CN114349878B - 一种黄精叶多糖及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄精叶多糖及其制备方法和用途，属于植物多糖领域，该多糖是提取自滇黄精、黄精或多花黄精的叶的一种或多种，该多糖分子量为44.7kDa，主要由六种单糖组成，摩尔比为：半乳糖35～41％，阿拉伯糖28～34％，葡萄糖21～25％，木糖2～5％，鼠李糖1～3％，甘露糖1～3％。该多糖可用于制备具有调节肠道菌群功能的保健食品或饮品。

Description

一种黄精叶多糖及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及植物多糖领域。

背景技术

中药黄精是中国著名的药食两用植物之一。《中国药典》2020版收载了滇黄精、黄精和多花黄精品种。古籍《名医别录》中记载黄精性味甘平，入脾、肾、肺经，具有补气养阴、润肺益肾等功能。现代研究也表明，黄精具有提高免疫、预防肿瘤、降低血糖和血脂等药理作用。多糖是黄精化学成分中的重要活性成分，具有降血脂血糖、提高免疫力、抗癌等功效。

到目前为止，国内外大多数的研究和开发应用主要着眼于黄精根部。关于黄精茎叶的多糖，则几乎没有研究以及文献报道。一般植物茎叶的多糖含量较根部低，难以提取纯度高的多糖，并且脱色困难。生产实践表明，采集一吨黄精根部药材会产生约400公斤茎叶的副产物，一般做丢弃处理，既浪费资源又污染环境。因此，为有效提高黄精药材的综合利用价值，获取更大的经济收益，对黄精茎叶的开发利用很有必要。在黄精茎叶中，茎的比重很低，并且多糖含量极低，所以本发明主要是对黄精叶的多糖进行提取。

申请号201110360706.5公开了一种从黄精茎叶中提取黄精多糖的方法，其工艺流程是原料精选、粉碎、超声提取、压滤、超滤、浓缩、层析、微滤分离、真空干燥，其有益效果是从黄精茎叶中提取黄精多糖，得到了一个新的提取来源，可使黄精多糖纯度的达75-95％。该发明的不足之处是所得的多糖没有经过脱色、脱蛋白和凝胶柱层析，为多种多糖混合物，纯度最高仅可能达到95％，也没有对所得多糖进行结构测定。本发明涉及的多糖经过脱色、脱蛋白、纤维素柱层析和凝胶柱层析，为单一纯净多糖，纯度实测为98％以上，并且对多糖的各个结构参数进行了测定描述，也对该多糖的生物活性进行了试验。

发明内容

为了解决现有技术当中的问题：

本发明的第一个目的在于公开了一种黄精叶多糖，是提取自滇黄精Polygonatumkingianum、黄精Polygonatum sibiricum或多花黄精Polygonatum cyrtonema的叶中的一种或多种。

本发明的多糖分子量为40～50kDa，由六种单糖组成，摩尔比为：半乳糖35～41％，阿拉伯糖28～34％，葡萄糖21～25％，木糖2～5％，鼠李糖1～3％，甘露糖1～3％。具体的摩尔比为：半乳糖38.91％，阿拉伯糖31.21％，葡萄糖23.24％，木糖3.21％，鼠李糖1.75％，甘露糖1.68％。以同样方法提取出的黄精根部的多糖，其单糖组成为甘露糖50.2％，葡萄糖39.7％，半乳糖5.3％，阿拉伯糖4.1％。可见黄精根部多糖与叶部多糖的单糖组成有较大的差异。

本发明的第二个目的，公开了该黄精叶多糖的制备方法，步骤如下：

(1)取干燥黄精茎叶，用水热提后醇沉，将沉淀脱色脱蛋白后得到粗多糖；

(2)粗多糖用DEAE纤维素层析柱纯化、不同梯度的NaCl溶液洗脱，收集多糖富集部分；

(3)多糖富集部分在Sephadex G交联葡聚糖凝胶柱上继续纯化，不同梯度的NaCl溶液洗脱，收集单峰组分，浓缩，得黄精叶多糖。

在脱色工艺研究中比较了十种脱色材料，确定脱色的具体步骤为：采用HPD-5000，NKA-9或DM130大孔树脂动态吸附，上样浓度为5～30mg/mL，上样量为4～8BV，流速为2～6BV/h。

在优选的方案中，脱色工艺的具体参数优选为：采用HPD-5000大孔树脂动态吸附，上样浓度为15mg/mL，上样量为6BV，流速为4BV/h。

在脱蛋白工艺研究中比较了三种脱蛋白方法，确定盐析法为最优方法，具体步骤为：取脱色后的黄精叶多糖溶液，进行盐析法脱蛋白，反应pH值8.0～9.0，CaCl₂浓度6％～10％，水浴温度60℃～80℃，水浴时间10min～30min。然后冷却到室温，稀HCl调节pH至7左右，离心，取上清液浓缩干燥即得。

在优选方案中，盐析法脱蛋白工艺的具体参数优选为：取脱色后的黄精叶多糖溶液，进行盐析法脱蛋白，反应pH值8.5，CaCl₂浓度8％，水浴温度70℃、水浴时间20min。然后冷却到室温，用稀HCl调节pH至7左右，离心，取上清液浓缩干燥即得。

在纤维素柱层析纯化工艺中，所用DEAE纤维素层析柱的填料包括但不限于DE-23、DE-32和DE-52，优选的方案为DE-52。

在葡聚糖凝胶柱层析纯化工艺中，所用Sephadex G交联葡聚糖凝胶柱的填料包括但不限于G-75、G-100和G-150，优选的方案为G-100。

本发明的第三个目的，公开了上述黄精叶多糖的用途，即公开了一种具有调节肠道菌群功能的保健食品，采用上述黄精叶多糖作为有效成份。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明所述黄精叶多糖是首次从中药黄精的叶中分离获得，是一种具有全新结构的多糖分子，并对脱色、脱蛋白、柱层析等提取纯化工艺进行了优化。其提取原料易得，工艺简单可行，制备成本低。所述黄精叶多糖可调节肠道菌群，调节体内短链脂肪酸含量，具有类似益生菌的活性，可作为保健食品的有效成分。

附图说明

图1脱色材料对比

图2脱色材料用量对比

图3脱色温度对比

图4脱色时间对比

图5脱色PH值对比

图6脱色最大上样浓度对比

图7脱色最大上样量对比

图8脱色洗脱流速对比

图9 Sevage法脱蛋白效果

图10木瓜蛋白酶法脱蛋白效果

图11pH值对脱蛋白效果的影响

图12 CaCl2浓度对脱蛋白效果的影响

图13温度对脱蛋白效果的影响

图14时间对脱蛋白效果的影响

图15黄精叶多糖HYP-2s的紫外光谱

图16黄精叶多糖HYP-2s的分子量标准曲线

图17黄精叶多糖HYP-2s的高效凝胶渗透色谱洗脱曲线

图18黄精叶多糖HYP-2s的单糖组分分析

图19高碘酸钠标准曲线

图20黄精叶多糖HYP-2s的傅立叶-红外光谱图

图21黄精叶多糖HYP-2s的三螺旋结构分析

具体实施方式

下面对本发明作详细的说明。

实施例1黄精叶粗多糖的提取。

将滇黄精Polygonatum kingianum、黄精Polygonatum sibiricum或多花黄精Polygonatum cyrtonema的叶的一种或多种干燥粉碎，加入一定量蒸馏水充分浸泡后热提，提取温度75℃、提取时间2.5h、液料比15:1(L/kg)；过滤，滤液浓缩至相对比重1.10，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，放4℃冷库静置24h，离心收集沉淀，干燥，制得黄精叶粗多糖。

实施例2黄精叶粗多糖的精制

2.1黄精叶粗多糖的脱色

2.1.1测定计算方法

2.1.1.1脱色率计算：

A₁表示脱色前黄精叶多糖溶液在最大吸收波长(490nm)处测得的吸光度。

A₂表示脱色后黄精叶多糖溶液在最大吸收波长(490nm)处测得的吸光度。

2.1.1.2多糖保留率计算：参照2020版《中国药典》采用蒽酮-硫酸法进行测定，在582nm处测定吸光值计算多糖浓度，再按公式2计算多糖保留率。

M₁表示脱色后的多糖含量，M₂表示脱色前的多糖含量。

2.1.2脱色材料选取

选取十种脱色材料进行考察。按照相同比例分别向锥形瓶中加入不同脱色材料和黄精叶粗多糖。150r/min震荡4h，取上清液测定多糖脱色率和保留率，重复三次，实验结果见图1。综合分析，10种脱色材料中，HPD-5000大孔树脂对色素吸附能力最强，且多糖的损失率较低。脱色率76.61％±2.59，多糖损失率为17.39％±1.46。所以选择HPD-5000大孔树脂为最优脱色材料做进一步的脱色，NKA-9和DM130大孔树脂可做为次优选择。

2.1.3静态脱色试验

2.1.3.1脱色材料用量对比

分别向锥形瓶中加入吸附材料HPD-5000和黄精叶粗多糖溶液，体积比分别为1:20、1:10、2:10、3:10、4:10、5:10，调节pH＝6，30℃下震荡40min，取上清液测定黄精叶粗多糖脱色率和多糖保留率，重复三次，结果如图2所示。随着HPD-5000大孔树脂用量的増加，粗多糖的脱色率随之增大，当体积比大于3：10时，脱色率上升趋势不明显。因此，当大孔树脂HPD-5000与粗多糖溶液比例为3:10时，粗多糖的脱色率为76.23％±2.19，粗多糖损失率为15.48％±1.46，此时对黄精叶粗多糖中的色素有最佳的脱色效果。

2.1.3.2脱色温度对比

向锥形瓶中加入体积比为3:10的大孔树脂HPD-5000和黄精叶粗多糖溶液，调节pH＝6，脱色温度分别设为：15℃、30℃、45℃、60℃、75℃，震荡40min，取上清液测定脱色率和多糖保留率，重复三次，结果如表图3所示，随着温度的升高，HPD-5000树脂脱色效果差异不显著，结合脱色率、多糖保留率和操作方便性综合分析，脱色温度选择为30℃，此时多糖的脱色率为76.46％±2.25，多糖损失率14.59％±1.08。

2.1.3.3脱色时间对比

向锥形瓶中加入比例为3:10的大孔树脂HPD-5000和黄精叶粗多糖溶液，调节pH＝6，温度设定30℃，分别震荡20min、40min、60min、80min、100min、120min，取上清液测定色素脱除率和多糖损失率，重复三次，结果如图4所示。随着脱色时间的延长，脱色率增大，脱色时间达40min后，脱色效果不显著，此时色素的脱除基本达到了动态平衡。因此，脱色时间选择40min，多糖的脱色率为75.41％±1.91，多糖损失率14.7％±1.39。

2.1.3.4脱色PH值对比

向锥形瓶中加入比例为3:10的大孔树脂HPD-5000和粗多糖提取液溶液，pH值分别调节为3、4、5、6、7、8、9，温度设定30℃，震荡40min，取上清液测定色素脱除率和多糖的损失率，重复三次结，结果如图5所示。随着pH值不断増大，HPD-5000大孔树脂的脱色率是先上升后下降，脱色率在pH值为4-6时基本稳定，pH值为5时多糖的脱色率为77.87％±1.98，多糖损失率为9.42％±1.46。

2.1.3.5结论

综上，树脂的用量、脱色的温度、时间以及pH值等都对黄精叶粗多糖的脱色率有一定影响，因此选择上述各单因素中最优的工艺条件进行粗多糖脱色静态优化实验，即树脂HPD-5000用量选择3g/10mL、脱色温度30℃、脱色时间40min、pH值为5，此条件下，黄精叶粗多糖的脱色率为79.23％±1.67，多糖损失率为11.56％±1.99，优于其他单因素试验结果。

2.1.4动态洗脱试验

2.1.4.1最大上样浓度对比

将HPD-5000大孔树脂装柱，室温，调节pH＝5，将不同浓度(5mg/mL、15mg/mL、30mg/mL、45mg/mL、60mg/mL)的黄精叶粗多糖溶液，分别以6BV上柱，流速控制6BV/h，考察粗多糖溶液的上样浓度对脱色率和多糖保留率的影响，重复三次，结果如图6所示。当上样浓度大于30mg/mL时，脱色率及多糖保留率下降较快，故选择5～30mg/mL的上样浓度较为合适，最优选为15mg/mL。

2.1.4.2最大上样量对比

将HPD-5000大孔树脂装柱，室温，调节pH＝5条件下，上样量(2BV、4BV、6BV、8BV、10BV、12BV、14BV)，15mg/mL上柱，流速为6BV/h，考察不同上样量对脱色率和多糖保留率的影响，结果如图7所示，当上样量大于8BV时，脱色率及多糖保留率下降较快，故选择4～8BV的上样量较为合适，最优选为6BV。

2.1.4.3洗脱流速对比

将HPD-5000大孔树脂装柱，室温，调节pH＝5条件下，上样量8BV，15mg/mL上柱，流速为(2BV/h、4BV/h、6BV/h、8BV/h、10BV/h、12BV/h、14BV/h)，考察不同流速对脱色率和多糖保留率的影响，结果如图8所示，当流速大于6BV/h时，脱色率及多糖保留率下降较快，故选择2～6BV/h的流速较为合适，最优选为4BV/h。

2.1.4.4结论

黄精叶多糖的上样浓度、上样量和上样流速等都对黄精叶粗多糖的脱色效果有一定影响，大孔树脂HPD-5000动态脱色的优选条件为：上样浓度5～30mg/mL、上样量4～8BV、上样流速2～6BV/h，最优的条件为上样浓度15mg/mL、上样量6BV、上样流速4BV/h。在此最优脱色条件下黄精粗多糖的脱色率为81.78％±1.97，多糖损失率为11.83％±1.75。

2.2黄精叶粗多糖的脱蛋白

2.2.1测定计算方法

2.2.1.1溶液的配制

(1)酸性染色液：精密称取100mg考马斯亮蓝G-250，用50mL 95％乙醇溶解，再加入85％磷酸溶液100mL，加蒸馏水定容至1L容量瓶，混匀。得考马斯亮蓝染色液。

(2)蛋白质标准液：分别准确5mg牛血清蛋白，加入蒸馏水溶解，定容至5mL的容量瓶，吸取定容好的溶液1mL，用蒸馏水稀释定容到10mL容量瓶，制成0.1mg/mL标准液，备用。

(3)多糖样品溶液：称取一定量多糖，加蒸馏水配至浓度为2mg/mL，备用。

2.2.1.2标准曲线的绘制

精密吸取标准液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL和1.0mL于干净的具塞试管中，分别加蒸馏水至1.0mL，混匀后加入5mL配置好的考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，室温静置10min，在595nm处测定吸光值。每组试验重复三次，求其平均值，以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值值为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为y＝5.3214x+0.0088(R²＝0.9992)。

2.2.1.3蛋白质含量的测定

精确吸取待测溶液1.0mL，加入G-250溶液5.0mL，摇匀，室温静置10min后测定，根据公式3进行计算。

式中:c—待测液中蛋白含量μg/mL；

V—待测溶液总量mL；

D—样品稀释倍数；

M—样品质量g

2.2.1.4蛋白脱除率计算

根据公式4进行计算

B₁为脱蛋白前黄精叶多糖溶液中的蛋白质含量。

B₂为脱蛋白后黄精叶多糖溶液中的蛋白质含量。

2.2.1.5多糖保留率计算

参照本实施例中2.1.1.2方法进行测定计算。

2.2.2Sevage法脱蛋白

由图9可知，采用Sevage法脱蛋白时，随着脱蛋白次数的增加，蛋白质脱除率呈现逐步增加的趋势，同时也会出现多糖损失率加大，保留率下降，Sevage试剂毒性大等缺点，试剂的残留不利于后期活性分析。当洗脱次数为4次时，蛋白脱除率基本稳定，达到57.64％±1.99，多糖损失率为35.48％±1.39。

2.2.3木瓜蛋白酶法脱蛋白

由图10可知，木瓜蛋白酶法脱蛋白时，随着反应溶液pH值的增大，蛋白脱除率呈现先增加后减小的趋势，但普遍偏低，这可能与外添加的酶有干扰有关，并且多糖的损失率也随着pH值的增加而提高，这可能与木瓜蛋白酶在不同pH值下活力不同有关。当pH值为5左右时，蛋白脱除率为18.50％±1.14，多糖损失率为20.11％±1.32。

2.2.4盐析法脱蛋白

2.2.4.1 pH值对脱蛋白效果的影响

固定水浴温度80℃，加入8％的CaCl₂粉末，水浴时间20min，考察不同pH值对蛋白脱除率及多糖保留率的影响。由图11可知，盐析法脱蛋白时，随着反应溶液pH值的增大，蛋白脱除率呈现先增加后趋于稳定的趋势，且效果较好，多糖的损失率随着pH值的增加而呈现先增加后减小的趋势。综合分析选择pH值8～9较为合适，最优选为PH值8.5，此条件下蛋白脱除率为82.68％±1.41，多糖损失率率为15.00％±1.12。

2.2.4.2 CaCl₂浓度对脱蛋白效果的影响

固定pH值为8.5，水浴温度80℃，水浴时间20min，考察不同浓度的CaCl₂对蛋白脱除率及多糖保留率的影响。由图12可知，盐析法脱蛋白时，随着CaCl₂比例的增大，蛋白脱除率呈现先增加后趋于稳定的趋势，多糖的损失率呈现先增加后减小的趋势。综合分析选择浓度为6～10％的CaCl₂较为合适，最优选为CaCl₂浓度8％，此条件下蛋白脱除率为79.80％±1.39，多糖损失率为15.83％±1.26。

2.2.4.3温度对脱蛋白效果的影响

固定pH值为8.5，溶液中CaCl₂浓度为8％，水浴时间20min，考察不同水浴温度对蛋白脱除率及多糖保留率的影响。由图13可知，盐析法脱蛋白时，随着水浴温度的增加，蛋白脱除率呈现先增加后减小的趋势，多糖的损失率呈现先增加后减小的趋势。综合分析选择温度为60～80℃较为合适，最优选为温度70℃，此条件下，蛋白脱除率为83.72％±1.10，多糖损失率为15.84％±1.40。

2.2.4.4时间对脱蛋白效果的影响

固定pH为8.5，溶液中CaCl₂浓度为8％，水浴温度70℃，考察不同水浴时间对蛋白脱除率及多糖保留率的影响。由图14可知，盐析法脱蛋白时，随着水浴时间的增加，蛋白脱除率呈现逐步减小的趋势，多糖的损失率呈现逐步减小的趋势。综合分析选择水浴时间为10～30min较为合适，最优选为水浴时间20min，此条件下蛋白脱除率为83.5％±1.43，多糖损失率为12.77％±1.35。

2.2.5结论

该黄精叶多糖选择盐析法脱蛋白为目前最佳方法，盐析法脱蛋白的优选条件为：pH值8～9，CaCl₂浓度6～10％，温度60～80℃，时间10～30min。最优条件为：pH为8.5，CaCl₂浓度8％，温度70℃，时间20min。在此最佳工艺条件下，蛋白质脱除率为86.98％±1.54，多糖的损失率为12.17％±1.87。

本实施例还公开了一种黄精叶多糖的精制方法，按照本实施例所述的方法进行脱色和脱蛋白，制得较高含量的黄精叶总多糖。

实施例3黄精叶多糖的纯化

3.1 DEAE纤维素柱层析

预试验中DE-23、DE-32和DE-52都是纤维素柱层析填料的较优选择，其中以DE-52最优。先用蒸馏水浸泡DE-52纤维素，4℃下静置12h，然后进行多次重复洗涤，直至pH维持在7左右。层析柱中注入DEAE-52液，让其自然沉降直到所需高度为止，观察是否有气泡，用洗脱液进行平衡从而使层析床稳定。称量10.0g脱蛋白后的黄精叶多糖待测样品，制备成浓度为0.2g/mL水溶液后上样。随后用蒸馏水和0.1mol/L、0.5mol/L的NaCl溶液依次行洗脱，调节洗脱液流速为1.0mL/min，每50ml收集一管，以硫酸苯酚法测定每管的多糖含量。根据检测结果绘制洗脱曲线，根据曲线分别汇集不同组分，将其透析后进行冻干处理，获得黄精叶混合多糖组分HYP-2。

3.2 Sephadex G葡聚糖凝胶柱层析

预试验中G-75、G-100和G-150都是葡聚糖凝胶柱层析填料的较优选择，其中以G-100最优。取一定量G-10，加20倍蒸馏水充分浸泡，再用蒸馏水反复冲洗去除悬浮杂质，去除气泡备用。层析柱固定好后沿柱壁缓慢倒入脱气后的柱料，等到柱料高度不再变化后，加入蒸馏水压柱12h至平衡。将纤维素柱层析收集的组分HYP-2，配制成5mg/mL的溶液上样，洗脱液依次用蒸馏水、0.1mol/L的NaCl洗脱，流速0.5mL/min，每5min收集一管。收集主峰洗脱液，浓缩，透析，冻干，得到纯净多糖HYP-2s，室温干燥保存。

本实施例还公开了一种黄精叶多糖的纯化方法，按照本实施例所述的方法进行纤维素柱层析和葡聚糖凝胶柱层析，制得黄精叶纯多糖HYP-2s。

实施例4黄精叶多糖HYP-2s的结构测定

4.1紫外光谱分析

如图15所示，HYP-2s在波长为260nm和280nm时没有吸收峰，说明除杂后得到的多糖没有核酸、蛋白质等杂质。

4.2相对分子量分析

以色谱出峰保留时间(tR)为横坐标，以葡聚糖标准品的平均分子量对数值(LgMw)为纵坐标进行线性回归，得到回归方程LgMw＝-0.0419tR+6.7251(R2＝0.9965)，见图16。

采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)对HYP-2s的分子量进行检测。如图17所示HYP-2s的分子量分布显示为相对单一且对称的单峰，纯度在98％以上，根据公式计算可得HYP-2s的分子量为44668Da(44.7kDa)，重复实验中按同样工艺提取的黄精叶多糖的分子量为40～50kDa。

4.3单糖组分分析

HYP-2s的GC图谱有6个峰，通过与单糖标准品的GC图谱对比知，组成HYP-2s的单糖为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，见图18，经计算，摩尔比为：1.75:31.21:3.21:1.68:23.24:38.91。重复实验中按同样工艺提取的黄精叶多糖的摩尔比为：半乳糖35～41％，阿拉伯糖28～34％，葡萄糖21～25％，木糖2～5％，鼠李糖1～3％，甘露糖1～3％。

结果如下表所示：

表1 HYP-2s的单糖组成及摩尔比

以同样方法提取纯化出的黄精根部多糖，其单糖组成为甘露糖50.2％，葡萄糖39.7％，半乳糖5.3％，阿拉伯糖4.1％。可见黄精根部多糖与本发明所述的黄精叶多糖的单糖组成有很大差异。

4.4高碘酸氧化结果与分析

黄精叶多糖HYP-2s经过高碘酸氧化后，其结果见表2。HYP-2s在氧化60h后吸光值相对稳定。将吸光值代入高碘酸钠标准曲线(图19)，计算得到高碘酸的消耗量。结果如下：

高碘酸耗量与己糖的摩尔比为1.86:1，说明1mol的己糖残基需要消耗1.86mol高碘酸，在反应液中加入NaOH溶液，发现有甲酸的产生，说明多糖的结构中存在1→、1→6键型；并且高碘酸的消耗量要超出生成甲酸的2倍以上，说明结构中可能有1→2、1→4、1→3、1→4,6等键的存在；反应体系中，每当反应1mol的己糖残基就会产生0.253mol的甲酸，这说明每10个己糖残基平均有2.53个非还原末端或者是1→6糖苷键存在。

表2 HYP-2s高碘酸氧化结果

4.5Smith降解结果分析

HYP-2s采用高碘酸氧化产物后用NaBH₄还原的Smith降解法对其结构解析分析。HYP-2s经过Smith降解、透析、冻干、离心等步骤共得到4个部分：完全水解(A)、袋外部分(B)、袋内上清(C)、袋内沉淀(D)，GC-MS分析后，结果见表3。

在HYP-2s中：可以从完全水解液中检测出Gly，说明Gly不能够高碘酸氧化，进一步推测其连接键的类型可能是1→，1→2，1→2,6糖苷键。在透析袋外部分(B)及袋内上清液(C)可以检测出Gly、Ery、Ara、Glc和Gal，说明Gly、Ery、Ara、Glc和Gal同样不能够被高碘酸氧化，推测其连接方式可能位于支链或位于主链末端，或是一些间隔排列在能被高碘酸氧化的键型之间，推测其连接键的类型可能是1→4，1→2，1→2,6和1→3等糖苷键。

表3 Smith降解结果

4.6 HYP-2s傅立叶-红外光谱结果与分析

从图20中可以看出，HYP-2s的红外吸收光谱具有典型的多糖特征吸收峰，在3446.55cm^-1处有一条较宽的吸收峰是–OH的伸缩振动吸收峰；在3000cm^-1～2800cm^-1(2931.60cm^-1)范围内的吸收峰是由C-H的伸缩振动和弯曲振动引起的；1635.52cm^-1处的吸收峰为C＝O伸缩振动引起的；1419.51cm^-1处的吸收峰为C-H变角振动，具有典型的多糖特性。在1616cm^-1处的峰中没有-NH₂和-NH₃+的特征吸收峰，说明没有蛋白质多糖峰，这与紫外光谱扫描结果一致。1280.65cm^-1出现了羧基中O-H弯曲振动峰；1027.98cm^-1是C-O-C在吡喃糖环上的不对称吸收峰；891.41cm^-1处的吸收峰表明HYP-2s中的糖苷键为β构型。

4.7 HYP-2s刚果红实验结果与分析

如图21所示，以纯刚果红溶液为空白对照，当NaOH浓度增加时，刚果红溶液的最大值逐渐下降并稳定。当NaOH浓度为0～0.3mol/L时，HYP-2s-刚果红络合物的λmax先减小后逐渐增大，当NaOH浓度大于0.3mol/L时，HYP-2s-刚果红络合物的λmax逐渐减小，发生红移，说明HYP-2s含有三股螺旋结构。

实施例5黄精叶多糖HYP-2s的调节肠道菌群的生物活性。

5.1动物试验

12只雄性昆明小鼠(体重20±2g，西南医科大学动物中心)。在相对湿度60±10％和温度23±2℃的条件下，将小鼠置于12h明暗循环的房间里喂养。饲养7天后，小鼠随机分为两组，每组6只：(1)对照组，小鼠每天喂养1次，提供与实验组供样相同体积的蒸馏水；(2)实验组，每天喂HYP-2s(200mg/kg)1次。观察小鼠的活力和精神状态，并记录其体重。实验结束时收集小鼠粪便，冷冻保存样品，以备下一步分析。

5.2调节肠道菌群功能

从两组中选择6个样本进行高通量测序，共采集12个样本进行16S rRNA基因和生物信息学分析(测试单位：上海美吉生物医药科技有限公司)。结果显示，各组小鼠的肠道菌群主要为厚壁菌门、拟杆菌门、弯曲杆菌门和脱铁杆菌门，与对照组比较，HYP-2s增加了厚壁菌门类的相对丰度，但降低了拟杆菌门类的相对丰度。从属的水平上看，实验组小鼠的粪便中乳酸菌属类数量增加，毛螺菌属类和拟杆菌属类数量减少。

5.3对肠道菌群代谢产物短链脂肪酸的影响

肠道微生物群中存在许多代谢物，包括短链脂肪酸，对宿主代谢和免疫保护必不可少。

测定方法：短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸和异己酸)用气-质联用色谱测定。将25mg粪便样品放入2mL研磨管中，并加入0.5％磷酸500μL。用正丁醇(含内标2-乙基丁酸10μg/mL)进行低温超声萃取10分钟，在4℃下以13000×g离心5分钟，过0.22μm滤膜。安捷伦8890B-5977B GC/MSD为分析仪器，安捷伦HP FFAP毛细管柱为分析柱。

结果表明，粪便中的主要短链脂肪酸是乙酸、丙酸和丁酸。与对照组相比，差异有统计学意义。实验组的乙酸、丙酸和丁酸浓度为显著增加(P<0.05)。相比之下，戊酸、己酸和异己酸的浓度没有显著增加，异丁酸和异戊酸的浓度显著高于对照组。

本实施例还公开了一种黄精叶多糖在调节肠道菌群功能方面的应用，按照本实施例所述的黄精多糖HYP-2s具有积极的益生元活性，可用于制备具有调节肠道菌群功能的保健食品。

Claims (4)

1.一种黄精叶多糖，其特征在于，其提取自滇黄精、黄精或多花黄精的叶的一种或多种，由六种单糖组成，包括：半乳糖，阿拉伯糖，葡萄糖，木糖，鼠李糖和甘露糖；

其六种单糖的摩尔比为：半乳糖35～41％，阿拉伯糖28～34％，葡萄糖21～25％，木糖2～5％，鼠李糖1～3％，甘露糖1～3％；

其单一纯净多糖的纯度在98％以上；其分子量为40～50kDa；

所述的黄精叶多糖含有1→4，1→2，1→2,6和1→3糖苷键；

所述的黄精叶多糖含有三股螺旋结构；

所述的黄精叶多糖含有β-型糖苷键且含有吡喃环骨架；

所述的黄精叶多糖的制备包括如下步骤：

(1)将滇黄精、黄精或多花黄精的叶的一种或多种干燥粉碎，加入一定量蒸馏水充分浸泡后热提，提取温度75℃、提取时间2.5h、液料比15:1，过滤，滤液浓缩至相对比重1:10，加入4倍体积的无水乙醇醇沉，放4℃冷库静置24h，离心收集沉淀，干燥，将沉淀脱色脱蛋白后得到粗多糖；

(2)粗多糖用DEAE纤维素层析柱纯化，不同梯度的NaCl溶液洗脱，以苯酚硫酸法进行监测，收集多糖富集部分；

(3)多糖富集部分在Sephadex G交联葡聚糖凝胶柱上继续纯化，不同梯度的NaCl溶液洗脱，以高效液法进行相监测，收集单峰组分，浓缩冻干，即得纯多糖HYP-2s；

脱色的具体步骤为：采用HPD-5000大孔树脂动态吸附，上样浓度为15mg/mL，上样量为6BV，上样流速为4BV/h；

脱蛋白的具体步骤为：取脱色后的黄精叶多糖溶液，进行盐析法脱蛋白，反应pH值8.5，CaCl2浓度8％，水浴温度70℃，水浴时间20min，然后冷却到室温，稀HCl调节pH至7左右，离心，取上清液浓缩干燥即得。

2.根据权利要求1所述的黄精叶多糖，其特征在于：其提取工艺的步骤(2)中，所用DEAE纤维素层析柱的填料包括DE-23、DE-32和DE-52。

3.根据权利要求2所述的黄精叶多糖，其特征在于：其提取工艺的步骤(3)中，所用Sephadex G交联葡聚糖凝胶柱的填料包括G-75、G-100和G-150。

4.一种利用权利要求1～3任一项所述的黄精叶多糖制备的用于调节肠道菌群功能的保健食品或饮品。

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