CN107337742A - 远东疣柄牛肝菌抗氧化多糖及其提取分离工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种远东疣柄牛肝菌抗氧化多糖的提取分离工艺，包括以下步骤：1）远东疣柄牛肝菌子实体经脱脂处理得到脱脂牛肝菌子实体粉；2）脱脂牛肝菌子实体粉采用热水浸提，水提物依次经浓缩、醇沉、除蛋白、除色素、透析后，干燥得到多糖粗品；3）分别采用离子交换层析、分子筛层析纯化多糖粗品，收集洗脱液，冷冻干燥即得远东疣柄牛肝菌抗氧化多糖。通过体外自由基清除能力实验，结果表明分子量342375 Da的多糖组分具有明显的抗氧化作用。本发明开发的产品安全，可将远东疣柄牛肝菌抗氧化多糖广泛作为食品添加剂。

Description

远东疣柄牛肝菌抗氧化多糖及其提取分离工艺
技术领域
本发明涉及食用菌中抗氧化物质及其提取工艺，具体地说，涉及远东疣柄牛肝菌抗氧化多糖及其提取分离工艺。
背景技术
自由基是生物体在新陈代谢过程中产生的一种中间代谢产物，与其他活性氧(ROS)一样存在动态平衡，但在体内存在过剩时便会引起氧化损伤，并伴随一些慢性疾病的产生(Liu et al.,2016)。除此之外，自由基还能够与机体中重要的生物大分子如DNA、蛋白质、碳水化合物等发生氧化损伤反应，会降低生物代谢反应和产生相关的疾病。最有效消除ROS的方法是使用抗氧化剂。但合成的抗氧化剂会影响机体的健康。所以通过饮食来消除ROS已成为一种较为安全的方法，同时也可以减少由氧化损伤而引起的疾病。因此，抗氧化剂的研究成为了生命科学硏究的热点，在保健医学、营养学上具有重要意义。经过科学实验研究，一些来自于食物中的多糖已被证明具有强大的抗氧化活性。多糖可通过直接或间接增强SOD酶的活性来清除自由基对机体的损伤，保护生物机体的正常运行。有很多学者通过实验验证了多糖的抗氧化性及清除自由基的能力，如野生牛肝菌的粗多糖提取物对·OH和O2·-均都表现出一定的清除效果(杜敏华等，2012)；点柄粘盖牛肝菌的粗多糖对·OH有很好的清除能力，且抗氧化性与多糖浓度呈一定的剂量效应(史振霞和吴智艳，2012)。
远东疣柄牛肝菌作为一种野生的、食用的、口感极佳的，且具有一定药用功效的珍稀野生真菌，受到大多数人们的喜爱，因此对其子实体中活性物质的研究有着重要的意义(王心诗，2015；史振霞和吴智艳，2012)。迄今为止，科学家对食用菌活性物质的研究主要集中在其多糖和多酚类化合物(Ruthes,2016)。邓百万等(2005)以多种食用野生牛肝菌为实验材料，主要研究了其营养成分的特点及功能，认为牛肝菌在食、药用领域具有较高的价值，且具有高优质的蛋白质、含量比较少的脂肪及较低的热量等优点；高锦明等在2003年以远东疣柄牛肝菌子实体为实验材料，共分离得到了13种化合物，并对这些化合物的活性成分进行体外筛选实验，结果显示筛选出的化合物对磷脂酶A2具有一定的选择性抑制作用，且作用效果比较显著；Choi(2011)从该种中获得15种化合物，这些化合物的类型主要是麦角甾醇类、脑苷脂类、核苷类和生物碱等；杨宁宁等(2014)采用Sephadex LH-20凝胶色谱柱层析和硅胶色谱柱层析研究该种子实体的化学成分，共分离鉴定出11种化合物。
尽管现在已有对远东疣柄牛肝菌化学成分进行研究的相关报道，但该种的多糖研究还未见报道，本发明以远东疣柄牛肝菌子实体为材料，对其抗氧化多糖的提取条件和工艺进行了优化。
发明内容
本发明的目的是提供远东疣柄牛肝菌抗氧化多糖及其提取分离工艺。
为了实现本发明目的，本发明的远东疣柄牛肝菌抗氧化多糖的提取分离工艺，包括以下步骤：
1)远东疣柄牛肝菌子实体经脱脂处理得到脱脂牛肝菌子实体粉；
2)脱脂牛肝菌子实体粉采用热水浸提，水提物依次经浓缩、醇沉、除蛋白、除色素、透析后，干燥得到多糖粗品；
3)分别采用离子交换层析、分子筛层析纯化多糖粗品，收集洗脱液，冷冻干燥即得远东疣柄牛肝菌抗氧化多糖。
热水浸提的最佳条件为：液料比按mL:g计为33:1，提取温度为75℃，提取时间为3h。
前述的工艺，步骤1)具体为：称取2g远东疣柄牛肝菌子实体，烘干，粉碎，过100目筛，加入4倍体积的80％乙醇，在60℃水浴锅中保温2h，3500rpm离心5min，取沉淀，于60℃水浴锅中蒸干得到脱脂牛肝菌子实体粉。前述的工艺，步骤3)进行离子交换层析、分子筛层析使用的层析柱分别为DEAE-52纤维素柱、Sephadex G-200凝胶柱，规格分别为2.6cm×60cm、1.6cm×80cm(直径×柱长)。
前述的工艺，步骤2)具体为：热水浸提的条件为：液料比按mL:g计为20-40:1，提取温度为55℃-95℃，提取时间为1-5h。
脱脂牛肝菌子实体粉经热水浸提后，3500rpm离心10min获得多糖上清液，用旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/3左右，于35-40℃加入4倍体积80％乙醇，4℃醇沉24h，3500rpm离心10-15min，取多糖上清液，将上清液与Sevage试剂(正丁醇:氯仿＝1:5)按1:1的体积比混合(除蛋白采用Sevage法)，3500rpm离心5min，取多糖上清液，按照1-5w/v％的比例向收集的上清液中加入活性炭(采用活性炭法除色素)，调节溶液pH至4.5左右，于40℃恒温水浴锅中水浴反应2h，过滤除掉活性炭，得到除色素后的多糖溶液；向多糖溶液中加入其4倍体积的无水乙醇，于4℃醇沉24h，然后3500rpm离心15min，收集多糖溶液的沉淀物，将沉淀物用适量无水乙醇洗涤3-4次，然后在冷冻烘干机中烘干得到粗多糖；将粗多糖用蒸馏水按料液比g:mL＝1:100-150进行复溶，复溶后釆用截留分子量8000-14000Da的透析袋流水透析3d(用细小水流的自来水流动透析)，然后将透析袋置于蒸馏水中透析2d，保证每隔3-5h换一次透析容器中的水；透析后，将透析袋内的多糖溶液干燥，即得多糖粗品。(注：透析袋应按照使用说明上的步骤提前进行处理，处理好后的透析袋可短暂保存在蒸馏水中，再次使用前应在沸水浴中煮沸10min便可使用)
本发明还提供由上述工艺制备的远东疣柄牛肝菌抗氧化多糖。经DEAE-52纤维素柱层析分离和Sephadex G-200凝胶柱层析纯化，共得到三个单一组分多糖，分别为LEP-1、LEP-2和LEP-3。通过自由基(·OH、DPPH·、O2-·)清除能力实验，结果表明LEP-2具有明显的抗氧化作用。
LEP-2的分子量为342375Da；单糖组成分析是由岩藻糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖6种单糖组成；各单糖对应的摩尔质量比分别为1.82:0.61:5.14:26:5.41:61.02。其中，甘露糖和葡萄糖的质量百分含量较高，分别为61.02％和26％。LEP-2中还含有糖醛酸。多糖中的化学键包括O-H、C-H、羰基C＝O对称及非对称区域、葡萄糖中特有的-OH变角振动区域、β-吡喃糖苷键。
本发明还提供所述抗氧化多糖在清除自由基(·OH、DPPH·、O2-·)中的应用。
本发明具有以下优点：
(一)采用热水浸提法提取远东疣柄牛肝菌的多糖，通过单因素实验与响应面分析法优化多糖的提取条件，确定远东疣柄牛肝菌多糖热水浸提的最适条件为液料比33:1(mL/g)，提取时间3h，提取温度75℃，在此条件下远东疣柄牛肝菌多糖的最佳得率是10.30％。
(二)通过体外自由基(·OH、DPPH·、O2-·)清除能力实验，结果表明分子量为342375Da的多糖组分具有明显的抗氧化作用，其对·OH、DPPH·、O2-·清除率分别达到88.80％、34.09％、31.65％。
(三)本发明开发的产品安全，可将远东疣柄牛肝菌抗氧化多糖广泛作为食品添加剂。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
图2、图3为本发明实施例1中Y＝f(A,B)的响应面与等值线。从图中提取温度(A)和液料比(B)二者之间曲面的关系可知，B对多糖得率的影响作用更大一些。且在接近曲面B的中心时，远东疣柄牛肝菌热水浸提的多糖得率达到最大值。
图4、图5为本发明实施例1中Y＝f(A,C)的响应面与等值线。从等高线图可知，等高线的形状越接近窄椭圆形，越能说明A(提取温度)、C(提取时间)这两种变量相互作用的效果越明显。且通过右图(3D图)可知，A、C的增长与多糖得率之间呈一定的线性增加关系。说明A、C均是影响多糖得率的重要因素。
图6、图7为本发明实施例1中Y＝f(B,C)的响应面与等值线。从等高线图可知，左图越近似于圆形，越能说明B(液料比)、C(提取时间)的相互作用越不显著。通过判断曲面斜率，可以得出：C对结果的影响更大。
图8为本发明实施例3中单糖标品PMP衍生物色谱图。其中，1.岩藻糖；2.鼠李糖；3.阿拉伯糖；4.氨基半乳糖；5.半乳糖；6.葡萄糖；7.木糖；8.甘露糖；9.果糖；10.核糖。
图9为本发明实施例3中LEP-2PMP衍生物色谱图。其中，1.岩藻糖；2.阿拉伯糖；3.半乳糖；4.葡萄糖；5.木糖；6.甘露糖。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行进一步说明。以下实施例中所使用的原料、试剂和仪器均可以通过购买市售产品的方式获得。
实施例1远东疣柄牛肝菌多糖提取与分离条件的优化
1、原材料预处理：称取2g远东疣柄牛肝菌子实体，烘干，粉碎，过100目筛，加入4倍体积的80％乙醇(w/v＝1:4)，在60℃水浴锅中水浴2h，3500rpm离心5min，取沉淀，于60℃水浴锅中蒸干得脱脂牛肝菌子实体粉，保存备用。
脱脂牛肝菌子实体粉经热水浸提后，3500rpm离心10min获得多糖上清液，用旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/3，于35-40℃加入4倍体积80％乙醇，4℃醇沉24h，3500rpm离心10-15min，取多糖上清液，将上清液与Sevage试剂(正丁醇:氯仿＝1:5)按1:1的体积比混合(除蛋白采用Sevage法)，3500rpm离心5min，取多糖上清液，按照1-5w/v％的比例向收集的上清液中加入活性炭(采用活性炭法除色素)，调节溶液pH至4.5左右，于40℃恒温水浴锅中水浴反应2h，过滤除掉活性炭，得到除色素后的多糖溶液；向多糖溶液中加入其4倍体积的无水乙醇，于4℃醇沉24h，然后3500rpm离心15min，收集多糖溶液的沉淀物，将沉淀物用1—2倍体积的无水乙醇洗涤3-4次，然后在冷冻烘干机中烘干得到粗多糖；将粗多糖用蒸馏水按料液比g:mL＝1:100-150进行复溶，复溶后釆用截留分子量8000-14000Da的透析袋流水透析3d(用细小水流的自来水流动透析)，然后将透析袋置于蒸馏水中透析2d，保证每隔3-5h换一次透析容器中的水；透析后，将透析袋内的多糖溶液干燥，即得多糖粗品。(注：透析袋应按照使用说明上的步骤提前进行处理，处理好后的透析袋可短暂保存在蒸馏水中，再次使用前应在沸水浴中煮沸10min便可使用)
3、响应面法优化提取条件：使用软件Design-Expert.V8.0.6设计实验过程，并根据Box-Benhnken中心组合的模型设计原理，在实验中选择三个自变量(具体数值及对应条件如表1所示)，采用3因素3水平共设计出17组实验(包括中心重复实验5组)，按照这些组数设计的组合条件进行试验，分别得出对应的多糖得率，在通过软件优化获得远东疣柄牛肝菌的热水浸提法提取多糖的条件。
表1响应面优化(RSM)实验设计表
响应面实验结果及模型的方差分析结果分别见表2、表3。
表2响应面BBD-试验设计与结果
表3模型的方差分析结果
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 Prob>F 显著性
回归模型 68.53 9 7.61 140.93 <0.0001 **
A-提取温度 20.83 1 20.83 385.61 <0.0001 **
B-液料比 0.75 1 0.75 13.89 0.0074 **
C-提取时间 2.81 1 2.81 51.98 0.0002 **
AB 0.11 1 0.11 1.96 0.2048
AC 0.0025 1 0.0025 0.046 0.8358
BC 1.08 1 1.08 20.02 0.0029 **
A2 10.92 1 10.92 202.2 <0.0001 **
B2 14.58 1 14.58 269.83 <0.0001 **
C2 12.94 1 12.94 239.56 <0.0001 **
残差 0.38 7 0.054
失拟项 0.25 3 0.082 2.5 0.1985 不显著
纯误差 0.13 4 0.033
总离差 68.91 16
Std.Dev. 0.23 R-Squared 0.9929
Mean 8.54 AdjR-Squared 0.9875
C.V.％ 2.72 PredR-Squared 0.9573
PRESS 2.94 Adeq Precision 34.931
注：**极显著(P<0.01)
模型方程的建立与显著性检验：
响应面法是在参数评估、对应变量和试验变量基础上运算的一种程序(Yan etal.,2009)。通过模型数据的运算及对试验数据的多元回归分析获得模型回归方程为：Y＝10.99+1.61A+0.31B+0.59C-0.16AB-0.025AC-0.52BC-1.61A2-1.86B2-1.75C2。且由表2-4可以读出：模型方程系数A、B、C、BC、A2、B2、C2的P值均都<0.01，代表极显著，说明模型真实有效可用。
从表3中所列的方差分析可以看出，模型的P<0.0001，说明所设计的热水浸提远东疣柄牛肝菌多糖的实验模型为极显著，可以用来评估实验结果；表中的失拟项(又可称之为拟合度)是用来解释模型的预测实验值与真实的实验结果值之间差异的一个指标。它的P值不显著，说明预测值与真实值之间拟合度较高，此模型可用于实验数据的分析。同时当模型分析中R-Squared的值越接近1，表明实验结果的真实值与模型给出的预测值之间的误差就越小。本模型中R-Squared＝0.9929，表明远东疣柄牛肝菌多糖的试验值和预测值之间的差异很小，即它们拟合的程度比较高。模型中的R2Adj＝0.9875，说明该模型能够较好地反映出98.75％的实验自变量与多糖得率之间的关系。具体分析的等高线图及三维响应面分析图如图2-图7所示。
响应面分析检验：
通过响应面模型分析，获得热水浸提法提取远东疣柄牛肝菌多糖的最佳提取条件为：液料比32.6:1、提取时间2.84h、提取温度74.7℃，预测其多糖得率为10.30％。考虑到实际操作的可行性及有效性，将参数稍加修改，得到结果为：液料比33:1(mg/L)、提取温度75℃、提取时间3h。此模型能够较好的反映实验因子对提取率的影响，为查验分析方法是否准确可用，通过试验验证测得多糖得率为9.98％，与理论值的偏差较小，说明该模型得到的试验参数与实际结果拟合的较好，能较好的说明试验因素与提取率的相互关系。
4、采用离子交换层析、分子筛层析纯化多糖粗品
经DEAE-52纤维素柱层析分离和Sephadex G-200凝胶柱层析纯化，共得到三个单一组分多糖，分别为LEP-1、LEP-2和LEP-3。
(1)DEAE-52纤维素纯化多糖：①装柱：采用湿法装柱(选用柱规格：2.6×60cm)，在填料装进柱时要保证少量多次，在洗脱溶液时采用下行的方式进行洗脱；②平衡：平衡的缓冲液选用蒸馏水或实验所用的洗脱溶液，平衡时间为1d左右，恒流泵控制流速为1.5mL/min；③上样：采用湿法上样，选择远东疣柄牛肝菌多糖浓度是0.3mg/mL，体积5mL(根据具体的实验情况适当调整多糖的浓度和体积，但要保证不要堵塞填料)；④洗脱：用0-0.5mol/L的NaCl溶液(实验前要进行预实验，确定NaCl溶液的一个大概浓度范围，保证能够洗脱出来多糖的不同组分)分别进行洗脱，洗脱时用恒流泵保证流速为1mL/min，且每管收集远东疣柄牛肝菌多糖溶液的量约为4mL；⑤检验：采用苯酚-硫酸法来检验多糖成分是否存在，直至检测不到远东疣柄牛肝菌多糖组分流出时才停止多糖洗脱；⑥除盐：将收集的远东疣柄牛肝菌多糖不同组分样品进行浓缩，通过透析袋+流水透析的方式除盐，除盐后的多糖进行冷冻干燥。
(2)Sephadex G-200纯化多糖：①采用填料湿法装柱(选取柱的规格：1.6×80cm；一定要少量多次，严防气泡的产生，一旦有气泡产生，就要重新装柱)，并采用下行的方式进行洗脱；②平衡：使用蒸馏水，平衡1d；③加样：溶液LEP-1、LEP-2和LEP-3，浓度均为为1mg/mL，体积为5mL，控制流动速度始终未为1mL/min；④洗脱：用蒸馏水洗脱，控制流动速度始终为0.5mL/min，每管收集4mL；⑤检验：苯酚-硫酸法。
通过计算得到LEP-1、LEP-2和LEP-3的回收率分别为16.7％、57.65％、6.63％，其中，LEP-2的量的回收量比较多，占3种组分总量的71.2％。
实施例2远东疣柄牛肝菌多糖LEP-2抗氧化活性的检测
1、清除·OH活性的测定：配制9mmol/L FeSO4(现用现配)，9mmol/L水杨酸-乙醇溶液，20mmol/L H2O2(Liu,2016)。按照表4依次加入各反应溶液，37℃反应1h，测OD510nm值，无样品的，记为A0；有样品，记为A1；无H2O2，记为A2；VC作为阳性对照。
·OH清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100
表4多糖的羟自由基清除能力测定
组分 A0 A1 A2
H2O2(mL) 0.1 0.1 0
FeSO4(mL) 0.1 0.1 0.1
水杨酸-乙醇(mL) 0.1 0.1 0.1
样品(mL) 0 1 1
蒸馏水(mL) 3 2 2.1
2、清除O2-·活性的测定：配制50mM的Tris-HCl(pH＝8.2)，0.05-1mg/mL的多糖溶液，25mM邻苯三酚溶液(Liu，2015)。按照表5加入反应溶液，25℃反应5min。用1mL 8mM的HCl终止反应。测OD420nm，无样品，记为A0；有样品，记为A1；无邻苯三酚溶液，记为A2；VC作为阳性对照。
O2-·清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100
表5超氧阴离子自由基的清除能力测定
组分 A0 A1 A2
Tris-HCl(mL) 5.9 4.5 4.9
样品(mL) 0 1 1
邻苯三酚(mL) 0.4 0.4 0
3、清除DPPH活性的测定:配制0.05-1mg/mL的LEPS、0.4mM的DPPH-甲醇溶液、蒸馏水(Liu 2015)。按照表6加入反应所需溶液，加液完成后，将混合液振荡混匀，且室温静置下30min，测OD517nm值，无样品，记为A0；有样品，记为A1；无DPPH，记为A2；VC作为阳性对照。
DPPH自由基清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100
表6多糖的DPPH的清除能力测定
组分 A0 A1 A2
DPPH(mL) 0.2 0.2 0
样品(mL) 0 1 1
蒸馏水(mL) 2.8 1.8 2.0
结果表明，分子量为342375Da的多糖组分LEP-2具有明显的抗氧化作用，其对·OH、DPPH·、O2-·清除率分别达到88.80％、34.09％、31.65％。
实施例3远东疣柄牛肝菌抗氧化多糖LEP-2的结构分析
1、单糖组分分析
⑴测定单糖组成的前处理：称取8.2mg纤维状LEP-2置于耐高温的玻璃管内，加入2mol/L的三氟乙酸(TFA)2mL，向里面吹N2，除尽玻璃管内的空气后迅速封口。在121℃(油浴锅)下水解2h。样液稀释50倍，进样。
⑵色谱条件条件：采用高效液相色谱法分析LEP-2的单糖组成，测OD250nm值；保持柱的温度始终为室温；且洗脱流速为0.5mL/min；流动相如下：
时间(min) 水(％) 250mM NaOH(％)
0 98 2.0
30 98 2.0
⑶单糖标准品的配制：实验中，将单糖标准品分别配置成浓度为3.85mg/L的溶液，备用。单糖包括：岩藻糖；鼠李糖；阿拉伯糖；氨基半乳糖；半乳糖(galactose)；葡萄糖；木糖；甘露糖；果糖；核糖。
单糖标品PMP及LEP-2PMP衍生物色谱图分别如图8、图9所示。
2、抗氧化多糖的红外光谱扫描
称取2mg LEP-2粉末+溴化钾(提前烘干)→研磨→压片，然后测定LEP-2的红外光谱：波长扫描范围400-4000cm-1，扫描次数：128次，分辨率4cm-1。
3、抗氧化多糖分子量的测定
采用高效凝胶过滤色谱法，色谱系统为Waters1525；色谱柱UltrahydrogelTMLinear，规格：300mm×7.8mm；流动相：0.1N硝酸钠；流速：0.9mL/min；柱温：30℃。
样品制备：称取50mg LEP-2，使用流动相(0.1N硝酸钠)配制2mg/mL的溶液。葡聚糖标准品校正分子量曲线，涉及使用的葡聚糖标准品如下：DextranT-2000(MW2000000)、DextranT-150(MW133850)、DextranT-40(MW36800)、DextranT-10(MW9750)、DextranT-5(MW2700)。
通过对LEP-2进行结构分析，其分子量为342375Da。单糖组成分析是由岩藻糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖6种单糖组成；各单糖对应的摩尔质量比分别为1.82:0.61:5.14:26:5.41:61.02。其中，甘露糖和葡萄糖的质量百分含量较高，分别为61.02％和26％。LEP-2中还含有糖醛酸。多糖中的化学键包括O-H、C-H、羰基C＝O对称及非对称区域、葡萄糖中特有的-OH变角振动区域、β-吡喃糖苷键。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而列举的较佳实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。
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Claims (7)

1.一种远东疣柄牛肝菌抗氧化多糖的提取分离工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1）远东疣柄牛肝菌子实体经脱脂处理得到脱脂牛肝菌子实体粉；
2）脱脂牛肝菌子实体粉采用热水浸提，水提物依次经浓缩、醇沉、除蛋白、除色素、透析后，干燥得到多糖粗品；
3）分别采用离子交换层析、分子筛层析纯化多糖粗品，收集洗脱液，冷冻干燥即得远东疣柄牛肝菌抗氧化多糖。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，步骤1）具体为：称取2g远东疣柄牛肝菌子实体，烘干，粉碎，过100目筛，加入4倍体积的80％乙醇，在60℃水浴锅中保温2 h，3500 rpm离心5 min，取沉淀，于60℃水浴锅中蒸干得到脱脂牛肝菌子实体粉。
3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，步骤2）具体为：热水浸提的条件为：液料比按mL:g计为33:1，提取温度为75℃，提取时间为3 h；脱脂牛肝菌子实体粉经热水浸提后，3500 rpm离心10 min获得多糖上清液，用旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/3，于35-40℃加入4倍体积80％乙醇，4℃醇沉24h，3500 rpm离心10-15 min，取多糖上清液，将上清液与Sevage试剂按1:1的体积比混合，3500 rpm离心5 min，取多糖上清液，按照1-5 w/v %的比例向收集的上清液中加入活性炭，调节溶液pH至4.5，于40℃恒温水浴锅中水浴反应2 h，过滤除掉活性炭，得到除色素后的多糖溶液；向多糖溶液中加入其4倍体积的无水乙醇，于4℃醇沉24h，然后3500 rpm离心15 min，收集多糖溶液的沉淀物，将沉淀物用适量无水乙醇洗涤3-4次，然后在冷冻烘干机中烘干得到粗多糖；将粗多糖用蒸馏水按料液比g:mL=1:100-150进行复溶，复溶后釆用截留分子量8000-14000 Da的透析袋流水透析3 d，然后将透析袋置于蒸馏水中透析2 d，保证每隔3-5 h换一次透析容器中的水；透析后，将透析袋内的多糖溶液干燥，即得多糖粗品。
4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，步骤3）进行离子交换层析、分子筛层析使用的层析柱分别为DEAE-52纤维素柱、Sephadex G-200凝胶柱，规格分别为2.6 cm×60 cm、1.6 cm×80 cm。
5.由权利要求1-5任一项所述工艺制备的远东疣柄牛肝菌抗氧化多糖。
6.根据权利要求6所述的抗氧化多糖，其特征在于，其分子量为342375 Da；含有岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖6种单糖，还含有糖醛酸；多糖中的化学键包括O-H、C-H、羰基C=O对称及非对称区域、葡萄糖中特有的-OH变角振动区域、β-吡喃糖苷键。
7.权利要求6或7所述抗氧化多糖在清除自由基中的应用。
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