CN101139320B - 从荷叶中分离制备荷叶碱和荷叶黄酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供从荷叶中分离制备荷叶碱和荷叶黄酮的方法，包括荷叶粗提物的制备，其特征在于：采用酸性亲水性有机溶剂提取荷叶碱和荷叶黄酮，提取液回收部分溶剂后，采用阳离子交换树脂富集纯化荷叶碱，残留的料液进一步采用聚酰胺吸附纯化荷叶黄酮。本发明构思新颖，可从荷叶中同时制备荷叶碱和荷叶黄酮，工艺简单，生产成本低，具有较大推广性。

Description

从荷叶中分离制备荷叶碱和荷叶黄酮的方法

技术领域

本发明涉及一种从药食两用植物中分离纯化荷叶碱和荷叶黄酮的方法，更具体涉及组合采用溶剂提取、树脂富集和聚酰胺纯化的集成技术从荷叶中分离制备荷叶碱和荷叶黄酮。

背景技术

莲(Nelumbo nucifera Gaertn)为一种药食两用植物，在我国南北方均有种植，种植历史长达3000多年，目前盛产于福建、江西、湖北、湖南和浙江等省份。

荷叶(Nelumbo nucifera leaf)为莲的干燥叶，又名莲叶或藕叶，入选中国卫生部“既是食品，又是药品”的植物名录，民间广泛用作食物和药物。作为天然植物的药用成分，荷叶生物碱和荷叶黄酮的降血脂、降胆固醇及减肥等生物活性功能近年受到关注[孔文琦等，《中药研究与信息》，2005，7(6)：22-24]。在中国，荷叶资源丰富，价廉易得，药效明确。

目前，提取荷叶黄酮的主要方法有：水提取法[陈海光等，《食品科学》，2002，23(1)：69-72]、水提取后采用大孔树脂富集吸附法[蔡为荣等，《江苏食品与发酵》，2002，24(4)：1-5；赵骏等，《中药材》，2005，28(9)：832-834]等。提取荷叶生物碱常用的方法有：酸性水溶液提取法[陈海光等，《食品与机械》，2001，17(5)：16-17；蒋益虹，《浙江大学学报(农业与生命科学版)》2004，30(5)：519-523；]、酸性水提取后采用大孔树脂富集吸附法[赵骏等，《中药材》，2003，26(9)：669-670]。

目前，根据树脂骨架的化学组成划分，阳离子交换树脂产品主要有苯乙烯系、丙烯酸系、酚醛系、环氧系、乙烯吡啶系、脲醛系和氯乙烯系等产品；根据树脂的品牌则可划分为华东理工大学和南开大学的001系列强酸性阳离子交换树脂[如001×2(商品名735)、001×4(商品名734)、001×7(商品名732)]和112、110、122系列弱酸性阳离子交换树脂[如112×1(商品名724)、112×4(商品名101)、110、122]等，上海罗门哈斯公司(中美合资)的Amberlite系列[如Amberlite IR-120(强酸)、Amberlite IRC-50(弱酸)]和浙江漂莱特(中英合资)的Dowex系列(如Dowex 50(强酸)等阳离子交换树脂产品。

荷叶碱(Nuciferine，简称NF)纯品为白色针状晶体。由于荷叶碱为弱碱性有机生物碱，不能直接溶解于水，但易溶于甲醇、乙醇、丙酮等亲水性有机溶剂的酸性水溶液中，微溶于热的石油醚、乙醚、乙酸乙酯和氯仿中。因此，根据离子交换理论，在酸性条件下，荷叶碱是以阳离子状态存在，可采用离子交换技术分离荷叶碱。对吸附在阳离子交换树脂上的荷叶碱，可采用含有H⁺、K⁺、Na⁺、NH₄ ⁺等无机离子的洗脱剂进行洗脱，该洗脱剂可以是酸性、中性或碱性的亲水性有机溶剂。

由于聚酰胺对富含羟基的黄酮类物质具有选择性吸附的作用，且其吸附能力取决于被吸附物质羟基的多少，故已经成为黄酮类物质良好的吸附剂。利用聚酰胺纯化黄酮，能获得常规分离纯化方法无法达到的产物纯度。

发明内容

本发明的目的在于提供从荷叶中分离制备荷叶碱和荷叶黄酮的方法，该方法不仅设备简单、分离效果好、产品收率高，而且树脂和聚酰胺的使用寿命长、生产成本低。

本发明的从荷叶中分离制备荷叶碱和荷叶黄酮的方法是这样实现的：采用酸性亲水性有机溶剂提取荷叶碱和荷叶黄酮，提取液回收部分溶剂后，采用阳离子交换树脂富集纯化荷叶碱，残留的料液进一步采用聚酰胺吸附纯化荷叶黄酮。

较之已有的制备方法而言，本发明组合采用酸性亲水性有机溶剂提取荷叶碱和荷叶黄酮、阳离子交换树脂富集纯化荷叶碱和聚酰胺吸附纯化荷叶黄酮的集成技术，从荷叶中同时分离制备荷叶碱和荷叶黄酮，可提供一种工艺简单、产品品质高、生产成本低的荷叶黄酮和荷叶碱制备方法，其优点在于：

一是充分利用了在酸性亲水性有机溶剂水溶液中，荷叶碱和荷叶黄酮等目标成分与蛋白质、多糖、精油、色素、无机盐等杂质成分的溶解度明显差异的特点，进行荷叶粗提物的制备，真正达到了荷叶碱和荷叶黄酮等药用活性成分与杂质成分的高效分离。

二是充分利用了酸性pH值条件下阳离子交换树脂对荷叶碱的亲和力与对蛋白质、多糖、色素等杂质的亲和力的差异，以及含有一定浓度阳离子的洗脱剂溶液对吸附在离子交换树脂上的荷叶碱与其它杂质的洗脱能力的差异，真正达到了荷叶碱与杂质的高效分离，可制备高纯度的荷叶碱产品。

三是充分利用了聚酰胺对黄酮的特异性吸附特点，进行荷叶黄酮的进一步分离纯化，可制备高纯度的荷叶黄酮产品。

具体实施方式

本发明从荷叶中分离制备荷叶碱和荷叶黄酮的方法，其方法步骤为：

1.荷叶粗提物的制备：以荷叶为原料，采用5～15倍荷叶量(W/W)的30～70％亲水性有机溶剂水溶液，在酸性pH值，即pH值＜7的条件下，于50～80℃下提取1～3次，每次1～3小时，合并提取液，过滤，滤液经减压回收部分溶剂后，采用亲水性有机溶剂调整pH值、亲水性有机溶剂浓度和荷叶碱浓度。

2.荷叶碱的纯化：荷叶粗提物的酸性亲水性有机溶剂水溶液，用阳离子交换树脂富集吸附荷叶碱至饱和，用不少于1倍树脂量(V/V)的纯水洗去未发生离子交换的残留料液和不少于2倍树脂量(V/V)的28～55％亲水性有机溶剂水溶液洗去吸附力较荷叶碱弱的杂质，再用2～10倍树脂量(V/V)的0.20～1.25mol/L阳离子浓度的洗脱剂水溶液、以1～3倍树脂量(V/V)/小时的流速洗脱荷叶碱，洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收部分溶剂后，加入荷叶碱溶解度调节剂，缓慢冷却洗脱液至开始析出荷叶碱、4～10℃静置养晶、过滤，得荷叶碱粗品。荷叶碱粗品进一步用5～10倍量的弱极性有机溶剂、于50～80℃条件下萃取荷叶碱不少于2次，每次萃取时间30min。合并萃取液，过滤。滤液经减压回收有机溶剂后，析出得荷叶碱晶体。

3.荷叶黄酮的纯化：上述步骤中未被阳离子交换树脂富集吸附的料液，用聚酰胺吸附荷叶黄酮至饱和，先用不少于1倍树脂量的水(V/V)洗去未被聚酰胺吸附的残留料液和吸附力较荷叶黄酮弱的杂质，再用不少于3倍树脂量的40～60％亲水性有机溶剂水溶液，以1～3BV/h的流速洗脱荷叶黄酮，收集洗脱液，在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收溶剂后，干燥得荷叶黄酮成品。

其中，亲水性有机溶剂是甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或异丙醇中的一种或几种混合溶剂。洗脱剂的阳离子组成是H⁺、K⁺、Na⁺、NH₄ ⁺等无机离子中的一种或几种。洗脱剂可以是酸性、中性或碱性的亲水性有机溶剂中的一种或几种。

阳离子交换树脂骨架的化学组成可以是聚苯乙烯、聚丙烯酸或酚醛中的一种或几种。

弱极性有机溶剂是石油醚、乙酸乙酯、乙醚或氯仿中的一种或几种混合溶剂。

本发明各制备物的理化参数测定方法如下：

(1)荷叶碱含量测定：采用液相色谱法，以荷叶碱标准品(纯度99％，购自中国生物制品检定所)为对照。色谱条件为：Agilent 1100型高效液相色谱仪(DAD二极管阵列检测器)，色谱柱为依利特C₁₈反相柱(Φ4.6×200mm，4μm)，流动相为甲醇和0.2％三乙胺溶液梯度洗脱，甲醇浓度15min内由50％变化至90％；流速1.0ml/min，柱温30℃，检测波长272nm，进样量20μL。荷叶碱的紫外光谱、红外光谱、液质联用和液相色谱鉴定按照国标进行。

(2)荷叶黄酮的含量测定：采用高效液相色谱法，以槲皮素(纯度99％，购自中国生物制品检定所)为对照。色谱条件：色谱柱选用Waters Nova-Pak C₁₈柱(Φ3.9×150mm，4μm)，预柱C₁₈(3.9mm×15mm)，流动相为甲醇：0.2％磷酸水溶液(45∶55)，流速1.0mL/min，柱温34℃，检测波长365nm，进样量20μL。样品的测定：取待测液4mL(或待测物粉末0.1g，溶于4mL溶剂中)，加甲醇6mL及12mol/L盐酸1mL，摇匀后置80℃水浴回流水解1h。而后将水解液转入50mL容量瓶中，用50％甲醇稀释至刻度，作为HPLC待测液。HPLC测定过程中采用外标法定量，以槲皮素为对照，计算水解后各苷元的含量，统一乘以因子2.51计算荷叶黄酮含量。

(3)喷雾干燥条件为：进料液浓度10～20波美度(60℃)，喷雾机进口温度160～250℃，出口温度60～110℃，离心转头工作压力1.6～3.0kgf/cm²。

(4)冷冻干燥条件为：干燥温度-10～-60℃，升华温度35～70℃，压力0.05～0.18mbar，干燥时间20～40 h。

(5)真空干燥条件为：干燥温度45～75℃，压力0.01～0.095MPa，干燥时间15～50h。

本发明制备方法的实施例陈述如下：

实施例1

以福建省建宁产荷叶为原料，将鲜荷叶水洗、干燥(风干、烘干或晒干均可)、粉碎、过16目筛得荷叶粉末，将3.0kg荷叶粉末放入提取罐中，用荷叶粉末5倍量(W/W)的70％乙醇水溶液，在pH值1.2条件下，于65℃提取3次，每次2小时，合并提取液，过滤。

滤液经减压回收部分溶剂后，采用乙醇调整成pH值2.1、乙醇浓度40％、荷叶碱浓度0.95g/L的料液，采用Dowex 50强酸性阳离子交换树脂，以0.63倍树脂量(V/V)/小时的上柱流速动态吸附荷叶碱至饱和，分别用3倍树脂量(V/V)的纯水洗去未发生离子交换的残留料液和5倍树脂量(V/V)的36％乙醇水溶液洗去吸附力较荷叶碱弱的杂质，再用2倍树脂量(V/V)的含有1.25mol/L NaCl的75％乙醇水溶液，以2倍树脂量(V/V)/小时的流速洗脱荷叶碱，洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收部分溶剂后加入荷叶碱溶解度调节剂，控制洗脱液体系中乙醇浓度36％和pH值5.3，缓慢冷却荷叶碱洗脱液至开始析出荷叶碱晶体、4～10℃静置养晶、过滤，得荷叶碱粗品。

荷叶碱粗品进一步用10倍量的石油醚、于65℃条件下萃取荷叶碱4次，每次萃取时间30min。合并萃取液，过滤。滤液经减压回收石油醚后，析出得荷叶碱晶体。经测定，荷叶碱晶体含水量3.3％，荷叶碱晶体纯度94.3％、荷叶碱总收率73.2％、荷叶黄酮未检出。荷叶碱晶体的紫外光谱、红外光谱、液质联用和液相色谱鉴定结果与荷叶碱标准品相符。

上述步骤中未被阳离子交换树脂富集吸附的料液，荷叶黄酮浓度为3.32g/L，用60目聚酰胺吸附荷叶黄酮至饱和，先用3倍树脂量(V/V)的水洗去未被聚酰胺吸附的残留料液和吸附力较荷叶黄酮弱的杂质，再用3倍树脂量(V/V)的60％乙醇水溶液，以1BV/h的流速洗脱荷叶黄酮，收集洗脱液，经减压回收溶剂后，喷雾干燥得荷叶黄酮成品。经测定，荷叶黄酮产品含水量4.6％，荷叶黄酮纯度56.3％、荷叶黄酮总收率68.8％、荷叶碱未检出。

实施例2

将16～20目荷叶粉末2.5kg放入提取罐中，用荷叶粉末15倍量(W/W)的30％乙醇水溶液，在pH值3.0条件下，于70℃提取2次，每次3小时，合并提取液，过滤。

滤液经减压回收部分溶剂后，采用乙醇调整成pH值5.8、乙醇浓度25％、荷叶碱浓度1.32g/L的料液，采用Amberlite IRC-50弱酸性阳离子交换树脂，在95r/min的搅拌转速条件下静态吸附至饱和，分别用4倍树脂量(V/V)的纯水洗去未发生离子交换的残留料液和2倍树脂量(V/V)的55％乙醇水溶液洗去吸附力较荷叶碱弱的杂质，再用10倍树脂量(V/V)的含有0.2mol/L HCl的60％乙醇水溶液，以1倍树脂量(V/V)/小时的流速洗脱荷叶碱，洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收部分溶剂后加入荷叶碱溶解度调节剂，控制洗脱液体系中乙醇浓度30％和pH值6.1，缓慢冷却荷叶碱洗脱液至开始析出荷叶碱晶体、4～10℃静置养晶、过滤，得荷叶碱粗品。

荷叶碱粗品进一步用6倍量的乙酸乙酯、于70℃条件下萃取荷叶碱2次，每次萃取时间30min。合并萃取液，过滤。滤液经减压回收乙酸乙酯后，析出得荷叶碱晶体。经测定，荷叶碱晶体含水量2.8％，荷叶碱晶体纯度89.2％、荷叶碱总收率70.5％、荷叶黄酮未检出。

上述步骤中未被阳离子交换树脂富集吸附的料液，荷叶黄酮的浓度为2.56g/L，用120目聚酰胺吸附荷叶黄酮至饱和，先用4倍树脂量(V/V)的水洗去未被聚酰胺吸附的残留料液和吸附力较荷叶黄酮弱的杂质，再用5倍树脂量(V/V)的50％乙醇水溶液，以1BV/h的流速洗脱荷叶黄酮，收集洗脱液，经减压回收溶剂后，冷冻干燥得荷叶黄酮成品。经测定，荷叶黄酮产品含水量6.8％，荷叶黄酮纯度57.3％、荷叶黄酮总收率65.3％、荷叶碱未检出。

实施例3

将16～20目荷叶粉末2.5kg放入提取罐中，用荷叶粉末10倍量(W/W)的65％甲醇水溶液，在pH值0.5条件下，于80℃回流提取1小时，过滤。

滤液经减压回收部分溶剂后，采用乙醇调整成pH值0.5、甲醇浓度36％、荷叶碱浓度0.68g/L的料液，采用聚苯乙烯系001×4强酸性阳离子交换树脂，以1倍树脂量(V/V)/小时的上柱流速动态吸附荷叶碱至饱和，分别用2倍树脂量(V/V)的纯水洗去未发生离子交换的残留料液和6倍树脂量(V/V)的28％甲醇水溶液洗去吸附力较荷叶碱弱的杂质，再用10倍树脂量(V/V)的含有0.75mol/L NH₄OH的45％甲醇水溶液，以3倍树脂量(V/V)/小时的流速洗脱荷叶碱，洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收部分溶剂后加入荷叶碱溶解度调节剂，控制洗脱液体系中甲醇浓度23％和pH值5.9，缓慢冷却荷叶碱洗脱液至开始析出荷叶碱晶体、4～10℃静置养晶、过滤，得荷叶碱粗品。

荷叶碱粗品进一步用8倍量的乙醚、于50℃条件下萃取荷叶碱3次，每次萃取时间30min。合并萃取液，过滤。滤液经减压回收乙醚后，析出得荷叶碱晶体。经测定，荷叶碱晶体含水量3.1％，荷叶碱晶体纯度90.7％、荷叶碱总收率69.3％、荷叶黄酮未检出。

上述步骤中未被阳离子交换树脂富集吸附的料液，荷叶黄酮的浓度为2.68g/L，用60目聚酰胺吸附荷叶黄酮至饱和，先用2倍树脂量(V/V)的水洗去未被聚酰胺吸附的残留料液和吸附力较荷叶黄酮弱的杂质，再用9倍树脂量(V/V)的40％甲醇水溶液，以2BV/h的流速洗脱荷叶黄酮，收集洗脱液，经减压回收溶剂后，真空干燥得荷叶黄酮成品。经测定，荷叶黄酮产品含水量3.2％，荷叶黄酮纯度53.1％、荷叶黄酮总收率64.4％、荷叶碱未检出。

实施例4

将16～20目荷叶粉末3.0kg放入提取罐中，用荷叶粉末15倍量(W/W)的50％丙酮水溶液，在pH值1.8条件下，于50℃提取1小时，过滤。

滤液经减压回收部分溶剂后，采用乙醇调整成pH值1.4、丙酮浓度32％、荷叶碱浓度0.59g/L的料液，采用732∶735(2∶3)强酸性阳离子交换树脂，以0.75倍树脂量(V/V)/小时的上柱流速动态吸附荷叶碱至饱和，分别用2倍树脂量(V/V)的纯水洗去未发生离子交换的残留料液和5倍树脂量(V/V)的32％丙酮水溶液洗去吸附力较荷叶碱弱的杂质，再用7倍树脂量(V/V)的含有0.58mol/L Na₂SO₄的50％丙酮水溶液，以1倍树脂量(V/V)/小时的流速洗脱荷叶碱，洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收部分溶剂后加入荷叶碱溶解度调节剂，控制洗脱液体系中丙酮浓度25％和pH值6.3，缓慢冷却荷叶碱洗脱液至开始析出荷叶碱晶体、4～10℃静置养晶、过滤，得荷叶碱粗品。

荷叶碱粗品进一步用5倍量的氯仿、于80℃条件下萃取荷叶碱2次，每次萃取时间30min。合并萃取液，过滤。滤液经减压回收氯仿后，析出得荷叶碱晶体。经测定，荷叶碱晶体含水量3.6％，荷叶碱晶体纯度87.6％、荷叶碱总收率68.4％、荷叶黄酮未检出。

上述步骤中未被阳离子交换树脂富集吸附的料液，荷叶黄酮的浓度为1.39g/L，用30目聚酰胺吸附荷叶黄酮至饱和，先用2倍树脂量(V/V)的水洗去未被聚酰胺吸附的残留料液和吸附力较荷叶黄酮弱的杂质，再用8倍树脂量(V/V)的45％丙酮水溶液，以3BV/h的流速洗脱荷叶黄酮，收集洗脱液，经减压回收溶剂后，喷雾干燥得荷叶黄酮成品。经测定，荷叶黄酮产品含水量4.9％，荷叶黄酮纯度53.4％、荷叶黄酮总收率67.7％、荷叶碱未检出。

以上实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。

本发明构思新颖，工艺简单，提取效率高，生产成本低，具有较大的推广意义。

Claims (9)

1.一种从荷叶中分离制备荷叶碱和荷叶黄酮的方法，包括荷叶粗提物的制备，其特征在于：采用酸性亲水性有机溶剂提取荷叶碱和荷叶黄酮，提取液回收部分溶剂后，采用阳离子交换树脂富集纯化荷叶碱，残留的料液进一步采用聚酰胺吸附纯化荷叶黄酮；所述的荷叶粗提物的制备方法是：以荷叶为原料，采用5～15倍荷叶量(W/W)的30～70％亲水性有机溶剂水溶液，在酸性pH值，即pH值＜7的条件下，于50～80℃下提取1～3次，每次1～3小时，合并提取液，过滤，滤液经减压回收部分溶剂后，采用亲水性有机溶剂调整pH值、亲水性有机溶剂浓度和荷叶碱浓度。

2.根据权利要求1所述的从荷叶中分离制备荷叶碱和荷叶黄酮的方法，其特征在于：所述的荷叶碱的纯化方法是：荷叶粗提物的酸性亲水性有机溶剂水溶液，用阳离子交换树脂富集吸附荷叶碱至饱和，用不少于1倍树脂量(V/V)的纯水洗去未发生离子交换的残留料液和不少于2倍树脂量(V/V)的28～55％亲水性有机溶剂水溶液洗去吸附力较荷叶碱弱的杂质，再用2～10倍树脂量(V/V)的0.20～1.25mol/L阳离子浓度的洗脱剂水溶液，以1～3倍树脂量(V/V)/小时的流速洗脱荷叶碱，洗脱液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收部分溶剂后，加入荷叶碱溶解度调节剂，缓慢冷却洗脱液至开始析出荷叶碱、4～10℃静置养晶、过滤，得荷叶碱粗品。

3.根据权利要求2所述的从荷叶中分离制备荷叶碱和荷叶黄酮的方法，其特征在于：所述荷叶碱粗品进一步用5～10倍量的弱极性有机溶剂、于50～80℃条件下萃取荷叶碱不少于2次，每次萃取时间30min，合并萃取液，过滤，滤液经减压回收有机溶剂后，析出得荷叶碱晶体。

4.根据权利要求1所述的从荷叶中分离制备荷叶碱和荷叶黄酮的方法，其特征在于：所述的荷叶黄酮的纯化方法是：所述未被阳离子交换树脂富集吸附的料液，用聚酰胺吸附荷叶黄酮至饱和，先用不少于1倍树脂量的水(V/V)洗去未被聚酰胺吸附的残留料液和吸附力较荷叶黄酮弱的杂质，再用不少于3倍树脂量的40～60％亲水性有机溶剂水溶液，以1～3BV/h的流速洗脱荷叶黄酮，收集洗脱液，在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收溶剂后，干燥得荷叶黄酮成品。

5.根据权利要求2所述的从荷叶中分离制备荷叶碱和荷叶黄酮的方法，其特征在于：所述的洗脱剂是酸性、中性或碱性的亲水性有机溶剂中的一种或几种。

6.根据权利要求5所述的从荷叶中分离制备荷叶碱和荷叶黄酮的方法，其特征在于：洗脱剂的阳离子组成是H⁺、K⁺、Na⁺、NH₄ ⁺无机离子中的一种或几种。

7.根据权利要求1、2或4所述的从荷叶中分离制备荷叶碱和荷叶黄酮的方法，其特征在于：所述的阳离子交换树脂骨架的化学组成是聚苯乙烯、聚丙烯酸或酚醛中的一种或几种。

8.根据权利要求3所述的从荷叶中分离制备荷叶碱和荷叶黄酮的方法，其特征在于：所述的弱极性有机溶剂是石油醚、乙酸乙酯、乙醚或氯仿中的一种或几种混合溶剂。

9.根据权利要求1、2、4或5所述的从荷叶中分离制备荷叶碱和荷叶黄酮的方法，其特征在于：所述亲水性有机溶剂是甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或异丙醇中的一种或几种混合溶剂。