CN108289494B - 能够产生具有α-1，2分支的葡聚糖的多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文公开了能够形成具有α‑1，2键/分支的葡聚糖的蛋白质、用于生产此类葡聚糖的反应和方法、包含此类葡聚糖的组合物、及其多种应用。

Description

能够产生具有α-1，2分支的葡聚糖的多肽及其用途
本申请要求国际申请号PCT/CN2015/095687(2015年11月26日提交)和PCT/CN2016/085547(2016年6月13日提交)的益处，这两个国际申请以其全文通过引用结合在此。
技术领域
本公开涉及例如能够形成具有α-1，2键的葡聚糖的蛋白质、用于生产此类葡聚糖的反应和方法、包含该葡聚糖的组合物、及使用该葡聚糖的多种应用。
以电子方式提交的序列表的引用
该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为20161122_CL6550WOPCT3_SequenceListing.txt，创建于2016年11月21日，且具有413千字节大小，并与本说明书同时提交。包含在该ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用并入本文。
背景技术
已经报道了将α-1，2分支促添加到右旋糖酐中。来自肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)NRRL B-1299的葡糖基转移酶(DsrE)具有能够将α-1，2分支添加到右旋糖酐的第二催化结构域(“CD2”)(美国专利号7439049和5141858；美国专利申请公开号2009-0123448；Bozonnet等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]184：5753-5761，2002)。美国专利申请公开号2010-0284972描述了通过施用包含α-1，2-支化的α-1，6右旋糖酐的组合物来改善受试者健康的方法和组合物。Sarbini等人(Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]77：5307-5315，2011)描述了人粪便微生物群对右旋糖酐和α-1，2-分支的右旋糖酐的体外发酵。Brison等人(J.Biol.Chem.[生物化学杂志]287：7915-7924，2012)描述了能够将α-1，2分支添加至右旋糖酐的来自肠膜明串珠菌NRRL B-1299的DsrE葡糖基转移酶的截短形式(与第二催化结构域CD2偶联的葡聚糖结合结构域[GBD][即GBD-CD2])。尽管有这些报道，仍然需要鉴定能够产生具有α-1，2键的葡聚糖的另外的酶。
发明内容
在一方面，本公开涉及一种反应组合物，其至少包含水、蔗糖、α-葡聚糖底物和能够从所述α-葡聚糖底物形成至少一个α-1，2分支的多肽，其中所述多肽包含与以下具有至少90％同一性的氨基酸序列：
(i)选自下组的序列的成熟形式，该组由以下组成：SEQ ID NO：4、1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、和13；
(ii)SEQ ID NO：27或与SEQ ID NO：27对齐的、SEQ ID NO：4、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、或13中的任一项中的子序列；和/或
(iii)选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO：4、1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、和13。
本公开还涉及生产包含α-1，2键的葡聚糖组合物的方法，所述方法包括：
(a)至少提供以下反应组分：水、蔗糖、α-葡聚糖底物和能够从所述α-葡聚糖底物形成至少一个α-1，2分支的多肽，其中所述多肽包含与以下具有至少90％同一性的氨基酸序列：
(i)选自下组的序列的成熟形式，该组由以下组成：SEQ ID NO：4、1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、和13；
(ii)SEQ ID NO：27或与SEQ ID NO：27对齐的、SEQ ID NO：4、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、或13中的任一项中的子序列；和/或
(iii)选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO：4、1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、和13；
(b)在合适的条件下组合所述反应组分，由此所述多肽催化从所述α-葡聚糖底物合成至少一个α-1，2分支，从而形成包含α-1，2键的葡聚糖组合物；以及
(c)任选地分离包含α-1，2键的葡聚糖组合物。
本公开还涉及包含葡聚糖组合物的组合物，所述葡聚糖组合物包含通过本文所述的方法或反应产生的一个或多个α-1，2键，优选地，其中所述组合物呈食物产品、药物产品、个人护理产品、家用护理产品、或工业产品的形式，任选地，其中所述组合物包含约0.01wt％至99wt％(基于干燥固体)的葡聚糖组合物。
本公开还涉及包括向哺乳动物肠内施用物质的方法，其中所述物质包含含有α-1，2键的葡聚糖组合物，其中与肠内施用缺乏所述葡聚糖组合物但代替地含有相同量的易消化的含葡萄糖的碳水化合物的物质的哺乳动物相比，所述施用导致所述哺乳动物中血糖升高更少或更慢，其中所述葡聚糖组合物通过本文所述的方法或反应生产，任选地其中所述哺乳动物是人，并且任选地其中所述易消化的含葡萄糖的碳水化合物是蔗糖、游离葡萄糖、或淀粉。
本公开还涉及生产食物或饮料的方法，所述方法包括将包含α-1，2键的葡聚糖组合物掺入所述食物或饮料中，其中与缺乏所述葡聚糖组合物的食物或饮料相比，所得食物或饮料的血糖指数不增加或仅稍微增加，并且其中所述葡聚糖组合物通过本文所述的方法或反应生产。
生物学序列简述
下面提供的鉴定(gi)和登录号来自GENEBANK(可在国家生物技术信息中心[NCBI]网站上获得)。
SEQ ID NO：1是全长GTFJ18的氨基酸序列(旧gi：356644413，新gi：504090610，登录号WP_014324604.1，肠膜明串珠菌)。认为预测的GTFJ18的成熟分泌形式对应于SEQ IDNO：1的位置21-2771。SEQ ID NO：1和13是相同的。
SEQ ID NO：2是来自gi：116096814的氨基酸序列(GENBANK登录号ABJ61965.1，肠膜明串珠菌；本文中也称为GTF6814)。认为预测的GTF6814的成熟分泌形式对应于SEQ IDNO：2的位置21-2821。
SEQ ID NO：3是来自gi：916260333的氨基酸序列(GENBANK登录号WP_050995379.1，肉明串珠菌(Leuconostoc carnosum)；本文中也称为GTF0333)。认为预测的GTF0333的分泌成熟形式对应于SEQ ID NO：3的位置41-2844。
SEQ ID NO：4是来自gi：902949905的氨基酸序列(GENBANK登录号GAP05007.1，Fructobacillus tropaeoli；本文中也称为GTF9905或FtrGtfl)。认为预测的GTF9905的表达的形式(预期是分泌的、成熟形式)对应于SEQ ID NO：4的位置36-1672。
SEQ ID NO：5是来自gi：938153845的氨基酸序列(GENBANK登录号WP_054608463.1，Lactobacillus kunkeei；本文中也称为GTF3845)。认为预测的GTF3845的成熟分泌形式对应于SEQ ID NO：5的位置51-1632。
SEQ ID NO：6是来自gi：938153846的氨基酸序列(GENBANK登录号WP_054608464.1，Lactobacillus kunkeei；本文中也称为GTF3846)。认为预测的GTF3846的成熟分泌形式对应于SEQ ID NO：6的位置51-1318。
SEQ ID NO：7是来自gi：927068954的氨基酸序列(GENBANK登录号KOY70706.1，Lactobacillus kunkeei；本文中也称为GTF8954)。认为预测的GTF8954的成熟分泌形式对应于SEQ ID NO：7的位置51-1139。
SEQ ID NO：8是来自gi：927268464的氨基酸序列(GENBANK登录号WP_053795842.1，Lactobacillus kunkeei；本文中也称为GTF8464)。认为预测的GTF8464的成熟分泌形式对应于SEQ ID NO：8的位置51-1463。
SEQ ID NO：9是来自gi：908395133的氨基酸序列(GENBANK登录号WP_049752804.1，肠膜明串珠菌；本文中也称为GTF5133)。认为预测的GTF5133的成熟分泌形式对应于SEQ ID NO：9的位置41-2841。
SEQ ID NO：10是来自gi：935566432的氨基酸序列(GENBANK登录号WP_054450649.1，Lactobacillus kunkeei；本文中也称为GTF6432)。认为预测的GTF6432的成熟分泌形式对应于SEQ ID NO：10的位置46-2580。
SEQ ID NO：11是来自gi：916985575的氨基酸序列(GENBANK登录号WP_051592287.1，Lactobacillus kunkeei；本文中也称为GTF5575)。认为预测的GTF5575的成熟分泌形式对应于SEQ ID NO：11的位置51-1463。
SEQ ID NO：12是来自gi：407242790的氨基酸序列(GENBANK登录号AFT82440.1，肉明串珠菌JB16；本文中也称为GTF2790)。认为预测的GTF2790的成熟分泌形式对应于SEQ IDNO：12的位置21-2824。
SEQ ID NO：13是来自gi：504090610的氨基酸序列(GENBANK登录号WP_014324604.1，肠膜明串珠菌；本文中也称为GTF0610)。认为预测的GTF0610的成熟分泌形式对应于SEQ ID NO：13的位置21-2771。
SEQ ID NO：14是编码全长GTFJ18(SEQ ID NO：1)的DNA序列。
SEQ ID NO：15是来自gb：CP000414.1的核苷酸846926-855391的DNA序列，并且编码GTF6814(SEQ ID NO：2)。
SEQ ID NO：16是来自gb：CP003851.1的核苷酸1620046-1611512的互补序列的DNA序列，并且编码GTF0333(SEQ ID NO：3)。
SEQ ID NO：17是来自gi：850934366的核苷酸237-5252的DNA序列，并且编码GTF9905(SEQ ID NO：4)。SEQ ID NO：34是编码GTF9905(SEQ ID NO：4)的表达形式的密码子优化的序列。
SEQ ID NO：18是来自gb：JXDF01000026.1的核苷酸13658-8760的互补序列的DNA序列，并且编码GTF3845(SEQ ID NO：5)。
SEQ ID NO：19是来自gb：JXDF01000026.1的核苷酸17742-13786的互补序列的DNA序列，并且编码GTF3846(SEQ ID NO：6)。
SEQ ID NO：20是来自gb：JXCW01000006.1的核苷酸99099-95680的互补序列的DNA序列，并且编码GTF8954(SEQ ID NO：7)。
SEQ ID NO：21是来自gb：JXCU01000040.1的核苷酸23080-18689的互补序列的DNA序列，并且编码GTF8464(SEQ ID NO：8)。
SEQ ID NO：22是来自gb：CP000414.1的核苷酸846866-855391的DNA序列，并且编码GTF5133(SEQ ID NO：9)。
SEQ ID NO：23是来自gb：JXDB01000011.1的核苷酸7742-3的互补序列的DNA序列，并且编码GTF6432(SEQ ID NO：10)。
SEQ ID NO：24是来自gb：AZBY01000038.1的核苷酸4456-65的互补序列的DNA序列，并且编码GTF5575(SEQ ID NO：11)。
SEQ ID NO：25是来自gb：CP003851.1的核苷酸1619986-1611512的互补序列的DNA序列，并且编码GTF2790(SEQ ID NO：12)。
SEQ ID NO：26是来自gb：CP003101.3的核苷酸845078-853513的DNA序列，并且编码GTF0610(SEQ ID NO：13)。
SEQ ID NO：27是GTFJ18T1的氨基酸序列，其表示GTFJ18(SEQ ID NO：1)的N-末端截短(去除了最先的1664个残基)形式。
SEQ ID NO：28是GTFJ18 CD2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：29是编码GENBANK登录号KRM57462.1的动物乳杆菌(Lactobacillusanimalis)KCTC 3501蛋白的成熟GTF8117(SEQ ID NO：30)(具有添加的起始甲硫氨酸)的密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO：31是编码GENBANK登录号WP_004182667.1的唾液链球菌(Streptococcus salivarius)M18蛋白的成熟GTF6831(SEQ ID NO：32)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：33是GTF5604的氨基酸序列，其衍生自仓鼠链球菌(Streptococcuscriceti)HS-6(
Figure BDA0001673369560000071
登录号WP_004226213.1，旧gi：357235604；也称为SG1018葡糖基转移酶或GtfHS6)。预测GTF5604的成熟形式从氨基酸位置37开始。
SEQ ID NO：34是编码GTF9905(SEQ ID NO：4)的表达形式的密码子优化的序列。
发明详述
所有引用的专利和非专利文献的公开内容通过引用以其全文结合在此。
在元素或组分前的冠词“一个/一种(a/an)”和“该(the)”关于该元素或组分的例子(即，出现)的数目旨在是非限制性的。因此，“一个/一种”和“该”应理解为包括一个/一种或至少一个/一种，并且元素或组分的单数词语形式还包括复数，除非该数字明显意指单数。
在存在的情况下，所有范围是包含端值的和可组合的。例如，当列举“1至5”的范围时，所列举的范围应解释为包括“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等范围。
术语“α-葡聚糖”、“α-葡聚糖聚合物”等在本文中可互换地使用。α-葡聚糖是包含通过α-糖苷键(alpha-glycosidic linkage或alpha-glucosidic linkage)连接在一起的葡萄糖单体单元的聚合物。
术语“键”、“糖苷键(glycosidic linkage)”、“糖苷键(glycosidic bond)”等是指连接糖化合物(低聚糖和/或多糖)内的糖单体的共价键。糖苷键的实例包括具有1，6-α-D-糖苷键(本文中也称为“α-1，6”键)；1，3-α-D-糖苷键(本文中也称为“α-1，3”键)；1，4-α-D-糖苷键(本文中也称为“α-1，4”键)；1，2-α-D-糖苷键(本文中也称为“α-1，2”键)；和通常与支化糖低聚物相关的此类键的组合的α-连接的葡萄糖低聚物。
术语“葡糖基转移酶(glucosyltransferase)”、“葡糖基转移酶(glucosyltransferase enzyme)”、“GTF”、“葡聚糖蔗糖酶”等在本文中可互换地使用。本文中葡糖基转移酶的活性催化底物蔗糖的反应以制得产物α-葡聚糖和果糖。例如，葡糖基转移酶反应的一些副产物可以包括葡萄糖和/或明串珠菌二糖。葡糖基转移酶的野生型形式通常含有(在N-末端至C-末端方向上)信号肽、可变结构域、催化结构域和葡聚糖结合结构域。本文中的葡糖基转移酶的实例是1，2-分支酶。
术语“反应组合物”、“酶促反应”、“葡糖基转移酶反应”、“葡聚糖合成反应”等在本文中可互换使用并且通常指最初包含水、蔗糖、至少一种活性葡糖基转移酶和任选地其他组分的反应。对于本文的1，2-分支反应组合物，包括的另一种组分是α-葡聚糖底物。通常在葡萄糖基转移酶反应开始后可以进一步存在于该反应中的组分包括产物果糖和α-葡聚糖，以及任选的副产物，如葡萄糖和明串珠菌二糖。应该理解，在葡糖基转移酶具有1，2-分支活性的实施例中，α-葡聚糖产物可以代表由该酶合成的1，2-分支材料和/或全部α-葡聚糖产物本身(即，α-葡聚糖底物加上增加的1，2-分支)。如本文所使用的术语“在合适的条件下”是指通过葡糖基转移酶活性支持将蔗糖转化为产物果糖和α-葡聚糖的反应条件。
术语“能够从α-葡聚糖底物形成至少一个α-1，2分支的多肽”是指能够通过一个或多个分支将一个或多个α-1，2糖苷键(使用蔗糖作为另外的底物)引入至α-葡聚糖底物(或“α-葡聚糖主链”)的催化活性葡糖基转移酶(或其活性片段)(在本文中也可以称为“1，2-分支酶”或其他类似术语)。据信多肽每个分支添加一个葡萄糖基团。在某些实施例中，这样的多肽是截短的葡糖基转移酶，其包括能够从α-葡聚糖底物进行α-1，2分支的催化结构域。本领域技术人员将认识到，截短可以涵盖相对于存在于野生型序列中的能够添加α-1，2分支的催化结构域在N-末端或C-末端方向或两个方向上的氨基酸的缺失。例如，N-末端截短可以由编码起始于延迟起始密码子的葡糖基转移酶的基因产生，并且C-末端截短可以由编码终止于早熟终止密码子的葡糖基转移酶的基因产生。在某些实施例中，除了催化结构域之外多肽还包含至少一个葡聚糖结合结构域。在某些实施例中，多肽是截短的葡糖基转移酶，其包括能够单独或与葡聚糖结合域组合将α-1，2分支添加至α-葡聚糖底物主链的催化结构域，并且不包括能够合成除α-1，2糖苷键之外的键的域。
例如，如本文所提及的“α-葡聚糖底物”或“α-葡聚糖主链”(以及类似术语)可以包含(i)α-1，6或(ii)α-1，6和α-1，3糖苷键，并且典型地具有至少3的聚合度(DP)并且通常是水溶性的。在典型的实施例中，α-葡聚糖底物能够在蔗糖存在下通过具有α-1，2分支活性的多肽在水性反应条件下进行修饰(即添加至少一个α-1，2糖苷键)。通常不包括作为本文所述α-葡聚糖底物的一部分的“β-葡聚糖”。
例如，本文所指的“α-1，2分支”(以及类似术语)可以来自本文中的α-葡聚糖底物主链。在α-1，2分支源自主链的1，6-连接的葡萄糖的情况下，这种1，2-键也可以被称为α-1，2，6。本文中为α-1，2连接于α-葡聚糖主链的分支通常具有一个葡萄糖基团(可任选地称为侧链葡萄糖)。本文中葡聚糖中1，2-分支的百分比是指代表1，2-分支点(例如1，2，6)的葡聚糖中所有键的百分比。
本文中，“α-1，3，6”是指如下分支点，其中分支葡萄糖的α-1，3与主链的1，6-连接的葡萄糖单体连接。
例如，依据(i)本文中的任何α-葡聚糖底物加上(ii)本文中任何添加的1，2-分支，可以表征本文中1，2-分支反应的葡聚糖产物(例如“包含α-1，2键的葡聚糖组合物”、“α-1，2-分支葡聚糖组合物”、“本文中的葡聚糖”等术语)。
术语“成熟的”、“分泌的”、“成熟分泌的”等在本文中可互换使用。成熟的蛋白质是可以穿过细胞(特别是细菌细胞)的细胞膜的蛋白质。在一些方面，成熟蛋白质由来自蛋白质的未成熟(预加工)形式的N-末端的“信号序列”(或“信号肽”)的翻译后去除(切割)而产生的。信号序列通常将未成熟的蛋白质指导至细胞膜，并在该蛋白质穿过膜期间(即在蛋白质分泌过程期间)从该蛋白质中去除。本文中成熟蛋白质的异源表达可以使用信号序列，在这种情况下，可能的目标是将该蛋白质分泌至周围介质。可替代地，异源表达可以使用表达被设计为已经缺乏其信号序列的蛋白质(在这类实施例中，通常将起始甲硫氨酸添加到N-末端)；这种成熟的蛋白质表达通常需要裂解细胞以释放蛋白质，因为该蛋白质不被分泌。本文的信号序列相对于任选使用的蛋白质可以是天然或异源的。
本文中的术语“葡聚糖”是指包含至少50％α-1，6糖苷键的水溶性α-葡聚糖(通常具有多达49％的α-1，3糖苷键，其中一些可以发生在分支点)。右旋糖酐通常具有1000kDa以上的平均分子量。能够从蔗糖合成右旋糖酐的酶可以描述为“右旋糖酐蔗糖酶”(EC2.4.1.5)。右旋糖酐是本文中合适的α-葡聚糖底物的实例。
如本文所用的术语“α-葡聚糖水解酶”、“葡聚糖水解酶”等是指能够内切或外切水解α-葡聚糖低聚物的酶。葡聚糖水解酶可以通过其对某些α-糖苷键的水解活性来定义。示例可以包括但不限于，右旋糖酐酶(EC 3.2.1.1；能够内切水解α-1，6-连接的糖苷键)、齿斑葡聚糖酶(mutanase)(EC 3.2.1.59；能够内切水解α-1，3-连接的糖苷键)、和交替酶(alternanase)(EC 3.2.1.-；能够内切水解切割交替糖)。各种因素，包括但不限于分支水平、分支类型和某些α-葡聚糖内的相对分支长度，可能不利地影响α-葡聚糖水解酶水解一些糖苷键的能力。
本文中的葡聚糖(例如，包含α-1，2键的α-葡聚糖底物或葡聚糖组合物)的分子量可以表示为聚合度(DP)、道尔顿、或克/摩尔。DP是指包含在葡聚糖内的葡萄糖的数量(例如，DP 10的葡聚糖是指该葡聚糖含有10个葡萄糖)。用于计算分子量测量的各种方法在本领域中是已知的，例如采用高压液相色谱法(HPLC)、尺寸排阻色谱法(SEC)或凝胶渗透色谱法(GPC)。
如本文所用，术语“水溶性”表征具有溶解于本文中的水和/或水性溶液中的能力的葡聚糖，其中整个葡聚糖分子是可溶解的。通常，这种溶解度的条件包括约1℃至85℃的水/溶液温度范围，该范围包括适合于各种用途的温度，例如在饮料和/或家用护理应用中。
术语“体积百分比”(percent by volume和volume percent)、“vol％”、“v/v％”等在本文中可互换地使用。在溶液中溶质的体积百分比可以使用以下公式确定：[(溶质体积)/(溶液体积)]×100％。
术语“重量百分比”(percent by weight)、“重量百分比(weight percentage，wt％)”、“重量-重量百分比(％w/w)”等在本文中可互换地使用。重量百分比是指当包含在组合物、混合物或溶液中时，材料在质量基础上的百分比。
例如，本文中的“哺乳动物”可以是人、宠物(例如猫科动物、犬科动物)、家养/饲养的哺乳动物(例如牛、猪、马、绵羊)或啮齿动物或其他小型哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔)。
术语“肠内施用”及类似术语是指通过胃肠(GI)道进食或药物施用。这与肠胃外施用形成对比，肠胃外施用从GI道外的途径(例如静脉内)发生。尽管本文中肠内施用的大多数情况是通过摄入(即通过口腔；口服)进行的，但是一些情况可以通过直接递送到食管或胃(例如使用进食管)。
如本文所用，术语“血糖指数”是指与指示食物对哺乳动物血糖(blood glucose/blood sugar)水平的影响的特定类型食物相关的数字。值为100代表标准，为等效量的纯葡萄糖。低血糖指数通常为约55或更低，中等血糖指数通常为约56至69，并且高血糖指数通常为约70或更高。本文中的术语“血糖反应”是指消耗特定食物或食物组合后血糖水平的变化。例如，本文中食物产品的血糖指数中的“边际增长”是指血糖指数升高小于约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、或10％。
与本文中摄入“缓慢葡萄糖释放葡聚糖组合物”相比，本文中“易消化的含葡萄糖的碳水化合物”是指如下碳水化合物，其被哺乳动物摄入时迅速升高该哺乳动物中的血糖水平。易消化的含葡萄糖的碳水化合物的实例包括蔗糖、游离葡萄糖和淀粉。本文中的“游离葡萄糖”是指呈游离形式的葡萄糖，其不与另一种糖通过糖苷键连接。
本文中的术语“膳食纤维”、“葡聚糖纤维”和类似术语是指当向哺乳动物肠内施用时不易消化和/或不增加血糖水平的葡聚糖。一般而言，本文中的膳食纤维不会显著地被哺乳动物(例如人)的上胃肠道中的内源性酶水解。
术语“水性条件”、“水性反应条件”、“水性设置”、“水性体系”等在本文中可互换使用。本文中的水性条件是指其中溶剂为例如至少约60wt％的水的溶液或混合物。本文中的分支反应通常在水性条件下进行。
本文中的“水性组合物”具有例如包含至少约10wt％的水的液体组分。水性组合物的实例包括例如混合物、溶液、分散体(例如胶体分散体)、悬浮液和乳液。本文中的“水性溶液”是指其中溶剂包含水的溶液。在本文的某些方面，水性溶液可以用作分散剂。在某些实施例中，α-1，2-分支葡聚糖可以在某些方面溶解在水性溶液中。
“家用护理产品”及类似术语是指与家及其内部的处理、清洁、护理和/或调节有关的产品、商品和服务。前述内容包括例如具有应用于这种护理的化学品、组合物、产品或其组合。
术语“织物”、“纺织品”、“布”等在本文可互换地使用，是指具有天然和/或人造纤维网络的编织材料。这种纤维可以是例如丝线或纱线的形式。
“织物护理组合物”及类似术语是指适合用于以某种方式处理织物的任何组合物。这种组合物的实例包括衣物洗涤剂和织物柔软剂，它们是衣物护理组合物的实例。
术语“重垢洗涤剂”、“通用洗涤剂”等在本文可互换地使用，是指可用于在任何温度常规洗涤白色和有色纺织品的洗涤剂。术语“轻垢洗涤剂”、“细薄织物洗涤剂”等在本文可互换地使用，以指代可用于护理精细织物例如粘胶纤维、羊毛、丝绸、超细纤维或需要特别护理的其他织物的洗涤剂。“特别护理”可以包括例如使用过量水、低搅拌和/或不漂白的条件。
典型地，本文“洗涤剂组合物”至少包含表面活性剂(洗涤剂化合物)和/或助洗剂。本文中“表面活性剂”是指倾向于降低物质溶解的液体的表面张力的物质。表面活性剂可以用作例如洗涤剂、润湿剂、乳化剂、发泡剂和/或分散剂。
“个人护理产品”及类似术语是指与此人的处理、清洁、清洗、护理或调节有关的产品、商品和服务。前述内容包括例如具有应用于这种护理的化学品、组合物、产品或其组合。
本文中“口腔护理组合物”是适合用于处理口腔中的软或硬表面(例如牙齿(dental或teeth)和/或牙龈表面)的任何组合物。
术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸分子”等在本文中可互换地使用。这些术语涵盖核苷酸序列等。多核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA的聚合物，其任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。多核苷酸可以由cDNA、基因组DNA、合成DNA或其混合物的一个或多个区段组成。
如本文中所使用，术语“基因”是指从编码区表达RNA(RNA从DNA多核苷酸序列转录)的DNA多核苷酸序列，该RNA可以是信使RNA(编码蛋白质)或非蛋白质编码RNA。基因可以是指单独的编码区，或者可以包括编码区上游和/或下游的调节序列(例如启动子、5’-非翻译区、3’-转录终止子区)。可替代地，编码蛋白质的编码区在本文中可以被称为“可读框”(ORF)。“天然”或“内源”的基因是指自然界中发现的具有其自身调节序列的基因；这样的基因位于宿主细胞基因组中的天然位置。“嵌合”基因是指不是天然基因的任何基因，该基因包括在自然界中未一起发现的调节序列和编码序列(即，调节区和编码区彼此是异源的)。因此，嵌合基因可以包含源自于不同来源的调节序列和编码序列，或者包含源自于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调节序列和编码序列。“外来”或“异源”的基因可能是指通过基因转移引入宿主生物体的基因。外来/异源基因可以包含插入非天然生物体内的天然基因、引入天然宿主内的新位置的天然基因、或嵌合基因。在某些实施例中本文公开的多核苷酸序列是异源的。“转基因”是通过基因递送程序(例如，转化)已经引入基因组中的基因。“密码子优化的”可读框的密码子使用频率被设计为模拟宿主细胞的优选密码子使用的频率。
术语“异源”是指不是在目的位置自然发现的。例如，异源基因可以是不是在宿主生物体中自然发现的基因，而是通过基因转移引入该宿主生物体中的基因。作为另一个实例，存在于嵌合基因中的核酸分子可以表征为异源的，因为这样的核酸分子不与该嵌合基因的其他区段天然相关(例如，启动子对于编码序列可以是异源的)。
本文中包含在细胞或生物体中的“非天然”氨基酸序列或多核苷酸序列不会发生在这样的细胞或生物体的天然的(自然的)对应物中。这样的氨基酸序列或多核苷酸序列也可以被称为是与细胞或生物体异源的。
如本文中所使用，“调节序列”是指位于基因转录起始位点(例如启动子)上游的核苷酸序列、5’非翻译区、内含子和3’非编码区，并且该调节序列可能影响转录、加工或稳定性、和/或从该基因转录的RNA的翻译。本文中，调节序列可以包括启动子、增强子、沉默子、5′非翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点、茎环结构以及涉及调节基因表达的其他元件。本文中的一个或多个调节元件可以与本文中的编码区异源。
如本文中所使用的“启动子”是指能够控制从基因转录RNA的DNA序列。通常，启动子序列位于基因的转录起始位点的上游。启动子可以全部来源于天然基因，或者由源自于在自然界发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA区段。在所有情况下在多数时候引起基因在细胞中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。本文中的一个或多个启动子可以与本文中的编码区异源。
如本文中所使用的“强启动子”是指可以指导每单位时间相对大量的生产性启动的启动子，和/或是驱动比在细胞中基因的平均转录水平更高的基因转录水平的启动子。
如本文中所使用，术语“3’非编码序列”、“转录终止子”和“终止子”是指位于编码序列下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其他序列。
如本文关于多核苷酸所使用的术语“上游”和“下游”分别是指“5’的”和“3’的”。
如本文所使用的术语“表达”是指(i)来自编码区的RNA(例如，mRNA或非蛋白质编码RNA)的转录，或(ii)多肽从mRNA的翻译。在某些实施例中，可以对多核苷酸序列的编码区域的表达进行上调或下调。
如本文所使用的术语“有效地连接”是指两个或更多个核酸序列的缔合，这样使得其中一种核酸序列的功能受到另一种核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，该启动子与该编码序列有效地连接。即，编码序列处于启动子的转录控制下。例如，编码序列可以与一个(例如，启动子)或多个(例如，启动子和终止子)调节序列有效地连接。
当本文中用于表征DNA序列例如质粒、载体或构建体时，术语“重组”是指例如通过化学合成和/或通过用基因工程技术操纵分离的核酸区段来将两个原本分离的序列区段进行人工组合。
如本文中所使用，术语“转化”是指通过任何方法将核酸分子转移到宿主生物体或宿主细胞中。已经转化到生物体/细胞中的核酸分子可以是在生物体/细胞中自主复制、或整合到生物体/细胞的基因组中、或瞬时存在于细胞中而不进行复制或整合的核酸分子。在本文中公开了适合于转化的核酸分子的非限制性实例，例如质粒和线性DNA分子。本文中含有转化核酸序列的宿主生物体/细胞可以被称为例如“转基因的”、“重组的”、“转化的”、“工程化的”、被称为“转化体”、和/或被称为“被修饰用于外源基因表达”。
如本文中所使用，关于多核苷酸或多肽序列的术语“序列同一性”、“同一性”等是指在两个序列中的核酸残基或氨基酸残基当在指定的比较窗口上比对最大对应度时是相同的。因此，“序列同一性百分比”、“百分比同一性”等是指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的值，其中与参比序列(其不包含添加或缺失)比较两个序列的最佳比对时，该多核苷酸或多肽序列在比较窗口中的部分可以包含添加或缺失(即空位)。通过以下方式计算该百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将该结果乘以100以产生序列同一性的百分比。应当理解，当计算DNA序列和RNA序列之间的序列同一性时，DNA序列的T残基与RNA序列的U残基比对，并且可以被认为与其“同一”。出于确定第一和第二多核苷酸的百分比互补性的目的，可以通过确定(i)第一多核苷酸和第二多核苷酸的互补序列之间的百分比同一性(或反之亦然)，例如和/或(ii)将产生规范的Watson和Crick碱基对的第一和第二多核苷酸之间的碱基百分比来获得。
百分比同一性可以通过任何已知的方法容易地确定，包括但不限于以下文献中所述的那些：1)Computational Molecular Biology[计算分子生物学](Lesk，A.M.编辑)，牛津大学：NY(1988)；2)Biocomputing：Informatics and Genome Projects[生物计算：信息 学和基因组项目](Smith，D.W.编辑)Academic：NY(1993)；3)Computer Analysis of Sequence Data，Part I[序列数据的计算机分析，第一部分](Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humana：NJ(1994)；4)Sequence Analysis in Molecular Biology[分子生物学 中的序列分析](von Heinje，G.编辑)Academic(1987)；和5)Sequence Analysis Primer [序列分析引物](Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑)Stockton：NY(1991)，其全部通过引用结合在此。
用于确定百分比同一性的优选方法被设计为在测试序列之间给出最佳匹配。例如，确定同一性和相似性的方法被编入公共可用的计算机程序中。例如，序列比对和百分比同一性计算可以使用LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR公司，麦迪逊(Madison)，威斯康星州)的MEGALIGN程序进行。例如，可以使用Clustal比对方法进行序列的多重比对，所述Clustal比对方法涵盖几种算法，包括Clustal V比对方法(描述于以下文献中：Higgins和Sharp，CABIOS.[计算机在生物学中的应用]5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.[计算机应用生物科学]，8：189-191(1992))，并在LASERGENE生物信息学计算套件的MEGALIGN v8.0程序(DNASTAR公司)中找到。对于多重比对，默认值可能对应于空位罚分(GAP PENALTY)＝10和空位长度罚分(GAP LENGTH PENALTY)＝10。使用Clustal方法进行逐对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数可以为KTUPLE＝1、空位罚分＝3、窗口(WINDOW)＝5、以及存储的对角线(DIAGONALS SAVED)＝5。对于核酸，这些参数可以是KTUPLE＝2、空位罚分＝5、窗口＝4、以及存储的对角线＝4。此外，可以使用Clustal W比对方法(描述于以下文献中：Higgins和Sharp，CABIOS.[计算机在生物学中的应用]5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.[计算机应用生物科学]，8：189-191(1992)；Thompson，J.D.等人，Nucleic Acids Research[核酸研究]，22(22)：4673-4680，1994)，并在LASERGENE生物信息学计算套件的MEGALIGN v8.0程序(DNASTAR公司)中找到。用于多重比对(蛋白质/核酸)的默认参数可以是：空位罚分＝10/15、空位长度罚分＝0.2/6.66、延迟发散序列(Delay Divergen Seqs)(％)＝30/30、DNA转换权重＝0.5、蛋白质权矩阵＝Gonnet系列、DNA权矩阵＝IUB。
作为某些实施例的特征，本文公开了各种多肽氨基酸序列和多核苷酸序列。可以使用或引用与本文公开的序列具有至少约70％至85％、85％至90％、或90％至95％同一性的这些序列的变体。可替代地，变体氨基酸序列或多核苷酸序列可以与本文公开的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。变体氨基酸序列或多核苷酸序列具有所公开的序列的相同功能/活性，或具有所公开的序列的功能/活性的至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的功能/活性。典型地，本文公开的不以甲硫氨酸开始的任何多肽氨基酸序列可以在氨基酸序列的N-末端进一步包含至少一个起始甲硫氨酸。
在本文公开的这些蛋白质的每个氨基酸位置处的所有氨基酸残基都是实例。鉴于某些氨基酸彼此共享类似的结构和/或电荷特征(即，保守的)，本文蛋白质的每个位置处的氨基酸可以是如所公开的序列提供的或被如下保守的氨基酸残基取代(“保守的氨基酸取代”)：
1.以下小脂肪族的、非极性的或轻微极性的残基可以相互取代：Ala(A)、Ser(S)、Thr(T)、Pro(P)、Gly(G)；
2.以下极性的、带负电荷的残基和它们的酰胺可以相互取代：Asp(D)、Asn(N)、Glu(E)、Gln(Q)；
3.以下极性的、带正电荷的残基可以相互取代：His(H)、Arg(R)、Lys(K)；
4.以下脂肪族的、非极性的残基可以相互取代：Ala(A)、Leu(L)、Ile(I)、Val(V)、Cys(C)、Met(M)；以及
5.以下大的芳香族残基可以相互取代：Phe(F)、Tyr(Y)、Trp(W)。
术语“与......对齐”、“对应于”等在本文中可互换地使用。本文中的一些实施例涉及与SEQ ID NO：27对齐的、SEQ ID NO：4、2、3和5-13中任一个内的子序列。本文中的“子序列”简单地是SEQ ID NO：4、2、3和5-13中任一个的一部分。如果子序列与SEQ ID NO：27具有至少约50％同一性或与SEQ ID NO：27具有至少约65％相似性(相同位点和保守位点二者的总数百分比)，则可以表征该子序列与SEQ ID NO：27对齐。通常，可以使用本文所述的比对算法和/或软件(例如，BLASTP、ClustalW、ClustalV、EMBOSS)将子序列的氨基酸序列与SEQ ID NO：27进行比对以确定同一性和/或相似性百分比。
术语“分离的”是指呈自然界中不存在的形式或在自然界中不存在的环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)任何物质，包括但不限于，从与其天然相关联的天然存在的成分中的一种或多种中或所有中至少部分地除去的任何宿主细胞、酶、变体、核酸、蛋白质、肽、辅因子、或碳水化合物/糖；(3)相对于自然界中发现的物质，经人类之手修饰的任何物质；或(4)相对于与其天然相关联的其他成分，通过增加物质的量进行修饰的任何物质。据信，本文公开的实施例(例如，反应组合物及其产物)是合成的/人造的，和/或具有非天然存在的性质。
如本文中所使用的术语“增加”可以是指比该增加的量或活性与之进行比较的量或活性多至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、50％、100％、或200％的量或活性。术语“增加的”、“提高的”、“增强的”、“大于”、“改进的”等在本文中可互换地使用。例如，可以将这些术语用于表征编码蛋白质的多核苷酸的“过表达”或“上调”。
本公开的一些方面涉及如下反应组合物，其至少包含水、蔗糖、α-葡聚糖底物和能够从所述α-葡聚糖底物形成至少一个α-1，2分支的多肽，其中所述多肽包含与以下具有至少90％同一性的氨基酸序列：
(i)选自下组的序列的成熟形式，该组由以下组成：SEQ ID NO：4、1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、和13；
(ii)SEQ ID NO：27或与SEQ ID NO：27对齐的、SEQ ID NO：4、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、或13中的任一项中的子序列；如/或
(iii)选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO：4、1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、和13。
如上刚刚所述的反应可以任选地在本文中表征为α-1，2分支反应。例如，这种反应的产物可以被称为包含α-1，2键的葡聚糖组合物(或葡聚糖产物)。
在本公开的一些方面中，能够从α-葡聚糖底物形成至少一个α-1，2分支的多肽可以包含如下氨基酸序列或由其组成，所述氨基酸序列与预测的选自下组的序列的成熟形式具有100％同一性，或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性，该组由以下组成：SEQ ID NO：4、1、2、3和5-13。以下序列被认为分别是这些多肽的成熟形式(表达的形式)的实例：SEQ ID NO：4的位置36至1672、SEQ ID NO：1的位置21至2771、SEQ ID NO：2的位置21至2821、SEQ ID NO：3的位置41至2844、SEQ ID NO：5的位置51至1632、SEQ ID NO：6的位置51至1318、SEQ ID NO：7的位置51至1139、SEQ ID NO：8的位置51至1463、SEQ ID NO：9的位置41至2841、SEQ ID NO：10的位置46至2580、SEQ ID NO：11的位置51至1463、SEQ ID NO：12的位置21至2824、SEQ ID NO：13的位置21至2771。这些序列中的任何一个可以任选地进一步包含添加的N-末端甲硫氨酸残基。
在一些方面，能够从α-葡聚糖底物形成至少一个α-1，2分支的多肽包含如下氨基酸序列或由其组成，所述氨基酸序列与选自下组的序列具有100％同一性，或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性，该组由以下组成：SEQ IDNO：4、1、2、3和5-13。
SEQ ID NO：27(GTFJ18T1)，SEQ ID NO：1的N-末端缩短版本，在下面的实例中显示为能够从α-葡聚糖底物形成至少一个α-1，2分支。此外，SEQ ID NO：4(GTF9905)，含有与SEQID NO：27相对相似的子序列，在本文中也显示为能够从α-葡聚糖底物形成至少一个α-1，2分支。基于此信息，相信在某些实施例中的合适的多肽可以包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：27或与SEQ ID NO：27对齐的、SEQ ID NO：4、2、3和5-13中的任一项中的子序列具有100％同一性，或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。在一些方面，与SEQ ID NO：27对齐的合适的子序列如下表中所列：
Figure BDA0001673369560000211
Figure BDA0001673369560000221
a每次EMBOSS比对的同一性和相似性百分比值。
从一些上述实施例中应该显而易见的是，能够从α-葡聚糖底物形成至少一个α-1，2分支的多肽可以包括相对于SEQ ID NO：1-13中任一个被截短的氨基酸序列。在某些实施例中，截短的氨基酸序列包括催化合成具有α-1，2键的葡聚糖的来自SEQ ID NO：1-13中任一个的结构域。这种截短的氨基酸序列可以任选地包含一个或多个葡聚糖结合结构域。在某些实施例中，截短的氨基酸序列不包括催化合成具有不同于α-1，2键的键的葡聚糖的结构域。
本文公开的一些实施例涉及包含编码任何1，2-分支酶(例如，上文涉及SEQ IDNO：4、1、2、3或5-13和27中任一个的部分i、ii或iii)或如现在公开的其他葡糖基转移酶的核苷酸序列的多核苷酸。任选地，一个或多个调节序列与核苷酸序列有效地连接，并且优选包含启动子序列作为调节序列。
包含编码本文所述酶的核苷酸序列的多核苷酸可以是用于将核苷酸序列转移到细胞中的载体或构建体，例如(如表达载体)。合适的载体/构建体的实例可以选自质粒、酵母人工染色体(YAC)、粘粒、噬菌粒、细菌人工染色体(BAC)、病毒、或线性DNA(例如线性PCR产物)。在一些方面多核苷酸序列能够在细胞中瞬时存在(即未整合到基因组中)或稳定存在(即整合到基因组中)。在一些方面多核苷酸序列可以包含或缺少一个或多个合适的标记序列(例如选择或表型标记)。
在某些实施例中，多核苷酸序列可以包含与编码酶的核苷酸序列有效连接的一个或多个调节序列。例如，编码酶的核苷酸序列可以与启动子序列(例如异源启动子)有效地连接。例如，启动子序列可以适合于在细胞(例如，细菌细胞，如大肠杆菌；真核细胞，如真菌；酵母、昆虫或哺乳动物细胞)中或在体外蛋白质表达系统中表达。本文公开了其他合适的调节序列的实例(例如转录终止子序列)。
在一些实施例中，多核苷酸序列不包含与编码葡糖基转移酶的核苷酸有效连接的调节序列。这种多核苷酸可以是克隆载体(例如克隆质粒)，例如，仅用于亚克隆或基因穿梭目的。
可以包含在本文所述表达载体中的可能的起始控制区或启动子是众多的并且是本领域技术人员熟悉的。实际上任何能够驱动这些基因的启动子都是合适的，包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在酵母属中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属中表达)；以及lac、araB、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac、和trc(用于在大肠杆菌中表达)以及用于在芽孢杆菌中表达的amy、apr、npr启动子和各种噬菌体启动子。
控制转录终止的DNA片段也可以衍生自对优选的宿主细胞而言天然的各种基因。在某些实施例中，包含终止控制区域是任选的。在某些实施例中，表达载体包含衍生自优选的宿主细胞的终止控制区域。
在某些实施例中，本文公开的任何多肽均呈融合蛋白的形式。例如，多肽可以包含一个或多个可以有助于纯化多肽的标签序列。示例性标签序列包括：GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、内含肽-CBD(几丁质结合结构域)、MBD(麦芽糖结合结构域)和组氨酸标签。
在某些实施例中，宿主细胞中，特别是微生物宿主细胞中包含表达载体。在一些实施例中，微生物宿主细胞可以发现于真菌或细菌家族内，和/或在宽范围的温度、pH值和溶剂耐受性上生长。例如，预期细菌、酵母和丝状真菌中的任一种可适当地接纳(host)该表达载体。在宿主细胞中包含表达载体可以用于如本文公开的多肽的细胞内和/或细胞外表达。相对于用于产生细胞生物质的细胞原料相比，转录、翻译和蛋白质生物合成装置可以保持不变；不管怎样，通常可以表达功能性基因。宿主细胞的实例包括但不限于细菌、真菌或酵母菌种，例如曲霉属(Aspergillus)，木霉属(Trichoderma)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、法夫酵母属(Phaffia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、耶氏酵母属(Yarrowia)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动细菌属(Acinetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、赤杆菌属(Erythrobacter)、绿菌属(Chlorobium)、着色菌属(Chromatium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、噬细胞菌属(Cytophaga)、红细菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基杆菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯曲菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、集胞藻属(Synechocystis)、聚球藻属(Synechococcus)、鱼腥藻属(Anabaena)、产硫杆菌属(Thiobacillus)、甲烷细菌属(Methanobacterium)、克雷伯菌属(Klebsiella)、和粘球菌属(Myxococcus)。在某些实施例中，真菌宿主细胞是木霉属，例如里氏木霉(Trichoderma reesei)的菌株。在某些实施例中，细菌宿主菌株包括埃希氏菌属、芽孢杆菌属、克鲁维酵母属和假单胞菌属。在一些实施例中，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或大肠杆菌(Escherichia coli)。
在某些实施例中，(i)宿主细胞包含超过一种表达载体，和/或(ii)多种多肽在宿主细胞中表达。例如，在某些实施例中，宿主细胞包含用于表达α-葡聚糖水解酶的表达载体。将认识到，用于表达α-葡聚糖水解酶的表达载体可以与用于表达能够从α-葡聚糖底物形成至少一个α-1，2分支的多肽的表达载体相同或不同。
在本公开的某些实施例中，α-葡聚糖底物/主链具有至少3的聚合度(DP)，至少包含(i)α-1，6糖苷键或(ii)α-1，3和α-1，6糖苷键，并且通常是水溶性的。
在一些方面，α-葡聚糖底物可以具有如下值的DP：约或至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、100、105、110、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、或2000。α-葡聚糖底物的DP可以任选地表示为这些值中的任何两个之间的范围。仅作为实例，DP可以是约8至20、8至30、8至100、或8至500(其恰好是DP8+α-葡聚糖底物的实例)、3至4、3至5、3至6、3至7、3至8、4至5、4至6、4至7、4至8、5至6、5至7、5至8、6至7、6至8、或7至8。仅作为其他实例，DP可以是90至120、95至120、100至120、105至120、110至120、115至120、90至115、95至115、100至115、105至115、110至115、90至110、95至110、100至110、105至110、90至105、95至105、100至105、90至100、95至100、或90至95。
在某些实施例中，α-葡聚糖底物至少包含(i)α-1，6糖苷键或(ii)α-1，3和α-1，6糖苷键。例如，α-1，6键的百分比可以是至少约20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、69％、70％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％。α-葡聚糖底物的键谱图可以任选地表示为具有这些值中的任何两个之间的范围。例如，在这些实施例中的任一个中的其他底物键可以是α-1，3(例如高达80％)，和/或不包括任何α-1，4或α-1，2键。在一些方面，α-葡聚糖底物包含至少50％的α-1，6糖苷键。在一些其他实施例中，α-葡聚糖底物包含1％至50％的α-1，3糖苷键。
在某些实施例中，使用选自葡糖基转移酶(通常来自GH70家族糖苷水解酶)、糊精右旋糖酐酶、4，6-α-葡糖基转移酶(来自家族GH70的“Gtf-B型”)或其组合的酶制备α-葡聚糖底物。任选地，还包括至少一种α-葡糖苷酶，例如右旋糖酐酶和/或齿斑葡聚糖酶。在一些实施例中，α-葡聚糖底物是葡糖基转移酶的产物，该葡糖基转移酶包含如下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO：30(GTF8117)、32(GTF6831)、或33(GTF5604)具有100％同一性，或至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。本文中的α-葡聚糖底物可以通过合适的葡糖基转移酶反应组合物(例如，除了至少一种GTF酶之外至少包含水和蔗糖)来制备。
在酶促引入α-1，2分支之前，可以合成(并任选分离)α-葡聚糖底物，或者可以在α-1，2分支酶存在下同时合成(即可以在有效量的蔗糖存在下，在与具有α-1，2分支活性的多肽相同的反应混合物中进行葡聚糖底物主链合成)。α-葡聚糖底物可以以各种方式生产，包括但不限于，(1)在蔗糖存在下从至少一种葡糖基转移酶合成(使用与具有α-1，2分支活性的多肽不同的多肽)，(2)使用具有糊精右旋糖酐酶活性的多肽、Gtf-B型GH70葡糖基转移酶、或其组合从由淀粉或蔗糖获得的麦芽糖糊精(例如，使用淀粉蔗糖酶从蔗糖合成的麦芽糖糊精底物)合成，(3)使用方法(1)和/或(2)在至少一种α-葡聚糖水解酶(例如右旋糖酐酶、齿斑葡聚糖酶、或其组合)存在下合成，和(4)(1)、(2)、或(3)的任何组合，只要α-葡聚糖底物能够被具有α-1，2分支活性的多肽作用即可。在另外的实施例中，可以在α-1，2分支步骤之前合成α-葡聚糖底物，或者可以与α-1，2分支同时合成(即，水性反应混合物中存在具有α-1，2分支活性和有效量的蔗糖的多肽)。在使用上述实施例中任何一个合成α-葡聚糖底物的情况下，用于合成的反应物可以包括蔗糖和/或麦芽糖糊精，并且任选地存在一种或多种另外的受体。在另一个实施例中，反应物可进一步包含一种或多种受体，仅举几例，如麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖。
在一些实施例中，使用至少一种能够在相同反应混合物中形成葡萄糖低聚物的葡糖基转移酶与至少一种α-葡聚糖水解酶的组合(即它们同时存在并在反应组合物中有活性)来合成α-葡聚糖底物。同样地，用于α-葡聚糖水解酶的反应物由葡萄糖低聚物表示，同时在反应体系中由来自蔗糖的葡糖基转移酶合成。
例如，本文中的1，2-分支反应的葡聚糖产物(例如“包含α-1，2键的葡聚糖组合物”)(这样的产物可以是本文中反应组合物的产物和/或本文中产生葡聚糖组合物方法的产物)可以根据(i)本文中的任何α-葡聚糖底物加上(ii)如本文公开的任何添加的1，2-分支来表征。例如，包含α-1，2键的葡聚糖组合物的1，2-分支百分比可以是约、至少约、或小于约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、或55％。该1，2-分支谱可以任选地表示为具有这些值中的任何两个之间的范围。仅作为实例，葡聚糖组合物中1，2-分支的百分比可以是15％至50％、15％至45％、15％至40％、15％至35％、15％至30％、15％至25％、15％至20％、20％至50％、20％至45％、20％至40％、20％至35％、20％至30％、20％至25％、25％至50％、25％至45％、25％至40％、25％至35％、25％至30％、30％至50％、30％至45％、30％至40％、30％至35％、35％至50％、35％至45％、35％至40％、40％至50％、或40％至45％(这类1，2-分支谱中的一些或全部任选地与本文中的葡聚糖组合物相关联，当向哺乳动物肠内施用时，该葡聚糖组合物不增加血糖水平[可任选地称为膳食葡聚糖纤维])。仅作为另外的实例，葡聚糖组合物中1，2-分支的百分比可以小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、或4％，或在2％至10％、4％至10％、6％至10％、2％至8％、4％至8％、6％至8％、2％至6％、4％至6％、4.5％至6％、5％至6％、4％至7％、4.5％至7％、或5％至7％的范围内(这种1，2-分支谱任选地与本文中的葡聚糖组合物相关，当向哺乳动物肠内施用时，该葡聚糖组合物缓慢增加血糖水平[可任选地称为低血糖指数葡聚糖])。在一些方面，包含α-1，2键的葡聚糖组合物仅包含1，6-键和1，2-分支(1，2，6)(例如，用1，2-连接的侧链葡萄糖装饰的1，6-连接的主链)，不存在其他连接类型。在其他实施例中，包含α-1，2键的葡聚糖组合物包含用1，2-连接的分支装饰的如本文公开的任何α-葡聚糖底物主链。本文中的1，2-分支点(以及其他连接类型)的百分比可以使用1H NMR或GC/MS方法来确定，例如，如以下实例中所公开的。
在一些方面，包含α-1，2键的葡聚糖组合物可以具有如下值的DP：约或至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、105、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、或2000。包含α-1，2键的葡聚糖组合物的DP可以任选地表示为这些值中任何两个之间的范围。仅作为实例，DP可以是约120-160、125-160、130-160、135-160、140-160、145-160、150-160、155-160、120-155、125-155、130-155、135-155、140-155、145-155、150-155、120-150、125-150、130-150、135-150、140-150、145-150、120-145、125-145、130-145、135-145、140-145、120-140、125-140、130-140、135-140、120-135、125-135、130-135、120-130、125-130、或120-125(这种DP谱任选地与本文中的葡聚糖组合物相关联，当向哺乳动物肠内施用时，该葡聚糖组合物不增加血糖水平)，或约100-110。仅作为另外的实例，DP可以是100-120、105-120、110-120、115-120、100-115、105-115、110-115、100-110、105-110、或100-105(这种DP谱任选地与本文中的葡聚糖组合物相关，当向哺乳动物肠内施用时，该葡聚糖组合物缓慢增加血糖水平)。
在一些方面，包含α-1，2键(例如水溶性的键)的葡聚糖组合物，当向哺乳动物(例如人)喂食(肠内施用)时，缓慢释放葡萄糖；这种类型的葡聚糖组合物可以表征为“慢葡萄糖释放葡聚糖组合物”(或类似术语)。这种慢葡萄糖释放对应于血糖水平的缓慢增加(低血糖反应)。在一些其他方面，包含α-1，2键的葡聚糖组合物当向哺乳动物喂食时不释放葡萄糖，并且因此不会导致血糖水平的任何增加(无血糖反应)。据信这种对血糖水平的作用(缓慢作用或无作用)对包含α-1，2键的葡聚糖组合物是特异性的，并且因此独立于可能由潜在地包含在被饲喂给哺乳动物的物质中的血糖增加成分(例如，蔗糖、游离葡萄糖、淀粉)产生的对血糖水平的影响。换句话说，如果一种或多种血糖增加成分包括在含有本文中包含α-1，2键的葡聚糖组合物的食物/饮料中，据信喂食该食物/饮料的哺乳动物血糖水平的任何显著或快速增加均可归因于一种或多种这类其他血糖增加成分。
据信，本文中的慢葡萄糖释放主要发生在肠内施用(摄入)本文中某些包含α-1，2键的葡聚糖组合物(例如，少于约10％的α-1，2分支)后的哺乳动物的肠中。慢葡萄糖释放通常不会导致血糖高峰。与蔗糖和其他形式的易消化的含葡萄糖的碳水化合物(例如游离葡萄糖)相比，本文的慢葡萄糖释放葡聚糖的益处在于其被哺乳动物缓慢且稳定地消化。虽然本文中的慢葡萄糖释放葡聚糖是一种热量可用的碳水化合物-意味着它是可消化和可摄取的(例如，参见表35，其显示样品105-3[本文的慢葡萄糖释放葡聚糖的实例]摄入导致AUC值与由游离葡萄糖摄入产生的AUC值相当)-与消化游离葡萄糖相比，其消化导致葡萄糖的缓慢和持续释放(例如，参见表35，其显示样品105-3摄取导致1h时的最大血糖浓度为334mg/dL，而仅在20min后游离葡萄糖摄取就导致最大值为401mg/dL)。因此，本文中的慢葡萄糖释放葡聚糖在哺乳动物中摄入后通常导致与由容易消化的含葡萄糖的碳水化合物产生的总葡萄糖释放相同或相似的总葡萄糖释放(例如摄入后2至2.5小时释放的总葡萄糖)(例如当摄入相同量的慢葡萄糖释放葡聚糖或容易消化的含有葡萄糖的碳水化合物时)。然而，在哺乳动物中摄入之后(例如，如在摄入后0.25至2.5小时内测量的)，本文慢葡萄糖释放葡聚糖导致：(i)低于由容易消化的含葡萄糖的碳水化合物诱导的峰值的血糖峰值(例如，低至少约10％、12.5％、15％、17.5％、20％、22.5％、25％、10％至25％、10％至20％、10％至15％、15％至25％、或15％至20％)，和/或(ii)与容易消化的含葡萄糖的碳水化合物相比被拉伸的血糖曲线。例如，当摄入相同或相似量的慢葡萄糖释放葡聚糖或易消化的含葡萄糖的碳水化合物时，可以观察到(i)和/或(ii)的结果。例如，可以通过测量血糖水平来确定哺乳动物中的葡萄糖释放水平。
源自本文的慢葡萄糖释放葡聚糖的葡萄糖的慢消化和吸收导致其被摄入后产生低血糖反应(low blood glucose response/low glycemic response)。据信这样的低血糖反应又导致胰岛素的低释放。欧洲食品安全局认为低血糖反应是一种生理上有益的作用。长期来说，包括降低血液中所不期望的高浓度葡萄糖的碳水化合物从而降低对胰岛素的需求的饮食(可能是例如本文的慢葡萄糖释放葡聚糖)对预防和治疗糖尿病、心血管疾病和可能的肥胖是有帮助的。此外，在物理耐受活性中缓慢释放碳水化合物受到关注，其中有限的碳水化合物源的最佳使用可能是有利的。碳水化合物及其向大脑供应葡萄糖在认知表现和情绪中起核心作用。因此，稳定和持续的葡萄糖供应可能在记忆表现和情绪中起作用。
因此，本文进一步公开了一种方法，其包括向哺乳动物肠内施用(例如摄入)物质(例如食物、饮料、补充剂或药物)，其中该物质包含含有α-1，2键的葡聚糖组合物，其中与肠内施用缺乏该葡聚糖组合物但代替地含有相同量的易消化的含葡萄糖的碳水化合物的哺乳动物相比，所述施用导致哺乳动物中血糖升高更少或更慢(例如，如果使用1g葡聚糖组合物，则与1g容易消化的含葡萄糖的碳水化合物比较)，其中该葡聚糖组合物通过本文的任何分支方法或反应产生。例如，肠内施用可以通过自我施用(例如，任何形式的摄入，例如进食、饮用、服用药物)或非自我施用(例如，口腔管饲法，喂食装置，如喂食管)。
因此，本文进一步公开了一种生产可摄取产品(例如食物或饮料)的方法，所述方法包括将包含α-1，2键的葡聚糖组合物掺入所述可摄取产品中，其中与缺乏所述葡聚糖组合物的可摄取产品相比，所得可摄取产品的血糖指数不增加或仅稍微增加，并且其中该葡聚糖组合物通过本文中的任何分支方法或反应产生。
包含本文中产生的α-1，2-分支的葡聚糖组合物的组合物
在某些实施例中，包含目前公开的α-1，2-分支的葡聚糖的组合物可以是水性组合物。
据信，在一些方面，包含α-1，2-分支的葡聚糖的组合物可以具有约或至少约3cP、4cP、5cP、10cP、15cP、20cP、25cP、30cP、35cP、40cP、45cP或50cP(厘泊)的粘度。例如，粘度可以用本文的水性组合物在约3℃至约110℃之间(或在3℃与110℃之间的任何整数)的任何温度测量。粘度可以在大气压力(约760托)或任何合适的更高或更低压力下测量。
本文中的水性组合物的pH可以例如在约2.0至约12.0之间。可替代地，pH可以为例如约2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0；或在5.0至约12.0之间；或在约4.0与8.0之间；或在约5.0与8.0之间。
本文的水性组合物可以包含具有至少约10wt％的水的溶剂。在其他实施例中，例如，溶剂为至少约20wt％、30wt％、40wt％、50wt％、60wt％、70wt％、80wt％、90wt％、或100wt％的水(或在10wt％与100wt％之间的任何整数)。
本文中的α-1，2-分支的葡聚糖能以约或至少约0.01wt％、0.05wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1.0wt％、1.2wt％、1.4wt％、1.6wt％、1.8wt％、2.0wt％、2.5wt％、3.0wt％、3.5wt％、4.0wt％、4.5wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％、15wt％、16wt％、17wt％、18wt％、19wt％、20wt％、21wt％、22wt％、23wt％、24wt％、25wt％、26wt％、27wt％、28wt％、29wt％、30wt％、31wt％、32wt％、33wt％、34wt％、35wt％、36wt％、37wt％、38wt％、39wt％、40wt％、41wt％、42wt％、43wt％、44wt％、45wt％、46wt％、47wt％、48wt％、49wt％、50wt％、51wt％、52wt％、53wt％、55wt％、56wt％、57wt％、58wt％、59wt％、60wt％、61wt％、62wt％、63wt％、64wt％、65wt％、66wt％、67wt％、68wt％、69wt％、70wt％、71wt％、72wt％、73wt％、74wt％、75wt％、76wt％、77wt％、78wt％、79wt％、80wt％、81wt％、82wt％、83wt％、84wt％、85wt％、86wt％、87wt％、88wt％、89wt％、或90wt％的wt％存在于水性组合物中。
除了α-1，2-分支葡聚糖以外，本文的水性组合物通常可以包含其他组分。例如，水性组合物可以包含一种或多种盐，例如钠盐(例如NaCl)。盐的其他非限制性实例包括具有(i)铝、铵、钡、钙、铬(II或III)、铜(I或II)、铁(II或III)、氢、铅(II)、锂、镁、锰(II或III)、汞(I或II)、钾、银、钠、锶、锡(II或IV)或锌阳离子，和(ii)乙酸盐、硼酸盐、澳酸盐、澳化物、碳酸盐、氯酸盐、氯化物、亚氯酸盐、铬酸盐、氨腈(cyanamide)、氰化物、重铬酸盐、磷酸二氢盐、铁氰化物、亚铁氰化物、氟化物、碳酸氢盐、磷酸氢盐、硫酸氢盐、硫化氢、亚硫酸氢盐、氢化物、氢氧化物、次氯酸盐、碘酸盐、碘化物、硝酸盐、氮化物、亚硝酸盐、草酸盐、氧化物、高氯酸盐、高锰酸盐、过氧化物、磷酸盐、磷化物、亚磷酸盐、硅酸盐、锡酸盐、亚锡酸盐、硫酸盐、硫化物、亚硫酸盐、酒石酸盐或硫氰酸盐阴离子的那些。因此，例如，具有上述(i)中的阳离子和上述(ii)中的阴离子的任何盐可以在水性组合物中。例如，盐能以约0.01至约10.00(或在0.01至10.00之间的任何百分之一增量)的wt％存在于本文的水性组合物中。
本文中包含α-1，2-分支葡聚糖的组合物在一些方面可以是非水性的(例如干组合物)。这样的实施例的实例包括粉末、颗粒、微胶囊、薄片或任何其他形式的颗粒物质。其他实例包括更大的组合物，例如球粒、棒、核、珠粒、片剂、条棍或其他附聚物。本文的非水性组合物或干组合物典型地在其中包含有少于3wt％、2wt％、1wt％、0.5wt％、或0.1wt％的水。例如，非水性组合物或干组合物中的本文的α-1，2-分支葡聚糖的量可以是约或至少约1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％、15wt％、16wt％、17wt％、18wt％、19wt％、20wt％、21wt％、22wt％、23wt％、24wt％、25wt％、26wt％、27wt％、28wt％、29wt％、30wt％、31wt％、32wt％、33wt％、34wt％、35wt％、36wt％、37wt％、38wt％、39wt％、40wt％、41wt％、42wt％、43wt％、44wt％、45wt％、46wt％、47wt％、48wt％、49wt％、50wt％、51wt％、52wt％、53wt％、55wt％、56wt％、57wt％、58wt％、59wt％、60wt％、61wt％、62wt％、63wt％、64wt％、65wt％、66wt％、67wt％、68wt％、69wt％、70wt％、71wt％、72wt％、73wt％、74wt％、75wt％、76wt％、77wt％、78wt％、79wt％、80wt％、81wt％、82wt％、83wt％、84wt％、85wt％、86wt％、87wt％、88wt％、89wt％、90wt％、91wt％、92wt％、93wt％、94wt％、95wt％、96wt％、97wt％、98wt％、99wt％、99.5wt％、或99.9wt％。
本文中包含α-1，2-分支葡聚糖的组合物可以任选地含有一种或多种活性酶。合适的酶的非限制性实例包括蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、过氧化物酶、脂肪分解酶(例如金属脂肪分解酶)、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶(例如芳基酯酶、聚酯酶)、过氧水解酶、角质酶、果胶酶、果胶裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶(例如胆碱氧化酶)、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、苹果酸酶(malanase)、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、金属蛋白酶、阿马多里酶(amadoriase)、葡糖淀粉酶、阿拉伯呋喃糖酶、肌醇六磷酸酶、异构酶、转移酶和淀粉酶。如果包括一种或多种酶，则其能以例如约0.0001wt％至0.1wt％(例如0.01wt％至0.03wt％)的活性酶(例如，以纯酶蛋白计算)包含在本文的组合物中。
至少一种、两种或更多种纤维素酶可以包括在本文的组合物中。本文的纤维素酶可以具有内切纤维素酶活性(EC 3.2.1.4)、外切纤维素酶活性(EC 3.2.1.91)或纤维二糖酶活性(EC3.2.1.21)。本文的纤维素酶是在合适的条件下具有维持纤维素酶活性的活性的“活性纤维素酶”；确定这样的合适的条件在本领域技术范围内。
本文的纤维素酶可以衍生自任何微生物来源，例如细菌或真菌。包括化学修饰的纤维素酶或蛋白质工程化的突变纤维素酶在内。合适的纤维素酶包括但不限于来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、链霉菌属、木霉属、腐质霉属、镰胞菌属、梭孢壳属(Thielavia)和枝顶孢属的纤维素酶。作为其他实例，纤维素酶可以衍生自特异腐质霉(Humicola insolens)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)或尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)；这些和其他纤维素酶被公开在美国专利号4435307、5648263、5691178、5776757和7604974中，其全部均通过引用结合在此。示例性里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶公开于美国专利号4689297、5814501、5324649和国际专利申请公开号WO 92/06221和WO 92/06165中，其全部通过引用结合在此。示例性芽孢杆菌属(Bacillus)纤维素酶公开于美国专利号6562612中，其通过引用结合在此。纤维素酶，例如前述任何一种，优选为缺乏N-末端信号肽的成熟形式。可用于本文的可商购的纤维素酶包括纤维素酶
Figure BDA0001673369560000351
和护理酶
Figure BDA0001673369560000352
(诺维信公司(Novozymes A/S))；
Figure BDA0001673369560000353
和
Figure BDA0001673369560000354
HA(杜邦工业生物科学公司(DuPont Industrial Biosciences))和KAC-
Figure BDA0001673369560000355
(花王公司(Kao Corporation))。
当制备本文公开的组合物时，可以直接添加一种或多种纤维素酶作为成分。可替代地，可以在所公开的组合物中间接地(非故意地)提供一种或多种纤维素酶。例如，可以通过存在于用于制备组合物的非纤维素酶制剂中而在本文的组合物中提供纤维素酶。间接地向其中提供纤维素酶的组合物中的纤维素酶能以例如约0.1ppm至10ppm(例如，少于1ppm)存在。
在某些实施例中，纤维素酶可以是热稳定的。纤维素酶热稳定性是指酶在暴露于高温(例如约60℃至70℃)持续一段时间(例如约30至60分钟)后保留活性的能力。纤维素酶的热稳定性可以通过其以几分钟、几小时或几天给出的半衰期(t1/2)来测量，在该半衰期期间纤维素酶活性的一半在限定的条件下丧失。
在某些实施例中纤维素酶可以在宽范围的pH值(例如中性或碱性pH，例如约7.0至约11.0的pH)下稳定。这样的酶可以在这样的pH条件下保持稳定一段预定的时间(例如至少约15min、30min或1小时)。
纤维素酶在处理织物的水性组合物中的有效浓度可以由本领域技术人员容易地确定。在织物护理过程中，例如，纤维素酶能以最小约0.01ppm至0.1ppm的总纤维素酶蛋白质的浓度、或约0.1ppm至10ppm的总纤维素酶蛋白质的浓度(少于1ppm)至最约100ppm、200ppm、500ppm、1000ppm、2000ppm、3000ppm、4000ppm、或5000ppm的总纤维素酶蛋白质的浓度存在于处理织物的水性组合物(例如洗涤液)中。
例如，本文中包含α-1，2-分支葡聚糖的组合物可以呈家用护理产品、个人护理产品、工业产品、药物产品或食物产品的形式和/或包含于其中，例如下述这些产品中任一种。例如，这些组合物中的任何一种都可以是水性组合物。
本文的个人护理产品没有特别限制，并且包括例如皮肤护理组合物、化妆品组合物、抗真菌组合物和抗细菌组合物。本文的个人护理产品可以呈例如洗剂、霜剂、糊剂、香脂、软膏、润发油、凝胶剂、液体、这些的组合等的形式。如果需要，本文公开的个人护理产品可以包括至少一种活性成分。活性成分通常被认为是引起预期的药理作用的成分。在某些实施例中，本文中的个人护理产品可用于个人护理清洁应用中。
典型地，皮肤护理产品可以包括用于治疗或预防皮肤疾病、提供美容效果、或为皮肤提供保湿益处的至少一种活性成分，例如氧化锌、凡士林、白凡士林、矿物油、鱼肝油、羊毛脂、二甲聚硅氧烷、硬脂、维生素A、尿囊素、炉甘石、高岭土、甘油或胶体燕麦片、以及这些的组合。皮肤护理产品可以包括一种或多种天然保湿因子，例如像神经酰胺、透明质酸、甘油、角鲨烷、氨基酸、胆固醇、脂肪酸、三酸甘油酯、磷脂质、鞘糖脂、尿素、亚油酸、葡糖氨基葡聚糖、黏多糖、乳酸钠、或吡咯烷酮羧酸钠。可以包括在皮肤护理产品中的其他成分包括但不限于甘油酯、杏仁油、低芥酸菜籽油、角鲨烷、角鲨烯、椰子油、玉米油、荷荷芭油、荷荷芭蜡、卵磷脂、橄榄油、红花油、芝麻油、乳木果油、大豆油、甜杏仁油、向日葵油、茶树油、乳木果油、棕榈油、胆固醇、胆固醇酯、蜡酯、脂肪酸和橙皮油。
本文的个人护理产品也可以呈例如化妆品、唇膏、睫毛膏、胭脂、粉底、腮红、眼线膏、唇线笔、唇彩、其他化妆品、防晒霜、防晒乳、指甲油、指甲调理剂、沐浴露(bath gel)、淋浴凝胶(shower gel)、沐浴乳(body wash)、洗面奶、润唇膏、护肤霜、冷霜、润肤膏、身体喷雾剂、皂、身体磨砂膏、去角质剂(exfoliant)、收敛剂、颈背爽肤水(scruffing lotion)、脱毛剂、烫发溶液(permanent waving solution)、去头皮屑配制品、止汗组合物、除臭剂、剃须产品、剃须前产品、剃须后产品、清洁剂、皮肤凝胶、染发剂、洁牙剂组合物、牙膏、或漱口剂。
在某些方面，个人护理产品可以是头发护理产品。本文的头发护理产品的实例包括洗发精、护发素(免洗或漂洗型)、营养发水、染发剂、染发产品、头发光亮产品、护发精华、头发防毛躁产品、头发分叉修复产品、摩丝、喷发剂和发型啫哩。在一些实施例中，头发护理产品可以呈液体、糊剂、凝胶、固体或粉末的形式。典型地，如本文公开的头发护理产品包含一种或多种以下通常用于配制头发护理产品的成分：阴离子表面活性剂，例如聚氧乙烯月桂醚硫酸钠；阳离子表面活性剂，例如硬脂酰基三甲基氯化铵和/或二硬脂酰基二甲基氯化铵；非离子表面活性剂，例如单硬脂酸甘油酯、山梨糖醇酐单棕榈酸酯和/或聚氧乙烯鲸蜡醚；润湿剂，例如丙二醇、1，3-丁二醇、甘油、山梨糖醇、焦谷氨酸盐、氨基酸和/或三甲基甘氨酸；烃类，例如液体石蜡、凡士林油、固体石蜡、角鲨烷和/或烯烃低聚物；高级醇，例如硬脂醇和/或鲸蜡醇；富脂剂；去头皮屑剂；消毒剂；消炎剂；生药；水溶性聚合物，例如甲基纤维素、羟基纤维素和/或部分脱乙酰甲壳素；防腐剂，例如对羟基苯甲酸酯；紫外光吸收剂；珠光剂；pH调节剂；香料；以及颜料。
本文的药物产品可以呈例如乳剂、液体、酏剂、凝胶、悬浮液、溶液、霜剂或软膏剂的形式。而且，本文的药物产品可以呈本文公开的任何个人护理产品的形式，例如抗细菌或抗真菌组合物。药物产品可以进一步包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或药学上可接受的盐。本文公开的α-1，2-分支葡聚糖也可以用于胶囊、封装剂、片剂包衣以及药剂和药物的赋形剂。
本文的家用护理和/或工业产品可以呈以下形式：例如，干壁胶带接合化合物；砂浆；水泥浆；石膏水泥灰浆(cemem plaster)；喷雾灰泥；水泥灰泥(cemem stucco)；粘合剂；糊剂；墙壁/天花板调质剂；用于带式浇注、挤压成型、喷射模塑和陶瓷的粘合剂和加工助剂；用于杀有害生物剂、除草剂和化肥的喷洒附着物和悬浮/分散助剂；织物护理产品，例如织物柔软剂和衣物洗涤剂；餐具洗涤剂；硬表面清洁剂：空气清新剂；聚合物乳液；凝胶例如水性凝胶；表面活性剂溶液；涂料如水性涂料；保护涂层；粘合剂；密封剂和填缝剂；油墨例如水性油墨；金属加工液；或用于电镀、磷化、镀锌和/或一般金属清洗操作中的乳液型金属清洗液。在某些实施例中，本文的家用护理产品或工业产品可用于清洁应用中，并且因此例如可以包含在洗涤剂组合物中。
据信，本文公开的α-1，2-分支葡聚糖可用于向个人护理产品、药物产品、家用护理产品、工业产品或食物产品提供一种或多种以下物理特性：例如血糖指数改变、膳食纤维、增稠、冷冻/解冻稳定性、润滑性、湿度保持和释放、质地、稠度、形状保持、乳化、粘合、悬浮、分散、凝胶化、矿物硬度降低。产品中α-1，2-分支葡聚糖的浓度或量的实例可以是例如上文提供的任何重量百分比。
目前公开的α-1，2-分支葡聚糖可以与适用于本文中食物产品和/或其他可摄入产品的一种或多种其他材料一起配制(例如，共混、混合、掺入等)(例如营养补充剂、药物)。任选地，本文中的α-1，2-分支葡聚糖可以以糖浆的形式提供，用于制备和/或修饰目前公开的任何食物或其他可摄入产品。
在一些实施例中，本文中的α-1，2-支化的葡聚糖可以包括在具有以下中的至少一种的产品中：单糖、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、异构化糖、麦芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纤维二糖、异麦芽糖、蜂蜜、枫糖、水果衍生的甜味剂、山梨糖醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤藓糖醇、双氢查耳酮、甜菊苷、α-糖基甜菊苷、乙酰磺胺酸钾、阿力甜、纽甜、甘草甜素、奇异果甜蛋白、三氯蔗糖、L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯、糖精、麦芽糖糊精、淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纤维、抗性麦芽糖糊精、支化麦芽糖糊精、菊糖、聚右旋糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、阿拉伯糖基低聚木糖、黑曲霉寡糖、龙胆寡糖(gentio-oligosaccharide)、半纤维素、果糖低聚物糖浆、异麦芽低聚糖、填充剂、赋形剂和黏合剂。
在某些实施例中，基于干固体，可摄入产品包含0.01wt％至99wt％、0.1wt％至90wt％、1wt％至90wt％、或5wt％至80wt％本文中的α-1，2-分支葡聚糖。
术语“食物”旨在涵盖供人消耗以及供动物(例如哺乳动物)消耗的食物。“功能性食物”是指任何声称具有超出提供营养素的基本营养功能的促进健康和/或预防疾病和/或降低疾病(风险)性质的新鲜或加工食物。功能性食物可以包括例如加工食物或用促进健康的添加剂强化的食品。功能性食物的实例是用维生素强化的食物，或具有活培养物的发酵食物。
可包含在本文的可摄入产品中的其他成分是水或其他水性溶液、脂肪、糖、淀粉、黏合剂、增稠剂、着色剂、调味剂、食用香料、酸化剂(例如乳酸或苹果酸等)、稳定剂、高强度甜味剂、和/或矿物质等。
本文中的一种或多种α-1，2-分支葡聚糖产品可以在目前公开的任何食物实施例中提供。根据期望的一种或多种效果，(i)具有膳食纤维品质的α-1，2-分支葡聚糖和/或(ii)具有低血糖指数的α-1，2-分支葡聚糖可以适当使用。
合适食物的实例包括面包、早餐麦片、饼干、蛋糕、曲奇、咸饼干、酸奶(yogurt)、开菲尔、味噌、纳豆、丹贝、泡菜、酸白菜、水、牛奶、果汁、蔬菜汁、碳酸软饮料、非碳酸软饮料、咖啡、茶、啤酒、葡萄酒、烈酒、酒精饮料、小吃、汤、冷冻甜点、油炸食物、披萨、面食制品、马铃薯制品、大米制品、玉米制品、小麦制品、乳制品、硬糖、营养棒、麦片、面团、加工肉和奶酪、酸奶(yoghurt)、冰淇淋甜点、基于牛奶的饮料、沙拉酱、酱汁、浇头、甜点、糖果产品、基于谷类的快餐、准备的菜品等。
在某些实施例中，本文的可摄入产品可以包含至少一种膳食纤维来源。在那些方面，其中本文中的α-1，2-分支葡聚糖本身是膳食纤维(例如，在一些情况下具有约15％至45％的1，2-分支葡聚糖)，这种葡聚糖可以是唯一的纤维来源或者除了一种或多种其他纤维来源之外。本文中合适的膳食纤维包括低聚糖或多糖，如抗性/分支麦芽糖糊精/纤维糊精(例如
Figure BDA0001673369560000401
来自罗盖特公司(Roquette Freres)，莱斯特朗，法国；Fibersol-
Figure BDA0001673369560000402
来自ADM-Matsutani有限责任公司，迪凯特，伊利诺伊州)、聚右旋糖(例如
Figure BDA0001673369560000403
或
Figure BDA0001673369560000404
ULTRA，来自丹尼斯克-杜邦营养与健康公司(Danisco-DuPont Nutrition&Health)，威尔明顿，特拉华州)、可溶性玉米纤维(例如
Figure BDA0001673369560000405
来自泰莱贸易有限公司(Tate&Lyle)，伦敦，英国)、异麦芽低聚糖(IMO)、交替糖和/或麦芽-交替糖低聚糖(MAO)(例如FibermaltTM，来自Aevotis GmbH公司，波茨坦，德国；SucromaltTM，来自卡吉尔公司(Cargill Inc.)，明尼阿波利斯，明尼苏达州)、普鲁兰多糖、抗性淀粉、菊粉、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖、阿拉伯糖基低聚木糖、黑曲霉寡糖、龙胆寡糖、半纤维素、和果糖低聚物糖浆。
例如，本文中的α-1，2-分支葡聚糖可以作为常规碳水化合物的替代物或补充物添加到食物中。
在某些实施例中，本文的可摄入产品可以包含至少一种人工甜味剂，包括但不限于甜菊糖、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜、乙酰磺胺酸钾、糖精及其任何组合。本文中的可摄入产品可以包含至少一种糖替代品，例如，像甜味蛋白、仙茅甜蛋白、赤藓糖醇、甘油、甘草甜素、氢化淀粉水解产物、菊粉、异麦芽酮糖醇、乳糖醇、马槟榔蛋白、麦芽糖醇、麦芽低聚糖、麦芽-交替糖低聚糖(例如
Figure BDA0001673369560000411
sucromaltTM，可从卡吉尔公司(Cargill Inc.，明尼阿波利斯，明尼苏达州)获得)、甘露醇、神秘果蛋白、罗汉果苷混合物、莫那甜、莫内林、欧亚水龙骨甜素、喷塔汀、山梨糖醇、甜叶菊、塔格糖、奇异果甜蛋白、木糖醇、及其任何组合。
在某些实施例中，与其中使用常规碳水化合物(例如易消化的含葡萄糖的碳水化合物)的类似食品相比(例如，当以相同或相似的量使用时)，本文的包含α-1，2-分支葡聚糖的食物具有较低的血糖反应、血糖指数和/或血糖负荷(例如，低至少约5％、10％、15％、20％、或25％)。此外，因为在某些方面α-1，2-分支葡聚糖的特征在于在人类胃和/或小肠中具有低消化率或无消化率，所以食物产品的热量含量降低(遵循上述比较)。α-1，2-分支葡聚糖可以单独地或与膨松剂(如糖醇或麦芽糖糊精)组合在食物产品中使用，以降低热量含量、增强食物的营养状况、和/或作为脂肪的部分替代物。
预期本文中的α-1，2-分支葡聚糖可作为嫩化剂或调质剂用于食物产品中以增加脆性或易断性(snap)，改善视觉效果(eye appeal)，和/或改善面团、面糊或其他食物组合物的流变性。还预期葡聚糖用作食物产品中的湿润剂，以增加产品保存期限，产生更柔软、更湿润的质地，降低水分活性，和/或固定和控制水分。葡聚糖的其他用途可包括：替代蛋液和/或增强食物产品的表面光泽、改变粉状淀粉糊化温度、改变产品的质地、和增强产品的褐变。
α-1，2-分支葡聚糖可以用于各种类型的食物产品中。可使用本发明的葡聚糖的一种类型的食物产品是焙烤食品(烘焙食品)，例如蛋糕、布朗尼蛋糕、曲奇、曲奇饼干、松饼、面包和美式甜面包。焙烤食品有两大类：酵母培养的和化学发酵的。在酵母培养产品(如甜甜圈、美式甜面包和面包)中，本文中的葡聚糖可以用于取代糖，但由于需要针对酵母或用于外皮褐变的发酵底物，仍然可能需要少量的糖。例如，糖浆中的α-1，2-分支葡聚糖可以与其他液体一起添加，作为不含纤维的糖浆或液体甜味剂的直接替代物。然后将面团在烘烤工业中通常使用的条件下加工，包括混合、发酵、分割、成形或挤出成块或形状、加膜(proofed)、和烘烤或油炸。该产品可以使用类似于传统产品的条件进行烘烤或油炸。通常将面包在从420°F至520°F(216℃至271℃)的温度范围下烘烤20至23分钟，并且可以在400°F至415°F(204℃至213℃)的温度范围下油炸甜甜圈，尽管也可以使用其他温度和时间。
化学发酵产品通常具有更多的糖，并且可以含有更高水平的包含本文的α-葡聚糖的碳水化合物组合物和/或可食用糖浆。成品曲奇可含有30％的糖，这些糖可完全或部分地用包含本发明葡聚糖组合物的碳水化合物组合物和/或糖浆替代。例如，这些产品可具有4至9.5的pH。例如，水分含量可以在2％至40％之间。
本文中的葡聚糖组合物(例如，在糖浆中)可以容易地掺入，并且可以在乳化步骤期间的混合开始时或以类似于用其进行代替的糖浆或干甜味剂的任何方法添加到脂肪中。产品将被混合并且然后成形，例如通过成片、旋转切割、线切割或通过另一成形工艺。然后在典型的烘烤条件下烘烤产品，例如在200°F至450°F(93℃至232℃)下烘烤。
可以使用本文中的葡聚糖(例如，在糖浆中)的另一类食物产品是早餐谷物。例如，可以使用含葡聚糖的糖浆来代替挤出的谷物碎片中和/或这些碎片外面的涂层中的全部或部分糖。该涂层通常为成品谷物片总重量的30％至60％。例如，糖浆可以以喷洒或涂淋的方式应用。
其中可以使用本文中的α-1，2-分支葡聚糖的另一类型的食物产品是乳制品。合适的乳制品的实例包括酸奶、酸奶饮料、奶饮料、调味奶、冰沙、冰淇淋、奶昔、松软干酪、松软干酪酱和乳制甜点，如脱脂凝乳和搅打奶油慕斯型产品。这将包括旨在直接食用的乳制品(如包装冰沙)以及旨在与其他成分(如混合冰沙)混合的乳制品。它可用于巴氏灭菌乳制品，例如在从160°F至285°F(71℃至141℃)的温度进行巴氏灭菌的乳制品。
其中可以使用本文中的α-1，2-分支葡聚糖的另一类型的食物产品是糖果。合适的甜食的例子包括硬糖、方旦糖、牛轧糖和棉花糖、明胶果冻糖果或橡皮糖、果冻、巧克力、甘草糖、口香糖、焦糖和太妃糖、求斯糖(chews)、薄荷糖、片状甜点和水果小吃。在水果小吃中，本文中包含葡聚糖的组合物可以与果汁组合使用。果汁将提供大部分的甜味，并且包含葡聚糖的组合物会降低总糖含量并可能添加纤维。包含本文中的α-葡聚糖的组合物可以被添加到初始糖果浆中并加热到成品固体含量。可以从200°F至305°F(93℃至152℃)加热浆料以获得成品固体含量。可以在加热之前或之后添加酸以得到2至7的最终pH。包含葡聚糖的组合物可以用作0至100％糖和存在的1％至100％玉米糖浆或其他甜味剂的替代品。
其中可以使用本文中的α-1，2-分支葡聚糖的另一类型的食物产品是果酱和果冻。果酱和果冻由水果制成；果酱含有水果块，而果冻是由果汁制成的。包含本发明葡聚糖的组合物可以用于代替如下糖或其他甜味剂：将水果和果汁倒入罐中；预混合糖、含α-葡聚糖的组合物和果胶；将干组合物添加到液体中并且烹调至214°F至220°F(101℃至104℃)的温度；热装入罐中并蒸煮5至30分钟。
其中可以使用本文中的α-1，2-分支葡聚糖的另一类型的食物产品是饮料。合适饮料的实例包括碳酸饮料、果汁、浓缩果汁混合物(例如玛格丽塔混合物)、清水和饮料干混物。使用本文中α-1，2-分支葡聚糖膳食纤维可以克服将其他类型的纤维添加到饮料中时产生的净度问题。糖的完全替代也许是可能的(例如，可能高达总配方的12％或更多)。
另一种合适类型的食物产品是高固体填料。高固体填料的实例包括小吃棒、烤面包糕点、甜甜圈和曲奇中的填料。例如，高固体填料可以是酸/水果填料或咸味填料。本文中的α-1，2-分支葡聚糖可以通过食物处理器(额外的烘烤)或消费者(烘烤稳定的填料)添加到将被原样消费的产品或将被进一步加工的产品中。在某些实施例中，高固体填料将具有67％至90％之间的固体浓度。固体可以完全被包含α-葡聚糖的组合物替代，或者其可以用于部分替代存在的其他甜味剂固体(例如替代从5％至100％的当前固体)。典型地，水果填料的pH值为2至6，而咸味填料的pH值为4至8。填料可以冷却制备或在高达250°F(121℃)加热以蒸发至所需的成品固体含量。
可以包含本文中葡聚糖的另一种合适类型的食物产品由挤压和片状小吃表示。挤压和片状的实例包括膨化小吃、咸饼干、墨西哥炸玉米片和玉米片。在制备挤压片时，包含本发明葡聚糖的组合物将直接与干产物一起添加。在挤出机中添加少量的水，并且然后通过在从100°F至300°F(38℃至149℃)范围内的各个区域。干产品可以以干产品混合物0至50％的水平添加。包含葡聚糖的糖浆也可以沿挤出机在液体口之一添加。该产品可以以低含水量(5％)产生并且然后烘烤去除多余的水分，或以稍高含水量(10％)产生并且然后油炸去除水分并煮熟产品。烘烤温度可能高达500°F(260℃)，持续20分钟。更典型地，烘烤会在350°F(177℃)持续10分钟。典型地，油炸会在350°F(177℃)持续2至5分钟。在片状小吃中，葡聚糖可以用于部分替代其他干成分(例如面粉)。葡聚糖可以是干重的0至50％。产品将被干混，并且然后加水形成粘性面团。产品混合物的pH值可以为5至8。然后将面团切片并切割，并且然后烘烤或油炸。烘烤温度可能高达500°F(260℃)，持续20分钟。典型地，油炸会在350°F(177℃)持续2至5分钟。使用包含葡聚糖的组合物的另一个潜在益处是，当其作为内部成分或作为油炸食物外面的涂层添加时，油炸小吃的脂肪含量减少多达15％。
可以使用本文中葡聚糖的另一种类型的食物产品是明胶甜点。明胶甜点的成分通常以明胶作为胶凝剂的干混合物出售。糖固体可以部分或全部用在干混合物中包含本发明葡聚糖的组合物代替。然后可以将干混合物与水混合并加热至212°F(100℃)以溶解明胶，并且然后可以添加更多的水和/或水果来完成明胶甜点。然后使明胶冷却并定型。明胶也可以以贮存稳定包装出售。在那种情况下，稳定剂通常是基于角叉菜胶的。如上所述，包含α-葡聚糖的组合物可用于替代高达100％的其他甜味剂固体。将干燥的成分混入液体中，并且然后进行巴氏灭菌并放入杯中并使其冷却和定型。
其中可以使用包含本文中葡聚糖的组合物的另一类型的食物是小吃棒。可以使用该组合物的小吃棒的实例包括早餐和晚餐替代棒、营养棒、格兰诺拉燕麦棒、蛋白棒和谷物棒。该组合物可以用于小吃棒的任何部分，例如用于高固体填料、粘合糖浆或颗粒部分。完全或部分替代粘合糖浆中的糖也许是可能的。结合糖浆通常为50％至90％固体，并且以从10％结合糖浆至90％颗粒、至70％结合糖浆至30％颗粒范围的比率施用。粘合糖浆通过将甜味剂、膨松剂和其他粘合剂(如淀粉)的溶液加热至160°F至230°F(71℃至110℃)(取决于糖浆中所需的成品固体)而制成。然后将糖浆与颗粒混合以涂覆这些颗粒，在整个基质中提供涂层。包含葡聚糖的组合物也可以用于颗粒本身。该组合物可能是挤压片，直接扩展或枪膨化。该组合物可以与其他谷物成分、玉米粉、米粉或其他类似成分组合使用。
其中可以使用包含本文中的葡聚糖的组合物的另一类食物产品是奶酪、奶酪酱和其他奶酪产品。其中可以使用该组合物的奶酪、奶酪酱和其他奶酪产品的实例包括低奶固体奶酪、低脂奶酪和低卡路里奶酪。在大块奶酪中，该组合物可以帮助改善熔化特性，或者降低由其他成分(如淀粉)添加的熔化限制的影响。该组合物也可用于奶酪酱，例如作为膨松剂，以取代脂肪、奶固体或其他典型的膨松剂。
其中可以使用本文中的葡聚糖的另一类食物产品是可食用和/或水溶性的薄膜。其中可以使用该葡聚糖的薄膜的实例包括用于封装旨在溶解在水中的各种食物和饮料的干混合物的薄膜，或用于递送颜色或味道的薄膜，如在烹饪后但仍然热的时候添加到食物中的辣味薄膜。其他薄膜应用包括但不限于水果和蔬菜皮革以及其他柔性薄膜。
在另一个实施例中，可以使用包含本文中葡聚糖的组合物是汤、糖浆、酱料和调料。典型的调料可以包含0至50％油，pH范围为2至7。调料可以被冷加工或热处理。混合调料，并且然后添加稳定剂。包含葡聚糖的组合物可以根据需要容易地以液体或干燥形式与其他成分一起添加。调料组合物可能需要加热以激活该稳定剂。典型的加热条件为170°F至200°F(77℃至93℃)，持续1至30分钟。冷却后，添加油制成预乳液。然后使用均化器、胶体磨或其他高剪切工艺将产品乳化。酱料可以含有0至10％的油和10％至50％的总固体，并且可以具有2至8的pH。酱料可以被冷加工或热处理。将各成分混合并且然后进行热处理。本文中的葡聚糖可以根据需要容易地以液体或干燥形式与其他成分一起添加。典型的加热为170°F至200°F(77℃至93℃)，持续1至30分钟。汤更典型的具有20％至50％固体和更中性的pH范围(4至8)。汤可以是其中可以添加包含本文中的葡聚糖的干组合物的干混合物，或罐装并且然后蒸煮的液体汤。在汤中，抗性玉米糖浆可以使用高达50％的固体，尽管更典型的用法是递送5g的纤维/份。
可以使用本文中葡聚糖的另一种类型的食物产品是咖啡奶精。可以使用该葡聚糖的咖啡奶精的实例包括液体奶精和干奶精二者。干混咖啡奶精可以与以下脂肪类型的商业奶精粉混合：大豆、椰子、棕榈、向日葵、或低芥酸菜籽油、或乳脂。这些脂肪可以是非氢化或氢化的。包含该葡聚糖的组合物可以作为纤维源添加，任选与低聚果糖、聚右旋糖、菊糖、麦芽糖糊精、抗性淀粉、蔗糖和/或常规玉米糖浆固体一起添加。该组合物还可以含有高强度甜味剂，例如三氯蔗糖、乙酰磺胺酸钾、阿斯巴甜或其组合。这些成分可以干混以产生所希望的组合物。喷雾干燥的奶精粉是脂肪、蛋白质和碳水化合物、乳化剂、乳化盐、甜味剂、和抗结块剂的组合。该脂肪源可以是大豆、椰子、棕榈、向日葵、或低芥酸菜子油、或乳脂中的一种或多种。蛋白质可以是酪蛋白酸钠或酪蛋白酸钙、奶蛋白、乳清蛋白、小麦蛋白、或大豆蛋白。碳水化合物可以是包含单独的或与低聚果糖、聚右旋糖、菊粉、抗性淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖、玉米糖浆或其任何组合进行组合的葡聚糖的组合物。乳化剂可以是甘油单酯和甘油二酯、乙酰化的甘油单酯和甘油二酯、或丙二醇单酯。盐可以是柠檬酸三钠、磷酸一钠、磷酸二钠、磷酸三钠、焦磷酸四钠、磷酸一钾、和/或磷酸二钾。该组合物还可以含有高强度甜味剂，如上面描述的那些甜味剂。合适的防结块剂包括硅铝酸钠或二氧化硅。将产物在浆液中混合，任选均化，并以粒状或团聚形式喷雾干燥。液体咖啡奶精只是一种均质和巴氏灭菌脂肪(乳脂或氢化植物油)乳剂、一些奶固体或酪蛋白酸盐、玉米糖浆、和香草或其他香料，以及稳定的混合物。产品通常通过在185°F(85℃)30秒的HTST(高温短时间)或在285°F(141℃)4秒的UHT(超高温)进行巴氏灭菌，并在第一阶段以500psi至3000psi(3.45MPa至20.7MPa)和第二阶段以200psi至1000psi(1.38MPa至6.89MPa)的两阶段均化器中匀化。咖啡奶精通常是稳定的，以便在添加到咖啡中时不会分解。
其中可以使用本文中的葡聚糖的另一类食物产品(例如，作为糖浆)是食物涂层，例如糖衣、糖霜和釉料。在糖衣和糖霜中，葡聚糖可以用作甜味剂替代品(完全或部分)以降低卡路里含量并增加纤维含量。釉料通常含有约70％至90％糖，其余大部分为水，并且葡聚糖可用于完全或部分替代糖。糖霜通常包含约2％至40％的液体/固体脂肪组合、约20％至75％甜味剂固体、颜色、香料和水。葡聚糖可用于替代全部或部分甜味剂固体，或作为低脂肪系统中的膨松剂。
其中可以使用葡聚糖的另一类食物产品是宠物食物，例如干燥或潮湿的狗食。宠物食物以各种方式制成，如挤出、成型和配制成肉汁。这些类型中的每种中的葡聚糖都可以以0至50％的水平使用。
其中可以使用葡聚糖的另一类食物产品是鱼和肉。常规玉米糖浆已经用于一些肉类中，因此本文中的含葡聚糖的糖浆可以用作部分或完全的替代物。例如，葡聚糖糖浆可以在真空翻滚或注入肉中之前添加到盐水中。葡聚糖糖浆可以与盐和磷酸盐一起添加，并且任选地与水结合成分，如淀粉、角叉菜胶或大豆蛋白一起添加。
有益的生理学性质
气体产生
下胃肠道中气体的快速产生会引起肠胃不适，如胀气和腹胀，而如果气体产量是渐变的并且低的，身体就会更容易应付。例如，与等效剂量的所公开的葡聚糖相比，菊粉可能促进气体快速和大量产生，而在一些实施例中，所公开的葡聚糖的气体释放速率低于等效剂量菊粉的气体释放速率。
在一个实施例中，对含有所公开的葡聚糖的食物产品的消耗可能导致对于食物应用良好耐受的气体产生速率。在一个实施例中，气体产生的相对速率不超过在类似条件下观察到的菊粉的速率，例如与菊粉相同或更小、或小于菊粉、或远低于等效剂量的菊粉。在另一个实施例中，使用本文所述的方法在3小时或24小时内测量气体形成的相对速率。在一些实施例中，气体形成的速率比在相同反应条件下观察到的菊粉的速率低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、或30％。
短链脂肪酸生产
使用本文中的葡聚糖可促进通过结肠发酵产生产能代谢物。使用本文中的葡聚糖可以促进短链脂肪酸(SCFA)(例如丙酸酯和/或丁酸酯)的产生。已知SCFA可降低胆固醇。因此，本文中的葡聚糖可降低患高胆固醇的风险。由于SCFA的产生或SCFA与乙酸酯的比例增加有利于控制对其有需要的哺乳动物中的胆固醇水平，因此所公开的葡聚糖组合物可能是营养学家和消费者特别感兴趣的，用于预防和/或治疗心血管风险。因此，在另一方面，本公开提供了用于改善受试者健康的方法，该方法包括以对所述受试者的健康产生有益效果(例如用于治疗胆固醇相关疾病)的有效量向受试者施用包含所公开的葡聚糖组合物的组合物。另外，通常已知SCFA降低肠道中的pH并且这有助于钙的吸收。因此，根据本公开的化合物也可以影响矿物质吸收。这意味着这些化合物也可以改善骨骼健康，或通过降低因肠内SCFA增加引起的pH来预防或治疗骨质疏松症。SCFA的产生可能增加小肠中的粘度，这减少了胆汁酸的再吸收；增加从胆固醇合成胆汁酸和降低循环低密度脂蛋白(LDL)胆固醇。
如本文所定义的化合物或组合物的“有效量”是指在必需的剂量和时间段内有效实现期望的有益生理学效应的量，如降低血胆固醇、增加SCFA产量、或者预防或治疗胃肠道疾病。例如，施用给受试者的组合物的量将根据多种因素(如受试者的状况、受试者的体重、受试者的年龄、以及组合物是否是唯一营养来源)而变化。有效量可由医生或营养师容易地设定。通常，施用足够量的组合物以向受试者提供每天至多约50g；或例如，每天约25g至约35g。在一些实施例中，受试者接受的公开的葡聚糖组合物的量在每天约0.1g至约50g、或每天0.5g至20g、或每天1g至10g的范围内。如本文所定义的化合物或组合物可以以多次剂量服用，例如1至5次，全天分散服用或密集服用，或者可以以单次剂量服用。如本文所定义的化合物或组合物也可以在期望的时间段内连续进料。在某些实施例中，所需时间段为至少一周或至少两周或至少三周或至少一个月或至少六个月。
在一些实施例中，本公开提供了通过向对其有需要的受试者施用如本文所定义的化合物或组合物来降低对其有需要的受试者的血液甘油三酯水平的方法。在另一个实施例中，本公开提供了通过向对其有需要的受试者施用如本文所定义的化合物或组合物来降低对其有需要的受试者的低密度脂蛋白水平的方法。在另一个实施例中，本公开提供了通过向对其有需要的受试者施用如本文所定义的化合物或组合物来增加对其有需要的受试者的高密度脂蛋白水平的方法。
餐后血糖浓度/血糖反应的降低
公开的葡聚糖组合物中除α-1，4主链键以外的键的存在提供了改善的消化抗性，因为人消化道的酶可能难以水解这类键和/或支化键。在一些实施例中，分支的存在为葡聚糖提供了部分或完全的难消化性，并且因此实际上没有葡萄糖向体内吸收或吸收较慢，这导致较低的血糖反应。因此，本公开提供了产生较低血糖反应的用于制造食物和饮料组合物的葡聚糖组合物。例如，这些化合物可以用于代替糖或其他快速消化的碳水化合物，并且从而降低食物的血糖负荷、降低卡路里和/或降低食物的能量密度。而且，所公开的具有这些类型键的葡聚糖组合物的稳定性允许它们容易地进入大肠中，在那里它们可以用作对结肠微生物菌群具有特异性的底物。
改善肠道健康
在另一个实施例中，如本文公开的化合物可以用于治疗和/或改善肠道健康。在一些实施例中，葡聚糖组合物在肠中通过肠微生物菌群缓慢发酵。在一些实施例中，本发明化合物表现出(在体外肠模型中)不比菊粉或其他市售纤维(例如
Figure BDA0001673369560000501
(可溶性玉米纤维，泰莱贸易有限公司(Tate&Lyle))、
Figure BDA0001673369560000502
(可溶性玉米纤维或糊精，罗盖特公司(Roquette))、或
Figure BDA0001673369560000503
-2(耐消化麦芽糖糊精，阿彻丹尼尔斯米德兰公司和松田化学(Archer Daniels Midland Company&Matsutani Chemical))差的耐受性(即，类似的产气水平)，并且特别是对一种或多种市售纤维提供改善的耐受性，即在3小时或24小时内，本发明葡聚糖的发酵产生比菊粉少的气体产量，从而降低由于气体形成而导致的不适，例如气胀和腹胀。在一个方面，本公开还涉及通过向对其有需要的受试者施用如本文公开的化合物或组合物来减慢受试者的胃肠道中气体形成，以减少由胀气和腹胀引起的肠道疼痛或肠道不适的方法。在另外的的实施例中，本文公开的组合物为受试者提供改善的食物发酵耐受性，并且可以与纤维(例如菊糖或FOS、GOS、或乳果糖)组合以通过降低气体产生来改善耐受性。在另一个实施例中，可以施用本文公开的化合物以通过增加大便体积来改善排泄或改善规律性。
益生元和益生菌
本文中的葡聚糖可以用作益生元，或者当与益生菌组合使用时作为“合生元”，如下所述。“益生元”是指通过选择性刺激胃肠道(特别是结肠)中一种或有限数量的细菌的生长和/或活性而有益地影响受试者的食物成分，并因此改善受试者的健康。益生元的实例包括低聚果糖、菊糖、聚右旋糖、抗性淀粉、可溶性玉米纤维、葡萄糖寡糖、低聚半乳糖、阿拉伯糖基低聚木糖、乳糖醇和乳果糖。
在另一个实施例中，包含本文中葡聚糖的组合物可以进一步包含至少一种益生菌生物体。“益生菌生物体”是指通过其在消化道中的功能为受试者提供有益效果的活微生物膳食补充物。为了有效，益生菌微生物必须能够在消化条件下存活，并且必须能够至少暂时在胃肠道中定植而不对受试者造成任何伤害。只有某些微生物菌株具有这些性质。在一些实施例中，益生菌微生物选自下组，该组由以下组成：乳杆菌属物种(Lactobacillusspp.)、双歧杆菌属物种(Bifidobacterium spp.)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、肠球菌属物种(Enterococcus spp.)、埃希氏菌属物种(Escherichia spp.)、链球菌属物种(Streptococcus spp.)和酵母菌属物种(Saccharomyces spp.)。具体的微生物包括但不限于枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)、Bifidobacterium bificum、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、粪链球菌(Streptococcus faecium)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、球拟酵母属(Torulopsia)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、和链球菌属等，包括其营养孢子、非营养孢子(芽孢杆菌)和合成衍生物。在一些实施例中，益生菌微生物包括但不限于如下三种细菌属的成员：乳杆菌属、双歧杆菌属和酵母属。
在一些实施例中，该组合物包含足量的益生菌生物体以递送至少10亿至2000亿、10亿至1000亿、或10亿至500亿个活益生菌生物体。如上所述递送的益生菌生物体的量可以是每个剂量和/或每天，其中每天多个剂量可能适合于一些应用。例如，可以在组合物中使用两种或更多种益生菌生物体。
本文公开的组合物可以呈织物护理组合物的形式。例如，本文的织物护理组合物可用于手洗、机洗和/或其他目的，例如织物的浸泡和/或预处理。织物护理组合物可以采取例如衣物洗涤剂；织物调理剂；任何洗涤产品、漂洗产品或烘干机添加的产品；单位剂量或喷雾的形式。处于液体形式的织物护理组合物可以呈如本文公开的水性组合物的形式。在其他方面，织物护理组合物可以呈干燥形式，例如颗粒洗涤剂或烘干机添加的织物柔软剂片。本文的织物护理组合物的其他非限制性实例包括：颗粒或粉末形式的通用或重垢洗涤剂；液体、凝胶或糊状形式的通用或重垢洗涤剂；液体或干燥精细织物(例如精致衣物)洗涤剂；清洁助剂例如漂白添加剂、“去污棒”或预处理；含基底的产品，例如干和湿的抹布、衬垫或海绵；喷雾和雾。
本文的洗涤剂组合物可以呈任何有用的形式，例如粉末、颗粒、糊剂、棒、单位剂量或液体。液体洗涤剂可以是水性的，典型地包含多达约70wt％的水和0wt％至约30wt％的有机溶剂。它也可以呈仅含有约30wt％水的紧密凝胶类型的形式。
典型地本文的洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，其中所述表面活性剂选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂及其混合物。在一些实施例中，表面活性剂以从约0.1％至约60％的水平存在，而在可替代的实施例中，该水平为从约1％至约50％，而在又进一步的实施例中，该水平为从约5％至约40％，以洗涤剂组合物的重量计。通常，洗涤剂将含有0wt％至约50wt％的阴离子表面活性剂，例如直链烷基苯磺酸盐(LAS)、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)、醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)、仲链烷磺酸盐(SAS)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸或皂。另外，洗涤剂组合物可任选地含有0wt％至约40wt％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、或多羟基烷基脂肪酸酰胺(如在WO92/06154中所描述，其通过引用结合在此)。
本文的洗涤剂组合物典型地包含一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂系统。在掺入至少一种助洗剂的一些实施例中，清洁组合物包含以组合物的重量计至少约1％、从约3％至约60％、或甚至从约5％至约40％的助洗剂。助洗剂包括但不限于，聚磷酸盐的碱金属、铵和链烷醇铵盐；碱金属硅酸盐、碱土金属和碱金属碳酸盐；铝硅酸盐；聚羧酸化合物；醚羟基聚羧酸酯；马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚、1，3，5-三羟基苯-2，4，6-三磺酸、和羧基甲基氧基琥珀酸的共聚物；聚乙酸的各种碱金属、铵和取代的铵盐，例如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸；连同聚羧酸酯，例如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧代二琥珀酸(oxydisuccinicacid)、聚马来酸、苯1，3，5-三羧酸、羧基甲基氧基琥珀酸及其可溶性盐。实际上，预期任何适合的助洗剂将可用于本公开的各种实施例中。洗涤剂助洗剂或络合剂的另外的实例包含沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状桂酸盐(如，来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)。
在一些实施例中，助洗剂形成水溶性硬离子络合物(例如螯合助洗剂)，例如柠檬酸盐和多磷酸盐(例如三聚磷酸钠和三聚磷酸钠六水合物、三聚磷酸钾、以及混合的三聚磷酸钠和三聚磷酸钾等)。预期任何适合的助洗剂将可用于本公开，包括本领域已知的那些(参见例如EP2100949)。
在一些实施例中，适合的助洗剂可以包括磷酸盐助洗剂和非磷酸盐助洗剂。在一些实施例中，助洗剂是磷酸盐助洗剂。在一些实施例中，助洗剂是非磷酸盐助洗剂。助洗剂以按组合物的重量计从0.1％至80％、或从5％至60％、或从10％至50％的水平使用。在一些实施例中，产品包括磷酸盐和非磷酸盐助洗剂的混合物。适合的磷酸盐助洗剂包括单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐或低聚多磷酸盐，包括这些化合物的碱金属盐，包括钠盐。在一些实施例中，助洗剂可以是三聚磷酸钠(STPP)。另外，组合物可以包含有助于实现中性pH组合物的碳酸盐和/或柠檬酸盐，优选柠檬酸盐。其他适合的非磷酸盐助洗剂包括多羧酸及其部分或完全中和盐、单体型多羧酸和羟基羧酸及其盐的均聚物和共聚物。在一些实施例中，上述化合物的盐包含铵盐和/或碱金属盐，即锂盐、钠盐和钾盐，包括钠盐。适合的多元羧酸包括无环的、脂环族的、杂环的和芳香族的羧酸，其中在一些实施例中，它们可以包含至少两个羧基基团，这些羧基基团在每种情况下彼此分离，在某些情况下被不超过两个碳原子分离。
本文的洗涤剂组合物可包含至少一种螯合剂。适合的螯合剂包括但不限于铜、铁和/或锰螯合剂及其混合物。在使用至少一种螯合剂的实施例中，该组合物包含以该组合物的重量计从约0.1％至约15％或甚至从约3.0％至约10％的螯合剂。
本文的洗涤剂组合物可以包含至少一种沉积助剂。合适的沉积助剂包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚羧酸盐、去污聚合物(例如聚对苯二甲酸)、粘土例如高岭土、蒙脱石、绿坡缕石、伊利石、膨润土、多水高岭土及其混合物。
本文的洗涤剂组合物可以包含一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基噁唑烷酮以及聚乙烯基咪唑或其混合物。另外的染料转移抑制剂包括锰酞菁、过氧化物酶、聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑和/或其混合物；螯合剂，其实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)；二亚乙基三胺五亚甲基膦酸(DTPMP)；羟基乙烷二膦酸(HEDP)；乙二胺N，N′-二琥珀酸(EDDS)；甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；二乙撑三胺五乙酸(DTPA)；丙二胺四乙酸(PDTA)；2-羟基吡啶-N-氧化物(HPNO)；或甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；谷氨酸N，N-二乙酸(N，N-二羧基甲基谷氨酸四钠盐(GLDA)；次氮基三乙酸(NTA)；4，5-二羟基间苯二磺酸；柠檬酸及其任何盐；N-羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟基乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟基乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)及其衍生物，其可以单独使用或与以上任何一种组合使用。在使用至少一种染料转移抑制剂的实施例中，本文的组合物可以包含以该组合物的重量计从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％、或甚至从约0.1％至约3％的该至少一种染料转移抑制剂。
本文的洗涤剂组合物可以包含硅酸盐。在这些实施例中的一些，可使用硅酸钠(例如，二硅酸钠、偏硅酸钠和/或晶体硅酸盐)。在一些实施例中，硅酸盐以按该组合物的重量计从约1％至约20％的水平存在。在一些实施例中，硅酸盐以按该组合物的重量计从约5％至约15％的水平存在。
本文的洗涤剂组合物可以包含分散剂。适合的水溶性有机材料包括但不限于均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个被不超过两个碳原子彼此分开的羧基自由基。
本文的洗涤剂组合物可以另外包含一种或多种如上所述的酶。
在一些实施例中，洗涤剂组合物可以包含一种或多种酶(例如，本文公开的任何一种)，其每一种处于按该组合物的重量计从约0.00001％至约10％的水平，以及按该组合物的重量计的余量的清洁辅助材料。在一些其他实施例中，洗涤剂组合物还可以包含以按该组合物的重量计约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的水平的每一种酶。
可以包含在本文的洗涤剂组合物中的酶可以使用常规的稳定剂例如多元醇例如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物(例如芳香族硼酸酯)来稳定。
某些实施例中的洗涤剂组合物可包含一种或多种聚合物。合适的聚合物的实例包括羧基甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚羧酸酯例如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物、和月桂酰甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物。
本文的洗涤剂组合物可以包含漂白系统。例如，漂白系统可以包含H2O2源例如过硼酸或过碳酸，其可以与形成过酸的漂白活化剂(例如四乙酰基乙二胺(TAED)或壬酰基氧基苯磺酸酯(NOBS))组合。可替代地，漂白系统可以包含过氧酸(例如，酰胺、酰亚胺或砜类过氧酸等)。还可替代地，漂白系统可以是包含过水解酶的酶促漂白系统，例如向在WO 2005/056783中描述的系统。
本文的洗涤剂组合物还可以包含常规的洗涤剂成分，例如织物调理剂、粘土、泡沫促进剂、泡沫抑制剂、抗腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀细菌剂、变色抑制剂、荧光增白剂或香料。本文的洗涤剂组合物的pH(在使用浓度的水溶液中测量)通常为中性或碱性(例如，pH为约7.0至约11.0)。
本文中的洗涤剂组合物还可以含有至少一种抗再沉积剂和/或粘土污垢去除剂(在某些方面，这类试剂可任选地表征为白度维持剂)。合适的抗再沉积和/或粘土污垢去除剂的实例包括聚乙氧基兼性离子表面活性剂、丙烯酸或甲基丙烯酸与丙烯酸或甲基丙烯酸-环氧乙烷缩合物的水溶性共聚物(例如，美国专利号3719647)、纤维素衍生物例如羧基甲基纤维素和羟基丙基纤维素(例如美国专利号3597416和3523088)、以及包含非离子烷基聚乙氧基表面活性剂、聚乙氧基烷基季阳离子表面活性剂和脂肪酰胺表面活性剂的混合物(例如美国专利号4228044)。其他适合的抗再沉积和粘土污垢去除剂的非限制性实例公开在美国专利号4597898和4891160，以及国际专利申请公开号WO95/32272中，其全部通过引用结合在此。
可以适用于本文公开的目的的洗涤剂组合物的特定形式公开在例如US20090209445A1、US20100081598A1、US7001878B2、EP1504994B1、WO2001085888A2、WO2003089562A1、WO2009098659A1、WO20 9098660A1、WO2009112992A1、WO2009124160A1、WO2009152031A1、WO2010059483A1、WO2010088112A1、WO2010090915A1、WO2010135238A1、WO2011094687A1、WO2011094690A1、WO2011127102A1、WO2011163428A1、WO2008000567A1、WO2006045391A1、WO2006007911A1、WO2012027404A1、EP1740690B1、WO2012059336A1、US6730646B1、WO2008087426A1、WO2010116139A1、和WO2012104613A1中，其全部通过引用结合在此。
本文的衣物洗涤剂组合物可以任选地是重垢型(通用)衣物洗涤剂组合物。示例性重垢型衣物洗涤剂组合物包含清洁表面活性剂(10％至40％wt/wt)，包括阴离子清洁表面活性剂(选自以下组：直链或支链或无规链、取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或其混合物)和任选地非离子表面活性剂(选自以下组：直链或支链或无规链、取代或未取代的烷基烷氧基化醇，例如C8-C18烷基乙氧基化醇和/或C6-C12烷基苯酚烷氧基化物)，其中阴离子清洁表面活性剂(具有从6.0至9的亲水指数(HIc))与非离子清洁表面活性剂的重量比大于1∶1。适合的清洁表面活性剂还包括阳离子清洁表面活性剂(选自以下组：烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三元锍化合物和/或其混合物)；兼性离子和/或两性清洁表面活性剂(选自一组链烷醇胺磺基甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子表面活性剂；及其混合物。
本文中的洗涤剂(例如重垢型衣物洗涤剂组合物)可以任选地包含由两亲烷氧基化油脂清洁聚合物组成的表面活性增强聚合物(选自以下组：具有支链亲水和疏水特性的烷氧基化聚合物，例如烷氧基化聚亚烷基亚胺(在0.05wt％至10wt％范围内))，和/或无规接枝聚合物(典型地包含亲水主链，该亲水主链含有选自下组的单体，该组由以下组成：不饱和的C1-C6羧酸、醚、醇、醛、酮、酯、糖单元、烷氧基单元、马来酸酐、饱和的多元醇(例如甘油)及其混合物；以及一个或多个疏水侧链，该疏水侧链选自下组，该组由以下组成：C4-C25烷基基团、聚丙烯、聚丁烯、饱和的C1-C6单羧酸的乙烯酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的C1-C6烷基酯及其混合物)。
本文的洗涤剂例如重垢型衣物洗涤剂组合物可以任选地包括另外的聚合物，例如去污聚合物(包括阴离子封端的聚酯(例如SRP1)；包含至少一种选自糖、二羧酸、多元醇及其组合的单体单元的处于无规或嵌段构型的聚合物；基于乙二醇对苯二甲酸酯的聚合物及其处于无规或嵌段构型的共聚物，例如REPEL-O-TEX SF、SF-2AND SRP6、TEXCARE SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300AND SRN325、MARLOQUEST SL)；本文的一种或多种抗再沉积剂(0.1wt％至10wt％)，包括羧酸酯聚合物，例如包含至少一种选自丙烯酸、马来酸(或马来酸酐)、富马酸、衣康酸、乌头酸、中康酸、柠康酸、亚甲基丙二酸及其任何混合物的聚合物；乙烯基吡咯烷酮均聚物；和/或聚乙二醇，分子量范围为从500Da至100,000Da)；以及聚合羧酸酯(例如，马来酸酯/丙烯酸酯无规共聚物或聚丙烯酸酯均聚物)。
本文的洗涤剂例如重垢衣物洗涤剂组合物可以任选地进一步包括饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和或不饱和的C12-C24脂肪酸(0wt％至10wt％)；本文公开的沉积助剂(其实例包括多糖；纤维素聚合物；聚联丙烯二甲基卤化铵(DADMAC))；和DAD MAC与乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、咪唑、咪唑啉卤化物及其混合物的共聚物(处于无规或嵌段构型)；阳离子瓜尔胶、阳离子淀粉、阳离子聚丙烯酰胺及其混合物)。
本文的洗涤剂例如重型衣物洗涤剂组合物可以任选地进一步包括染料转移抑制剂，其实例包括锰酞菁、过氧化物酶、聚乙烯基吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑和/或其混合物；螯合剂，其实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸(DTPMP)、羟基乙烷二膦酸(HEDP)、乙二胺N，N′-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、丙二胺四乙酸(PDTA)、2-羟基吡啶-N-氧化物(HPNO)、或甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸N，N-二乙酸酸(N，N-二羧基甲基谷氨酸四钠盐(GLDA)、次氮基三乙酸(NTA)、4，5-二羟基间苯二磺酸、柠檬酸及其任何盐、N-羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟基乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟基乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)及其衍生物。
本文的洗涤剂例如重垢型衣物洗涤剂组合物可以任选地包括基于硅酮或脂肪酸的泡沫抑制剂；调色染料、钙和镁阳离子、视觉信号传导成分、止泡剂(0.001wt％至约4.0wt％)、和/或结构剂/增稠剂(0.01wt％至5wt％)，该结构剂/增稠剂选自下组，该组由以下组成：甘油二酸酯和甘油三酸酯、乙烯乙二醇二硬脂酸酯、微晶纤维素、超细纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶及其混合物)。结构剂(structurant)也可以称为结构试剂(structural agent)。
例如，本文的洗涤剂可以呈重垢型干/固体衣物洗涤剂组合物的形式。这样的洗涤剂可以包括：(i)清洁表面活性剂，例如本文公开的任何阴离子清洁表面活性剂、本文公开的任何非离子清洁表面活性剂、本文公开的任何阳离子清洁表面活性剂、本文公开的任何兼性离子和/或两性清洁表面活性剂、任何两性表面活性剂、任何半极性非离子表面活性剂及其混合物；(ii)助洗剂，例如任何无磷酸盐助洗剂(例如，在0wt％至小于10wt％范围内的沸石助洗剂)、任何磷酸盐助洗剂(例如，在0wt％至小于10wt％范围内的三聚磷酸钠)、柠檬酸、柠檬酸盐和次氮基三乙酸、任何硅酸盐(例如，在0wt％至小于10wt％的范围内的硅酸钠或硅酸钾或偏硅酸钠)；任何碳酸盐(例如，在0wt％至小于80wt％的范围内的碳酸钠和/或碳酸氢钠)及其混合物；(iii)漂白剂，例如任何光漂白剂(例如磺化锌酞菁、磺化铝酞菁、呫吨染料及其混合物)；任何疏水或亲水性漂白活化剂(例如十二烷酰氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯甲酸或其盐、3，5，5-三甲基己酰基氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺-TAED、壬酰基氧基苯磺酸盐-NOBS、腈季铵盐及其混合物)；任何过氧化氢源(例如，无机过氧水合物盐，其实例包括过硼酸盐、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐或过硅酸盐的单或四水合钠盐)；任何预先形成的亲水和/或疏水过酸(例如过羧酸和盐、过碳酸和盐、过碘酸和盐，过氧单硫酸和盐、及其混合物)；和/或(iv)任何其他组分例如漂白催化剂(例如，亚胺漂白促进剂，其实例包括亚铵阳离子和聚阴离子、亚胺兼性离子、改性胺、改性氧化胺、N-磺酰基亚胺、N-膦酰基亚胺、N-酰基亚胺、噻二唑二氧化物、全氟亚胺、环状糖酮及其混合物)和含金属的漂白催化剂(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子以及辅助金属阳离子(例如锌或铝)和螯合(例如EDTA、乙二胺四(亚甲基膦酸))。
本文公开的组合物可以是呈餐具洗涤剂组合物的形式。餐具洗涤剂的实例包括自动餐具洗涤剂(典型地用于餐具洗涤机中)和洗手餐具洗涤剂。餐具洗涤剂组合物可以是例如处于本文公开的任何干或液体/水性形式。可以包括在餐具洗涤剂组合物的某些实施例中的组分包括例如一种或多种磷酸盐；基于氧或氯的漂白剂；非离子表面活性剂；碱性盐(例如偏硅酸盐、碱金属氢氧化物、碳酸钠)；本文公开的任何活性酶；抗腐蚀剂(如硅酸钠)；消泡剂；减缓陶瓷中釉和图案的脱去的添加剂；香料；抗结块剂(在颗粒洗涤剂中)；淀粉(在基于片剂的洗涤剂中)；凝胶化剂(在基于液体/凝胶洗涤剂中)；和/或砂(粉末洗涤剂)。
餐具洗涤剂例如自动餐具洗涤机洗涤剂或液体餐具洗涤剂可以包括(i)非离子表面活性剂，包括任何乙氧基化非离子表面活性剂、醇烷氧基化表面活性剂、环氧封端的聚(氧基烷基化)醇、或以0wt％至10wt％的量存在的氧化胺表面活性剂；(ii)约5wt％至60wt％范围内的助洗剂，包括任何磷酸盐助洗剂(例如单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐、其他低聚多磷酸盐、三聚磷酸钠-STPP)、任何无磷酸盐助洗剂(例如基于氨基酸的化合物，包括甲基-甘氨酸-二乙酸[MGDA]及其盐或衍生物、谷氨酸-N，N-二乙酸[GLDA]及其盐或衍生物、亚氨基二琥珀酸(IDS)及其盐或衍生物、羧基甲基菊粉及其盐或其衍生物、次氮基三乙酸[NTA]、二亚乙基三胺五乙酸[DTPA]、B-丙氨酸二乙酸[B-ADA]及其盐)、多元羧酸的均聚物和共聚物及其部分或完全中和的盐、在0.5wt％至50wt％范围内的单体多元羧酸和羟基羧酸及其盐、或在约0.1wt％至约50wt％范围内的磺化/羧化聚合物；(iii)在约0.1wt％至约10wt％范围内的干燥助剂(例如，聚酯，特别是阴离子聚酯(任选地与具有有利于缩聚的3至6个官能团-典型地酸、醇或酯官能团的另外的单体一起)，聚碳酸酯-、聚氯酯-和/或聚脲-聚有机硅氧烷化合物或其前体化合物，特别是反应性环状碳酸酯和尿素类型)；(iv)从约1wt％至约20wt％范围内的硅酸盐(例如硅酸钠或硅酸钾，例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐)；(v)无机漂白剂(例如，过氧水合物盐例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)和/或有机漂白剂(例如有机过氧酸例如二酰基-和四酰基过氧化物，特别是二过氧十二烷二酸、二过氧十四烷二酸和二过氧十六烷二酸)；(vi)漂白活化剂(例如，在从约0.1wt％至约10wt％范围内的有机过酸前体)和/或漂白催化剂(例如，锰三氮环壬烷及相关络合物；Co、Cu、Mn和Fe双吡啶胺及相关络合物；以及五胺乙酸钴(III)及相关络合物)；(vii)在从约0.1wt％至5wt％范围内的金属护理剂(例如苯并三唑、金属盐和络合物、和/或硅酸盐)；和/或(viii)本文公开的任何活性酶(范围为从约0.01mg至5.0mg活性酶/克自动餐具洗涤剂组合物)、和酶稳定剂组分(例如，低聚糖、多糖和无机二价金属盐)。
据信，许多可商购的洗涤剂配制品可以适合于包含如本文公开的α-1，2-分支葡聚糖。实例包括
Figure BDA0001673369560000621
ULTRAPACKS(汉高公司(Henkel))、
Figure BDA0001673369560000622
QUANTUM(利洁时公司(Reckitt Benckiser))、CLOROXTM 2PACKS(可洛罗克斯公司(Clorox))、OXICLEAN MAXFORCEPOWER PAKS(切迟杜威公司(Church&Dwight))、
Figure BDA0001673369560000623
STAIN RELEASE、
Figure BDA0001673369560000624
ACTIONPACS、和
Figure BDA0001673369560000625
PODSTM(宝洁公司(Procter&Gamble))。
本文公开的组合物可以是例如处于口腔护理组合物的形式。口腔护理组合物的实例包括提供某种形式的口腔护理(例如，治疗或预防空洞[龋齿]、牙龈炎、斑块、牙垢和/或牙周病)的洁牙剂、牙膏、漱口水、口腔清洗剂、口香糖、可食用条(edible strip)、以及牙齿乳膏/凝胶。口腔护理组合物还可以用于治疗“口腔表面”，其涵盖口腔内的任何软或硬表面，包括以下表面：舌头、硬和软腭、颊粘膜、牙龈和牙齿表面的表面。本文的“牙齿表面”是天然牙齿的表面或人造牙列(包括例如牙冠、盖、填料、桥、义齿或牙科植入物)的硬表面。
本文的口腔护理组合物可以包含例如约0.01wt％至15.0wt％(例如，约0.1wt％至10wt％或约0.1wt％至5.0wt％、约0.1wt％至2.0wt％)的一种或多种如本文公开的α-1，2-分支葡聚糖。还可以在本文的口腔护理组合物中提供一种或多种其他增稠剂或分散剂，例如像羧基乙烯聚合物、角叉菜胶(例如，L-角叉菜胶)、天然树胶(例如，梧桐树胶(karaya)、黄原胶、阿拉伯胶、黄芪胶)、胶体硅酸镁铝、或胶体二氧化硅。
本文的口腔护理组合物可以是例如牙膏或其他洁牙剂。此类组合物以及本文的任何其他口腔护理组合物可以另外包含但不限于一种或多种防龋剂、抗微生物剂或抗细菌剂、抗结石或牙垢控制剂、表面活性剂、研磨料、pH调节剂、泡沫调节剂、湿润剂、食用香料、甜味剂、颜料/着色剂、增白剂和/或其他合适的组分。可以添加一种或多种本文的α-1，2-分支葡聚糖的口腔护理组合物的实例公开于美国专利申请公开号2006/0134025、2002/0022006和2008/0057007中，其通过引用结合在此。
本文的防龋剂可以是口服可接受的氟离子源。氟离子的合适来源包括例如氟化物、单氟磷酸盐和氟硅酸盐以及胺氟化物，包括奥拉氟(N’-十八烷基三亚甲基二胺-N，N，N’-三(2-乙醇)-二氢氟化物)。例如，防龋剂能以向组合物提供总共约100ppm至20000ppm、约200ppm至5000ppm或约500ppm至2500ppm氟离子的量存在。在氟化钠是氟离子的唯一来源的口腔护理组合物中，例如约0.01wt％至5.0wt％、约0.05wt％至1.0wt％或约0.1wt％至0.5wt％氟化钠的量可以存在于组合物中。
适合用于本文的口腔护理组合物的抗微生物剂或抗细菌剂包括例如酚类化合物(例如4-烯丙基儿茶酚；对羟基苯甲酸酯，例如对羟基苯甲酸苄酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯；2-苄基苯酚；丁基化羟基苯甲醚；丁基化羟基甲苯；辣椒素；香芹酚；木焦油醇；丁子香酚；愈创木酚；卤代双酚例如六氯苯酚(hexachlorophene)和澳氯苯酚(bromochlorophene)；4-己基间苯二酚；8-羟基喹啉及其盐；水杨酸酯例如水杨酸薄荷酯、水杨酸甲酯和水杨酸苯酯；苯酚；焦儿茶酚；N-水杨酰苯胺；百里酚；卤代二苯醚化合物，例如三氯生和三氯生单磷酸盐)；铜(II)化合物(例如铜(II)氯化物、氟化物、硫酸盐和氢氧化物)；锌离子源(例如锌乙酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、甘氨酸盐、氧化物和硫酸盐)；邻苯二甲酸及其盐(例如邻苯二甲酸镁单钾)；双辛氢啶；奥替尼淀；血根碱；苯扎氯铵；澳化度灭芬；烷基吡啶氯化物(例如十六烷基吡啶氯化物、十四烷基吡啶氯化物、N-十四烷基-4-乙基吡啶氯化物)；碘；磺酰胺类；二双胍类(例如，阿立西定、氯己定、氯己定二葡糖酸盐)；氮杂环己烷衍生物(例如，地莫匹醇、辛哌醇)；木兰提取物、葡萄籽提取物、迷迭香提取物、薄荷醇、香叶醇、柠檬醛、桉油精；抗生素(例如，沃格孟汀、阿莫西林、四环素、多西环素、米诺环素、甲硝哒唑、新霉素、卡那霉素、克林霉素)和/或美国专利5776435中公开的任何抗细菌剂，其为通过引用结合在此。一种或多种抗微生物剂可以任选地以约0.01wt％至10wt％(例如，0.1wt％至3wt％)存在，例如在所公开的口腔护理组合物中。
适合用于本文的口腔护理组合物的抗结石或牙垢控制剂包括例如磷酸盐和多磷酸盐(例如焦磷酸盐)、聚氯基丙磺酸(AMPS)、柠檬酸锌三水合物、多肽(例如聚天冬氨酸和聚谷氨酸)、聚烯烃磺酸盐、聚烯烃磷酸盐、二膦酸盐(例如氮杂环烷-2，2-二膦酸盐，例如氮杂环庚烷-2，2-二膦酸)、N-甲基氮杂环戊烷-2，3-二膦酸、乙烷-1-羟基-1，1-二膦酸(EHDP)、乙烷-1-氨基-1，1-二膦酸盐和/或膦酰基链烷羧酸及其盐(例如，它们的碱金属盐和铵盐)。有用的无机磷酸盐和多磷酸盐包括例如一元、二元和三元磷酸钠；三聚磷酸钠；四聚磷酸盐；焦磷酸单钠、二钠、三钠和四钠；焦磷酸二氢二钠；三偏磷酸钠；六偏磷酸钠；或钠被钾或铵代替的这些中的任何一种。在某些实施例中，其他有用的抗结石剂包括阴离子多羧酸盐聚合物(例如丙烯酸、甲基丙烯酸和马来酸酐的聚合物或共聚物，例如聚乙烯基甲基醚/马来酸酐共聚物)。其他有用的抗结石剂包括螯合剂，例如羟基羧酸(例如，柠檬酸、富马酸、苹果酸、戊二酸、和草酸及其盐)和氨基多羧酸(例如，EDTA)。一种或多种抗结石或牙垢控制剂可以任选地以约0.01wt％至50wt％(例如，约0.05wt％至25wt％或约0.1wt％至15wt％)存在，例如在所公开的口腔护理组合物中。
适合用于本文的口腔护理组合物的表面活性剂可以是例如阴离子、非离子或两性的。适合的阴离子表面活性剂包括但不限于C8-20烷基硫酸盐的水溶性盐、C8-20脂肪酸磺化单酸甘油酯、肌氨酸盐和牛磺酸盐。阴离子表面活性剂的实例包括月桂基硫酸钠、椰子单甘油酯磺酸钠、月桂基肌氨酸钠、月桂基羟乙基磺酸钠、聚乙二醇单十二醚羧酸钠和十二烷基苯磺酸钠。适合的非离子表面活性剂包括但不限于泊洛沙姆、聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯、脂肪醇乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物、叔胺氧化物、叔膦氧化物和二烷基亚砜。适合的两性表面活性剂包括但不限于具有阴离子基团例如羧酸根、硫酸根、磺酸根、磷酸根或膦酸根的C8-20脂肪族仲胺和叔胺的衍生物。适合的两性表面活性剂的实例是椰油酰胺丙基甜菜碱。一种或多种表面活性剂任选地以约0.01wt％至10wt％(例如，约0.05wt％至5.0wt％或约0.1wt％至2.0wt％)的总量存在于例如所公开的口腔护理组合物中。
适合用于本文的口腔护理组合物的研磨料可以包括例如二氧化硅(例如硅胶、水合二氧化硅、沉淀二氧化硅)、氧化铝、不溶性磷酸盐、碳酸钙和树脂研磨料(例如，脲-甲醛缩合物产品)。可用作研磨料的不溶性磷酸盐的实例是正磷酸盐、聚偏磷酸盐和焦磷酸盐，并且包括正磷酸二钙二水合物、焦磷酸钙、焦磷酸β-钙、磷酸三钙、聚偏磷酸钙和不溶性聚偏磷酸钠。一种或多种研磨料任选地以约5wt％至70wt％(例如，约10wt％至56wt％或约15wt％至30wt％)的总量存在于例如所公开的口腔护理组合物中。在某些实施例中，研磨料的平均粒径为约0.1微米至30微米(例如约1微米至20微米或约5微米至15微米)。
在某些实施例中，口腔护理组合物可以包含至少一种pH调节剂。可以选择这样的试剂将组合物的pH酸化、制成更碱性或缓冲至约2至10的pH范围(例如，pH范围为约2至8、3至9、4至8、5至7、6至10或7至9)。可用于本文的pH调节剂的实例包括但不限于羧酸、磷酸和磺酸；酸性盐(例如柠檬酸一钠、柠檬酸二钠、苹果酸一钠)；碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠、碳酸盐例如碳酸钠、碳酸氢盐、倍半碳酸钠)；硼酸盐；硅酸盐；磷酸盐(例如，磷酸一钠、磷酸三钠、焦磷酸盐)；以及咪唑。
适合用于本文的口腔护理组合物的泡沫调节剂可以是例如聚乙二醇(PEG)。高分子量PEG是适合的，包括例如平均分子量为约200000至7000000(例如约500000至5000000或约1000000至2500000)的那些。一种或多种PEG任选地以约0.1wt％至10wt％(例如，约0.2wt％至5.0wt％或约0.25wt％至2.0wt％)的总量存在于例如所公开的口腔护理组合物中。
在某些实施例中，口腔护理组合物可以包含至少一种湿润剂。在某些实施例中，湿润剂可以是多元醇，例如甘油、山梨糖醇、木糖醇或低分子量PEG。最适合的湿润剂也可以用作本文的甜味剂。一种或多种湿润剂任选地以约1.0wt％至70wt％(例如，约1.0wt％至50wt％、约2wt％至25wt％、或约5wt％至15wt％)的总量存在于例如所公开的口腔护理组合物中。
天然的或人造的甜味剂可以任选地包含在本文的口腔护理组合物中。适合的甜味剂的实例包括右旋糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、转化糖、甘露糖、木糖、核糖、果糖、左旋糖、半乳糖、玉米糖浆(例如高果糖玉米糖浆或玉米糖浆固体)、部分水解的淀粉、氢化淀粉水解产物、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、阿斯巴甜、纽甜、糖精及其盐、基于二肽的强甜味剂和环磺酸盐。一种或多种甜味剂任选地以约0.005wt％至5.0wt％的总量存在于例如所公开的口腔护理组合物中。
天然的或人造的食用香料可以任选地包含在本文的口腔护理组合物中。适合的食用香料的实例包括香草醛；鼠尾草；马郁兰；欧芹油；留兰香油；肉桂油；冬青油(水杨酸甲酯)；胡椒薄荷油；丁香油；月桂油；茴香油；桉树油；柑橘油；水果油；香精，例如源自于柠檬、橙子、酸橙、葡萄柚、杏、香蕉、葡萄、苹果、草莓、樱桃或菠萝的那些；源自于豆类和坚果的香料，如咖啡、可可豆、可乐、花生或杏仁；以及吸附和包封的食用香料。还涵盖在本文的食用香料中的是在口中提供香味和/或其他感官效果的成分，包括冷却或加温效果。此类成分包括但不限于薄荷醇、乙酸薄荷酯、乳酸薄荷酯、樟脑、桉树油、桉油精、茴香脑、丁子香酚、肉桂、噁烷酮(oxanone)、紫罗兰酮
Figure BDA0001673369560000671
羟甲基茴香脑、麝香草酚、芳樟醇、苯甲醛、肉桂醛、N-乙基-对薄荷烷-3-甲酰胺、N，2，3-三甲基-2-异丙基丁酰胺、3-(1-薄荷氧基)-丙烷-1，2-二醇、肉桂醛甘油缩醛(CGA)和薄荷酮甘油缩醛(MGA)。一种或多种食用香料任选地以约0.01wt％至5.0wt％(例如，约0.1wt％至2.5wt％)的总量存在于例如所公开的口腔护理组合物中。
在某些实施例中，口腔护理组合物可以包含至少一种碳酸氢盐。可以使用任何口服可接受的碳酸氢盐，包括例如碱金属碳酸氢盐例如碳酸氢钠或碳酸氢钾、和碳酸氢铵。例如，一种或多种碳酸氢盐任选地以约0.1wt％至50wt％(例如，约1wt％至20wt％)的总量存在于所公开的口腔护理组合物中。
在某些实施例中，口腔护理组合物可以包含至少一种增白剂和/或着色剂。适合的增白剂是过氧化物化合物，例如在美国专利号8540971中公开的任何一种，其通过引用结合在此。本文中，适合的着色剂包括例如赋予特定光泽或反射率的颜料、染料、色淀和试剂，例如珠光剂。用于本文的着色剂的具体实例包括滑石；云母；碳酸镁；碳酸钙；硅酸镁；硅酸铝镁；二氧化硅；二氧化钛；氧化锌；红色、黄色、棕色、黑色铁氧化物；亚铁氰化铁铵；锰紫；深蓝色；钛云母；以及氯氧化铋。例如，一种或多种着色剂任选地以约0.001wt％至20wt％(例如，约0.01wt％至10wt％或约0.1wt％至5.0wt％)的总量存在于所公开的口腔护理组合物中。
可任选地包括在本文的口腔组合物中的另外的组分包括例如一种或多种酶(上文)、维生素和抗粘结剂。可用于本文的维生素的实例包括维生素C、维生素E、维生素B5和叶酸。适合的抗粘结剂的实例包括对羟基苯甲酸甲酯(solbrol)、无花果蛋白酶和群体感应抑制剂。
包含本文的α-1，2-分支葡聚糖的组合物在一些实施例中可以是葡聚糖的醚衍生物(即，本文中的α-1，2-分支葡聚糖可衍生为醚，其连接至一个或多个不同的有机基团)。例如，具有一个或多个醚化有机基团的α-1，2-分支葡聚糖的取代度(DoS)可以为约0.0025至约3.0。可替代地，DoS可以是例如约或至少约0.0025、0.005、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、或3.0(可以可选地表示为这些值中的任何两个之间的范围)。
醚化为本文的α-1，2-分支葡聚糖的有机基团可以是烷基，例如像甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基或癸基。在一些方面，醚化为α-1，2-分支葡聚糖的有机基团可以是在烷基的一个或多个碳上具有取代的取代的烷基。该一个或多个取代基可以是一个或多个羟基、醛、酮和/或羧基。例如，取代的烷基可以是羟烷基、二羟烷基或羧烷基。合适的羟基烷基基团的实例是羟甲基、羟乙基、羟丙基、羟丁基和羟戊基基团。其他实例包括二羟基烷基基团(二醇)，例如二羟甲基、二羟乙基、二羟丙基、二羟丁基和二羟戊基基团。合适的羧基烷基的例子是羧甲基(-CH2COOH)、羧乙基、羧丙基、羧丁基和羧戊基。
在一些方面，醚化成α-1，2-分支葡聚糖的有机基团可以是带正电荷的有机基团。例如，本文的带正电荷的基团可以是取代的铵基团。取代的铵基团的实例是伯、仲、叔和季铵基团。美国专利申请公开号2016/0311935中公开了合适的带正电基团的另外实例，其通过引用结合在此。
在某些实施例中，α-1，2-分支葡聚糖醚化合物可以含有一种类型的有机基团。这种化合物的具体非限制性实例是羧甲基α-1，2-分支葡聚糖。可替代地，α-1，2-分支葡聚糖醚化合物可含有两种或更多种不同类型的有机基团。在一些方面，本文的葡聚糖醚化合物可以包含至少一个非离子有机基团和至少一个阴离子基团作为醚基团。在一些方面，本文的葡聚糖醚化合物可以包含至少一个非离子有机基团和至少一个带正电荷的有机基团作为醚基团。
本文中的与有机基团醚连接的α-1，2-分支葡聚糖醚化合物的单糖单元(即，其中单糖单体单元的一个或多个羟基已经被醚化)的百分比可以根据在醚化反应中α-1，2-分支葡聚糖被醚化的程度而变化。该百分比可以是例如至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％(或在30％与100％之间的任何整数值)。
目前公开的任何α-1，2-分支葡聚糖可用于制备相应的醚化合物。可以采用任何合适的醚衍生低聚糖和/或多糖的方法，例如在美国专利号2961439、2344179、2203703、2203704、2380879、和2974134，美国专利申请公开号2014/179913、2016/0304629、2016/0311935、2015/0232785、和20150239995，以及国际专利申请公开号WO 16/160738中所公开的，其全部通过引用并入本文中。
仅作为实例，本文中的醚化合物可以通过以下制备：(i)向具有至少95％(例如100％)α-1，6键和约15kD至20kD(例如约17kD)分子量的葡聚糖主链中添加约35％至45％(例如40％)的α-1，2分支，和(ii)用上述任何有机基团(例如羧甲基基团)醚化α-1，2-分支葡聚糖产品。
本公开的另一方面涉及生产包含α-1，2键的葡聚糖组合物的方法。这种方法可以包括以下步骤：
(a)至少提供以下反应组分：水、蔗糖、α-葡聚糖底物和能够从所述α-葡聚糖底物形成至少一个α-1，2分支的多肽，其中所述多肽包含与以下具有至少90％同一性的氨基酸序列：
(i)选自下组的序列的成熟形式，该组由以下组成：SEQ ID NO：4、1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、和13；
(ii)SEQ ID NO：27或与SEQ ID NO：27对齐的、SEQ ID NO：4、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、或13中的任一项中的子序列；和/或
(iii)选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO：4、1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、和13；
(b)在合适的条件下组合所述反应组分，由此所述多肽催化从所述α-葡聚糖底物合成至少一个α-1，2分支，从而形成包含一个或多个α-1，2键的葡聚糖组合物；以及
(c)任选地分离包含一个或多个α-1，2键的葡聚糖组合物。
本文公开的关于反应组合物(1，2-分支反应)的任何特征(例如，以上和下面的实例中)可以表征这种葡聚糖生产方法的合适方面，反之亦然。
包含α-1，2键的葡聚糖组合物的生产可以通过在任何合适的反应条件下(例如本文公开的那些)组合反应组分来进行。反应可以在水性溶液中进行，和/或在某些实施例中，可以按照任何已知的方法在产品(例如食物、药物、个人护理、家用护理或工业产品)中原位进行。在某些实施例中，将一种或多种1，2-分支酶添加到含蔗糖的液体食物产品中。该酶可以减少液体食物产品中蔗糖的量，同时增加果糖和α-1，2-分支葡聚糖的量。例如在WO2013/182686中可以找到在食物产品中原位生产葡聚糖的合适方法，其通过引用并入本文。
本文中1，2-分支酶的浓度可以取决于其特定的催化活性，并且该浓度通常被选择以获得所需的总反应速率。酶浓度通常在从0.0001mg至20mg/mL总反应体积、或从0.001mg至10mg/mL的范围内。1，2-分支酶也可以使用已知方法固定在可溶或不可溶支持物上；参见例如，Immobilization of Enzymes and Cells[酶和细胞的固定]；Gordon F.Bickerstaff编辑；胡玛纳出版社(Humana Press)，美国新泽西州托托瓦市；1997。1，2-分支酶可作为微生物细胞表面展示酶、透化微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化形式或纯化形式、或其任何混合物提供于整个微生物细胞中。
在某些实施例中，生产α-1，2-分支葡聚糖组合物的方法进一步包括浓缩葡聚糖组合物的步骤(d)。
在某些实施例中，在α-1，2分支开始时的α-葡聚糖底物浓度至少约为10g/L、或50g/L至500g/L、或100g/L至500g/L、或150g/L至450g/L、或250g/L至450g/L、或250g/L至600g/L。
反应过程中使用的蔗糖浓度可能会有所不同。在某些实施例中，当组合反应组分时初始存在的蔗糖浓度为至少约50g/L、或50g/L至600g/L、或100g/L至500g/L、或100g/L至200g/L、或150g/L至450g/L、或200g/L至450g/L、或250g/L至600g/L。在具体的实施例中，蔗糖浓度为约200g/L或100g/L。如果该反应与α-葡聚糖底物制备反应同时发生，可以使用更高浓度的蔗糖。
在本文中的1，2分支反应过程中蔗糖与α-葡聚糖底物主链的重量比可以变化。在一个实施例中，蔗糖与α-葡聚糖底物主链的重量比可以在从0.01∶1.0至1.0∶0.01的范围内，包含端值。在某些实施例中，该方法在3至8、或4至8、或5至8、或5.5至7.5、或5.5至约6.5的pH下进行。在某些实施例中，该组反应组分包括合适的缓冲剂，包括但不限于磷酸盐、焦磷酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐或柠檬酸盐。当使用时，缓冲液的浓度通常为从0.1mM至1.0M、或从1mM至300mM，或从10mM至100mM。该方法可以任选地利用pH对照以在该反应过程中保持最佳pH，通过增量或连续添加合适的酸或碱以将pH保持在期望的范围内以获得最佳酶活性。
本文的1，2-分支反应的持续时间可以变化并且通常可以通过使用全部可用的蔗糖底物所花费的时间量来确定。在某些实施例中，进行反应直至最初存在于反应混合物中的蔗糖的至少90％、或至少95％、或至少99％被消耗。在某些实施例中，反应时间为约1小时至168小时、1小时至72小时、1小时至24小时、或1小时至2小时。
根据需要，可以选择本文的1，2-分支反应的温度以控制反应速率和所用一种或多种酶的稳定性。例如，反应的温度可以在从刚好高于反应配制品的凝固点(大约0℃)至约60℃，或从5℃至约47℃的范围内，或者在约20℃至约37℃的范围内。
在某些实施例中，该组反应组分可以进一步包括α-葡聚糖水解酶(外切和/或内切葡聚糖水解酶)。在某些实施例中，α-葡聚糖水解酶是右旋糖酐酶或齿斑葡聚糖酶，例如内切齿斑葡聚糖酶或内切右旋糖酐酶。在某些实施例中，α-葡聚糖水解酶是右旋糖酐酶(EC2.1.1.11)、齿斑葡聚糖酶(EC 3.1.1.59)或其组合。在某些实施例中，右旋糖酐酶是来自Chaetomium erraticum的食品级右旋糖酐酶。在某些实施例中，来自Chaetomiumerraticum的右旋糖酐酶是可从丹麦诺维信公司(Novozymes A/S，Denmark)获得的
Figure BDA0001673369560000721
PLUS L。
在某些实施例中，分离1，2-分支葡聚糖产品组合物包括离心、过滤、分级、色谱分离、透析、蒸发和稀释中的至少一种。
本文中用于合成具有α-1，2分支的葡聚糖组合物的前述条件中的任何一种，例如前述或下面实例中所述的那些条件，可用于实践目前公开的反应组合物。
本文公开的组合物和方法的非限制性实例包括：
1.一种反应组合物，其至少包含水、蔗糖、α-葡聚糖底物和能够从所述α-葡聚糖底物形成至少一个α-1，2分支的多肽，其中所述多肽包含与以下具有至少90％同一性的氨基酸序列：(i)选自下组的序列的成熟形式，该组由以下组成：SEQ ID NO：4、1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、和13；(ii)SEQ ID NO：27或与SEQ ID NO：27对齐的、SEQ ID NO：4、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、或13中的任一项中的子序列；和/或(iii)选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO：4、1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、和13。
2.如实施例1所述的反应组合物，其中(i)的序列包含：SEQ ID NO：4的位置36至1672、SEQ ID NO：1的位置21至2771、SEQ ID NO：2的位置21至2821、SEQ ID NO：3的位置41至2844、SEQ ID NO：5的位置51至1632、SEQ ID NO：6的位置51至1318、SEQ ID NO：7的位置51至1139、SEQ ID NO：8的位置51至1463、SEQ ID NO：9的位置41至2841、SEQ ID NO：10的位置46至2580、SEQ ID NO：11的位置51至1463、SEQ ID NO：12的位置21至2824、或SEQ ID NO：13的位置21至2771。
3.如实施例1所述的反应组合物，其中(ii)的序列包含：SEQ ID NO：4的位置36至1115、SEQ ID NO：2的位置1715至2821、SEQ ID NO：3的位置1735至2834、SEQ ID NO：5的位置51至1167、SEQ ID NO：6的位置93至1178、SEQ ID NO：7的位置51至1130、SEQ ID NO：8的位置51至1158、SEQ ID NO：9的位置1735至2841、SEQ ID NO：10的位置1274至2413、SEQ IDNO：11的位置51至1158、SEQ ID NO：12的位置1715至2821、或SEQ ID NO：13的位置1665至2771。
4.如实施例1-3中任一项所述的反应组合物，其中所述α-葡聚糖底物具有至少为3的聚合度，并且至少包含(i)α-1，6糖苷键或(ii)α-1，6和α-1，3糖苷键。
5.一种生产包含α-1，2键的葡聚糖组合物的方法，所述方法包括：(a)至少提供以下反应组分：水、蔗糖、α-葡聚糖底物和能够从所述α-葡聚糖底物形成至少一个α-1，2分支的多肽，其中所述多肽包含与以下具有至少90％同一性的氨基酸序列：(i)选自下组的序列的成熟形式，该组由以下组成：SEQ ID NO：4、1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、和13；(ii)SEQID NO：27或与SEQ ID NO：27对齐的、SEQ ID NO：4、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、或13中的任一项中的子序列；和/或(iii)选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO：4、1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、和13；(b)在合适的条件下组合所述反应组分，由此所述多肽催化从所述α-葡聚糖底物合成至少一个α-1，2分支，从而形成包含一个或多个α-1，2键的葡聚糖组合物；和(c)任选地分离包含一个或多个α-1，2键的葡聚糖组合物。
6.如实施例5所述的方法，其中所述α-葡聚糖底物(i)具有至少为3的聚合度，并且至少包含(i)α-1，6糖苷键或(ii)α-1，6和α-1，3糖苷键。
7.如实施例5和6中任一项所述的方法，其中所述α-葡聚糖底物和蔗糖以0.01∶1和1∶0.01之间的比例存在于(b)中，所述比例包含端值。
8.如实施例5-7中任一项所述的方法，其中所述反应组分进一步包含α-葡聚糖水解酶。
9.一种含有包含一个或多个α-1，2键的葡聚糖组合物的组合物，所述包含一个或多个α-1，2键的葡聚糖组合物通过实施例5-8中任一项的方法产生或由实施例1-4中任一项的反应组合物产生，优选地，其中所述组合物呈食物产品、药物产品、个人护理产品、家用护理产品、或工业产品的形式，任选地，其中所述组合物包含约0.01wt％至99wt％(基于干燥固体)的葡聚糖组合物。
10.如实施例9所述的组合物，其中包含α-1，2键的葡聚糖组合物是水溶性的，并且当饲喂给哺乳动物时，缓慢地释放葡萄糖，其中所述哺乳动物优选地是人。
11.如实施例9和10中任一项所述的组合物，其中包含α-1，2键的葡聚糖组合物具有10％或更少的α-1，2分支。
12.如实施例9所述的组合物，其中所述包含α-1，2键的葡聚糖组合物是水溶性的，并且当饲喂给哺乳动物时，充当膳食纤维，其中所述哺乳动物优选地是人。
13.如实施例9或12中任一项所述的组合物，其中包含α-1，2键的葡聚糖组合物具有至少约15％的α-1，2分支。
14.如实施例9-13中任一项所述的组合物，其进一步包含至少一种选自下组的成分，该组由以下组成：合生元、肽、肽水解产物、蛋白质、蛋白质水解产物、大豆蛋白、乳蛋白、氨基酸、多元醇、多酚、维生素、矿物质、草本植物、草本植物提取物、脂肪酸、多不饱和脂肪酸(PUFA)、植物甾醇(phytosteroid)、甜菜碱、类胡萝卜素、消化酶、和益生菌生物体；优选地，其中所述组合物呈食物产品或药物产品的形式。
15.如实施例9-14中任一项所述的组合物，其中所述组合物呈食物产品或药物产品的形式，并且进一步包含至少一种选自下组的成分，该组由以下组成：单糖、二糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、明串珠菌二糖、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、异构化糖、麦芽糖、海藻糖、潘糖、棉子糖、纤维二糖、异麦芽糖、蜂蜜、枫糖、水果衍生的甜味剂、山梨糖醇、麦芽糖醇、异麦芽糖醇、乳糖、黑曲霉糖、曲二糖、木糖醇、赤藓糖醇、双氢查耳酮、甜菊苷、α-糖基甜菊苷、乙酰磺胺酸钾、阿力甜、纽甜、甘草甜素、奇异果甜蛋白、三氯蔗糖、L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯、糖精、麦芽糖糊精、淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、右旋糖酐、可溶性玉米纤维、抗性麦芽糖糊精、支化麦芽糖糊精、菊糖、聚右旋糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、阿拉伯糖基低聚木糖、黑曲霉寡糖、龙胆寡糖、半纤维素、果糖低聚物糖浆、异麦芽低聚糖、填充剂、赋形剂和黏合剂。
16.如实施例9所述的组合物，其中所述组合物是洗涤剂组合物，并且其中所述组合物优选为家用产品。
17.一种方法，所述方法包括向哺乳动物肠内施用物质，其中所述物质包含含有α-1，2键的葡聚糖组合物，其中与肠内施用缺乏所述葡聚糖组合物但代替地含有相同量的易消化的含葡萄糖的碳水化合物的物质的哺乳动物相比，所述施用导致所述哺乳动物中血糖升高更少或更慢，其中所述葡聚糖组合物通过实施例5-8中任一项的方法产生或由实施例1-4中任一项的反应组合物产生，任选地其中所述哺乳动物是人，并且任选地其中所述易消化的含葡萄糖的碳水化合物是蔗糖、游离葡萄糖、或淀粉。
18.一种生产可摄取产品的方法，所述方法包括将包含α-1，2键的葡聚糖组合物掺入所述可摄取产品中，其中与缺乏所述葡聚糖组合物的可摄取产品(但在其他方面相同)相比，所得可摄取产品的血糖指数不增加或仅稍微增加，并且其中所述葡聚糖组合物通过实施例5-8中任一项的方法产生或由实施例1-4中任一项的反应组合物产生。
实例
本公开在下面的实例中进一步定义。应该理解的是，这些实例虽然指示了某些实施例，但仅以举例说明的方式给出。从以上的讨论和这些实例中，本领域的技术人员能够确定本公开的本质特性，并且在不脱离本公开的实质和范围的情况下，可进行各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。
缩写的含义如下：“sec”或“s”表示秒、“ms”表示毫秒、“min”表示分钟、“h”或“hr”表示小时、“μL”表示微升、“mL”表示毫升、“L”表示升；“mL/min”是毫升每分钟；“μg/mL”是微克每毫升；“LB”是Luria肉汤；“μm”是微米、“nm”是纳米；“OD”是光密度；“IPTG”是异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；“g”是引力；“mM”是毫摩尔；“SDS-PAGE”是十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺；“mg/mL”是毫克每毫升；“N”是正常的；“w/v”是体积重量；“DTT”是二硫苏糖醇；“BCA”是二辛可宁酸；“DMAc”是N，N’-二甲基乙酰胺；“LiCl”是氯化锂；“NMR”是核磁共振；“DMSO”是二甲基亚砜；“SEC”是尺寸排阻色谱法；“GI”或“gi”是指GenInfo Identifier，其是由
Figure BDA0001673369560000761
和其他序列数据库使用的系统，用于唯一地鉴定相应数据库内的多核苷酸和/或多肽序列；“DPx”是指具有“x”个单位长度的葡聚糖聚合度；“ATCC”是指美国典型培养物保藏中心(马纳萨斯，弗吉尼亚州)、“DSMZ”和“DSM”是指莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心(德国布伦瑞克)；“EELA”是成品安全局(Finish Food SafetyAuthority)(芬兰赫尔辛基)；“CCUG”是指瑞典哥德堡大学的培养物保藏中心；“Suc.”是指蔗糖；“Gluc.”是指葡萄糖；“Fruc.”是指果糖；“Leuc.”是指明串珠菌二糖；以及“Rxn”是指反应。
一般方法
除非另有说明，所有试剂、限制酶和细菌培养材料均获得自BD DiagnosticSystems(Sparks，MD)、英杰/生命技术公司(卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、生命技术公司(罗克维尔，马里兰州)、凯杰公司(QIAGEN)(瓦伦西亚，加利福尼亚州)、西格玛奥德里奇化学公司(Sigma-Aldrich Chemical Company)(圣路易斯，密苏里州)、或皮尔斯化学公司(PierceChemical Co.)(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific Inc.，伊利诺伊州罗克福德市)的分公司)。IPTG(目录号I6758)、三苯基四唑氯化物和BCA蛋白质测定试剂从西格玛公司(密苏里州圣路易斯)获得。BELLCO旋转烧瓶获得自贝克尔公司(Bellco Co.，Vineland，NJ)。LB培养基获得自Becton、Dickinson和Company(富兰克林湖，新泽西州)。
使用PAHBAH测定法确定还原糖(Lever，Anal.Biochem.[生物化学分析]47，273-279，1972)。
实例1
鉴定能够形成具有α(1，2)键的葡聚糖的多肽
GTF-J18序列(来自肠膜明串珠菌亚种mesenteroides J18)(SEQ ID NO：1)含有三个不同的区域：催化结构域1(“CD1”)、葡聚糖结合结构域和CD2。CD1和CD2是GH70结构域，负责不同的催化活性。
我们已经表明，当在反应中提供α-1，6-连接的多糖时，命名为GTFJ18T1(SEQ IDNO：27)的N-末端截短版本的GTFJ18可以产生α-1，2-分支(参见国际专利申请公开号WO2015/183714的实例1，其通过引用并入本文)(也参考下面的实例6)。GTF-J18T1(SEQ IDNO：27)仅包含一部分葡聚糖结合结构域和CD2。这表明来自GTF-J18的CD2(“GTF-J18-CD2”)可以催化α-1，6-连接的多糖底物上的α-1，2-分支。
使用GTF-J18-CD2序列(SEQ ID NO：28)作为针对GENBANK蛋白质数据库的非冗余版本的BLAST查询。在BLAST高评分区段中，通过BLAST报道了四十个序列与GTF-J18-CD2序列(SEQ ID NO：28)具有超过50％同一性。使用来自UCSC的SAM套件的TARGET2K程序对四十个序列进行比对(SAM：加州大学圣克鲁斯分校的Karplus小组发布HMM工具包；SAM中的算法描述于Karplus等人，Bioinformatics[生物信息学]14：846-856，1998)。选择在比对区域中与GTF-J18-CD2序列(SEQ ID NO：28)具有至少60％同一性的十三个序列(SEQ ID NO：1-13)作为可能形成具有α(1，2)键的葡聚糖的多肽并在本文中公开。
实例2
动物乳杆菌KCTC 3501葡糖基转移酶GTF8117的表达
从动物乳杆菌KCTC 3501(本文中的“GTF8117”)鉴定了推定的葡糖基转移酶基因，LanGtfl，其GI号为335358117(旧)(新GI号948839227；GENBANK登记号KRM57462.1)。GTF8117蛋白具有由SignalP4.0预测的37个氨基酸信号肽(Petersen等人，Nature Methods[自然方法]8：785-786，2011)。这表明GTF8117是分泌蛋白。使编码GTF8117的成熟蛋白质的基因序列经密码子优化用于在枯草芽孢杆菌中表达。该基因由Generay(中国上海)合成，并插入到p2JM103BBI质粒中(Vogtentanz，Protein Expr.Purif.[蛋白表达纯化]55：40-52，2007)，得到pZZH561质粒。pZZHB561含有(以5′至3′方向)aprE启动子、编码用于指导在枯草芽孢杆菌中的蛋白质分泌的aprE信号序列的序列、编码Ala-Gly-Lys以促进靶蛋白分泌的寡核苷酸、以及编码靶蛋白的合成基因。
构建另一表达质粒pDCQ1004用于表达不含信号肽的GTF8117。使用质粒pZZHB561作为用于GTF8117编码序列与Tlat终止子一起PCR扩增的模板。将PCR产物克隆到枯草芽孢杆菌整合的表达质粒p4JH的SpeI和BamHI位点中，这些位点具有aprE启动子，但没有信号序列编码区。得到的pDCQ1004质粒含有SEQ ID NO：29，其编码具有添加的N-末端甲硫氨酸(SEQ ID NO：30)的成熟GTF8117。使用pDCQ1004转化枯草芽孢杆菌BG6006细胞以表达GTF8117(SEQ ID NO：30)。枯草芽孢杆菌宿主BG6006菌株含有九种蛋白酶缺失(amyE：：xylRPxylAcomK-ermC、degUHy32、oppA、ΔspoIIE3501、ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpr、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、ΔnprB)。将转化的细胞涂布在补充有5μg/mL氯霉素的LB平板上。将在这些平板上生长的菌落多次加条纹涂到具有25μg/mL氯霉素的LB平板上。使产生的扩增克隆在含有25μg/mL氯霉素的LB中生长6至8小时，并且然后传代培养至Grant′sII培养基中并在30℃生长2至3天。将培养物在4℃以15,000g旋转30分钟，并且通过0.22μm过滤器过滤收集的上清液，所述上清液由于细胞自溶而预期含有可溶性细胞内蛋白质。将过滤的上清液等分并在-80℃冷冻，并且稍后用于对羟基苯甲酸肼(PAHBAH)测定中以确定酶活性。使用具有在PAHBAH测定中具有最高活性的上清液的克隆(命名为菌株SG1024)来制备用于发酵的种子小瓶。
在实例4中进一步进行GTF8117(SEQ ID NO：30)的生产。
实例3
唾液链球菌M18葡萄糖基转移酶GTF6831的表达
从唾液链球菌M18中鉴定出推定的葡糖基转移酶(旧GI号345526831，新GI号490287001；GENBANK登录号WP_004182667.1)。该酶在本文中被称为“GTF6831”并且具有1600个氨基酸残基，其中前42个残基被SignalP4.1程序预测为天然信号肽。编码GTF6831(SEQ ID NO：32)的成熟蛋白质的基因核苷酸序列(SEQ ID NO：31)由美国金斯瑞有限公司(GenScript USA Inc.)(新泽西州皮斯卡塔韦)合成。将合成的序列(SEQ ID NO：31)克隆到在aprE启动子和编码枯草芽孢杆菌AprE信号肽的序列下的枯草芽孢杆菌整合表达质粒p4JH的NheI和HindIII位点。首先将构建体转化到大肠杆菌DH10B中并在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB上选择。证实的构建体pDCQ990-5允许成熟GTF6831葡糖基转移酶(SEQ IDNO：32)的表达。然后将pDCQ990-5转化到枯草芽孢杆菌BG6006中，其含有九种蛋白酶缺失(amyE：xylRPxylAcomK-ermC、degUHy32、oppA、ΔspoIIE3501、ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpr、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、ΔnprB)，并在含有氯霉素(5μg/mL)的LB平板上选择。将在这些平板上生长的菌落多次加条纹涂到具有25μg/mL氯霉素的LB平板上。使所得到的枯草芽孢杆菌表达菌株SG1190的多个菌落首先在含有25μg/mL氯霉素的LB培养基中生长6至8小时，并且然后传代培养至Grant′s II培养基中并在30℃生长2至3天。将培养物在4℃以15,000g旋转30min，并将上清液通过0.22μm过滤器过滤。将过滤的上清液等分并在-80℃冷冻，并且稍后用于PAHBAH测定中以确定酶活性。选择具有最高PAHBAH活性的克隆来制备用于发酵的种子小瓶。
在实例5中进一步进行GTF6831(SEQ ID NO：32)的生产。
实例4
在枯草芽孢杆菌中产生GTF8117葡糖基转移酶
使用SG1204菌株(其为含有pDCQ1004质粒的九个蛋白酶敲除的枯草芽孢杆菌，comK菌株)产生GTF8117葡糖基转移酶(SEQ ID NO：30)。最初，将冷冻的SG1204小瓶培养成含10g/L大豆胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl、10g/L葡萄糖和10mg/L氯霉素抗生素的40mL种子培养基。生长温度为30℃，以及初始pH为7.2。将含有40mL种子培养基的250mL种子烧瓶置于30℃的振荡培养箱中，并以300rpm混合2.83小时。此后，使接种物生长至0.33个单位的OD(600nm)值。使用30mL的生长种子培养基接种含有7升发酵培养基的生产容器。
该发酵培养基含有5g/L玉米浆固体、8g/L磷酸二氢钠一水合物、8g/L磷酸钾一水合物、4.2g/L七水合硫酸镁、0.3g/L七水硫酸亚铁、0.2g/L四水氯化锰、0.1g/L氯化钙脱水物和2.06mL/L的消泡剂，FOAM BLAST882。
设定下列操作条件：30℃，pH7.2和25％溶解氧。最初以分批模式进行发酵，从10g/L的残余葡萄糖浓度开始。由于在发酵时间消逝15.3小时时残余葡萄糖几乎耗尽，我们通过启动补料分批模式开始连续葡萄糖补料。使用69％v/v NH4OH溶液(20％NH3含量)控制pH。进料葡萄糖直至发酵时间消逝40.6小时，以650g/L葡萄糖浓度递送约1593克。在40.6小时时，葡萄糖进料停止，同时保持其他操作条件大约一个半小时，以便完全消耗剩余的残留葡萄糖。然后，在发酵时间消逝41.1小时时，运行的裂解部分通过补充葡萄糖停止开始，同时将操作的发酵温度增加到33℃，气流完全停止，搅拌速度降低至200rpm，以及提升pH控制条件，导致在随后的8小时内完成原位细胞裂解。发酵运行在开始后49.1小时结束。
通过测量蔗糖的消耗速率和相应的果糖生产速率，收集运行结束的肉汤的上清液并通过HPLC分析GTF8117(SEQ ID NO：30)的存在。该生物化学测定法测量4.64mg GTF8117/mL(472U/mL，基于蔗糖消耗)和4.25mg GTF8117/mL(基于果糖生产)。将上清液储存在-80℃。
将在本实例中产生的GTF8117(SEQ ID NO：30)用于一个或多个以下实例中以合成葡聚糖以充当α-1，2-分支酶的底物。
实例5
在枯草芽孢杆菌中产生GTF6831葡糖基转移酶
使用SG1190菌株(其为含有pDCQ990-5质粒的九个蛋白酶敲除的枯草芽孢杆菌，comK菌株)产生GTF6831葡糖基转移酶(SEQ ID NO：32)。种子烧瓶培养基、发酵培养基和所有操作条件与实例4中概述的相同。发酵运行持续53小时。在发酵时间消逝41小时时开始细胞裂解并持续12小时。递送的葡萄糖补料总量为2147克的50％w/w溶液。
裂解后，收集上清液并通过测量残余蔗糖的消耗速率和相应的果糖生产速率，通过HPLC分析酶GTF6831(SEQ ID NO：32)的存在。该生物化学测定法测得108.7U/mL上清液。离心裂解物产生具有114.5U/mL活性的上清液；将上清液储存在-80℃。
将在本实例中产生的GTF6831(SEQ ID NO：32)用于一个或多个以下实例中以合成葡聚糖以充当α-1，2-分支酶的底物。
实例6
截短的葡萄糖基转移酶GTFJ18T1的表达并测试其α-1，2分支活性
以下实例描述了全长葡糖基转移酶和该酶的截短版本在大肠杆菌中的表达，并测试了其各自在葡聚糖主链上的α-1，2分支活性。全长葡萄糖基转移酶产生具有很少α-1，2分支的葡聚糖，而截短版本的葡糖基转移酶产生具有显著量的α-1，2分支的葡聚糖。
来自肠膜明串珠菌亚种mesenteroides J18(命名为GTFJ18)的推定葡糖基转移酶(旧
Figure BDA0001673369560000821
gi：356644413，新gi：504090610，登录号WP_014324604.1)具有2771个氨基酸(SEQ ID NO：1)。它从分离自泡菜的J18菌株的完全基因组测序中鉴定为糖基水解酶(Jung等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]194：730，2012)。GTFJ18的全长序列与来自肠膜明串球菌NRRL B-1299(
Figure BDA0001673369560000831
gi：23320943，登录号CAD22883.1)的DsrE蛋白(长度为2835个氨基酸)具有68.6％氨基酸同一性。显示DsrE蛋白是具有两个催化结构域的双功能蛋白质(Bozonnet等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]184：5763，2002)。第一催化结构域“CD1”催化α-1，6键的合成，并且第二催化结构域“CD2”催化α-1，2键的合成。CD1和CD2结构域被葡聚糖结合结构域“GBD”分离(Fabre等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]187：296，2005)。DsrE和GTFJ18蛋白的CD1结构域共享79.3％氨基酸同一性，并且这两种蛋白的CD2结构域具有76.6％氨基酸同一性。
通过SignalP 4.0程序推断GTFJ18(SEQ ID NO：1)的N-末端20个氨基酸为信号肽(Petersen等人，同上)。为了构建全长GTFJ18表达质粒，由美国金斯瑞有限公司(GenScriptUSA Inc.)合成编码不含信号肽的成熟蛋白质的DNA。将合成的基因亚克隆到pET23D+载体的NheI和HindIII位点(
Figure BDA0001673369560000832
默克集团(Merck KGaA)，达姆施塔特，德国)。将编码称为GTF18T1(SEQ ID NO：27)的截短版本的GTFJ18的多核苷酸，其含有C-末端CD2结构域和部分GBD结构域(总共含有SEQ ID NO：1的氨基酸残基1665-2771)，也亚克隆到pET23D+载体中。将携带编码全长(SEQ ID NO：1)或截短的(SEQ ID NO：27)GTFJ18蛋白的基因序列的质粒转化到大肠杆菌BL21 DE3宿主细胞中，分别得到菌株EC0059和EC0059T1。使EC0059和EC0059T1的细胞生长至OD约0.5，并在37℃用1mM IPTG诱导3小时，或者在23℃诱导过夜。将细胞通过以4000xg离心10min收集并重悬于pH 6.8的PBS缓冲液中。以14,000psig(约96.53MPa)通过弗氏压碎器(French Press)将细胞破碎两次，并通过以15,000xg离心20min使细胞碎片沉淀。将各粗酶提取物的上清液等分并在-80℃冷冻。
单独地在葡糖基转移酶的葡聚糖产物GTF5604上测试每种酶(GTFJ18或GTFJ18T1)的α-1，2分支活性，其衍生自仓鼠链球菌HS-6(
Figure BDA0001673369560000841
登录号WP_004226213.1，旧gi：357235604)，并公开于国际专利申请号WO 2015/183714(在其中也称为SG1018葡糖基转移酶或GtfHS6)中。GTF5604(SEQ ID NO：33)具有1338个氨基酸，其N-末端36个氨基酸被SignalP 4.0程序推断为其信号肽。编码包括其天然信号肽的全长GTF5604(SEQ ID NO：33)的天然核苷酸序列(GENBANK登录号NZ_AEUV02000002.1的位置1289627-1293643)通过GenScript合成，并克隆到枯草芽孢杆菌aprE启动子下的复制型芽孢杆菌表达质粒pHYT(宝生物工程株式会社(Takara Bio Inc.)，日本大津市)的SpeI和HindIII位点。首先将构建体转化到大肠杆菌DH10B中并在氨苄青霉素(100μg/mL)平板上选择。然后将确认的克隆pDCQ918转化到枯草芽孢杆菌菌株BG6006(amyE：xylRPxylAcomK-ermC、degUHy32、oppA、ΔspoIIE3501、ΔaprE、ΔnprE、Δepr、ΔispA、Δbpr、Δvpr、ΔwprA、Δmpr-ybfJ、ΔnprB)中，并在四环素(12.5μg/mL)平板上进行选择，然后将转化的菌株(称为SG1018)首先在含有10μg/mL四环素的LB中生长，然后传代培养到含有12.5μg/mL四环素的格兰特II培养基中，并在37℃生长2至3天。将培养物在4℃以15,000x g旋转30min，并将上清液通过0.22μm过滤器过滤。设置包含具有100g/L蔗糖的10％(v/v)SG1018上清液、10mM柠檬酸钠(pH5)和1mMCaCl2的葡聚糖合成反应。在37℃，6小时后，所有蔗糖在反应中消耗；葡聚糖产品具有约3000的分子量并且由几乎100％的α-1，6键组成。使葡聚糖合成反应在95℃热灭活30min。
用70％(v/v)的热灭活葡聚糖合成反应设置分支反应。将被测试以获得上述葡聚糖产品GTFJ18或GTFJ18T1的分支活性的酶分别用40g/L蔗糖以上述制备的来自EC0059或EC0059T1的粗细胞提取物的10％(v/v)提供。将每个分支反应在37℃或30℃孵育22小时，并通过HPLC分析产物的蔗糖消耗量，和通过NMR分析键谱图。
NMR数据是使用5mm低温三共振脉冲场梯度探头，在以5001H MHz操作的安捷伦DD2光谱仪(安捷伦科技公司(Agilent Technologies，Inc.)，圣克拉拉，加利福尼亚州)上获得的。通过在“presat”实验中小心地将观测发射器频率设置在残余水信号共振上获得水抑制，并且然后使用具有全相周期(32的倍数)和混合时间为10ms的NOESY实验的第一切片。采集一维1H光谱，其具有6410Hz光谱宽度、5.1s采集时间、65536个数据点、4s预饱和、和90度观测脉冲。信号平均通常涉及64次扫描的累积。样品温度保持在25℃。
通过将50μL或100μL完成的分支反应液与60μL含有12.4mM 4，4-二甲基-4-硅杂戊烷-1-磺酸钠盐(DSS)的D2O和D2O余量(450μL或400μL)(达到总体积为560μL)一起添加到5mm NMR管中来制备液体样品作为内部化学位移参考。DSS甲基共振被设定为0ppm。
不同端基异构体键的化学位移分配取自Goffin等人(Bull Korean Chem.Soc.[韩国化学会公报]30：2535，2009)。对α-1，6主链上的α-1，2分支特异性的分配取自Maina等人(Carb.Res.[碳水化合物研究]343：1446，2008)。1，6主链上的α-1，2取代(即α1-2，6键)导致邻近该取代位点的端基异构体H的特征性化学位移(5.18ppm)。1，2-连接的糖(5.10ppm)的端基异构体H在反应混合物中被明串珠菌二糖遮蔽，但在纯化的样品中直接观察到。
包含GTFJ18的分支反应的产物含有97％的α-1，6键和仅0.6％的α-1，2键。包含GTFJ18T1(SEQ ID NO：27)的分支反应产物含有82％的α-1，6键和18％的α-1，2键。因此，与其全长对应物GTFJ18相比，截短的酶GTFJ18T1(SEQ ID NO：27)显示出高得多的α-1，2分支活性。尽管不打算受到本文任何理论的束缚，但该结果可能是由于全长GTFJ18中的CD1结构域非常活跃并且与蔗糖底物的CD2分支结构域竞争。
因此，GTFJ18T1(SEQ ID NO：27)具有显著的α-1，2分支活性并可用于修饰葡聚糖底物的结构。在实例7中进一步生产该酶。
实例7
使用大肠杆菌生产GTFJ18T1 1，2-分支酶
使用EC0059T1菌株产生实例6中公开的GTFJ18T1 1，2-分支酶(SEQ ID NO：27)，所述菌株是含有质粒中靶向酶遗传信息的BL21 DE3大肠杆菌菌株。最初，使冷冻的EC0059T1小瓶生长成含有10g/L酵母提取物、16g/L胰蛋白胨、5g/L NaCl、无葡萄糖和100mg/L氨苄青霉素抗生素的260mL种子培养基。生长温度为30℃，并且起始pH为6.8。将含有260mL用于接种两个发酵容器的种子培养基的1L种子烧瓶置于振荡培养器中并以250rpm混合3.7小时。此后，使接种物生长至4.0个单位的OD(600nm)值。使用125mL的生长种子培养基接种含有7升发酵培养基的每个生产容器。
该发酵培养基含有5g/L酵母提取物、5g/L磷酸二氢钾、1.9g/L NaCl、1.0g/LTWEEN-80和0.1mL/L BIOSPUMEX 153K消泡剂。将这些组分在容器/肉汤灭菌之前添加。在灭菌周期完成并且操作温度达到设定值后，我们通过无菌技术添加下列化合物：2/4g/L七水硫酸镁、50mg/L七水硫酸亚铁、100mg/L氯化钙脱水物、10mL/L NIT微量元素混合物、100mg/L氨苄青霉素抗生素和10g/L葡萄糖。NIT微量元素混合物溶液包含：10g/L柠檬酸一水合物、2g/L一水硫酸锰、2g/L氯化钠、0.5g/L七水硫酸亚铁、0.2g/L七水硫酸锌、20mg/L硫酸铜五水合物、20mg/L钼酸钠脱水物和2.94mg/L二水氯化钙。
发酵运行控制在30℃、pH 6.8和25％溶解氧。最初，在前5个小时，发酵以分批模式运行，从10g/L的残余葡萄糖浓度开始。发酵时间消逝5小时后，我们开始了连续的葡萄糖补料并开始补料分批模式。小心补料葡萄糖以保持非常低的残余葡萄糖浓度(＜0.1g/L)。发酵时间消逝17小时后，我们通过向肉汤中添加IPTG来诱导产生GTFJ18T1蛋白(SEQ ID NO：27)，实现0.5mM的残余浓度。诱导在一次实验中持续7小时，并且在另一次实验中持续16小时。在此期间，我们继续补料葡萄糖，同时保持非常低的残余浓度(＜0.1g/L)。
在两次发酵结束时(分别为24和33小时)，在使用2升瓶的RC-12离心机中从约9kg发酵液回收细胞沉淀。将一组两个塑料袋放置在瓶子内以便于回收细胞糊。离心在6728RCF进行20分钟。从袋中倾出液体后，将细胞沉淀物在-80℃冷冻；共回收了1943克冷冻糊状物。随后将冷冻的糊状物添加到3.2升缓冲液(50mM磷酸钾，pH 6.0)中，并且在糊状物融化后，使用在大约850巴的压力下操作的APV-100均化器使得到的细胞悬浮液均化。将匀浆用冰冷却，并且然后倾倒入六个1升离心瓶中。以5890 RCF在RC-3离心机中将瓶子旋转超过1小时。将上清液倾倒入瓶中并在-80℃冷冻储存；通过测量蔗糖向果糖的转化率，分析两种发酵运行裂解物上清液的等分试样中靶酶GTFJ18T1(SEQ ID NO：27)的存在。生物化学测定测量两种发酵的活性酶分别为5.8U/mL和9.90U/mL。使用SS34转子以12,000rpm对5.8U/ml上清液进行第二次离心产生具有5.0U/mL GTFJ18T1活性的澄清上清液(在-80℃冷冻储存)。
将本实例中制备的GTFJ18T1(SEQ ID NO：27)用于以下实例中的一个或多个中。
实例8
Fructobacillus tropaeoli F214-1葡糖基转移酶FtrGtfl(GTF9905)的序列
从Fructobacillus tropaeoli F214-1鉴定葡萄糖基转移酶基因FtrGtfl。在NCBI数据库中发现了FtrGtfl基因的核酸序列(GENBANK登录号DF968096.1，SEQ ID NO：17)和由FtrGtfl基因编码的假定蛋白的氨基酸序列(GENBANK登录号GAP05007.1，gi 902949905，SEQ ID NO：4，本文中的“GTF9905”)。在以上实例1中公开的分析中，SEQ ID NO：4的一部分与SEQ ID NO：28进行比对，从而将GTF9905鉴定为推定的α-1，2分支酶。成熟的分泌形式GTF9905对应于SEQ ID NO：4的位置36-1672。
实例9
用于表达成熟GTF9905(FtrGtfl)的序列
编码成熟版本的GTF9905(来自Fructobacillus tropaeoli F214-1的Gtf1)的核苷酸序列经密码子优化用于在枯草芽孢杆菌中表达，产生SEQ ID NO：34。该序列由Generay(中国上海)合成，并插入到p2JM103BBI质粒中(Vogtentanz，Protein Expr.Purif.[蛋白表达纯化]55：40-52，2007)，得到pZQ2-CRC08152-FtrGtfl质粒。pZQ2-CRC08152-FtrGtfl含有(以5’至3’方向)aprE启动子、编码用于指导在枯草芽孢杆菌中的蛋白质分泌的aprE信号序列的序列、编码Ala-Gly-Lys以促进靶蛋白分泌的寡核苷酸、以及编码成熟形式的GTF9905(即，SEQ ID NO：4的位置36-1672)的合成序列(SEQ ID NO：34)。
使用质粒pZQ2-CRC08152-FtrGtfl转化枯草芽孢杆菌细胞，并将转化的细胞涂布在补充有5ppm氯霉素的Luria琼脂平板上。如通过PCR和测序证实的，具有正确插入的菌落被选择并进行用于GTF9905生产的发酵。
实例10
GTF9905(FtrGtfl)的生产
将具有正确插入的枯草芽孢杆菌转化体菌落挑选入补充有5ppm氯霉素的5mLLuria肉汤培养基中并生长过夜。然后将30μL该培养物接种到含有30mL补充有5ppm氯霉素的格兰特II培养基的250mL摇瓶中，然后将其在30℃伴随250rpm振荡孵育48小时。通过在4℃以24,000×g离心1h收集所得培养物上清液并用0.22μm过滤器过滤。
首先用透析管中的50mM K2HPO4pH 6.8缓冲液(赛默飞(Thermo)产品#68100)透析含有GTF9905的上清液，之后使用FREEZONE 6冷冻干燥系统(Labconco)将透析的上清液冻干并储存在-80℃(22.5U/mL)。
将本实例中产生的GTF9905用于以下实例中的一个或多个中。
实例11
GTF8117和GTF6831酶活性测定
通过在37℃和125rpm轨道摇动下在25g/L右旋糖(MW约1500，西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，目录号31394)存在下在pH 5.5的25mM乙酸盐缓冲液中用200g/L蔗糖孵育每种GTF酶，进行GTF8117和GTF6831的葡糖基转移酶活性测定。在1h、2h、和3h孵育期取出一等份试样的反应混合物，并在90℃加热5min以灭活GTF。通过以13,000xg离心5min除去不溶性材料，然后通过0.22μm尼龙膜过滤。将所得滤液通过HPLC在85℃用AMINEX HPX-87C柱系列(伯乐公司(Bio-Rad)，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)分析以定量蔗糖浓度。将每个时间点的蔗糖浓度与反应时间作图并根据线性图的斜率确定初始反应速率。一个单位的GTF活性被定义为在测定条件下在一分钟内消耗一微摩尔蔗糖所需的酶的量。
实例12
GTF9905和GTFJ18T1酶1，2-分支活性测定
通过在30℃和125rpm轨道摇动下在右旋糖40K(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，目录号D1662-100G)存在下在pH5.5的50mM乙酸盐缓冲液中用100g/L蔗糖孵育每种酶，进行1，2-分支酶GTF9905和GTFJ18T1的葡糖基转移酶活性测定。在1h、2h、和3h孵育期取出一等份试样的反应混合物，并在90℃加热5min以灭活该酶。通过以13,000xg离心5min除去不溶性材料，然后通过0.2μm尼龙膜过滤。将所得滤液通过HPLC在85℃用AMINEX HPX-87C柱系列(伯乐公司(Bio-Rad)，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)分析以定量蔗糖浓度。将每个时间点的蔗糖浓度与反应时间作图并根据线性图的斜率确定初始反应速率。一个单位的GTF 1，2-分支酶活性被定义为在测定条件下在一分钟内消耗一微摩尔蔗糖所需的酶的量。
实例13
通过逐步组合葡糖基转移酶GTF8117和α-1，2分支酶GTF9905生产可溶性α-1，2-分 支多糖
首先，进行反应以制备用于本实例第二部分作为1，2-分支酶的底物的葡聚糖。用6.0N盐酸将由蔗糖(488g/L)和GTF8117(实例4，9.4U/mL)组成的反应混合物(20mL)调节至pH 5.5，并在47℃搅拌。在预定时间取出等分试样，并通过在90℃加热20min使其淬火。将得到的热处理的等分试样离心并通过HPLC分析上清液以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖、低聚糖和多糖的浓度。6h后，将反应混合物加热至90℃达30分钟，并将等分试样的热处理过的反应混合物离心，并分析所得上清液中的可溶性单糖、低聚糖和多糖(DP8+)(表1)。DP8+多糖似乎含有约100％α-1，6键。
表1.HPLC分析由葡糖基转移酶GTF8117产生的可溶性单糖、低聚糖和多糖。
Figure BDA0001673369560000901
然后进行第二反应以从第一反应的产物进行α-1，2分支。通过混合5.84mL的上述制备的经热处理的第一反应混合物与2.92mL的蔗糖溶液(600g/L去离子水中的蔗糖；最终蔗糖浓度175g/L)、0.67mL的0.75M乙酸钠缓冲液(pH 5.5，50mM终浓度)、0.070mL去离子水和0.50mL的含有α-1，2-分支酶GTF9905的离心细胞裂解物(实例10；最终GTF9905浓度1.13U/mL)，随后在30℃搅拌，来制备第二反应混合物。在预定时间取出等分试样，并通过在90℃加热20min使其淬火。将得到的热处理的等分试样离心并通过HPLC分析上清液以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖、低聚糖和多糖的浓度。76.2h后，将反应混合物加热至90℃持续20分钟，并将等分式样的热处理过的反应混合物离心。分析所得上清液中可溶性单糖、低聚糖和多糖(表2)，并通过1H NMR光谱分析以确定低聚糖和多糖的端基异构体键(表3)。
表2.HPLC分析通过α-1，2分支反应产生的可溶性单糖、低聚糖和多糖。
Figure BDA0001673369560000911
表3.通过1H NMR光谱的可溶性低聚糖和多糖的端基异构体键分析。
Figure BDA0001673369560000912
因此，GTF9905具有显著的α-1，2分支活性并可用于修饰葡聚糖底物的结构。
实例14
通过逐步组合葡糖基转移酶GTF6831和α-1，2分支酶GTF9905生产可溶性α-1，2-分 支多糖
首先，进行反应以制备用于本实例第二部分作为1，2-分支酶的底物的葡聚糖。用6.0N盐酸将由蔗糖(488g/L)和GTF6831(实例5，4.6U/mL)组成的反应混合物(20mL)调节至pH 5.5，并在47℃搅拌。在预定时间取出等分试样，并通过在90℃加热20min使其淬火。将得到的热处理的等分试样离心并通过HPLC分析上清液以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖、低聚糖和多糖的浓度。24.5h后，将反应混合物加热至90℃达30分钟，并将等分试样的热处理过的反应混合物离心，并分析所得上清液中的可溶性单糖、低聚糖和多糖(DP8+)(表4)。
表4.HPLC分析由葡糖基转移酶GTF6831产生的可溶性单糖、低聚糖和多糖。
Figure BDA0001673369560000921
然后进行第二反应以从第一反应的产物进行α-1，2分支。通过混合5.84mL的上述制备的经热处理的第一反应混合物与2.92mL的蔗糖溶液(600g/L去离子水中的蔗糖；最终蔗糖浓度175g/L)、0.67mL的0.75M乙酸钠缓冲液(pH 5.5，50mM终浓度)、0.070mL去离子水和0.50mL的含有α-1，2-分支酶GTF9905的离心细胞裂解物(实例10，最终GTF9905浓度1.13U/mL)，随后在30℃搅拌，来制备第二反应混合物。在预定时间取出等分试样，并通过在90℃加热20min使其淬火。将得到的热处理的等分试样离心并通过HPLC分析上清液以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖、低聚糖和多糖的浓度。76.2h后，将反应混合物加热至90℃持续20分钟，并将等分式样的热处理过的反应混合物离心。分析所得上清液中可溶性单糖、低聚糖和多糖(表5)，并通过1H NMR光谱分析以确定低聚糖和多糖的端基异构体键(表6)。
表5.HPLC分析通过α-1，2分支反应产生的可溶性单糖、低聚糖和多糖。
Figure BDA0001673369560000922
表6.通过1H NMR光谱的可溶性低聚糖和多糖的端基异构体键分析。
Figure BDA0001673369560000931
因此，进一步显示GTF9905具有显著的α-1，2分支活性并可用于修饰葡聚糖底物的结构。
实例15
通过逐步组合葡糖基转移酶GTF6831和α-1，2分支酶GTFJ18T1生产可溶性α-1，2- 分支多糖
首先，进行反应以制备用于本实例第二部分作为1，2-分支酶的底物的葡聚糖。用6.0N盐酸将由蔗糖(488g/L)和GTF6831(实例5，4.6U/mL)组成的反应混合物(20mL)调节至pH 5.5，并在47℃搅拌。在预定时间取出等分试样，并通过在90℃加热20min使其淬火。将得到的热处理的等分试样离心并通过HPLC分析上清液以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖、低聚糖和多糖的浓度。22.5h后，将反应混合物加热至90℃达30分钟，并将等分试样的热处理过的反应混合物离心，并分析所得上清液中的可溶性单糖、低聚糖和多糖(DP8+)(表7)。
表7.HPLC分析由葡糖基转移酶GTF6831产生的可溶性单糖、低聚糖和多糖。
Figure BDA0001673369560000932
然后进行第二反应以从第一反应的产物进行α-1，2分支。通过混合5.84mL的上述制备的经热处理的第一反应混合物与2.09mL的蔗糖溶液(600g/L去离子水中的蔗糖；最终蔗糖浓度125g/L)、0.67mL的0.75M乙酸钠缓冲液(pH 5.5，50mM终浓度)、和1.40mL的含有α-1，2-分支酶GTFJ18T1的离心细胞裂解物(实例7；最终GTFJ18T1浓度0.70U/mL)，随后在30℃搅拌，来制备第二反应混合物。在预定时间取出等分试样，并通过在90℃加热20min使其淬火。将得到的热处理的等分试样离心并通过HPLC分析上清液以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖、低聚糖和多糖的浓度。51.5h后，将反应混合物加热至90℃持续30分钟，并将等分式样的热处理过的反应混合物离心。分析所得上清液中可溶性单糖、低聚糖和多糖(表8)，并通过1H NMR光谱分析以确定低聚糖和多糖的端基异构体键(表9)。
表8.HPLC分析通过α-1，2分支反应产生的可溶性单糖、低聚糖和多糖。
Figure BDA0001673369560000941
表9.通过1H NMR光谱的可溶性低聚糖和多糖的端基异构体键分析。
Figure BDA0001673369560000942
因此，进一步显示GTFJ18T1具有显著的α-1，2分支活性并可用于修饰葡聚糖底物的结构。
实例16
通过同时组合葡糖基转移酶GTF8117和α-1，2分支酶GTF9905(1)生产可溶性α-1， 2-分支多糖
将在54mM乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中的包含蔗糖(450g/L)、GTF8117(实例4，0.944U/mL)和α-1，2-分支酶GTF9905(实例10，1.06U/mL)的反应混合物在30℃搅拌。在预定时间取出等分试样，并通过在90℃加热20min使其淬火。将经热处理的等分试样离心并通过HPLC分析上清液以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖、低聚糖和多糖的浓度。74h后，将反应混合物加热至90℃持续20分钟，并离心。分析所得上清液中可溶性单糖、低聚糖和多糖(DP8+)(表10)，并通过1H NMR光谱分析以确定低聚糖和多糖的端基异构体键(表11)。
表10.HPLC分析通过同时葡聚糖合成和α-1，2分支反应产生的可溶性单糖、低聚糖和多糖。
Figure BDA0001673369560000951
表11.通过1H NMR光谱的可溶性低聚糖和多糖的端基异构体键分析。
Figure BDA0001673369560000952
因此，进一步显示GTF9905具有显著的α-1，2分支活性并可用于修饰葡聚糖底物的结构。
实例17
通过同时组合葡糖基转移酶GTF8117和α-1，2分支酶GTF9905(2)生产可溶性α-1， 2-分支多糖
将在54mM乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中的由蔗糖(500g/L)、GTF8117(实例4，2.83U/mL)和α-1，2-分支酶GTF9905(实例10，3.17U/mL)组成的反应混合物在30℃搅拌。在预定时间取出等分试样，并通过在90℃加热20min使其淬火。将经热处理的等分试样离心并通过HPLC分析上清液以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖、低聚糖和多糖的浓度。28.5h后，将反应混合物加热至90℃持续20分钟，并离心。分析所得上清液中可溶性单糖、低聚糖和多糖(DP8+)(表12)，并通过1H NMR光谱分析以确定低聚糖和多糖的端基异构体键(表13)。
表12.HPLC分析通过同时葡聚糖合成和α-1，2分支反应产生的可溶性单糖、低聚糖和多糖。
Figure BDA0001673369560000961
表13.通过1H NMR光谱的可溶性多糖的端基异构体键分析。
Figure BDA0001673369560000962
因此，进一步显示GTF9905具有显著的α-1，2分支活性并可用于修饰葡聚糖底物的结构。
实例18
通过同时组合葡糖基转移酶GTF8117和α-1，2分支酶GTFJ18T1(1)生产可溶性α-1， 2-分支多糖
将在54mM乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中的由蔗糖(450g/L)、GTF8117(实例4，0.944U/mL)和α-1，2-分支酶GTFJ18T1(实例7，1.06U/mL)组成的反应混合物在30℃搅拌。在预定时间取出等分试样，并通过在90℃加热20min使其淬火。将经热处理的等分试样离心并通过HPLC分析上清液以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖、低聚糖和多糖的浓度。71h后，将反应混合物加热至90℃持续20分钟，并离心。分析所得上清液中可溶性单糖、低聚糖和多糖(DP8+)(表14)，并通过1H NMR光谱分析以确定低聚糖和多糖的端基异构体键(表15)。
表14.HPLC分析通过同时葡聚糖合成和α-1，2分支反应产生的可溶性单糖、低聚糖和多糖。
Figure BDA0001673369560000971
表15.通过1H NMR光谱的可溶性低聚糖和多糖的端基异构体键分析。
Figure BDA0001673369560000972
因此，进一步显示GTFJ18T1具有显著的α-1，2分支活性并可用于修饰葡聚糖底物的结构。
实例19
通过同时组合葡糖基转移酶GTF8117和α-1，2分支酶GTFJ18T1(2)生产可溶性α-1， 2-分支多糖
将在54mM乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中的由蔗糖(450g/L)、GTF8117(实例4，0.472U/mL)和α-1，2-分支酶GTFJ18T1(实例7，1.06U/mL)组成的反应混合物在30℃搅拌。在预定时间取出等分试样，并通过在90℃加热20min使其淬火。将经热处理的等分试样离心并通过HPLC分析上清液以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖、低聚糖和多糖的浓度。131h后，将反应混合物加热至90℃持续20分钟，并离心。分析所得上清液中可溶性单糖、低聚糖和多糖(DP8+)(表16)，并通过1H NMR光谱分析以确定低聚糖和多糖的端基异构体键(表17)。
表16.HPLC分析通过同时葡聚糖合成和α-1，2分支反应产生的可溶性单糖、低聚糖和多糖。
Figure BDA0001673369560000973
表17.通过1H NMR光谱的可溶性低聚糖和多糖的端基异构体键分析。
Figure BDA0001673369560000981
因此，进一步显示GTFJ18T1具有显著的α-1，2分支活性并可用于修饰葡聚糖底物的结构。
实例20
α-1，2-分支多糖的分离和表征
将含有200g/L蔗糖和9.44U/mL GTF8117(实例4)的四个500mL反应液(1-4)调节至pH 5.5，并在47℃在旋转振荡器上混合18h。在预定时间取出每种产物混合物的等分试样，在90℃加热20min，冷却至约25℃，并然后分离；通过HPLC分析所得上清液以确定在将蔗糖转化为线性α-1，6-右旋糖多糖期间存在的蔗糖、葡萄糖、果糖和明串珠菌二糖的浓度(表18)。18h后，将四种反应混合物在90℃加热20min，冷却至约25℃，并且然后离心；将所得上清液合并并储存在5℃，然后用于随后的反应(下文)中，该反应向α-1，6-连接的右旋糖多糖反应产物添加α-1，2-葡萄糖基分支。
表18.HPLC分析通过使用GTF8117将蔗糖转化为多糖产生的可溶性单糖和二糖。
Figure BDA0001673369560000982
向两个250mL夹套树脂釜中各自填充100mL的来自上述的GTF8117反应产物上清液(最终浓度：80g/L的衍生自蔗糖的总溶解固体)、33.3mL的600g/L蔗糖储备液(最终浓度为80g/L蔗糖)和91.7mL的蒸馏水。将混合物在80℃原位加热30分钟，然后冷却至30℃，之后添加25mL的GTFJ18T1酶溶液(实例7，0.5U/mL最终GTFJ18T1浓度)并立即用0.5％氢氧化钠将pH调节至5.5(这两个反应以下称为反应1和2)。使用连接到蠕动泵的pH电极将反应pH连续控制在5.5，该蠕动泵根据需要向反应混合物中补料0.5％氢氧化钠。在预定时间取出等分试样，并通过在90℃加热20min使其淬火。将得到的热处理的等分试样离心并通过HPLC分析上清液以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖、低聚糖和多糖的浓度。44h后，将每个反应混合物(反应1和2)加热至90℃持续20分钟，并离心。通过HPLC分析所得上清液中可溶性单糖、低聚糖和多糖(表19)；通过1H NMR光谱确定低聚糖和多糖的端基异构体键(表20)；并通过尺寸排阻色谱法测定分子量(表21)。
表19.反应1和2中产生的可溶性单糖和二糖的HPLC分析。
Figure BDA0001673369560000991
表20.在反应1和2中产生的可溶性α-1，2-分支多糖的端基异构体键分析。
Figure BDA0001673369560000992
表21.在反应1和2中产生的α-1，2-分支多糖的分子量分析。
Figure BDA0001673369560000993
因此，进一步显示GTFJ18T1具有显著的α-1，2分支活性并可用于修饰葡聚糖底物的结构。
将来自反应1和2的上清液合并，并使用5-kDa截留分子量(MWCO)聚醚砜(PES)膜(Pall CentramateTM LV)通过超滤(UF)纯化和分离其中的α-1，2-分支多糖。UF渗余物的HPLC分析表明没有可检测的单糖、二糖或DP2-DP8低聚糖。将UF渗余物调节至约5wt％溶解固体并将所得溶液冻干以产生呈干燥固体的可溶性α-1，2-分支多糖。通过1H NMR光谱(表22)和GC/MS分析固体多糖产物以确定该多糖的端基异构体键(表23)。
表22.在反应1和2(组合的)中产生的可溶性α-1，2-分支多糖的端基异构体键分析(1H NMR)。
Figure BDA0001673369560001001
表23.在反应1和2(组合的)中使用GTFJ18T1产生的可溶性α-1，2-分支多糖的端基异构体键分析(GC/MS)。
Figure BDA0001673369560001002
实例21
α-1，2-分支多糖的分离和表征
向两个250mL夹套树脂釜中各自填充100mL的在以上实例20的第一部分中产生的GTF8117反应产物上清液(最终浓度：80g/L的衍生自蔗糖的总溶解固体)、33.3mL的600g/L蔗糖储备液(最终浓度为80g/L蔗糖)和91.7mL的蒸馏水。将混合物在80℃原位加热30分钟，然后冷却至30℃，之后添加25mL的GTFJ18T1酶溶液(实例7，0.5U/mL最终GTFJ18T1浓度)并立即用0.5％氢氧化钠将pH调节至5.5(这两个反应以下称为反应3和4)。使用连接到蠕动泵的pH电极将反应pH连续控制在5.5，该蠕动泵根据需要向反应混合物中补料0.5％氢氧化钠。在预定时间取出等分试样，并通过在90℃加热20min使其淬火。将得到的热处理的等分试样离心并通过HPLC分析上清液以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖、低聚糖和多糖的浓度。4h后，将每个反应混合物(反应3和4)加热至90℃持续20分钟，并离心。通过HPLC分析所得上清液中可溶性单糖、低聚糖和多糖(表24)；通过1H NMR光谱确定低聚糖和多糖的端基异构体键(表25)；并通过尺寸排阻色谱法测定分子量(表26)。
表24.反应3和4中产生的可溶性单糖和二糖的HPLC分析。
Figure BDA0001673369560001011
表25.在反应3和4中产生的可溶性α-1，2-分支多糖的端基异构体键分析。
Figure BDA0001673369560001012
表26.在反应3和4中产生的α-1，2-分支多糖的分子量分析。
Figure BDA0001673369560001013
因此，进一步显示GTFJ18T1具有显著的α-1，2分支活性并可用于修饰葡聚糖底物的结构。
将来自反应3和4的上清液合并，并使用5-kDa截留分子量(MWCO)聚醚砜(PES)膜(Pall CentramateTM LV)通过超滤(UF)纯化和分离其中的α-1，2-分支多糖。UF渗余物的HPLC分析表明没有可检测的单糖、二糖或DP2-DP8低聚糖。将UF渗余物调节至约5wt％溶解固体并将所得溶液冻干以产生呈干燥固体的可溶性α-1，2-分支多糖。通过1H NMR光谱(表27)和GC/MS分析固体多糖产物以确定该多糖的端基异构体键(表28)。
表27.在反应3和4(组合的)中产生的可溶性α-1，2-分支多糖的端基异构体键分析(1H NMR)。
Figure BDA0001673369560001021
表28.在反应3和4(组合的)中使用GTFJ18T1产生的可溶性α-1，2-分支多糖的端基异构体键分析(GC/MS)。
Figure BDA0001673369560001022
实例22
α-1，2-分支多糖的分离和表征
向两个250mL夹套树脂釜中各自填充175mL的在以上实例20的第一部分中产生的GTF8117反应产物上清液(最终浓度：140g/L的衍生自蔗糖的总溶解固体)、4.2mL的600g/L蔗糖储备液(最终浓度为10g/L蔗糖)和45.8mL的蒸馏水。将混合物在80℃原位加热30分钟，然后冷却至30℃，之后添加25mL的GTFJ18T1酶溶液(实例7，0.5U/mL最终GTFJ18T1浓度)并立即用0.5％氢氧化钠将pH调节至5.5(这两个反应以下称为反应5和6)。使用连接到蠕动泵的pH电极将反应pH连续控制在5.5，该蠕动泵根据需要向反应混合物中补料0.5％氢氧化钠。在预定时间取出等分试样，并通过在90℃加热20min使其淬火。将得到的热处理的等分试样离心并通过HPLC分析上清液以确定蔗糖、葡萄糖、果糖、明串珠菌二糖、低聚糖和多糖的浓度。20h后，将每个反应混合物(反应5和6)加热至90℃持续20分钟，并离心。通过HPLC分析所得上清液中可溶性单糖、低聚糖和多糖(表29)；通过1H NMR光谱确定低聚糖和多糖的端基异构体键(表30)；并通过尺寸排阻色谱法测定分子量(表31)。
表29.反应5和6中产生的可溶性单糖和二糖的HPLC分析。
Figure BDA0001673369560001031
表30.在反应5和6中产生的可溶性α-1，2-分支多糖的端基异构体键分析。
Figure BDA0001673369560001032
表31.在反应5和6中产生的α-1，2-分支多糖的分子量分析。
Figure BDA0001673369560001033
因此，进一步显示GTFJ18T1具有显著的α-1，2分支活性并可用于修饰葡聚糖底物的结构。
将来自反应5和6的上清液合并，并使用5-kDa截留分子量(MWCO)聚醚砜(PES)膜(Pall CentramateTM LV)通过超滤(UF)纯化和分离其中的α-1，2-分支多糖。UF渗余物的HPLC分析表明没有可检测的单糖、二糖或DP2-DP8低聚糖。将UF渗余物调节至约5wt％溶解固体并将所得溶液冻干以产生呈干燥固体的可溶性α-1，2-分支多糖。通过1H NMR光谱(表32)和GC/MS分析固体多糖产物以确定该多糖的端基异构体键(表33)。
表32.在反应5和6中产生的可溶性α-1，2-分支多糖的端基异构体键分析。
Figure BDA0001673369560001041
表33.在反应5和6中产生的可溶性α-1，2-分支多糖的端基异构体键分析。
Figure BDA0001673369560001042
实例23
小鼠中的血糖反应
筛选研究的目的是评估样品105-1(实例20)、样品105-2(实例21)和样品105-3(实例22)的消化性，以上样品各自使用GTF8117和GTFJ18T1，通过评估单次剂量后雄性小鼠的血糖反应来产生。七组雄性C57B1/6只小鼠各自接受单剂量的三种测试物质中的一种(样品105-1、105-2或105-3)、阳性或阴性对照物质、或载体对照物。通过尾静脉获得血液，以使用血糖仪测量血糖水平。在测试物质暴露当天获得多个读数。
选择口服施用途径是因为它是预期的人体暴露途径和递送精确剂量的最有效方式。通过口腔管饲法给12只年轻成年雄性C57B1/6J小鼠的组给药下列处理之一：测试物质(样品105-1、样品105-2、或样品105-3)、阳性对照物质(葡萄糖[所示数据]，或不具有α-1，2分支的α-1，3-连接的葡聚糖[数据未显示])、阴性对照物质(
Figure BDA0001673369560001043
Ultra)、或载体对照物(去离子水)。除水对照外，所有处理的剂量水平均为2000mg/kg，以与其他处理(表34)相同的剂量体积(10mL/kg)施用。
在使动物习惯于测试程序(包括在给药之前每日用水管饲和多次基线血糖仪读数)之后进行实验。在给药前约1小时内进行三次基线血糖仪读数(给药前测量1-3)，三次读数之间以及第三次读数与给药之间约为20分钟。大约20分钟、40分钟、60分钟和120分钟后进行给药后血糖仪读数。使用ALPHA TRAK2血糖仪测量通过用无菌针头刺穿尾静脉获得的至少0.3微升血液中的葡萄糖。计算曲线下面积(AUC)0至2小时。AUC是通过将一系列梯形而不是平滑曲线的预测模型相加来计算的。为计算目的，最终基线值被指定为“给药后0分钟”。
在该研究条件下，通过口服管饲法以2000mg/kg施用样品105-1或样品105-2不会导致血糖的任何增加；血糖反应类似于
Figure BDA0001673369560001053
Ultra膳食纤维或去离子水(表35)。通过口服管饲法以2000mg/kg施用样品105-3导致血糖反应，其起始较慢且峰值幅度低于游离葡萄糖(阳性对照)诱导的峰值幅度(不具有α-1，2分支的α-1，3-连接的葡聚糖诱导非常类似于由葡萄糖诱导的血糖反应[数据未显示])。在2000mg/kg的最大剂量下，血糖反应(即血糖水平在统计学上显著增加)被认为是这些测试物质可消化性的潜在指标。
表34.研究设计。
Figure BDA0001673369560001051
a测试物质的重量/kg动物体重。
表35.血糖仪读数＊(mg/dL)。
Figure BDA0001673369560001052
Figure BDA0001673369560001061
＊数据(每个测量读数)表示为“平均(SD)”。
#与水对照相比较，通过One Way ANOVA，然后进行Dunnett′s测试，统计学上显著的p＜0.05。
a为AUC计算目的，最终基线值被指定为“给药后0分钟”。
因此，样品105-3可以表征为本文的慢葡萄糖释放葡聚糖组合物，并且样品105-1和105-2可以表征为具有膳食纤维品质。值得注意的是，样品105-3具有小于10％的α-1，2分支(实例22)，而样品105-1和105-2各自具有大于15％的α-1，2分支(实例20和21)。
实例24
制备酸奶/可饮用的冰沙
以下实例描述了含有本发明α-1，2-分支葡聚糖的酸奶/可饮用冰沙的制备。
表36
Figure BDA0001673369560001062
Figure BDA0001673369560001071
步骤编号 程序
果胶溶液形成
1将50％的配方水加热至160°F(约71.1℃)。
2通过高剪切分散果胶；混合10分钟。
3添加果汁浓缩物和酸奶；混合5至10分钟直至酸奶分散。蛋白浆
1向在140°F(60℃)的50％的批量水中添加SUPRO XT40并充分混合。
2加热至170°F(约76.7℃)并保持15分钟。
3将果胶/果汁/酸奶浆添加到蛋白质溶液中；混合5分钟。
4添加果糖、葡聚糖、香料和颜色；混合3分钟。
5用磷酸调节pH至所希望范围(pH范围4.0至4.1)。
6使用间接蒸汽(IDS)装置以2500/500psig(17.24/3.45MPa)加热后，在224°F(约106.7℃)下超高温(UHT)处理7秒，同时进行UHT均化。
7将产品收集在瓶子中并在冰浴中冷却。
8将产品储存在冷藏条件下。
实例25
制备包含α-1，2-分支葡聚糖的水制剂
下面的实例描述了增强的水组合物的制备。
表37
Figure BDA0001673369560001072
Figure BDA0001673369560001081
步骤编号 程序
1添加干燥成分并混合15分钟。
2添加剩余的干燥成分；混合3分钟。
3如配制中所示，使用柠檬酸将pH调节至3.0+/-0.05。
4在224°F(约106.7℃)下超高温(UHT)处理7秒，同时以2500/500psig(17.24/3.45MPa)进行UHT均化。
5将产品收集在瓶子中并在冰浴中冷却。
6将产品储存在冷藏条件下。
实例26
制备可用勺子的酸奶配制品
以下实例描述了含有α-1，2-分支葡聚糖的可用勺子的酸奶的制备。
表38
Figure BDA0001673369560001082
步骤编号 程序
1将干燥成分添加到碱性奶液中；混合5min。
2在195°F(约90.6℃)下巴氏灭菌30秒，以2500psig(约17.24MPa)均质，并冷却至105°F至110°F(约40.6℃至43.3℃)。
3与培养物一起孵育；轻轻混合并在108°F(约42.2℃)下添加到水批或热箱中，直到pH达到4.5至4.6。
水果制备程序
1添加水到批量罐中；加热至140°F(约60℃)。
2预先混合碳水化合物和稳定剂。添加到批量罐中并充分混合。
3添加酸以降低pH至所希望范围(目标pH 3.5至4.0)。
4添加香料。
5冷却并冷藏。
实例27
制备模型小吃棒配制品
以下实例描述了含有目前公开的α-1，2-分支葡聚糖的模型小吃棒的制备。
表39
Figure BDA0001673369560001091
步骤编号 程序
1将玉米糖浆与液体葡聚糖溶液组合。在微波炉中温热糖浆10秒钟。
2将糖浆与油和液体香料在搅拌碗中组合。以速度2混合1分钟。
3将所有干燥成分添加到碗中，以速度1混合45秒。
4刮拭并混合另外30秒或直到面团混合。
5融化巧克力涂层。
6将巧克力涂层完全涂覆在棒上。
实例28
制备薄饼
以下实例描述了含有目前公开的α-1，2-分支葡聚糖的薄饼的制备。
表40
Figure BDA0001673369560001101
步骤编号 程序
1.将水、油和CITREM高剪切20秒。
2.缓慢添加干燥成分，高剪切2至4分钟。
3.静置面糊60分钟。
4.将面糊放在设置为200℃的热板的顶部和底部上，烘烤1分30秒。
5.尽快让该面糊层冷却。
实例29
制备软巧克力片曲奇饼
以下实例描述了含有目前公开的α-1，2-分支葡聚糖的软巧克力片曲奇饼的制备。
表41
Figure BDA0001673369560001111
步骤编号 程序
1.快速混合第1阶段成分1分钟。
2.慢速混合第2阶段成分2分钟。
3.慢速添加第3阶段成分20秒。
4.刮拭碗；慢速添加第4阶段成分20秒。
5.分成30g碎片，压平，并且然后放在硅酮内衬的烘烤托盘上。
6.大约在190℃烘烤10分钟。
实例30
制备低脂短壳酥皮面团
以下实例描述了含有目前公开的α-1，2-分支葡聚糖的低脂短壳酥皮面团的制备。
表42
Figure BDA0001673369560001121
步骤编号 程序
1.干混面粉、盐和葡聚糖(干燥)。
2.轻轻擦入脂肪，直到混合物类似细面包屑。
3.添加足够的水使面团变得光滑。
实例31
低糖谷物簇的制备
以下实例描述了含有目前公开的α-1，2-分支葡聚糖的低糖谷物簇的制备。
表43
Figure BDA0001673369560001122
步骤编号 程序
1.切碎细料。
2.称量谷物混合物并添加细料。
3.在谷物上添加植物油并充分混合。
4.通过溶解成分来制备糖浆。
5.使糖浆冷却。
6.将所需量的糖浆添加到谷物混合物中。
7.充分混合，以确保谷物均匀涂层。
8.在托盘上分散开。
9.放入烘干机/烘箱中并让其干燥。
10.在破碎成簇之前，让其完全冷却。
实例32
制备果胶冻
以下实例描述了含有目前公开的α-1，2-分支葡聚糖的果胶冻的制备。
表44
Figure BDA0001673369560001131
步骤编号 程序
1.将果胶与木糖醇干混(组分A)。
2.加热组分B直到溶液开始沸腾。
3.逐渐添加组分A，并且然后煮沸直至完全溶解。
4.逐渐添加组分C以避免该批次过度冷却。
5.煮沸至113℃。
6.允许冷却至＜100℃，并且然后添加颜色、风味和酸(组分D)。立即存入淀粉模具中。
7.放置直到变硬，然后脱淀粉。
实例33
制备口嚼糖
以下实例描述了含有目前公开的α-1，2-分支葡聚糖的口嚼糖的制备。
表45
成分 wt％
α-1，2-分支葡聚糖(本文中目前公开的) 35
木糖醇 35
水 10
植物脂肪 4.0
甘油单硬脂酸酯(GMS) 0.5
卵磷脂 0.5
明胶180bloom(40％溶液) 4.0
木糖醇，CM50 10.0
香料、颜色和酸 q.s.
步骤编号 程序
1.将葡聚糖、木糖醇、水、脂肪、GMS和卵磷脂混合在一起，并且然后轻轻煮至158℃。
2.将该团块冷却至90℃以下，并且然后添加明胶溶液、香料、颜色和酸。
3.进一步冷却，并且然后添加木糖醇CM50。立即拉动该团块5分钟。
4.在加工之前允许该团快再次冷却(切割并包裹或脱落滚动)。
实例34
制备咖啡樱桃冰淇淋
以下实例描述了含有目前公开的α-1，2-分支葡聚糖的咖啡樱桃冰淇淋的制备。
表46
Figure BDA0001673369560001151
步骤编号 程序
1.在剧烈搅拌的同时将干成分添加到水中。
2.融化脂肪。
3.在40℃将脂肪添加到混合物中。
4.在200巴/70℃至75℃均化。
5.巴氏灭菌，80℃至85℃/20至40秒。
6.冷却至老化温度(5℃)。
7.老化至少4小时。
8.向混合物中添加香料。
9.在连续冷冻机中冷冻至所需膨胀度(建议100％)。
10.硬化并储存在-25℃。
序列表
<110> E. I.内穆尔杜邦公司
DiCosimo, Robert
Zhang, Zhenghong
Prasad, Jahnavi
Cheng, Qiong
<120> 能够产生具有α-1,2分支的葡聚糖的多肽及其用途
<130> CL6550
<150> PCT/CN2015/095687
<151> 2015-11-26
<150> PCT/CN2016/085547
<151> 2016-06-13
<160> 34
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 2771
<212> PRT
<213> 肠膜明串珠菌
<400> 1
Met Thr Ala Gly Ile Phe Ser Ala Val Ile Phe Gly Val Ser Thr Thr
1 5 10 15
Asn Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Asn Thr Gly Val Thr Val Ser Gln
20 25 30
Ala Thr Asp Lys Val Ala Asp Thr Thr Ala Thr Thr Asp Lys Val Ala
35 40 45
Asp Thr Thr Ala Thr Thr Asp Lys Val Ala Asp Thr Ala Ala Thr Thr
50 55 60
Asp Lys Val Ala Asp Thr Thr Ala Thr Thr Asp Lys Val Ala Asp Thr
65 70 75 80
Ala Ala Thr Thr Asp Lys Val Ala Asp Thr Thr Ala Thr Thr Asp Lys
85 90 95
Val Ala Asp Thr Ala Ala Ala Thr Asp Lys Ala Ala Asp Thr Ala Ala
100 105 110
Thr Thr Asp Lys Val Ala Asp Thr Ala Ala Ala Thr Asp Lys Val Ala
115 120 125
Asp Thr Val Ala Ala Thr Asp Lys Val Ala Asp Thr Thr Ala Thr Thr
130 135 140
Asp Lys Ala Ala Asp Thr Ala Ala Thr Thr Asp Lys Val Thr Asp Thr
145 150 155 160
Thr Ala Ala Thr Asp Lys Ala Ala Asp Thr Thr Ala Thr Thr Asp Lys
165 170 175
Val Ala Asp Thr Thr Ala Thr Thr Ser Glu Lys Ser Lys Ser Ile Lys
180 185 190
Gln Ile Asp Gly Lys Thr Tyr Phe Ile Gly Asn Asp Gly Gln Pro Lys
195 200 205
Lys Asn Phe Thr Ala Ile Val Asp Gly Gln Val Leu Tyr Phe Asp Lys
210 215 220
Asp Thr Gly Ala Leu Thr Ser Asn Ser Ser Gln Tyr Thr Asp Gly Leu
225 230 235 240
Ala Asn Ile Gly Asn Glu His Asn Ala Ala Tyr Ser Leu Ser Ser Asp
245 250 255
Ser Phe Thr Gln Val Asp Gly Tyr Leu Thr Ala Asn Ser Trp Tyr Arg
260 265 270
Pro Lys Asp Ile Leu Lys Asn Gly Thr Thr Trp Thr Ala Ala Thr Ala
275 280 285
Asn Asp Phe Arg Pro Leu Leu Met Ser Trp Trp Pro Asp Lys Asp Thr
290 295 300
Gln Val Ser Tyr Leu Lys Tyr Met Gln Ser Ala Gly Leu Leu Ser Asp
305 310 315 320
Asp Val Ala Leu Ser Asn Asn Asp Ser Met Asn Ser Leu Thr Asp Thr
325 330 335
Ala Met Thr Val Gln Lys Lys Ile Glu Glu Lys Ile Gly Leu Leu Gly
340 345 350
Ser Thr Asp Trp Leu Lys Ala Asp Met Asn Gln Met Val Asp Ser Gln
355 360 365
Ser Asn Trp Asn Ile Ser Ser Glu Ser Lys Gly Thr Asp His Leu Gln
370 375 380
Gly Gly Ala Leu Leu Tyr Val Asn Ser Asp Leu Thr Pro Asn Ala Asn
385 390 395 400
Ser Asp Tyr Arg Leu Leu Asn Arg Thr Pro Thr Asn Gln Lys Gly Gln
405 410 415
Ile Thr Thr Asn Gly Asn Gln Gly Gly Tyr Glu Met Leu Leu Ala Asn
420 425 430
Asp Val Asp Asn Ser Asn Pro Ile Val Gln Ala Glu Gln Leu Asn Trp
435 440 445
Leu Tyr Tyr Met Met Asn Ile Gly Ser Ile Ala Gln Asn Asp Pro Thr
450 455 460
Ala Asn Phe Asp Gly Tyr Arg Val Asp Ala Val Asp Asn Val Asn Ala
465 470 475 480
Asp Leu Leu Gln Ile Ala Gly Asp Tyr Phe Lys Ala Ala Tyr Gly Thr
485 490 495
Asn Gln Ser Asp Ala Asn Ala Asn Asn His Ile Ser Ile Leu Glu Asp
500 505 510
Trp Asp Asn Asn Asp Pro Ala Tyr Val Lys Ala Gln Gly Asn Asn Gln
515 520 525
Leu Thr Met Asp Phe Pro Met His Leu Ala Leu Lys Tyr Ser Leu Asn
530 535 540
Met Pro Ser Ser Ala Arg Ser Gly Leu Glu Pro Ala Ile Ser Thr Ser
545 550 555 560
Leu Val Asn Arg Ala Ala Asp Ala Thr Glu Asn Glu Ala Gln Pro Asn
565 570 575
Tyr Ser Phe Ile Arg Ala His Asp Ser Glu Val Gln Thr Val Ile Ala
580 585 590
Gln Ile Ile Lys Asp Lys Ile Asn Pro Ser Ser Asp Gly Leu Thr Val
595 600 605
Ser Thr Asp Glu Ile Ala Lys Ala Phe Glu Ile Tyr Asn Ala Asp Glu
610 615 620
Leu Lys Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Ala Tyr Asn Ile Pro Ser Ser Tyr
625 630 635 640
Ala Leu Met Leu Thr Asn Lys Asp Thr Ile Pro Arg Val Tyr Tyr Gly
645 650 655
Asp Leu Phe Thr Asp Asp Gly Gln Tyr Met Ser Ala Lys Ser Pro Tyr
660 665 670
Tyr Asp Ala Leu Thr Ser Leu Leu Gln Ser Arg Val Lys Tyr Val Ser
675 680 685
Gly Gly Gln Ser Met Asn Met Thr Tyr Leu His Asn Asn Gln Gly Leu
690 695 700
Leu Thr Ser Val Arg Tyr Gly Lys Asp Ala Met Thr Ala Asn Asp Thr
705 710 715 720
Gly Thr Ser Glu Thr Arg Thr Gln Gly Ile Gly Leu Ile Val Gly Asn
725 730 735
Lys Thr Asp Leu Asn Leu Asn Asn Asp Glu Gln Ile Val Leu Asn Met
740 745 750
Gly Ala Ala His Lys Asn Gln Ala Tyr Arg Ala Leu Met Leu Ser Thr
755 760 765
Lys Asp Gly Leu Lys Ile Tyr Asn Asn Asp Asp Glu Ala Pro Val Ser
770 775 780
Tyr Thr Asp Asp Gln Gly Arg Leu Ile Phe Lys Ser Asp Val Val Tyr
785 790 795 800
Gly Val Ser Asp Ala Gln Val Ser Gly Tyr Leu Ala Ala Trp Val Pro
805 810 815
Val Gly Ala Asn Asp Ser Gln Asp Ala Arg Thr Glu Ser Ser Thr Thr
820 825 830
Ala Ser Thr Asp Gly Asn Thr Tyr His Ser Asn Ser Ala Leu Asp Ser
835 840 845
Gln Leu Ile Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Phe Gln Ala Met Pro Thr Gln
850 855 860
Ala Asp Glu Tyr Thr Asn Ile Lys Ile Ala Glu Asn Ala Gln Leu Phe
865 870 875 880
Lys Ser Leu Gly Ile Thr Ser Phe Glu Leu Ala Pro Gln Tyr Arg Ser
885 890 895
Ser Thr Asp Asn Ser Phe Leu Asp Ser Val Ile Gln Asn Gly Tyr Ala
900 905 910
Phe Thr Asp Arg Tyr Asp Ile Gly Tyr Asn Thr Pro Thr Lys Tyr Gly
915 920 925
Thr Val Asp Gln Leu Leu Asp Ala Leu Arg Ala Leu His Ala Gln Gly
930 935 940
Ile Gln Ala Ile Asn Asp Trp Val Pro Asp Gln Ile Tyr Asn Leu Pro
945 950 955 960
Gly Glu Glu Ile Val Thr Ala Ser Arg Thr Asn Gly Ser Gly Lys Val
965 970 975
Asn Glu Ser Ser Val Ile Asn Asn Thr Leu Tyr Asp Ser Arg Thr Val
980 985 990
Gly Gly Gly Glu Tyr Gln Ala Ile Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Asp Lys
995 1000 1005
Leu Lys Gln Asp Tyr Pro Glu Leu Phe Glu Thr Lys Gln Ile Ser
1010 1015 1020
Thr Gly Glu Ala Met Asn Pro Asp Val Lys Ile Thr Glu Trp Ser
1025 1030 1035
Ala Lys Tyr Phe Asn Gly Ser Asn Ile Gln Gly Arg Gly Ala Trp
1040 1045 1050
Tyr Val Leu Lys Asp Trp Ser Thr Asn Gln Tyr Phe Asn Val Ser
1055 1060 1065
Ser Gly Ser Glu Phe Leu Pro Lys Gln Leu Leu Gly Glu Lys Thr
1070 1075 1080
Ser Thr Gly Phe Thr Asn Val Asp Asn Gly Lys Thr Glu Phe Tyr
1085 1090 1095
Ser Thr Ser Gly Tyr Gln Ala Lys Asn Thr Phe Ile Gln Asp Asn
1100 1105 1110
Asp Asn Trp Tyr Tyr Phe Asp Asn Asp Gly Tyr Met Val Val Gly
1115 1120 1125
Gly Gln Glu Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Leu Pro Asn Gly
1130 1135 1140
Val Glu Leu Gln Asp Ala Tyr Leu Ser Asp Gly Thr Ser Glu Tyr
1145 1150 1155
Tyr Tyr Ser Ser Asp Gly Arg Gln Ile Ser Asn Gln Tyr Tyr Gln
1160 1165 1170
Gly Ser Asp Asn Asn Trp Arg Tyr Phe Phe Ala Asp Gly His Met
1175 1180 1185
Ala Val Gly Leu Ala Thr Ile Thr Thr Glu Asn Gly Thr Thr Asn
1190 1195 1200
Gln Gln Tyr Phe Asp Ala Asn Gly Val Gln Leu Lys Gly Val Ala
1205 1210 1215
Ile Lys Asp Thr Asp Gly Asn Val His Tyr Phe Asp Gly Lys Thr
1220 1225 1230
Gly Asn Met Val Ile Asn Ser Trp Gly Lys Ile Ser Asp Gly Ser
1235 1240 1245
Trp Leu Tyr Leu Asn Asp Ser Gly Val Ala Val Thr Gly Pro Gln
1250 1255 1260
Asn Ile Asn Gly Gln Asn Leu Tyr Phe Asn Glu Asp Gly Ile Gln
1265 1270 1275
Val Lys Gly Glu Ala Ile Thr Asp Asn Ser Gly Asn Ile His Tyr
1280 1285 1290
Tyr Asp Arg Ser Thr Gly Asn Met Val Val Asn Ser Trp Gly Glu
1295 1300 1305
Thr Asn Asn Gly Ser Trp Leu Tyr Leu Asn Asp Lys Gly Asp Ala
1310 1315 1320
Val Thr Gly Glu Gln Val Ile Asp Gly Gln Lys Leu Tyr Phe Ser
1325 1330 1335
Ser Asn Gly Ile Gln Leu Lys Asn Thr Phe Lys Lys Leu Ser Asp
1340 1345 1350
Gly Ser Trp Leu Tyr Leu Asn Asp Lys Gly Leu Pro Val Thr Gly
1355 1360 1365
Ala Gln Val Ile Asp Gly Gln Asn Leu Tyr Phe Asp Gln Asp Gly
1370 1375 1380
Lys Gln Val Lys Gly Asp Val Ala Thr Asp Gly Gln Gly Asn Thr
1385 1390 1395
His Tyr Tyr Asp Gly Asn Thr Gly Asn Met Val Thr Asn Ser Trp
1400 1405 1410
Ala Glu Leu Pro Asp Gly Ser Trp Met Tyr Leu Asp Asn Asp Gly
1415 1420 1425
Asn Pro Leu Thr Gly Gln Gln Lys Ile Asp Gly Gln Ser Leu Tyr
1430 1435 1440
Phe Asn Asp Ala Gly Lys Gln Ile Lys Asn Ala Leu Val Lys Leu
1445 1450 1455
Asp Asp Gly Ser Thr Ile Tyr Leu Asp Asp Lys Gly Val Ser Ser
1460 1465 1470
Thr Gly Ile Gln Arg Ile Asp Asp Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp Pro
1475 1480 1485
Asp Gly Lys Gln Val Val Cys Arg Phe Glu Glu Leu Pro Asp Gly
1490 1495 1500
Ser Trp Met Tyr Leu Asp Asp Asp Gly Val Ala Ala Thr Gly Ala
1505 1510 1515
Gln Lys Ile Asn Gly Gln Glu Leu Tyr Phe Asp Asn Ser Gly Lys
1520 1525 1530
Gln Val Lys Asn Asp Lys Val Ile Asn Asp Asp Gly Thr Ile Asn
1535 1540 1545
Tyr Tyr Thr Gly Met Ser Gly Glu Lys Leu Lys Asn Asp Phe Gly
1550 1555 1560
Glu Leu Pro Asp Gly Ser Trp Met Tyr Leu Asp Asn Gln Gly Asn
1565 1570 1575
Ala Val Ile Gly Ala Gln Lys Ile Asn Gly Gln Asn Leu Tyr Phe
1580 1585 1590
Lys Thr Asp Gly Arg Gln Val Lys Gly Glu Ala Asn Val Asp Ser
1595 1600 1605
Ser Gly Glu Met His Phe Tyr Asp Pro Asp Ser Gly Glu Leu Ile
1610 1615 1620
Thr Asn Arg Phe Glu Gln Val Ala Ser Gly Val Trp Ala Tyr Phe
1625 1630 1635
Asp Ala Lys Gly Val Ala Val Thr Gly Glu Gln Arg Ile Gly Lys
1640 1645 1650
Gln Asn Leu Phe Phe Asp Pro Thr Gly Tyr Gln Val Lys Gly Asp
1655 1660 1665
Lys Arg Thr Ile Asp Gly Val Leu Tyr Thr Phe Asp Lys Glu Ser
1670 1675 1680
Gly Glu Arg Lys Gly Leu Asp Ser Ile Ser Val Leu Pro Thr Asn
1685 1690 1695
Gly Gln Tyr Thr Thr Asp Lys Ala Gln Asn Trp Tyr Tyr Gln Val
1700 1705 1710
Asp Gly Glu Asn Val Lys Gly Leu Tyr Thr Asn Asn Asp Gly Gln
1715 1720 1725
Leu Arg Tyr Phe Asp Leu Thr Thr Gly Val Gln Thr Lys Gly Asn
1730 1735 1740
Phe Val Thr Ile Gly Asn Asp Thr Tyr Tyr Phe Thr Lys Glu Gln
1745 1750 1755
Gly Asp Gly Gln Ile Val Ser Glu Val Val Ser Gly His Tyr Gly
1760 1765 1770
Thr Val Gln Leu Ser Asp Asn Ser Ser Ala Trp Val Tyr Arg Gly
1775 1780 1785
Ala Asn Asp Gln Ile Leu Lys Gly Leu Gln Asn Ile Asn Gly Arg
1790 1795 1800
Leu Gln Tyr Phe Asp Leu Thr Thr Gly Ala Gln Leu Lys Gly Gly
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Gly Lys Val Thr Arg Ile Asn Ile Gly Asn Gly Lys Phe Val Thr
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Ile Ala Ile Phe Ser Gly Asn Gln Leu Phe Ser Gly Asn Val Val Ala
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Gln Ala Lys Asn Thr Phe Ile Gln Asp Asn Asp Asn Trp Tyr Tyr
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Phe Asp Asn Asp Gly Tyr Met Val Val Gly Gly Gln Glu Ile Asn
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Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Leu Pro Asn Gly Val Glu Leu Gln Asp
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Ala Tyr Leu Ser Asp Gly Thr Ser Glu Tyr Tyr Tyr Ser Ser Asp
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Gly Arg Gln Ile Ser Asn Gln Tyr Tyr Gln Gly Ser Asp Asn Asn
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Trp Arg Tyr Phe Phe Ala Asp Gly His Met Ala Val Gly Leu Ala
1250 1255 1260
Thr Ile Thr Thr Glu Asn Gly Thr Thr Asn Gln Gln Tyr Phe Asp
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Ala Asn Gly Met Gln Leu Lys Gly Val Ala Ile Lys Asp Thr Asp
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Gly Asn Val His Tyr Phe Asp Gly Lys Thr Gly Asn Met Val Ile
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Asn Ser Trp Gly Lys Ile Ser Asp Gly Ser Trp Leu Tyr Leu Asn
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Asp Ser Gly Val Ala Val Thr Gly Pro Gln Asn Ile Asn Gly Gln
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Asn Leu Tyr Phe Asn Glu Asp Gly Ile Gln Val Lys Gly Glu Ala
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Val Ile Asp Gly Gln Lys Leu Tyr Phe Ser Ser Asn Gly Ile Gln
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Leu Asn Asp Lys Gly Leu Pro Val Thr Gly Ala Gln Val Ile Asp
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<212> PRT
<213> Lactobacillus kunkeei
<400> 10
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Ile Lys Gly Asn Phe Val Thr Ile Gly His Asn Thr Tyr Tyr Phe
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<213> Fructobacillus tropaeoli
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<210> 26
<211> 8436
<212> DNA
<213> 肠膜明串珠菌
<400> 26
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<211> 1107
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<213> 肠膜明串珠菌
<400> 27
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100 105 110
Leu Ser Asp Asn Ser Ser Ala Trp Val Tyr Arg Gly Ala Asn Asp Gln
115 120 125
Ile Leu Lys Gly Leu Gln Asn Ile Asn Gly Arg Leu Gln Tyr Phe Asp
130 135 140
Leu Thr Thr Gly Ala Gln Leu Lys Gly Gly Ala Ala Asn Tyr Asp Gly
145 150 155 160
Asn Leu Tyr Tyr Phe Glu Ser Ser Asp Gly Asn Leu Val Ser Lys Ile
165 170 175
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Gly Asn Tyr Val Thr Asp Gly Asp Lys Val
180 185 190
Thr Tyr Ala Asp Glu Gln Asn Asn Gln Val Thr Gly Leu Ala Leu Ile
195 200 205
Asp Asp Gln Leu Gln Tyr Phe Asp Pro Ser Asp Gly Arg Gln Val Lys
210 215 220
Asn Glu Gln Val Ile Val Asp Gly Val Thr Tyr Tyr Phe Asp Lys Asn
225 230 235 240
Gly Asn Gly Gln Tyr Leu Phe Thr Asn Thr Ala Thr Met Ser Thr Asn
245 250 255
Glu Phe Ala Lys His Ser Ala Ala Tyr Ser Asn Asp Ser Ser Ser Phe
260 265 270
Lys Asn Thr Ile Asp Gly Phe Leu Thr Ala Asp Thr Trp Tyr Arg Pro
275 280 285
Lys Asp Ile Leu Glu Asn Gly Gln Thr Trp Val Val Ser Ser Thr Asn
290 295 300
Asp Val Arg Pro Leu Ile Thr Val Trp Trp Leu Asn Lys Asp Val Gln
305 310 315 320
Val Asn Tyr Ser Asn Phe Met Lys Gln Asn Gly Leu Leu Asp Thr Ser
325 330 335
Ser Gln Phe Asn Leu Gln Ser Asp Gln Tyr Asp Leu Asn Val Ala Ala
340 345 350
Gln Lys Val Gln Val Ala Ile Glu Lys Arg Ile Ser Lys Glu Lys Ser
355 360 365
Thr Asp Trp Leu Lys Asp Leu Leu Phe Glu Ala His Glu Asp Thr Pro
370 375 380
Ser Phe Val Lys Gln Gln Phe Ile Trp Asn Lys Asp Ser Glu Tyr Gln
385 390 395 400
Gly Gln Gly Asp Ala Trp Phe Gln Gly Gly Tyr Leu Lys Tyr Gly Asn
405 410 415
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420 425 430
Thr Leu Asp Phe Leu Leu Ala Asn Asp Val Asp Asn Ser Asn Pro Ala
435 440 445
Val Gln Ala Glu Asn Leu Asn Trp Leu His Tyr Leu Met Asn Phe Gly
450 455 460
Thr Ile Thr Ala Asn Asp Asp Asp Ala Asn Phe Asp Ser Ile Arg Ile
465 470 475 480
Asp Ala Val Asp Phe Ile Asp Asn Asp Ala Ile Gln Arg Thr Tyr Asp
485 490 495
Tyr Met Arg Asp Ala Tyr Lys Val Asp Ala Ser Glu Asp Asn Ala Asn
500 505 510
Lys His Ile Ser Leu Val Glu Ala Gly Leu Asp Ala Gly Thr Ser Thr
515 520 525
Ile Lys Ser Asp Ala Leu Val Glu Ser Asn Phe Arg Glu Ala Ala Thr
530 535 540
Leu Ser Leu Ala Asn Gln Ser Gly Glu Asn Ser Ser Leu Thr Asn Met
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Ala Ala Tyr Tyr Gln Asp Gln Arg Ser Thr Asn Lys Lys Tyr Asn Ile
625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
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705 710 715 720
Ser Asp Leu Gly Thr Asn Glu Thr Arg Thr Glu Gly Val Gly Val Leu
725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
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820 825 830
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835 840 845
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980 985 990
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Tyr Val Leu Lys Asp Trp Asn Thr Gly Glu Tyr Phe Lys Ile Gly
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1100 1105
<210> 28
<211> 856
<212> PRT
<213> 肠膜明串珠菌
<400> 28
Thr Met Ser Thr Asn Glu Phe Ala Lys His Ser Ala Ala Tyr Ser Asn
1 5 10 15
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20 25 30
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Ser Lys Glu Lys Ser Thr Asp Trp Leu Lys Asp Leu Leu Phe Glu Ala
115 120 125
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130 135 140
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Leu Lys Tyr Gly Asn Asn Glu Leu Thr Pro Thr Thr Asn Ser Asp Tyr
165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
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385 390 395 400
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485 490 495
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565 570 575
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595 600 605
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<210> 29
<211> 4848
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 添加甲硫氨酸的编码成熟GTF8117的密码子优化的序列
<400> 29
gtggacgaga caagcagctc aaacgaaaca caaacggaac aaacgcttaa cacggatgag 60
tcaacagaca caacgacgga cgtctcaaat gaggccaaag caacggaggc acaactgaca 120
acgcaagatg cagacatggc gagctcagaa gaaaaaacaa cgaatgtcga gaaagaggtt 180
acaacggctg aaacaaataa agacacgacg gtcaaaaatg tggagtcaag cgaacagaat 240
acaacgacag tggcagacaa gaatgccgtg gattcaacag ctcaagttaa cacagcggag 300
aaggagaaca agtacacgca ggagaatgtg aacggcaatt ggtatctgaa agatgagcag 360
ggcaactatc ttacgggatt ccaagagatt aaagaccaaa acaaaacagt gtattataac 420
cctgatagca agcagatggt ctacggacag caaaacatca acggaaactg gtaccttttc 480
gatacattca atggagcgat gcaaacagga cttcaatata tcagagatca aaaaaagctt 540
gcttattaca atgaacaggg acaaatgcaa tatggcacag tcgagatcga tggacaaaag 600
taccaagcgg atacgtttaa tggcgcgatc aaaggcaaag gccagacaaa aatcgctgac 660
aattggtatc ttttcaataa tgccggacag gtcgtggatg gctggcagtg gattaacgac 720
cagggaaaga cagtttatta ctcaacaaaa acggcccaaa tggtccatgg ccagcagaat 780
attaatggac attggtacct gttcgataag acaacaggcg ctatgcaaag aggcttccaa 840
aaccttaaag cctacggaga cgacaagacg gtgtactata atcaagacgg ctggatgctg 900
tatggccaac agaagattga taacaagtgg tacaatttcg acacgttcaa tggagctatg 960
aagacaggat tcgtgaaaat tccggagcag aacaagacag tctactacgc accgaacggc 1020
caaatgcagt atggctggca gtgggtcgat aacgcgacga gatatttcga cacgtttaat 1080
ggcgcaatgg caacgggaca gaagctgatt acaggacact ggtatctgtt tgacaacaat 1140
ggcgcaatgc agagaggctt ccagaatctg aagaattatg gagacaataa aacggtttac 1200
tacaaccaag atggatggat gctttatggc tggcaatggg tcaacaacgc tacaagatac 1260
tttgacacat ttaacggagc catgacgacg ggccagaaaa agattaatga ccattggtac 1320
ctttttgata aggacggcgc catgcagaga ggaatccaat acatccctga ggaaaataag 1380
cttgtgtact acaatcagga cggatggatg ctgtacggca agcaaaatat caatggcgtc 1440
gatcataact ttaatacgtt caatggagca cttgaggcta agggccaagt gaaagtgggc 1500
aataattggt atctgttcaa caatagcgga acgattcaga caggctttca ggacctgaag 1560
gcttacggcc aggataaagt cgtttactat gatcctaaga cggcagccat ggtttatgga 1620
tatcagaaca tcgacggcaa ctggtacctt ttcagcagag caaatggcag catgcaaaga 1680
ggccttcaaa acgtcaacgg cgttgacctg cttttcgatg aaaagacggg cgcactgctg 1740
acaggagttc aaaatatcaa gggaaataac tactttgtgg ataagagaag cggaaacatc 1800
aagaagaacc ttgtggtcct tggagccgat aataagtgga tgtacttcga tgcgaaaacg 1860
ggaaaaggca cgaacacgct tgaggatcag tacaaaaaag gagttgttag cggcaacgtg 1920
gaatttatta cgaataacgc agcgtatagc tttgatggca atagcttcga aaacattaac 1980
ggcttcctga cggccgattc atggtacaga ccgaaatcaa ttcttaaaga tggctcaaca 2040
tggacagcaa caacagagac agaccttaga ccgctgctga tgacatggtg gccgaacgaa 2100
caaatcaagg ccaactacct gaactacatg aaggacaagg gattcatcaa taactcaggc 2160
acgtataatg ctgagtcaga cccgaactat atggacttcg ctgcccagga ggcgcagaga 2220
aatattgaga gaaaaatcac gaaggaaaac gatacgacgt ggcttagaga tcttatcaca 2280
gacttcatta aaacacagga tatctggaac gagcaatcag agggagttag cacggagggc 2340
ctgcaaaaat ttcagggcgg ctttcttaag tatgtgaata gcgagctgac gccttacgca 2400
aactcagaat ggagaaaact gggctaccaa ccgacgatgc ttacacaaaa taacgttggc 2460
gcggagttcc ttcttgccaa tgatatcgac aactcaaatc cggtcgtgca agctgaacaa 2520
cttaactggc tgcactttct gatgaacttt ggcacgatca cagctaacga tccgagcgcg 2580
aacttcgacg gaatcagaat cgatgcagtc gataatgtgg acgcatcact gctgtcaatc 2640
gctggcgatt atttcaaggc agcgtacaag gtgggccaaa acgatgccac agccaacaag 2700
cacatctcaa tcctggaaga ctggaacgat aaggaccctg agtacgttaa tagcatcgga 2760
aacccgcaac tgacaatgga tgactacatc gtgcaacaac tgaaattttc actgggacag 2820
gcacctgata aggtcgacag aatgcaaaga tttaaggagt ggtacctggt tgacagatca 2880
aaggataata cggaaaacac agcgatcccg aactatagct tcgtgagagc acatgacgcc 2940
tcagttcaag aggacatcct gcagctgatc caggacacga caggaaaacc gtggggcgtc 3000
tatacgaacg aagagctgca acaaggcctg aaggactata tggcggacca gaagcttacg 3060
aacaagaaat acaatagata caacatcccg agcagctatg ctatcctgct gacaaacaaa 3120
gacacaatcc ctagagtgta ttatggcgac ctgtatagcg acgccggaaa gtacatggcc 3180
gagaagtcaa tttactttga tgccattgac aacctgctta aaacgagaac gaaatatgtg 3240
gcaggcggcc aaacactgga cgttgacgga catgatatcc tgacaagcgt cagattcgga 3300
aagggagccc tgaatgtcac agataaaggc acgagcgaga caagaacgca aggcatggga 3360
ctgatcatca gcaataacaa ctcactgaag ctgaacgacg gagaaaaggt tgtgcttcat 3420
atgggcgccg cacacaagaa tcaagcctat agagcagtca tgcttagcag cgcaaatggc 3480
ctgattaact atacatcaga cgcgaacgca cctgtggttt atacaaataa cgatggcgat 3540
ctgatcttta cgaataaaga tgtcgtcaca aatggaaagg tgcaggccaa tacagcaatt 3600
aagggcgtta tgaaccctta cgtcagcggc tatcttgcaa tgtgggtgcc ggttggcgca 3660
tcagcgacac aggatgcaag aacagccgct agcacgaaga caacgacaga tggctcagtt 3720
ttccacagca acgctgcact tgatagcaac ctgatttatg aaggattctc aaacttccaa 3780
gcttttccgg agaatgcctc agaaaatgcc aatgcgatca tcgcccaaaa tgtcgatctg 3840
ttcaactcat ggggagtcac gtcatttcaa ctggctcctc aatatgtctc aagccacgac 3900
ggcagcttcc tggacagcat catcgacaac ggctatgcat tcacggacag atacgacctt 3960
gcgatgagca aaaacaacaa atatggctca taccaggatc tggttaatgt cctgaaggca 4020
ctgcatgcgg gaggaatcca agttatcgca gattgggttc cggaccaaat ctattcactg 4080
ccgggcaaag aggtcgttag cgttgttaga agcgacgagt tcggcaacaa agtggatggc 4140
acgcaaatcg ataacacgct gtacgtggtc aatacgatcg gcggaggcca gtatcaaaag 4200
gaatacggcg gaagatacct tgaagaactt aaacaaaagt atccggagct ttttaagacg 4260
aaacagcctt caacaggcgt tacaatcgat ccgtcagaga agattacgga gtggagcgcc 4320
aagtatctga acggcacaaa cattcttcat agaggcgcag aatttgtcct gagagatggc 4380
gctacatact ttagagtcgc agaaacaagc gaagtgttcc ttcctagcca gcttagaggc 4440
aaaatcacaa aaaacggatt ttggaaaaac gacgcgggaa aagtcaacta ctataactca 4500
gagggagaaa tcatgaaaaa tgctttcgtc aaagacggaa agaataactg gtactacttc 4560
gacaatgacg gcaatatggt cacgaacacg gcactgacga ttgattcaga tgcccaggtg 4620
gctgattact atttcctgaa taacggcatt agccttagag acggctttgt gcaacttgca 4680
aacggagaca tctactacta cgatgtgaat ggcagaaaac ttaagaacgg caaagttaca 4740
gtcaataacg ttgaatacac aacggacaaa aatggcaagg tggtcggaga gaacgtgctg 4800
aaaaaactgg atgagattat tacaacggga aagacgacac ttatttga 4848
<210> 30
<211> 1615
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 添加甲硫氨酸的成熟GTF8117
<400> 30
Met Asp Glu Thr Ser Ser Ser Asn Glu Thr Gln Thr Glu Gln Thr Leu
1 5 10 15
Asn Thr Asp Glu Ser Thr Asp Thr Thr Thr Asp Val Ser Asn Glu Ala
20 25 30
Lys Ala Thr Glu Ala Gln Leu Thr Thr Gln Asp Ala Asp Met Ala Ser
35 40 45
Ser Glu Glu Lys Thr Thr Asn Val Glu Lys Glu Val Thr Thr Ala Glu
50 55 60
Thr Asn Lys Asp Thr Thr Val Lys Asn Val Glu Ser Ser Glu Gln Asn
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Thr Thr Thr Val Ala Asp Lys Asn Ala Val Asp Ser Thr Ala Gln Val
85 90 95
Asn Thr Ala Glu Lys Glu Asn Lys Tyr Thr Gln Glu Asn Val Asn Gly
100 105 110
Asn Trp Tyr Leu Lys Asp Glu Gln Gly Asn Tyr Leu Thr Gly Phe Gln
115 120 125
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145 150 155 160
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165 170 175
Gln Lys Lys Leu Ala Tyr Tyr Asn Glu Gln Gly Gln Met Gln Tyr Gly
180 185 190
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195 200 205
Ala Ile Lys Gly Lys Gly Gln Thr Lys Ile Ala Asp Asn Trp Tyr Leu
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225 230 235 240
Gln Gly Lys Thr Val Tyr Tyr Ser Thr Lys Thr Ala Gln Met Val His
245 250 255
Gly Gln Gln Asn Ile Asn Gly His Trp Tyr Leu Phe Asp Lys Thr Thr
260 265 270
Gly Ala Met Gln Arg Gly Phe Gln Asn Leu Lys Ala Tyr Gly Asp Asp
275 280 285
Lys Thr Val Tyr Tyr Asn Gln Asp Gly Trp Met Leu Tyr Gly Gln Gln
290 295 300
Lys Ile Asp Asn Lys Trp Tyr Asn Phe Asp Thr Phe Asn Gly Ala Met
305 310 315 320
Lys Thr Gly Phe Val Lys Ile Pro Glu Gln Asn Lys Thr Val Tyr Tyr
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340 345 350
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355 360 365
Leu Ile Thr Gly His Trp Tyr Leu Phe Asp Asn Asn Gly Ala Met Gln
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Gln Arg Gly Ile Gln Tyr Ile Pro Glu Glu Asn Lys Leu Val Tyr Tyr
450 455 460
Asn Gln Asp Gly Trp Met Leu Tyr Gly Lys Gln Asn Ile Asn Gly Val
465 470 475 480
Asp His Asn Phe Asn Thr Phe Asn Gly Ala Leu Glu Ala Lys Gly Gln
485 490 495
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500 505 510
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530 535 540
Asp Gly Asn Trp Tyr Leu Phe Ser Arg Ala Asn Gly Ser Met Gln Arg
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Gly Leu Gln Asn Val Asn Gly Val Asp Leu Leu Phe Asp Glu Lys Thr
565 570 575
Gly Ala Leu Leu Thr Gly Val Gln Asn Ile Lys Gly Asn Asn Tyr Phe
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595 600 605
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610 615 620
Asn Thr Leu Glu Asp Gln Tyr Lys Lys Gly Val Val Ser Gly Asn Val
625 630 635 640
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Leu Arg Pro Leu Leu Met Thr Trp Trp Pro Asn Glu Gln Ile Lys Ala
690 695 700
Asn Tyr Leu Asn Tyr Met Lys Asp Lys Gly Phe Ile Asn Asn Ser Gly
705 710 715 720
Thr Tyr Asn Ala Glu Ser Asp Pro Asn Tyr Met Asp Phe Ala Ala Gln
725 730 735
Glu Ala Gln Arg Asn Ile Glu Arg Lys Ile Thr Lys Glu Asn Asp Thr
740 745 750
Thr Trp Leu Arg Asp Leu Ile Thr Asp Phe Ile Lys Thr Gln Asp Ile
755 760 765
Trp Asn Glu Gln Ser Glu Gly Val Ser Thr Glu Gly Leu Gln Lys Phe
770 775 780
Gln Gly Gly Phe Leu Lys Tyr Val Asn Ser Glu Leu Thr Pro Tyr Ala
785 790 795 800
Asn Ser Glu Trp Arg Lys Leu Gly Tyr Gln Pro Thr Met Leu Thr Gln
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Asn Asn Val Gly Ala Glu Phe Leu Leu Ala Asn Asp Ile Asp Asn Ser
820 825 830
Asn Pro Val Val Gln Ala Glu Gln Leu Asn Trp Leu His Phe Leu Met
835 840 845
Asn Phe Gly Thr Ile Thr Ala Asn Asp Pro Ser Ala Asn Phe Asp Gly
850 855 860
Ile Arg Ile Asp Ala Val Asp Asn Val Asp Ala Ser Leu Leu Ser Ile
865 870 875 880
Ala Gly Asp Tyr Phe Lys Ala Ala Tyr Lys Val Gly Gln Asn Asp Ala
885 890 895
Thr Ala Asn Lys His Ile Ser Ile Leu Glu Asp Trp Asn Asp Lys Asp
900 905 910
Pro Glu Tyr Val Asn Ser Ile Gly Asn Pro Gln Leu Thr Met Asp Asp
915 920 925
Tyr Ile Val Gln Gln Leu Lys Phe Ser Leu Gly Gln Ala Pro Asp Lys
930 935 940
Val Asp Arg Met Gln Arg Phe Lys Glu Trp Tyr Leu Val Asp Arg Ser
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Lys Ala Leu His Ala Gly Gly Ile Gln Val Ile Ala Asp Trp Val
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Val Val Gly Glu Asn Val Leu Lys Lys Leu Asp Glu Ile Ile Thr
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Thr Gly Lys Thr Thr Leu Ile
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<210> 31
<211> 4674
<212> DNA
<213> 唾液链球菌
<400> 31
gaagaaacaa ataactctaa tggatcacct tcaacaacta cggtcgggga aaatacaaat 60
cctgtggttg aaaaagaggt aggcacaaca actgaggtag caaatacttc aaatgccaca 120
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tcaggaacaa ctacaagtga tagagctgta gcagtagagg ttgaagccaa acctgaaacg 240
actgctaagc cagaagttgc tactaaacca gaaacagcta caacatcaga agtcgctgca 300
aatgctggag tagctgctcc aacgactgag aagtctaaag agctttctga agccgaaatt 360
aaggctgcag tctcactcga taatattaaa aaagaaaaag atggtaaata ttactatctt 420
ttagaagatg gatcacacaa gaaaaacttt gccattactg taaatggtca ggtcctttat 480
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<210> 32
<211> 1557
<212> PRT
<213> 唾液链球菌
<400> 32
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Ser Asp Ser Thr Lys Trp Ala Asn Ser Asp Tyr Arg Lys Leu Asn Gln
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Gly Gln Ile Val Phe Gly Asp Lys Asp Lys Asp Ala His Phe Asp Gly
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Ile Arg Val Asp Ala Val Asp Asn Val Ser Val Asp Met Leu Gln Leu
420 425 430
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485 490 495
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500 505 510
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<211> 1338
<212> PRT
<213> 仓鼠链球菌
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Met Glu Lys Asn Leu Arg Tyr Lys Leu His Lys Val Lys Lys Gln Trp
1 5 10 15
Val Ala Ile Gly Val Thr Thr Phe Ala Val Gly Phe Leu Ala Gly Gly
20 25 30
Gln Val Val Ala Ala Asp Ala Thr Asp Gly Asn Gly Gly Asn Thr Gln
35 40 45
Val Ala His Leu Ile Pro Lys Glu Pro Thr Asp Tyr Lys Phe Asp Thr
50 55 60
Pro Ser Gly Ile Leu Thr Gly Leu Asn Phe Ala Asn Ala Gln Thr Ser
65 70 75 80
Pro Ala Gly Asp Asn Ala Gly Ala Asn Gln Pro Ala Gly Gly Ile Glu
85 90 95
Pro Gln Thr Ala Glu Asn Ala Ala Thr Asp Gly Gln Ala Val Pro Gln
100 105 110
Thr Ser Asp Gln Pro Gly His Leu Glu Asn Val Asp Gly Lys Thr Tyr
115 120 125
Tyr Val Asp Ala Asn Gly Gln Arg Leu Lys Asn Tyr Ser Thr Val Ile
130 135 140
Asp Gly Lys Thr Tyr Tyr Phe Asp Ala Gln Thr Gly Gln Ala Gln Ala
145 150 155 160
Glu Thr Pro Gln Ile Asn Gln Asn Asp Asn Gln Val Ala Pro Asp Thr
165 170 175
Tyr Ala Ala Asn Asn Gln Ala Phe Thr Asn Asp Val Ser Ser Phe Glu
180 185 190
Thr Val Asp Asn Tyr Val Thr Ala Asp Ser Trp Tyr Arg Pro Arg Lys
195 200 205
Ile Leu Lys Asn Gly Glu Ser Trp Gln Ala Ser Ala Glu Ser Asp Met
210 215 220
Arg Pro Ile Leu Met Thr Trp Trp Pro Asp Ala Ala Thr Lys Ala Ala
225 230 235 240
Tyr Ala Asn Tyr Trp Val Lys Glu Gly Leu Ile Ser Gly Ser Tyr Ser
245 250 255
Pro Asn Ser Ala Asn Leu Glu Thr Ala Val Gln Thr Ile Gln Ala Ala
260 265 270
Ile Glu Lys Lys Ile Ala Ser Glu Gly Ser Thr Ala Trp Leu Arg Asp
275 280 285
Lys Met Ser Gln Phe Val Lys Ser Gln Asn Gln Trp Ser Leu Ala Ser
290 295 300
Glu Asn Pro Thr Val Tyr Pro Asn Gln Asp His Leu Gln Gly Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Phe Ser Asn Asn Glu Ala Thr Ala His Ala Asn Ser Asp Trp
325 330 335
Arg Leu Leu Asn Arg Asn Pro Thr Phe Gln Thr Gly Lys Gln Lys Tyr
340 345 350
Phe Thr Thr Asn Tyr Ala Gly Tyr Glu Leu Leu Leu Ala Asn Asp Val
355 360 365
Asp Asn Ser Asn Pro Ile Val Gln Ala Glu Gln Leu Asn His Phe His
370 375 380
Tyr Leu Met Asn Trp Gly Glu Ile Val Met Gly Asp Lys Asn Ala Asn
385 390 395 400
Phe Asp Gly Val Arg Val Asp Ala Val Asp Asn Val Asn Ala Asp Leu
405 410 415
Leu Gln Ile Gln Arg Asp Tyr Tyr Lys Ala Lys Tyr Gly Val Asp Gln
420 425 430
Asn Glu Lys Asn Ala Ile Asp His Leu Ser Ile Leu Glu Ala Trp Ser
435 440 445
Gly Asn Asp Asn Asp Tyr Val Lys Asp Gln Asn Asn Phe Ser Leu Ser
450 455 460
Ile Asp Asn Ser Gln Arg Ser Tyr Met Leu Ala Ala Phe Ala Tyr Pro
465 470 475 480
Ala Ser Gln Arg Gly Asn Asp Tyr Ile Ser Leu Leu Pro Lys Val Gly
485 490 495
Leu Lys Asp Arg Arg Tyr Ala Lys Asn Gly Asn Pro Val Pro Asn Tyr
500 505 510
Val Phe Ile Arg Ala His Asp Ser Glu Val Gln Thr Arg Ile Ala Lys
515 520 525
Ile Ile Arg Glu Arg Leu Gly Lys Thr Asn Ala Asp Gly Leu Thr Asn
530 535 540
Ile Thr Leu Asp Asp Leu Asn Lys Ala Phe Asp Ile Tyr Asn Gln Asp
545 550 555 560
Met Lys Ala Val Asp Lys Gln Tyr Tyr Pro Asn Asn Leu Pro Met Ala
565 570 575
Tyr Ala Trp Met Leu Gln Asn Lys Asp Thr Val Thr Arg Val Tyr Tyr
580 585 590
Gly Asp Met Tyr Thr Asp Asp Gly Gln Tyr Met Glu Thr Lys Thr Pro
595 600 605
Phe His Asp Ala Ile Glu Thr Leu Leu Lys Ala Arg Ile Lys Tyr Val
610 615 620
Ala Gly Gly Gln Thr Ala Gly Tyr Val Gln Gly Trp Gly Ser Gly Ile
625 630 635 640
Leu Thr Ser Val Arg Tyr Gly Lys Gly Ala Asp Thr Ala Ile Asp Ala
645 650 655
Gly Thr Ala Glu Thr Arg Thr Ser Gly Met Ala Val Leu Ile Asn Asn
660 665 670
Lys Pro Asn Phe Gln Ser Tyr Asn Gly Leu Thr Leu Asp Met Gly Ala
675 680 685
Ala His Lys Asn Gln Ala Tyr Arg Pro Leu Leu Leu Ser Thr Lys Asp
690 695 700
Gly Ile Ala Thr Tyr Leu Asn Asp Ser Asp Val Ser Ser Asn Gln Tyr
705 710 715 720
Lys Tyr Thr Asp Gly Gln Gly Arg Leu Asn Phe Ser Ala Ser Glu Leu
725 730 735
Arg Ser Val Ala Asn Val Gln Val Ser Gly Met Ile Gln Val Trp Val
740 745 750
Pro Val Gly Ala Ala Asp Asn Gln Asp Val Arg Val Ala Pro Asn Thr
755 760 765
Asn Arg Asn Asn Ser Ser Asn Ile Tyr Thr Gln Ser Asp Ala Leu Asp
770 775 780
Ser Gln Val Ile Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Phe Gln Ala Phe Ala Lys
785 790 795 800
Thr Pro Glu Gln Tyr Thr Asn Ala Val Ile Ala Lys Asn Ala Asp Leu
805 810 815
Phe Lys Ser Trp Gly Ile Thr Gln Phe Glu Met Ala Pro Gln Tyr Val
820 825 830
Ser Ser Glu Asp Gly Thr Phe Leu Asp Ser Val Val Leu Asn Gly Tyr
835 840 845
Ala Phe Ser Asp Arg Tyr Asp Leu Ala Met Ser Lys Asn Asn Lys Tyr
850 855 860
Gly Ser Lys Glu Asp Leu Ala Asn Ala Ile Lys Gly Leu His Asn Ala
865 870 875 880
Gly Ile Lys Val Leu Ser Asp Trp Val Pro Asp Gln Met Tyr Asn Leu
885 890 895
Pro Gly Lys Glu Val Val Thr Ala Thr Arg Val Asp Gln Tyr Gly Arg
900 905 910
Pro Lys Ala Gly Ala Thr Ile Asn Arg Thr Pro Tyr Val Val Asn Thr
915 920 925
Lys Thr Tyr Gly Asp Tyr Gln Glu Gln Tyr Gly Gly Lys Phe Leu Asp
930 935 940
Glu Leu Gln Lys Leu Tyr Pro Ser Leu Phe Thr Thr Lys Gln Ile Ser
945 950 955 960
Thr Gly Lys Pro Ile Asp Pro Ser Val Lys Ile Thr Asn Trp Ser Ala
965 970 975
Lys Tyr Phe Asn Gly Ser Asn Ile Leu Gly Arg Gly Ala Lys Tyr Val
980 985 990
Leu Ser Asp Asn Asn Lys Tyr Leu Asn Leu Gly Ala Gly Gln Phe Phe
995 1000 1005
Leu Pro Thr Asn Leu Asn Asn Thr Tyr Gly Gln Pro Gln Ala Pro
1010 1015 1020
Ala Asn Gly Phe Ile Ser Lys Asn Gly Gly Ile His Tyr Ile Asp
1025 1030 1035
Asn Asn Gly Gln Glu Val Lys Asn Gln Phe Lys Glu Ile Ala Gly
1040 1045 1050
Ser Trp Tyr Tyr Phe Asp Ala Asn Gly Lys Met Ala Thr Gly Gln
1055 1060 1065
Thr Lys Ile Gly Asn Thr Thr Tyr Leu Phe Met Pro Asn Gly Lys
1070 1075 1080
Gln Leu Lys Glu Gly Val Trp Tyr Asp Gly Lys Lys Ala Tyr Tyr
1085 1090 1095
Tyr Asp Asp Asn Gly Arg Thr Trp Thr Asn Lys Gly Phe Val Glu
1100 1105 1110
Phe Lys Val Asn Gly Gln Asp Lys Trp Arg Tyr Phe Asn Gly Asp
1115 1120 1125
Gly Ser Ile Ala Val Gly Leu Val Ser Leu Asp Asn Arg Thr Leu
1130 1135 1140
Tyr Phe Asp Ala Tyr Gly Tyr Gln Val Lys Gly Gln Thr Leu Thr
1145 1150 1155
Ile Asn Gly Lys Thr Tyr Ser Phe Asp Ala Asn Glu Gly Asp Leu
1160 1165 1170
Ile Thr Gly Asn Thr Pro Ser Pro Glu Pro Asn Asn Gln Gly Ala
1175 1180 1185
Trp Glu Ala Leu Gly Asp Asn Gln Trp Gly Tyr Arg Lys Asp Gly
1190 1195 1200
Lys Leu Leu Thr Gly Ser Gln Thr Ile Ala Gly Gln Lys Val Phe
1205 1210 1215
Phe Gln Pro Asn Gly Val Gln Val Lys Gly Gly Thr Ala Lys Asp
1220 1225 1230
Glu Ala Gly Val Leu Arg Phe Tyr Asp Arg Asp Gln Gly His Leu
1235 1240 1245
Ala Gly Lys Gly Trp Tyr Ser Thr Ala Asp Asn Asn Trp Val Tyr
1250 1255 1260
Val Asp Asp Ala Gly Arg Val Val Thr Gly Leu Gln Lys Ile Gly
1265 1270 1275
Ser Gln Thr Leu Tyr Phe Asp Asp Asn Gly Ile Gln Ala Lys Gly
1280 1285 1290
Lys Ala Ile Trp Asp Lys Asp Gly Asn Leu Arg Tyr Phe Ala Ala
1295 1300 1305
Gly Ser Gly Asp Met Ile Thr Asn Arg Trp Tyr Asn Ile Gly Asp
1310 1315 1320
Asn Gln Trp Tyr Trp Phe Asn Asn Gln Gly Ile Ala Ser Arg Trp
1325 1330 1335
<210> 34
<211> 4914
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码成熟GTF9905的密码子优化的序列
<400> 34
gatgattcac aacaaagctc tacacaaatc caaagcacac aagtgacgac agcgttaccg 60
gcgggcggcc aatattctac gacgaacgga ggacaatctt ggaattacct ggtgaacggg 120
gtcgcgatta aaggcatgta tcaagatggc caaggccaac ttcggtattt taattttatc 180
gatggaacac aagttaaagg tgaatttttg agcattaatg gcacgtatta ttattttgat 240
caaaatagtg gagaaggaca tctggttcct acacaatcta atggccatta tacagaaatc 300
ggcaatacgg gagcgtgggg ctatcaaaat tctaacggag aactggtgaa aggcatccaa 360
aatatcgatg gccaacttcg ctattttgat gaaaatacag gaaatcaagt gaaaggcggc 420
tcagcgacga ttggcaacaa aagctattat tttgaaccga gccaaggaac actgacaacg 480
acgatcgatc aagtttctga tgcgcaaaat gcgaatatcc ggggccttgc gacagtgaat 540
gggcaactta attattttga tcctacaacg ggagaacaag cgaaacataa acaagttgcg 600
acgaatggcg cgacgtatta ttttaatgat agcggcgtcg gcacatatct gtttacgaat 660
gtccaaaata cacctgcgaa tgatgtgagc caacataatg cagtcaattc tacggatacg 720
aaagattata cgaatacagt cgatggcttt cttacagcgg atacgtggta tagacctaaa 780
tatatcttag ataacggcga aaattggagg gcgtctaatg agggcgaata tcgcccgttt 840
atcatgaatt ggtggcctaa caaaaatgtc gaagttaatt atctgaaact tatgcaaaac 900
aacaatctgc tgagctctac agttcaatat gatttgttta cggatcaagc gatcctgaat 960
caagcagcat atcaagcgca aattgcaatt gaaaaacgca ttaaatctga aggctctacg 1020
gattggctga atacactgct gtttggcggc gatgattctc atccgagctt tgttaaacaa 1080
cagtttatct ggaactcaga ttcagaaagc ccttggcaag gggatgcgtg gtttcagggg 1140
ggctatctta aatatggcaa ttctgtcatg acaccgacgt ctaatagcaa ttatagacaa 1200
gcaggcaatg cgtttgattt tctgcttgcg aatgatgtcg ataatcaaaa tccgatcgtc 1260
caagcagaag atcttaattg gttgtattat cttatgaatt ttggctctat cacgacgaat 1320
ggtctggata atgattctaa ttttgattct attcggttag atgcagtcga ttttatccat 1380
aatgatgcga tccaacgtac atatgattat cttcgccaag cgtttaatct gacgaaaaac 1440
gaggcgacag cgaatcaaca tctgagcctg gttgaagcag gcgtcgatgc aggaacaacg 1500
acgtataatt cagatggact tatcgaaagc aatattcgcc cgcttgcgac ggatagcctg 1560
acgaatgcac cgggcaaaaa tgcgagcctt tctaatctga ttaaagatgt cgatagcgga 1620
gaagtcattg cagatcatgc gaattttagc acggatgatg gcatccctaa ttatagcatc 1680
atccatgcac atgataaagg catccaagaa aatgtcggcg cggcgatcac agcagcgacg 1740
ggcgcggatt ggacgaattt tacgacagaa caacttgaac aaggcttaga tctgtattat 1800
caagatcaac gctctacgaa taagaaatat aatatctata acttgccgag catctatgca 1860
cttatgttga cgaataaggg aacggtgcct agagtgtatt atggagatat gtatcaagat 1920
aatggccaat atatgcaaca aaaatctctg tattatgatg cgattagctc acttatgaca 1980
gcgcgtaaac aatatgtcgc gggaggccaa acgatgtctg tcgatgaaaa cggactgctt 2040
aaatcagttc gctttggcaa aaatgcaatg acagcacaag atacagggga cgcagaaaca 2100
cgcacagaag gggtgggagt catcattggc aatgatcctt cagtgaaagt cgcggatggc 2160
caaacggtga cgttagatat gggcgcagca cataaaaatc aagcgtatag accgttgatc 2220
ctgacgacgt cagatggcat ccaaacgtat gatagcgatg aaaatgcacc ggttgtgtat 2280
acggatgata atggcattct tacattttct aatcaagata tcaatggcca agcgaatacg 2340
aaaattgtcg gcacgctgaa tcctcaagtc tcaggctatc ttgcagtgtg ggttccggtc 2400
ggcgcatctg cggatcaaga tgcacgcaca gcgccgagca cgcaaagcac gaatgatggc 2460
aaagtgcttc atacaggcgc agcactggat tctaatctta tctttgaagg cttttctaat 2520
tttcaaccta tgccgacaac gcatgatgaa atgacaaatg ttgtcatctc acaaaatgcg 2580
tctcaatttg cgaaatgggg catcacgagc tttgaaatgg cgcctcaata tcgtagctca 2640
gaagatcata gctttttaga ttctacgatc gataatggct atgcgttttc agatcgctat 2700
gatctgggct ttggaacacc tacgaaatat ggaacggatg aagatcttcg taatgcgatt 2760
aaagcgctgc atcaaaatgg catgcaagtc atggcggatg ttgtcatgaa tcaactgtat 2820
agcctgaatg gcaaagaagt ggtgagcgcg tctcgtgcgg gagtgtatgg caatgatgtc 2880
gatcttccgt ttggaacgca actgtatgtc gttaatacga cgggcggcgg agaatatcag 2940
aaaaaatatg gaggcgcgtt tctgaatatc attaaagaaa aatatcctac gctgtttgat 3000
tcagaaagct atgattatta tcttaaaaat tattcagata atggccatgg acctgcgtat 3060
atgacgacgg cgacagcgac acgggaagcg atcccgtcag atcaaccgct taaagaatgg 3120
tctgcgaaat atatgaacgg cacgaatatc ctgggactgg gcatgggcta tgtgcttaaa 3180
gattggaata acggcgcgta ttttaaactt tcaggaacgg atacgacact gccgcaaagc 3240
cttgttgcac ttacaggctg gaatcaaaat gatgatggaa cgtggtcata ttatagcacg 3300
gatacagatg atcgtgtcac gggcaaacaa gtcatcgatg gccgcacgtt actgtttgat 3360
aatcaaggca atcaaattaa aggcggctgg ggagaaaatc cggatggaac gtggtcatat 3420
tataatgcgg atacggggga tcgggtcatc ggagaacaag tcatcgatgg ccgtacattg 3480
ttctttgata atcaaggcgt ccaagttaaa ggcggatggg gagaaaatta tgatggaacg 3540
tggtcttatt ataatgcaga tacaggcgat agagtgacag gcaaacaagt catcgatggc 3600
cgtacgctgt tgtttgataa tagaggcgtc caagttaaag ggggctgggg agaaaattca 3660
gatggaacgt ggtcatatta taatgcagat actggcgata gagtcacggg caatcaactg 3720
atcggcggcc gtaacttgct gtttgataat caaggcaatc aaattaaagg cggctgggat 3780
gaaaatccgg atggcacgtg gtcatattat aatgcagata cgggagatcg tgtgacggga 3840
gtccaagtca ttgatggcaa acaactgctg tttgatagca atggcattca agttaaaaat 3900
agctggcaga agaacgcgaa tggcacatgg tcatattatg atgcgaatga tggccacctt 3960
gttcctgcga atagctctaa tgatggcacg agctcttcta cacaagattc aggcaacaaa 4020
agcaatcaaa atccgtctag ctctagcaat gcagttaaca aaacaacggg ctggattaaa 4080
aattcagatg gaacgtggtc atatctgagc gcgaaaagcg gccaaaaagt tacaggaagc 4140
caaacgatcg atggcaaaca actgttgttt gatgatcatg gagtccaaat taagggtggc 4200
tggggcaaaa atgcggatgg aacgtggtca tattatgatg cgaatagcgg agaacttacg 4260
tctacgtcag atatgtctaa tgtgaatcct caacaaacga caacgacgac gaatgagcaa 4320
tctacgacga atcaacctac ggatatcacg aaaaattcag atggagtgta tgtgtataag 4380
aatgattcta acaagaaagc acaaggctat cttaatgatg gaagctcttg gaaatggttt 4440
aatgatggcc aactgtatac gggctttcaa aattatatgg gcgcgtatta ttattttatc 4500
aatggcatcc gccaacaaaa tcaatgggaa aatatctggg gacttaaata ttatgtggga 4560
gatgatggcc gtacggtcga aggcatccat gcgatcgatg gacatgcgta tgattttggc 4620
acggatggaa cgtttaatgt taaaggctca gcgtcaggct atttgaatga tggcaaatct 4680
tggatgtggt atgaaggcgg caatccgtat acaggctttc ggtattatat ggatacgtat 4740
tattggtttg aaaatggtgt tagacaagat aatgcgtggc atcaagcgtg gggacttaca 4800
tattatacgg gcgcagatgg acgcgcggtc cagggtgtcc aaaatatcaa tggcaaactg 4860
tattattttg gcaatgatgg aacatttttc atgcgtacga atcaagaagt gtga 4914

Claims (13)

1.一种生产包含α-1,2键的葡聚糖组合物的方法，所述方法包括：
(a) 至少提供以下反应组分：水、蔗糖、包含至少70% α-1,6键的α-葡聚糖底物和能够从所述α-葡聚糖底物的1,6连接的葡萄糖形成至少一个α-1,2分支的多肽，其中所述多肽包含与以下相同的氨基酸序列：
(i) SEQ ID NO: 4的成熟形式；
(ii) SEQ ID NO: 4的位置36至1115；或
(iii) SEQ ID NO: 4；
(b) 在合适的条件下组合所述反应组分，由此所述多肽催化从所述α-葡聚糖底物的1,6-连接的葡萄糖合成至少一个α-1,2分支，从而形成包含一个或多个α-1,2键的葡聚糖组合物；以及
(c) 任选地分离包含一个或多个α-1,2键的葡聚糖组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述α-葡聚糖底物具有至少3的聚合度。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述α-葡聚糖底物包含至少80% α-1,6键。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述α-葡聚糖底物包含至少90% α-1,6键。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述α-葡聚糖底物包含至少95% α-1,6键。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述α-葡聚糖底物包含100% α-1,6键。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述多肽包含与所述SEQ ID NO: 4的成熟形式相同的氨基酸序列，且其中所述成熟形式包含SEQ ID NO: 4的位置36至1672。
8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述多肽包含与SEQ ID NO: 4的位置36至1115相同的氨基酸序列。
9.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述α-葡聚糖底物具有8至500的聚合度。
10.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述α-葡聚糖底物具有至少50的聚合度。
11.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述α-葡聚糖底物和蔗糖以0.01 : 1和1 : 0.01之间的比例存在于 (b) 中，所述比例包含端值。
12.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述反应组分进一步包含α-葡聚糖水解酶。
13.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其包括分离所述葡聚糖组合物。
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