CN102439048B - 组合物及制备α-(1,2)-支化的α-(1,6)葡聚寡糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于改善个体健康的组合物，其包含α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖，所述葡聚寡糖的平均分子量优选为约10kDa至70kDa，具有约10％至50％的α-(1，2)-糖苷侧链，并且在所述个体中至少部分地不可消化。本发明还提供用于改善个体健康的方法，其包括向个体给药有效量的所述组合物以改善肠健康，或者预防或治疗胃肠道病症、胆固醇相关的病症、糖尿病或者肥胖。本发明还提供制备具有受控的大小和受控的支化度的葡聚寡糖的方法，其包括：提供平均分子量为0.5-100kDa的α-(1，6)葡聚寡糖，并将至少10％的α-(1，2)-糖苷侧链引入所述α-(1，6)葡聚寡糖上。

Description

组合物及制备α-(1,2)-支化的α-(1,6)葡聚寡糖的方法
相关申请的交叉引用 
本申请要求于2009年5月7日提交的第61/176,242号申请的优先权，其为了所有目的整体援引加入本文。 
发明领域
本发明涉及α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖(alpha-(1，2)-branched alpha-(1，6)oligodextran)。具体而言，本发明的实施方案涉及使用α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖来改善个体的胃肠和心血管健康的组合物及方法。 
发明背景 
益生元(prebiotic)(例如寡糖)是被肠内微生物群的微生物降解的非消化性膳食化合物。益生元的降解通常对宿主健康发挥有益效应。这些有益健康的效应是由对肠微生物群中向宿主提供健康益处的有限数量的微生物属、种或株(特别是肠内菌群的双岐杆菌和乳酸菌)的生长和/或生物活性进行选择性刺激引起的。已证明益生元在健康个体中增加粪便和粘膜的双岐杆菌。寡糖广泛用于食品，例如软饮料、饼干、谷物制品、糖果和乳制品中。也已开发了寡糖的其它应用，例如防龋剂或者低甜度保湿剂。 
益生元的效应主要是由选择性地刺激肠中的双岐杆菌(也称为双歧生成性效应(bifidogenic effect))和/或其它有益菌的生长引起的。对该生长的刺激使得能够降低结肠的pH、增加短链脂肪酸的产生、预防致病微生物的增殖和粘附(屏蔽效应)、增加潜在致癌胺化化合物的代谢以及维生素B的产生。但是，寡糖的缺点是，若它们增加碳水化合物发酵，则它们也增加气体形成。这意味着，主要副作用是气胀(flatulence)、不适和胃气胀(bloating)。 
目前，最明确定义的益生元是归类于膳食纤维的碳水化合物：非消化性寡糖(也称为低聚糖)。寡糖具有低的聚合度。参与形成寡糖的糖单元多种多样。实例包括：己糖例如葡萄糖、半乳糖和果糖，以及戊糖例如木糖。 寡糖可包含单一类型的单糖(同质寡糖)或者混合单糖(杂寡糖)。寡糖目前是从天然聚合物例如淀粉或菊糖的降解、从天然物质例如大豆的直接提取或者由化学合成或酶法合成制得。 
特定益生元对多种健康问题的效应仍然未知。在膳食不均衡的情况下，大部分人群表现出血脂肪值，特别是血液胆固醇值的含量升高。高胆固醇水平被公认为是心血管病症的主要风险因素。因此，急需针对显著增高的胆固醇值(特别是LDL胆固醇)和增高的血脂肪值的治疗。对此已记载了多种解决方法；但是，特定益生元寡糖对这样的胆固醇相关的疾病或问题的效应仍然未知。特定益生元对明显影响大部分人群的内脏疼痛和肥胖(例如脂肪代谢)问题也仍然未知。 
发明概述 
本发明提供用于改善个体健康的组合物，其包含α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖。所述α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖具有受控的大小和受控的支化度。例如，在本发明的一实施方案中，所述α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖的平均分子量为约10千道尔顿(kDa)至70kDa，并且包含约10％至50％的α-(1，2)-糖苷(alpha-(1，2)-osidic)侧链。 
本发明还提供用于改善个体健康的方法，其包括向个体给药对所述个体的健康发挥有益效应的有效量的包含α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖的组合物。所述有益效应可包括例如改善肠健康、改善肠舒适度、降低脂质含量、影响体重，或者预防或治疗胃肠道病症、糖尿病、肥胖或胆固醇相关的病症。 
本发明还提供制备具有受控的大小和受控的支化度的葡聚寡糖(oligodextran)的方法。例如，在本发明的一实施方案中，所述方法包括：(1)提供数均分子量为0.5-100kDa的α-(1，6)葡聚寡糖；(2)将至少10％的α-(1，2)-糖苷侧链引入所述α-(1，6)葡聚寡糖上，由此获得α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖；和(3)任选地纯化所述α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖。 
应理解以上概述和以下详述均是本发明的示例而非限制。 
附图简述 
图1显示对于本发明化合物的各种实施方案，在控制pH(pH controlled)的粪便分批培养发酵的0h、10h、24h、36h和48h，对来自4位健康供体的双岐杆菌属(Bifidobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、乳杆菌属(Lactobacillus)、梭菌属(Clostridium)、奇异菌属(Atopobium)、真细菌属(Eubacterium)和梭菌IX群(Clostridium Cluster IX)水平的平均细菌计数(Log10个细胞/ml培养液)。 
图2显示在给药本发明化合物的各种实施方案后，在控制pH的粪便分批培养发酵的10h、24h、36h和48h，短链脂肪酸(SCFA)特别是乳酸(lactate)、乙酸(acetate)、丙酸(propionate)和丁酸(butyrate)的测定(mM)。 
图3显示在本发明化合物的各种实施方案中，在控制pH的分批培养发酵中的乙酸比丙酸的比值(mM)。 
图4A和4B显示用本发明化合物的体外消化试验的结果。绘制表示具有受控的分子量(1kD或40kDa)和受控的支化度(％支化：0％、16％或32％)的α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖的可消化性曲线的图表。 
图5显示表示用本发明化合物进行的气体产生试验的结果的图表。 
图6A显示在4周给药期间本发明化合物对大鼠体重增长的效应。 
图6B显示依据在大鼠中的结肠直肠胀(colorectal distension)研究结果的本发明化合物的镇痛性质。 
图7显示本发明的化合物对大鼠肠微生物群的效应。 
图8A显示在瘦和肥胖供体中本发明化合物对气体产生速度的效应。 
图8B显示在瘦和肥胖供体中菊糖(用作对照)对气体产生速度的效应。 
图9A显示在肥胖供体中给药本发明化合物后溶组织梭菌(C.histolyticum)的水平。 
图9B显示在肥胖供体中给药本发明化合物后普拉氏梭杆菌(F.prausnizii)的水平。 
图10A显示葡萄糖的加入有助于获得本发明的纯α-1，6结构。 
图10B显示降低蔗糖/葡萄糖的比值使得能够控制产物的多分散性。 
图10C显示通过加入葡萄糖并调整蔗糖与葡萄糖的比值可在DP和MW的分布曲线方面控制期望的化合物的合成。 
图11显示在给药本发明化合物后的接受高脂肪饮食的大鼠中的体重增 长。 
图12显示在给药本发明化合物后的大鼠中的葡萄糖耐量。 
发明详述 
本发明提供支化的葡聚寡糖化合物及包含这样的化合物的组合物。本发明还提供用于改善个体健康(特别是用于改善胃肠健康和控制血液胆固醇水平)的方法，其包括向个体给药对所述个体的健康发挥有益效应的有效量的葡聚寡糖化合物。本发明还提供制备具有受控的大小和受控的支化度的葡聚寡糖的方法。 
“葡聚糖(dextran)”是包含葡萄糖单元的聚合物，也称为多聚葡萄糖，并且包含至少50％的连续的α-1，6葡萄糖苷键(alpha 1，6 glucosidic bond)。各种结构和分子量的葡聚糖已久为人所知。葡聚糖是通过在蔗糖培养基上培养乳酸菌(例如明串珠球菌属(Leuconostoc)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、魏斯氏菌属(Weisella)和乳杆菌属)制备的。参与它们的合成的酶是葡聚糖蔗糖酶(glucansucrase)，其产生葡聚糖(glucan)并从蔗糖培养基中释放果糖。术语葡聚糖、天然葡聚糖和高分子量葡聚糖在本文中同义使用。葡聚糖的平均分子量通常高于1000kDa。 
本文中使用的“葡聚寡糖“或“α-(1，6)葡聚寡糖”指数均分子量介于常少于3个葡萄糖单元的寡聚葡糖苷(oligoglucoside)与天然葡聚糖(常高于1000kDa)的平均分子量之间的多聚葡萄糖。 
本文中使用的“α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖”是指包含基本上由α-(1，6)-键连接的α-D-吡喃葡萄糖基单元的基本为线性的骨架并具有α-(1，2)-糖苷侧链的葡聚寡糖。该基本上由α-(1，6)-键连接的α-D-吡喃葡萄糖基单元的基本为线性的骨架在本文中常称为“骨架”或“受体”。 
应注意，本文中使用的术语“葡萄糖”和“吡喃葡萄糖”被视为同义并可互换使用。相似地，本文中使用的术语“葡萄糖基”和“吡喃葡萄糖基”单元被视为同义并可互换使用。 
本文中使用的术语“异麦芽糖寡糖(isomaltooligosaccharide)”或IMOS是指包含由α-1，6葡萄糖苷键连接的葡萄糖单体的化合物，其可从α-淀粉酶、支链淀粉酶和β-淀粉酶、α-葡糖苷酶对玉米淀粉或淀粉衍生产品的酶反应 商业生产。可商购的产品包括异麦芽糖寡糖(DP为2-8，例如异麦芽糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖、异麦芽五糖、异麦芽六糖、异麦芽七糖、异麦芽八糖)的混合物和葡萄糖的混合物，以及含有α-1，4和α-1，6键二者的葡萄糖寡糖(glucooligosaccharide)(例如潘糖)的混合物。 
“平均分子量”是指单个高分子的分子量的常规算术平均值或平均值。它是通过测定n个聚合物分子的分子量，求得重量之和，并除以n来确定的。数均分子量是确定聚合物分子量的一种方式。聚合物的数均分子量可通过凝胶渗透色谱法、粘度测定法以及依数性法(例如蒸气压渗透压测定法或端基滴定法)进行测定。 
本文所称的“受控的分子量”是指可根据本发明调整或控制葡聚寡糖化合物的长度乃至分子质量或分子量。“支化度”是指骨架中支承α-(1，2)-位的葡萄糖单元或与之偶连的葡萄糖单元数除以该分子中所含的葡萄糖单元总数，以百分比表示。因此，支化度是指α-(1，2)-位的葡萄糖单元占整个分子而不只是骨架的百分比。“受控的支化度”是指可根据本发明的方法调整或控制该葡萄糖单元数。 
术语“本发明的化合物”、“支化的葡聚寡糖”和“α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖”在本文中同义地使用。在一具体实施方案中，本发明涉及α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖。在一优选实施方案中，这样的α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖是包含基本上由α-(1，6)键连接的α-D-吡喃葡萄糖基单元的线性或基本为线性的骨架并且具有α-(1，2)-糖苷侧链(优选一个或多个葡萄糖单元的链)的α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖。 
在一优选实施方案中，本发明涉及葡聚寡糖化合物，其中所述α-(1，2)-糖苷侧链包含1、2或3个葡萄糖单元，优选1个葡萄糖单元。在一实例中，单个葡萄糖单元与所述葡聚寡糖的骨架连接以形成支化的化合物。术语“α-(1，2)-糖苷侧链”在上下文中优选地指通过α-(1，2)-键与所述线性骨架的葡萄糖单元连接的一个或多个葡萄糖单元的链。 
正如以下更详细的描述，本发明的一个方面提供用于改善个体健康的组合物，其包含α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖。在一实施方案中，所述葡聚寡糖是益生元化合物。本发明的葡聚寡糖优选地包含至少10％的α-(1，2)-糖苷侧链以及基本为线性的骨架，所述骨架包含至少2个由α-(1，6)-键连接 的α-D-吡喃葡萄糖基单元。所述基本为线性的骨架优选地包含至少90％的α-(1，6)-D-吡喃葡萄糖苷键。所述包含α-(1，6)-键的骨架优选地包含约10％至50％的α-(1，2)-糖苷侧链和少于10％的α-(1，4)-键。每分子优选地存在多于1个α-(1，2)-糖苷侧链。在这些骨架上添加α-(1，2)-糖苷侧链使平均分子量随支化度而增高。 
所述α-(1，2)-糖苷侧链可随机地分布于本发明的葡聚寡糖的整个骨架，或者它们可存在于所述骨架的某些区域，例如骨架的末端。在一优选实施方案中，所述α-(1，2)-糖苷侧链随机地分布于葡聚寡糖的整个骨架。 
优选地，本发明的支化的葡聚寡糖的平均分子量介于寡聚葡糖苷的平均分子量(通常低于1kDa)和天然葡聚糖的平均分子量(通常高于1000kDa)之间。例如，包含α-(1，6)-键的骨架的平均分子量优选地为0.5kDa至100kDa，或者1kDa至70kDa，或者1kDa至10kDa。在一优选实施方案中，骨架的平均分子量为至少0.5kDa，或者至少1kDa，或者至少10kDa，或者至少40kDa，或者至少70kDa。由于添加α-(1-2)连接的残基，本发明的α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖的平均分子量得以增加。因此，分子量的变化与支化度和侧链中所含单元(例如葡萄糖单元)的总数直接相关。例如，所述骨架的平均分子量的范围是约0.5kDa至约100kDa，而所述α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖的平均分子量的范围是约0.60kDa(例如，约0.5kDa的骨架加10％的支化度)至约170kDa(例如，约100kDa的骨架加约40％的支化度)。在实施例部分提供本发明的α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖化合物的其它优选实例。 
在一优选实施方案中，本发明的α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖具有多于一个α-(1，2)-糖苷侧链，并且其支化度为至少10％的α-(1，2)-糖苷侧链，例如至少15％，或者至少20％，或者至少25％，或者至少30％，或者至少35％，或者至少40％的α-(1，2)-糖苷侧链。更优选地，支化水平为约10％至40％，最优选约15％、16％、18％、31％、32％、33％或者37％。 
在另一优选实施方案中，本发明的α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖包含少于10％，优选少于5％的α-(1，4)-键，更优选地，其基本上没有α-(1，4)-键。其优点在于本发明的化合物所含的易水解键的含量低。因此，所述化合物高度不易消化，并且能够相当完整地到达肠的较下部，从而可最大影响局 部微生物群。 
在又一实施方案中，所述支化的葡聚寡糖的骨架包含至少3个，例如至少4个，至少5个或者至少6个基本上由α-(1，6)-键连接的α-D-吡喃葡萄糖基单元。在另一实施方案中，所述骨架包含6-12个，或者6-10个α-D-吡喃葡萄糖基单元。在另一实施方案中，所述葡聚寡糖的骨架包含100-1000个α-D-吡喃葡萄糖基单元。 
本发明的葡聚寡糖化合物包含基本上由α-(1，6)-键连接的α-D-吡喃葡萄糖基单元的线性或者基本为线性的骨架，并具有α-(1，2)-糖苷侧链。术语“基本上由α-(1，6)-键连接”是指所述线性骨架中的大多数葡萄糖单元通过α-(1，6)-键彼此连接。 
在一优选实施方案中，所述化合物的线性骨架中至少90％；至少92％；至少95％；或乃至至少97％的葡萄糖单元在该线性骨架中通过α-(1，6)-键彼此连接。因此，在另一实施方案中，所述葡聚寡糖包含线性骨架，其含有至少90％；至少92％；至少95％；或乃至至少97％的α-(1，6)-吡喃葡萄糖苷键。本发明还提供支化的葡聚寡糖化合物，其中所述线性骨架包含少于10％或者少于5％的在该线性骨架中彼此连接的葡萄糖单元的α-(1，4)-键。 
在一优选实施方案中，所述葡聚寡糖骨架包含至少2个基本上由α-D(1，6)-键连接的α-D-吡喃葡萄糖基单元，优选3-600个α-D-吡喃葡萄糖基单元，更优选6-10个单元。在另一实施方案中，所述线性骨架包含至少90％的α-(1，6)-吡喃葡萄糖苷键。 
在另一方面，本发明提供制备上述化合物的方法，所述化合物优选地具有受控的大小和受控的支化度。本申请的申请人已发现具有目标分子量和支化度的α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖的合成方法。根据该方法，可制备具有多种分子量和支化度的多种葡聚寡糖化合物。具体而言，本申请的申请人已建立将α-(1，2)-支链接枝到包含葡萄糖单元的骨架上的方法。该包含葡萄糖单元的骨架优选为线性或者基本为线性的葡聚寡糖，其平均分子量为0.5-70kDa。 
因此，本发明的另一方面提供制备α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖的方法，其包括以下步骤：提供具有适当分子量的寡糖(优选葡聚寡糖)，并将α-(1，2)-糖苷侧链引入所述葡聚寡糖上。任选地，所述方法包括纯化步骤， 用以除去在该制备方法中已获得的不需要的副产物，例如果糖、葡萄糖、明串珠菌二糖、曲二糖和/或剩余的蔗糖。 
在一优选实施方案中，上述制备具有受控的大小和受控的支化度的葡聚寡糖的方法包括以下步骤：(1)提供平均分子量为0.5-100kDa的α-(1，6)葡聚寡糖；(2)将至少10％的α-(1，2)-糖苷侧链引入步骤(1)中所得的α-(1，6)葡聚寡糖上，由此获得α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖；和(3)任选地纯化所述α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖以除去在该方法中已得到的不需要的副产物。 
在一优选实施方案中，步骤(1)包括：(1a)使含有葡萄糖的原料进行酶法转葡萄糖基化(transglucosylation)反应，由此获得异麦芽糖寡糖(IMOS)；和(1b)使所述IMOS与葡聚糖蔗糖酶在蔗糖的存在下反应，由此获得α-(1，6)葡聚寡糖。在一实施方案中，(1a)和(1b)在单一步骤中进行。所述含有葡萄糖的原料可包括例如葡聚糖、淀粉、葡萄糖浆、葡萄糖或者麦芽糖浆。 
通常，IMOS是通过以麦芽糖浆为底物的转葡萄糖基化酶法制得。所述麦芽糖浆可使用α-淀粉酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶和/或α-葡糖苷酶作为催化剂进行制备。因此，根据本发明，通过转葡萄糖基化获得的IMOS可在没有任何纯化处理的情况下直接使用。另一方面，其它α-(1-6)葡聚寡糖通常是通过部分水解和分级分离高分子量葡聚糖而从蔗糖底物制得。在支化前，必须纯化这些产物以消除果糖残余物。 
步骤(1)中提供的葡聚寡糖优选地具有线性或者基本为线性的骨架。更优选地，所述葡聚寡糖具有糖苷骨架，所述糖苷骨架包含至少90％的α-(1，6)-D-吡喃葡萄糖苷键，更优选包含至少92％、95％或者97％的α-(1，6)-D-吡喃葡萄糖苷键。 
在另一实施方案中，步骤(1)中提供的葡聚寡糖的分子量为0.5-100kDa；例如1-70kDa或者1-40kDa。在又一实施方案中，步骤(1)中提供的葡聚寡糖的平均分子量为0.5-10kDa。在又一实施方案中，步骤(1)中提供的葡聚寡糖的平均分子量为至少0.5kDa或者至少1kDa或者至少70kD。步骤(2)中提供的葡聚寡糖的平均分子量因添加α-(1-2)连接的残基而增高。因此，分子量的变化与支化度和该侧链中所含单元(例如葡萄糖单元)的总数直接相关。例如，步骤(1)中制得的骨架的平均分子量范围是约0.5kDa至 约100kDa，α-(1，2)α-(1，6)葡聚寡糖的平均分子量范围是约0.60kDa至约170kDa。 
步骤(1)中提供的葡聚寡糖可从不同的原料制备。在一实施方案中，步骤(1)中提供的葡聚寡糖可从葡聚糖获得。所使用的葡聚糖可以是任意适合的葡聚糖(天然的、合成的或者部分水解的葡聚糖)。在一实施例中，高分子量天然葡聚糖(即分子量大于105kDa的葡聚糖)可用来提供具有选定分子量的葡聚寡糖。高分子量葡聚糖可从微生物如明串珠球菌属获得。此方法是本领域公知的。基本上，它包括水解高分子量天然葡聚糖以提供不同分子量的葡聚寡糖。将经水解的组合物分级分离以提供具有不同分子量的葡聚寡糖流分，并且纯化这些流分。通过此方法获得的葡聚寡糖是公知的，并且可商购获得。 
在又一实施方案中，淀粉可用作原料来制备葡聚寡糖。淀粉是廉价易得的原料。可能100％可转化成水解产物，例如麦芽糖浆。在又一实施方案中，麦芽糖浆可用作原料来制备葡聚寡糖。 
在另一实施方案中，用于步骤(2)中的步骤(1)中提供的α-(1，6)葡聚寡糖可通过能够提供葡聚糖蔗糖酶的微生物进行制备。葡聚糖蔗糖酶对蔗糖底物的作用提供一般分子量高于105kDa的聚合物。 
在又一实施方案中，用于步骤(2)中的步骤(1)中提供的葡聚寡糖可通过直接提供具有期望分子量的葡聚寡糖的合成方法获得。例如，这可利用可产生修饰葡聚糖蔗糖酶的修饰微生物如明串珠球菌属得以实现。适合的葡聚糖蔗糖酶可包括按照WO2007/091178(其援引加入本文)中所述获得的葡聚糖蔗糖酶DSR-S的变异体。这些葡聚糖蔗糖酶突变体以一步法从蔗糖合成受控大小的葡聚糖。 
参照上述方法，含有葡萄糖的原料可用于上述方法的步骤(1a)中，所述原料可包括淀粉或者其它材料(如葡聚糖或麦芽糖浆)。在一优选实施方案中，淀粉用作上述方法的步骤(1a)中的原料。至多100％的淀粉可被转化成水解产物，例如麦芽糖或者麦芽糖浆。由转葡糖苷酶催化的转葡萄糖基化反应将麦芽糖转化成聚合度(DP)主要为2-5的异麦芽糖寡糖(IMOS)，例如异麦芽糖、潘糖、异葡糖基麦芽糖(isopanose)和异麦芽三糖。 
在以上方法中，所述IMOS可与蔗糖和葡聚糖蔗糖酶一起用作受体。 这致使IMOS延长。所述IMOS的骨架由葡萄糖单元延长并形成葡聚寡糖。用于此步骤中的葡聚糖蔗糖酶优先催化α-(1，6)-键的形成。 
可用于本发明的步骤(1b)中的葡聚糖蔗糖酶是本领域已知的，并且未在本文中详细公开。适合的实例是例如从肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B512F、肠膜状明串珠菌B1299和/或肠膜状明串珠菌B742获得的葡聚糖蔗糖酶。 
在本发明方法的一具体实施方案中，当麦芽糖浆用作原料时，其优选地进行本文所述方法的步骤(1a)和(1b)。 
在另一实施方案中，步骤(1)包括使蔗糖与葡聚糖蔗糖酶反应，由此获得α-(1，6)葡聚寡糖。在一优选实施方案中，步骤(1)包括使蔗糖与葡聚糖蔗糖酶在葡萄糖的存在下反应，由此获得α-(1，6)葡聚寡糖。本申请的申请人已发现这使得能够直接合成具有受控的分子量(即集中于特定的MW值)的期望的骨架。本申请的申请人已发现，可通过在反应介质中向蔗糖中加入大量的葡萄糖来制备具有受控的大小的骨架。因此，蔗糖是供体，而葡萄糖起受体的作用(此反应被称为“由受体进行的合成(synthesis by acceptor)”反应)。加入葡萄糖受体使所述结构中α-1，6-键的含量增高，产生更纯的IMOS型产物，即加入葡萄糖有助于获得纯的α-1，6结构(参见图10A)。 
在另一优选实施方案中，步骤(1)还包括调整蔗糖与葡萄糖的比值，由此调整所述α-(1，6)葡聚寡糖的DP特征。降低供体/受体的比值使得能够控制产物的多分散性；例如，在供体与受体的比值为10时，聚合度远远更高，而通过将该比值降至6然后降至2，则限制了高聚合度化合物的合成(参见图10B)。通过加入葡萄糖并调整供体与受体的比值，可在DP和MW的分布曲线方面控制期望的化合物的合成(参见图10C)。 
在步骤(2)中，将额外的葡萄糖单元连接到寡糖或者葡聚寡糖骨架上。它们被连接到骨架中在α-(1，2)-位的葡萄糖单元上，从而形成α-(1，2)-支链。所得化合物是α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖。所述支链通常随机地分布于整个骨架。 
在一优选实施方案中，本发明的方法包括其中将至少15％、20％、25％、30％、35％或40％的α-(1，2)-糖苷侧链引入或者接枝到所述葡聚寡糖骨架上的步骤。此步骤有利地使该制备方法能够产生具有受控的可消化性和可发 酵性的化合物。 
在一优选实施方案中，步骤(2)包括在蔗糖的存在下用适合的葡聚糖蔗糖酶将α-(1，2)-糖苷侧链(优选一个或多个吡喃葡萄糖基(葡萄糖)单元的侧链)引入α-(1，6)葡聚寡糖上，由此获得α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖。在此实施方案中，步骤(2)包括使α-(1，6)葡聚寡糖与葡聚糖蔗糖酶(优选转葡糖苷酶GBD-CD2)在蔗糖的存在下反应。 
可用于本发明的步骤(2)中的葡聚糖蔗糖酶是本领域已知的，并且未在本文中详细公开。在一实例中，适合的葡聚糖蔗糖酶是由天然肠膜状明串珠菌(L.mesenteroides)NRRL B-1299菌株产生的葡聚糖蔗糖酶DSR-E。在另一实例中，用于步骤(2)中的适合的葡聚糖蔗糖酶在WO 02/074943、FR 2822162和FR 2822163(其援引加入本文)中有述，并且优选地包括葡聚糖蔗糖酶DSR-E和/或GBD-CD2。通常，由B-1299菌株或GBD-CD2产生的葡聚糖蔗糖酶可生成α-(1，2)-键。 
本申请的申请人发现，葡聚糖蔗糖酶对具有一个α-(1，6)-葡萄糖单元或者α-(1，6)-葡萄糖单元重复序列的结构的亲和性高于对麦芽糖的亲和性。因此，在步骤(2)中使用IMOS替代麦芽糖的反应在时间和收率方面有所改善。 
在另一实施方案中，本发明提供其中可通过调整受体/蔗糖的比值，特别是步骤(2)中使用的IMOS与蔗糖的比值来控制所述化合物的支化度，优选至少10％至40％的支化度的方法。因此，在另一实施方案中，本发明涉及其中调整步骤(2)中使用的IMOS与蔗糖的比值的方法。 
在一实例中，使用转葡糖苷酶GBD-CD2实现本发明的α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖化合物的合成。通过使用该酶可获得受控量的α-(1，2)-支化。GBD-CD2是由DSR-E(由肠膜状明串珠菌NRRL B-1299天然产生的葡聚糖蔗糖酶)改造(engineer)而得的α-(1，2)转葡糖苷酶。该酶催化糖苷基部分从蔗糖α-(1，2)-转葡萄糖基化到α-1，6-葡聚糖链上。水解和转葡萄糖基化可在作为受体的蔗糖和葡聚寡糖的存在下在该方法的早期进行，其中步骤(1)中所得的葡聚寡糖可具有选定的分子量。本申请的申请人发现，合成的α-(1，2)支链的量或者支化度取决于步骤(2)中使用的蔗糖与α-(1，6)葡聚寡糖的比值。可通过调整步骤(2)中使用的蔗糖与葡聚寡糖的比值获得具有受控的分子量和受控的支化度的α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖。在一实例中，支化 度可为13％至40％不等。如下文实施例中所述，在一优选实施方案中，蔗糖与α-(1，6)葡聚寡糖的摩尔比为约0.10-5.00，并且α-(1，2)-键的百分比(即支化度)为约10％至50％；更优选地，蔗糖与α-(1，6)葡聚寡糖的摩尔比为约0.90-1.00，并且α-(1，2)-键的百分比(即支化度)为约30％至40％。 
可有利地在步骤(1)中使用可直接合成具有期望分子量的葡聚寡糖的酶，然后在步骤(2)中使用可将期望量的α-(1，2)支链引入线性骨架中的酶，从而得到针对具体需要(例如针对具体性能或用途)而特制的α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖化合物库。 
在一实例中，从包括以下步骤的方法获得α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖：步骤(1)，使用WO2007/091178(其援引加入本文)中所述的葡聚糖蔗糖酶DSR-S的变异体；然后步骤(2)，使用WO 02/074943(其援引加入本文)中所述的酶GBD-CD2。 
任选地，本发明的方法还包括纯化步骤以除去不需要的副产物。所述任选的纯化步骤可包括通过过滤纯化α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖，其中纯化的葡聚寡糖的平均分子量为约0.5-100kDa。从反应介质中除去果糖可基于本领域技术的现有状态。例如，超滤可用来分离集中于70kDa的化合物，而在用于分离的任意类型的树脂上通过色谱法富集可用来分离0.5kDa和/或1kDa和/或10kDa的α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖。可使用离子交换树脂，例如其中钙和/或钾作为可交换反离子的阳离子型树脂。 
在另一方面，本发明提供组合物，其包含本文所述的支化的葡聚寡糖化合物。利用上述方法，可控制支化的葡聚寡糖的α-(1，2)-键的量和分子量二者。这有利于制备适合的α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖。可利用本文所述的方法合成大批α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖化合物，为新的组合物提供途径。 
正如下文中更详细的描述，本发明的另一方面提供用于改善个体健康的方法，其包括向个体给药对所述个体的健康发挥有益效应的有效量的包含α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖的组合物。在一实施方案中，所述葡聚寡糖是益生元化合物，其对所述个体的肠微生物群提供有益效应。本发明的葡聚寡糖的有益效应可包括例如改善肠健康、提供镇痛效应(例如改善肠舒适度)、降低脂质含量(即脂肪量)、影响体重(例如体重增长)或者预防或治疗 胃肠道病症、糖尿病或它们的症状。 
这样的有益效应的实例包括：增加短链脂肪酸的产生、降低胃肠道中的气体形成、刺激肠有益菌(例如双岐杆菌)的生长或活性、缓解肠疼痛，及其组合。本发明的葡聚寡糖的另一有益效应可包括例如预防或治疗胆固醇相关的病症或其症状。这样的有益效应的实例包括：增加丙酸的产生、降低血液甘油三酯水平、降低低密度脂蛋白水平，及其组合。 
在本发明的一个方面，所述组合物还包含益生菌，例如乳杆菌属、双岐杆菌属、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、链球菌属、酵母菌属(Saccharomyces)，及其组合。在本发明的另一发明，所述组合物还包含膳食纤维，例如抗性麦芽糖糊精、纤维糊精、聚葡萄糖、菊糖、IMOS、线性和支化葡聚糖、支链淀粉、半纤维素，及其组合。 
本文限定的支化的葡聚寡糖化合物可配制成适合的组合物。术语“组合物”在上下文中可包括例如营养组合物或者食品组合物，例如食品、食品补充剂或者功能性食品。其还可包括药用组合物。本文中使用的术语“食品”意图涵盖供人类摄取和供动物摄取的食物。“功能性食品”是指除了供给营养素的基本营养功能之外还声称具有促进健康和/或预防疾病和/或减轻疾病的性质的任意新鲜食品或加工食品。功能性食品可包括例如加工食品或者用促进健康的添加剂强化的食品。功能性食品的实例是用维生素强化的食品或者用活培养物发酵的食品。 
本发明的组合物还包含本领域中已知的包含于营养组合物中的其它物质，例如水或其它水溶液、脂肪、糖类、淀粉、粘合剂、增稠剂、着色剂、矫味剂、芳香剂、酸化剂(例如乳酸或者苹果酸等)、稳定剂或者高强度甜味剂或者矿物质等。适合的食品的实例包括面包、早餐用谷物制品、饼干、蛋糕、甜饼、薄脆饼干(cracker)、酸乳(yogurt)、酸奶(kefir)、味噌、纳豆、印尼豆豉、朝鲜泡菜、德国泡菜、水、乳、果汁、蔬菜汁、碳酸软饮料、非碳酸软饮料、咖啡、茶、啤酒、葡萄酒、烈性酒、酒精饮料、点心、汤、速冻甜点、油炸食品、披萨、面食品、马铃薯制品、大米制品、玉米制品、小麦制品、乳制品、硬糖、营养棒、谷类食物、生面团、加工的肉食和乳酪、酸乳酪(yoghurt)、冰淇淋甜食、乳饮料、色拉调料、调味汁、糕点装饰配料、甜点、糖果制品、基于谷物的点心棒、事先准备好的餐品(prepared  dish)等。 
本发明的组合物还可包含期望的其它膳食纤维。例如，组合物可包含其它多糖，例如不溶性纤维和可溶性纤维。“膳食纤维”通常指植物食品的基本上不消化的部分，其使食物通过消化系统移动，并吸收水和通便，膳食纤维包括合成而得的纤维以及源自植物或天然来源的那些纤维。 
根据一些定义，“膳食纤维”是指具有10个或更多个单体单元的碳水化合物聚合物(或者在一些情况中具有3-9个单体单元的碳水化合物)，其不被人小肠中的内源酶水解，并且属于以下类别：(1)摄取的食物中天然存在的可食用的碳水化合物聚合物，或者通过物理、酶或化学手段从原食材已得到的以及已证明具有经公认的科学证据证实的健康裨益的碳水化合物聚合物，和/或(2)已证明具有经公认的科学证据证实的健康裨益的合成碳水化合物聚合物。 
膳食纤维可包括非淀粉类多糖例如纤维素，以及许多其它植物组分例如糊精、菊糖、木素、甲壳质、果胶、β-葡聚糖、寡聚果糖、抗性淀粉、可溶性玉米(葡萄糖)纤维(soluble corn(gluco)fiber)、聚葡萄糖，以及树胶例如瓜耳胶、槐豆胶、黄原胶或者支链淀粉胶。已知一些膳食纤维对胆固醇和葡萄糖水平具有有益效应。适合的可溶性和不溶性纤维来源可商购获得。 
适合的纤维的实例是菊糖或其水解产物。所述菊糖可以以天然提取物的形式提供，其适合于人类摄取。适合的菊糖提取物可从Orafti NV Belgium以商标“Raftiline”获得。例如，所述菊糖可以以RaftilineTM ST的形式提供，其是包含约90重量％至约94重量％的菊糖、至多约4重量％的葡萄糖和果糖，以及约4重量％至9重量％的蔗糖的白色细粉。所述菊糖的平均聚合度为约10至约12。菊糖的水解产物是果糖低聚物形式的寡聚果糖，其包含1-蔗果三糖(GF2)、真菌四糖(GF3)和1F-呋喃果糖基真菌四糖(GF4)，其中果糖基单元(F)分别通过β-(2，1)-键与蔗糖(GF)连接。所述寡聚果糖可从例如Orafti NV，Belgium以商标“Raftilose”商购获得。在一优选实施方案中，菊糖提取物从Sensus获得。优选的Sensus产品包括Frutafit HD和Frutafit TEX！。Frutafit HD是较短链的菊糖(约8-13个单体单元)，Frutafit TEX！是较长链的菊糖(＞22个单体)。在实施例和附图中，它们通常由菊糖(即短链)或者菊糖TEX(即长链)表示。 
在一优选实施方案中，本发明的组合物可包含至少两种纤维源。在一更优选的实施方案中，一种纤维源是本发明的α-(1，2)-支化的α-(1，6)-葡聚糖，而第二纤维源是选自抗性麦芽糖糊精、聚葡萄糖、可溶性玉米(葡萄糖)纤维、纤维糊精、支链淀粉、抗性淀粉、菊糖、寡聚果糖、寡聚半乳糖、半纤维素和果糖低聚物浆或者乳果糖或者任意其它益生元化合物(包括益生元二糖例如乳果糖和塔格糖等)的寡糖或多糖。含有α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖的纤维源的该组合的结果是益生元被供给至个体的胃肠道的较大部分，从而所述益生元不仅在小肠的第一部分中发酵，而且在结肠的整个长度中发酵。通过改变不同化合物的比值，可能可靶向从结肠的近端、中部至远端的发酵部位。因此，对所述个体遍及整个结肠长度的肠微生物群生态发挥有益效应。若使用可溶性纤维和不溶性纤维二者，则可溶性纤维与不溶性纤维的重量比优选为约1∶4至约4∶1；更优选约1∶1至约2∶1。 
当所述营养组合物是食品或营养配方(nutritional formula)的形式时，所述营养组合物可包含蛋白质源、脂质源和/或碳水化合物源。这些来源可视需要进行选择，并且是本领域公知的。本发明的组合物也可包含维生素和矿物质或者高强度/高效甜味剂。例如，可提供足够的维生素和矿物质，以使每1000卡的所述营养组合物供给推荐的维生素和矿物质每日规定量的约25％至约250％。 
本文所述的化合物和组合物可用作益生元，或者当与下述益生菌组合使用时用作“合生剂(synbiotics)”。“益生元”是指通过选择性地刺激胃肠道特别是结肠中的有限数量的细菌的生长和/或活性来有益地影响个体，由此改善宿主健康的食品成分。益生元的实例包括寡聚果糖、菊糖、聚葡萄糖、抗性淀粉、可溶性玉米(葡萄糖)纤维、寡聚葡萄糖和寡聚半乳糖、阿拉伯糖基木糖寡糖(arabinoxylan-oligosaccharide)以及乳果糖。 
在另一实施方案中，本发明的组合物还包含益生菌。“益生菌(probiotic organism)”是指活微生物膳食补充剂，其通过它们在消化道中的功能为个体提供有益效应。为了发挥效应，所述益生微生物必须能够在消化条件下存活，并且它们必须能够在绝不损及所述个体的情况下至少暂时地在胃肠道中形成集落。仅有某些微生物菌株具有这些性质。优选地，所述益生菌选自：乳杆菌属、双歧杆菌属、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、肠球菌属、埃希 氏杆菌属、链球菌属和酵母菌属。具体的微生物包括但不限于：枯草杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bificum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、屎肠球菌、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、罗氏乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、屎链球菌(Streptococcus faecium)、双乙酰乳酸链球菌(diacetilactus)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、鲍氏酵母菌(Saccharomyces boulardii.)、Torulopsia、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)和链霉菌(Streptomyces)等，包括它们的营养性孢子、非营养性孢子(芽孢杆菌属)及合成衍生物。根据本发明，更优选的益生微生物包括但不限于以下三种细菌属的成员：乳杆菌属、双岐杆菌属和酵母菌属。在一优选实施方案中，所述益生菌是双岐杆菌属。 
所述益生菌可以以其在水或另一种液体或半固体介质中的培养物的形式掺入到所述组合物中，在所述培养物中所述益生菌仍然有活力。在另一种技术中，可将包含所述益生菌的冻干粉通过混合或掺和掺入颗粒材料或者液体或半固体材料中。 
在一优选实施方案中，所述组合物所含的益生菌的量为至少1000个细胞/10g，优选10,000个细胞/10g，更优选100,000个细胞/10g，最优选1,000,000个细胞/10g。应理解任何提及的益生菌细胞计数是指活细胞数。两种或更多种益生菌可用于组合物中。 
本发明的葡聚寡糖和包含它们的组合物具有缓慢的可发酵性。这导致产生气体的量低而且平缓，由此减轻与其相关的症状。菊糖快速且大量地促进气体生成，而与菊糖相比，本发明的葡聚寡糖较低量地逐渐释放气体。参见例如实施例10和图8A及8B。快速峰(rapid peak)造成胃肠不适例如气胀和胃气胀，而若是逐渐且低量地产生气体，则身体可更容易地应对。 
依据体外消化数据(参见例如实施例4、图4A和4B以及实施例12)， 本发明的葡聚寡糖因α-(1，2)支化而至少部分地不可消化。相信支化水平越高，则化合物的抗消化性越好，并且分子越大，则可消化性越低。支化避免被人类酶消化，并且分子越大，则在结肠中的发酵速度(即可被细菌消化的速度)越低。不可消化性是纤维的重要特征。本发明的葡聚寡糖可依据此特征归类为纤维。 
使用本发明的化合物使得能够产生短链脂肪酸，特别是丙酸。已知丙酸降低胆固醇。因此，本发明的化合物可降低罹患高胆固醇的风险。出人意料的是，在发酵研究中，低于100kD的葡聚寡糖的缓慢可发酵性刺激短链脂肪酸特别是丙酸的产生。由于丙酸的产生或者丙酸与乙酸的比值增高有益于控制有此需要的哺乳动物中的胆固醇水平，故此本发明对营养学家和消费者而言具有特别意义用以预防和/或治疗心血管病症风险。故此，本发明的另一方面提供用于改善个体健康(例如用于治疗胆固醇相关的疾病)的方法，其包括向个体给药对所述个体的健康发挥有益效应的有效量的包含α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖的组合物。此外，公知短链脂肪酸降低肠内的pH并且这有助于钙吸收。故此，本发明的化合物还可影响矿物质吸收。这意味着它们还可通过因肠中SCFA增加而降低pH，从而改善骨健康，或者预防或治疗骨质疏松。 
“个体”通常是人类，但是本领域技术人员应理解，所述个体可以是非人类的动物。故此，其它个体可包括哺乳动物，例如啮齿类动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔、牛、马、山羊、绵羊、猪和灵长类动物(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)。 
本文中使用的术语“胆固醇相关的疾病”包括但不限于涉及血浆中胆固醇(特别是非高密度脂质(非HDL)胆固醇)的水平升高的病症，例如LDL胆固醇水平升高和HDL/LDL比值升高、高胆固醇血症以及高甘油三酯血症等。在患有高胆固醇血症的患者中，降低LDL胆固醇是治疗的首要目标之一。在患有高甘油三酯血症的患者中，降低高血清甘油三酯浓度是治疗的首要目标之一。具体而言，本文定义的胆固醇相关的疾病的治疗包括通过给药本发明的α-(1，2)-支化的α-(1，6)-葡聚糖或者包含本发明的α-(1，2)-支化的α-(1，6)-葡聚糖的组合物来控制血液胆固醇水平、血液甘油三酯水平、血液脂蛋白水平、血糖和胰岛素敏感度。 
“有效量”的本文所述的化合物或组合物是指在剂量下且经所需时间有效实现期望的治疗结果(例如降低血液胆固醇或者预防或治疗胃肠道病症)的量。例如，向个体给药的组合物的量会取决于诸如个体的健康状况、个体的体重、个体的年龄以及组合物是否是唯一营养源等因素而变化。医师或营养师可容易地确定有效量。通常，给药足量的所述组合物以向所述个体提供每天至多约40g的(不溶性和可溶性)膳食纤维；例如，约25g至约35g膳食纤维/天。所述个体接受的α-(1，2)-支化的α-(1，6)-葡聚糖的量优选为约0.1g至约15g/天，或者至多约40g/天。本文限定的化合物或组合物可以多剂量摄取(例如分散在整天中的2-5次摄取或者急性(acutely)摄取)，或者可以单剂量摄取。本文限定的化合物或组合物还可在期望的时期内持续摄取。在某些实施方案中，所述期望的时期为至少1周，或者至少2周，或者至少3周，或者至少1个月，或者至少6个月。 
在一优选实施方案中，本发明提供通过向有此需要的个体给药本文限定的化合物或组合物来降低该有此需要的个体中的血液甘油三酯水平的方法。在另一优选实施方案中，本发明提供通过向有此需要的个体给药本文限定的化合物或组合物来降低该有此需要的个体中的低密度脂蛋白水平的方法。在另一优选实施方案中，本发明提供通过向有此需要的个体给药本文限定的化合物或组合物来增高该有此需要的个体中的高密度脂蛋白水平的方法。 
在另一方面，本发明提供含有至少15％的α-(1，2)-糖苷侧链的葡聚寡糖。这些α-(1-2)支链的存在赋予该葡聚寡糖特定的性质；实际上人类的消化系统一般不具有水解此类键所需的酶途径。这些支链的存在赋予葡聚寡糖部分或完全的不可消化性，因此，葡萄糖几乎未被吸收或者较缓慢地被吸收入体内，由此导致血糖反应(glycemic response)低。因此，本发明提供本文限定的葡聚寡糖，其用于制备导致血糖反应低的食品和饮料组合物。例如，这些化合物可用来替代糖或者其它可快速消化的碳水化合物，并由此降低食品的升糖负荷(glycemic load)、降低热量和/或降低食品的能量密度。另外，含有此类键的葡聚寡糖的稳定性使它们能够容易地通过并进入大肠，在其中它们可用作对结肠微生物群具有特异性的底物。因此，这些葡聚寡糖具有作为益生元的特征。 
在另一实施方案中，本发明的化合物用于治疗和/或改善肠健康。所述支化的葡聚寡糖在肠中被肠微生物群发酵，并且在体外肠模型中表现出与菊糖相比改善的耐受性，即与菊糖相比，所述支化的葡聚寡糖的发酵导致气体产生较少，并且减轻因气体形成所致的不适，例如气胀和胃气胀。故此，本发明还涉及通过向有此需要的个体给药本文限定的化合物或组合物来减轻所述个体胃肠道中的气体形成，从而减轻由于气胀和胃气胀引起的肠疼痛或者肠不适的方法。在其它实施方案中，本发明的组合物为个体提供对食品发酵的改善的耐受性，并且可与纤维例如菊糖或者FOS、GOS或乳果糖组合以通过降低气体产生来改善耐受性。 
在另一实施方案中，以影响体重增长的量有效给药本发明的化合物，例如随着时间降低体重增长(参见例如以下实施例9，其中相对于对照，用本发明的化合物治疗的大鼠在给药4周后表现出较少的体重增长)。这表明本发明的化合物影响体重增长，并且可用来预防或治疗肥胖，或者有助于控制重量。此外，由于公知一些纤维如菊糖可诱导GLP1，故而本发明的化合物还可影响食物摄入，由此产生较小的体重增长(GLP1具有许多已知的生理功能，包括通过增加饱满感来减少食物摄入以及增加胰腺分泌的胰岛素)。在另一实施方案中，以降低个体的脂质含量(即通过降低个体的脂肪量)的有效量给药本发明的化合物(参见例如以下实施例11)。 
在其它实施方案中，可以产生以下任一种效应的有效量向个体给药本发明的化合物：(1)抗菌效应(通过刺激有益菌，葡聚寡糖可有助于对抗致病菌例如沙门氏菌属(Salmonella)的生长)；(2)对食物摄入和胰岛素敏感度的效应(并由此预防或降低代谢综合征、糖尿病和/或肥胖的风险)，其是通过影响GLP1释放以及可能地影响与食欲调节和胰岛素分泌相关的其它肠激素实现的；(3)对发育进程(developmental programming)的效应，其是通过在怀孕和/或哺乳期间给药葡聚寡糖实现的(这可影响胎儿和/或婴儿，由此通过影响GLP1和/或肠内微生物群(代谢物)来预防以后生命中的胰岛素抗药性/肥胖)；(4)通过因SCFA产生(发酵)降低pH而影响钙吸收；(5)由于已证明益生菌影响孤独症、阿尔茨海默病、变态反应、类风湿性关节炎、其它免疫缺陷等，因此本发明的化合物也可具有相同效应，因为所有这些疾病至少部分地起因于炎症，而炎症可通过使菌群转变为减轻局部(肠)和全身炎症 的有益菌而得以消除；(6)预防或治疗炎性肠疾病和/或肠易激综合征，因为已证明给药本发明的化合物在克罗恩病的动物模型中改善炎性反应。 
参考以下实施例进一步描述本发明。 
实施例
实施例1 
表1显示平均分子量为1-70kDa并含有至少15％的α-(1，2)-糖苷侧链的本发明的α-(1，2)-支化的α-(1，6)化合物的实施方案。 
表1 
表1中所列化合物可通过实施本文公开的本发明的方法获得。 
以下实施例中使用的F1或DEX 1000-15是指表1中的化合物1；F2或DEX 1000-30是指表1中的化合物2；并且F3或DEX 7000-30是指表1中的化合物8。 
实施例2 
表2显示本发明的包含α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖的组合物的实施方案。 
表2：浓缩调味水(Enriched Flavored Water) 
实施例3 
此实施例说明本发明的α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖化合物在发酵研究中的使用。如下述实验所证明，本发明的化合物在胃肠道中诱导短链脂肪酸的产生。 
从4位瘦且健康的男性志愿者(年龄30-36岁)获得粪便样品，所述志愿者不患有已知的代谢疾病和胃肠疾病(例如糖尿病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、肠易激综合征、消化性溃疡和癌症)。现场采集样品，保存在厌氧箱中(10％H2、10％CO2、80％N2)，并且在采集后最迟15分钟内使用。配制在厌氧PBS[0.1mol/l磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)]中的1/10w/v稀释液，并将样品在均质器(stomacher)中在正常速度下均质化2分钟。评价以表1中的化合物为代表的测试物质。 
准备无菌搅拌的10批培养发酵系统(100ml工作体积)，并且无菌填充45ml基础培养基(胨水2g/l，酵母提取物2g/l，NaCl 0.1g/l，K2HPO4 0.04g/l，KH2PO4 0.04g/l，MgSO4·7H2O 0.01g/l，CaCl2·6H2O 0.01，NaHCO3 2g/l，Tween 80 2ml，Hemin 0.05g/l，维生素K1 10μl，半胱氨酸·HCl 0.5g/l，胆汁盐0.5g/l，pH 7.0)，并且过夜充入无氧的氮气。将碳水化合物(1/10w/v)加入发酵容器后，立即加入粪便浆状物。温度保持在37℃，并且使用Electrolab pH控制器将pH控制在6.7-6.9。对各容器接种5ml新鲜粪便浆状物(1/10 w/v)。进行分批培养48小时，并且在0h、5h、10h、24h、36h和48h从各容器中采集5ml样品用于荧光原位杂交(FISH)和短链脂肪酸(SCFA)分析。 
使用用荧光染料Cy3标记的靶向16S rRNA分子的特定区域的合成寡 核苷酸探针对双岐杆菌属(Bif164)、拟杆菌属/普里沃菌属(Prevotella)(Bac303)、乳杆菌属/肠球菌属(Lab158)和产气荚膜梭菌溶组织梭菌亚类(C.perfringens，histolyticum subgrp)(Chis 150)进行计数。使用种群特异性16S rRNA靶向的寡核苷酸探针，通过荧光原位杂交测定人粪便中的细菌群落的变化。使用荧光显微镜显现被标记的细胞。 
将在各取样时间从各容器中获得的325μl样品在1275μl 4％(w/v)多聚甲醛中固定4h(4℃)。将被固定的细胞在15,000×G下离心5min，并在1ml过滤的无菌PBS中清洗2次。将已清洗的细胞再悬浮于150μl过滤的PBS中，并在-20℃下在150μl乙醇(99％)中保存至少1h，然后进一步处理。将10μl上述样品稀释于适量的PBS中以获得在各视野中20-100个荧光细胞，并将20μl以上溶液加入到6孔特氟隆/聚-L-赖氨酸涂布的载玻片(Tekdon Inc.，Myakka City，USA)的各孔中。将样品在干燥箱(46℃)中干燥15分钟。然后使用乙醇系列(50％，80％和96％(v/v)乙醇)在各溶液中使它们脱水3分钟。将载玻片返回至烘箱中，持续2分钟以蒸发过量的乙醇，然后加入杂交混合物。 
将50μl杂交混合物(5μl探针和45μl杂交缓冲剂)加入各孔中，并置于微阵列杂交孵化器中杂交4小时。杂交后，将载玻片在50ml清洗缓冲剂中清洗15分钟，将它们浸入冷水中数秒，并用压缩空气干燥。将5μl的ProLong Gold抗荧光衰减试剂(antifade reagent)加入到各孔上，并将盖玻片置于各载玻片上(20mm盖玻片)。将载玻片在室温下置于暗处过夜，然后计数。在表面荧光显微镜Nikon Eclipse 400(Nikon，Surrey，UK)下使用Fluor 100镜头检测载玻片。对于各孔，对15个不同的视野计数。 
使用FISH获得细菌计数。对于该报告进行计数的群落是人粪便中的主要的4种在数量和功能上有意义的细菌群。此外，在48h发酵期中采集用于FISH分析的样品中，仅对在0h、10h、24h和36h的样品进行计数。关于发酵持续时间、采样时间和要计数的样品的选择的决定基于在非pH控制的分批培养实验中研究气体产生速度的初步实验，该实验表明大约在发酵的9h开始释放气体，并且在发酵的36h气体释放几乎全部结束(在此未提供结果)。结果以图表方式显示于图1和图2中。 
从图1中所示和被计数的细菌群可得出结论：特别是1kDa支化的葡 聚寡糖作为底物时，表现出基于选择性发酵和双歧生成性(bifidogenicity)的良好的益生元潜力。它们表现出双岐杆菌(其在分批培养发酵24h后仍然存活)的显著增长，而且与阳性对照(菊糖TEX)相比，提供更好的双歧生成效应。如图2中所示，相对于乙酸以及绝对而言，α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚糖的发酵使丙酸的产生增加。 
所述化合物的乙酸与丙酸的比值如下(参见表3)。 
表3 
图3还显示了在控制pH的分批培养发酵中乙酸与丙酸的比值(mM)。 
实施例4 
此实施例说明本发明的α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖化合物在降解性研究中的使用。用于实施降解性研究的方法如Kendall等人，2008(Effect of  Novel Maize-based Dietary Fibers on Postprandial Glycemia and Insulinemia，Kendall等人，Journal of the American College of Nutrition，第27卷，第6期，711-718，2008)所述。测定具有受控的分子量(1kDa或40kDa)和受控的支化度(％支化：0％、16％或者32％)的α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖的可消化性特征。 
如图4A和4B中所示，与现有技术化合物相比，本发明的化合物具有降低的可消化性。降低的可消化性是有利的，因为它提供更高的纤维含量和/或更高的益生元含量。另一益处是较低的剂量。抗消化性取决于长度和支化水平。例如，40KD比1KD更不易消化，并且高度支化的分子比非支化的分子更不易消化。根据此体外消化数据可得出结论：本发明的葡聚寡糖由于α-(1，2)支化而至少部分地不可消化，因为相信支化水平越高，则所述化合物的抗消化性越好，并且所述化合物越大，则可消化性越低。 
实施例5 
此实施例涉及与提供有其它对照化合物例如菊糖的样品相比，对提供有本发明化合物的来自人类个体的粪便样品中气体产生的体外研究。除非另外说明，所有使用的试剂均购自Sigma laboratories(Gillingham，Dorset，UK)。将装有13.5ml预还原基础培养基的无菌玻璃管(18×150mm，Bellco，Vineland，New Jersey，USA)置于厌氧箱(10％H2，10％CO2和80％N2)中并保持过夜。将测试底物(1/10w/v)加入管中，然后加入粪便接种物(1/10w/v)。然后将该管用气密性丁基橡胶隔片(Supelco，Gillingham，Dorset，UK)和铝卷边(Supelco，Gillingham，Dorset，UK)进行密封。将该管在恒定搅拌下在37℃下进行孵育。 
通过将与传感器(transducer)相连的无菌针插入各管的丁基橡胶隔片中来获得每3h直至36h发酵的各底物的顶部空间压力读数。在各次测量后，使各管的顶部空间与大气平衡。对各底物，一式四份地进行气体产生实验。使用通过用0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml和7ml的注射器将空气导入管内而得的气压(PSI)校准曲线来定量气体量(ml)。 
所得数据和相应的图表显示于图5和表4中。与阳性对照菊糖相比，本发明的支化葡聚寡糖引起较小的气体产生，表明它们的耐受性优于菊糖。 因此，使用这些化合物有利于人类膳食的纤维强化，特别是对肠中气体产生敏感的个体，例如对患有便秘、肠易激综合征或者克罗恩病(慢性结肠炎症)的个体。就此而言，所述化合物还可有益于宠物及其它动物。 
表4：提供有本发明化合物和现有技术化合物的供体或对照中的气体产生 
  底物   平均总气体量(n＝4供体，ml)   标准偏差
  1kDa+16％α-1，2   10.99   1.27
  1kDa+32％α-1，2   11.12   1.27
  6kDa+33％α-1，2   12.18   1.26
  70kDa+15％α-1，2   11.97   1.02
  70kDa+37％α-1，2   11.96   1.19
  菊糖TEX   16.89   4.19
  菊糖(阳性对照)   15.16   5.02
  阴性对照   3.31   0.33
此外，下表5显示36h内非pH控制的分批培养发酵(n＝4)中的气体产生速度(以ml/h表示)。 
表5 
实施例6 
此实施例说明本发明的具有受控的分子量和支化度的一系列支化葡聚寡糖化合物的合成。已对作为受体的具有不同MW的线性葡聚寡糖进行若干受体反应。 
在已灭菌的反应器中，将蔗糖、葡聚寡糖和酶GBD-CD2溶于蒸馏水中并搅拌。将pH调节至5.4，并将温度调节至30℃。在搅拌下进行反应24h，然后将该罐加热至60℃。然后在截留(cut off)为0.8μm的纤维素膜上过滤受体反应产物。通过将热的1kD和6kDa支化样品上样到离子交换树 脂(Amberlite 1320K+)色谱柱上，以水作为流动相，来除去果糖。在截留为10kD的Filtron膜上通过透析过滤来纯化40kD和70kD样品。冷冻样品，然后使用常规方法在冻干机上冻干。将不同比值的供体/受体(即蔗糖/线性葡聚寡糖)在固定量的转葡糖苷酶GBD-CD2的存在下孵育。不同的比值在表5中有述。所得的化合物列于上表1中。 
表5 
实施例7 
将从肠膜状明串珠菌NRRL B-512F获得的不同量的平均分子量为70kDa的α-1，6-葡聚寡糖与蔗糖(292mM)和GBD-CD2(1U/ml)在30℃下在补充有3.4mM氯化钙的乙酸钠缓冲液20mM(pH 5.4)中孵育12小时。α-1，6-葡聚糖的用量为62mM、309mM、463mM、1235mM和2470mM。 
如上述的70kDa葡聚寡糖，在300mM浓度下使用葡聚寡糖10kDa、40kDa、70kDa和2000kDa。通过HPLC测定蔗糖消耗(depletion)和葡萄糖/果糖生成。用1体积的乙醇95％沉淀所得的支化葡聚寡糖，通过离心收集，并用1体积的超纯水洗涤3次。重复此操作1次。其后，冻干所得的产物。记录NMR谱图以计算α-(1，2)支化度。相对于13C-NMR，优选1H-NMR，因为它为来自纯α-(1，2)-支化的α-1，6-葡聚寡糖的端基氢(anomeric proton)的信号提供更高的信噪比。 
如下从通过峰面积的积分而得的相应的端基碳或氢信号的相对强度计算制得的不同葡聚寡糖的α-(1，2)-支化百分比： 
％α-(1，2)支化＝(100×(Ib+Ic)/2)/(Ia+Ib+Ic) 
Ia、Ib、Ic是端基共振(anomeric resonance)强度。A是来自线性主链的 α-1，6连接的D-Glc吡喃糖基残基的“游离碳2”的端基共振。B是来自线性主链的α-1，6连接的D-Glc吡喃糖基残基的端基共振，其中碳2参与与支化的葡萄糖基单元的α-(1，2)键。C是来自α-(1，2)-连接的D-Glc吡喃糖基(即支化点)的端基共振。 
[蔗糖]/[葡聚寡糖]初始摩尔比能够控制葡聚糖中的α-(1，2)支化百分比。在较高的初始比下，α-(1，2)键的形成降低，较大部分的葡萄糖基残基被转移至果糖上以产生明串珠菌二糖，或者被释放入培养基中产生葡萄糖(水解)。由于在培养基中果糖浓度高，因此在反应结束时，明串珠菌二糖的产生增加。 
对在[蔗糖]/[葡聚寡糖]初始比为4.74下制得的支化葡聚寡糖观察到α-(1，2)键的最高值(40％)。在[蔗糖]/[葡聚寡糖]初始比为0.63下，获得α-(1，2)键的高百分比与副产物的低收率之间的最佳折中。使用此比值，蔗糖的69％的葡萄糖基被转移至α-(1，6)葡聚寡糖上，产生35％的α-(1，2)键的程度。 
可通过选择用于受体反应的[蔗糖]/[葡聚寡糖]初始摩尔比来控制α-(1，2)-键的程度。通过将该比值从约0.92变为约4.74，获得支化度为10％至40％的α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖。 
表6显示在292mM蔗糖和浓度为62-2470mM的不同分子量的葡聚糖(葡聚寡糖浓度以葡萄糖基单元当量表示)的存在下通过1H-NMR和13C-NMR测定的α-(1，2)-支化的α-1，6-葡聚寡糖的α-(1，2)-键的百分比。 
表6 
实施例8 
在[蔗糖]/[葡聚寡糖]初始比为0.95下，在10kDa、40kDa、70kDa或 者2000kDa葡聚寡糖的存在下进行受体反应。依据13C-NMR测定，所有产物均显示出37％至39％的相似的α-(1，2)键含量。令人惊讶地，无论受体(即来自步骤(1)中的葡聚寡糖)的分子大小如何，该转葡糖苷酶效果均相同。在步骤(2)中用作受体的步骤(1)中所得的α-1，6-葡聚寡糖的分子量对形成的α-(1，2)-键的量没有影响。GBD-CD2的α-(1，2)-转葡糖苷酶活性与来自步骤(1)的产物的聚合度无关，至少对于聚合度(DP)为60-12500个葡萄糖基(glc)单元的α-(1，6)葡聚寡糖而言是如此。 
实施例9 
在健康大鼠中测试α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖的镇痛性质和重量控制效应。本研究的目的是在健康大鼠中评价在两种浓度(饮食的1％和5％)下给药3周α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖是否增加肠舒适度并影响体重增长。具体而言，通过结肠直肠胀研究评价结肠敏感性，并且在整个实验过程中称重动物。 
在此研究中使用重约150g的雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River，l’Arbresle，France)。在实验前，使大鼠在实验室条件下饲养1周。按照5只/笼圈养动物，并且可随意进食和进水。通过测量在结肠直肠胀(CRD)过程中因导入结肠的气囊膨胀诱导行为反应(behavorial response)所需的结肠内压来评价动物中的伤害感受。此反应的特征在于动物身体的后部升高和相当于严重收缩的明显可见的腹部收缩。简言之，用挥发性麻醉剂(2％异氟烷)麻醉大鼠，将气囊从肛门以最小侵害的方式插入直肠内7cm，并用胶带将导管固定于尾底部。5分钟后，将大鼠置于40×40-cm Plexiglas箱的中间，并且将导管连接至电恒压器装置(Distender Series IIRTM，G&J Electronics)。持续施加增高的压力直至表现出疼痛行为或者达到80mm Hg的截止压。 
测试80只大鼠： 
10只大鼠对照 
10只大鼠+吗啡(1只在CRD测定前30分钟进行皮下注射(1mg/kg)) 
10只大鼠+F1 1％(DEX1000-15) 
10只大鼠+F1 5％(DEX1000-15) 
10只大鼠+F2 1％(DEX1000-30) 
10只大鼠+F2 5％(DEX1000-30) 
10只大鼠+F3 1％(DEX7000-30) 
10只大鼠+F3 5％(DEX7000-30) 
本文中使用的F1或者DEX 1000-15是指表1中的化合物1。F2或者DEX 1000-30是指表1中的化合物2。F3或者DEX 7000-30是指表1中的化合物8。如下所述，1％或者5％是指占饮食的百分比。 
按照理论食物消耗(大鼠的食物摄入10g/100g体重)来确定每日一次通过口腔管饲法向大鼠给药的每种本发明的α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖的量。将各纤维再悬浮于1ml饮用水中。 
5％相当于0.75g纤维/大鼠/天。 
1％相当于0.15g纤维/大鼠/天。 
在3周的纤维给药期间，每周一次测定各大鼠的体重(图6A)。利用常规细菌分析方法，使用用于细菌生长的选择性培养基，来测定在3周给药期之前和之后大鼠中粪便菌群的进化。 
图6A显示在4周纤维给药期间大鼠体重增加的评价。其表明相对于对照(水)，在用占饲料1％和5％的F1、占饲料5％的F2和占饲料1％的F3治疗的大鼠中，在4周后体重增长的显著差异。相对于对照，在给药4周后，用本发明的葡聚寡糖治疗的大鼠表现出较小的体重增长。这表明可向个体给药影响体重增长(例如通过随着时间降低体重增长)的有效量的所述葡聚寡糖，并由此有助于控制体重。 
图6B显示根据大鼠中结肠直肠胀研究结果的α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖的镇痛性。1％和5％的F2(DEX 1000-30)以及1％的F3(DEX 7000-30)具有镇痛性，并且改善健康大鼠的肠舒适度。故此，可向个体给药提供镇痛效应和/或改善肠舒适度的有效量的本发明化合物。 
此外，在4周治疗后，评价F1、F2和F3对大鼠的肠微生物群的效应。结果显示于图7中。与对照相比，所测试的产物显示出乳酸杆菌数的增加，表明它们发挥益生元效应。最有效的产物是5％剂量的DEX 1000-30。至于致病菌，与对照相比，5％的DEX 1000-30和5％的DEX 7000-30在给药4周后显示出粪便中肠球菌数的降低。故此，可向个体给药减少肠中致病菌的有效量的本发明化合物。 
总之，基于体重增长数据、结肠直肠胀数据以及在被治疗动物的粪便菌群的研究中获得的数据，以5％使用的DEX 1000-30(上表1中的化合物2)是最有效的产物。 
实施例10 
在实施例3中，在控制pH和温度的分批培养实验中，使用来自4位瘦且健康的供体的粪便浆来评价本发明的葡聚寡糖的效能。此实施例提供该研究的下一步骤，其包括在与利用来自瘦且健康的供体的材料相同的实验条件下体外评价选定的测试底物的效应，并且在此系列实验中使用来自4位健康的肥胖供体的实验浆。其目的是确认，与瘦供体比较，在肥胖供体中，在细菌群的组成和它们的代谢活性以及它们对选定底物的反应方面的可能差异。 
来自瘦分批培养的结果表明，大多数发酵在发酵的前36h中完成，并且肥胖实验可在36h时间点终止。因为此组的发酵性质未知，所以培养进行48h。 
从4位不患有已知的代谢疾病和胃肠疾病(例如糖尿病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、IBS、消化性溃疡和癌症)的肥胖且健康的男性志愿者(年龄44.5±5.74岁；BMI 37.7±3；腰围125.9±9.86)获取粪便样品。现场采集样品，保存在厌氧箱中(10％H2、10％CO2、80％N2)，并且在采集后最迟15分钟内使用。配制在厌氧PBS[0.1mol/l磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)]中的1/10w/v稀释液，并将样品在均质器中在正常速度下均质化2分钟。 
评价以下高纯益生元： 
葡聚糖1kDa、葡聚糖1kDa+16％α-1，2、葡聚糖1kDa+32％α-1，2、葡聚糖6kDa、葡聚糖6kDa+33％α-1，2、葡聚糖70kDa+15％α-1，2、葡聚糖70kDa、葡聚糖70kDa+37％α-1，2，以及菊糖TEX(97％)。 
准备无菌搅拌的分批培养发酵系统(100ml工作体积)，并且无菌填充45ml基础培养基(胨水2g/l，酵母提取物2g/l，NaCl 0.1g/l，K2HPO4 0.04g/l，KH2PO4 0.04g/l，MgSO4·7H2O 0.01g/l，CaCl2·6H2O 0.01，NaHCO3 2g/l，Tween 802ml，Hemin 0.05g/l，维生素K1 10μl，半胱氨酸·HCl 0.5g/l，胆汁盐0.5g/l，pH 7.0)，并且过夜充入无氧的氮气。将碳水化合物(1/10w/v)加 入发酵容器后，立即加入粪便浆状物。温度保持在37℃，并且使用Electrolab pH控制器将pH控制在6.7-6.9。对各容器接种5ml新鲜粪便浆状物(1/10w/v)。进行分批培养48小时，并且在0h、10h、24h、36h和48h从各容器中采集5ml样品用于FISH和SCFA分析。 
寡核苷酸探针。使用用荧光染料Cy3标记的靶向16S rRNA分子的特定区域的合成寡核苷酸探针对粪便细菌进行计数。使用Bif164(双岐杆菌属)和Ato291(奇异菌族)探针对属于放线菌门的大多数细菌进行计数。 
一系列探针用来对硬壁菌(Firmicutes)门的大部分进行计数：乳杆菌属/肠球菌属(Lab158)、产气荚膜梭菌溶组织梭菌亚类(Chis150)、梭菌IX群(Prop853)、瘤胃球菌(Ruminococcus)群(Rbro730/Rfla729)、Faecalibacterium prausnizii群(Fpra655)和直肠真杆菌(E.rectale)/球形梭菌(C.coccoides)群(Erec482)。 
最后，使用拟杆菌/普雷沃菌(Prevotella)(Bac303)和纤维黏菌属(Cytophaga)-产黄菌属(Flavobacter)-拟杆菌门(CFB719)对大多数拟杆菌计数。 
荧光原位杂交(FISH)。将在各取样时间从各容器中获得的325μl样品在1275μl 4％(w/v)多聚甲醛中固定4h(4℃)。将被固定的细胞在15,000×G下离心5min，并在1ml过滤的无菌PBS中清洗2次。将已清洗的细胞再悬浮于150μl过滤的PBS中，并在-20℃下在150μl乙醇(99％)中保存至少1h，然后进一步处理。 
将10μl上述样品稀释于适量的PBS中以获得在各视野中20-100个荧光细胞，并将20μl以上溶液加入到6孔特氟隆/聚-L-赖氨酸涂布的载玻片(Tekdon Inc.，Myakka City，USA)的各孔中。将样品在干燥箱(46℃)中干燥15分钟。然后，使用乙醇系列(50％，80％和96％(v/v)乙醇)在各溶液中使它们脱水3分钟。将载玻片返回至烘箱中，持续2分钟以蒸发过量的乙醇，然后加入杂交混合物。 
将50μl杂交混合物(5μl探针和45μl杂交缓冲剂)加入各孔中，并置于微阵列杂交孵化器(Grant-Boekel，Cambridge，UK)中杂交4小时。杂交后，将载玻片在50ml清洗缓冲剂中清洗15分钟，将它们浸入冷水中数秒，并用压缩空气干燥。将5μl的ProLong Gold抗荧光衰减试剂(Invitrogen Ltd.， Paisley，UK)加入到各孔上，并将盖玻片置于各载玻片上(20mm盖玻片，厚度No1，VWR，Lutterworth，UK)。将载玻片在室温下置于暗处过夜，然后计数。在表面荧光显微镜Nikon Eclipse 400(Nikon，Surrey，UK)下使用Fluor 100镜头检测载玻片。对于各孔，对15个不同的视野进行计数。 
使用配有泵(L-7100)、RI检测器(L-7490)和自动取样器(L-7200)的离子排阻高效液相色谱(HPLC)系统(LaChrom Merck Hitachi，Poole，Dorset UK)，进行短链脂肪酸分析。使用Jones Chromatography Ltd.的Windows 2.0版软件采集数据。使用的柱是离子排阻Rezex ROA-有机酸H+(8％)，300×7.80mm(Phenomenex，Cheshire，UK)。保护柱是SecurityGuardTM Carbo-H+4x3.0mm短柱(Phenomenex，Cheshire，UK)。使用的洗脱剂是0.0025mM的硫酸水(HPLC级)溶液。 
将来自各发酵时间点的样品(1ml)在13,000×g下离心10min。通过0.22μm过滤单元(Millipore，Cork，Ireland)过滤上清液。将20μL注射入HPLC中，在0.5ml/min的流速下用在84.2℃下加热的柱操作。样品的运行时间为35分钟。使用在12.5mM、25mM、50mM、75mM和100mM的浓度下乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的标准校准曲线进行样品定量。 
所有探针均用来在0h、10h、24h、36h和48h对细菌计数，除了CFB719、Fpra655和Rfla730/Rint729之外，对它们的48h样品不进行计数。 
如图8A中可看出，与图8B中的菊糖相比，瘦供体与肥胖供体的气体产生速度以及气体释放速度的模式非常相似，这提供了本发明的葡聚寡糖的代表性实例。无论在何时间发生，将在瘦供体组中对特定底物观察到的最大气体产生速度与来自肥胖供体组的相应最大速度比较。瘦供体与肥胖供体的总气体产生没有差异。但是，显然在瘦和肥胖组二者中，相对于菊糖(图8A和8B)，测试的葡聚糖引起较少的气体产生并且更加平缓地产生气体。故此，可向个体给药降低气体产生和/或引起较缓慢的气体产生的有效量的本发明的化合物。 
较低分子量的葡聚糖(1kDa)表现出最好的双歧生成效应。在肥胖组中，对于70kDa葡聚糖也观察到与基线浓度相比显著的增长。 
非常有趣的是，在肥胖供体中，对于葡聚糖观察到潜在致病菌溶组织梭菌水平的显著降低(图9A)，而在瘦供体中观察到此趋势。在瘤胃球菌群 中，反应相似。在肥胖供体(图9B)和瘦供体中，对于所有测试底物，相对于基线浓度，普拉氏梭杆菌显著降低。故此，可向个体给药减少肠中某些致病菌的有效量的本发明化合物。 
在大多数情况下，此二供体组中的SCFA产生相似。我们已观察到，除了线性未支化的1kDa葡聚糖之外，在瘦供体中葡聚糖发酵导致产生显著高水平的丙酸。在肥胖供体中，除了1kDa之外，对于所有的葡聚糖再现此观察，但是比值甚至更有利于丙酸，因为在分批培养发酵刚才中产生较少水平的乙酸。 
总体而言，在肥胖供体中，性能最佳的底物是1kDa葡聚糖，因为它们兼具双歧生成性与选择性和对溶组织梭菌水平的负效应。支化的1kDa葡聚糖可能更优异，因为在分批培养发酵过程中实现的乙酸与丙酸的比值有利于丙酸，这对于肥胖个体而言可能特别重要，因为这可介导降胆固醇效应。 
实施例11 
使用体内新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)模型来评价本发明的葡聚寡糖对脂质含量的效应。被评价的底物是TLD-1000(未支化的1kDa葡聚糖)和TLD-1030(1kDa葡聚糖+32％α-1，2)。在5种不同浓度(1％，0.5％，0.25％，0.1％，0.05％，0.025％和0.01％w/v)下评价TLD-1000。还包括阴性对照(DMSO)和阳性对照(Orlistat)。用总计120条虫/底物和浓度将各底物测定4次。 
在TLD-1000底物的情况中，0.25％和0.1％的浓度表现出脂质含量的显著降低，但是最佳浓度是0.1％，其实现了30％的降低。对于最高测定浓度(1％和0.5％)和最低浓度(0.05％)，降低率为约10％。在TLD-1030底物的情况中，大多数测定的浓度表现出脂质含量的显著降低。在低浓度(0.05％)下，可发现脂质含量的最大降低值接近40％，用阳性对照Orlistat得到比它更低的值。这些脂质含量的降低表明，可向个体给药降低所述个体的脂质含量(即降低所述个体的脂肪量)的有效量的本发明化合物。 
总体而言，各底物的最佳剂量不同。对于TLD-1000和TLD-1030，得出最佳剂量值分别为0.1％和0.05％。在每种底物中在最佳浓度下的脂质含 量的降低在TLD-1030中更高。 
实施例12 
在雄鸡模型中测定如表1中所示的TLD1000(线性1kDa葡聚寡糖)、TLD1030(1kDa 32％支化的葡聚寡糖)和TLD7030(70kDa 37％支化的葡聚寡糖)的热量值。 
在被关在笼中的切除盲肠的或者常规的雄性单冠白来航鸡(Single Comb White Leghorn rooster)中测定本发明的三种化合物的校正至零氮平衡(zero nitrogen balance)的TME能量(TME)。使雄鸡禁食24小时，然后向5只雄鸡管饲(入嗉囊中)30g的测试饲料成分。然后将雄鸡置于各个笼中，并将盘置于各笼下，并收集所有排泄物，持续24小时。然后将排泄物冻干，称重，粉碎，并分析总能量和氮。然后使用用于内源校正的被禁食的雄鸡的能量释放(energy excretion)计算TMEn。然后对结果进行统计学分析并总结于下表7中。 
表7：葡聚寡糖的实际可代谢能量(TME)评价 
TLD1000具有3.650kcal/g的总可代谢能量(TME)，这意味着它几乎完全被消化。TLD1030的TME小于TLD1000的TME，而TLD7030的TME 更小于TLD1030的TME。这意味着这些产物通常在小肠中不可消化，还意味着所述的多种葡聚寡糖在结肠中的可发酵速度有差异。由于TLD7030具有低TME值，其几乎不被消化，也不被发酵。来自这些数据的最重要指示是线性葡聚寡糖(TLD1000)是可消化的，而支化葡聚寡糖(TLD1030和TLD7030)不可消化。故此，支化防止被人类酶消化，并且分子越长，则在结肠中的发酵速度(即可被细菌消化的速度)越低。不可消化性是纤维的重要特征。根据此特征，本发明的葡聚寡糖可归类为纤维。 
实施例13 
此研究的目的是确定在治疗12周后的小鼠中，本发明的化合物在高脂肪饮食诱导的肥胖模型中对代谢标记物的效应。以下提供的数据显示在6周治疗后，在OGTT(口服葡萄糖耐量试验)测定后，所述化合物对体重、体重增长、空腹血糖的效应。如上表1中所示，本文中使用的TLD1030是指1kDa+32％支化的葡聚寡糖；TLD1015是指1kDa+16％支化的葡聚寡糖；TLD7030是指70kDa+37％支化的葡聚寡糖。 
圈养购自Charles River的雄性C57BL/6j小鼠，并且在2周的适应期间可随意摄取标准饲料和水。在用D12450B饲料适应11天后，按照体重随机地将小鼠划分成4组，每组8只动物。然后给小鼠饲喂单独的高脂肪饲料(D12492)，或者含有1％要测试的产物的高脂肪。每周2次称量各个动物。通过从在该研究的第0天时的总体重减去所得的最终值(每周的第二次测量值)来计算体重增长。 
在第6周进行葡萄糖耐量试验。此方法有助于突显不同化合物对由高脂肪饲料诱导的胰岛素抗药性的效应。在实验前一天至18h使小鼠禁食。在试验当日(上午9点)称量小鼠，并口服(经口)给药葡萄糖(2g/kg至10mL/kg的10％葡萄糖溶液)。在从已做防护措施的动物的尾静脉切口取血后，使用血糖测计仪测定它们在T0/T+15/+30/+60/T+90/T+120/180min的时间的血葡萄糖。在Sigma Plot 11.0(2008)Systat Software，Inc上，使用学生检验来计算体重、空腹葡萄糖和OGTT数据的组间差异。 
如图11中所示，治疗6周后，与DIO(＝饲料诱导的肥胖)对照相比，TLD1030显示出体重增长的显著降低(-9.68％)。图11显示体重增长(克和第 1天的％)和空腹葡萄糖(mg/dl)平均值(+/-SEM)。(*p≤0.05；**p：≤0.01； ***p：≤0.001(对比对照DIO的t-检验)。就空腹血糖参数而言，对于TLD1015观察到显著降低(-19.5％)。该OGTT数据表明这三种产物能够显著降低血糖AUC(图12和表8)。 
这些结果表明，可向个体给药增加个体的葡萄糖耐量、增加胰岛素分泌并且使接受高脂肪或典型的西方式饮食的个体的体重增长降低的有效量的本发明化合物。 
表8：曲线下面积平均值(+/-SEM)1(第6周) 
*p≤0.05；**p：≤0.01；***p：≤0.001(对比对照DIO的t-检验) 
  组   曲线下面积
  DIO D12492   49190±3979
  DIO D12492+TLD 1015   40039±7959*
  DIO D12492+TLD 1030   43468±5248*
  DIO D12492+TLD 7030   43034±6147*
虽然上文参考某些具体实施方案例示和描述本发明，但是本发明并不意图限于所示细节。反而，可在权利要求的范围和等效范围内并且在不脱离本发明的情况下进行各种细节上的改变。 

Claims (29)

1.组合物，其包含α-(1,2)-支化的α-(1,6)葡聚寡糖，所述葡聚寡糖包含平均分子量为1kDa至10kDa的基本为线性的骨架，所述骨架包含至少2个由α-(1,6)-键连接的α-D-吡喃葡萄糖基单元和至少90％的α-(1,6)-D-吡喃葡萄糖苷键，并且所述葡聚寡糖包含10％至50％的α-(1,2)-糖苷侧链，其中所述α-(1,2)-糖苷侧链随机地分布于整个所述骨架，由此所述组合物用于改善个体健康。
2.权利要求1的组合物，其中所述葡聚寡糖是益生元化合物。
3.权利要求1的组合物，其中所述葡聚寡糖包含少于10％的α-(1,4)-键。
4.α-(1,2)-支化的α-(1,6)葡聚寡糖在制备用于改善个体健康的组合物中的用途，所述葡聚寡糖包含平均分子量为1kDa至10kDa的基本为线性的骨架，所述骨架包含至少90％的α-(1,6)-D-吡喃葡萄糖苷键，并且所述葡聚寡糖包含10％至50％的α-(1,2)-糖苷侧链，其中所述α-(1,2)-糖苷侧链随机地分布于整个所述骨架。
5.权利要求4的用途，其中所述葡聚寡糖是益生元化合物。
6.权利要求5的用途，其中所述益生元化合物对所述个体的肠微生物群提供有益效应。
7.权利要求4的用途，其中所述葡聚寡糖包含少于10％的α-(1,4)-键。
8.权利要求4的用途，其中所述组合物用于对所述个体的健康发挥有益效应，其中所述有益效应选自改善肠健康、降低脂质含量、降低体重增长、减少食物摄入、减轻血糖反应、增加葡萄糖耐量、增加胰岛素分泌、增加GLP1分泌、预防或治疗代谢综合征、预防或治疗糖尿病，及其组合。
9.权利要求4的用途，其中所述组合物用于对所述个体的健康发挥有益效应，其中所述有益效应选自增加短链脂肪酸的产生、降低胃肠道中的气体形成、改善肠舒适度、预防或治疗胃肠道病症、刺激有益菌的生长或活性、抑制致病菌的生长、缓解肠疼痛、预防或治疗炎性肠疾病、预防或治疗肠易激综合征、提供镇痛效应、提供内脏疼痛的缓解，及其组合。
10.权利要求4的用途，其中所述组合物用于对所述个体的健康发挥有益效应，其中所述有益效应选自预防或治疗孤独症、预防或治疗阿尔茨海默病、预防或治疗变态反应、预防或治疗类风湿性关节炎，及其组合。
11.权利要求4的用途，其中所述组合物用于对所述个体的健康发挥有益效应，其中所述有益效应选自预防或治疗胆固醇相关的病症、预防或治疗肥胖、增加丙酸的产生、降低血液甘油三酯水平、降低脂肪量、降低低密度脂蛋白水平，及其组合。
12.权利要求1的组合物，其中所述组合物还包含选自乳杆菌属(Lactobacillus)、双岐杆菌属(Bifidobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、链球菌属(Streptococcus)、酵母菌属(Saccharomyces)及其组合的益生菌。
13.权利要求1的组合物，其中所述组合物还包含选自抗性麦芽糖糊精、抗性淀粉、聚葡萄糖、可溶性玉米纤维、菊糖、寡聚果糖、纤维糊精、支链淀粉、半纤维素、寡聚半乳糖、阿拉伯糖基木糖寡糖、乳果糖、塔格糖、益生元化合物及其组合的膳食纤维。
14.权利要求1的组合物，其中所述组合物是食品，并且还包含至少一种食品成分。
15.权利要求1的组合物，其中所述组合物是药物组合物，并且还包含至少一种药学成分。
16.制备如权利要求1中所述的葡聚寡糖的方法，其包括以下步骤：使平均分子量为0.5-100kDa的α-(1,6)葡聚寡糖与葡聚糖蔗糖酶在蔗糖的存在下反应，其中蔗糖与所述α-(1,6)葡聚寡糖中的葡萄糖基单元的摩尔比为0.10-1.00，由此获得含有至少10％的α-(1,2)-糖苷侧链的α-(1,2)-支化的α-(1,6)葡聚寡糖；和任选地纯化所述α-(1,2)-支化的α-(1,6)葡聚寡糖。
17.权利要求16的方法，其还包括使含有葡萄糖的原料进行酶法转葡萄糖基化反应，由此获得异麦芽糖寡糖(IMOS)；和使所述IMOS与所述葡聚糖蔗糖酶在所述蔗糖的存在下反应，由此获得所述α-(1,6)葡聚寡糖。
18.权利要求17的方法，其中所述含有葡萄糖的原料包括葡聚糖、淀粉、葡萄糖浆或者麦芽糖浆。
19.权利要求17的方法，其中使所述含有葡萄糖的原料进行酶法转葡萄糖基化反应和使所述IMOS与所述葡聚糖蔗糖酶反应的步骤在单一步骤中进行。
20.权利要求16的方法，其中所述葡聚糖蔗糖酶包括转葡糖苷酶GBD-CD2。
21.权利要求16的方法，其中蔗糖与α-(1,6)葡聚寡糖的摩尔比为0.10-5.00，并且α-(1,2)-键的百分比为10％至50％。
22.权利要求16的方法，其中蔗糖与α-(1,6)葡聚寡糖的摩尔比为0.90-1.00，并且α-(1,2)-键的百分比为30％至40％。
23.权利要求16的方法，其包括通过过滤纯化所述α-(1,2)-支化的α-(1,6)葡聚寡糖，其中所述被纯化的葡聚寡糖的平均分子量为0.5-100kDa。
24.权利要求16的方法，其还包括使蔗糖与葡聚糖蔗糖酶在葡萄糖的存在下反应，由此获得所述α-(1,6)葡聚寡糖的步骤。
25.权利要求24的方法，其还包括调整蔗糖与葡萄糖的比值，由此调整所述α-(1,6)葡聚寡糖的DP特征的步骤。
26.权利要求13的方法，其中所述葡聚寡糖能够到达所述个体的结肠的整个长度。
27.权利要求4的用途，其中所述分子量越高并且α-(1,2)支化的百分比越高，则所述化合物在所述个体中的抗消化性越高。
28.权利要求4的用途，其中所述组合物用于对所述个体的健康发挥有益效应，其中所述有益效应包括增加短链脂肪酸的产生，由此降低肠中的pH，并且(i)改善矿物质吸收，(ii)改善骨健康，或者(iii)预防或治疗骨质疏松。
29.权利要求4的用途，其中所述组合物用于对所述个体的健康发挥有益效应，其中所述有益效应包括降低所述个体中产生气体的量和速度，由此减轻气胀和胃气胀。
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