CN106539848A - 一种甜柿黄酮的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了甜柿黄酮及其制备方法，具体包括提取、富集和精制三个步骤。甜柿叶粉碎，经60~85%乙醇溶液提取，提取液过滤，滤液浓缩得浸膏；浸膏加水搅拌混悬，用碱调节至碱性（pH=9.5~11）后，过滤，用乙酸乙酯萃取，水液再用酸调节至酸性（pH=3~5），再用乙酸乙酯萃取，浓缩，得甜柿黄酮粗品；取甜柿黄酮，加水溶解，通过MCI GEL（75~150μm），先用水洗脱，再用40~60%乙醇洗脱，收集该部分洗脱液，浓缩，干燥，得甜柿黄酮精品。本发明以甜柿叶为原料深加食用黄酮，纯度高，操作简便，适用于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于医药及食品技术领域，具体涉及一种从甜柿叶制备甜柿黄酮及其制备方法。
背景技术
甜柿(Diospyros Kaki)叶富含黄酮类P族维生素，具有软化血管、增加血管通透性、活血化瘀等功效，是制备药物及保健食品的重要原料，还因其具有显著抗菌及抗氧化活性而广泛应用于食品添加剂中。目前柿叶黄酮的制备主要有萃取法、吸附法。两者均只能针对部分杂质的去除，所得总黄酮含量不高。本发明采用两种方法结合，利用黄酮酚酸结构性质，在碱性条件下呈离子状态，不能被乙酸乙酯萃取而去除中性、碱性物质，再在酸性条件下由乙酸乙酯萃取得到总黄酮粗品；总黄酮粗品经过MCI GEL树脂吸附，用水洗脱除去大极性有机酸后，再用50%乙醇洗脱下中等极性的黄酮，浓缩干燥得到甜柿黄酮精品。该方法简便易操作，所得总黄酮含量高，应用于医药、保健食品及食品添加剂行业具有巨大经济前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甜柿黄酮的制备方法。
本发明通过如下方法实现：所述的甜柿黄酮制备方法是以甜柿叶为原料，经提取、富集、精制得到，具体包括：
A、提取：取甜柿叶，粉碎，加入4~7倍量（V/W）60~85%乙醇溶液，加热回流提取2~5次，每次1~3小时，提取液过滤，滤液浓缩，得浸膏；
B、富集：取柿叶浸膏，加入3~6倍水（V/W），搅拌混悬，加入3%~7%%浸膏量的活性炭，搅拌，静置1~4小时，过滤，滤液用20%氢氧化钠溶液调节至碱性（pH=9.5~11），再用三分之一水液体积量的乙酸乙酯萃取三次，水层用10~20%盐酸溶液调节至酸性（pH=3~4），再用三分之一水液体积量的乙酸乙酯萃取三次，合并此次乙酸乙酯萃取液，浓缩，得甜柿叶黄酮粗品。
C、精制：取甜柿叶黄酮粗品，加15~30倍水溶解，用MCI GEL树脂（75~150um）吸附，先用2~5倍柱体积水洗脱，再用3~6倍柱体积40%~60%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得甜柿黄酮精品。
本发明的有益效果在于：
本发明以甜柿叶为原料制备天然来源黄酮应用于药品、食品等领域，操作简便；制备过程中首先用活性炭吸附去除大部分叶绿素等脂溶性成分，再利用黄酮酚酸性性质，在碱性条件下呈离子态，不能被乙酸乙酯萃取，从而除去碱性及中性成分，再利用其在酸性条件下呈游离态可以被乙酸乙酯萃取，得到粗品黄酮；粗品黄酮通过大孔吸附树脂去除有机酸、单糖等大极性成分，最后用50%乙醇洗脱下黄酮成分，从而选择性获得甜柿叶中的高含量黄酮（研究表明甜柿叶中大极性及小极性黄酮非常微量）。该工艺所得天然黄酮可以满足医药、保健品、食品及化妆品行业原料的需求，具有良好的市场前景和竞争力。
具体实施方式
为使本领域技术人员详细了解本发明的生产工艺和技术效果，下面以具体的生产实例来进一步介绍本发明的应用和技术效果，以下实施例为对本发明的说明而不是限定。
本发明所述的方法是以甜柿叶为原料，经提取、富集、精制步骤得到，具体包括：
A、提取：取甜柿叶，粉碎，加入4~7倍量（V/W）60~85%乙醇溶液，加热回流提取2~5次，每次1~3小时，提取液过滤，滤液浓缩，得浸膏；
B、富集：取柿叶浸膏，加入3~6倍水（V/W），搅拌混悬，加入3%~7%浸膏量的活性炭，搅拌，静置1~4小时，过滤，滤液用20%氢氧化钠溶液调节至碱性（pH=9.5~11），再用三分之一水液体积量的乙酸乙酯萃取三次，水层用10~20%盐酸溶液调节至酸性（pH=3~4），再用三分之一水液体积量的乙酸乙酯萃取三次，合并此次乙酸乙酯萃取液，浓缩，得甜柿叶黄酮粗品。
C、精制：取甜柿叶黄酮粗品，加15~30倍水溶解，用MCI GEL树脂（75~150um）吸附，先用2~5倍柱体积水洗脱，再用3~6倍柱体积40%~60%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得甜柿黄酮精品。
本发明的方法制备的甜柿黄酮精品含总黄酮不少于75%，且其含山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷不少于10%、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷不少于5%、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷20%。
实施例1：
取甜柿叶50 kg，粉碎成粗粉，加入75%乙醇溶液250L，加热回流提取2次，每次2小时，提取液过滤，滤液浓缩，得浸膏11.2公斤；浸膏中加入67L水，搅拌混悬，加入3.4公斤活性炭，搅拌，静置2小时，过滤，滤液用20%氢氧化钠溶液调节至碱性（pH=10），再用乙酸乙酯萃取三次，每次23L（回收乙酸乙酯，残渣弃去）；水层用15%盐酸溶液调节至酸性（pH=3.5），再用乙酸乙酯萃取三次（每次23L），合并乙酸乙酯萃取液，浓缩，得甜柿叶黄酮粗品2.22kg。取甜柿叶黄酮粗品，加44L水，使溶解，用MCI GEL树脂（75~150μm）吸附（20L），先用42L水洗脱（3倍柱体积），再用50%乙醇70L洗脱（5倍柱体积），收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得甜柿黄酮精品1.78kg。
甜柿黄酮含量测定：
（1）紫外法测定（UV）
测定波长：254nm
对照品溶液制备 精密称取芦丁对照品适量，加75%乙醇配制成50ug/ml的溶液。
供试品溶液制备 精密称取本品适量，加75%乙醇配制成50ug/ml的溶液。
测定：分别取对照品溶液和供试品溶液测定，即得。
结果：本品含黄酮以芦丁计为83.32%。
（2）高效液相法测定（HPLC）
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.4%磷酸溶液为流动相A，甲醇为流动性B；按下表中的规定进行梯度洗脱；流速每分钟为1.2ml；检测波长为265nm；柱温30℃。
时间程序见下表
对照品溶液的制备 精密称取山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷适量，加甲醇制成每1ml含45μg、20μg、50μg的混合溶液，即得。
供试品溶液制备 取本品粉末25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇20ml，超声处理使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取5ml置于50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
测定：分别取对照品溶液和供试品溶液各10ul注入色谱仪，测定即得。
结果：本品含山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷分别为13.24%、7.12%、24.55%。
实施例2：
取甜柿叶60 kg，粉碎成粗粉，加入85%乙醇溶液280L，加热回流提取5次，每次3小时，提取液过滤，滤液浓缩，得浸膏13.4公斤；浸膏中加入75L水，搅拌混悬，加入4.1公斤活性炭，搅拌，静置2小时，过滤，滤液用20%氢氧化钠溶液调节至碱性（pH=11），再用乙酸乙酯萃取三次，每次35L（回收乙酸乙酯，残渣弃去）；水层用20%盐酸溶液调节至酸性（pH=4），再用乙酸乙酯萃取三次（每次26L），合并乙酸乙酯萃取液，浓缩，得甜柿叶黄酮粗品2.85kg。取甜柿叶黄酮粗品，加50L水，使溶解，用MCI GEL树脂（75~150μm）吸附（20L），先用60L水洗脱（5倍柱体积），再用60%乙醇84L洗脱（6倍柱体积），收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得甜柿黄酮精品1.67kg。
甜柿黄酮含量测定：
（1）紫外法测定（UV）
测定波长：254nm
对照品溶液制备 精密称取芦丁对照品适量，加75%乙醇配制成50ug/ml的溶液。
供试品溶液制备 精密称取本品适量，加75%乙醇配制成50ug/ml的溶液。
测定：分别取对照品溶液和供试品溶液测定，即得。
结果：本品含黄酮以芦丁计为80.11%。
（2）高效液相法测定（HPLC）
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.4%磷酸溶液为流动相A，甲醇为流动性B；按下表中的规定进行梯度洗脱；流速每分钟为1.2ml；检测波长为265nm；柱温30℃。
时间程序见下表
对照品溶液的制备 精密称取山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷适量，加甲醇制成每1ml含45μg、20μg、50μg的混合溶液，即得。
供试品溶液制备 取本品粉末25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇20ml，超声处理使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取5ml置于50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
测定：分别取对照品溶液和供试品溶液各10ul注入色谱仪，测定即得。
结果：本品含山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷分别为13.01%、6.88%、23.68%。
实施例3：
取甜柿叶45 kg，粉碎成粗粉，加入60%乙醇溶液220L，加热回流提取3次，每次1小时，提取液过滤，滤液浓缩，得浸膏9.3公斤；浸膏中加入30L水，搅拌混悬，加入2.1公斤活性炭，搅拌，静置1小时，过滤，滤液用20%氢氧化钠溶液调节至碱性（pH=9.5），再用乙酸乙酯萃取三次，每次11L（回收乙酸乙酯，残渣弃去）；水层用10%盐酸溶液调节至酸性（pH=3），再用乙酸乙酯萃取三次（每次11L），合并乙酸乙酯萃取液，浓缩，得甜柿叶黄酮粗品1.52kg。取甜柿叶黄酮粗品，加30L水，使溶解，用MCI GEL树脂（75~150μm）吸附（20L），先用28L水洗脱（2倍柱体积），再用40%乙醇42L洗脱（3倍柱体积），收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得甜柿黄酮精品1.05kg。
甜柿黄酮含量测定：
（1）紫外法测定（UV）
测定波长：254nm
对照品溶液制备 精密称取芦丁对照品适量，加75%乙醇配制成50ug/ml的溶液。
供试品溶液制备 精密称取本品适量，加75%乙醇配制成50ug/ml的溶液。
测定：分别取对照品溶液和供试品溶液测定，即得。
结果：本品含黄酮以芦丁计为78.25%。
（2）高效液相法测定（HPLC）
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.4%磷酸溶液为流动相A，甲醇为流动性B；按下表中的规定进行梯度洗脱；流速每分钟为1.2ml；检测波长为265nm；柱温30℃。
时间程序见下表
对照品溶液的制备 精密称取山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷适量，加甲醇制成每1ml含45μg、20μg、50μg的混合溶液，即得。
供试品溶液制备 取本品粉末25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇20ml，超声处理使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取5ml置于50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
测定：分别取对照品溶液和供试品溶液各10ul注入色谱仪，测定即得。
结果：本品含山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷分别为11.24%、6.45%、22.69%。
Claims (2)
1.一种甜柿黄酮的制备方法，其特征在于以甜柿叶为原料，经提取、富集、精制步骤得到，具体包括：
A、提取：取甜柿叶，粉碎，加入4~7倍量（V/W）60~85%乙醇溶液，加热回流提取2~5次，每次1~3小时，提取液过滤，滤液浓缩，得浸膏；
B、富集：取柿叶浸膏，加入3~6倍水（V/W），搅拌混悬，加入3%~7%浸膏量的活性炭，搅拌，静置1~4小时，过滤，滤液用20%氢氧化钠溶液调节至碱性（pH=9.5~11），再用三分之一水液体积量的乙酸乙酯萃取三次，水层用10~20%盐酸溶液调节至酸性（pH=3~4），再用三分之一水液体积量的乙酸乙酯萃取三次，合并此次乙酸乙酯萃取液，浓缩，得甜柿叶黄酮粗品;
C、精制：取甜柿叶黄酮粗品，加15~30倍水溶解，用MCI GEL树脂（75~150μm）吸附，先用2~5倍柱体积水洗脱，再用3~6倍柱体积40%~60%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得甜柿黄酮精品。
2.根据权利要求1所述的一种甜柿黄酮的制备方法，其特征在于甜柿黄酮精品含总黄酮不少于75%，且其含山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷不少于10%、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷不少于5%、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷20%。
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