CN115651090B - 一种富集乳酸杆菌的广陈皮多糖提取物的制备方法及应用 - Google Patents
一种富集乳酸杆菌的广陈皮多糖提取物的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种富集乳酸杆菌的广陈皮多糖提取物的制备方法及应用，涉及生物医药技术领域。该广陈皮多糖的制备方法，包括以下步骤：将经醇脱脂后的广陈皮按液固比15～50mL/g与水混合，超声辅助提取，醇沉得粗提物；对所述粗提物进行纯化处理，即得广陈皮多糖。通过该制备方法制备得到的广陈皮多糖能够有效抑制脂肪组织脂肪酸从头合成和β氧化信号通路，调节肠道菌群多样性与结构，促进肠道益生菌生长，尤其是在科、属、种水平上显著富集乳酸杆菌，从而改善高脂饮食引起的代谢综合征。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种富集乳酸杆菌的广陈皮多糖提取物的制备方法及应用。
背景技术
代谢综合征，如肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝等病症，已经成为威胁人类健康的重要问题。代谢紊乱的根本原因是由于长期摄入能量超过消耗能力，导致过剩能量以脂肪形式积累于体内。除了常规药物治疗之外，药食同源植物中具有调节糖、脂代谢功效的生物活性物质在预防或辅助治疗代谢综合征中也具有广阔的前景和重要科学意义。目前，代谢综合征的药物如降血糖、血脂类药物，通常只针对疾病表型症状，并无从根本上彻底解决根源问题，而且这些药物长期服用可能会引发肝、肾、骨等多器官副作用；此外，用于缓解代谢综合征的功能食品或生物制品中，往往价格昂贵，无法满足长期使用的需求。越来越多研究证据表明，肠道微生物群在代谢综合征发病机理中起着关键的作用。也有研究指出，利用膳食益生元或益生菌来调节肠道菌群组成可能是防治肥胖及相关代谢性疾病的有效方案。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种广陈皮多糖的制备方法，工艺简单，能够制备得到改善代谢综合征功效的广陈皮多糖提取物(PCRCP)。该多糖提取物可有效通过调节肠道菌群结构与多样性，尤其是选择性促进肠道益生菌乳酸杆菌的生长，抑制脂肪组织脂肪酸从头合成和β氧化的信号通路，从而改善HFD引起的代谢综合征。
本发明还提供由上述制备方法制备得到的广陈皮多糖。
本发明还提供上述制备方法或广陈皮多糖的应用。
本发明还提供一种产品。
根据本发明的第一方面实施例的一种广陈皮多糖的制备方法，包括以下步骤：
将经醇提后的广陈皮残渣按液固比15～50mL/g与水混合，超声辅助提取，醇沉得粗提物；
对所述粗提物进行纯化处理，即得广陈皮多糖。
根据本发明实施例的制备方法，至少具有如下有益效果：
实施例的制备方法工艺简单，条件温和，提取时间短，提取率高，在广陈皮多糖的工业应用上具有很好的应用前景。
根据本发明的一些实施例，所述超声辅助提取的超声功率为50～300W。
根据本发明的一些实施例，所述超声辅助提取的超声功率为100～250W。
根据本发明的一些实施例，所述超声辅助提取的超声功率为150～250W。
根据本发明的一些实施例，所述超声辅助提取的溶液的pH为3～7。
根据本发明的一些实施例，所述超声辅助提取的溶液的pH为4.0～6.5。
根据本发明的一些实施例，所述超声辅助提取的溶液的pH为4.5～5.5。
根据本发明的一些实施例，所述超声辅助提取的温度6～100℃。
根据本发明的一些实施例，所述超声辅助提取的温度75～95℃。
根据本发明的一些实施例，所述超声辅助提取的时间为5～40min。
根据本发明的一些实施例，所述超声辅助提取的时间为5～30min。
根据本发明的一些实施例，所述超声辅助提取的时间为20～25min。
根据本发明的一些实施例，所述固液比为25～35mL/g。
根据本发明的一些实施例，所述醇沉处理具体包括以下步骤：
将所述粗提物与乙醇按体积比1：3～5混合后，静置处理；固液分离，得固相。
根据本发明的一些实施例，所述静置处理的温度为0～6℃。优选为4℃
根据本发明的一些实施例，所述静置处理的时间为8～20h。
根据本发明的一些实施例，所述乙醇溶液中的乙醇体积浓度为90％～100％，优选为95％。
根据本发明的一些实施例，所述纯化处理包括洗涤处理、脱色处理、除蛋白处理、透析处理中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述洗涤处理包括乙醚洗涤处理、丙酮洗涤处理中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述脱色处理包括活性炭脱色、大孔树脂脱色、双氧水脱色中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述大孔树脂包括大孔树脂AB-8、大孔树脂D101或聚酰胺树脂，优选为聚酰胺树脂。
根据本发明的一些实施例，所述除蛋白处理包括Sevage法、三氯乙酸法中的至少一种。优选为Sevage法。
根据本发明的一些实施例，所述Sevage法所用的试剂为丁醇和氯仿的混合物。丁醇和氯仿的体积比为1:3～5。优选为1:4。
根据本发明的一些实施例，所述透析处理的截留分子量为8kDa～14kDa。
根据本发明的第二方面实施例的广陈皮多糖，由本发明第一方面的制备方法制备得到。
根据本发明实施例的广陈皮多糖，至少具有如下有益效果：
实施例的广陈皮多糖可有效改善高脂饮食引起的体重增加、脂肪累积、肝功能异常、血糖血脂升高、胰岛素抵抗等，具有良好的抗代谢综合征作用。
实施例的广陈皮多糖能够调节HFD饮食小鼠肠道菌群的多样性与结构，促进肠道乳酸杆菌、毛螺杆菌等益生菌的生长。研究发现，天然植物多糖通常在体内并不能直接发挥药理作用，需肠道微生物群及其产生的酶将其降解为小分子如低聚糖，才能够被机体所吸收和发挥药效。反之，肠道微生物群能够利用多糖作为生长碳源，改变菌群结构、多样性和丰富度，继而发挥机体调节作用。值得注意的是，实施例所用广陈皮多糖在HFD饮食小鼠体内复杂的微生物群中，从科、属、种不同水平上显著富集乳酸杆菌，分别增殖666.7％、666.7％和600.3％，具有高度的选择性和靶向性。因此，广陈皮多糖可应用作肠道益生菌，如乳酸杆菌、毛螺杆菌等的益生元，也可应用于改善与肠道菌群有关的疾病。
根据本发明的一些实施例，所述广陈皮多糖的分子量为110～130kDa。
根据本发明的一些实施例，所述广陈皮多糖包括中性糖和糖醛酸。
根据本发明的一些实施例，按质量百分数计，所述中性糖和糖醛酸的含量为90％以上。优选为92％以上。
根据本发明的一些实施例，按质量百分数计，所述广陈皮多糖中的中性糖含量为60％～70％，所述糖醛酸的含量为25％～35％。
根据本发明的一些实施例，按质量百分数计，所述广陈皮多糖中的中性糖含量为64％～70％，所述糖醛酸的含量为25％～30％。
根据本发明的一些实施例，所述广陈皮多糖的单糖组成包括半乳糖醛酸、阿拉伯糖和半乳糖。
根据本发明的一些实施例，所述广陈皮多糖的单糖组成还包括葡萄糖、木糖和甘露糖。
根据本发明的一些实施例，所述半乳糖醛酸、阿拉伯糖和半乳糖的摩尔比为3.5～4.5:1.5～2.5:1。优选为3.8～4.2:1.8～2.2:1。进一步优选为3.99:2:1。
根据本发明的一些实施例，半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖的摩尔比为32～36:15～19:7～10:2～6:0.5～3:1。优选为33～35:16～18:7.5～9.5:2.5～4.5:1.5～2:1。进一步优选为34.06:17.07:8.53:3.6:1.67:1。
根据本发明的一些实施例，所述广陈皮多糖分子结构中的糖苷键主要包括4-Gal(p)-UA、4-Gal(p)、5-Ara(f)、t-Ara(f)、t-Gal(p)-UA和4-Glc(p)。
根据本发明的第三方面实施例的上述制备方法或上述的广陈皮多糖应用，包括(1)至(10)任一项中的应用；
(1)在制备改善代谢综合征的产品中的应用；
(2)在制备调节肠道菌群的产品中的应用；
(3)在制备促进乳酸杆菌生长的产品中的应用；
(4)在制备抑制脂肪组织脂肪酸从头合成的产品中的应用；
(5)在制备抑制脂肪组织脂肪酸β氧化的产品中的应用；
(6)在制备预防/减少脂肪累积的产品中的应用；
(7)在制备预防/减少体重增加的产品中的应用；
(8)在制备降血脂的产品中的应用；
(9)在制备降血糖的产品中的应用；
(10)在制备改善肝功能的产品中的应用。
由于应用采用了上述实施例的制备方法或广陈皮多糖的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果。
根据本发明的一些实施例，所述产品为药品、保健品和功能性食品中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述产品针对由饮食引起的代谢综合征，或肠道菌群失衡，或脂肪累积，或体重增加，或血脂升高，或血糖升高，或肝功能异常。
根据本发明的一些实施例，所述改善代谢综合征包括：改善代谢紊乱导致的体重增加、脂肪累积、肝功能异常、血糖血脂升高、胰岛素抵抗、肠道菌群失衡等中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述调节肠道菌群包括科水平上促进菌群f_Lactobacillaceae；属水平上促进菌群g_Lactobacillus(乳酸杆菌)和g_Enterobacter；种水平上促进菌群s_Lactobacillus_johnsonii,s_Helicobacter,s_Lachnospiraceae_bacterium_COE1和s_Enterobacter_asburiae等微生物中的至少一种生长。
根据本发明的一些实施例，所述调节肠道菌群包括至少从科、属、种三个不同水平上显著促进s_Lactobacillus_johnsonii的生长。
根据本发明的一些实施例，所述预防/减少脂肪累积包括预防/减少体重、附睾白色脂肪(gWAT)、腹股沟白色脂肪(iWAT)、肾周白色脂肪(pWAT)中的至少一种的累积。
根据本发明的一些实施例，所述降血脂包括降血中甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等中的至少一种的水平。
根据本发明的一些实施例，所述改善肝功能包括降低谷丙转氨酶(ALT)和/或谷草转氨酶(AST)水平。
根据本发明的一些实施例，所述广陈皮多糖的用量为40～100mg/kg/d。优选为60mg/kg/d。
根据本发明的一些实施例，所述产品为药品，所述药品还包括药学上可接受的辅料。所述药品的剂型包括液体制剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂中的至少一种。
根据本发明的第四方面实施例的产品，含有本发明第一方面的广陈皮多糖。由于产品采用了上述实施例的广陈皮多糖的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明一实施例的广陈皮多糖提取得率单因素试验结果(A：液固比；B：pH；C：温度；D：超声功率；E：提取时间)；
图2是本发明一实施例的广陈皮多糖提取得率响应面图；
图3是本发明一实施例的广陈皮多糖提取得率等高线图；
图4是本发明一实施例的广陈皮多糖的分子量分布(A)、单糖的高效阴离子交换色谱(B)和红外光谱图(C)；
图5是本发明一实施例的小鼠肠道H&E染色结果(比例尺，100μm)；
图6是本发明一实施例的小鼠肠道菌群OTU数量(A)、Shannon指数(B)、物种等级丰度曲线(C)、PCoA分析结果(D)和门水平的相对丰度分析结果(E)；
图7是本发明一实施例的小鼠肠道属水平丰度Top30微生物群和体征指标之间的Spearman相关性结果；
图8是本发明一实施例的模型组、PCRCP干预组的LEfSe分析显示的微生物类群的差异；
图9是本发明一实施例的模型组、PCRCP干预组的线性判别分析(LDA)结果；
图10是本发明一实施例的小鼠肠道乳酸杆菌在科、属、种水平上的相对丰度；
图11是本发明一实施例的小鼠体重变化(A)、和gWAT(B)、iWAT(C)和pWAT(D)重量；
图12是本发明一实施例的小鼠葡萄糖耐量变化曲线(A)及其曲线下面积(B)结果；
图13是本发明一实施例的小鼠血浆TG(A)、CHO(B)、LDL-C(C)、ALT(D)和AST(E)的水平；
图14是本发明一实施例的小鼠肝脏(上)和gWAT(下)的H&E染色结果(比例尺，100μm)；
图15是本发明一实施例的模型组和PCRCP干预组脂肪组织中差异表达基因的M-versus-A(A)和KEGG通路(B)分析结果；
图16是本发明一实施例的模型组和PCRCP干预组脂肪组织中参与脂质运输和代谢(A)、碳水化合物运输和代谢(B)、胰岛素抵抗(C)的差异表达基因热图；
图17是本发明一实施例的模型组和PCRCP干预组的GSEA分析结果；
图18是本发明一实施例的经抗生素清除肠道菌群的小鼠体重变化(A)、葡萄糖耐量变化曲线(B)、空腹血糖水平(C)、血浆ALT(D)和AST(E)的水平、gWAT(F)、iWAT(G)和pWAT重量(H)、及血浆CHO(I)、TG(J)和LDL-C(K)的水平。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明的描述中，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下述测试例的小鼠购自广东省医学实验动物中心。
下述测试例的饲料购自小黍有泰(北京)生物科技有限公司。
下述实施例中，广陈皮多糖的提取原料广陈皮由广东新会茶枝柑果皮制得。多糖得率的计算公式如下：
多糖得率(％)＝WPCRCP/W×100％，
其中，WPCRCP为所得多糖质量，W为广陈皮质量。
实施例1
本实施例基于响应面法对广陈皮多糖的制备方法的工艺进行优化。
1、单因素实验(每实验重复3次)
(1)液固比对多糖得率的影响
取100g广陈皮干粉，加入95％乙醇(v/v)，按料液比1g：10mL在80℃热回流提取2次，每次3h，抽滤后，残渣60℃干燥至恒重。将残渣与水混合，在液固比(A:10,15,20,25,30,35mL/g)、pH5.5、85℃、超声功率200W的条件下提取15min。过滤，所得溶液与4体积的95％乙醇混合，4℃静置沉淀过夜。过滤所得沉淀依次用乙醚和丙酮洗涤两次后，依次用聚酰胺脱色、Sevage试剂(丁醇/氯仿，1/4，v/v)脱蛋白、水透析48h(透析袋的截留分子量为8～14kDa)，冷冻干燥至恒重。
(2)pH对多糖得率的影响
取100g广陈皮干粉，加入95％乙醇，按料液比1g:10mL在80℃热回流提取2次，每次3h，过滤所得残渣60℃干燥至恒重。将残渣与水混合，在液固比30mL/g、pH(B:4、4.5、5、5.5、6、6.5)、85℃、超声功率200W的条件下提取15min。过滤所得溶液与4体积95％乙醇混合，4℃静置沉淀过夜。过滤所得沉淀依次用乙醚和丙酮洗涤两次后，依次用聚酰胺脱色、Sevage试剂脱蛋白、水透析48h，冷冻干燥至恒重。
(3)温度对多糖得率的影响
取100g广陈皮干粉，加入95％乙醇，按料液比1g：10mL在80℃热回流提取2次，每次3h，过滤所得残渣60℃干燥至恒重。将残渣与水混合，在液固比30mL/g、pH 4.5、温度(C:70、75、80、85、90、95℃)、超声功率200W的条件下提取15min。过滤所得溶液与4体积95％乙醇混合，4℃静置沉淀过夜。过滤所得沉淀依次用乙醚和丙酮洗涤两次，依次用聚酰胺脱色、Sevage试剂脱蛋白、水透析48h，冷冻干燥至恒重。
(4)超声功率对多糖得率的影响
取100g广陈皮干粉，加入95％乙醇，按料液比1g:10mL在80℃热回流提取2次，每次3h，过滤所得残渣60℃烤箱干燥至恒重。将残渣与水混合，在液固比30mL/g、pH 4.5、90℃、超声功率(D:50、100、150、200、250、300W)的条件下提取15min。过滤所得溶液与4体积95％乙醇混合，4℃静置沉淀过夜。过滤所得沉淀依次用乙醚和丙酮洗涤两次后，依次用聚酰胺脱色、Sevage试剂脱蛋白、水透析48h，冷冻干燥至恒重。
(5)提取时间对多糖得率的影响
取100g广陈皮干粉，加入95％乙醇，按料液比1g：10mL在80℃热回流提取2次，每次3h，所得残渣60℃干燥至恒重。将残渣与水混合，在液固比30mL/g、pH 4.5、90℃、超声功率250W的条件下，提取(E:5、10、15、20、25、30min)。过滤所得溶液与4体积95％乙醇混合，4℃静置沉淀过夜。过滤所得沉淀依次用乙醚和丙酮洗涤两次后，依次用聚酰胺脱色、Sevage试剂脱蛋白、水透析48h，冷冻干燥至恒重。
单因素实验的结果如图1所示。
2、响应面优化实验
在单因素试验基础上，利用Design-expert软件的Box-Behnken方法优化影响多糖得率的主要因素。以液固比(A)、pH(B)、温度(C)、超声功率(D)、提取时间(E)作为自变量，以多糖得率为响应值设计实验。实验设计的因素和水平见表1，实验设计及结果见表2，回归模型的显著性分析及差异分析结果见表3。
表1广陈皮多糖提取优化实验设计的单因素和水平
表2单因素试验设计及结果
表3回归模型的显著性分析及差异分析结果
响应面分析图见图2和3。等高线图越接近于椭圆形，表示两两因素交互作用越显著。
利用以上分析，获得了最佳提取率(Y)的最佳提取条件：液固比为30mL/g，pH为4.4，温度为90℃，超声功率为250W，提取时间为20min，预测多糖得率6.94±0.09％。
实施例2
本实施例提供一种广陈皮多糖的制备方法，步骤如下：
取100g广陈皮干粉，加入95％乙醇，按料液比1g：10mL在80℃热回流提取2次，每次3h，过滤所得残渣60℃干燥至恒重。在液固比30mL/g、pH 4.5、90℃、超声功率250W的条件下提取20min。过滤所得溶液与4体积95％乙醇混合，4℃静置沉淀过夜。过滤所得沉淀依次用乙醚和丙酮洗涤两次后，依次用聚酰胺脱色、Sevage试剂脱蛋白、水透析48h冷冻干燥至恒重。3次平行实验的多糖平均得率为7.02±0.02％，与预测多糖得率相近。这表明该回归模型能够较好地模拟和预测广陈皮多糖的提取条件和多糖得率之间的关系。
测试例1
本测试例对实施例2制备得到的广陈皮多糖的单糖组成、分子量、糖苷键等结构进行解析。方法如下：
检测单糖组成：取5mg广陈皮多糖与2M三氟乙酸在121℃下水解2h，溶液用氮气干燥后溶解残渣，用甲醇洗涤三次。去离子水溶解残渣，0.45μm膜过滤，采用高性能阴离子交换色谱(HPAEC,Thermo Fisher Scientific,USA)，配备CarboPac PA-20阴离子交换柱(3×150mm；Dionex)和一个脉冲安培检测器(Dionex ICS 5000，赛默飞世尔科学，美国)。
检测红外光谱：傅立叶变换红外分光光度计(FT-IR,Bruker,Germany)测定了广陈皮多糖的红外光谱。
检测平均分子量检测：取1mg样品溶解在0.1M NaNO3溶液中的终浓度为1mg/mL，经0.45μm膜过滤后注入凝胶渗透色谱(Waters Division Millipore,Milford,MA,USA)，使用两个超水凝胶线性柱(内径8mm，长300mm)串联，连接到折射率检测器(410型，WatersAssociates,Milford,USA)。用去离子水洗脱，流速0.8mL/min。根据葡聚糖标准物测定分子量(Mw)的校正曲线，用Empower软件(Waters Corp.,Milford,MA,USA)计算平均Mw。
测得的实施例2的广陈皮多糖的糖苷键类型如表4所示，分子量分布结果、单糖的高效阴离子交换色谱以及红外光谱图见图4。
实施例2制备得到的广陈皮多糖的分子量为122.0kDa，主要由半乳糖醛酸(51.1％)、阿拉伯糖(25.6％)、半乳糖(12.8％)、葡萄糖(5.4％)、木糖(2.5％)组成，具体化学成分和单糖组成见表4。糖苷键的连接方式主要有4-Gal(p)-UA、4-Gal(p)、5-Ara(f)、t-Ara(f)、t-Gal(p)-UA和4-Glc(p)。具体见表5。
表4广陈皮多糖的主要化学成分和单糖组成
| 化学成分 | w/w％ | 单糖组成 | mol％ |
| 中性糖 | 66.0 | 半乳糖醛酸 | 51.1 |
| 糖醛酸 | 28.0 | 阿拉伯糖 | 25.6 |
| 水分 | 4.8 | 半乳糖 | 12.8 |
| 蛋白 | 0.59 | 葡萄糖 | 5.4 |
| 多酚 | 0.25 | 木糖 | 2.5 |
| 甘露糖 | 1.5 |
表5广陈皮多糖分子结构中的糖苷键类型
测试例2
本测试例测试了实施例2制备得到的广陈皮多糖的抗肥胖作用和肠道菌群调节作用。
本测试例使用的小鼠为SPF级雄性C57BL/6小鼠，8周龄，体重20±2g。
具体测试方法如下：
小鼠饲养于SPF级屏障环境中，常规饲养适应1周后，分为3组(n＝7)：Chow组、HFD组和PCRCP组，分别给予基础饲料或高脂饲料，灌胃生理盐水或60mg/kg PCRCP，每天一次，连续灌胃24天。
定期记录小鼠食物摄入量和体重。实验结束后，测量糖耐量和血糖水平，收集新鲜粪便样本进行菌群分析；采集血液，分离血浆，利用商业试剂盒(由北京百思诺生物科技股份有限公司提供)检测CHO、TG、LDL-C、ALT和AST水平；分离肝脏、肠道、gWAT、iWAT、pWAT等组织样本，用于称重或后续染色等分析。
通过口服葡萄糖耐受实验检测小鼠葡萄糖耐量变化曲线，具体实验步骤为：实验结束后，小鼠禁食12h，灌胃2mg/kg葡萄糖后，分别在时间点0、30、60、90、120min尾部取血，用罗氏血糖仪测定血糖水平。
分析结果如下：
1、对肠道组织进行H&E染色，采用16S rDNA扩增子测序分析小鼠的肠道菌群多样性与结构。
肠道H&E染色结果如图5所示。肠道菌群OTU数量、Shannon指数、物种等级丰度曲线、PCoA分析结果、肠道菌群门水平的相对丰度分析结果见图6。
综上结果所述，广陈皮多糖干预24天后可有效改善HFD饮食小鼠肠道菌群结构和多样性，有益于其抗代谢综合征作用的发挥。
进一步地，通过LEfSe分析发现，与HFD组小鼠相比，PCRCP组小鼠在科水平上的菌群f_Lactobacillaceae的相对丰度明显增加；属水平上菌群g_Lactobacillus和g_Enterobacter的相对丰度显著增加；种水平上菌群s_Lactobacillus_johnsonii、s_Helicobacter、s_Lachnospiraceae_bacterium_COE1和s_Enterobacter_asburiae的相对丰度增加。值得注意的是，这些菌群中只有s_Lactobacillus_johnsonii在科、属、种三个不同水平上显著增加，这也说明了PCRCP能够选择性促进肠道内益生菌乳酸杆菌的生长，具有作为乳酸杆菌的靶向性益生元的潜力。结果见LEfSe分析的差异微生物类群(图8)及其LDA结果(图9)和乳酸杆菌在科、属、种水平上的相对丰度(图10)。
2、实验结束后，小鼠体重变化及gWAT、iWAT、pWAT重量如图11所示；葡萄糖耐量变化曲线及曲线下面积结果如图12所示；血浆TG、CHO、LDL-C、ALT和AST水平如图13所示。
综上所述结果显示，广陈皮多糖干预HFD饮食小鼠，能够有效降低血浆TG、CHO、LDL-C、ALT和AST水平，抑制HFD饮食导致的gWAT、iWAT、pWAT等脂肪累积，保护小鼠免受HFD诱导的代谢异常。
3、对肝脏和gWAT进行病理学检查，并利用RNA_seq测序对脂肪组织的基因表达谱进行分析。
肝脏和gWAT的H&E染色结果如图14所示，结果显示，PCRCP显著减小脂肪组织的细胞大小，以及坏死细胞和巨噬细胞形成的树冠状结构数量，同时也降低肝细胞肥大和肝小叶脂肪变性。模型组和PCRCP干预组脂肪组织的差异表达基因数量及其KEGG分析结果见图15。基于COG的脂质运输和代谢、碳水化合物运输和代谢、胰岛素抵抗差异表达基因的热图(调整后P<0.05)，如图16所示。基因集富集分析(GSEA)结果见图17，显示PCRCP调节白色脂肪组织的主要信号通路为三羧酸循环、β氧化磷酸化、脂肪酸从头合成和PI3K-Akt信号通路等。
这些结果分析表明，PCRCP对HFD诱导的代谢综合征形成的预防可能与其调节脂肪细胞的脂肪生成和脂肪分解信号通路有关。
测试例3
本测试例对肠道菌群在实施例2制备得到的广陈皮多糖抗肥胖中的作用进行了测试。具体测试方法如下：
8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠14只，常规饲料1周后，分成2组(n＝7)：HFD+ABX组和PCRCP+ABX组，其中ABX是指抗生素混合物。所有小鼠均自由食用高脂饲料，饮用含ABX(氨苄西林1g/mL、甲硝唑1g/mL、万古霉素0.5g/mL和新霉素0.5g/mL)的水。同时，HFD+ABX组和PCRCP+ABX组小鼠分别灌胃无菌水和60mg/kg PCRCP，每天1次，连续灌胃24d。
定期记录食物摄入量和体重。实验结束后，采集血液，分离得到血浆，用于检测CHO、TG、LDL-C、ALT和AST水平；解剖称量记录gWAT、iWAT和pWAT等组织重量。
通过口服葡萄糖耐受实验检测小鼠葡萄糖耐量变化曲线，具体实验步骤为：实验结束后，小鼠禁食12h，灌胃2mg/kg葡萄糖后，分别在时间点0、30、60、90、120min尾部取血，用罗氏血糖仪测定血糖水平。
小鼠体重变化、葡萄糖耐量变化曲线、空腹血糖水平、血浆ALT和AST水平，gWAT、iWAT和pWAT重量，以及血浆TG、CHO和LDL-C水平见图18。
从上述结果可知，抗生素混合物耗尽肠道微生物后，PCRCP改善HFD诱导的代谢综合征作用明显减弱或者消失，表明PCRCP对抗代谢综合征的改善作用依赖于肠道微生物群的调节。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (21)
1.广陈皮多糖在（1）至（3）任一项中的应用；
（1）制备高脂饮食下抑制脂肪组织脂肪酸从头合成的药品；
（2）制备高脂饮食下抑制脂肪组织脂肪酸β氧化的药品；
（3）制备预防/减少脂肪累积的药品，所述药品针对由高脂饮食引起的脂肪累积；
所述广陈皮多糖的制备方法包括以下步骤：
将经醇提后的广陈皮按液固比15 ~ 50 mL/g与水混合，超声辅助提取，醇沉得粗提物；
对所述粗提物进行纯化处理，即得广陈皮多糖。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述超声辅助提取的超声功率为50 ~ 300W。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述超声辅助提取的溶液的pH为3~7。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述超声辅助提取的温度65 ~ 100 ℃。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述超声辅助提取的时间为5 ~40 min。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述固液比为25 ~ 40 mL/g。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述醇沉处理具体包括以下步骤：
将所述粗提物与乙醇溶液按体积比1 : 3~5混合后，静置处理；固液分离，得固相。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述静置处理的温度为0~6 ℃。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述静置处理的时间为8~20 h。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述乙醇溶液中的乙醇体积浓度为90%~100%。
11.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纯化处理包括洗涤处理、脱色处理、除蛋白处理、透析处理中的至少一种。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述洗涤处理包括乙醚洗涤处理、丙酮洗涤处理中的至少一种。
13.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述脱色处理包括活性炭脱色、大孔树脂脱色、双氧水脱色中的至少一种。
14.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述除蛋白处理包括Sevage法、三氯乙酸法中的至少一种。
15.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述透析处理的截留分子量为8 ~ 14kDa。
16.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述广陈皮多糖的分子量为110 ~130kDa。
17.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述广陈皮多糖包括中性糖和糖醛酸。
18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，按质量百分数计，所述中性糖和糖醛酸的含量为90%以上。
19.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述广陈皮多糖的单糖组成包括半乳糖醛酸、阿拉伯糖和半乳糖。
20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述半乳糖醛酸、阿拉伯糖和半乳糖的摩尔比为3.5~4.5 : 1.5~2.5 : 1。
21.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述广陈皮多糖分子结构中的糖苷键主要包括4-Gal(p)-UA、4-Gal(p)、5-Ara(f)、t-Ara(f)、t-Gal(p)-UA和4-Glc(p)。
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