CN112362792B - 玄参环烯醚萜对照提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种玄参环烯醚萜对照提取物及其制备方法和用途。所述制备方法包括：(1)将玄参粗提取物上样于第一硅胶柱并洗脱，得洗脱后的第一硅胶柱；(2)将洗脱后的第一硅胶柱沿柱头到底部的方向平均分成N段；得第一目标段和第二目标段；分别处理后得玄参环烯醚萜对照提取物I和玄参环烯醚萜对照提取物中间体；(3)将玄参环烯醚萜对照提取物中间体处理后得玄参环烯醚萜对照提取物II；(4)将玄参环烯醚萜对照提取物I和玄参环烯醚萜对照提取物II混合，得玄参环烯醚萜对照提取物。本发明所得玄参环烯醚萜对照提取物中，哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量高于60wt％。

Description

玄参环烯醚萜对照提取物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种玄参环烯醚萜对照提取物及其制备方法和用途。
背景技术
玄参始载于《神农本草经》，为“浙八味”之一，是常用中药，具有保护心血管系统、抗炎、抗氧化等药理活性，其主要活性成分为环烯醚萜类和苯丙素类成分。
中药对照提取物是指主要化学成分及含量明确、稳定性好、纯度较高的中药提取物，其各化学成分比例相对固定，指标性成分含量已标定，可以实现同时对多个组分进行定性和定量分析，其价格通常低于多个组分单体对照品的总和。中药对照提取物的物质成本较低，检测程序简化，则可大大节约检测成本。
因此，有必要研究并制备可以定量用的玄参对照提取物，尤其是玄参环烯醚萜类对照提取物，以此替代对应的化学对照品对玄参药材等进行质量控制。
CN106146578A公开了一种提取玄参中哈巴苷和哈巴俄苷的新工艺。包括：粉碎玄参根块干燥-粉碎-过70目筛-以按料液比1:20加入10％乙醇浸提-微波萃取-将萃取液进行抽滤，得到抽滤液-将抽滤液进行浓缩-干燥，得到哈巴苷和哈巴俄苷产品。该专利文献中未提及哈巴苷和哈巴俄苷以及安格洛苷C三者的总含量。
CN105287885A公开了一种从玄参下脚料中提取玄参皂甙的方法。包括将玄参下脚料干燥，粉碎，用75％浓度乙醇浸泡，回流提取，提取3次，合并提取液。制备上样液，并上样于HPD100型大孔树脂上，然后依次用水、50～70％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，获得玄参皂甙粉末。
CN106831891A公开了一种高纯度哈巴苷的制备方法，包括(1)将玄参药材粉碎成粗粉，经水或乙醇水溶液初提，浓缩得到初提液；(2)将初提液通过活化好的阳离子交换树脂，然后依次水洗和用体积分数为35％～45％的乙醇水溶液进行解析得到含哈巴苷的馏分，并浓缩得到哈巴苷粗品；(3)采用300～400目硅胶柱对哈巴苷粗品进行层析，洗脱剂为体积比为60～70:30～40:10的氯仿、甲醇和水的混合液的下层溶液，对收集液进行浓缩获得浓缩物；(4)采用十八烷基硅烷键合硅胶层析柱，以乙腈水溶液为洗脱剂，对浓缩物进行反相层析获得收集液，浓缩，得到哈巴苷。该专利文献中可得到较高纯度的哈巴苷，但仅涉及一种哈巴苷的提纯方法，不同时涉及哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的纯化方法。
CN107412430A公开了一种玄参水提物的提取分离方法，包括：1)将玄参根经水提取，浓缩，得到提取液；2)将提取液经AB-8非极性大孔树脂层析，用体积浓度为65％的乙醇水溶液进行洗脱，得到洗脱物；3)将洗脱物经过聚苯乙烯合成吸附树脂柱色谱层析，分别以体积浓度为10％、30％、60％、90％甲醇水溶液进行洗脱，分别得到10％、30％、60％和90％甲醇洗脱物；4)将30％的甲醇洗脱物经凝胶柱层析，在甲醇与水的体积比为40:60的条件下分离，得到含安格洛苷C、阿克替苷、赛斯坦苷D和土可玄参苷A，得到第二产物；将60％的甲醇洗脱物经凝胶柱层析，在甲醇和水的体积比为65:35的条件下分离，得到第三产物。该专利文献中得到的产物中哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量较低。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种玄参环烯醚萜对照提取物的制备方法，该制备方法所得的玄参环烯醚萜对照提取物中哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷三个指标成分的总含量明显提高。进一步地，本发明的制备方法工艺稳定，重现性好。
本发明的另一目的在于提供所述玄参环烯醚萜对照提取物，其中含有哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷，且该三种指标成分的总含量高。
本发明的再一目的在于提供所述玄参环烯醚萜对照提取物的用途。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
本发明提供一种玄参环烯醚萜对照提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将玄参粗提取物采用干法上样于第一硅胶柱中，然后用第一洗脱剂洗脱，得到洗脱后的第一硅胶柱；其中，所述第一洗脱剂为体积比为7.5～8.2:1:0.1的二氯甲烷、甲醇和水的混合溶液；所述第一洗脱剂的用量为2.6～3.1BV；所述玄参粗提取物中，哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷三个指标成分的总含量小于20wt％；
(2)将洗脱后的第一硅胶柱沿柱头到底部的方向平均分成N段，N为10～40之间的整数；将各硅胶柱段检测，取含有所述指标成分中的至少一个且杂质含量小于50wt％的硅胶段，合并为第一目标段；取其余的含有所述指标成分中至少一个的硅胶段，合并为第二目标段，分别用甲醇洗脱第一目标段和第二目标段，分别得到第一甲醇洗脱液和第二甲醇洗脱液，并分别进行浓缩，干燥，分别得到玄参环烯醚萜对照提取物I和玄参环烯醚萜对照提取物中间体；
(3)将所述玄参环烯醚萜对照提取物中间体采用干法上样于第二硅胶柱，用体积比为4.8～5.2:1:0.1的二氯甲烷、甲醇和水的混合溶液作为第二洗脱剂洗脱，得到洗脱后的第二硅胶柱；第二洗脱剂的用量为1.5～2.5BV；将洗脱后的第二硅胶柱沿柱头到底部的方向平均分成M段，M为10～25之间的整数；将各硅胶柱段检测，取含有所述指标成分中至少一个的硅胶段，合并为第三目标段，用甲醇洗脱，并浓缩，干燥，得玄参环烯醚萜对照提取物II；
(4)将玄参环烯醚萜对照提取物I和玄参环烯醚萜对照提取物II混合，得玄参环烯醚萜对照提取物。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(1)中，将所述玄参粗提取物用甲醇溶解，并固液分离，得到母液，将母液浓缩，得到浓度为0.05～0.25g/mL的玄参粗提取物甲醇溶液，与空白硅胶混合，得到第一拌样硅胶；将第一拌样硅胶上样于第一硅胶柱中；其中，第一拌样硅胶中玄参粗提取物与拌样中的空白硅胶的质量比为1:1.75～2.5；第一硅胶柱的径高比为1:13～15。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(3)中，将玄参环烯醚萜对照提取物中间体配制为0.08～0.13g/mL的玄参环烯醚萜对照提取物中间体甲醇溶液，与空白硅胶混合，得到第二拌样硅胶；将第二拌样硅胶上样于第二硅胶柱中；其中，第二拌样硅胶中玄参环烯醚萜对照提取物中间体与拌样中的空白硅胶的质量比为1:1.75～2.5；第二硅胶柱的径高比为1:9～11。
根据本发明的制备方法，优选地，所述玄参粗提取物由包括以下步骤制备而得：
(a)将玄参药材用水作溶剂回流提取2～3次，每次1～2h；每次用水量为所述玄参药材重量的9～12倍；将回流提取液合并浓缩至相对密度为1.18～1.22，得到玄参水提液；
(b)向玄参水提液内加入90～95vol％乙醇至乙醇浓度为77～83vol％，在0～6℃下冷藏12～36h，固液分离，浓缩，干燥，得玄参水提醇沉物；
(c)将玄参水提醇沉物加水分散至浓度为0.09～0.13g/mL，上样于大孔吸附树脂柱，然后依次用1.5～2.5BV的水，和4.5～5.5BV的55～65vol％乙醇洗脱，洗脱流速均为4.5～5.0BV/h，并收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到玄参粗提取物。
根据本发明的制备方法，优选地，大孔吸附树脂柱为SP825型大孔吸附树脂柱。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(2)中，N为24～35之间的整数。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(3)中，M为15～25之间的整数。
本发明还提供一种玄参环烯醚萜对照提取物，其采用上述制备方法制备得到。
根据本发明的玄参环烯醚萜对照提取物，其含有的哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷三个指标组分的总含量大于60wt％。
本发明还提供所述玄参环烯醚萜对照提取物用于控制玄参药材和/或含玄参的中药复方的质量的用途。
本发明的制备方法所得的玄参环烯醚萜对照提取物中的哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量较高，高于60wt％。进一步地，本发明的制备方法稳定可靠，重现性好。更进一步地，本发明优选采用特定的洗脱剂以及洗脱体积能够使玄参粗提取物中哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷这三种指标成分富集在硅胶柱中几个较窄的段中，从而从几个较窄的硅胶柱段中洗脱即可将这三种成分充分提取出来，工作量小，指标成分损耗少，转移率高，且杂质少，纯度高，能够得到三种指标成分含量高的玄参环烯醚萜对照提取物，适合工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
玄参是一种常用中药材，其主要活性成分为环烯醚萜类和苯丙素类成分。根据现有技术，玄参的环烯醚萜类成分中，哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷这三种成分是指标性成分，可以用作玄参药材、含玄参的中药复方的定性和定量检测基准，中药复方比如四妙勇安汤。因而制备含有较高含量的哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的玄参环烯醚萜对照提取物是十分必要的。而由现有技术CN107412430A可知，玄参中含有的化合物种类很多，要将哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷三种组分主要分离出来并不容易。
本发明的玄参环烯醚萜对照提取物的制备方法包括如下步骤：1)玄参粗提取物的制备步骤；2)玄参环烯醚萜对照提取物I的制备步骤；3)玄参环烯醚萜对照提取物II的制备步骤；4)玄参环烯醚萜对照提取物的制备步骤。
＜玄参粗提取物的制备步骤＞
(a)将玄参药材用水作溶剂回流提取2～3次，每次1～2h，分别得到回流提取液。优选地，回流提取2次，每次1～1.5h。每次用水量为所述玄参药材重量的9～12倍，优选为9～11倍，更优选为10～11倍。将回流提取液合并并浓缩至相对密度为1.18～1.22，优选为1.19～1.22，更优选为1.19～1.20，得到玄参水提液。这样一方面有利于提高玄参粗提取物的收率，另一方面有利于提高玄参粗提取物中哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷三个指标成分的总含量。玄参药材可以为玄参药材粉末，优选为60～70目。
在本发明中，所述指标成分指的是哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷中的至少一种。
(b)向玄参水提液内加入90～95vol％乙醇至乙醇浓度为77～83vol％，优选为至乙醇浓度为80～83vol％，更优选为至乙醇浓度为80vol％。然后置于0～6℃下冷藏12～36h，固液分离，浓缩，干燥，得玄参水提醇沉物。这样有利于去除杂质，提高玄参水提醇沉物中哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷三个指标成分的总含量。
(c)将玄参水提醇沉物加水分散至浓度为0.09～0.13g/mL，优选为0.1～0.13g/mL，更优选为0.1～0.11g/mL，得到分散液。然后将该分散液上样于大孔吸附树脂柱。在本发明中，大孔吸附树脂柱为SP825型大孔吸附树脂柱。树脂体积与上样液的体积比为2:1～5:1，优选为3:1～4:1。大孔吸附树脂柱的径高比可以为1:8～12，优选为1:8～11，更优选为1:9～10。然后依次用1.5～2.5BV的水，和4.5～5.5BV的55～65vol％乙醇洗脱。优选地，依次用1.8～2.2BV的水，和4.7～5.2BV的55～65vol％乙醇洗脱。其中，洗脱流速均为4.5～5.0BV/h，优选为4.8～5.0BV/h。收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到玄参粗提取物。这样有利于提高玄参粗提取物中哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量。
根据本发明的一个实施方式，(a)将玄参药材用水作溶剂回流提取2～3次，每次1～1.5h；每次用水量为所述玄参药材重量的10～11倍；将回流提取液合并浓缩至相对密度为1.18～1.22，得到玄参水提液；(b)向玄参水提液内加入90～95vol％乙醇至乙醇浓度为77～83vol％，在0～6℃下冷藏12～36h，固液分离，浓缩，干燥，得玄参水提醇沉物；(c)将玄参水提醇沉物加水分散至浓度为0.1～0.13g/mL，上样于径高比为1:9～10的大孔吸附树脂柱，然后依次用1.8～2.2BV的水，和4.7～5.2BV的55～65vol％乙醇洗脱，洗脱流速均为4.5～5.0BV/h，并收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到玄参粗提取物。
本发明的玄参粗提取物中，哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷三个指标成分的总含量小于20wt％，优选为大于10wt％并小于20wt％，更优选为大于15wt％并小于20wt％。
＜玄参环烯醚萜对照提取物I的制备步骤＞
将上述玄参粗提取物采用干法上样于第一硅胶柱中。
具体地，将所述玄参粗提取物用50～55倍重量的甲醇溶解，并固液分离，得到母液，将母液浓缩，得到浓度为0.05～0.25g/mL的玄参粗提取物甲醇溶液。优选地，得到浓度为0.09～0.2g/mL的玄参粗提取物甲醇溶液。更优选地，得到浓度为0.1～0.13g/mL的玄参粗提取物甲醇溶液。然后，将玄参粗提取物甲醇溶液与空白硅胶混合，得到第一拌样硅胶。空白硅胶的粒径为200～300目。第一拌样硅胶中，玄参粗提取物与空白硅胶的质量比为1:1.75～2.5，优选为1:1.75～2.3，更优选为1:2～2.3。
在本发明中，第一硅胶柱的径高比为1:13～15，优选为1:14～15，更优选为1:15。第一拌样硅胶中玄参粗提取物与第一硅胶柱中空白硅胶的重量比为1:45～52，优选为1:48～52，更优选为1:48～50。这样有利于提高玄参环烯醚萜对照提取物I中的哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量。
在本发明中，将上样后的第一硅胶柱用第一洗脱剂洗脱，得到洗脱后的第一硅胶柱。第一洗脱剂为体积比为7.5～8.2:1:0.1的二氯甲烷、甲醇和水的混合溶液。优选地，第一洗脱剂为体积比为7.8～8.2:1:0.1的二氯甲烷、甲醇和水的混合溶液。更优选地，第一洗脱剂为体积比为8～8.1:1:0.1的二氯甲烷、甲醇和水的混合溶液。本发明经过大量研究发现，采用本发明特定的第一洗脱剂可以明显提高玄参环烯醚萜对照提取物I中的哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量。
根据本发明优选的一个具体实施方式，第一洗脱剂为体积比为8:1:0.1的二氯甲烷、甲醇和水的混合溶液。
第一洗脱剂的用量为2.6～3.1BV，优选为2.8～3.1BV，更优选为2.9～3.0BV。这样有利于提高玄参环烯醚萜对照提取物I中的哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量。
将洗脱后的第一硅胶柱沿柱头到底部的方向平均分成N段，N为10～40之间的整数，优选地，N为16～38之间的整数，再优选地，N为20～35之间的整数，更优选地，N为24～35之间的整数。将各硅胶柱段检测，取含有所述指标成分中的至少一个且杂质含量小于50wt％的硅胶段，合并为第一目标段。优选地，杂质含量小于等于45wt％，更优选地，杂质含量小于等于40wt％，再优选地，杂质含量小于等于35wt％。所述杂质指的是除哈巴苷、安格洛苷C或哈巴俄苷之外的物质的总和。取其余的含有所述指标成分中至少一个的硅胶段，合并为第二目标段。用甲醇洗脱第一目标段，得到第一甲醇洗脱液，将第一甲醇洗脱液浓缩，干燥，得到玄参环烯醚萜对照提取物I。用甲醇洗脱第二目标段，得到第二甲醇洗脱液，将第二甲醇洗脱液浓缩，干燥，得到玄参环烯醚萜对照提取物中间体。这样有利于提高玄参环烯醚萜对照提取物I中的哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量。在本发明中，所述检测方法可以为高效液相色谱法或者薄层色谱和高效液相色谱配合使用。比如先用薄层色谱检测，粗略定出杂质含量较少的各段，然后采用高效液相色谱进行含量分析。这样更准确。
根据本发明的一个具体实施方式，将洗脱后的第一硅胶柱沿柱头到底部的方向平均分成24段；将各硅胶柱段检测，取含有所述指标成分中的至少一个且杂质含量小于50wt％的硅胶段，合并为第一目标段。取其余的含有所述指标成分中至少一个的硅胶段，合并为第二目标段，分别用甲醇洗脱第一目标段和第二目标段，分别得到第一甲醇洗脱液和第二甲醇洗脱液，分别将第一甲醇洗脱液和第二甲醇洗脱液浓缩，干燥，分别得玄参环烯醚萜对照提取物I和玄参环烯醚萜对照提取物中间体。
根据本发明的另一个具体实施方式，将洗脱后的第一硅胶柱沿柱头到底部的方向平均分成30段；将各硅胶柱段检测，取含有所述指标成分中的至少一个且杂质含量小于35wt％的硅胶段，合并为第一目标段。取其余的含有所述指标成分中至少一个的硅胶段，合并为第二目标段，分别用甲醇洗脱第一目标段和第二目标段，分别得到第一甲醇洗脱液和第二甲醇洗脱液，分别将第一甲醇洗脱液和第二甲醇洗脱液浓缩，干燥，分别得玄参环烯醚萜对照提取物I和玄参环烯醚萜对照提取物中间体。
采用本发明的制备方法所得玄参环烯醚萜对照提取物I中，哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量的总含量大于60wt％，优选为大于62wt％，更优选为大于64wt％；且具有较高的转移率，转移率大于55％。
＜玄参环烯醚萜对照提取物II的制备步骤＞
将上述玄参环烯醚萜对照提取物中间体采用干法上样于第二硅胶柱。
具体地，将玄参环烯醚萜对照提取物中间体直接用甲醇配制为0.08～0.13g/mL的玄参环烯醚萜对照提取物中间体甲醇溶液，并与空白硅胶混合，得到第二拌样硅胶。将第二拌样硅胶上样于第二硅胶柱中。空白硅胶的粒径为200～300目。
第二拌样硅胶中玄参环烯醚萜对照提取物中间体与拌样中的空白硅胶的质量比为1:1.75～2.5，优选为1:1.75～2.3，更优选为1:2～2.2。第二硅胶柱的径高比为1:9～11，优选为1:10～11，更优选为1:10。第二拌样硅胶中玄参环烯醚萜对照提取物中间体与第二硅胶柱中空白硅胶的重量比为1:45～52，优选为1:47～52，更优选为1:48～50。这样有利于提高玄参环烯醚萜对照提取物II中的哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量。
在本发明中，采用体积比为4.8～5.2:1:0.1的二氯甲烷、甲醇和水的混合溶液作为第二洗脱剂洗脱，得到洗脱后的第二硅胶柱。优选地，第二洗脱剂中，二氯甲烷、甲醇和水的体积比为4.9～5.2:1:0.1。更优选地，第二氯甲烷、甲醇和水的体积比为5～5.1:1:0.1。第二洗脱剂的用量为1.5～2.5BV，优选为1.5～2.0BV，更优选为1.7～1.9BV，再优选为1.75～1.85BV。本发明经过大量研究和实验发现，采用特定的第二洗脱剂可以提高玄参环烯醚萜对照提取物II中的哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量。
将洗脱后的第二硅胶柱沿柱头到底部的方向平均分成M段，M为10～25之间的整数，优选地，M为15～25之间的整数，更优选地，M为18～23之间的整数。将各硅胶柱段检测，取含有所述指标成分中至少一个的硅胶段，合并为第三目标段，用甲醇洗脱，并浓缩，干燥，得玄参环烯醚萜对照提取物II。
在本发明中，柱头指的是上样端；用甲醇洗脱各目标段时，可以直接将各硅胶段打散了直接用甲醇洗脱。
采用本发明的制备方法所得玄参环烯醚萜对照提取物II中，哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量的总含量大于64wt％，优选为大于65wt％，更优选为大于66wt％。
＜玄参环烯醚萜对照提取物的制备步骤＞
将玄参环烯醚萜对照提取物I和玄参环烯醚萜对照提取物II混合，得玄参环烯醚萜对照提取物。
采用本发明的制备方法所得玄参环烯醚萜对照提取物中，哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量大于60wt％，优选为大于62wt％，更优选为大于65wt％，且得率可达0.50％以上。
得率的计算公式＝所得玄参环烯醚萜对照提取物的重量/相应所用玄参药材的重量×100％。
并且，本发明的制备方法工艺较稳定，重现性好。
在本发明中，玄参环烯醚萜对照提取物中，哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷通过与标准对照品的出峰时间对比进行确认。
＜玄参环烯醚萜对照提取物＞
本发明还提供采用上述制备方法制得的玄参环烯醚萜对照提取物。该对照提取物含有较高总含量的哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷。在玄参环烯醚萜对照提取物中，所述三种化合物的总含量大于60wt％，优选为大于62wt％，更优选为大于65wt％。
根据本发明的玄参环烯醚萜对照提取物，其中哈巴苷的含量为27～43wt％；安格洛苷C的含量为13～25wt％；哈巴俄苷的含量为4～16wt％。本发明发现，由于原料玄参药材的来源不同，其中三个目标组分的含量会有区别。
本发明的玄参环烯醚萜对照提取物包含上述三种结构明确且含量确切的成分，纯度较高，指标成分含量稳定，可以实现同时对三个组分进行定性和定量分析，且制备成本远低于上述三个指标成分单体对照品的总和。
＜玄参环烯醚萜对照提取物的用途＞
本发明还提供所述玄参环烯醚萜对照提取物用于控制玄参药材和/或含玄参的中药复方的质量的用途。所述用途包括以哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷这三种含量已知的玄参环烯醚萜对照提取物为对照，对玄参药材中哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的含量进行测定，或对含玄参的中药复方中的哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的含量进行测定。
所述玄参环烯醚萜对照提取物可以预先以哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷对照品为对照进行含量标定，以确定所述玄参环烯醚萜对照提取物中哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的含量。可以同时对多个批次的玄参环烯醚萜对照提取物进行标定。
以下通过具体实施例对本发明进行详细说明。
以下实施例和对比例中，玄参粗提取物和终产品(玄参环烯醚萜对照提取物)等供试品中的哈巴苷、安格洛苷和哈巴俄苷的含量测定方法如下：
1.色谱条件
色谱柱：Agilent Extend C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.03％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱条件：0～10min，5％(A)；10～20min，5％～23％(A)；20～23min，23％(A)；23～28min，23％～28％(A)；28～34min，28％～33％(A)；34～39min，33％～50％(A)。流速：1.0mL/min；检测波长：210nm(哈巴苷)、280nm(哈巴俄苷)、330nm(安格洛苷C)；柱温：35℃；进样体积：20μL。
2.本发明中，转移率用于表征药材经过处理后，所得中间品/终产品中某类(个)成分的质量占药材中该类(个)成分的质量的百分比。
Figure BDA0002836219090000141
n1指中间品/终产品中某类(个)成分的质量，n2指药材中该类(个)成分的质量。
制备例1-玄参粗提取物的制备
采用水作为溶剂，加热回流提取法提取玄参药材100g，提取次数为2次，每次提取的水用量为玄参药材重量的10倍，每次提取时间为1小时，合并回流提取液，减压浓缩至相对密度为1.20，得到玄参水提液。
向玄参水提液内加入95vol％乙醇至乙醇浓度为80vol％，在4℃下冷藏24h，抽滤，减压浓缩，干燥，得玄参水提醇沉物。
将玄参水提醇沉物加水分散至浓度为0.1g/mL，上样于径高比为1:10的SP825大孔吸附树脂柱，树脂体积与上样液的体积比为3:1，吸附流速为2.4BV/h，然后依次用2BV的水，和5BV的60vol％乙醇洗脱，洗脱流速均为4.8BV/h，并收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到玄参粗提取物12.0g。玄参粗提取物中，哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷三个指标成分的总含量为19.5wt％。
实施例1-玄参环烯醚萜对照提取物I的制备
将制备例1的玄参粗提取物用50倍质量的甲醇超声溶解，离心分离，得到母液，将母液浓缩，得到浓度为0.1g/mL玄参粗提取物甲醇溶液，将该玄参粗提取物甲醇溶液与空白硅胶以质量比为1:2的比例混合，得到第一拌样硅胶。
将第一拌样硅胶上样于径高比为1:15的第一硅胶柱中(第一拌样硅胶中玄参粗提取物为3g，且与第一硅胶柱中所用空白硅胶的质量比为1:50)，然后用3.0BV的第一洗脱剂洗脱，得到洗脱后的第一硅胶柱；其中，所述第一洗脱剂为体积比为8:1:0.1的二氯甲烷、甲醇和水的混合溶液。
将洗脱后的第一硅胶柱沿柱头到底部的方向平均切割分成30段，将各硅胶柱段检测，取含有所述指标成分中的至少一个且杂质含量小于等于35wt％的各硅胶段(分别为第16、17、26、27段)合并，得到第一目标段；将其余的含有所述指标成分中至少一个的硅胶段(分别为第15、18、25、28段)合并，得到第二目标段；分别用甲醇洗脱第一目标段和第二目标段，分别得到第一甲醇洗脱液和第二甲醇洗脱液，分别将第一甲醇洗脱液和第二甲醇洗脱液浓缩和干燥，分别得到玄参环烯醚萜对照提取物I和玄参环烯醚萜对照提取物中间体。
对比例1
与实施例1的区别仅在于，所用第一洗脱剂为体积比为7:1:0.1的二氯甲烷、甲醇和水的混合溶液。得到玄参环烯醚萜对照提取物I。
对比例2
与实施例1的区别仅在于，所用第一洗脱剂为体积比为9:1:0.1的二氯甲烷、甲醇和水的混合溶液。得到玄参环烯醚萜对照提取物I。
对比例3
与实施例1的区别仅在于，所用第一洗脱剂为体积比为8:1:0.5的二氯甲烷、甲醇和水的混合溶液。得到玄参环烯醚萜对照提取物I。
对比例4
与实施例1的区别仅在于，所用第一洗脱剂为体积比为8:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液。得到玄参环烯醚萜对照提取物I。
对比例5
与实施例1的区别仅在于，所用第一洗脱剂为体积比为8:1.5:0.1的二氯甲烷、甲醇和水的混合溶液。得到玄参环烯醚萜对照提取物I。
实施例2-玄参环烯醚萜对照提取物I的制备
与实施例1的区别仅在于，所用第一洗脱剂的用量为2.8BV。
实施例3-玄参环烯醚萜对照提取物II的制备
将实施例1中的玄参环烯醚萜对照提取物中间体用10倍重量的甲醇溶解，并与空白硅胶以1:2的质量比混合，得到第二拌样硅胶，并将第二拌样硅胶采用干法上样于径高比为1:10的第二硅胶柱(玄参环烯醚萜对照提取物中间体与第二硅胶柱中空白硅胶的重量比为1:50)，用体积比为5:1:0.1的二氯甲烷、甲醇和水的混合溶液作为第二洗脱剂洗脱，得到洗脱后的第二硅胶柱；第二洗脱剂的用量为1.8BV；将洗脱后的第二硅胶柱沿柱头到底部的方向平均分成20段，然后取含有所述指标成分中至少一个的硅胶段(分别为第11、17、18段)，合并为第三目标段，用甲醇洗脱，并浓缩，干燥，得玄参环烯醚萜对照提取物II。
对比例6
与实施例1的区别仅在于，所用第二洗脱剂为体积比为5:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液。得到玄参环烯醚萜对照提取物II。
对比例7
与实施例1的区别仅在于，所用第二洗脱剂为体积比为5:1:0.5的二氯甲烷、甲醇与水的混合溶液。得到玄参环烯醚萜对照提取物II。
实施例5-玄参环烯醚萜对照提取物的制备
将实施例1和实施例3所得的玄参环烯醚萜对照提取物I和玄参环烯醚萜对照提取物II混合，得玄参环烯醚萜对照提取物。
实施例6～7-玄参环烯醚萜对照提取物的制备
与实施例5的区别仅在于，原料玄参药材的用量分别扩大至1kg和2.5kg。
将实施例1重复三次，分别得到玄参环烯醚萜对照提取物Ⅰ。分别测定实施例1和三次重复实验的产品中哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的含量，并计算哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量和转移率。结果见表1。
表1
Figure BDA0002836219090000181
由表1可知，本发明的玄参环烯醚萜对照提取物Ⅰ的制备工艺稳定，重现性好。
分别测定实施例2、对比例1～5的产品中哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的含量，并计算哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量和转移率。结果见表2。
表2
Figure BDA0002836219090000182
由表2可知，本发明采用特定的第一洗脱剂以及特定的切割方法可以提高玄参环烯醚萜对照提取物Ⅰ中的哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量。
分别测定实施例3、对比例6～7的产品中哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的含量，并计算哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量。结果见表3。
表3
Figure BDA0002836219090000191
由表3可知，本发明采用特定的第二洗脱剂可以提高玄参环烯醚萜对照提取物II中的哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量。从将玄参环烯醚萜对照提取物中间体再利用，减少资源浪费。
分别取同一批玄参环烯醚萜对照提取物中间体，重复实施例3的工艺，得到玄参环烯醚萜对照提取物Ⅱ，并计算哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量和转移率。结果见表4。
表4
Figure BDA0002836219090000192
由表4可知，本发明的玄参环烯醚萜对照提取物Ⅱ的制备工艺稳定，重现性好。
分别测定实施例5～7产品中哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的含量，并计算哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量和得率。结果见表5。
表5
Figure BDA0002836219090000201
由表5可知，采用本发明的制备方法所得的玄参环烯醚萜对照提取物含量均在60wt％以上，明显提高了三个指标成分的含量。而且，本发明的玄参环烯醚萜对照提取物的制备工艺稳定性好。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (7)

1.一种玄参环烯醚萜对照提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将玄参粗提取物采用干法上样于第一硅胶柱中，然后用第一洗脱剂洗脱，得到洗脱后的第一硅胶柱；其中，所述第一洗脱剂为体积比为7.5～8.2:1:0.1的二氯甲烷、甲醇和水的混合溶液；所述第一洗脱剂的用量为2.6～3.1BV；所述玄参粗提取物中，哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷三个指标成分的总含量小于20wt％；
(2)将洗脱后的第一硅胶柱沿柱头到底部的方向平均分成N段，N为10～40之间的整数；将各硅胶柱段检测，取含有所述指标成分中的至少一个且杂质含量小于50wt％的硅胶段，合并为第一目标段；取其余的含有所述指标成分中至少一个的硅胶段，合并为第二目标段，分别用甲醇洗脱第一目标段和第二目标段，分别得到第一甲醇洗脱液和第二甲醇洗脱液，并分别进行浓缩，干燥，分别得到玄参环烯醚萜对照提取物I和玄参环烯醚萜对照提取物中间体；玄参环烯醚萜对照提取物I中，哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量大于60wt％；
(3)将所述玄参环烯醚萜对照提取物中间体采用干法上样于第二硅胶柱，用体积比为4.8～5.2:1:0.1的二氯甲烷、甲醇和水的混合溶液作为第二洗脱剂洗脱，得到洗脱后的第二硅胶柱；第二洗脱剂的用量为1.5～2.5BV；将洗脱后的第二硅胶柱沿柱头到底部的方向平均分成M段，M为10～25之间的整数；将各硅胶柱段检测，取含有所述指标成分中至少一个的硅胶段，合并为第三目标段，用甲醇洗脱，并浓缩，干燥，得玄参环烯醚萜对照提取物II；玄参环烯醚萜对照提取物II中，哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷的总含量大于64wt％；
(4)将玄参环烯醚萜对照提取物I和玄参环烯醚萜对照提取物II混合，得玄参环烯醚萜对照提取物；玄参环烯醚萜对照提取物含有的哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷三个指标组分的总含量大于60wt％。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将所述玄参粗提取物用甲醇溶解，并固液分离，得到母液，将母液浓缩，得到浓度为0.05～0.25g/mL的玄参粗提取物甲醇溶液，与空白硅胶混合，得到第一拌样硅胶；将第一拌样硅胶上样于第一硅胶柱中；其中，第一拌样硅胶中玄参粗提取物与拌样中的空白硅胶的质量比为1:1.75～2.5；第一硅胶柱的径高比为1:13～15。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将玄参环烯醚萜对照提取物中间体配制为0.08～0.13g/mL的玄参环烯醚萜对照提取物中间体甲醇溶液，与空白硅胶混合，得到第二拌样硅胶；将第二拌样硅胶上样于第二硅胶柱中；其中，第二拌样硅胶中玄参环烯醚萜对照提取物中间体与拌样中的空白硅胶的质量比为1:1.75～2.5；第二硅胶柱的径高比为1:9～11。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述玄参粗提取物的制备方法包括以下步骤：
(a)将玄参药材用水回流提取2～3次，每次1～2h；每次用水量为所述玄参药材重量的9～12倍；将回流提取液合并浓缩至相对密度为1.18～1.22，得到玄参水提液；
(b)向玄参水提液内加入90～95vol％乙醇至乙醇浓度为77～83vol％，在0～6℃下冷藏12～36h，固液分离，浓缩，干燥，得玄参水提醇沉物；
(c)将玄参水提醇沉物加水分散至浓度为0.09～0.13g/mL，上样于大孔吸附树脂柱，然后依次用1.5～2.5BV的水，和4.5～5.5BV的55～65vol％乙醇洗脱，洗脱流速均为4.5～5.0BV/h，并收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得到玄参粗提取物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，大孔吸附树脂柱为SP825型大孔吸附树脂柱。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，N为24～35之间的整数。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，M为15～25之间的整数。
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