，得到大豆异黄酮浸膏；浓缩液与乙酸乙酯的体积比为1：1～1：3；
(3)硅胶层析柱上样
步骤(2)得到的大豆异黄酮浸膏用乙醇溶解后与硅胶混合，搅拌均匀分散，干燥后加入装填有硅胶的层析柱；
(4)层析柱洗脱
步骤(3)中的层析柱用洗脱液洗脱，薄层层析法254nm紫外灯下检测分析，合并收集254nm紫外吸收相同的部分，减压浓缩得到大豆异黄酮粗品；
所述洗脱液为氯仿和甲醇的混合物、氯仿和丙酮的混合物或乙酸乙酯和甲醇的混合物中的一种，氯仿与甲醇的体积比为5：1，所述氯仿与丙酮的体积比为1：3，所述乙酸乙酯与甲醇的体积比为7：1；
(5)重结晶
步骤(4)得到的大豆异黄酮粗品用丙酮或者乙醇溶解，重结晶便得到大豆异黄酮。
2.根据权利要求1所述的豆粕中提取大豆异黄酮的方法，其特征在于，大豆异黄酮浸膏使用干法上层析柱，具体操作为大豆异黄酮浸膏用乙醇溶解后与适量80～100目硅胶搅拌，均匀分散，干燥后加入装填80～100目硅胶的层析柱。
3.根据权利要求1或2所述的豆粕中提取大豆异黄酮的方法，其特征在于，所述层析柱中装填的硅胶与大豆异黄酮浸膏重量比为3：1～5：1。
4.根据权利要求1所述的豆粕中提取大豆异黄酮的方法，其特征在于，所述洗脱液在层析柱中的流速为1～5ml/min。
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