BR112018010683B1 - Método para produzir uma composição de glucano - Google Patents

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Robert DiCosimo
Jahnavi Chandra Prasad
Zhengdong Zhang
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Abstract

COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA COMPOSIÇÃO, MÉTODO QUE COMPREENDE ADMINISTRAR POR VIA ENTERAL UMA SUBSTÂNCIA E MÉTODO PARA PRODUZIR UM PRODUTO. São divulgadas no presente pedido proteínas capazes de formar glucanos que têm ligações/ramificações alfa-1,2, reações e métodos para produzir este glucano, composições que compreendem este glucano, e várias aplicações dos mesmos.

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício dos pedidos de patentes internacionais PCT/CN2015/095687 (depositado em 26 de novembro de 2015) e PCT/CN2016/085547 (depositado em 13 de junho de 2016), ambos integralmente incorporados ao presente pedido como referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A divulgação refere-se, por exemplo, a proteínas que são capazes de formar glucano que tem ligações alfa-1,2, reações e métodos para produzir este glucano, composições que compreendem este glucano, e várias aplicações de uso deste glucano.
REFERÊNCIA À LISTA DE SEQUÊNCIAS APRESENTADA ELETRONICAMENTE
[003] A cópia oficial da lista de sequências é submetida eletronicamente através de EFS-Web como uma lista de sequências formatada ASCII com um arquivo denominado 20161122_CL6550WOPCT3_SequenceListing.txt, criado em segunda-feira, 21 de novembro de 2016, e tem um tamanho de 413 kilobytes e está atualmente depositada com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida nesse documento formatado ASCII é parte do relatório descritivo e é integralmente incorporada ao presente pedido como referência.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[004] A adição enzimática de ramificação alfa-1,2 a dextranos foi relatada. Uma glicosiltransferase (DsrE) de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299 tem um segundo domínio catalítico (“CD2”) capaz de adicionar a ramificação alfa-1,2 a dextranos (patentes US 7439049 e 5141858; publicação de pedido de patente US 2009-0123448; Bozonnet et al., J. Bacteriol.184:5753- 5761, 2002). A publicação de pedido de patente US 2010-0284972 descreve métodos e composições para melhorar a saúde de um sujeito administrando composições que compreendem dextranos alfa-1,6 ramificados alfa-1,2. Sarbini et al. (Appl. Environ. Microbiol. 77:5307-5315, 2011) descreve a fermentação in vitro de dextrano e dextranos ramificados alfa-1,2 pela microbiota fecal humana. Brison et al. (J. Biol. Chem. 287:7915-7924, 2012) descreve uma forma truncada da glicosiltransferase DsrE de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299 (um domínio de ligação de glucano (CGD) acoplado ao segundo domínio catalítico, CD2 (isto é, GBD-CD2)) que é capaz de adicionar a ramificação alfa-1,2 a dextranos. Apesar destes relatórios, há ainda uma necessidade para identificar outras enzimas que são capazes de produzir glucanos que têm ligações alfa-1,2.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[005] Em um aspecto, a presente divulgação refere-se a uma composição de reação que compreende pelo menos água, sacarose, um substrato de alfa-glucano e um polipeptídeo que é capaz de formar pelo menos uma ramificação alfa-1,2 a partir do substrato de alfa-glucano, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica a: (i) a forma madura de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13; (ii) SEQ ID NO: 27 ou uma subsequência dentro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 que se alinha com SEQ ID NO: 27; e/ou (iii) uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13.
[006] A presente divulgação também se refere a um método para produzir uma composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2, o método compreendendo: (a) fornecer pelo menos os seguintes componentes de reação: água, sacarose, um substrato de alfa-glucano e um polipeptídeo que é capaz de formar pelo menos uma ramificação alfa-1,2 a partir do substrato alfa-glucano, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica a: (i) a forma madura de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13; (ii) SEQ ID NO: 27 ou uma subsequência dentro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 que se alinha com SEQ ID NO: 27; e/ou (iii) uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13; (b) combinar os componentes de reação sob condições adequadas através das quais o polipeptídeo catalisa a síntese de pelo menos uma ramificação alfa-1, 2 do substrato alfa-glucano, formando assim uma composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2; e (c) opcionalmente isolar a composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2.
[007] A presente divulgação também se refere a uma composição que compreende uma composição de glucano compreendendo uma ou mais ligações alfa-1,2 produzidas por um método ou reação, conforme descrito no presente pedido, preferencialmente em que a composição está sob a forma de um produto alimentício, produto farmacêutico, produto para cuidados pessoais, produto para cuidados domésticos ou produto industrial, opcionalmente em que a composição compreende cerca de 0,01 a 99%, em peso, (com base em sólidos secos) da composição de glucano.
[008] A presente divulgação também se refere a um método que compreende administrar por via enteral uma substância a um mamífero, em que a substância compreende uma composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2, em que a administração resulta em elevação menor ou mais lenta de glicose no sangue do mamífero, em comparação a um mamífero que é administrado por via enteral com uma substância que é desprovida da composição de glucano mas, ao invés disso, contém a mesma quantidade de um carboidrato contendo glicose facilmente digerível, em que a composição de glucano é produzida por um método ou reação, conforme descrito no presente pedido, opcionalmente em que o mamífero é um humano, e opcionalmente em que o carboidrato contendo glicose facilmente digerível é sacarose, glicose livre ou amido.
[009] A presente divulgação também se refere a um método para produzir um alimento ou bebida, o método compreendendo incorporar uma composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2 no alimento ou bebida, em que o índice glicêmico do alimento ou bebida resultante não é aumentado, ou apenas ligeiramente aumentada, em comparação a um alimento ou bebida desprovido da composição de glucano, e em que a composição de glucano é produzida por um método ou reação, conforme descrito no presente pedido.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS BIOLÓGICAS
[010] A identificação (gi) e números de acesso fornecidos abaixo são do GENEBANK (disponíveis no website do National Center for Biotechnology Information (NCBI)).
[011] SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácidos da GTFJ18 inteira (gi antigo: 356644413, gi novo: 504090610, n° de acesso WP_014324604.1, Leuconostoc mesenteroides). Acredita-se que a forma secretada madura predita de GTFJ18 corresponda às posições 21-2771 de SEQ ID NO: 1. SEQ ID NOs: 1 e 13 são idênticas.
[012] SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos de gi: 116096814 (n° de acesso no GENBANK ABJ61965.1, Leuconostoc mesenteroides; também citado no presente pedido como GTF6814). Acredita-se que a forma secretada madura predita de GTF6814 corresponda às posições 21- 2821 de SEQ ID NO: 2.
[013] SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácidos de gi: 916260333 (n° de acesso no GENBANK WP_050995379.1, Leuconostoc carnosum; também citada no presente pedido como GTF0333). Acredita-se que a forma secretada madura predita de GTF0333 corresponda às posições 41-2844 de SEQ ID NO: 3.
[014] SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácidos de gi: 902949905 (n° de acesso no GENBANK GAP05007.1, Fructobacillus tropaeoli; também citado no presente pedido como GTF9905 ou FtrGtf1). Acredita-se que a forma expressa predita (contemplada para ser uma forma madura secretada) de GTF9905 corresponda às posições 36-1672 de SEQ ID NO: 4.
[015] SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos de gi: 938153845 (n° de acesso no GENBANK WP_054608463.1, Lactobacillus kunkeei; também citado no presente pedido como GTF3845). Acredita-se que a forma secretada madura predita de GTF3845 corresponda às posições 51-1632 de SEQ ID NO: 5.
[016] SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácidos de gi: 938153846 (n° de acesso no GENBANK WP_054608464.1, Lactobacillus kunkeei; também citado no presente pedido como GTF3846). Acredita-se que a forma secretada madura predita de GTF3846 corresponda às posições 51-1318 de SEQ ID NO: 6.
[017] SEQ ID NO: 7 é a sequência de aminoácidos de gi: 927068954 (n° de acesso no GENBANK KOY70706.1, Lactobacillus kunkeei; também citado no presente pedido como GTF8954). Acredita-se que a forma secretada madura predita de GTF8954 corresponda às posições 51-1139 de SEQ ID NO: 7.
[018] SEQ ID NO: 8 é a sequência de aminoácidos de gi: 927268464 (n° de acesso no GENBANK WP_053795842.1, Lactobacillus kunkeei; também citado no presente pedido como GTF8464). Acredita-se que a forma secretada madura predita de GTF8464 corresponda às posições 51-1463 de SEQ ID NO: 8.
[019] SEQ ID NO: 9 é a sequência de aminoácidos de gi: 908395133 (n° de acesso no GENBANK WP_049752804.1, Leuconostoc mesenteroides; também citado no presente pedido como GTF5133). Acredita-se que a forma secretada madura predita de GTF5133 corresponda às posições 412841 de SEQ ID NO: 9.
[020] SEQ ID NO: 10 é a sequência de aminoácidos de gi: 935566432 (n° de acesso no GENBANK WP_054450649.1, Lactobacillus kunkeei; também citado no presente pedido como GTF6432). Acredita-se que a forma secretada madura predita de GTF6432 corresponda às posições 46-2580 de SEQ ID NO: 10.
[021] SEQ ID NO: 11 é a sequência de aminoácidos de gi: 916985575 (n° de acesso no GENBANK WP_051592287.1, Lactobacillus kunkeei; também citado no presente pedido como GTF5575). Acredita-se que a forma secretada madura predita de GTF5575 corresponda às posições 51-1463 de SEQ ID NO: 11.
[022] SEQ ID NO: 12 é a sequência de aminoácidos de gi: 407242790 (n° de acesso no GENBANK AFT82440.1, Leuconostoc carnosum JB16; também citado no presente pedido como GTF2790). Acredita-se que a forma secretada madura predita de GTF2790 corresponda às posições 21-2824 de SEQ ID NO: 12.
[023] SEQ ID NO: 13 é a sequência de aminoácidos de gi: 504090610 (n° de acesso no GENBANK WP_014324604.1, Leuconostoc mesenteroides; também citado no presente pedido como GTF0610). Acredita-se que a forma secretada madura predita de GTF0610 corresponda às posições 212771 de SEQ ID NO: 13.
[024] SEQ ID NO: 14 é a sequência de DNA que codifica GTFJ18 inteira (SEQ ID NO: 1).
[025] SEQ ID NO: 15 é a sequência de DNA de nucleotídeos 846926-855391 de gb: CP000414.1, e codifica GTF6814 (SEQ ID NO: 2).
[026] SEQ ID NO: 16 é a sequência de DNA da sequência complementar para os nucleotídeos 1620046-1611512 de gb: CP003851.1, e codifica GTF0333 (SEQ ID NO: 3).
[027] SEQ ID NO: 17 é a sequência de DNA de nucleotídeos 237-5252 de gi: 850934366 e codifica GTF9905 (SEQ ID NO: 4). SEQ ID NO: 34 é uma sequência códon-otimizada que codifica a forma expressa de GTF9905 (SEQ ID NO: 4).
[028] SEQ ID NO: 18 é a sequência de DNA da sequência complementar para os nucleotídeos 13658-8760 de gb: JXDF01000026.1, e codifica GTF3845 (SEQ ID NO: 5).
[029] SEQ ID NO: 19 é a sequência de DNA da sequência complementar de nucleotídeos 17742-13786 de gb: JXDF01000026.1, e codifica GTF3846 (SEQ ID NO: 6).
[030] SEQ ID NO: 20 é a sequência de DNA da sequência complementar para os nucleotídeos 99099-95680 de gb: JXCW01000006.1, e codifica GTF8954 (SEQ ID NO: 7).
[031] SEQ ID NO: 21 é a sequência de DNA da sequência complementar para os nucleotídeos 23080-18689 de gb: JXCU01000040.1, e codifica GTF8464 (SEQ ID NO: 8).
[032] SEQ ID NO: 22 é a sequência de DNA de nucleotídeos 846866-855391 de gb: CP000414.1, e codifica GTF5133 (SEQ ID NO: 9).
[033] SEQ ID NO: 23 é a sequência de DNA da sequência complementar para os nucleotídeos 7742-3 de gb: JXDB01000011.1, e codifica GTF6432 (SEQ ID NO: 10).
[034] SEQ ID NO: 24 é a sequência de DNA da sequência complementar para os nucleotídeos 4456-65 de gb: AZBY01000038.1, e codifica GTF5575 (SEQ ID NO: 11).
[035] SEQ ID NO: 25 é a sequência de DNA da sequência complementar para os nucleotídeos 1619986-1611512 de gb: CP003851.1, e codifica GTF2790 (SEQ ID NO: 12).
[036] SEQ ID NO: 26 é a sequência de DNA de nucleotídeos 845078-853513 de gb: CP003101.3, e codifica GTF0610 (SEQ ID NO: 13).
[037] SEQ ID NO: 27 é a sequência de aminoácidos de GTFJ18T1, que representa uma forma truncada N-terminal (primeiros resíduos 1664 removidos) de GTFJ18 (SEQ ID NO: 1).
[038] SEQ ID NO: 28 é a sequência de aminoácidos da CD2 de GTFJ18.
[039] SEQ ID NO: 29 é uma sequência de nucleotídeos códon- otimizada que codifica GTF8117 madura (SEQ ID NO: 30) (com uma metionina inicial adicionada) da proteína KCTC 3501 de Lactobacillus animalis de n° de acesso no GENBANK KRM57462.1.
[040] SEQ ID NO: 31 é uma sequência de nucleotídeos que codifica GTF6831 madura (SEQ ID NO: 32) da proteína M18 de Streptococcus salivarius de n° de acesso no GENBANK WP_004182667.1.
[041] SEQ ID NO: 33 é a sequência de aminoácidos de GTF5604, que é derivada de Streptococcus criceti HS-6 (n° de acesso no GENBANK® WP_004226213.1, antigo gi: 357235604; também citada como glicosiltransferase SG1018 ou GtfHS6). A forma madura de GTF5604 é predita para começar na posição de aminoácido 37.
[042] SEQ ID NO: 34 é uma sequência códon-otimizada que codifica a forma expressa de GTF9905 (SEQ ID NO: 4).
DESCRIÇÃO DETALHADA
[043] As divulgações de todas as patentes citadas e literaturas não patentes são integralmente incorporadas ao presente pedido como referência.
[044] Os artigos “um”, “uma” e “o/a” antes de um elemento ou componente têm a intenção de ser não restritivo em relação a uma série de exemplos (isto é, ocorrências) do elemento ou componente. Portanto “um”, “uma” e “o/a” deveriam ser interpretados como incluindo uma ou pelo menos uma, e a forma da palavra no singular do elemento ou componente também inclui o plural, a menos que o número tenha a intenção de estar no singular de forma óbvia.
[045] Quando presente, todas as faixas são inclusivas e combináveis. Por exemplo, quando uma faixa de “1 a 5” é dita, a faixa deve ser entendida como incluindo faixas de “1 a 4”, “1 a 3”, “1 a 2”, “1 a 2 e 4 a 5”, “1 a 3 e 5”, e similares.
[046] Os termos “alfa-glucano”, “polímero alfa-glucano” e similares são usados de forma intercambiável no presente pedido. Um alfa-glucano é um polímero que compreende unidades monoméricas de glicose ligadas juntas por ligações glicosídicas alfa (também pode ser citada como ligações alfa- glicosídicas).
[047] Os termos “ligação”, ligações glicosídicas”, “pontes glicosídicas”, e similares referem-se às ligações covalentes que conectam os monômeros de açúcar dentro de um composto sacarídeo (oligossacarídeos e/ou polissacarídeos). Exemplos de ligações glicosídicas incluem oligômeros de glicose α-ligados com ligações D-glicosídicas alfa-1,6 (no presente pedido também citadas como ligações “alfa-1,6”); ligações D-glicosídicas alfa-1,3 (no presente pedido também citadas como ligações “alfa-1,3”); ligações D- glicosídicas alfa-1,4 (no presente pedido também citadas como ligações “alfa- 1,4”; ligações D-glicosídicas alfa-1,2 (no presente pedido também citadas como ligações “alfa-1,2”); e combinações dessas ligações tipicamente associadas com oligômeros de sacarídeos ramificados.
[048] Os termos “glicosiltransferase”, “enzima glicosiltransferase”, “GTF”, “glucano-sacarase” e similares são usados de forma intercambiável no presente pedido. A atividade de uma glicosiltransferase no presente pedido catalisa a reação do substrato de sacarose para produzir os produtos alfa- glucano e frutose. Alguns subprodutos de uma reação de glicosiltransferase podem incluir glicose e/ou leucrose, por exemplo. Formas tipo selvagem de enzimas glicosiltransferase geralmente contêm (na direção N-terminal para C- terminal) um peptídeo sinal, um domínio variável, um domínio catalítico e um domínio de ligação de glucano. Um exemplo de uma glicosiltransferase no presente pedido, é uma enzima de ramificação 1,2.
[049] Os termos “composição de reação”, “reação enzimática”, “reação de glicosiltransferase”, “reação de síntese de glucano”, e similares são usados de forma intercambiável no presente pedido e geralmente se referem a uma reação que inicialmente compreende água, sacarose, pelo menos uma enzima glicosiltransferase ativa e, opcionalmente outros componentes. Para uma composição de reação de ramificação 1,2 no presente pedido, outro componente que está incluído é um substrato de alfa-glucano. Componentes que podem estar ainda presentes em uma reação de glicosiltransferase tipicamente após ter iniciado incluem os produtos de frutose e alfa-glucano, e opcionalmente subprodutos como a glicose e leucrose. Seria entendido que em realizações nas quais uma glicosiltransferase tem atividade de ramificação 1,2, os produtos de alfa-glucano podem representar o material com ramificação 1,2 sintetizado pela enzima, e/ou o próprio produto alfa-glucano inteiro (isto é, o substrato de alfa- glucano com ramificações 1,2 adicionadas). O termo “sob condições adequadas”, como usado no presente pedido, refere-se a condições de reação que suportam a conversão de sacarose para produtos frutose e alfa-glucano através de atividade da enzima glicosiltransferase.
[050] O termo “polipeptídeo que é capaz de formar pelo menos uma ramificação alfa-1,2 a partir de um substrato de alfa-glucano” refere-se a uma glicosiltransferase cataliticamente ativa (ou fragmento ativo da mesma) capaz de introduzir uma ou mais ligações glicosídicas alfa-1,2 (com o uso de sacarose como substrato adicional) a um substrato de alfa-glucano (ou “esqueleto de alfa- glucano”) através de uma ou mais ramificações (também pode ser citada no presente pedido como uma “enzima de ramificação 1,2” ou com outros termos similares). Acredita-se que o polipeptídeo adicione um grupo de glicose por ramificação. Em certas realizações, esse polipeptídeo é uma glicosiltransferase truncada que inclui um domínio catalítico capaz de realizar ramificação alfa-1,2 a partir de um substrato de alfa-glucano. Seria reconhecido por um técnico no assunto que esses truncamentos podem incluir a deleção de aminoácidos em uma ou outra, ou ambas as direções N e C-terminal em relação ao domínio catalítico capaz de adicionar a ramificação alfa-1,2 que estão presentes em uma sequência tipo selvagem. Por exemplo, truncamentos N-terminais podem ser produzidos a partir de genes que codificam uma glicosiltransferase iniciando a partir de um códon de iniciação, e truncamentos C-terminais podem ser produzidos a partir de genes que codificam uma glicosiltransferase terminando em um códon de parada prematuro. Em certas realizações, um polipeptídeo inclui pelo menos um domínio de ligação de glucano em adição ao domínio catalítico. Em certas realizações, um polipeptídeo é uma glicosiltransferase truncada que inclui um domínio catalítico capaz de adicionar ramificação alfa-1,2 a um esqueleto de substrato de alfa-glucano isoladamente ou em combinação com um domínio de ligação de glucano e que não inclui um domínio capaz de sintetizar ligações exceto ligações glicosídicas alfa-1,2.
[051] Um “substrato de alfa-glucano” ou “esqueleto de alfa- glucano” (e termos similares), como citado no presente pedido, podem compreender (i) ligações glicosídicas alfa-1,6 ou (ii) alfa-1,6 e alfa-1,3, por exemplo, e tipicamente tem um grau de polimerização (DP) de pelo menos 3 e é tipicamente solúvel em água. Em realizações típicas, um substrato de alfa- glucano é capaz de ser modificado (isto é, a adição de pelo menos uma ligação glicosídica alfa-1,2) sob condições de reação aquosa por um polipeptídeo que tem atividade de ramificação alfa-1,2 na presença de sacarose. “Beta-glucano” é tipicamente excluído como sendo parte de um substrato de alfa-glucano no presente pedido.
[052] Uma “ramificação alfa-1,2” (e termos similares), como citado no presente pedido, pode ser a partir de um esqueleto de substrato de alfa- glucano no presente pedido, por exemplo. Quando uma ramificação alfa-1,2 origina-se a partir de uma glicose 1,6-ligada de um esqueleto, essa ligação 1,2 também pode ser citada como alfa-1,2,6. Uma ramificação que é alfa-1,2-ligada a um esqueleto de alfa-glucano no presente pedido tipicamente tem um grupo de glicose (pode opcionalmente ser citada como uma glicose pendente). O percentual de ramificação 1,2 em um glucano no presente pedido refere-se àquela porcentagem de todas as ligações no glucano que representam pontos de ramificação 1,2 (por exemplo, 1,2,6).
[053] No presente pedido, “alfa 1,3,6” refere-se a um ponto de ramificação no qual a glicose de ramificação é alfa-1,3-ligada a um monômero de glicose 1,6-ligado de um esqueleto.
[054] Um produto de glucano de uma reação de ramificação 1,2 no presente pedido (por exemplo, “composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2”, composição de glucano alfa-1,2 ramificado, “um glucano no presente pedido” e termos similares) pode ser caracterizado, por exemplo, em termos de (i) qualquer substrato de alfa-glucano no presente pedido mais (ii) qualquer ramificação 1,2 adicionada no presente pedido.
[055] Os termos “madura”, “secretada”, “secretada madura” e similares são usados de forma intercambiável no presente pedido. Uma proteína madura é aquela que pode passar através da membrana celular de uma célula, particularmente uma célula bacteriana. Uma proteína madura, em alguns aspectos, resulta da remoção pós-tradução (clivagem para fora) de uma “sequência sinal” (ou “peptídeo sinal”) da terminação N da forma imatura da proteína (pré-processada). Uma sequência sinal tipicamente direciona uma proteína imatura para a membrana celular, e é removida da proteína durante o trânsito da mesma através da membrana (isto é, durante o processo de secreção de proteína). Expressão heteróloga no presente pedido de uma proteína madura pode empregar uma sequência sinal, no caso do provável objetivo ser a secreção da proteína para o meio. Alternativamente, a expressão heteróloga pode empregar expressar uma proteína projetada para já ser desprovida de sua sequência sinal (uma metionina de partida é tipicamente adicionada à terminação N nessas realizações); essa expressão de proteína madura tipicamente acarreta em lisar células para liberar a proteína, uma vez que não é secretada. Uma sequência sinal no presente pedido pode ser tanto nativa como heteróloga em relação à proteína com a qual ela é opcionalmente empregada.
[056] O termo “dextrano” no presente pedido refere-se a um alfa- glucano solúvel em água que compreende pelo menos 50% de ligações glicosídicas alfa-1,6 (tipicamente com até 49% de ligações glicosídicas alfa-1,3, algumas das quais podem ocorrer nos pontos de ramificação). Dextranos têm frequentemente um peso molecular médio acima de 1000 kDa. Enzimas capazes de sintetizar dextrano a partir de sacarose podem ser descritas como “dextrano- sacarases” (EC 2.4.1.5). Um dextrano é um exemplo de um substrato alfa- glucano adequado no presente pedido.
[057] Os termos “alfa-glucanohidrolase”, “glucanohidrolase”, e similares, como usados no presente pedido, referem-se a uma enzima capaz de endo- ou exo-hidrolizar um oligômero de alfa-glucano. Uma glucanohidrolase pode ser definida pela sua atividade de hidrólise em certas ligações glicosídicas alfa. Exemplos podem incluir, mas não se limitam a, dextranases (EC 3.2.1.1; capazes de endohidrolisar pontes glicosídicas α-1,6-ligadas, mutanases (EC 3.2.1.59; capazes de endohidrolisar pontes glicosídicas alfa-1,3-ligadas) e alternanases (EC 3.2.1.-; capazes de clivar alternano endohidroliticamente). Vários fatores incluindo, mas não se limitando a, nível de ramificação, tipo de ramificação e comprimento de ramificação relativo dentro de certos alfa-glucanos podem impactar adversamente a capacidade de uma alfa-glucanohidrolase hidrolizar algumas ligações glicosídicas.
[058] O peso molecular de um glucano no presente pedido (por exemplo, substrato de alfa-glucano ou composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2) pode ser representado como grau de polimerização (DP), Daltons ou como gramas/mol. DP refere-se ao número de glicoses compreendido dentro de um glucano (por exemplo, um glucano de DP 10 significa que o glucano contém 10 glicoses). Vários meios são conhecidos na técnica para calcular medições de peso molecular, como cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) ou cromatografia de permeação em gel (GPC).
[059] O termo “solúvel em água”, como usado no presente pedido, caracteriza um glucano que tem a capacidade de se dissolver em a água e/ou em uma solução aquosa no presente pedido, onde a molécula de glucano inteira pode se dissolver. Tipicamente, as condições para essa solubilidade incluem uma faixa de temperatura de água/solução na faixa de cerca de 1 a 85°C, o que inclui as temperaturas adequadas para vários usos como, por exemplo, em bebidas e/ou aplicações de cuidados domésticos.
[060] Os termos “percentual por volume”, “percentual de volume”, “% vol”, “% v/v” e similares são usados de forma intercambiável no presente pedido. O percentual por volume de um soluto em uma solução pode ser determinado com o uso da fórmula: [(volume de soluto)/(volume de solução)] x 100%.
[061] Os termos “percentual, em peso”, “porcentagem, em peso (%, em peso)”, “porcentagem peso-peso (% p/p)” e similares são usados de forma intercambiável no presente pedido. Percentual, em peso, refere-se à porcentagem de um material sobre uma base de massa como ele está compreendido em uma composição, mistura ou solução.
[062] Um “mamífero” no presente pedido pode ser um humano, animal de estimação (por exemplo, felinos, caninos), mamíferos domesticados/criados (por exemplo, bovinos, suínos, equinos, ovinos), ou roedores ou outro mamífero pequeno (por exemplo, camundongo, rato, coelho), por exemplo.
[063] O termo “administração enteral” e termos similares referem- se à alimentação ou administração de droga através do trato gastrointestinal (GI). Isto contrasta com a administração parenteral, que ocorre a partir de rotas fora do trato GI (por exemplo, intravenosa). Enquanto a maioria dos casos no presente pedido de administração enteral seja realizadas por ingestão (isto é, por boca, via oral), alguns casos podem ser através de distribuição direta para o esôfago ou estômago (por exemplo, com o uso de um tubo de alimentação).
[064] O termo “índice glicêmico”, como usado no presente pedido, refere-se a um número associado com um tipo particular de alimento que indica o efeito da comida sobre um nível de glicose no sangue do mamífero (nível de açúcar). Um valor de 100 representa o padrão, que é uma quantidade equivalente de glicose pura. Um índice glicêmico baixo é tipicamente cerca de 55 ou menos, um índice glicêmico médio é tipicamente cerca de 56 a 69, e um índice glicêmico alto é tipicamente cerca de 70 ou acima. O termo “resposta glicêmica” no presente pedido, refere-se à alteração nos níveis de glicose no sangue após o consumo de um alimento específico ou combinação de alimentos. Um “aumento marginal” no índice glicêmico de um produto alimentício no presente pedido refere-se a um aumento no índice glicêmico de pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10%, por exemplo.
[065] Um “carboidrato contendo glicose facilmente digerível” no presente pedido refere-se a um carboidrato que, após ingestão por um mamífero, eleva rapidamente os níveis de glicose no sangue no mamífero, em comparação à ingestão de uma “composição de glucano de baixa liberação de glicose” no presente pedido. Exemplos de um carboidrato contendo glicose facilmente digerível incluem sacarose, glicose livre e amido. “Glicose livre” no presente pedido refere-se à glicose sob a forma livre, que não está em ligação glicosídica com outro açúcar.
[066] Os termos “fibra alimentar”, “fibra de glucano” e termos similares no presente pedido, referem-se a um glucano no presente pedido que não é digerível e/ou que não aumenta os níveis de glicose no sangue quando administrado por via enteral a um mamífero. Em geral, uma fibra dietética no presente pedido não é significativamente hidrolisada por enzimas endógenas no trato intestinal superior de mamíferos, como humanos.
[067] Os termos “condições aquosas”, “condições aquosas de reação”, “ambiente aquoso”, “sistema aquoso” e similares são usados de forma intercambiável no presente pedido. Condições aquosas no presente pedido referem-se a uma solução ou mistura na qual o solvente é pelo menos cerca 60%, em peso, de água, por exemplo. Uma reação de ramificação no presente pedido é tipicamente realizada sob condições aquosas.
[068] Uma “composição aquosa” no presente pedido tem um componente líquido que compreende pelo menos cerca de 10%, em peso, de água, por exemplo. Exemplos de composições aquosas incluem misturas, soluções, dispersões (por exemplo, dispersões coloidais), suspensões e emulsões, por exemplo. Uma “solução aquosa” no presente pedido refere-se a uma solução na qual o solvente compreende água. Uma solução aquosa pode servir como um dispersante em certos aspectos no presente pedido. Um glucano alfa-1,2 ramificado, em certas realizações, pode ser dissolvido em uma solução aquosa em certos aspectos.
[069] O termo “produto para cuidados domésticos” e termos similares referem-se a produtos, bens e serviços relacionados ao tratamento, limpeza, cuidados e/ou condicionamento da casa e seus conteúdos. Os supracitados incluem, por exemplo, produtos químicos, composições, produtos ou combinações dos mesmos que têm aplicação nesses cuidados.
[070] Os termos “tecido”, “produto têxtil”, “pano” e similares são usados de forma intercambiável no presente pedido para se referir a um material não tecido que tem uma rede de fibras naturais e/ou artificiais. Essas fibras podem estar sob a forma de linha ou fio, por exemplo.
[071] Uma “composição para cuidados de tecidos” e termos similares referem-se à qualquer composição adequada para tratamento de tecido de alguma maneira. Exemplos dessa composição incluem detergentes para roupas e amaciantes que são exemplos de composições para cuidados de lavagem de roupas.
[072] Os termos “detergente para serviço pesado”, “detergente para todos os propósitos” e similares são usados de forma intercambiável no presente pedido e referem-se a um detergente útil para lavagem regular de tecidos brancos e coloridos em qualquer temperatura. Os termos “detergente para serviço leve”, “detergente para tecido fino” e similares são usados de forma intercambiável no presente pedido para se referir a um detergente útil para o cuidado de tecidos delicados como viscose, lã, seda, microfibra ou outro tecido que necessita de cuidados especiais. “Cuidados especiais” podem incluir condições de uso de água em excesso, baixa agitação e/ou sem alvejante, por exemplo.
[073] Uma “composição detergente” no presente pedido tipicamente compreende pelo menos um tensoativo (composto detergente) e/ou um reforçador (builder). Um “tensoativo” no presente pedido refere-se a uma substância que tende a reduzir a tensão superficial de um líquido no qual a substância é dissolvida. Um tensoativo pode agir como um detergente, agente umectante, emulsificante, agente formador de espuma e/ou dispersante, por exemplo.
[074] O termo “produto para cuidados pessoais” e termos similares referem-se a produtos, bens e serviços relacionados ao tratamento, limpeza, lavagem, cuidados ou condicionamento da pessoa. Os supracitados incluem, por exemplo, produtos químicos, composições, produtos ou combinações dos mesmos que têm aplicação nesses cuidados.
[075] Uma “composição para cuidados orais” no presente pedido é qualquer composição adequada para tratamento de uma superfície dura ou macia na cavidade oral, como dental (dentes) e/ou superfícies da gengiva.
[076] Os termos “polinucleotídeo”, “sequência de polinucleotídeo”, “molécula de ácido nucleico” e similares são usados de forma intercambiável no presente pedido. Esses termos englobam sequências de nucleotídeos e similares. Um polinucleotídeo pode ser um polímero de DNA ou RNA que é de fita simples ou dupla, que opcionalmente contém bases de nucleotídeos sintéticas, não naturais ou alteradas. Um polinucleotídeo pode ser compreendido por um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou misturas dos mesmos.
[077] O termo “gene”, como usado no presente pedido, refere-se a uma sequência de polinucleotídeos de DNA que expressa um RNA (RNA é transcrito a partir da sequência de polinucleotídeos de DNA) a partir de uma região codificadora, a qual o RNA pode ser um RNA mensageiro (que codifica uma proteína) ou um RNA não codificador de proteína. Um gene pode se referir à região codificadora sozinha, ou pode incluir sequências reguladoras a montante e/ou a jusante para a região codificadora (por exemplo, promotores, regiões não traduzidas 5’, regiões terminadoras de transcrição 3’). Uma região codificadora que codifica uma proteína pode alternativamente ser citada no presente pedido como um “quadro aberto de leitura” (ORF). Um gene que é “nativo” ou “endógeno” refere-se a um gene como encontrado na natureza com suas próprias sequências reguladoras; esse gene está localizado em sua localização natural no genoma de uma célula hospedeira. Um gene “quimérico” refere-se a qualquer gene que não é um gene nativo, que compreende sequências reguladoras e codificadoras que não são encontradas juntas na natureza (isto é, as regiões reguladoras e codificadoras que são heterólogas entre si). Consequentemente, um gene quimérico pode compreender sequências reguladoras e sequências codificadoras derivadas de diferentes fontes ou sequências reguladoras e sequências codificadoras derivadas da mesma fonte, mas organizadas de uma maneira diferente das encontradas na natureza. Um gene “estranho” ou “heterólogo” pode se referir a um gene que é introduzido no organismo hospedeiro por transferência de gene. Genes estranhos/heterólogos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo, genes nativos introduzidos em uma nova localização dentro do hospedeiro nativo ou genes quiméricos. As sequências de polinucleotídeos em certas realizações divulgadas no presente pedido são heterólogas. Um “transgene” é um gene que foi introduzido no genoma por um procedimento de distribuição de genes (por exemplo, transformação). Um quadro aberto de leitura “códon otimizado” tem sua frequência de uso de códon projetada para imitar a frequência de uso de códon preferencial da célula hospedeira.
[078] O termo “heterólogo” significa não encontrado naturalmente no local de interesse. Por exemplo, um gene heterólogo pode ser aquele que não é encontrado naturalmente em um organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro por transferência gênica. Como outro exemplo, uma molécula de ácido nucleico que está presente em um gene quimérico pode ser caracterizada como sendo heteróloga, visto que uma molécula de ácido nucleico não está naturalmente associada com outros segmentos do gene quimérico (por exemplo, um promotor pode ser heterólogo para uma sequência codificadora).
[079] Uma sequência de aminoácidos “não nativa” ou sequência de polinucleotídeo compreendida em uma célula ou organismo no presente pedido não ocorre em uma contrapartida nativa (natural) dessa célula ou organismo. Essa sequência de aminoácidos ou sequência de polinucleotídeos também pode ser citada como sendo heteróloga para a célula ou organismo.
[080] “Sequências reguladoras”, como usado no presente pedido, referem-se às sequências de nucleotídeos localizadas a montante de um sítio de iniciação de transcrição da sequência codificadora (por exemplo, promotor), regiões não traduzidas 5’, íntrons e regiões não codificadoras 3’, e que podem influenciar a transcrição, processo ou estabilidade, e/ou tradução de um RNA transcrito a partir do gene. Sequências reguladores no presente pedido podem incluir promotores, enhancers, silenciadores, sequências líder não traduzidas 5’, íntrons, sequências de reconhecimento de poliadenilação, sítios de processamento de RNA, sítios de ligação efetora, estruturas haste-alça e outros elementos envolvidos na regulação da expressão gênica. Um ou mais elementos de reguladores no presente pedido podem ser heterólogos para uma região codificadora no presente pedido.
[081] Um “promotor” como usado no presente pedido refere-se a uma sequência de DNA capaz de controlar a transcrição de RNA a partir de um gene. Em geral, uma sequência promotora está a montante do sítio de iniciação de transcrição de um gene. Os promotores podem ser derivados em sua totalidade de um gene nativo ou podem ser compostos de diferentes elementos derivados a partir de diferentes promotores encontrados na natureza ou até compreender segmentos de DNA sintéticos. Promotores que provocam um gene a ser expresso em uma célula na maioria das vezes sob todas as circunstâncias são comumente citados como “promotores constitutivos”. Um ou mais promotores no presente pedido podem ser heterólogos para uma região codificadora no presente pedido.
[082] Um “promotor forte”, como usado no presente pedido, refere- se a um promotor que pode direcionar um número relativamente grande de iniciações produtivas por unidade de tempo e/ou é um promotor que dirige um nível mais alto de transcrição do gene do que o nível médio de transcrição dos genes em uma célula.
[083] Os termos “sequência não codificadora 3’”, “terminador de transcrição” e “terminador”, como usado no presente pedido, referem-se às sequências de DNA localizadas a jusante de uma sequência codificadora. Isto inclui sequências de reconhecimento de poliadenilação e outras sequências que codificam sinais reguladores capazes de afetar o processamento de mRNA ou de expressão gênica.
[084] Os termos “a montante” e “a jusante”, como usado no presente pedido, em relação a polinucleotídeos referem-se a “5’ de” e “3’ de”, respectivamente.
[085] O termo “expressão”, como usado no presente pedido, refere- se a (i) transcrição de RNA (por exemplo, mRNA ou um RNA não codificador de proteína) a partir de uma região codificadora, e/ou (ii) tradução de um polipeptídeo a partir de mRNA. A expressão de uma região codificadora de uma sequência de polinucleotídeos pode ser suprarregulada ou infrarregulada em certas realizações.
[086] O termo “ligado de maneira funcional”, como usado no presente pedido, refere-se à associação de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos de modo que a função de uma é afetada pela outra. Por exemplo, um promotor está ligado de forma funcional a uma sequência codificadora quando este é capaz de afetar a expressão dessa sequência codificadora. Em outras palavras, a sequência codificadora está sob o controle transcricional do promotor. Uma sequência codificadora pode ser ligada de maneira funcional a uma (por exemplo, promotor) ou mais (por exemplo, promotor e terminador) sequências reguladoras, por exemplo.
[087] O termo “recombinante”, quando usado no presente pedido para caracterizar uma sequência de DNA como um plasmídeo, vetor ou constructo, refere-se a uma combinação artificial de dois segmentos de sequência separados de outro modo, por exemplo, por síntese química e/ou por manipulação de segmentos isolados de ácidos nucleicos por técnicas de engenharia genética.
[088] O termo “transformação”, como usado no presente pedido, refere-se à transferência de uma molécula de ácido nucleico para um organismo hospedeiro ou célula hospedeira, por qualquer método. Uma molécula de ácido nucleico que tenha sido transformada em um organismo/célula pode ser aquela que replica autonomamente no organismo/célula, ou que se integra no genoma do organismo/célula, ou que existe temporariamente na célula sem replicar ou integrar. Exemplos não limitantes de moléculas de ácido nucleico adequadas para transformação são divulgados no presente pedido, como plasmídeos e moléculas de DNA lineares. Organismos hospedeiros/células no presente pedido contendo uma sequência de ácido nucleico de transformação podem ser citados como “transgênicos”, “recombinantes”, “transformados”, “elaborados geneticamente”, como um “transformante” e/ou como sendo “modificados para expressão gênica exógena”, por exemplo.
[089] Os termos “identidade de sequência”, “identidade” e similares, como usado no presente pedido em relação às sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos referem-se aos resíduos de ácidos nucleicos ou resíduos de aminoácidos em duas sequências que são as mesmas, quando alinhadas para a máxima correspondência sobre uma janela de comparação especificada. Desta forma, “porcentagem de identidade de sequência”, “percentual de identidade” e similares referem-se ao valor determinado por comparação de duas sequências alinhadas da melhor forma sobre uma janela de comparação, em que a porção da sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, gaps), em comparação à sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para a melhor forma de alinhamento das duas sequências. A porcentagem é calculada por determinação do número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica ou o resíduo de aminoácido ocorrem em ambas as sequências para produzir o número de posições compatíveis, dividindo o número de posições compatíveis pelo total do número de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para produzir o percentual de identidade de sequência. Entende-se que, ao calcular a identidade de sequência entre uma sequência de DNA e uma sequência de RNA, resíduos T da sequência de DNA alinham com, e podem ser considerados “idênticos” com, resíduos U da sequência de RNA. Para fins de determinação do “percentual de complementaridade” do primeiro e segundo polinucleotídeos, pode-se obter este determinando (i) o percentual de identidade entre o primeiro polinucleotídeo e a sequência de complemento do segundo polinucleotídeo (ou vice-versa), por exemplo, e/ou (ii) a porcentagem de bases entre o primeiro e segundo polinucleotídeos que criaria pares de base Watson e Crick canônicos.
[090] O percentual de identidade pode ser prontamente determinado por métodos conhecidos incluindo, mas não se limitando àqueles descritos em: 1) Computational Molecular Biology (Lesk, A.M., Ed.) Oxford University: NY (1988); 2) Biocomputing:_Informatics and Genome Projects (Smith, D.W., Ed.) Academic: NY (1993); 3) Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A.M., e Griffin, H.G., Eds.) Humana: NJ (1994); 4) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987); e 5) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991), todos os quais são incorporados ao presente pedido como referência.
[091] Métodos preferenciais para determinar o percentual de identidade são projetados para dar a melhor compatibilidade entre as sequências testadas. Métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computação publicamente disponíveis, por exemplo. Alinhamentos de sequências e cálculos de percentual de identidade podem ser realizados com o uso do programa MEGALIGN do conjunto de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI), por exemplo. O alinhamento múltiplo de sequências pode ser realizado, por exemplo, com o uso do método de alinhamento Clustal que engloba diversas variedades de algoritmos incluindo o método de alinhamento Clustal V (descrito por Higgins e Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al. et al., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191(1992)) e encontrado no programa MEGALIGN v8.0 do conjunto de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc.). Para alinhamentos múltiplos, os valores padrão podem corresponder a PENALIDADE PARA GAP = 10 e PENALIDADE PARA EXTENSÃO DE GAP = 10. Parâmetros padrão para alinhamentos de pareamentos e cálculo de percentual de identidade de sequências de proteínas com o uso do método Clustal podem ser KTUPLE = 1, PENALIDADE DE GAP = 3, JANELA = 5 e DIAGONAIS SALVAS = 5. Para ácidos nucleicos, esses parâmetros podem ser KTUPLE = 2, PENALIDADE DE GAP = 5, JANELA = 4 e DIAGONAIS SALVAS = 4. Adicionalmente, pode ser usado o método de alinhamento Clustal W (descrito por Higgins e Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al. et al., Comput. Appl. Biosci. 8:189-191(1992); Thompson, J.D. et al, Nucleic Acids Research, 22 (22): 4673- 4680, 1994) e encontrado no programa MEGALIGN v8.0 do conjunto de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc.). Parâmetros padrão para alinhamento múltiplo (proteína/ácido nucleico) podem ser: PENALIDADE DE GAP = 10/15, PENALIDADE DE EXTENSÃO DE GAP = 0,2/6,66, Divergência no Atraso de Sequências (%) = 30/30, Peso de Transição de DNA = 0,5, Matriz de Peso de Proteína = Série Gonnet, Matriz de Peso de DNA = IUB.
[092] Várias sequências de aminoácidos de polipeptídeos e sequências de polinucleotídeos são divulgadas no presente pedido como características de certas realizações. As variantes destas sequências que são pelo menos cerca de 70 a 85%, 85 a 90% ou 90% a 95% idênticas às sequências divulgadas no presente pedido podem ser usadas ou referenciadas. De maneira alternativa, uma sequência de aminoácidos variante ou sequência de polinucleotídeos pode ter pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência divulgada no presente pedido. A sequência de aminoácidos variante ou sequência de polinucleotídeos tem a mesma função/atividade da sequência divulgada, ou pelo menos cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da função/atividade da sequência divulgada. Qualquer sequência de aminoácidos de polipeptídeo divulgada no presente pedido que não começa com uma metionina pode tipicamente compreender ainda, pelo menos, uma metionina de partida na terminação N da sequência de aminoácidos.
[093] Todos os resíduos de aminoácidos em cada posição de aminoácido das proteínas divulgadas no presente pedido são exemplos. Dado que certos aminoácidos compartilham características estruturais e/ou cargas similares uns com os outros (isto é, conservado), o aminoácido em cada posição de uma proteína no presente pedido pode ser fornecido nas sequências divulgadas ou substituído por um resíduo de aminoácido conservado (“substituição de aminoácido conservativa”) da seguinte forma: 1. Os seguintes resíduos pequenos alifáticos, não polares ou ligeiramente polares podem se substituir entre si: Ala (A), Ser (S), Thr (T), Pro (P), Gly (G); 2. Os seguintes resíduos polares, negativamente carregados e suas amidas podem se substituir entre si: Asp (D), Asn (N), Glu (E), Gln (Q); 3. Os seguintes resíduos polares, positivamente carregados podem se substituir entre si: His (H), Arg (R), Lys (K); 4. Os seguintes resíduos alifáticos, não polares podem se substituir entre si: Ala (A), Leu (L), Ile (I), Val (V), Cys (C), Met (M); e 5. Os seguintes resíduos aromáticos grandes podem se substituir entre si: Phe (F), Tyr (Y), Trp (W).
[094] Os termos “alinha-se com”, “corresponde a”, e similares podem ser usados de forma intercambiável no presente pedido. Algumas realizações no presente pedido referem-se a uma subsequência dentro de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 4, 2, 3 e 5 a 13 que se alinha com SEQ ID NO: 27. Uma subsequência no presente pedido é simplesmente uma parte de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 4, 2, 3 e 5 a 13. Uma subsequência pode ser caracterizada por se com a SEQ ID NO: 27 se é pelo menos cerca 50% idêntica à SEQ ID NO: 27, ou pelo menos cerca 65% similar (percentual total de ambos os sítios idênticos e sítios conservados) à SEQ ID NO: 27. Em geral, pode-se alinhar a sequência de aminoácidos de uma subsequência com a SEQ ID NO: 27 com o uso de um algoritmo de alinhamento e/ou software descrito no presente pedido (por exemplo, BLASTP, ClustalW, ClustalV, EMBOSS) para determinar o percentual de identidade e/ou de similaridade.
[095] O termo “isolado” significa uma substância sob a forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância que não ocorre naturalmente, (2) qualquer substância que inclui, mas não se limita a, qualquer célula hospedeira, enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo, cofator ou carboidrato/sacarídeo, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais, ou de todos os constituintes que ocorrem naturalmente com os quais ela está associado na natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão humana em relação à substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada pelo aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes com os quais ela está naturalmente associada. Acredita-se que as realizações (por exemplo, composições de reação e produtos das mesmas) divulgadas no presente pedido são sintéticas/feitas pelo homem e/ou têm propriedades que não ocorrem naturalmente.
[096] O termo, “aumentado”, como usado no presente pedido, pode se referir a uma quantidade ou atividade que tem pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 50%, 100% ou 200% mais que a quantidade ou atividade para a qual a quantidade ou atividade aumentada está sendo comparada. Os termos “aumentado”, “elevado”, “melhorado”, “maior que”, “aprimorado” e similares são usados de forma intercambiável no presente pedido. Estes termos podem ser usados para caracterizar a superexpressão ou suprarregulação de um polinucleotídeo que codifica uma proteína, por exemplo.
[097] Alguns aspectos da presente divulgação referem-se a uma composição de reação que compreende pelo menos água, sacarose, um substrato de alfa-glucano e um polipeptídeo que é capaz de formar pelo menos uma ramificação alfa-1,2 a partir do substrato de alfa-glucano, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica a: (i) a forma madura de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13; (ii) SEQ ID NO: 27 ou uma subsequência dentro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 que se alinha com SEQ ID NO: 27; e/ou (iii) uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13.
[098] Uma reação, conforme descrito imediatamente acima, pode ser opcionalmente caracterizada no presente pedido como uma reação de ramificação alfa-1,2. Um produto dessa reação pode ser citado como uma composição de glucano (ou produto de glucano) que compreende ligações alfa- 1,2, por exemplo.
[099] Um polipeptídeo capaz de formar pelo menos uma ramificação alfa-1,2 a partir um substrato de alfa-glucano, em alguns aspectos de a presente divulgação, pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos que é 100% idêntica, ou pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à forma madura predita de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 1, 2, 3 e 5 a 13. Acredita-se que as seguintes sequências são exemplos de formas maduras (formas expressas) desses polipeptídeos, respectivamente: posições 36 a 1672 de SEQ ID NO: 4, posições 21 a 2771 de SEQ ID NO: 1, posições 21 a 2821 de SEQ ID NO: 2, posições 41 a 2844 de SEQ ID NO: 3, posições 51 a 1632 de SEQ ID NO: 5, posições 51 a 1318 de SEQ ID NO: 6, posições 51 a 1139 de SEQ ID NO: 7, posições 51 a 1463 de SEQ ID NO: 8, posições 41 a 2841 de SEQ ID NO: 9, posições 46 a 2580 de SEQ ID NO: 10, posições 51 a 1463 de SEQ ID NO: 11, posições 21 a 2824 de SEQ ID NO: 12, posições 21 a 2771 de SEQ ID NO: 13. Qualquer uma dessas sequências pode opcionalmente ainda compreender um resíduo de metionina N-terminal adicionado.
[0100] Em alguns aspectos, um polipeptídeo capaz de formar pelo menos uma ramificação alfa-1,2 a partir um substrato de alfa-glucano compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que é 100% idêntica, ou pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 1, 2, 3 e 5 a 13.
[0101] SEQ ID NO: (27 GTFJ18T1), que é uma versão encurtada N-terminal de SEQ ID NO: 1, é mostrada nos Exemplos abaixo como sendo capaz de formar pelo menos uma ramificação alfa-1,2 a partir um substrato de alfa-glucano. Além disso, SEQ ID NO: 4 (GTF9905), que contém uma subsequência que é relativamente semelhante à SEQ ID NO: 27, também é mostrada nos Exemplos abaixo como sendo capaz de formar pelo menos uma ramificação alfa-1,2 a partir um substrato de alfa-glucano. Com base nesta informação, acredita-se que um polipeptídeo adequado, em certas realizações, pode compreender uma sequência de aminoácidos que é 100% idêntica a, ou pelo menos cerca 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas à SEQ ID NO: 27 ou uma subsequência dentro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 2, 3 e 5 a 13 que se alinha com SEQ ID NO: 27. Em alguns aspectos, uma subsequência adequada que se alinha com a SEQ ID NO: 27 é conforme listado nas tabelas a seguir:
Figure img0001
Figure img0002
a Percentual de identidade e valores de similaridade por alinhamento EMBOSS.
[0102] Deve ser aparente a partir de algumas das realizações acima que um polipeptídeo capaz de formar pelo menos uma ramificação alfa- 1,2 a partir um substrato de alfa-glucano pode incluir uma sequência de aminoácidos que é truncada em relação a qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 1-13. Em certas realizações, uma sequência de aminoácidos truncada inclui um domínio de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 1 a 13 que catalisa a síntese de glucano que tem ligações alfa-1,2. Essa sequência de aminoácidos truncada pode opcionalmente incluir um ou mais domínios de ligação de glucano. Em certas realizações, uma sequência de aminoácidos truncada não inclui um domínio que catalisa a síntese de glucano que tem ligações diferentes de ligações alfa-1,2.
[0103] Algumas realizações divulgadas no presente pedido referem-se a um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica qualquer enzima de ramificação 1,2 (por exemplo, partes i, ii ou iii acima relacionadas a qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 4, 1, 2, 3, 5 a 13 e 27) ou outras glicosiltransferases conforme atualmente divulgado. Opcionalmente, uma ou mais sequências reguladoras são ligadas de maneira funcional à sequência de nucleotídeos e, preferencialmente, uma sequência promotora é incluída como uma sequência reguladora.
[0104] Um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima no presente pedido pode ser um vetor ou constructo útil para transferir uma sequência de nucleotídeos para uma célula, por exemplo (por exemplo, vetor de expressão). Exemplos de um vetor/constructo adequados podem ser selecionados a partir de um plasmídeo, cromossomo artificial de levedura (YAC), cosmídeo, fagomídeo, cromossomo artificial bacteriano (BAC), vírus ou DNA linear (por exemplo, produto de PCR linear). Uma sequência de polinucleotídeos, em alguns aspectos, pode ser capaz de existir temporariamente (isto é, não é integrada no genoma) ou de forma estável (isto é, integrada no genoma) em uma célula. Uma sequência de polinucleotídeos em alguns aspectos pode compreender ou ser desprovida de uma ou mais sequências marcadoras adequadas (por exemplo, marcador de seleção ou de fenótipo).
[0105] Uma sequência de polinucleotídeos, em certas realizações, pode compreender uma ou mais sequências reguladoras ligadas de maneira funcional a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima pode estar em ligação funcional com uma sequência promotora (por exemplo, um promotor heterólogo). Uma sequência promotora pode ser adequada para expressão em uma célula (por exemplo, célula bacteriana como E. coli; célula eucarionte como fungos, leveduras, células de insetos ou de mamíferos) ou em um sistema de expressão de proteína in vitro, por exemplo. Exemplos de outras sequências reguladoras adequadas são divulgados no presente pedido (por exemplo, sequências de terminador da transcrição).
[0106] Em algumas realizações, uma sequência de polinucleotídeos não compreende uma sequência reguladora ligada de maneira funcional a um nucleotídeo que codifica uma glicosiltransferase. Esse polinucleotídeo poderia ser um vetor de clonagem (por exemplo, plasmídeo de clonagem), por exemplo, usado simplesmente para propósitos de subclonagem ou transmissão de genes.
[0107] Possíveis regiões de controle de iniciação ou promotores que podem ser incluídos em um vetor de expressão no presente pedido são numerosos e familiares para os técnicos no assunto. Na prática, qualquer promotor capaz de dirigir esses genes é adequado, incluindo, mas não se limitando a, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (útil para expressão em Saccharomyces); AOX1 (útil para expressão em Pichia); e lac, araB, tet, trp, lPL, lPR, T7, tac, e trc (útil para expressão em Escherichia coli), bem como os promotores amy, apr, npr e vários promotores de fago úteis para expressão em Bacillus.
[0108] Fragmentos de DNA que controlam a terminação da transcrição também podem ser derivados de vários genes nativos para uma célula hospedeira preferencial. Em certas realizações, a inclusão de uma região de controle de terminação é opcional. Em certas realizações, o vetor de expressão inclui uma região de controle da terminação derivada da célula hospedeira preferencial.
[0109] Em certas realizações, qualquer polipeptídeo divulgado no presente pedido está sob a forma de uma proteína de fusão. Por exemplo, um polipeptídeo pode incluir uma ou mais sequências marcadoras que podem auxiliar na purificação do polipeptídeo. Sequências marcadoras exemplares incluem: GST (glutationa-S-transferase), inteína-CBD (domínio de ligação à quitina), MBD (domínio de ligação de maltose) e marcadores de histidina.
[0110] Em certas realizações, um vetor de expressão está incluído em uma célula hospedeira, em particular uma célula hospedeira microbiana. Em algumas realizações, uma célula hospedeira microbiana pode ser encontrada dentro das famílias fúngicas ou bacterianas e/ou crescem com uma grande variedade de temperatura, valores de pH e tolerâncias a solventes. Por exemplo, contempla-se que qualquer um dentre bactérias, leveduras e fungos filamentosos possam hospedar adequadamente o vetor de expressão. A inclusão de um vetor de expressão em uma célula hospedeira pode ser usada para expressão intracelular e/ou extracelular de um polipeptídeo conforme divulgado no presente pedido. A transcrição, tradução e o aparelho biossintético de proteína permanecem invariáveis em relação à matéria-prima celular usada para gerar biomassa celular; genes funcionais tipicamente podem ser expressos de forma independente. Exemplos de células hospedeiras incluem, mas não se limitam a, bactérias, fungos ou espécies de leveduras como Aspergillus, Trichoderma, Saccharomyces, Pichia, Phaffia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Yarrowia, Salmonella, Bacillus, Acinetobacter, Zymomonas, Agrobacterium, Erythrobacter, Chlorobium, Chromatium, Flavobacterium, Cytophaga, Rhodobacter, Rhodococcus, Streptomyces, Brevibacterium, Corynebacteria, Mycobacterium, Deinococcus, Escherichia, Erwinia, Pantoea, Pseudomonas, Sphingomonas, Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylosinus, Methylomicrobium, Methylocystis, Alcaligenes, Synechocystis, Synechococcus, Anabaena, Thiobacillus, Methanobacterium, Klebsiella e Myxococcus. Em certas realizações, uma célula hospedeira fúngica é Trichoderma, como uma linhagem de Trichoderma reesei. Em certas realizações, linhagens hospedeiras bacterianas incluem Escherichia, Bacillus, Kluyveromyces e Pseudomonas. Em algumas realizações, a célula hospedeira bacteriana é Bacillus subtilis ou Escherichia coli.
[0111] Em certas realizações, (i) uma célula hospedeira inclui mais de um vetor de expressão, e/ou (ii) múltiplos polipeptídeos são expressos na célula hospedeira. Por exemplo, em certas realizações, uma célula hospedeira inclui um vetor de expressão para a expressão de uma alfa-glucanohidrolase. Seria reconhecido que o vetor de expressão para expressar uma alfa- glucanohidrolase pode ser o mesmo ou diferente do que o vetor de expressão para expressar um polipeptídeo capaz de formar pelo menos uma ramificação alfa-1,2 a partir um substrato de alfa-glucano.
[0112] Um substrato/esqueleto de alfa-glucano, em certas realizações da presente divulgação tem um grau de polimerização (DP) de pelo menos 3, compreende pelo menos (i) ligações glicosídicas alfa-1,6 ou (ii) ligações glicosídicas alfa-1,3 e alfa-1,6, e tipicamente é solúvel em água.
[0113] Em alguns aspectos, um substrato de alfa-glucano pode ter um DP de cerca de, ou pelo menos cerca de, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 105, 110 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 ou 2000. O DP de um substrato de alfa-glucano pode opcionalmente ser expresso como uma faixa entre quaisquer destes dois valores. Meramente como exemplos, o DP pode ser de cerca de 8-20, 8-30, 8-100 ou 8-500 (que por acaso são exemplos de DP8+ substratos de alfa-glucano), 3-4, 3-5, 3-6, 3-7, 3-8, 4-5, 4-6, 4-7, 4-8, 5-6, 5-7, 58, 6-7, 6-8 ou 7-8. Meramente como outros exemplos, o DP pode ser 90-120, 95120, 100-120, 105-120, 110-120, 115-120, 90-115, 95-115, 100-115, 105-115, 110-115, 90-110, 95-110, 100-110, 105-110, 90-105, 95-105, 100-105, 90-100, 95-100 ou 90-95.
[0114] Um substrato de alfa-glucano, em certas realizações, compreende pelo menos (i) ligações glicosídicas alfa-1,6 ou (ii) ligações glicosídicas alfa-1,3 e alfa-1,6. Por exemplo, a porcentagem de ligações alfa-1,6 pode ser de pelo menos cerca de 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 69%, 70%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. O perfil de ligação de um substrato de alfa-glucano pode opcionalmente ser expresso como tendo uma faixa entre quaisquer destes dois valores. As outras ligações de substrato, em qualquer uma destas realizações, podem ser alfa-1,3 (por exemplo, até 80%) e/ou não incluírem quaisquer ligações alfa-1,4 ou alfa-1,2, por exemplo. Em alguns aspectos, um substrato de alfa- glucano compreende pelo menos 50% de ligações glicosídicas alfa-1,6. Em algumas outras realizações, um substrato de alfa-glucano compreende de 1 a 50% de ligações glicosídicas alfa-1,3.
[0115] Em certas realizações, um substrato de alfa-glucano é preparado com o uso de uma enzima selecionada a partir de glicosiltransferases (tipicamente da família GH70 de glicosídeo hidrolases), dextrina dextranases, glicosiltransferases 4,6-alfa (“tipo Gtf-B” da família GH70), ou combinações das mesmas. Opcionalmente, pelo menos uma alfa-glicosidase ainda é incluída, como dextranase e/ou mutanase. Em algumas realizações, um substrato de alfa- glucano é um produto de uma glicosiltransferase que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que é 100% idêntica, ou pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 30 (GTF8117), 32 (GTF6831) ou 33 (GTF5604). Um substrato de alfa-glucano no presente pedido pode ser preparado por uma composição de reação de glicosiltransferase apropriada (por exemplo, que compreende pelo menos água e sacarose, em adição a pelo menos uma enzima GTF).
[0116] Um substrato de alfa-glucano pode ser sintetizado (e opcionalmente isolado) antes de introduzir enzimaticamente a ramificação alfa- 1,2, ou pode ser concomitantemente sintetizado na presença de uma enzima de ramificação alfa-1,2 (isto é, a síntese do esqueleto de substrato de glucano pode ser conduzida na mesma mistura de reação com o polipeptídeo que tem atividade de ramificação de alfa-1,2 na presença de uma quantidade efetiva de sacarose). Um substrato de alfa-glucano pode ser produzido em uma variedade de formas incluindo, mas não se limitando a, (1) síntese de pelo menos uma glicosiltransferase (com o uso de um polipeptídeo que é diferente do polipeptídeo que tem atividade de ramificação alfa-1,2) na presença de sacarose (2) síntese de maltodextrina que pode ser obtida a partir de amido ou sacarose (por exemplo, substrato de maltodextrina sintetizado a partir de sacarose com o uso de uma amilosacarase) com o uso de um polipeptídeo que tem atividade de dextrina dextranase, uma glicosiltransferase GH70 tipo Gtf-B, ou uma combinação das mesmos, (3) síntese com o uso do método (1) e/ou (2) na presença de pelo menos um alfa-glucanohidrolase (por exemplo, dextranase, mutanase ou uma combinação das mesmas), e (4) qualquer combinação de (1), (2) ou (3), desde que o substrato de alfa-glucano seja capaz de ser atuado pelo polipeptídeo que tem atividade de ramificação alfa-1,2. Em uma realização adicional, um substrato de alfa-glucano pode ser sintetizado antes de uma etapa de ramificação alfa-1,2 ou pode ser sintetizado concomitante com a ramificação alfa-1,2 (isto é, o polipeptídeo que tem atividade de ramificação alfa-1,2 e uma quantidade efetiva de sacarose está presente na mistura de reação aquosa). No contexto de síntese de um substrato de alfa-glucano com o uso de qualquer uma das realizações acima, reagentes para síntese podem incluir sacarose e/ou maltodextrina e, opcionalmente ser na presença de um ou mais aceitantes adicionais. Em outra realização, os reagentes podem ainda compreender ainda um ou mais aceitantes, como maltose, isomaltose, isomaltotriose e metil-alfa-D- glucano, para citar alguns.
[0117] Em certas realizações, o substrato de alfa-glucano é sintetizado com o uso de uma combinação de pelo menos uma glicosiltransferase capaz de formar oligômeros de glicose com pelo menos uma alfa-glucanohidrolase na mesma mistura de reação (isto é, que estão concomitantemente presentes e ativas na composição de reação). Como tal, os reagentes para a alfa-glucanohidrolase são representados pelos oligômeros de glicose sendo concomitantemente sintetizados no sistema de reação pela glicosiltransferase a partir de sacarose.
[0118] Um produto de glucano de uma reação de ramificação 1,2 no presente pedido (por exemplo, “composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2”) (esse produto pode ser o de uma composição de reação no presente pedido e/ou um produto de um método no presente pedido para produzir uma composição de glucano) pode ser caracterizado em termos de (i) qualquer substrato de alfa-glucano no presente pedido mais (ii) qualquer ramificação 1,2 adicionada, conforme divulgado no presente, por exemplo. O percentual de ramificação 1,2 de uma composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2 pode ser cerca de, pelo menos cerca de, ou menos que cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54% ou 55%, por exemplo. Este perfil de ramificação 1,2 pode opcionalmente ser expresso como tendo uma faixa entre qualquer um destes dois valores. Meramente como exemplos, o percentual ramificações 1,2 em uma composição de glucano pode ser 15 a 50%, 15 a 45%,15 a 40%, 15 a 35%, 15 a 30%, 15 a 25%, 15 a 20%, 20 a 50%, 20 a 45%, 20 a 40%, 20 a 35%, 20 a 30%, 20 a 25%, 25 a 50%, 25 a 45%, 25 a 40%, 25 a 35%, 25 a 30%, 30 a 50%, 30 a 45%, 30 a 40%, 30 a 35%, 35 a 50%, 35 a 45%, 35 a 40%, 40 a 50% ou 40 a 45% (alguns ou todos desses perfis de ramificação 1,2 estão opcionalmente associados com composições de glucano no presente pedido que não aumentam os níveis de glicose no sangue quando administradas por via enteral a um mamífero (pode opcionalmente ser citada como uma fibra de glucano dietética)). Meramente como exemplos adicionais, a porcentagem de ramificações 1,2 em uma composição de glucano pode ser menor que cerca de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5% ou 4%, ou na faixa de 2 a 10%, 4 a 10%, 6 a 10%, 2 a 8%, 4 a 8%, 6 a 8%, 2 a 6%, 4 a 6%, 4,5 a 6%, 5 a 6%, 4 a 7%, 4,5 a 7% ou 5 a 7% (esses perfis de ramificação 1,2 opcionalmente estão associados com composições de glucano no presente pedido que aumentam lentamente os níveis de glicose no sangue quando administrados por via enteral a um mamífero (pode opcionalmente ser citado como glucano de índice glicêmico baixo)). Em alguns aspectos, uma composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2 compreende apenas ligações 1,6 e ramificações 1,2 (1,2,6) (por exemplo, um esqueleto 1,6-ligado decorados com glicoses pendentes 1,2-ligadas), com nenhum outro tipo de ligação presente. Em outras realizações, uma composição de glucano que compreende ligações alfa- 1,2 compreende qualquer esqueleto de substrato de alfa-glucano, conforme divulgado no presente decorado com ramificações 1,2-ligadas. A porcentagem de pontos de ramificação 1,2 (bem como outros tipos de ligações) no presente pedido pode ser determinada com o uso de um 1H NMR ou método GC/MS, por exemplo, conforme divulgado nos Exemplos abaixo.
[0119] Em alguns aspectos, uma composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2 pode ter um DP de cerca de, ou pelo menos cerca de, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 105, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 ou 2000. O DP de uma composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2 pode opcionalmente ser expresso como uma faixa entre quaisquer destes dois valores. Meramente como exemplos, o DP pode ser de cerca de 120-160, 125-160, 130-160, 135-160, 140-160, 145-160, 150-160, 155-160, 120-155, 125-155, 130-155, 135-155, 140-155, 145-155, 150-155, 120-150, 125-150, 130-150, 135150, 140-150, 145-150, 120-145, 125-145, 130-145, 135-145, 140-145, 120-140, 125-140, 130-140, 135-140, 120-135, 125-135, 130-135, 120-130, 125-130 ou 120-125 (esses perfis de DP são opcionalmente associados a composições de glucano no presente pedido que não aumentam os níveis de glicose no sangue quando administrados enteralmente a um mamífero), ou cerca de 100-110. Meramente como exemplos adicionais, o DP pode ser 100-120, 105-120, 110120, 115-120, 100-115, 105-115, 110-115, 100-110, 105-110 ou 100-105 (esses perfis de DP são opcionalmente associados a composições de glucano no presente pedido que aumentam lentamente os níveis de glicose no sangue quando administrados enteralmente a um mamífero).
[0120] Em alguns aspectos, uma composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2 (por exemplo, uma que é solúvel em água) libera lentamente glicose quando fornecida (administração enteral) a um mamífero como um humano; este tipo de composição de glucano pode ser caracterizada como uma “composição de glucano de liberação lenta de glicose” (ou termos similares). Essa liberação lenta de glicose corresponde a um aumento lento nos níveis de glicose no sangue (resposta glicêmica baixa). Em alguns outros aspectos, uma composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2 não libera glicose quando fornecida a um mamífero e, através disso, não resulta em qualquer aumento nos níveis de glicose no sangue (sem resposta glicêmica). Acredita-se que esses efeitos nos níveis de glicose no sangue (efeito lento ou nenhum efeito) sejam específico para a composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2 e, desta forma, independente dos efeitos sobre os níveis de glicose no sangue que podem resultar de um ingrediente que aumenta a glicose no sangue (por exemplo, sacarose, glicose livre, amido), potencialmente incluído em uma substância sendo fornecida ao mamífero. Em outras palavras, se um ingrediente que aumenta a glicose no sangue está incluído em um alimento/bebida que contém uma composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2 no presente pedido, acredita-se que qualquer aumento significativo ou rápido nos níveis de glicose no sangue em um mamífero alimentado com o alimentos/bebida seja atribuível a esses outros ingredientes que aumentam a glicose no sangue.
[0121] Acredita-se que a liberação lenta de glicose no presente pedido ocorra principalmente no intestino de um mamífero após administração enteral (ingestão) de certas composições de glucano no presente pedido, que compreendem ligações alfa-1,2 (por exemplo, menos que cerca de 10% de ramificações alfa-1,2). A liberação lenta de glicose tipicamente não resulta em um pico de glicose no sangue. O benefício de um glucano de liberação lenta de glicose no presente pedido, em comparação com sacarose e outras formas de carboidratos contendo glicose facilmente digeríveis (por exemplo, glucose livre), é que ele é digerido lentamente e de forma constante por mamíferos. Embora um glucano de liberação lenta de glicose no presente pedido seja um carboidrato disponível de forma calórica significa que ele é digerível e absorvível (por exemplo, consulte a Tabela 35, que mostra que a ingestão da amostra 105-3 (um exemplo de um glucano de liberação lenta de glicose no presente pedido) resultou em um valor de AUC razoavelmente igual ao valor de AUC resultantes da ingestão de glicose livre) - sua digestão resulta em uma liberação lenta e sustentada de glicose, em comparação à digestão de glicose livre (por exemplo, consulte a Tabela 35, que mostra que a ingestão da amostra 105-3 resulta em uma concentração máxima de glicose no sangue de 334 mg/dL em 1 h, enquanto que a ingestão de glicose livre resulta em um máximo de 401 mg/dL após apenas 20 min). Desta forma, um glucano de liberação lenta de glicose no presente pedido, após a ingestão em um mamífero, tipicamente resulta na mesma liberação total de glicose ou similar, como aquela resultante de um carboidrato contendo glicose facilmente digerível (por exemplo, glicose total liberada ao longo de 2 a 2,5 horas pós-ingestão) (por exemplo, quando a mesma quantidade de glucano de liberação lenta de glicose ou carboidrato contendo glicose facilmente digerível são ingeridos). No entanto, um glucano de liberação lenta de glicose no presente pedido, após a ingestão em um mamífero (por exemplo, conforme medido dentro de 0,25 a 2,5 horas pós-ingestão), resulta em: (i) um pico de glicose no sangue que é menor (por exemplo, pelo menos cerca de 10%, 12,5%, 15%, 17,5%, 20%, 22,5%, 25%, 10 a 25%, 10 a 20%, 10 a 15%, 15 a 25% ou menor) do que o pico induzido por um carboidrato contendo glicose facilmente digerível, e/ou (ii) um curva de glicose no sangue que é esticada em comparação à de um carboidrato contendo glicose facilmente digerível. Os resultados de (i) e/ou (ii) podem ser observados, por exemplo, quando a mesma quantidade ou similar de glucano de liberação lenta de glicose ou carboidrato contendo glicose facilmente digerível são ingeridos. Níveis de liberação de glicose em um mamífero podem ser determinados, por exemplo, medindo os níveis de glicose no sangue.
[0122] A digestão e absorção lenta da glicose a partir de um glucano de liberação lenta de glicose no presente pedido contribui para a resposta de glicose no sangue baixa (resposta glicêmica baixa) após sua ingestão. Acredita-se que essa resposta glicêmica baixa, por sua vez, leva a uma baixa liberação de insulina. Uma resposta glicêmica baixa foi considerada um efeito benéfico fisiologicamente pela Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos. Em longo prazo, uma dieta incluindo carboidratos que reduzem de maneira desejável altas concentrações de glicose no sangue e, desta forma, uma menor demanda por insulina (possivelmente como um glucano de liberação lenta de glicose no presente pedido), é favorável para a prevenção e gerenciamento de diabetes mellitus, doença cardiovascular e, possivelmente, a obesidade. Além disso, os carboidratos de liberação lenta são de interesse em atividade de resistência física onde um uso ótimo de fontes de carboidratos limitadas pode ser vantajoso. Carboidratos e seu fornecimento de glicose para o cérebro desempenham um papel central no desempenho cognitivo e humor. Então, um suprimento de glicose constante e sustentado pode desempenhar um papel na memória e humor.
[0123] Desta forma, é ainda divulgado no presente pedido um método que compreende administrar de forma enteral (por exemplo, ingestão) uma substância (por exemplo, alimento, bebida, suplemento ou produto farmacêutico) a um mamífero, em que a substância compreende uma composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2, em que a administração resulta em menor elevação de glicose no sangue no mamífero ou mais lenta, em comparação a um mamífero em que é administrado uma substância que é desprovida da composição de glucano, mas invés disso, contém a mesma quantidade de um carboidrato contendo glicose facilmente digerível (por exemplo, se 1 g da composição de glucano foi usada, então a comparação é com 1 g do carboidrato contendo glicose facilmente digerível), em que a composição de glucano é produzida por qualquer método ou reação de ramificação no presente pedido. A administração enteral pode, por exemplo, ser através de autoadministração (por exemplo, qualquer forma de ingestão, como comer, beber, tomar um medicamento) ou sem autoadministração (por exemplo, gavagem oral, aparelho para alimentação como tubo de alimentação).
[0124] Desta forma, é ainda divulgado no presente pedido um método para produzir um produto ingerível (por exemplo, comida ou bebida), o método compreendendo incorporar uma composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2 no produto ingerível, em que o índice glicêmico do produto ingerível resultante não é aumentado, ou apenas ligeiramente aumentado, em comparação a um produto ingerível que é desprovido da composição de glucano, e em que a composição de glucano é produzida por qualquer método de ramificação ou reação no presente pedido. COMPOSIÇÕES QUE COMPREENDEM COMPOSIÇÕES DE GLUCANO ALFA-1 ,2 RAMIFICADO PRODUZIDAS NO PRESENTE PEDIDO
[0125] Uma composição que compreende um glucano alfa-1,2 ramificado, conforme atualmente divulgado, pode ser uma composição aquosa, em certas realizações.
[0126] Acredita-se que uma composição aquosa que compreende um glucano alfa-1,2 ramificado pode, em alguns aspectos, ter uma viscosidade de cerca de, ou pelo menos cerca de 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 cPs (centipoise). A viscosidade pode ser medida com uma composição aquosa no presente pedido em qualquer temperatura entre 3°C a cerca 110°C (ou qualquer número inteiro entre 3 e 110°C), por exemplo. A viscosidade pode ser medida à pressão atmosférica (cerca de 760 torr) ou qualquer pressão maior ou menor adequada.
[0127] O pH de uma composição aquosa no presente pedido pode ser entre cerca de 2,0 para cerca de 12,0, por exemplo. Alternativamente, o pH pode ser cerca de 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0; ou entre 5,0 a cerca de 12,0; ou entre cerca de 4,0 e 8,0; ou entre cerca de 5,0 e 8,0, por exemplo.
[0128] Uma composição aquosa no presente pedido pode compreender um solvente que tem pelo menos cerca de 10%, em peso, de água. Em outras realizações, um solvente é pelo menos cerca 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100%, em peso, de água (ou qualquer número valor inteiro entre 10 e 100%, em peso), por exemplo.
[0129] Um glucano alfa-1,2 ramificado no presente pedido pode estar presente em uma composição aquosa em uma %, em peso, de cerca de, ou pelo menos cerca de 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 ou 90%, em peso, por exemplo.
[0130] Uma composição aquosa no presente pedido geralmente pode compreender outros componentes em adição a um glucano alfa-1,2 ramificado. Por exemplo, uma composição aquosa pode compreender um ou mais sais como um sal de sódio (por exemplo, NaCl). Outros exemplos não limitantes de sais incluem os que tem (i) um cátion de alumínio, amônio, bário, cálcio, cromo (II ou III), cobre (I ou II), ferro (II ou III), hidrogênio, chumbo (II), lítio, magnésio, manganês (II ou III), mercúrio (I ou II), potássio, prata, sódio, estrôncio, estanho (II ou IV) ou zinco, e (ii) um ânion de acetato, borato, bromato, brometo, carbonato, clorato, cloreto, clorito, cromato, cianamida, cianeto, dicromato, diidrogênio fosfato, ferricianeto, ferrocianeto, fluoreto, carbonato de hidrogênio, hidrogênio fosfato, sulfato de hidrogênio, sulfeto de hidrogênio, sulfito de hidrogênio, hidróxido, hipoclorito, iodato, iodeto, nitrato, nitreto, nitrito, oxalato, óxido, perclorato, permanganato, peróxido, fosfato, fosfeto, fosfito, silicato, estanato, estanito, sulfato, sulfeto, sulfito, tartarato ou tiocianato. Desta forma, qualquer sal que tem um cátion de (i) acima e um ânion de (ii) acima pode estar em uma composição aquosa, por exemplo. Um sal pode estar presente em uma composição aquosa no presente pedido em uma %, em peso, de cerca de 0,01 a cerca de 10,00 (ou qualquer centésimo incremento entre 0,01 e 10,00), por exemplo.
[0131] Uma composição que compreende um glucano alfa-1,2 ramificado no presente pedido, pode ser não aquoso (por exemplo, uma composição seca), em alguns aspectos. Exemplos dessas realizações incluem pós, grânulos, microcápsulas, flocos, ou qualquer outra forma de matéria particulada. Outros exemplos incluem composições maiores como péletes, barras, grãos, esferas, tabletes, bastonetes ou outros aglomerados. Uma composição não aquosa ou seca no presente pedido, tipicamente tem menos de 3, 2, 1, 0,5 ou 0,1%, em peso, de água compreendida nesse. A quantidade de glucano alfa-1,2 ramificado no presente pedido em uma composição não aquosa ou seca pode ter cerca de, ou pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 ou 99,9%, em peso, por exemplo.
[0132] Uma composição que compreende um glucano alfa-1,2 ramificado no presente pedido pode conter opcionalmente uma ou mais enzimas ativas. Exemplos não limitantes de enzimas adequadas incluem proteases, celulases, hemicelulases, peroxidases, enzimas lipolíticas (por exemplo, enzimas metalolipolíticas), xilanases, lipases, fosfolipases, esterases (por exemplo, arilesterase, poliesterase), peridrolases, cutinases, pectinases, pectato liase, mananases, queratinases, reductases, oxidases (por exemplo, colina oxidase), fenoloxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, malanases, beta-glucanases, arabinosidases, hialuronidases, condroitinases, lacases, metaloproteinases, amadoriases, glucoamilases, arabinofuranosidases, fitases, isomerases, transferases e amilases. Se uma(s) enzima(s) é(são) incluídas, ela(s) pode(m) estar compreendida(s) em uma composição no presente pedido em cerca de 0,0001 a 0,1%, em peso (por exemplo, 0,01 a 0,03%, em peso) de enzima ativa (por exemplo, calculado como proteína de enzima pura), por exemplo.
[0133] Pelo menos uma, duas ou mais celulases podem estar incluídas em uma composição no presente pedido. Uma celulase no presente pedido pode ter atividade de endocelulase (EC 3.2.1.4), atividade de exocelulase (EC 3.2.1.91) ou atividade de celobiase (EC 3.2.1.21). Uma celulase no presente pedido, é uma “celulase ativa” que tem atividade sob condições adequadas para manutenção de atividade de celulase; ela está dentro da técnica para determinar essas condições adequadas.
[0134] Uma celulase no presente pedido pode ser derivada de qualquer fonte microbiana, como uma bactéria ou fungo. Celulases modificadas quimicamente ou celulases mutantes elaboradas geneticamente com proteína são incluídas. Celulases adequadas incluem, mas não se limitam a, celulases do gênero Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Trichoderma, Humicola, Fusarium, Thielavia e Acremonium. Como outros exemplos, uma celulase pode ser derivada a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila ou Fusarium oxysporum; estas e outras celulases são divulgadas na patente US 4435307, 5648263, 5691178, 5776757 e 7604974, que são todas incorporadas ao presente pedido como referência. Celulases de Trichoderma reesei exemplares são divulgadas nas patentes US 4689297, 5814501, 5324649 e publicação de pedido patente internacional documentos WO 92/06221 e WO92/06165, todas as quais são incorporadas ao presente pedido como referência. Celulases exemplares de Bacillus são divulgados no pedido de patente US 6562612, que é incorporada ao presente pedido como referência. Uma celulase, como qualquer uma das anteriores, está preferencialmente em uma forma madura desprovida de um peptídeo sinal N-terminal. Celulases comercialmente disponíveis úteis no presente pedido incluem CELLUZYME® e CAREZYME® (Novozymes A/S); CLAZINASE® e PURADAX® HA (DuPont Industrial Biosciences) e KAC-500(B)® (Kao Corporation).
[0135] Uma ou mais celulases podem ser diretamente adicionadas como ingrediente ao preparar uma composição divulgada no presente pedido. De maneira alternativa, uma ou mais celulases podem ser indiretamente (inadvertidamente) fornecidas na composição divulgada. Por exemplo, a celulase pode ser fornecida em uma composição no presente em virtude de estar presente em uma preparação de enzima sem celulase usada para preparar uma composição. Celulase em composições em que a celulase é indiretamente fornecida a isto pode estar presente em cerca de 0,1 a 10 ppb (por exemplo, menor que 1 ppm), por exemplo.
[0136] Uma celulase, em certas realizações, pode ser termoestável. Termoestabilidade da celulase refere-se à capacidade da enzima manter a atividade após exposição a uma temperatura elevada (por exemplo, cerca de 60 a 70°C) por um período de tempo (por exemplo, cerca de 30 a 60 minutos). A termoestabilidade de uma celulase pode ser medida por sua meia- vida (t1/2) dada em minutos, horas ou dias, durante cujo metade do período de tempo a atividade da celulase é perdida sob condições definidas.
[0137] Uma celulase, em certas realizações, pode ser estável para uma grande variedade de valores de pH (por exemplo, pH neutro ou alcalino como pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 11,0). Essas enzimas podem permanecer estáveis por um período de tempo predeterminado (por exemplo, pelo menos cerca de 15 min., 30 min. ou 1 hora) sob essas condições de pH.
[0138] A concentração efetiva de celulase em uma composição aquosa na qual um tecido é tratado pode ser facilmente determinada por um técnico no assunto. Em processos para cuidados de tecidos, a celulase pode estar presente em uma composição aquosa (por exemplo, líquido de lavagem) em que um tecido é tratado em uma concentração que é de forma mínima cerca de 0,01 a 0,1 ppm de proteína total de celulase, ou cerca de 0,1 a 10 ppb de proteína total de celulase (por exemplo, menos que 1 ppm), para de forma máxima cerca de 100, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000 ou 5000 ppm de proteína total de celulase, por exemplo.
[0139] Uma composição que compreende um glucano alfa-1,2 ramificado no presente pedido pode estar sob a forma de, e/ou compreendida em um produto para cuidados domésticos, produto para cuidados pessoais, produto industrial, produto farmacêutico ou produto alimentício, por exemplo, como qualquer um dos produtos descritos abaixo. Qualquer uma destas composições pode ser composições aquosas, por exemplo.
[0140] Produtos para cuidados pessoais no presente pedido não são particularmente limitados e incluem, por exemplo, composições para cuidados da pele, composições cosméticas, composições antifúngicas e composições antibacterianas. Os produtos para cuidados pessoais no presente pedido podem estar sob a forma de, por exemplo, loções, cremes, pastas, bálsamos, unguentos, pomadas, géis, líquidos, combinações desses e similares. Os produtos para cuidados pessoais descritos no presente pedido podem incluir pelo menos um ingrediente ativo, se desejável. Um ingrediente ativo é geralmente reconhecido como um ingrediente que causa um efeito farmacológico pretendido. Um produto para cuidados pessoais no presente pedido pode ser usado em aplicações de limpeza para cuidados pessoais, em certas realizações.
[0141] Um produto para cuidados da pele pode tipicamente incluir pelo menos um ingrediente ativo para o tratamento ou prevenção de doenças da pele, fornecendo um efeito cosmético, ou para fornecer um benefício hidratante à pele, como óxido de zinco, vaselina, vaselina branca, óleo mineral, óleo de fígado de bacalhau, lanolina, dimeticona, gordura dura, vitamina A, alantoína, calamina, caulim, glicerina ou aveia coloidal, e combinações dos mesmos. Um produto para cuidados da pele pode incluir um ou mais fatores hidratantes naturais como ceramidas, ácido hialurônico, glicerina, esqualano, aminoácidos, colesterol, ácidos graxos, triglicerídeos, fosfolipídeos, glicosfingolipídeos, ureia, ácido linoleico, glicosaminoglicanos, mucopolissacarídeo, lactato de sódio ou pirrolidona carboxilato de sódio, por exemplo. Outros ingredientes que podem ser incluídos em um produto para cuidados da pele incluem, sem limitações, glicerídeos, óleo de semente de damasco, óleo de canola, esqualeno, óleo de coco, óleo de milho, óleo de jojoba, cera de jojoba, lecitina, azeite, óleo de cártamo, óleo de gergelim, manteiga de karitê, óleo de soja, óleo de amêndoa doce, óleo de girassol, óleo de malaleuca, manteiga de karitê, óleo de palma, colesterol, ésteres de colesterol, ésteres de cera, ácidos graxos e óleo de laranja.
[0142] Um produto para cuidados pessoais no presente pedido também pode estar sob a forma de maquiagem, batom, rímel, ruge, base, blush, delineador, lápis labial, brilho labial, outros cosméticos, protetor solar, bloqueador solar, esmalte de unha, condicionador de unha, gel de banho, gel para banho, lavagem corporal, lavagem facial, bálsamo labial, condicionador de pele, creme frio, hidratante, spray corporal, sabonete, esfoliação corporal, esfoliante, adstringente, loção esfoliante, depilatório, solução de lavagem permanente, formulação anticaspa, composição antiperspirante, desodorante, produto de barbear, produto de pré-barbear, produto pós-barba, produto de limpeza, gel de pele, enxaguatório, pasta de dentes ou enxaguatório bucal, por exemplo.
[0143] Um produto para cuidados pessoais, em alguns aspectos, pode ser um produto para cuidados do cabelo. Exemplos produtos para cuidados do cabelo no presente pedido incluem xampu, condicionador para cabelo (com ou sem enxague), creme de enxague, tintura para cabelo, produto para coloração do cabelo, produto para dar brilho ao cabelo, sérum para cabelo, produto para frizar o cabelo, produto para reparo de pontas do cabelo, mousse, fixador para cabelo e gel para penteado. Um produto para cuidados do cabelo pode estar sob a forma de um líquido, pasta, gel, sólido ou pó, em algumas realizações. Um produto para cuidados do cabelo conforme atualmente divulgado tipicamente compreende um ou mais dos seguintes ingredientes, que são geralmente usados para a formular produtos para cuidados do cabelo: tensoativos aniônicos como polioxietilenolauril éter sulfato de sódio, tensoativos catiônicos como cloreto de esteariltrimetilamônio e/ou cloreto de disteariltrimetilamônio; tensoativos não iônicos como monostearato de glicerila, monopalmitato de sorbitane/ou éter de polioxietilenocetil; agentes umectantes, como propileno glicol, 1,3-butileno glicol, glicerina, sorbitol, sais de ácido piroglutâmico, aminoácidos e/ou trimetilglicina; hidrocarbonetos como parafinas líquidas, vaselina, parafinas sólidas esqualano e/ou oligômeros de olefinas; álcoois superiores como álcool estearílico e/ou álcool cetílico; agentes superengordurantes; agentes anticaspa; desinfetantes; anti-inflamatórios; drogas em bruto; polímeros solúveis em água, como metilcelulose, hidroxicelulose e/ou quitina parcialmente desacetilada; antissépticos como parabeno; absorvedores de luz ultravioleta; agentes perolizantes; ajustadores de pH; perfumes; e pigmentos.
[0144] Um produto farmacêutico no presente pedido pode estar sob a forma de uma emulsão, líquido, elixir, gel, suspensão, solução, creme, ou pomada, por exemplo. Além disso, um produto farmacêutico do presente pedido pode estar sob a forma de qualquer um dos produtos para cuidados pessoais divulgados no presente pedido, como uma composição antibacteriana ou antifúngica. Um produto farmacêutico pode ainda compreender um ou mais veículos, diluentes e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis. Um glucano alfa-1,2 ramificado divulgado no presente pedido também pode ser usado em cápsulas, encapsulantes, revestimentos de comprimidos e excipientes para medicamentos e drogas.
[0145] Um produto para cuidados domésticos e/ou industrial no presente pedido pode estar sob a forma de compostos para fita de junção de gesso acartonado (drywall); argamassas; rejuntes; emplastros de cimento; emplastros em spray; estuque de cimento; adesivos; colas; texturizadores de parede/teto; ligantes e auxiliares para fundição de fita, formação de extrusão, moldagem por injeção e cerâmicas; aderentes em spray e auxiliares de suspensão/dispersão de pesticidas, herbicidas e fertilizantes; produtos para cuidados de tecidos, como amaciantes e detergentes para lavagem de roupas; detergentes para lavagem de louça; limpadores de superfícies duras; desodorisadores; emulsões de polímeros; géis como géis à base de água; soluções tensoativas; tintas (paints) como tintas à base de água, revestimentos protetores; adesivos; selantes e vedantes; tintas (inks) como tintas à base de água; fluidos para metalurgia; ou fluidos de limpeza de metal à base de emulsão usado em galvanoplastia, fosfatização, galvanização e/ou operações de limpeza de metal em geral, por exemplo. Um produto para cuidados domésticos ou produto industrial no presente pedido, pode ser usado em aplicações de limpeza, em certas realizações, e, como tal, pode estar compreendido em composições detergentes, por exemplo.
[0146] Acredita-se que glucanos alfa-1,2 ramificados divulgados no presente pedido sejam úteis para fornecer uma ou mais das seguintes propriedades físicas de um produto para cuidados pessoais, produto farmacêutico, produto para cuidados doméstico, produto industrial ou produto alimentício: modificação de índice glicêmico, fibras alimentares, espessantes, estabilidade de congelamento/descongelamento, lubrificação, retenção e liberação de umidade, textura, consistência, retenção de formato, emulsificação, ligação, suspensão, dispersão, gelificação, redução da dureza de minerais, por exemplo. Exemplos de uma concentração ou quantidade de um glucano alfa-1,2 ramificado em um produto pode ser qualquer uma das porcentagens, em peso, fornecidas acima, por exemplo.
[0147] Um glucano alfa-1,2 ramificado, conforme atualmente divulgado pode ser formulado (por exemplo, fundido, misturado, incorporado, etc.) com um ou mais materiais adequados para uso em um produto alimentício e/ou outros produtos ingeríveis no presente pedido (por exemplo, suplementos nutricionais, produtos farmacêuticos). Opcionalmente, um glucano alfa-1,2 ramificado no presente pedido pode ser fornecido em um xarope para uso na preparação e/ou modificação de qualquer alimento ou outro produto ingerível conforme atualmente divulgado.
[0148] Em algumas realizações, um glucano alfa-1,2 ramificado no presente pedido pode ser incluído em um produto com pelo menos um dos seguintes: monossacarídeos, dissacarídeos, glicose, sacarose, frutose, leucrose, xarope de milho, , xarope de milho de alta frutose, açúcar isomerizados, maltose, trealose, panose, rafinose, celobiose, isomaltose, mel, açúcar de bordo, adoçantes derivados de frutas, sorbitol, maltitol, isomaltitol, lactose, nigerose, kojibiose, xilitol, eritritol, dihidrocalcona, esteviosídeo, acessulfame de potássio, alitame, neotame, glicirrizina, taumantina, sucralose, éster metílico de L-aspartil-L-fenilalanina, sacarina, maltodextrina, amido, amido de batata, amido de tapioca, dextrano, fibra de milho solúvel, maltodextrinas resistentes, maltodextrinas ramificadas, inulinas, polidextrose, fruto- oligossacarídeos, galacto-oligossacarídeos, xilo-oligossacarídeos, arabinoxilo- oligossacarídeos, nigero-oligossacarídeos, gentio-oligossacarídeos, hemicelulose, xarope de oligômero de frutose, isomalto-oligossacarídeos, preenchedores, excipientes e aglutinantes.
[0149] Em certas realizações, um produto ingerível compreende 0,01 a 99%, em peso, 0,1 a 90%, em peso, 1 a 90%, em peso, ou 5 a 80 %, em peso, de glucano alfa-1,2-ramificado no presente pedido em uma base de sólidos secos.
[0150] O termo “alimento” se destina a englobar alimentos para consumo humano, bem como para consumo animal (por exemplo, mamíferos). Por “alimento funcional” entende-se qualquer alimento fresco ou processado reivindicado para ter uma propriedade promotora de saúde e/ou preventiva de doenças e/ou de redução de risco de doença, além da função nutricional básica de fornecimento de nutrientes. Os alimentos funcionais podem incluir, por exemplo, alimentos processados ou alimentos fortificados com aditivos promotores da saúde. Exemplos de alimentos funcionais são alimentos fortificados com vitaminas ou alimentos fermentados com culturas vivas.
[0151] Outros ingredientes que podem ser incluídos em um produto ingerível no presente pedido são água ou outras soluções aquosas, gorduras, açúcares, amido, aglomerantes, espessantes, corantes, flavorizantes, odorizantes, acidulantes (como ácido láctico ou ácido málico, entre outros), estabilizantes, adoçantes de alta intensidade e/ou minerais, entre outros.
[0152] Um ou mais produtos de glucano alfa-1,2 ramificado no presente pedido podem ser fornecidos em qualquer uma das realizações de alimentos atualmente divulgadas. Dependendo do(s) efeito(s) desejado(s), (i) um glucano alfa-1,2 ramificado com qualidades de fibra dietética e/ou (ii) um glucano alfa-1,2 ramificado que tem um índice glicêmico baixo pode ser usado conforme apropriado.
[0153] Exemplos de produtos alimentícios adequados incluem pão, cereais matinais, biscoitos, bolos, biscoitos, bolachas, iogurte, quefir, missô, natto, tempeh, kimchee, chucrute, água, leite, suco de fruta, suco de vegetais, bebidas gaseificadas, bebidas não gaseificadas, café, chá, cerveja, vinho, licor, bebidas alcoólicas, salgadinhos, sopas, sobremesas congeladas, frituras, pizza, produtos de massa, produtos de batata, produtos de arroz, produtos de milho, produtos de trigo, laticínios, doces, barras nutritivas, cereais, massa, carnes e queijos processados, iogurtes, sorvetes, bebidas à base de leite, temperos para saladas, molhos, coberturas, sobremesas, produtos de confeitaria, barras à base de cereais, pratos preparados e semelhantes.
[0154] Em certas realizações, um produto ingerível no presente pedido pode compreender pelo menos uma fonte de fibra alimentar. Nos aspectos em que um glucano alfa-1,2 ramificado no presente pedido, é uma fibra alimentar por si só (por exemplo, glucano que tem cerca de 15 a 45% de ramificações 1,2 em alguns casos), esse glucano pode ser a única fonte de fibra, ou em adição a uma ou mais outras fontes de fibra. Fibras alimentares adequadas no presente pedido incluem oligo- ou polissacarídeos como maltodextrinas/fibras de dextrina resistentes/ramificadas (por exemplo, NUTRIOSE® da Roquette Freres, Lestrem, França; FIBERSOL-2® da ADM- Matsutani LLC, Decatur, Illinois), polidextrose (por exemplo, LITESSE® ou LITESSE® ULTRA da Danisco-DuPont Nutrition & Health, Wilmington, DE), fibra de milho solúvel (por exemplo, PROMITOR® da Tate & Lyle, Londres, UK), isomalto-oligossacarídeos (IMOs), oligossacarídeos alternano e/ou malto- alternano (MAOs) (por exemplo, FIBERMALT™ da Aevotis GmbH, Potsdam, Alemanha; SUCROMALT™ da Cargill Inc., Minneapolis, MN), pululano, amido resistente, inulina, fruto-oligossacarídeos (FOS), galacto-oligossacarídeos (GOS), xilo-oligossacarídeos, arabinoxilo-oligossacarídeos, nigero- oligossacarídeos, gentio-oligossacarídeos, hemicelulose e xarope de oligômero de frutose.
[0155] Um glucano alfa-1,2 ramificado no presente pedido pode ser adicionado a alimentos como uma substituição ou suplemento para carboidratos convencionais, por exemplo.
[0156] Em certas realizações, um produto ingerível no presente pedido pode compreender pelo menos um adoçante artificial incluindo, mas não se limitando a, estévia, aspartame, sucralose, neotame, acessulfame de potássio, sacarina, e qualquer combinação dos mesmos. Um produto ingerível no presente pedido pode compreender pelo menos um substituto de açúcar, por exemplo, como brazeína, curculina, eritritol, glicerol, glicirrizina, hidrolisados de amido hidrogenado, inulina, isomalte, lactitol, mabinlina, maltitol, malto- oligossacarídeo, oligossacarídeos malto-alternano (como XTEND ® SUCROMALT™, disponível junto à Cargill Inc., Minneapolis, MN), manitol, miraculina, uma mistura de mogrósido, monatina, monelina, osladina, pentadina, sorbitol, estévia, tagatose, taumatina, xilitol e qualquer combinação dos mesmos.
[0157] Em certas realizações, um produto alimentício contendo um glucano alfa-1,2 ramificado no presente pedido terá uma resposta glicêmica, índice glicêmico e/ou carga glicêmica mais baixa (por exemplo, pelo menos cerca 5%, 10%, 15%, 20%, ou 25% mais baixa) do que um produto alimentício similar em que um carboidrato convencional (por exemplo, um carboidrato contendo glicose facilmente digerível) é usado (por exemplo, quando usado na mesma quantidade ou similar). Além disso, devido a um glucano alfa-1,2 ramificado, em alguns aspectos, ser caracterizado por ter pouca ou nenhuma digestibilidade no estômago e/ou intestino delgado humano, o teor calórico do produto alimentício é reduzido (após a comparação acima). Um glucano alfa-1,2 ramificado pode ser usado em produtos alimentícios isoladamente ou em combinação com agentes de volume, como álcoois de açúcar ou maltodextrinas, para reduzir o teor calórico, para melhorar o perfil nutricional do alimento e/ou como uma substituição parcial para gordura.
[0158] Contempla-se que um glucano alfa-1,2 ramificado pode ser usado em produtos alimentícios como amaciador ou texturizante, para aumentar a crocância ou estalo, para aprimorar a atração visual e/ou para aprimorar a reologia de massa, massa líquida ou outras composições alimentícias. Contempla-se também que o glucano seja usado em produtos alimentícios como um umectante, para aumentar a vida útil do produto, para produzir uma textura mais úmida e mais macia, para reduzir a atividade de água e/ou para imobilizar e gerir a água. Usos adicionais do glucano podem incluir: a substituição de água com ovos e/ou para aumentar o brilho superficial de um produto alimentício, alterar a temperatura de gelificação do amido da farinha, modificar a textura do produto e aumentar o escurecimento do produto.
[0159] Um glucano alfa-1,2 ramificado pode ser usado em uma variedade de tipos de produtos alimentícios. Um tipo de produto alimentício em que o presente glucano pode ser útil é o produto de panificação (alimentos assados), como bolos, brownies, biscoitos, biscoitos crocantes, muffins, pães e massas doces. Existem duas categorias principais de produtos de panificação: os fermentados com levedura e os quimicamente fermentados. Em produtos fermentados com levedura, como donuts, massas doces e pães, um glucano no presente pedido pode ser usado para substituir açúcares, mas uma pequena quantidade de açúcar pode ainda ser desejável devido à necessidade de um substrato de fermentação para a levedura ou para escurecimento da crosta. Um glucano alfa-1,2 ramificado em um xarope, por exemplo, pode ser adicionado com outros líquidos como um substituto direto para xaropes não contendo fibras ou adoçantes líquidos. A massa seria então processada em condições normalmente usadas na indústria de panificação, incluindo sendo misturada, fermentada, divida, formada ou extrudada em pães ou formas, fermentadas e cozidas ou fritas. O produto pode ser assado ou frito com o uso de condições semelhantes aos produtos tradicionais. Os pães são assados geralmente a temperaturas que variam de 420 a 520°F (216 a 271°C) por 20 a 23 minutos e donuts podem ser fritos a temperaturas que variam de 400 a 415°F (204 a 213°C), embora outras temperaturas e tempos também podem ser usados.
[0160] Os produtos fermentados quimicamente têm tipicamente mais açúcar e podem conter um nível mais elevado das composições de carboidratos e/ou xaropes comestíveis que compreendem α-glucano no presente pedido. Um biscoito acabado pode conter 30% de açúcar, que pode ser substituído, total ou parcialmente, por composições de carboidratos e/ou xaropes que compreendem a presente composição de glucano. Esses produtos podem ter um pH de 4 a 9,5, por exemplo. O teor de umidade pode estar entre 2 a 40%, por exemplo.
[0161] As composições de glucano no presente pedido (por exemplo, em um xarope) podem ser facilmente incorporadas e podem ser adicionadas à gordura no início da mistura durante uma etapa de creme ou em qualquer método similar ao xarope ou adoçante seco que está sendo usado para substituir. O produto seria misturado e depois formado, por exemplo, sendo laminado, tendo um corte rotativo, corte por arame, ou através de outro processo de formação. Os produtos seriam então assados sob condições típicas de panificação, por exemplo, a 200 a 450°F (93 a 232°C).
[0162] Outro tipo de produto alimentício em que um glucano no presente pedido (por exemplo, em um xarope) pode ser usado é o cereal matinal. Por exemplo, os xaropes contendo glucano poderiam ser usados para substituir parcial ou totalmente o açúcar em pedaços de cereal extrudados e/ou na cobertura no exterior desses pedaços. A cobertura é tipicamente 30 a 60% do peso total do pedaço de cereal acabado. O xarope pode ser aplicado em um spray ou regado, por exemplo.
[0163] Outro tipo de produto alimentício em que um glucano alfa- 1,2 ramificado no presente pedido pode ser usado é produto lácteo. Exemplos de produtos lácteos adequados incluem iogurte, iogurte líquido, bebidas à base de leite, leites aromatizados, smoothies, sorvetes, shakes, queijo cottage, molho de queijo cottage e sobremesas lácteas, como quarg e os produtos espumados tipo mousse. Isso inclui laticínios que pretendem a ser consumidos diretamente (como smoothies embalados), bem como aqueles que pretendem ser misturados com outros ingredientes (como smoothies misturados). Ele pode ser usado em produtos lácteos pasteurizados, como aqueles que são pasteurizados a uma temperatura de 160-285°F (71 a 141 °C).
[0164] Outro tipo de produto alimentício em que um glucano alfa- 1,2 ramificado no presente pedido pode ser usado são confeitos. Exemplos de confeitos em que pode ser usado incluem balas duras, fondants, nougats e marshmallows, balas de gelatina ou de goma, gelatinas, chocolate, alcaçuz, gomas de mascar, caramelos e toffees, balas para mastigar, balas de menta, confeitos em tabletes e petiscos de frutas. Em petiscos de fruta, uma composição que compreende um glucano no presente pedido poderia ser usada em combinação com suco de fruta. O suco de fruta forneceria a maior parte da doçura, e a composição que compreende o glucano reduziria o teor de açúcar total e possivelmente adicionaria fibra. Composições que compreendem o glucano podem ser adicionadas à pasta fluida de bala inicial e aquecidas até ao conteúdo de sólidos acabados. A pasta líquida pode ser aquecida a 200 a 305°F (93 a 152°C) para se obter o conteúdo de sólido acabado. O ácido pode ser adicionado antes ou depois do aquecimento para dar um pH final de 2 a 7. A composição que compreende o glucano poderia ser usada como uma substituição para 0 a 100% do açúcar e 1 a 100% do xarope de milho ou outros adoçantes presentes.
[0165] Outro tipo de produto alimentício em que um glucano alfa- 1,2 ramificado no presente pedido pode ser usado são geleias e gelatinas. Geleias e gelatinas são feitas de fruta; geleia contém pedaços de fruta, enquanto a gelatina é feita de suco de fruta. A composição que compreende o presente glucano pode ser usada no lugar do açúcar ou outros adoçantes da seguinte forma: pesar a fruta e o suco em um tanque; pré-misturar o açúcar, a composição contendo alfa-glucano e pectina; adicionar a composição seca ao líquido e cozinhar a uma temperatura de 214-220°F (101-104°C); armazenar ainda quente em frascos e fazer a retorta por 5 a 30 minutos.
[0166] Outro tipo de produto alimentício em que um glucano alfa- 1,2 ramificado no presente pedido pode ser usado são bebidas. Exemplos de bebidas adequadas incluem bebidas gaseificadas, sucos de fruta, misturas de suco concentrado (por exemplo, mistura de margarita), águas puras e misturas secas para bebidas. O uso de uma fibra alimentar de glucano alfa-1,2 ramificado no presente pedido pode superar problemas de clareza que resultam quando outros tipos de fibras são adicionados às bebidas. Pode ser possível uma substituição completa de açúcares (o que poderia ser, por exemplo, até 12% ou mais da fórmula total).
[0167] Outro tipo adequado de produto alimentício são os recheios com alto teor de sólidos. Exemplos de recheios com alto teor de sólidos incluem recheios em barras, tortas, donuts e biscoitos. Um recheio com alto teor de sólidos pode ser um recheio ácido/de fruta ou um recheio saboroso, por exemplo. Um glucano alfa-1,2 ramificado no presente pedido poderia ser adicionado a produtos que seriam consumidos como são, ou produtos que seriam submetidos a um processamento posterior, por um processador de alimentos (cozimento adicional) ou por um consumidor (recheio estável assado). Em certas realizações, os recheios com alto teor de sólidos teriam uma concentração de sólidos entre 67 a 90%. Os sólidos podem ser completamente substituídos por uma composição que compreende o α-glucano ou podem ser usados para uma substituição parcial dos outros adoçantes sólidos presentes (por exemplo, substituição dos sólidos atuais de 5 a 100%). Tipicamente os recheios de frutas teriam um pH de 2-6, enquanto que os recheios salgados teriam entre pH 4 a 8. Os recheios poderiam ser preparados a frio ou aquecidos até 250°F (121°C) para evaporar até o conteúdo de sólidos acabados.
[0168] Outro tipo adequado de produto alimentício que pode compreender glucano no presente pedido é representado por lanches extrudados e folhados. Exemplos de extrudados e folhados incluem lanches estufados, biscoitos, chips de tortilha e chips de milho. Na preparação de uma peça extrudada, uma composição que compreende o presente glucano seria adicionada diretamente com os produtos secos. Uma pequena quantidade de água seria adicionada na extrusora, e então passaria por várias zonas que variam de 100° a 300°F (38 a 149°C). O produto seco pode ser adicionado a níveis de 0 a 50% da mistura de produtos secos. Um xarope que compreende o glucano também poderia ser adicionado em uma das porções líquidas ao longo da extrusora. O produto sairia com um teor de umidade baixo (5%) e depois é cozido para remover o excesso de umidade, ou a um teor de umidade ligeiramente mais alto (10%) e depois fritar para remover a umidade e cozinhar o produto. O cozimento pode ser feito a temperaturas de até 500° F (260°C) por 20 minutos. O cozimento seria mais tipicamente a 350°F (177°C) por 10 minutos. A fritura seria tipicamente a 350°F (177°C) por 2 a 5 minutos. Em um lanche folhado, o glucano poderia ser usado como uma substituição parcial dos outros ingredientes secos (por exemplo, farinha). O glucano poderia ter de 0 a 50% do peso seco. O produto seria misturado a seco, e depois adicionado água para formar a massa coesiva. A mistura do produto poderia ter um pH de 5 a 8. A massa seria então folhada e cortada e depois cozida ou frita. O cozimento pode ser feito a temperaturas de até 500°F (260°C) por 20 minutos. A fritura seria tipicamente a 350°F (177°C) por 2 a 5 minutos. Outro benefício potencial do uso de uma composição que compreende o glucano é uma redução do teor de gordura de petiscos fritos em até 15% quando é adicionada como um ingrediente interno ou como uma cobertura no exterior de uma comida frita.
[0169] Outro tipo de produto alimentício em que um glucano no presente pedido pode ser usado são as sobremesas de gelatina. Os ingredientes para sobremesas de gelatina são frequentemente vendidos como uma mistura seca com gelatina como um agente gelificante. Os sólidos de açúcar podem ser substituídos parcial ou totalmente por uma composição que compreende o presente glucano na mistura seca. A mistura seca pode então ser misturada com água e aquecida a 212°F (100°C) para dissolver a gelatina e depois adicionar mais água e/ou fruta para completar a sobremesa de gelatina. A gelatina é então deixada para resfriar e endurecer. A gelatina também pode ser vendida em embalagens estáveis em prateleiras. Nesse caso, o estabilizante é normalmente baseado em carragenano. Conforme estabelecido acima, uma composição que compreende o alfa-glucano poderia ser usada para substituir até 100% dos outros adoçantes sólidos. Os ingredientes secos são misturados nos líquidos e depois pasteurizados e colocados em xícaras e deixados para resfriar e endurecer.
[0170] Outro tipo de produto alimentício em que uma composição que compreende glucano no presente pedido pode ser usada são barras para lanche. Exemplos de barras para lanche em que pode ser usado incluem barras de substituição de café da manhã e refeições, barras de nutrição, barras de granola, barras de proteína e barras de cereais. Poderia ser usada em qualquer parte das barras para lanche, como no recheio com elevado teor de sólidos, no xarope de aglutinação ou na porção particulada. Uma substituição completa ou parcial do açúcar no xarope de aglutinação pode ser possível. O xarope de aglutinação tem tipicamente de 50 a 90% de sólidos e aplicado em uma razão que varia de 10% de xarope de aglutinação a 90% de particulados, a 70% de xarope de aglutinação a 30% de particulados. O xarope de aglutinação é feito por aquecimento de uma solução de adoçantes, agentes de volume e outros ligantes (como amido) a 160 a 230°F (71 a 110°C) (dependendo dos sólidos acabados necessários no xarope). O xarope é então misturado com os particulados para cobrir os particulados, proporcionando uma cobertura ao longo da matriz. Uma composição que compreende o glucano também poderia ser usada nos próprios particulados. Essa poderia ser uma peça extrudada, diretamente expandida ou gun puffed. Poderia ser usada em combinação com outro ingrediente de grão, farinha de milho, farinha de arroz ou outro ingrediente similar.
[0171] Outro tipo de produto alimentício em que uma composição que compreende um glucano no presente pedido pode ser usada são queijo, molhos de queijo e outros produtos de queijo. Exemplos de queijos, molhos de queijo e outros produtos de queijo em que pode ser usada incluem queijo com baixo teor de leite, queijo com baixo teor de gordura e queijo com baixo teor calórico. Nos queijos em bloco, pode ajudar a aprimorar as características de fusão, ou a diminuir o efeito da limitação de fusão adicionada por outros ingredientes como amido. Também pode ser usada em molhos de queijo, por exemplo, como um agente de volume, para substituir gordura, sólidos de leite ou outros agentes de volume típicos.
[0172] Outro tipo de produto alimentício em que um glucano no presente pedido pode ser usado são películas que são comestíveis e/ou solúveis em água. Exemplos de películas nas quais pode ser usada incluem películas que são usadas para finalizar misturas secas para uma variedade de alimentos e bebidas destinadas a serem dissolvidas em água ou películas que são usadas para fornecer cor ou sabores como uma película de especiarias que é adicionada a um alimento após o cozimento ainda quente. Outras aplicações de películas incluem, mas não se limitam a, cascas de frutas e vegetais e outras películas flexíveis.
[0173] Em outra realização, as composições que compreendem um glucano no presente pedido podem ser usadas em sopas, xaropes, molhos e temperos. Um tempero típico poderia ter de 0 a 50% de óleo, com pH na faixa de 2 a 7. Poderia ser processado frio ou quente. Seria misturado, e então o estabilizante seria adicionado. A composição que compreende o glucano poderia ser facilmente adicionada na forma líquida ou seca com os outros ingredientes conforme necessário. A composição de tempero pode necessitar de aquecimento para ativar o estabilizante. As condições de aquecimento típicas seriam de 170 a 200°F (77 a 93°C) por 1 a 30 minutos. Após resfriamento, o óleo é adicionado para fazer uma pré-emulsão. O produto é então emulsionado com o uso de um homogeneizador, moinho coloide ou outro processo de emulsificação. Os molhos podem conter desde 0 a 10% de óleo e de 10 a 50% de sólidos totais, e podem ter um pH de 2 a 8. Os molhos podem ser processados a frio ou quente. Os ingredientes são misturados e depois processados pelo calor. Um glucano no presente pedido poderia ser facilmente adicionado na forma líquida ou seca com os outros ingredientes conforme necessário. O aquecimento típico seria de 170 a 200°F (77 a 93°C) por 1 a 30 minutos. As sopas têm, mais tipicamente, 20 a 50% de sólidos e com pH mais neutro (4 a 8). Podem ser uma mistura seca, à qual poderia ser adicionada uma composição seca que compreende glucano, ou uma sopa líquida que é enlatada e depois submetida à retorta. Em sopas, xarope de milho resistente poderia ser usado até 50% de sólidos, embora um uso mais típico seria distribuir 5g de fibra/porção.
[0174] Outro tipo de produto alimentício em que um glucano no presente pedido pode ser usado são os cremes para café. Exemplos de cremes para café em que podem ser usadas incluem cremes líquidos e secos. Um creme para café misturado a seco pode ser misturado com pós comerciais para creme dos seguintes tipos de gordura: óleo de soja, coco, palma, girassol ou canola ou óleo de manteiga. Essas gorduras podem ser não hidrogenadas ou hidrogenadas. A composição que compreende o glucano pode ser adicionada como uma fonte de fibra, opcionalmente em conjunto com fruto- oligossacarídeos, polidextrose, inulina, maltodextrina, amido resistente, sacarose e/ou sólidos convencionais de xarope de milho. A composição também pode conter adoçantes de alta intensidade, como sucralose, acessulfame de potássio, aspartame, ou combinações dos mesmos. Esses ingredientes podem ser misturados a seco para produzir a composição desejada. Um pó cremoso seco por spray é uma combinação de gordura, proteína e carboidratos, emulsificantes, sais emulsificantes, adoçantes e agentes antiaglomerantes. A fonte de gordura pode ser uma ou mais dentre óleo de soja, coco, palma, girassol, ou canola ou óleo de manteiga. A proteína pode ser caseinato de sódio ou cálcio, proteínas de leite, proteínas de soro de leite, proteínas de trigo ou proteínas de soja. O carboidrato poderia ser uma composição que compreende o glucano sozinho ou em combinação com fruto-oligossacarídeos, polidextrose, inulina, amido resistente, maltodextrina, sacarose, xarope de milho ou qualquer combinação dos mesmos. Os emulsificantes podem ser mono e diglicerídeos, mono e diglicerídeos acetilados ou monoésteres de propilenoglicol. Os sais podem ser citrato trissódico, fosfato monossódico, fosfato dissódico, fosfato trissódico, pirofosfato tetrassódico, fosfato monopotássico e/ou fosfato dipotássico. A composição também pode conter adoçantes de alta intensidade, como os descritos acima. Agentes antiaglomerantes adequados incluem silico- aluminatos de sódio ou dióxidos de sílica. Os produtos são combinados em pasta líquida, opcionalmente homogeneizados e secos por pulverização tanto sob a forma granular como aglomerada. Os cremes líquidos para café são simplesmente uma emulsão homogeneizada e pasteurizada de gordura (tanto gordura láctea como óleo vegetal hidrogenado), alguns sólidos ou caseinatos de leite, xarope de milho e baunilha ou outros aromas, bem como uma mistura estabilizante. O produto é geralmente pasteurizado por HTST (temperatura elevada por curto período de tempo) a 185°F (85°C) por 30 segundos ou UHT (temperatura ultra alta) a 285°F (141°C) por 4 segundos, e homogeneizado em dois estágios de homogeneização a 500 a 3000 psi (3,45 a 20,7 MPa) no primeiro estágio e 200 a 1000 psi (1,38 a 6,89 MPa) no segundo estágio. O creme para café geralmente é estabilizado de modo que não se quebre quando adicionado ao café.
[0175] Outro tipo de produto alimentício em que um glucano no presente pedido pode ser usado (por exemplo, como um xarope) são coberturas de alimentos como coberturas doces macias (icings), coberturas doces duras (frostings) e glacês. Nas coberturas doces macias (icings) e coberturas doces duras (frostings), o glucano pode ser usado como uma substituição do adoçante (completa ou parcial) para reduzir o teor calórico e aumentar o teor de fibra. Glacês tem tipicamente cerca de 70 a 90% de açúcar, com a maioria do resto sendo água, e o glucano pode ser usado para substituir o açúcar totalmente ou parcialmente. Coberturas doces duras (frostings) contém tipicamente cerca de 2 a 40% de uma combinação de gordura líquida/sólida, cerca de 20 a 75% de adoçantes sólidos, cor, sabor e água. O glucano pode ser usado para substituir tudo ou parte dos adoçantes sólidos, ou como um agente de volume em sistemas com teor de gordura mais baixo.
[0176] Outro tipo de produto alimentício em que um glucano no presente pedido pode ser usado é o alimento para animais de estimação, como alimento seco ou úmido para cães. Alimentos para animais de estimação são feitos em uma variedade de maneiras, como extrusão, formação e formulação como molhos. O glucano poderia ser usado a níveis de 0 a 50% em cada um destes tipos.
[0177] Outro tipo de produto alimentício em que um glucano no presente pedido pode ser usado são peixes e carnes. O xarope de milho convencional já é usado em algumas carnes, por isso um xarope contendo glucano no presente pedido pode ser usado como um substituto parcial ou completo. Por exemplo, o xarope de glucano pode ser adicionado à salmoura antes de ser revolvido a vácuo ou injetado na carne. Pode ser adicionado com sal e fosfatos, e opcionalmente com ingredientes de aglutinação à água como amido, carragenano ou proteínas de soja.
PROPRIEDADES FISIOLÓGICAS BENÉFICAS PRODUÇÃO DE GÁS
[0178] Uma rápida taxa de produção de gases no trato gastrointestinal inferior dá origem ao desconforto gastrointestinal como flatulência e inchaço, enquanto que se produção de gases é gradual e baixa, o corpo pode lidar mais facilmente. Por exemplo, pedido, é possível que a inulina dê um estímulo de produção de gases, que é rápido e alto em comparação ao glucano divulgado em uma dosagem equivalente, enquanto que, em algumas realizações, o glucano divulgado tem uma taxa de liberação de gases que é mais baixo que o da inulina em uma dosagem equivalente.
[0179] Em uma realização, o consumo de produtos alimentícios que contêm o glucano divulgado pode resultar em uma taxa de produção de gases que é bem tolerada para aplicações alimentícias. Em uma realização, a taxa relativa de produção de gases não é maior que a taxa observada para inulina sob condições similares, assim como a mesma ou menor que a inulina, ou menor que a inulina e muito menor que a inulina em uma dosagem equivalente. Em outra realização, a taxa relativa de formação de gases é medida durante 3 horas ou 24 horas com o uso de métodos descritos no presente pedido. Em algumas realizações, a taxa de formação de gases é pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% ou 30% menor que a taxa observada para inulina sob as mesmas condições de reação.
PRODUÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS DE CADEIA CURTA
[0180] O uso de um glucano no presente pedido pode facilitar a produção de metabólitos que produzem energia através da fermentação colônica. O uso de um glucano no presente pedido pode facilitar a produção de ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs), como propionato e/ou butirato. SCFAs são conhecidos por reduzir o colesterol. Consequentemente, um glucano no presente pedido pode diminuir o risco de desenvolvimento de colesterol alto. Como a produção de SCFAs ou o aumento da razão de SCFA acetato é benéfica para o controle dos níveis de colesterol em um mamífero com necessidade do mesmo, a composição de glucano divulgada pode ser de particular interesse para nutricionistas e consumidores para a prevenção e/ou tratamento de riscos cardiovasculares. Desta forma, em outro aspecto, a divulgação fornece um método para melhorar a saúde de um indivíduo que compreende administrar uma composição que compreende a composição de glucano divulgada a um sujeito em uma quantidade efetiva para exercer um efeito benéfico à saúde do dito sujeito, como para tratar doenças relacionadas ao colesterol. Além disso, é geralmente conhecido que SCFAs diminuem o pH no intestino e isso ajuda a absorção de cálcio. Desta forma, os compostos de acordo com a presente divulgação também podem afetar a absorção de minerais. Isso significa que eles também podem melhorar a saúde óssea, ou prevenir ou tratar osteoporose, diminuindo o pH devido ao aumento de SCFA no intestino. A produção de SCFA pode aumentar a viscosidade no intestino delgado, o que reduz a reabsorção dos ácidos biliares; aumentando a síntese de ácidos biliares a partir do colesterol e reduzindo o colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL) circulante.
[0181] Uma “quantidade efetiva” de um composto ou composição, conforme definido no presente pedido, refere-se a uma quantidade efetiva, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para se obter o efeito fisiológico benéfico desejado, como a redução do colesterol no sangue, aumento na produção de SCFA ou a prevenção ou tratamento de uma disfunção gastrointestinal. Por exemplo, a quantidade de uma composição administrada a um indivíduo irá variar dependendo de fatores como a condição do sujeito, o peso corporal do sujeito, a idade do indivíduo e, se uma composição é a única fonte de nutrição. A quantidade efetiva pode ser facilmente definida por um médico ou nutricionista. Em geral, é administrada uma quantidade suficiente da composição para fornecer ao sujeito até cerca de 50g por dia ou, por exemplo, cerca de 25g a cerca de 35g por dia. Em algumas realizações, a quantidade da composição de glucano divulgada que o sujeito recebe está na faixa de cerca de 0,1 g a cerca de 50 g por dia, ou na faixa de 0,5 g por 20 g por dia, ou 1 g a 10 g por dia. Um composto ou composição, conforme definido no presente pedido, pode ser tomado em doses múltiplas, por exemplo, 1 a 5 vezes, distribuídas ao longo do dia ou agudamente ou pode ser tomado em dose única. Um composto ou composição, conforme definido no presente pedido, também pode ser administrado continuamente durante um período desejado. Em certas realizações, o período desejado é pelo menos uma semana, pelo menos duas semanas, pelo menos três semanas, pelo menos um mês ou pelo menos seis meses.
[0182] Em algumas realizações, esta divulgação fornece um método para diminuir os níveis de triglicerídeos no sangue em um sujeito com necessidade do mesmo por administração de um composto ou uma composição, conforme definido no presente pedido, para um indivíduo com necessidade do mesmo. Em outra realização, esta divulgação fornece um método para diminuir os níveis de lipoproteínas de baixa densidade em um sujeito com essa necessidade, por administração de um composto ou uma composição, conforme definido no presente pedido, para um sujeito com essa necessidade. Em outra realização, a divulgação fornece um método para aumentar os níveis de lipoproteínas de alta densidade em um sujeito com necessidade do mesmo por administração de um composto ou de uma composição, conforme definido no presente pedido, para um sujeito com essa necessidade.
ATENUAÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES PÓS-PRANDIAIS DE GLICOSE NO SANGUE/ RESPOSTA GLICÊMICA
[0183] A presença de ligações diferentes das ligações da cadeia principal alfa-1,4 na composição de glucano divulgada fornece resistência digestiva aprimorada, uma vez que as enzimas do trato digestivo humano podem ser dificilmente hidrolisadas como pontes e/ou ligações ramificadas. A presença de ramificações fornece indigestibilidade parcial ou completa ao glucano em algumas realizações e, portanto, praticamente nenhuma ou uma absorção mais lenta de glicose no corpo, o que resulta em uma resposta glicêmica mais baixa. Consequentemente, a divulgação fornece uma composição de glucano para a fabricação de composições de alimentos e bebidas, resultando em resposta glicêmica mais baixa. Por exemplo, esses compostos podem ser usados para substituir o açúcar ou outros carboidratos rapidamente digeríveis e, assim, diminuir a carga glicêmica dos alimentos, reduzir as calorias e/ou diminuir a densidade energética dos alimentos. Além disso, a estabilidade da composição de glucano divulgada que possui estes tipos de ligações, permite que sejam facilmente passadas através do intestino grosso, onde podem servir como substrato específico para a flora microbiana do cólon.
APRIMORAMENTO DA SAÚDE INTESTINAL
[0184] Em uma realização adicional, compostos conforme divulgados no presente pedido, podem ser usados para o tratamento e/ou aprimoramento da saúde intestinal. Em algumas realizações, a composição de glucano é fermentada lentamente no intestino pela microflora intestinal. Em algumas realizações, os presentes compostos exibem em um modelo do intestino in vitro, uma tolerância não pior do que a inulina ou outras fibras comercialmente disponíveis, como PROMITOR® (fibra de milho solúvel, Tate & Lyle), NUTRIOSE® (fibra de milho solúvel ou dextrina, Roquette), ou FIBERSOL®-2 (maltodextrina resistente à digestão, Archer Daniels Midland Company & Matsutani Chemical), (isto é, um nível similar de produção de gases) e, em particular, fornece uma tolerância aprimorada sobre uma ou mais das fibras disponíveis comercialmente, isto é, a fermentação do presente glucano resulta em menor produção de gases do que a inulina em 3 horas ou 24 horas, diminuindo assim o desconforto, como flatulência e inchaço, devido à formação de gases. Em um aspecto, a divulgação também se refere a um método para moderar a formação de gases no trato gastrointestinal de um sujeito por administração de um composto ou uma composição conforme divulgada no presente pedido a um indivíduo com necessidade da mesma, de modo a diminuir a dor intestinal ou desconforto intestinal devido à flatulência e inchaço. Em realizações adicionais, as composições conforme divulgadas no presente pedido fornecem aos sujeitos tolerância aprimorada à fermentação de alimentos e podem ser combinadas com fibras, como inulina ou FOS, GOS ou lactulose para melhorar a tolerância por redução da produção de gases. Em outra realização, os compostos divulgados no presente pedido podem ser administrados para melhorar a laxação ou melhorar a regularidade aumentando o volume das fezes.
PREBIÓTICOS E PROBIÓTICOS
[0185] Um glucano no presente pedido pode ser útil como um prebiótico ou como um “sinbióticos” quando usado em combinação com probiótico, conforme discutido abaixo. Por “prebiótico” entende-se um ingrediente alimentar que afeta um sujeito de forma benéfica estimulando seletivamente o crescimento e/ou atividade de uma ou de um número limitado de bactérias no trato gastrointestinal, particularmente o cólon, e assim melhora a saúde do sujeito. Exemplos de prebióticos incluem fruto-oligossacarídeos, inulina, polidextrose, amido resistente, fibra de milho solúvel, gluco- oligossacarídeos e galacto-oligossacarídeos, arabinoxilano-oligossacarídeos, lactitol e lactulose.
[0186] Em outra realização, composições que compreendem um glucano no presente pedido ainda podem compreender pelo menos um organismo probiótico. Por “organismo probiótico” entende-se suplementos alimentares microbiológicos vivos, que fornecem efeitos benéficos a um sujeito através de sua função no trato digestivo. A fim de serem efetivos, um microrganismo probiótico deve ser capaz de sobreviver às condições digestivas, e deve ser capaz de colonizar o trato gastrointestinal, pelo menos temporariamente, sem qualquer dano ao sujeito. Apenas certas linhagens de microrganismos têm essas propriedades. Em algumas realizações, o microrganismo probiótico é selecionado a partir do grupo que compreende Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Bacillus spp., Enterococcus spp., Escherichia spp., Streptococcus spp., e Saccharomyces spp. Specific microrganismos incluem, mas não se limitam a, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bificum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium thermophilum, Enterococcus faecium, Enterococcus faecium, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Streptococcus faecium, Streptococcus mutans, Streptococcus thermophilus, Saccharomyces boulardii, Torulopsia, Aspergillus oryzae e Streptomyces entre outros, incluindo seus esporos vegetativos, esporos não vegetativos (Bacillus) e derivados sintéticos. Em algumas realizações, microrganismos probióticos incluem, mas não se limitam a, membros de três gêneros bacterianos: Lactobacillus, Bifidobacterium e Saccharomyces.
[0187] Em algumas realizações, a composição compreende um organismo probiótico em uma quantidade suficiente para distribuição de pelo menos 1 a 200 bilhões, 1 a 100 bilhões ou 1 a 50 bilhões de organismos probióticos viáveis. A quantidade de organismos probióticos distribuídos, conforme descrito acima, pode ser por dosagem e/ou por dia, onde dosagens múltiplas por dia podem ser adequadas para algumas aplicações. Dois ou mais organismos probióticos podem ser usados em uma composição, por exemplo.
[0188] Composições divulgadas no presente pedido podem estar sob a forma de uma composição para cuidados de tecidos. Uma composição para cuidados de tecidos no presente pedido, pode ser usada para lavar à mão, máquina de lavar e/ou outros propósitos, como imersão e/ou pré-tratamento de tecidos, por exemplo. Composição para cuidados de tecidos pode assumir a forma, por exemplo, de um detergente para lavagem de roupas; condicionador de tecido; qualquer produto adicionado para lavar, enxaguar ou secar; dose unitária ou spray. Composições para cuidados de tecidos em uma forma líquida podem estar sob a forma de uma composição aquosa conforme divulgado no presente pedido. Em outros aspectos, uma composição para cuidados de tecidos pode estar em uma forma seca como um detergente granular ou uma folha amaciadora adicionada à secadora. Outros exemplos não limitantes de composições para cuidados de tecidos no presente pedido incluem: agentes de lavagem para todos os propósitos ou serviço pesado na forma granular ou em pó, agentes de lavagem para todos os propósitos ou serviço pesado na forma de gel ou de líquido; detergentes líquidos ou tecidos finos secos (por exemplo, delicados); auxiliares de limpeza, como aditivos alvejantes, “bastão para manchas”, ou pré-tratamentos; produtos carregados de substrato como lenços secos e umedecidos, almofadas ou esponjas; sprays e nebulizadores.
[0189] Uma composição detergente no presente pedido pode estar em qualquer forma útil, por exemplo, como pós, grânulos, pastas, barras, dose unitária ou líquido. Um detergente líquido pode ser aquoso, contendo tipicamente até cerca de 70%, em peso, de água e 0%, em peso, a cerca de 30%, em peso, de solvente orgânico. Ela também pode estar sob a forma de um tipo de gel compacto contendo somente cerca de 30%, em peso, de água.
[0190] Uma composição detergente no presente pedido compreende tipicamente um ou mais tensoativos, em que o tensoativo é selecionado a partir de tensoativos não iônicos, tensoativos aniônicos, tensoativos catiônicos, tensoativos anfolíticos, tensoativos zwitteriônicos, tensoativos não iônicos semi-polares e misturas dos mesmos. Em algumas realizações, o tensoativo está presente em um nível de cerca de 0,1% a cerca de 60%, enquanto em realizações, o nível é de cerca de 1% para cerca de 50%, embora em realizações alternativas, o nível é de cerca de 5% a cerca de 40%, em peso, da composição detergente. Um detergente geralmente conterá 0%, em peso, a cerca de 50%, em peso, de um tensoativo aniônico como alquilbenzenosulfonato linear (LAS), alfa-olefinsulfonato (AOS), sulfato de alquila (sulfato de álcool graxo) (AS), etoxisulfato de álcool (AEOS ou AES), alcanosulfonatos secundários (SAS), ésteres metílicos de ácidos graxos alfa- sulfo, ácido alquil- ou alquenilsuccínico, ou sabão. Além disso, uma composição detergente pode conter opcionalmente 0%, em peso, a cerca de 40%, em peso, de um tensoativo não iônico como etoxilato de álcool (AEO ou AE), etoxilado de álcool carboxilado, etoxilado de nonilfenol, alquilpoliglicosídeo, óxido de alquil dimetil amina, monoetanolamida de ácido graxo etoxilado, monoetanolamida de ácido graxo, ou amida de ácido graxo polihidróxi alquila (conforme descrito, por exemplo, no documento WO 92/06154, que é incorporado ao presente pedido como referência).
[0191] Uma composição detergente no presente pedido compreende tipicamente um ou mais reforçadores de detergente ou sistemas reforçadores. Em algumas realizações, incorporando pelo menos um reforçador, as composições de limpeza compreendem pelo menos cerca de 1%, a partir de cerca de 3% a cerca de 60%, ou mesmo de cerca de 5% a cerca de 40%, em peso, de reforçador da composição. Reforçadores incluem, mas não se limitam a, metal alcalino, sais de amônio e alcanolamônio de polifosfatos, silicatos de metais alcalinos, carbonatos de terras alcalinas e metais alcalinos, aluminosilicatos, compostos de policarboxilato, éter hidroxipolicarboxilatos, copolímeros de anidrido maleico com etileno ou éter metil vinil, ácido 1,3,5- triidróxi benzeno-2,4,6-trisulfônico, e ácido carboximetiloxisuccínico, vários metais alcalinos, sais de amônio e amônio substituído de ácidos poliacéticos como ácido etilenodiamino tetra-acético e ácido nitrilotriacético, bem como policarboxilatos como ácido melítico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido oxidisuccínico, ácido polimaleico, ácido benzeno 1,3,5-tricarboxílico, ácido carboximetiloxisuccínico, e sais solúveis dos mesmos. De fato, contempla-se que qualquer reforçador adequado irá encontrar uso em várias realizações da presente divulgação. Exemplos adicionais de um reforçador de detergente ou agente complexante incluem zeólito, difosfato, trifosfato, fosfonato, citrato, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido dietilenotriaminopentaacético (DTMPA) ou ácido alquil- alquenilsuccínico, silicatos solúveis ou silicatos em camadas (por exemplo, SKS-6 da Hoechst).
[0192] Em algumas realizações, reforçadores formam complexos iônicos dureza solúvel em água (por exemplo, reforçadores sequestrantes), como citratos and polifosfatos (por exemplo, tripolifosfato de sódio e hexahidrato tripolifosfato de sódio, tripolifosfato de potássio, e tripolifosfato de sódio e potássio misturado, etc.). Contempla-se que qualquer reforçador adequado encontrará uso na presente divulgação, incluindo os conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, patente EP 2100949).
[0193] Em algumas realizações, reforçadores adequados podem incluir reforçadores de fosfato e reforçadores sem fosfato. Em algumas realizações, um reforçador é um reforçador de fosfato. Em algumas realizações, um reforçador é um reforçador sem fosfato. Um reforçador pode ser usado em um nível de 0,1% a 80%, ou de 5% a 60%, ou de 10% a 50%, em peso, da composição. Em algumas realizações, o produto compreende uma mistura de reforçadores de fosfato e sem fosfato. Reforçadores de fosfato adequados incluem mono-fosfatos, di-fosfatos, tri-fosfatos ou polifosfatos oligoméricos incluindo sais de metais alcalinos destes compostos, incluindo os sais de sódio. Em algumas realizações, um construtor pode ser tripolifosfato de sódio (STPP). Adicionalmente, a composição pode ser compreender carbonato e/ou citrato, preferencialmente citrato que ajuda a obter uma composição de pH neutro. Outros reforçadores sem fosfato adequados incluem homopolímeros e copolímeros de ácidos policarboxílicos e seus sais parcialmente ou completamente neutralizados, ácidos policarboxílicos monoméricos e ácidos hidroxicarboxílicos e seus sais. Em algumas realizações, sais dos compostos mencionados acima incluem amônio e/ou sais de metais alcalinos, isto é, sais de lítio, sódio, potássio, incluindo sais de sódio. Ácidos policarboxílicos adequados incluem ácidos acíclicos, alicíclicos, hetero-cíclicos e carboxílicos aromáticos, em que, em algumas realizações, eles podem conter pelo menos dois grupos carboxila que são em cada caso separados um do outro por, em alguns casos, não mais que dois átomos de carbono.
[0194] Uma composição detergente no presente pedido pode compreender pelo menos um agente quelante. Agentes quelantes adequados incluem, mas não se limitam a agentes quelantes de cobre, ferro e/ou manganês e misturas dos mesmos. Em realizações nas quais pelo menos um agente quelante é usado, a composição compreende de cerca de 0,1% a cerca de 15%, ou mesmo de cerca de 3,0% a cerca de 10%, de agente quelante, em peso, da composição.
[0195] Uma composição detergente no presente pedido pode compreender pelo menos uma ajuda de deposição. Auxiliares de deposição adequada incluem, mas não se limitam a, polietileno glicol, polipropileno glicol, policarboxilato, polímeros de liberação de sujeira como ácido politeleftálico, argilas como caulinita, montmorilonita, atapulgita, ilita, bentonita, haloisita, e misturas das mesmas.
[0196] Uma composição detergente no presente pedido pode compreender um ou mais agentes de inibição de transferência de corantes. Agentes de inibição de transferência de corantes poliméricos adequados incluem, mas não se limitam a, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de poliamina N-óxido, copolímeros de N-vinilpirrolidona e N-vinilimidazola, poliviniloxazolidonas e polivinilimidazolas, ou misturas dos mesmos. Agentes de inibição de transferência de corante incluem ftalocianina de manganês, peroxidases, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de poliamina N-óxido, copolímeros de N-vinilpirrolidona e N-vinilimidazola, poliviniloxazolidonas e polivinilimidazolas e/ou misturas dos mesmos; exemplos de agentes quelantes dos quais incluem ácido etilenodiamino-tetra-acético (EDTA); ácido dietileno triamino penta metileno fosfônico (DTPMP); ácido hidróxi-etano-difosfônico (HEDP); ácido etilenodiamino N,N’-disuccínico (EDDS); ácido metil glicina diacético (MGDA); ácido dietileno triamino penta acético (DTPA); ácido propileno diamino tetracético (PDT A); 2-hidroxipiridina-N-óxido (HPNO); ou ácido metil glicina diacético (MGDA); ácido de ácido glutâmico N,N-diacético; sal de tetrasódio de ácido (N,N-dicarboximetil glutâmico (GLDA); ácido nitrilotriacético (NTA); ácido 4,5-dihidróxi-m-benzenodisulfônico; ácido cítrico e quaisquer sais dos mesmos; ácido N-hidroxietil etilenodiamino tri-acético (HEDTA), ácido trietileno tetra-amino hexa-acético (TTHA), ácido N-hidróxi etilimino diacético (HEIDA), diidroxietilglicina (DHEG), ácido etileno diamino tetra-propiônico (EDTP) e derivados dos mesmos, que podem ser usados sozinhos ou em combinação com qualquer um dos acima. Em realizações, na qual pelo menos um agente de inibição de transferência de corante é usado, uma composição no presente pedido pode compreender de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, de cerca de 0,01% a cerca de 5%, ou até cerca de 0,1% a cerca de 3%, em peso, da composição.
[0197] Uma composição detergente no presente pedido pode compreender silicatos. Em algumas destas realizações, silicatos de sódio (por exemplo, bissilicato de sódio, metassilicato de sódio e/ou filossilicatos cristalinos) encontram uso. Em algumas realizações, os silicatos estão presentes em um nível de cerca de 1% a cerca de 20%, em peso, da composição. Em algumas realizações, os silicatos estão presentes em um nível de cerca de 5% a cerca de 15%, em peso, da composição.
[0198] Uma composição detergente no presente pedido pode compreender dispersantes. Materiais orgânicos solúveis em água adequados incluem, mas não se limitam aos ácidos homo- ou copoliméricos ou seus sais, em que o ácido policarboxílico compreende pelo menos dois radicais carboxila separados um do outro por não mais que dois átomos de carbono.
[0199] Uma composição detergente no presente pedido pode compreender adicionalmente uma ou mais enzimas conforme delineado acima.
[0200] Em algumas realizações, uma composição detergente pode compreender uma ou mais enzimas (por exemplo, qualquer uma divulgada no presente pedido), cada uma a um nível de cerca de 0,00001% a cerca de 10%, em peso, da composição e o equilíbrio dos materiais adjuntos de limpeza, em peso, de composição. Em algumas outras realizações, uma composição detergente também pode compreender cada enzima a um nível de cerca de 0,0001% a cerca de 10%, cerca de 0,001% a cerca de 5%, cerca de 0,001% a cerca de 2% ou cerca de 0,005% a cerca de 0,5%, em peso, da composição.
[0201] Enzimas que podem estar compreendidas em uma composição detergente no presente pedido podem ser estabilizadas com o uso de agentes estabilizantes convencionais, por exemplo, um poliol como propilenoglicol ou glicerol; um açúcar ou álcool de açúcar; ácido láctico; ácido bórico ou um derivado de ácido bórico (por exemplo, um éster de borato aromático).
[0202] Uma composição detergente, em certas realizações, pode compreender um ou mais polímeros. Exemplos de polímeros adequados incluem carboximetil celulose (CMC), poli(vinilpirrolidona) (PVP), polietileno glicol (PEG), poli(vinil álcool) (PVA), policarboxilatos como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico e copolímeros de ácido metacrilato/acrílico lauril.
[0203] Uma composição detergente no presente pedido pode conter um sistema alvejante. Por exemplo, de um sistema de alvejamento pode compreender uma fonte de H2O2 como perborato ou percarbonato, que pode ser combinada com um ativador alvejante de formação de perácido como tetra- acetiletilenodiamino (TAED) ou nonanoiloxibenzenosulfonato (NOBS). De maneira alternativa, um sistema de alvejamento pode compreender peroxiácidos (por exemplo, peroxiácidos tipo amida, imida ou sulfona). Ainda de maneira alternativa, um sistema de alvejamento pode ser um sistema de alvejamento enzimático que compreende peridrolase, por exemplo, como o sistema descrito no documento WO 2005/056783.
[0204] Uma composição detergente no presente pedido também pode conter ingredientes de detergentes convencionais como condicionadores de tecido, argilas, intensificadores de espuma, supressores de espuma de sabão, agentes anticorrosão, agentes de suspensão de sujeira, agentes anti- redeposição de sujeira, corantes, bactericidas, inibidores de manchas, clareadores ópticos ou perfumes. O pH de uma composição detergente no presente pedido (medido em solução aquosa na concentração de uso) geralmente é neutro ou alcalino (por exemplo, pH de cerca de 7,0 a cerca de 11,0).
[0205] Uma composição detergente no presente pedido também pode conter pelo fato de pelo menos um agente anti-redeposição e/ou agente de remoção de sujeira argilosa (esses agentes podem ser opcionalmente caracterizados como agentes de manutenção de brancura em certos aspectos). Exemplos de agentes de anti-redeposição e/ou de remoção de sujeira argilosa no presente pedido incluem tensoativos polietóxi zwiteriônicos, copolímeros de ácido acrílico ou metacrílico solúveis em água com condensados de ácido acrílico ou metacrílico-óxido de etileno (por exemplo, patente US 3719647), derivados de celulose como carboximetilcelulose e hidroxipropilcelulose (por exemplo, patentes US 3597416 e 3523088), e misturas que compreendem tensoativo de alquil polietóxi não iônico, tensoativo de alquil polietóxi quaternário catiônico e tensoativo de amida graxa (por exemplo, patente US 4228044). Exemplos não limitantes de outros agentes anti-redeposição e de remoção de sujeira argilosa são divulgados na patente US 4597898 e 4891160, e publicação de pedido de patente documento WO 95/32272, todos os quais são incorporados ao presente pedido como referência.
[0206] Formas particulares de composições detergentes que podem ser adaptadas para propósitos divulgados no presente pedido, por exemplo, nas patentes US 20090209445A1, US 20100081598A1, US 7001878B2, EP 1504994B1, documentos WO 2001085888A2, WO 2003089562A1, WO 2009098659A1, WO 2009098660A1, WO 2009112992A1, WO 2009124160A1, WO 2009152031A1, WO 2010059483A1, WO 2010088112A1, WO 2010090915A1, WO 2010135238A1, WO 2011094687A1, WO 2011094690A1, WO 2011127102A1, WO 2011163428A1, WO 2008000567A1, WO 2006045391A1, WO 2006007911A1, WO 2012027404A1, patente EP 1740690B1, documento WO 2012059336A1, patente US 6730646B1, documentos WO 2008087426A1, WO 2010116139A1, e WO2012104613A1, todos os quais são incorporados ao presente pedido como referência.
[0207] Composições detergentes para lavagem de roupas no presente pedido podem opcionalmente ser composições detergentes para lavagem de roupas para serviço pesado (todos os propósitos). Composições detergentes para lavagem de roupas para serviço pesado exemplares compreendem um tensoativo detersivo (10% a 40%, peso/peso), incluindo um tensoativo detersivo aniônico (selecionado a partir de um grupo de sulfatos de alquila de cadeia linear ou ramificada ou aleatória, substituído ou não substituído, sulfonatos de alquila, sulfato alcoxilado de alquila, fosfatos de alquila, fosfonatos de alquila, carboxilatos de alquila, e/ou misturas dos mesmos) e, opcionalmente tensoativo não iônico (selecionado a partir de um grupo de álcool alcoxilado de alquila, de cadeia linear ou ramificada ou aleatória, substituído ou não substituído, por exemplo, alcoóis etoxilados de alquila C8-C18 e/ou alcoxilatos de alquil fenol C6-C12, onde a razão, em peso, do tensoativo detersivo aniônico (com um índice hidrofílico (HIc) a partir de 6,0 a 9) para tensoativo detersivo não iônico é maior que 1:1. Tensoativos detersivos adequados também incluem tensoativos detersivos catiônicos (selecionados a partir de um grupo de compostos de alquil piridínio, compostos de alquil quaternário de amônio, compostos de alquil quaternário de fosfônio, compostos de alquil ternário de sulfônio, e/ou misturas dos mesmos); tensoativos detersivos zwitteriônicos e/ou anfotéricos (selecionado a partir de um grupo de alcanolamina sulfo-betaínas); tensoativos anfolíticos; tensoativos não iônicos semi-polares e misturas dos mesmos.
[0208] Um detergente no presente pedido como composição detergente para lavagem de roupas para serviço pesado pode opcionalmente incluir, um polímero estimulado de tensoatividade que consiste em polímeros de limpeza de graxa alcoxilados anfifílicos (selecionados a partir de um grupo de polímeros alcoxilados que têm propriedades hidrofílicas e hidrofóbicas ramificadas, como polialquileniminas na faixa de 0,05%, em peso, a 10%, em peso) e/ou polímeros de enxerto aleatório (tipicamente que compreendem esqueleto hidrofílico que compreendem monômeros selecionados a partir do grupo que consiste em: ácidos carboxílicos C1-C6 insaturados, éteres, alcoóis, aldeídos, cetonas, ésteres, unidades de açúcar, unidades alcóxi, anidrido maleico, polialcoóis saturados como glicerol, e misturas dos mesmos; e cadeia(s) lateral(ais) hidrofóbica(s) selecionada(s) a partir do grupo que consiste em: Grupo alquila C4-C25, polipropileno, polibutileno, éster de vinil de um ácido mono-carboxílico C1-C6 saturado, éster de alquila C1-C6 de ácido acrílico ou metacrílico, e misturas dos mesmos.
[0209] Um detergente no presente pedido como um detergente para lavagem de roupas para serviço pesado pode incluir opcionalmente polímeros adicionais como polímeros de liberação de sujeira (inclui poliésteres com extremidade terminada anionicamente, por exemplo SRP1, polímeros compreendendo pelo menos uma unidade de monômero selecionados a partir de sacarídeo, ácido dicarboxílico, poliol e combinações dos mesmos, em configuração aleatória ou em bloco, polímeros e copolímeros à base de etileno tereftalato dos mesmos em configuração aleatória ou em bloco, por exemplo, REPEL-O-TEX SF, SF-2 AND SRP6, TEXCARE SRA100, SRA300, SRN100, SRN170, SRN240, SRN300 AND SRN325, MARLOQUEST SL), agente(s) anti- redeposição no presente pedido (0,1%, em peso a 10%, em peso), inclui(em) polímeros de carboxilato, como polímeros que compreendem pelo menos um monômero selecionado a partir de ácido acrílico, ácido maleico (ou anidrido maleico), ácido fumárico, ácido itaconíco, ácido aconítico, ácido mesacônico, ácido citracônico, ácido metilenomalônico, e qualquer mistura dos mesmos, homopolímero de vinilpirrolidona, e/ou polietilenoglicol, peso molecular na faixa a partir de 500 a 100.000 Da); e carboxilato polimérico (como copolímero aleatório de maleato/acrilato ou homopolímero de poliacrilato).
[0210] Um detergente no presente pedido, como uma composição detergente para lavagem de roupas para serviço pesado pode opcionalmente incluir ainda ácidos graxos saturados ou insaturados, preferencialmente ácidos graxos saturados ou insaturados C12-C24 (0%, em peso, a 10%, em peso); auxiliares de deposição divulgados no presente pedido (exemplos para os quais incluem polissacarídeos, polímeros celulósicos, haletos de dialildimetilamino (DADMAC) e copolímeros de DAD MAC com vinilpirrolidona, acrilamidas, imidazol, haletos de imidazolinio e misturas dos mesmos, em configuração aleatória ou em blocos, goma guar catiônica, amido catiônico, poliacilamidas catiônicas e misturas dos mesmos).
[0211] Um detergente no presente pedido como uma composição detergente para lavagem de roupas para serviço pesado ainda pode opcionalmente incluir agentes de inibição de transferência de corante, exemplos dos quais incluem ftalocianina de manganês, peroxidases, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de poliamina N-óxido, copolímeros de N- vinilpirrolidona e N-vinilimidazola, poliviniloxazolidonas e polivinilimidazolas e/ou misturas dos mesmos, exemplos de agentes quelantes dos quais incluem ácido etilenodiamino-tetra-acético (EDTA), ácido dietileno triamino penta metileno fosfônico (DTPMP), ácido hidróxi-etano-difosfônico (HEDP), ácido etilenodiamino N,N’-disuccínico (EDDS), ácido metil glicina diacético (MGDA), ácido dietileno triamino penta acético (DTPA), ácido propileno diamino tetracético (PDTA), 2-hidroxipiridina-N-óxido (HPNO), ou ácido metil glicina diacético (MGDA), ácido de ácido glutâmico N,N-diacético, sal de tetrasódio de ácido (N,N-dicarboximetil glutâmico (GLDA), ácido nitrilotriacético (NTA), ácido 4,5-dihidróxi-m-benzenodisulfônico, ácido cítrico e quaisquer sais dos mesmos, ácido N-hidroxietil etilenodiamino tri-acético (HEDTA), ácido trietileno tetraamino hexaacético (TTHA), ácido N-hidróxi etilimino diacético (HEIDA), diidroxietilglicina (DHEG), ácido etileno diamino tetra-propiônico (EDTP), e derivados dos mesmos.
[0212] Um detergente no presente pedido como uma composição detergente para lavagem de roupa para serviço pesado podem opcionalmente incluir supressores de espuma à base de silicone ou ácido graxo; corantes tonalizantes, cátions de cálcio e magnésio, ingredientes sinalizadores visuais, antiespumante (0,001%, em peso, a 4,0%, em peso) e/ou um estruturante/espessante (0,01%, em peso, a 5%, em peso) selecionado a partir do grupo que consiste em diglicerídeos e triglicerídeos, diestearato de etilenoglicol, celulose microcristalina, celulose de microfibra, biopolímeros, goma xantana, goma de gelano e misturas dos mesmos). Um estruturante também pode ser citado como um agente estrutural.
[0213] Um detergente no presente pedido pode estar sob a forma de uma composição detergente seca/sólida para lavagem de roupas para serviço pesado, por exemplo. Esse detergente pode incluir: (i) um tensoativo detersivo, como qualquer tensoativo detersivo aniônico divulgado no presente pedido, qualquer tensoativo detersivo não iônico, divulgado no presente pedido, qualquer tensoativo detersivo catiônico divulgado no presente pedido, qualquer tensoativo detersivo zwitteriônico e/ou anfotérico divulgado no presente pedido, qualquer tensoativo anfolítico, qualquer tensoativo não iônico semi-polar, e misturas dos mesmos, (ii) um reforçador, como qualquer reforçador livre de fosfato (por exemplo, reforçadores de zeólito na faixa de 0%, em peso, a menos de 10%, em peso), qualquer reforçador de fosfato (por exemplo, tri-polifosfato de sódio na faixa de 0%, em peso, a menos de 10%, em peso), ácido cítrico, sais de citrato e ácido nitrilotriacético, qualquer sal de silicato (por exemplo, silicato de sódio ou de potássio ou metasilicato de sódio na faixa de 0% a menos de 10%, em peso); qualquer sal de carbonato (por exemplo, carbonato de sódio e/ou bicarbonato de sódio na faixa de 0%, em peso, a menos de 80%, em peso), e misturas dos mesmos; (iii) um agente alvejante, como qualquer fotoalvejante (por exemplo, ftalocianinas de zinco sulfonadas, ftalocianinas de alumínio sulfonadas, corantes xantanas, e misturas dos mesmos), qualquer ativador alvejante hidrofóbico ou hidrofílico (por exemplo, sulfonato de dodecanoil oxibenzeno, sulfonato de decanoil oxibenzeno, ácido decanoil oxibenzoico ou sais dos mesmos, sulfonato de 3,5,5-trimetil hexanoil oxibenzeno, tetracetil etileno diamino-TAED, sulfonato de nonanoiloxibenzeno-NOBS, nitrila quats, e misturas dos mesmos), qualquer fonte de peróxido de hidrogênio (por exemplo, sais de perohidrato inorgânico, exemplos dos quais incluem sal de perborato de sódio mono ou tetra hidrato, percarbonato, persulfato, perfosfato ou persilicato), qualquer perácido hidrofílico e/ou hidrofóbico pré-formado (por exemplo, ácidos e sais percarboxílicos, ácidos e sais percarbônicos, ácidos e sais perimídicos, ácidos e sais peroximonosulfurícos, e misturas dos mesmos); e/ou (iv) quaisquer outros componentes como um catalisador de alvejante (por exemplo, reforçador de alvejante imina, exemplos dos quais incluem cátions e poli-íons de imínio, zwitteríons de imínio, aminas modificadas, óxidos de aminas modificadas, iminas N-sulfonila, iminas N-fosfonila, iminas N-acila, dióxidos de tiadiazola, perfluoroiminas, cetonas de açúcar cíclico, e misturas das mesmas), e um catalisador de alvejante contendo metal (por exemplo, cátions de cobre, ferro, titânio, rutênio, tungstênio, molibdênio ou manganês junto com cátions de metais auxiliares como zinco ou alumínio e um sequestrado como EDTA, ácido etilenodiaminotetra(metilenofosfônico).
[0214] Composições divulgadas no presente pedido podem estar sob a forma de uma composição detergente para lavagem de louça. Exemplos de detergentes para lavagem de louça incluem detergentes para lavagem automática de louça (tipicamente usados em máquinas de lavar louça) e detergentes para lavagem de louça à mão. Uma composição detergente pode estar em qualquer forma, seca ou líquida/aquosa, conforme divulgado no presente pedido, por exemplo. Os componentes que podem ser incluídos, em certas realizações de uma composição detergente para lavar louça incluem, por exemplo, um ou mais de um fosfato; agente alvejante à base de oxigênio ou cloro; tensoativo não iônico; sal alcalino (por exemplo, metassilicatos, hidróxidos de metais alcalinos, carbonato de sódio); qualquer enzima ativa divulgada no presente pedido; agente anticorrosão (por exemplo, silicato de sódio); agente antiespumante; aditivos para retardar a remoção de esmalte e padrões de cerâmicas; perfume; agente antiaglomerante (em detergente granular); amido (em detergentes à base de pastilhas); agente gelificante (em detergentes à base de líquido/gel); e/ou areia (detergentes em pó).
[0215] Detergentes para lavagem de louça como um detergente para lavadora de louça automática ou detergente líquido para lavadora de louça podem compreender (i) um tensoativo não iônico, incluindo qualquer tensoativo não iônico etoxilado, tensoativo alcoxilado de álcool, álcool epóxi-terminado poli(oxialquilado), ou tensoativo de óxido de amina presente em uma quantidade a partir de 0 a 10%; em peso (ii) um reforçador, na faixa de cerca de 5 a 60%, em peso, incluindo qualquer reforçador de fosfato (por exemplo, mono-fosfatos, di-fosfatos, tri-polifosfatos, outros polifosfatos oligoméricos, tripolifosfato de sódio-STPP), qualquer reforçador livre de fosfato (por exemplo, compostos a base de aminoácidos incluindo ácido metil-glicina-diacético (MGDA) e sais ou derivados dos mesmos, ácido glutâmico-N,N-diacético (GLDA) e sais ou derivados dos mesmos, ácido iminodisuccínico (IDS) e sais ou derivados dos mesmos, carbóxi metil inulina e sais ou derivados dos mesmos, ácido nitrilotriacético (NTA), ácido dietileno triamina penta acético (DTPA), ácido B- alaninadiacético (B-ADA) e sais dos mesmos), homopolímeros e copolímeros de ácidos poli-carboxílicos e sais parcialmente ou completamente neutralizados dos mesmos, ácidos policarboxílicos monoméricos e ácidos hidroxicarboxílicos e sais dos mesmos na faixa de 0,5%, em peso, a 50%, em peso, ou polímeros sulfonados/carboxilados na faixa de cerca de 0,1%, em peso, a cerca de 50%, em peso; (iii) um auxiliar de secagem na faixa de cerca de 0,1t%, em peso, a cerca de 10%, em peso, (por exemplo, poliésteres, especialmente poliésteres aniônicos, opcionalmente junto com monômeros adicionais com 3 a 6 funcionalidades - tipicamente funcionalidades de ácido, álcool ou éster que são condutivas para policondensação, compostos de policarbonato-, poliuretano- e/ou poliureia-poliorganosiloxano ou compostos precursores dos mesmos, particularmente do carbonato cíclico reativo e do tipo de ureia); (iv) um silicato na faixa de cerca de 1%, em peso, a cerca de 20%, em peso (por exemplo, silicatos de sódio ou de potássio como bissilicato de sódio, meta-silicato de sódio e filosilictos cristalinos); (v) um alvejante inorgânico (por exemplo, sais de peridrato como sais de perborato, percarbonato, perfosfato, persulfato e persilicato) e/ou um alvejante orgânico (por exemplo, peroxiácidos orgânicos como diacil- e tetracil-peróxidos, especialmente ácido diperoxidodecanodioico, ácido diperoxitetradecanodioico, e ácido diperoxihexadecanodioico); (vi) um ativador de alvejante (por exemplo, precursores de perácido orgânico na faixa de cerca de 0,1%, em peso, a cerca de 10%, em peso) e/ou catalisador de alvejante (por exemplo, triazaciclononano de manganês e complexos relacionados; Co, Cu, Mn e Fe bispiridilamina e complexos relacionados; e pentamina acetato de cobalto(III) e complexos relacionados); (vii) um agente para tratamento de metais na faixa de cerca de 0,1%, em peso, a 5%, em peso (por exemplo, benzatriazolas, sais e complexos metálicos, e/ou silicatos); e/ou (viii) qualquer enzima ativa divulgada no presente pedido na faixa de cerca de 0,01 a 5,0 mg de enzima ativa por grama de composição detergente para lavagem automática de louça, e um componente estabilizador de enzima (por exemplo, oligossacarídeos, polissacarídeos e sais metálicos bivalentes inorgânicos).
[0216] Acredita-se que numerosas formulações de formulações de detergente comercialmente disponível podem ser adaptadas para incluir um glucano alfa-1,2 ramificado conforme divulgado no presente pedido. Exemplos incluem PUREX® ULTRAPACKS (Henkel), FINISH® QUANTUM (Reckitt Benckiser), CLOROX™ 2 PACKS (Clorox), OXICLEAN MAX FORCE POWER PAKS (Church & Dwight), TIDE® STAIN RELEASE, CASCADE® ACTIONPACS e TIDE® PODS™ (Procter & Gamble).
[0217] Composições divulgadas no presente pedido podem estar sob a forma de uma composição para tratamento bucal, por exemplo. Exemplos de composições para tratamento bucal incluem dentifrícios, pasta de dentes, lavagem bucal, enxaguatório bucal, goma de mascar, tiras comestíveis e creme/gel dental que fornecem alguma forma de tratamento bucal (por exemplo, tratamento ou prevenção de cáries (cáries dentárias), gengivite, placa, tártaro e/ou doença periodontal). Uma composição para tratamento bucal também pode ser para tratar uma “superfície oral”, que engloba qualquer superfície dura ou macia dentro da cavidade oral, incluindo superfícies da língua, palato duro e mole, mucosa bucal, gengivas e superfícies dentárias. Uma “superfície dentária” no presente pedido é uma superfície de um dente natural ou uma superfície dura de dentição artificial incluindo uma coroa, restauração, preenchimento, ponte, prótese ou implante dentário, por exemplo.
[0218] Uma composição para tratamento bucal no presente pedido pode compreender cerca de 0,01 a 15,0%, em peso, (por exemplo, aproximadamente 0,1 a 10%, em peso, ou aproximadamente 0,1 a 5,0%, em peso, aproximadamente 0,1 a 2,0%, em peso) de um ou mais glucanos alfa-1,2- ramificados conforme divulgado no presente pedido, por exemplo. Um ou mais agentes espessantes ou de dispersão também podem ser fornecidos em uma composição para tratamento bucal no presente pedido, como um polímero de carboxivinil, carragenano (por exemplo, L-carragenano), goma natural (por exemplo, caraia, xantana, goma arábica, tragacanto), silicato de alumínio e magnésio coloidal ou sílica coloidal, por exemplo.
[0219] Uma composição para tratamento bucal no presente pedido pode ser uma pasta de dente ou outro dentifrício, por exemplo. Essas composições, bem como qualquer outra composição para tratamento bucal, pode compreender adicionalmente, sem limitação, um ou mais agentes anticárie, agente antimicrobiano ou antibacteriano, agente anticálculo ou de controle de tártaro, surfactante, abrasivo, agente modificador de pH, modulador de espuma, umectante, flavorizante, adoçante, pigmento/corante, agente de branqueamento e/ou outros componentes adequados. Exemplos de composições para tratamento bucal às quais um ou mais glucanos alfa-1,2-ramificados no presente pedido podem ser adicionados são divulgadas na publicação de pedido de patente US 2006/0134025, 2002/0022006 e 2008/0057007, que são incorporadas ao presente pedido como referência.
[0220] Um agente anticáries no presente pedido pode ser uma fonte de íons de flúor oralmente aceitável. Fontes adequadas de íons de flúor incluem fluoreto, monofluorofosfato e sais de fluorossilicato, bem como fluoretos de amina, incluindo olaflur (N-octadeciltrimetilendiamina-N, N, N’-tris (2-etanol) - di-hidrofluoreto), por exemplo. Um agente anticáries pode estar presente em uma quantidade que fornece um total de cerca de 100 a 20.000, cerca de 200 a 5000 ppm, ou cerca de 500 a 2500 ppm, de íons de flúor para a composição, por exemplo. Nas composições para tratamento bucal nas quais fluoreto de sódio em que o fluoreto de sódio é a única fonte de íons de flúor, uma quantidade de cerca 0,01 a 5,0%, em peso, cerca de 0,05 a 1,0%, em peso, ou cerca de 0,1 a 0,5%, em peso, de fluoreto de sódio pode estar presente na composição, por exemplo.
[0221] Um agente antimicrobiano ou antibacteriano adequado para uso na composição para tratamento bucal no presente pedido inclui, por exemplo, compostos fenólicos (por exemplo, 4-alilcatecol; ésteres de ácido p- hidroxibenzoico como benzilparabeno, butilparabeno, etilparabeno, metilparabeno e propilparabeno; 2-benzilfenol; hidroxianisol butilado; hidroxitolueno butilado; capsaícina; carvacrol; creosol; eugenol; guaiacol; bisfenólicos halogenados como hexaclorofeno e bromoclorofeno; 4- hexilresorcinol; 8-hidroxiquinolina e sais dos mesmos; ésteres de ácido salicílico como salicilato de mentila, salicilato de metila e salicilato de fenila; fenol; pirocatecol; salicilanilida; timol; compostos de difeniléter halogenado como triclosan e monofosfato de triclosan), compostos de cobre (II) (por exemplo, cloreto de cobre(II), fluoreto, sulfato e hidróxido), fontes iônicas de zinco (por exemplo, acetato de zinco, citrato, gluconato, glicinato, óxido e sulfato), ácido ftálico e sais dos mesmos (por exemplo, ftalato monopotássio de magnésio), hexetidina, octenidina, sanguinarina, cloreto de benzalcônio, brometo de domifen, cloreto de alquilpiridínio (por exemplo, cloreto de cetilpiridínio, cloreto de tetradecilpiridínio, cloreto de N-tetradecil-4-etilpiridínio), iodina, sulfonamidas, bisbiguanidas (por exemplo, alexidina, clorexidina, digluconato de clorexidina), derivados de piperidino (por exemplo, delmopinol, octapinol), extrato de magnólia, extrato de semente de uva, extrato de alecrim, mentol, geraniol, citral, eucaliptol, antibióticos (por exemplo, augmentina, amoxicilina, tetraciclina, doxiciclina, minociclina, metronidazola, neomicina, canamicina, clindamicina), e/ou quaisquer agentes antibacterianos divulgados na patente US 5776435, que é incorporada ao presente pedido como referência. Um ou mais agentes antimicrobianos podem estar opcionalmente presentes em cerca de 0,01 a 10%, em peso (por exemplo, 0,1 a 3%, em peso), por exemplo, na composição para tratamento bucal divulgada.
[0222] Um agente anticálculo ou de controle de tártaro adequado para uso na composição para tratamento bucal no presente pedido inclui, por exemplo, fosfatos e polifosfatos (por exemplo, pirofosfatos), ácido poliaminopropanosulfônico (AMPS), triidrato de citrato de zinco, polipeptídeos (por exemplo, ácidos poliaspártico e poliglutâmico), sulfonatos de poliolefina, fosfatos de poliolefina, difosfonatos (por exemplo, azacicloalcano-2,2- difosfonatos como ácido azacicloheptano-2,2-difosfônico), ácido N-metil azaciclopentano-2,3-difosfônico, ácido etano-1-hidróxi-1,1-difosfônico (EHDP), ácidos etano-1-amino-1,1-difosfonato e/ou fosfonoalcano carboxílico e sais dos mesmos (por exemplo, seus sais de metais alcalinos e amônio). Os sais de fosfato e polifosfato inorgânicos úteis incluem, por exemplo, fosfatos de sódio monobásico, dibásico e tribásico, tripolifosfato de sódio, tetrapolifosfato, pirofosfatos mono-, di-, tri- e tetrassódicos, diidrogeno pirofosfato dissódico, trimetafosfato de sódio, hexametafosfato de sódio ou qualquer um destes nos quais o sódio é substituído por potássio ou amônio. Outros agentes anticálculo úteis em certas realizações incluem polímeros de policarboxilato aniônico (por exemplo, polímeros ou copolímeros de ácido acrílico, metacrílico e anidrido maleico, como copolímeros de polivinil metil éter/anidrido maleico). Ainda outros agentes anticálculo úteis incluem agentes sequestrantes como ácidos hidroxicarboxílicos (por exemplo, ácido cítrico, fumárico, málico, glutárico e oxálico, e sais dos mesmos) e ácidos aminopolicarboxílicos (por exemplo, EDTA). Um ou mais agentes anticálculo ou de controle de tártaro podem estar opcionalmente presentes em cerca de 0,001 a 50%, em peso (por exemplo, cerca de 0,05 a 25%, em peso, ou cerca de 0,1 a 15%, em peso), por exemplo, na composição para tratamento bucal divulgada.
[0223] Um tensoativo adequado para uso em uma composição para tratamento bucal no presente pedido pode ser aniônico, não iônico ou anfotérico, por exemplo. Os tensoativos aniônicos adequados incluem, sem limitação, sais de sulfato de alquila C8-20 solúveis em água, monoglicerídeos sulfonados de ácidos graxos C8-20, sarcosinatos e tauratos. Exemplos de tensoativos aniônicos incluem lauril sulfato de sódio, monoglicerídeo de coco sulfonato de sódio, laurilsarcosinato de sódio, laionil isoetionato de sódio, lauret carboxilato de sódio e dodecil benzeno sulfonato de sódio. Tensoativos não iônicos adequados incluem, sem limitação, poloxâmeros, ésteres de polioxietileno sorbitano, álcool graxo etoxilado, alquilfenol etoxilado, óxidos de amina terciária, óxidos de fosfina terciários e sulfóxidos de dialquila. Tensoativos anfotéricos adequados incluem, sem limitação, derivados de aminas secundárias e terciárias alifáticas C8-20 que têm um grupo aniônico como um carboxilato, sulfato, sulfonato, fosfato ou fosfonato. Um exemplo de um tensoativo anfotérico adequado é cocoamidopropil betaína. Um ou mais tensoativos estão opcionalmente presentes em uma quantidade total de cerca de 0,01 a 10%, em peso (por exemplo, cerca de 0,05 a 5%, em peso, ou cerca de 0,1 a 2,0%, em peso), por exemplo, na composição para tratamento bucal divulgada.
[0224] Um abrasivo adequado para uso em uma composição para tratamento bucal pode incluir, por exemplo, sílica (por exemplo, sílica gel, sílica hidratada, sílica precipitada), alumina, fosfatos insolúveis, carbonato de cálcio e abrasivos resinosos (por exemplo, um produto de condensação de ureia- formaldeído). Exemplos de fosfatos insolúveis úteis como abrasivos no presente pedido são ortofosfatos, polimetafosfatos e pirofosfatos, e incluem ortofosfato dicálcico di-hidratado, pirofosfato de cálcio, pirofosfato de beta-cálcio, fosfato tricálcico, polimetafosfato de cálcio e polimetafosfato de sódio insolúvel. Um ou mais abrasivos estão opcionalmente presentes em uma quantidade total de cerca de 5 a 70%, em peso (por exemplo, cerca de 10 a 56%, em peso, ou cerca de 15 a 30%, em peso), por exemplo, na composição para tratamento bucal divulgada. A média de tamanho de partícula de um abrasivo, em certas realizações, é cerca de 0,1 a 30 mícrons (por exemplo, cerca de 1 a 20 mícrons ou cerca de 5 a 15 mícrons).
[0225] Uma composição para tratamento bucal, em certas realizações, pode compreender pelo menos um agente modificador de pH. Esses agentes podem ser selecionados para acidificar, tornar mais básico ou tamponar o pH de uma composição para uma faixa de pH de cerca de 2 a 10 (por exemplo, pH na faixa de cerca de 2 a 8, 3 a 9, 4 a 8, 5 a 7, 6 a 10 ou 7 a 9). Exemplos de agentes modificadores de pH úteis no presente pedido incluem, sem limitação, ácidos carboxílicos, ácidos fosfóricos e sulfônicos; sais de ácidos (por exemplo, citrato monossódico, citrato dissódico, malato monossódico); hidróxidos de metais alcalinos (por exemplo, hidróxido de sódio, carbonatos como carbonato de sódio, bicarbonatos, sesquicarbonatos); boratos; silicatos; fosfatos (por exemplo, fosfato monossódico, fosfato trissódico, pirofosfato, sais de pirofosfato); e imidazol.
[0226] Um modulador de espuma adequado para uso em uma composição para tratamento bucal no presente pedido pode ser um polietileno glico (PEG), por exemplo. PEGs de alto peso molecular são adequados, incluindo os que têm um peso molecular médio de cerca de 200.000 a 7.000.000 (por exemplo, cerca 500.000 a 5.000.000 ou cerca de 1.000.000 a 2.500.000), por exemplo. Um ou mais PEGs estão opcionalmente presentes em uma quantidade total de cerca de 0,1 a 10%, em peso (por exemplo, cerca de 0,2 a 5%, em peso, ou cerca de 0,25 a 2,0%, em peso), por exemplo, na composição para tratamento bucal divulgada.
[0227] Uma composição para tratamento bucal, em certas realizações, pode compreender pelo menos um umectante. Um umectante, em certas realizações, pode ser um álcool poli-hídrico, como glicerina, sorbitol, xilitol ou um PEG de baixo peso molecular. Umectantes mais adequados também podem funcionar como adoçantes no presente pedido. Um ou mais umectantes estão opcionalmente presentes em uma quantidade total de cerca de 1,0 a 70%, em peso (por exemplo, cerca de 1,0 a 50%, em peso, cerca de 2 a 25%, em peso, ou cerca de 5 a 15%, em peso), por exemplo, na composição para tratamento bucal divulgada.
[0228] Um adoçante natural ou artificial pode opcionalmente estar compreendido na composição para tratamento bucal no presente pedido. Exemplos de adoçantes adequados incluem dextrose, sacarose, maltose, dextrina, açúcar invertido, manose, xilose, ribose, frutose, levulose, galactose, xarope de milho (por exemplo, xarope de milho de alta frutose ou sólidos de xarope de milho), amido parcialmente hidrolisado, hidrolisado de amido hidrogenado, sorbitol, manitol, xilitol, maltitol, isomalte, aspartame, neotame, sacarina e sais dos mesmos, adoçantes intensos baseados em dipeptídeo e ciclamatos. Um ou mais adoçantes estão opcionalmente presentes em uma quantidade total de cerca de 0,005 a 5,0%, em peso, por exemplo, na composição para tratamento bucal divulgada.
[0229] Um flavorizante natural ou artificial pode opcionalmente estar compreendido na composição para tratamento bucal no presente pedido. Exemplos de flavorizantes adequados incluem vanilina; sálvia; manjerona; óleo de salsa; óleo de hortelã; óleo de canela; óleo de gualtéria (metilsalicilato); óleo de menta; óleo de cravo; óleo de louro; óleo de anis; óleo de eucalipto; óleos cítricos; óleos de frutas; essências como aquelas derivadas de limão, laranja, lima, toranja, damasco, banana, uva, maçã, morango, cereja ou abacaxi; sabores derivados de feijão e nozes, como café, cacau, cola, amendoim ou amêndoa; e flavorizantes adsorvidos e encapsulados. Também englobados dentro de flavorizantes no presente pedido estão ingredientes que fornecem fragrância e/ou outro efeito sensorial na boca, incluindo efeitos de refrescância até aquecimento. Esses ingredientes incluem, sem limitação, mentol, acetato de mentila, lactato de mentila, cânfora, óleo de eucalipto, eucaliptol, anetol, eugenol, cássia, oxanona, Irisone®, propenil guaietol, timol, linalol, benzaldeído, cinamaldeído, N-etil-p-mentano-3-carboxamida, N, 2,3-trimetil-2- isopropilbutanamida, 3-(1-metóxi) -propano-1,2-diol, cinamaldeído glicerol acetal (CGA) e mentona glicerol acetal (MGA). Um ou mais flavorizantes estão opcionalmente presentes em uma quantidade total de cerca de 0,01 a 5,0%, em peso (por exemplo, cerca de 0,1 a 2,5%, em peso), por exemplo, na composição para tratamento bucal divulgada.
[0230] Uma composição para tratamento bucal, em certas realizações, pode compreender pelo menos um sal bicarbonato. Qualquer bicarbonato oralmente aceitável pode ser usado, incluindo bicarbonatos de metal alcalino, como bicarbonato de sódio ou de potássio e bicarbonato de amônio, por exemplo. Um ou mais sais de bicarbonato estão opcionalmente presentes em uma quantidade total de cerca de 0,1 a 50%, em peso (por exemplo, cerca de 1 a 20%, em peso), por exemplo, na composição para tratamento bucal divulgada.
[0231] Uma composição para tratamento bucal, em certas realizações, pode compreender pelo menos um agente de branqueamento e/ou corante. Um agente de branqueamento adequado é um composto de peróxido como qualquer um daqueles divulgados na patente US 8540971, que é incorporada ao presente pedido como referência. Corantes adequados no presente pedido incluem pigmentos, corantes, vernizes e agentes que conferem um brilho particular ou refletividade como agentes perolizantes, por exemplo. Exemplos específicos de corantes úteis no presente pedido incluem talco, mica, carbonato de magnésio, carbonato de cálcio, silicato de magnésio, silicato de magnésio alumínio, sílica, dióxido de titânio, óxido de zinco, óxidos de ferro vermelho, amarelo, marrom e preto, ferrocianeto de amônio férrico, violeta manganês, ultramarino, mica titaniada e oxicloreto de bismuto. Um ou mais corantes estão opcionalmente presentes em uma quantidade total de cerca de 0,001 a 20%, em peso (por exemplo, cerca de 0,01 a 10%, em peso, ou cerca de 0,1 a 5,0%, em peso), por exemplo, na composição para tratamento bucal divulgada.
[0232] Componentes adicionais que podem ser opcionalmente incluídos em uma composição oral no presente pedido incluem uma ou mais enzimas (acima), vitaminas e agentes anti-adesão, por exemplo. Exemplos de vitaminas úteis no presente pedido incluem vitamina C, vitamina E, vitamina B5 e ácido fólico. Exemplos de agentes anti-adesão adequados incluem solbrol, ficina e inibidores de sensibilidade ao quorum.
[0233] Uma composição que compreende um glucano alfa-1,2 ramificado no presente pedido pode ser derivada do glucano em algumas realizações (isto é, um glucano alfa-1,2 ramificado no presente pedido pode ser derivado para ser ligado ao éter a um ou mais grupos orgânicos diferentes). O grau de substituição (DoS) de um glucano alfa-1,2 ramificado com um ou mais grupos orgânicos eterificados pode ser de cerca de 0,0025 a cerca de 3,0, por exemplo. De maneira alternativa, o DoS pode ser cerca de, ou pelo menos cerca de 0,0025, 0,005, 0,01, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, ou 3,0, por exemplo (pode ser expresso opcionalmente como uma faixa entre qualquer um desses dois valores).
[0234] Um grupo orgânico eterificado para um glucano alfa-1,2 ramificado no presente pedido pode ser um grupo alquila, como grupo metila, etila, propila, butila, pentila, hexila, heptila, octila, nonila ou decila, por exemplo. Em alguns aspectos, um grupo orgânico eterificado para um glucano alfa-1,2 ramificado pode ser um grupo alquila substituído no qual há uma substituição em um ou mais carbonos do grupo alquila. A(s) substituição(ões) podem ser um ou mais grupos hidroxila, aldeído, cetona e/ou grupos carboxila. Por exemplo, um grupo alquila substituído pode ser um grupo hidróxi alquila, grupo diidróxi alquila ou carbóxi alquila. Exemplos de grupos hidróxi alquila adequados são grupos hidroximetila, hidroxietila, hidroxipropila, hidroxibutila e hidroxipentila. Outros exemplos incluem grupos diidróxi alquila (dióis), como grupos diidroximetila, diidroxietila, diidroxipropila, diidroxibutila e diidroxipentila. Exemplos de grupos carbóxi alquila adequados são grupos carboximetila (-CH2COOH), carboxietila, carboxipropila, carboxibutila e carboxipentila.
[0235] Um grupo orgânico eterificado para um glucano alfa-1,2 ramificado pode ser um grupo orgânico carregado positivamente, em alguns aspectos. Um grupo carregado positivamente no presente pedido, pode ser um grupo amônio, por exemplo. Exemplos de grupos amônio substituído são grupos primários, secundários, terciários e quaternários. Exemplos adicionais de grupos carregados positivamente adequados são divulgados na publicação de pedido de patente US 2016/0311935, que é incorporada ao presente pedido como referência.
[0236] Um composto de éter de glucano alfa-1,2 ramificado, em certas realizações, pode conter um tipo de grupo orgânico. Um exemplo não limitante específico desse composto é carboximetil glucano alfa-1,2 ramificado. Alternativamente, um composto de éter de glucano alfa-1,2 ramificado pode conter dois ou mais tipos diferentes tipos de grupos orgânicos. Em alguns aspectos, um composto de éter de glucano no presente pedido pode compreender pelo menos um grupo orgânico não iônico e pelo menos um grupo aniônico como grupos éter. Em alguns aspectos, um composto de éter de glucano no presente pedido pode compreender pelo menos um grupo orgânico não iônico e pelo menos um grupo orgânico carregado positivamente como grupos éter.
[0237] A porcentagem das unidades de monossacarídeos de um composto de éter de glucano alfa-1,2 ramificado no presente pedido que são éter-ligadas a um grupo orgânico (isto é, onde um ou mais grupos hidroxila de uma unidade monomérica de monossacarídeo foram eterificados) pode variar dependendo do grau em que um glucano alfa-1,2 ramificado é eterificado em uma reação de eterificação. Esta percentagem pode ser de pelo menos cerca 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% (ou qualquer valor inteiro entre 30% e 100%), por exemplo.
[0238] Qualquer glucano alfa-1,2 ramificado conforme atualmente divulgado pode ser usado para preparar um composto de éter correspondente. Qualquer processo adequado para oligossacarídeos e/ou polissacarídeos que derivam de éter pode ser empregado, conforme divulgado nas patentes US 2961439, 2344179, 2203703, 2203704, 2380879 e 2974134, publicação de pedido de patentes US 2014/179913, 2016/0304629, 2016/0311935, 2015/0232785 e 20150239995, e publicação de pedido de patente documento WO 16/160738, todos os quais são incorporados ao presente pedido como referência.
[0239] Apenas como um exemplo, um composto de éter no presente pedido pode ser preparado por (i) adição de cerca de 35 a 45%, em peso (por exemplo, 40%) de ramificações alfa-1,2 a um esqueleto de glucano com pelo menos 95%, em peso (por exemplo, 100%) de ligações alfa-1,6 e um peso molecular de cerca de 15 a 20 kD (por exemplo, aproximadamente 17 kD), e (ii) eterificar o produto de glucano alfa-1,2 ramificado com qualquer grupo orgânico divulgado acima (por exemplo, grupo carboximetila).
[0240] Outro aspecto da presente divulgação diz respeito a um método para produzir uma composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2. Esse método pode compreender as etapas de: (a) fornecer pelo menos os seguintes componentes de reação: água, sacarose, um substrato de alfa-glucano e um polipeptídeo que é capaz de formar pelo menos uma ramificação alfa-1,2 a partir do substrato alfa-glucano, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica a: (i) a forma madura de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13; (ii) SEQ ID NO: 27 ou uma subsequência dentro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 que se alinha com SEQ ID NO: 27; e/ou (iii) uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13; (b) combinar os componentes de reação sob condições adequadas através das quais o polipeptídeo catalisa a síntese de pelo menos uma ramificação alfa-1, 2 do substrato de alfa-glucano, formando assim uma composição de glucano que compreende uma ou mais ligações alfa-1,2; e (c) opcionalmente isolar a composição de glucano que compreende uma ou mais ligações alfa-1,2.
[0241] Qualquer das características divulgadas no presente pedido (por exemplo, acima e nos Exemplos abaixo) a respeito de uma composição de reação (reação de ramificação 1,2) pode caracterizar aspectos apropriados desse método de produção de glucano, e vice-versa.
[0242] A produção de uma composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2 pode ser realizada combinando os componentes de reação sob quaisquer condições de reação adequadas, como aquelas divulgadas no presente pedido. A reação pode ser realizada em uma solução aquosa e/ou, em certas realizações, pode ser realizada in situ dentro de um produto (por exemplo, um alimento, produto farmacêutico, para cuidados pessoais, cuidados domésticos ou industrial) seguindo qualquer metodologia. Em certas realizações, a enzima de ramificação 1,2 é adicionada a um produto alimentício líquido contendo sacarose. A enzima pode reduzir a quantidade de sacarose no produto alimentício líquido, ao mesmo tempo aumentando a quantidade de frutose e glucano alfa-1,2 ramificado. Metodologia adequada para produção in situ de glucano dentro de um produto alimentício pode ser encontrada no documento WO 2013/182686, por exemplo, que é incorporado ao presente pedido como referência.
[0243] A concentração de uma enzima de ramificação 1,2 no presente pedido pode depender de sua atividade catalítica específica, e tipicamente é escolhida para se obter a taxa total desejada de reação. A concentração da enzima tipicamente situa-se na faixa de 0,0001 mg a 20 mg por mL de volume total de reação, ou de 0,001 mg a 10 mg por mL. A enzima de ramificação 1,2 também pode ser imobilizada em um suporte solúvel ou insolúvel com o uso de métodos conhecidos consulte, por exemplo, Immobilization of Enzymes and Cells; Gordon F. Bickerstaff, Editora; Humana Press, Totowa, NJ, EUA; 1997. A enzima de ramificação 1,2 pode ser fornecida nas células microbianas inteiras, como enzima exibida na superfície de células microbianas, células microbianas permeabilizadas, extratos de células microbianas, forma parcialmente purificada ou forma purificada, ou qualquer mistura dos mesmos.
[0244] Em certas realizações, um método para produzir uma composição de glucano alfa-1,2 ramificado ainda inclui a etapa (d) de concentrar a composição de glucano.
[0245] Em certas realizações, a concentração de substrato de alfa- glucano no início da ramificação alfa-1,2 é pelo menos cerca de 10 g/L ou 50 g/L a 500 g/L ou 100 g/L a 500 g/L ou 150 g/L a 450 g/L ou 250 g/L a 450 g/L ou 250 g/L a 600 g/L.
[0246] A concentração de sacarose usada durante a reação pode variar. Em certas realizações, a concentração de sacarose inicialmente presente quando os componentes de reação são combinados é de pelo menos cerca 50 g/L ou 50 g/L a 600 g/L ou 100 g/L a 500 g/L ou 100 g/L a 200 g/L ou 150 g/L a 450 g/L ou 200 g/L a 450 g/L ou 250 g/L a 600 g/L. Em realizações particulares, a concentração de sacarose é cerca de 200 g/L ou 100 g/L. Concentrações mais altas de sacarose podem ser usadas se a reação ocorrer concomitantemente com uma reação de preparação de substrato de alfa-glucano.
[0247] A razão, em peso, de sacarose para o esqueleto de substrato de alfa-glucano durante uma reação de ramificação 1,2 no presente pedido pode variar. Em uma realização, a razão, em peso de sacarose para esqueleto de substrato de alfa-glucano pode variar de 0,01:1,0 a 1,0:0,01, inclusive. Em certas realizações, o método é realizado em um pH entre 3 e 8, ou entre 4 e 8, ou entre 5 e 8, ou entre 5,5 e 7,5, ou entre 5,5 a cerca de 6,5. Em certas realizações, o conjunto dos componentes de reação inclui um tampão adequado incluindo, mas não se limitando a, fosfato, pirofosfato, bicarbonato, acetato ou citrato. A concentração de tampão, quando empregada, é tipicamente de 0,1 mM a 1,0 M, ou de 1 mM a 300 mM, ou de 10 mM a 100 mM. O método pode, opcionalmente, utilizar controle de pH para manter um pH ótimo ao longo do curso de reação, por adição contínua ou incremental de um ácido ou base adequada para manter o pH na faixa desejada para uma atividade enzimática ótima.
[0248] A duração de uma reação de ramificação 1,2 no presente pedido pode variar e pode com frequência ser determinada pela quantidade de tempo que ela leva para usar todo o substrato de sacarose disponível. Em certas realizações, a reação é conduzida até que pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 99% da sacarose inicialmente presente na mistura de reação seja consumida. Em certas realizações, o tempo de reação é de cerca de 1 hora a 168 horas, 1 hora a 72 horas, 1 hora a 24 horas ou 1 hora a 2 horas.
[0249] A temperatura de uma reação de ramificação 1,2 no presente pedido pode ser escolhida para controlar tanto a taxa de reação como a estabilidade da(s) enzimas(s) usadas, conforme desejado. A temperatura da reação pode variar desde apenas acima do ponto de congelamento da formulação de reação (aproximadamente 0°C) a cerca de 60°C, ou de 5°C a cerca de 47°C, ou uma faixa de cerca de 20°C a cerca de 47°C, por exemplo.
[0250] Em certas realizações, o conjunto de componentes de reação podem ainda incluir uma alfa-glucanohidrolase (exo- e/ou endo- glucanohidrolase). Em certas realizações, a alfa-glucanohidrolase é uma dextranase ou mutanase, como um endomutanase ou endodextranase. Em certas realizações, a alfa-glucanohidrolase é uma dextranase (EC 2.1.1.11), mutanase (EC 3.1.1.59) ou combinação das mesmas. Em certas realizações, a dextranase é uma dextranase de grau alimentício de Chaetomium erraticum. Em certas realizações, a dextranase de Chaetomium erraticum é DEXTRANASE® PLUS L, disponível junto à Novozymes A/S, Dinamarca.
[0251] Em certas realizações, isolar uma composição de produto de glucano 1,2 ramificado inclui pelo menos um dentre centrifugação, filtração, fracionamento, separação cromatográfica, diálise, evaporação e diluição.
[0252] Qualquer uma das condições supracitadas no presente pedido para sintetizar uma composição de glucano com ramificações alfa-1,2, como as supracitadas ou as descritas nos Exemplos abaixo, podem ser aplicadas para praticar uma composição de reação como atualmente divulgado.
[0253] Exemplos não limitantes de composições e métodos divulgados no presente pedido incluem: 1. Uma composição de reação que compreende pelo menos água, sacarose, um substrato de alfa-glucano e um polipeptídeo que é capaz de formar pelo menos uma ramificação alfa-1,2 a partir do substrato de alfa-glucano, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica a: (i) a forma madura de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13; (ii) SEQ ID NO: 27 ou uma subsequência dentro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 que se alinha com SEQ ID NO: 27; e/ou (iii) uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13. 2. A composição de reação da realização 1, em que a sequência de (i) compreende: posições 36 a 1672 de SEQ ID NO: 4, posições 21 a 2771 de SEQ ID NO: 1, posições 21 a 2821 de SEQ ID NO: 2, posições 41 a 2844 de SEQ ID NO: 3, posições 51 a 1632 de SEQ ID NO: 5, posições 51 a 1318 de SEQ ID NO: 6, posições 51 a 1139 de SEQ ID NO: 7, posições 51 a 1463 de SEQ ID NO: 8, posições 41 a 2841 de SEQ ID NO: 9, posições 46 a 2580 de SEQ ID NO: 10, posições 51 a 1463 de SEQ ID NO: 11, posições 21 a 2824 de SEQ ID NO: 12, ou posições 21 a 2771 de SEQ ID NO: 13. 3. A composição de reação da realização 1, em que a sequência de (ii) compreende: posições 36 a 1115 de SEQ ID NO: 4, posições 1715 a 2821 de SEQ ID NO: 2, posições 1735 a 2834 de SEQ ID NO: 3, posições 51 a 1167 de SEQ ID NO: 5, posições 93 a 1178 de SEQ ID NO: 6, posições 51 a 1130 de SEQ ID NO: 7, posições 51 a 1158 de SEQ ID NO: 8, posições 1735 a 2841 de SEQ ID NO: 9, posições 1274 a 2413 de SEQ ID NO: 10, posições 51 a 1158 de SEQ ID NO: 11, posições 1715 a 2821 de SEQ ID NO: 12, ou posições 1665 a 2771 de SEQ ID NO: 13. 4. A composição de reação de qualquer uma das realizações 1 a 3, em que o substrato de alfa-glucano tem um grau de polimerização de pelo menos 3, e compreende pelo menos (i) ligações glicosídicas alfa-1,6 ou (ii) ligações glicosídicas alfa-1,6 e alfa-1,3. 5. Um método para produzir uma composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2, o método compreendendo: (a) fornecer pelo menos os seguintes componentes de reação: água, sacarose, um substrato de alfa-glucano e um polipeptídeo que é capaz de formar pelo menos uma ramificação alfa-1,2 a partir do substrato alfa-glucano, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica a: (i) a forma madura de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13; (ii) SEQ ID NO: 27 ou uma subsequência dentro de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 que se alinha com SEQ ID NO: 27; e/ou (iii) uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13; (b) combinar os componentes de reação sob condições adequadas através das quais o polipeptídeo catalisa a síntese de pelo menos uma ramificação alfa-1,2 a partir do substrato de alfa-glucano, formando através disso uma composição de glucano que compreende uma ou mais ligações alfa- 1,2; e (c) opcionalmente isolar a composição de glucano que compreende uma ou mais ligações alfa-1,2. 6. O método da realização 5, em que o substrato de alfa- glucano (i) tem um grau de polimerização de pelo menos 3, e compreende pelo menos (i) ligações glicosídicas alfa-1,6 ou (ii) ligações glicosídicas alfa-1,6 e alfa- 1,3. 7. O método de qualquer uma das realizações 5 a 6, em que o substrato de alfa-glucano e sacarose estão presentes em (b) em uma razão entre 0,01:1 e 1:0,01, inclusive. 8. O método de qualquer uma das realizações 5 a 7, em que os componentes de reação compreendem ainda uma alfa-glucanohidrolase. 9. Uma composição que compreende uma composição de glucano compreendendo uma ou mais ligações alfa-1,2 produzidas pelo método de qualquer uma das realizações 5 a 8, ou conforme produzida pela composição de reação de qualquer uma das realizações 1 a 4, preferencialmente em que a composição está sob a forma de um produto alimentício, produto farmacêutico, produto para cuidados pessoais, produto para cuidados domésticos ou produto industrial, opcionalmente em que a composição compreende cerca de 0,01 a 99%, em peso, (com base em sólidos secos) da composição de glucano. 10. A composição da realização 9, em que a composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2 é solúvel em água e libera lentamente glicose quando fornecida a um mamífero, em que o mamífero é preferencialmente um humano. 11. A composição de qualquer uma das realizações 9 a 10, em que a composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2 tem 10% ou menos de ramificação alfa-1,2. 12. A composição da realização 9, em que a composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2 é solúvel em água e age como uma fibra dietética quando fornecida a um mamífero, em que o dito mamífero é preferencialmente um humano. 13. A composição de qualquer uma das realizações 9 ou 12, em que a composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2 tem pelo menos cerca 15% de ramificação alfa-1,2. 14. A composição de qualquer uma das realizações 9 a 13, que ainda compreende pelo menos um ingrediente selecionado a partir do grupo que consiste em: simbióticos, peptídeos, hidrolisados de peptídeo, proteínas, hidrolisados de proteína, proteínas de soja, proteínas lácteas, aminoácidos, polióis, polifenóis, vitaminas, minerais, ervas, extratos vegetais, ácidos graxos, ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs), fitosteróis, betaína, carotenoides, enzimas digestivas e organismos probióticos; preferencialmente em que a composição está sob a forma de um produto alimentício ou produto farmacêutico. 15. A composição de qualquer uma das realizações 9 a 14, em que a composição está sob a forma de um produto alimentício ou produto farmacêutico, e que ainda compreende pelo menos um ingrediente selecionado a partir do grupo que consiste em: monossacarídeos, dissacarídeos, glicose, sacarose, frutose, leucrose, xarope de milho, , xarope de milho de alta frutose, açúcar isomerizados, maltose, trealose, panose, rafinose, celobiose, isomaltose, mel, açúcar de bordo, adoçantes derivados de frutas, sorbitol, maltitol, isomaltitol, lactose, nigerose, kojibiose, xilitol, eritritol, dihidrocalcona, esteviosídeo, acessulfame de potássio, alitame, neotame, glicirrizina, taumantina, sucralose, éster metílico de L- aspartil-L-fenilalanina, sacarina, maltodextrina, amido, amido de batata, amido de tapioca, dextrano, fibra de milho solúvel, maltodextrinas resistentes, maltodextrinas ramificadas, inulinas, polidextrose, fruto-oligossacarídeos, galacto-oligossacarídeos, xilo-oligossacarídeos, arabinoxilo-oligossacarídeos, nigero-oligossacarídeos, gentio- oligossacarídeos, hemicelulose, xarope de oligômero de frutose, isomalto- oligossacarídeos, preenchedores, excipientes e aglutinantes. 16. A composição da realização 9, em que a composição é uma composição detergente, e em que a composição é preferencialmente um produto doméstico. 17. Um método que compreende administrar por via enteral uma substância a um mamífero, em que a substância compreende uma composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2, em que a administração resulta em elevação menor ou mais lenta de glicose no sangue do mamífero, em comparação a um mamífero que é administrado por via enteral com uma substância que é desprovida da composição de glucano mas, ao invés disso, contém a mesma quantidade de um carboidrato contendo glicose facilmente digerível, em que a composição de glucano é produzida pelo método de qualquer uma das realizações 5 a 8, ou conforme produzida pela composição de reação de qualquer uma das realizações 1 a 4, opcionalmente em que o mamífero é um humano, e opcionalmente em que o carboidrato contendo glicose facilmente digerível é sacarose, glicose livre ou amido. 18. Um método para produzir um produto ingerível, o método compreendendo incorporar uma composição de glucano que compreende ligações alfa-1,2 no o produto ingerível, em que o índice glicêmico do produto ingerível resultante não é aumentado, ou apenas ligeiramente aumentada, em comparação a um produto ingerível que é desprovido da composição de glucano (mas é, de outra forma, o mesmo), e em que a composição de glucano é produzida pelo método de qualquer uma das realizações 5 a 8 ou conforme produzido pela composição de reação de qualquer uma das realizações 1 a 4.
EXEMPLOS
[0254] A divulgação é ainda definida nos Exemplos a seguir. Deve- se entender que os Exemplos, embora indicando certas realizações, são dados apenas a título de ilustração. A partir da discussão acima e dos Exemplos, um técnico no assunto pode averiguar características essenciais dessa divulgação e, sem se afastar do espírito e do escopo desta, pode fazer várias alterações e modificações para adaptar a vários usos e condições.
[0255] O significado das abreviações é como a seguir: “seg” ou “s” significa segundo(s), “ms” significa milissegundos, “min” significa minuto(s), “h” ou “hr” significa hora(s), “μL” significa microlitro(s), “mL” significa mililitro(s), “L” significa litro(s); “mL/min” é mililitros por minuto; “μg/mL” é micrograma(s) por mililitro(s); “LB” é caldo de Luria; “μm” é micrômetros, “nm” é nanômetros; “OD” é densidade ótica; “IPTG” é isopropil-β-D-tio-galactosideo; “g” é força gravitacional; “mM” é milimolar; “SDS-PAGE” é poliacrilamida dodecil sulfato de sódio; “mg/mL” é miligramas por mililitros; “N” é normal; “p/v” é peso por volume; “DTT” é ditiotreitol; “BCA” é ácido bicinconínico; “DMAc” é N, N’- dimetil acetamida; “LiCl” é cloreto de lítio, “NMR” é ressonância magnética nuclear; “DMSO” é dimetilsulfóxido; “SEC” é cromatografia de exclusão por tamanho; “GI” ou “gi” significa Identificador GenInfo, um sistema usado por GENBANK ® e outro banco de dados de sequência para identificar exclusivamente sequências de polinucleotídeos e/ou polipeptídeos dentro dos respectivos banco de dados; “DPx” significa grau de glucano de polimerização que tem “x” unidades de comprimento; “ATCC” significa Coleção Americana de Tipo de Cultura (Manassas, VA), “DSMZ” e “DSM” referem-se a Instituto Leibniz DSMZ-Coleção Alemã de Microrganismos e Culturas Celulares, (Braunschweig, Alemanha); “EELA” é a Finish Food Safety Authority (Helsinki, Finlândia;) “CCUG” refere-se à Coleção de Cultura, University of Goteborg, Suécia; “Sac.” significa sacarose; “Glic.” significa glicose; “Frut.” significa frutose; “Leuc.” significa leucrose; e “Rxn” significa reação.
MÉTODOS GERAIS
[0256] Todos os reagentes, enzimas de restrição e materiais de cultura bacteriana foram obtidos junto à BD Diagnostic Systems (Sparks, MD), Invitrogen/Life Technologies Corp. (Carlsbad, CA), Life Technologies (Rockville, MD), QIAGEN (Valencia, CA), Sigma-Aldrich Chemical Company (St. Louis, MO) ou Pierce Chemical Co. (uma divisão da Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL) a menos que especificado de outra forma. IPTG, (cat. n° 16758), cloreto de trifeniltetrazólio e reagentes de ensaio de proteína BCA foram obtidos junto à Sigma Co., (St. Louis, MO). Os frascos giratórios BELLCO foram obtidos junto à Bellco Co., (Vineland, NJ). O meio LB foi obtido junto à Becton, Dickinson and Company (Franklin Lakes, Nova Jersey).
[0257] Os açúcares redutores foram determinados com o uso do ensaio PAHBAH (Lever, Anal. Biochem. 47, 273-279, 1972). EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO DE POLIPEPTÍDEOS CAPAZES DE FORMAR GLUCANOS QUE TÊM LIGAÇÕES ALFA (1,2)
[0258] A sequência GTF-J18 (de Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides J18) (SEQ ID NO: 1) contém três regiões distintas: domínio catalítico 1 (““CD1””), um domínio de ligação de glucano e CD2. CD1 e CD2 são domínios GH70, responsáveis por diferentes atividades catalíticas.
[0259] Nós mostramos que uma versão truncada N-terminal de GTFJ18, designada GTFJ18T1 (SEQ ID NO: 27), pode produzir ramificação alfa- 1,2 quando um polissacarídeo alfa-1,6-ligado é fornecido na reação (consulte o Exemplo 1 da publicação de pedido de patente internacional WO 2015/183714, que é incorporado ao presente pedido como referência) (consulte também o Exemplo 6 abaixo). GTF-J18T1 (SEQ ID NO: 27) inclui apenas uma porção do domínio de ligação de glucano e CD2. Isto sugere que o CD2 de GTF-J18 (“GTF- J18-CD2”) pode catalisar a ramificação alfa-1,2 de um substrato de polissacarídeos alfa-1,6-ligado.
[0260] A sequência GTF-J18-CD2 (SEQ ID NO: 28) foi usada como uma consulta para BLAST contra a versão não redundante do banco de dados de proteína no GENBANK. Quarenta sequências foram relatadas por BLAST como mais que 50% idênticas à sequência de GTF-J18-CD2 (SEQ ID NO: 28) no Segmento de Alta Pontuação de BLAST. As quarenta sequências foram alinhadas com o uso do programa TARGET2K do conjunto SAM de UCSC (SAM: Pacote de ferramentas HMM lançado pelo grupo Karplus em UC Santa Cruz; os algoritmos no SAM são descritos em Karplus et al., Bioinformatics 14:846-856, 1998). Treze sequências (SEQ ID NOs: 1-13) que eram pelo menos 60% idênticas à sequência de GTF-J18-CD2 (SEQ ID NO: 28) na região alinhada foram selecionadas como polipeptídeos possivelmente capazes de formar glucanos que têm ligações alfa (1,2) e são divulgadas no presente pedido. EXEMPLO 2 EXPRESSÃO DE GLICOSILTRANSFERASE GTF8117 LACTOBACILLUS ANIMALIS KCTC 3501
[0261] Um gene de glicosiltransferase putativo, LanGtfl, com GI n° 335358117 (antigo) (novo GI n° 948839227; n° de acesso no GENBANK KRM57462.1) foi identificado a partir de Lactobacillus animalis KCTC 3501 (“GTF8117” no presente pedido). A proteína GTF8117 tem um peptídeo sinal com 37 aminoácido predita pelo (Petersen et al., Nature Methods 8:785-786, 2011). Isto indica que a GTF8117 é uma proteína secretada. A sequência do gene que codifica a proteína madura de GTF8117 foi otimizada para expressão em Bacillus subtilis. O gene foi sintetizado por Generay (Xangai, China), e inserido no plasmídeo p2JM103BBI (Vogtentanz, Protein Expr. Purif. 55:40-52, 2007), resultando no plasmídeo pZZHB561. PZZHB561 contém (na direção 5’ para 3') um promotor aprE, uma sequência que codifica uma sequência sinal aprE usada para direcionar a secreção de proteína em Bacillus subtilis, um oligonucleotídeo que codifica Ala-Gly-Lys para facilitar a secreção da proteína alvo, e o gene sintético que codifica a proteína alvo.
[0262] Outro plasmídeo de expressão, pDCQ1004, foi construído para expressar GTF8117 sem um peptídeo sinal. O plasmídeo PZZHB561 foi usado como o molde para amplificação por PCR da sequência codificadora de GTF8117 juntamente com a terminadora Tlat. O produto de PCR foi clonado nos sítios SpeI e BamHI do plasmídeo de expressão integrador de B. subtilis, p4JH, tendo um promotor aprE, mas nenhuma região codificadora de sequência sinal. O plasmídeo pDCQ1004 resultante contém a SEQ ID NO: 29, que codifica GTF8117 madura com uma metionina N-terminal adicionada (SEQ ID NO: 30). pDCQ1004 foi usado para transformar células de B. subtilis BG6006 para expressar GTF8117 (SEQ ID NO: 30). A linhagem BG6006 hospedeira de B. subtilis contém nove deleções de protease (amyE::xylRPxylAcomK-ermC, degUHy32, oppA, ΔspoIIE3501, ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpr, Δvpr, ΔwprA, Δmpr-ybfJ, ΔnprB). As células transformadas foram espalhadas em placas LB suplementadas com 5 μg/mL de cloranfenicol. As colônias cultivadas nessas placas foram aplicadas por esfregaço várias vezes sobre placas LB com 25 μg/mL de cloranfenicol. As colônias amplificadas resultantes foram cultivadas em LB contendo 25 μg/mL de cloranfenicol por 6 a 8 horas e, em seguida, subcultivadas em meio de Grant II e cultivadas a 30°C por 3 dias. As culturas foram centrifugadas a 15.000 g por 30 min a 4°C e o sobrenadante coletado, que se esperava conter proteínas intracelulares solúvel devido à autólise celular, foram filtradas através de filtros de 0,22 μm. Os sobrenadantes filtrados foram aliquotados e congelados a -80°C, e foram usados mais tarde em um ensaio de hidrazina ácido p-hidroxibenzóico (PAHBAH) para determinar a atividade enzimática. O clone com sobrenadante com a atividade mais alta no ensaio PAHBAH (denominado linhagem SG1024) foi usado para fazer tubos de sementes para fermentação.
[0263] Produção adicional de GTF8117 (SEQ ID NO: 30) foi conduzida no Exemplo 4. EXEMPLO 3 EXPRESSÃO DE GLICOSILTRANSFERASE DE STREPTOCOCCUS SALIVARIUS M18 GTF6831
[0264] Uma glicosiltransferase putativa (antigo GI n° 345526831, novo GI n° 490287001; n° de acesso no GENBANK WP_004182667.1) foi identificada a partir de Streptococcus salivarius M18. Essa enzima é citada no presente pedido como “GTF6831” e tem 1600 resíduos de aminoácidos com os 42 primeiros resíduos preditos para ser o peptídeo sinal nativo pelo programa SignalP4.1. A sequência de nucleotídeos de genes (SEQ ID NO: 31) que codifica a proteína madura de GTF6831 (SEQ ID NO: 32) foi sintetizada por GenScript USA Inc. (Piscataway, NJ). A sequência sintetizada (SEQ ID NO: 31) foi clonado nos sítios nos sítios NheI e HindIII do plasmídeo de expressão integrativa p4JH de Bacillus subtilis mediante o promotor aprE e a sequência que codifica um peptídeo sinal AprR de B. subtilis. O constructo foi primeiro transformado em E. coli DH10B e selecionado em LB com placas com ampicilina (100 μg/mL). O constructo confirmado, pDCQ990-5, permitiu a expressão de glicosiltransferase GTF6831 madura (SEQ ID NO: 32). pDCQ990-5 foi então transformado em B. subtilis BG6006, que contém nove deleções de protease (amyE::xylRPxylAcomK-ermC, degUHy32, oppA, ΔspoIIE3501, ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpr, Δvpr, ΔwprA, Δmpr-ybfJ, ΔnprB), e selecionados em placas LB com cloranfenicol (5 μg/mL). As colônias cultivadas nessas placas foram aplicadas por esfregaço várias vezes sobre placas LB com 25 μg/mL de cloranfenicol. As colônias múltiplas da linhagem de expressão de B. subtilis resultantes, SG1190, foram cultivadas em meio LB com 25 ug/mL de cloranfenicol por 6 a 8 horas primeiro e, em seguida, subcultivadas em meio de Grant II e cultivadas a 30°C por 2 a 3 dias. As culturas foram centrifugadas a 15.000 g por 30 min a 4°C e os sobrenadantes foram filtrados através de filtros de 0,22 μm. Os sobrenadantes filtrados foram aliquotados e congelados a -80°C, e foram usados mais tarde em um ensaio PAHBAH para determinar a atividade enzimática. O clone com atividade PAHBAH mais alta foi escolhido para produzir o frasco de semente para fermentação.
[0265] Produção adicional de GTF6831 (SEQ ID NO: 32) foi conduzida no Exemplo 5. EXEMPLO 4 PRODUÇÃO DE GLICOSILTRANSFERASE GTF8117 EM B. SUBTILIS
[0266] A glicosiltransferase GTF8117 (SEQ ID NO: 30) foi produzida com o uso da linhagem SG1204, que é uma nove protease-knockout de B. subtilis, linhagem comK, contendo o plasmídeo pDCQ1004. Inicialmente, um frasco congelado SG1204 foi cultivado em 40 mL de meio de sementes contendo 10 g de soytone, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de NaCl, 10 g/L de glicose e 10 mg/L de antibiótico cloranfenicol. A temperatura de crescimento era de 30°C e um pH inicial de 7,2. Um frasco de sementes de 250 mL contendo 40 mL de meio de sementes foi colocado em um agitador-estufa a 30°C e misturados a 300 rpm por 2,83 horas. Após esse tempo o inóculo cresceu a um valor de OD (600 nm) de 0,33 unidades. 30 mL do meio de sementes cultivadas foi usado para inocular um tanque de produção contendo 7 litros de meio de fermentação.
[0267] O meio de fermentação continha 5 g/L de sólidos de maceração de milho, 8 g/L de fosfato de sódio monobásico monohidratado, 8 g/L de fosfato de potássio monoidratado, 4,2 g/L de sulfato de magnésio heptahidratado, 0,3 g/L de sulfato ferroso heptahidratado, 0,2 g/L de cloreto de manganês tetrahidratado, 0,1 g/L de cloreto de cálcio desidratado e 2,06 mL/L do agente antiespuma, FOAM BLAST 882.
[0268] As seguintes condições de operação foram configuradas: 30°C, pH 7,2 e 25% de oxigênio dissolvido. A fermentação decorreu inicialmente em modo de batelada, começando com uma concentração de glicose residual de 10 g/L. Como a glicose residual foi quase esgotada em 15,3 horas do tempo decorrido de fermentação, começamos a alimentação contínua de glicemia, iniciando um modo de batelada alimentada. O pH foi controlado com o uso de uma solução de NH4OH 69% v/v (conteúdo de NH3 20%). A glicose foi alimentada até 40,6 horas de tempo decorrido de fermentação, distribuindo aproximadamente 1593 gramas a 650 g/L de concentração de glicose. Em 40,6 horas, a alimentação de glicose foi interrompida mantendo as outras condições de operação para aproximadamente meia hora a fim de permitir completar o consumo completo da glicose residual remanescente. Então, em 41,1 horas de tempo decorrido de fermentação, a porção de lise da execução foi iniciada complementando a cessação de glicose com um aumento da temperatura de fermentação da operação para 33°C, uma parada completa do fluxo de ar, redução da velocidade de agitação de 200 rpm, e um elevador de controle de pH, resultando em lise celular completa in situ dentro do período subsequente de 8 horas. A execução da fermentação terminou em 49,1 horas após o início.
[0269] O sobrenadante do caldo do fim da execução foi coletado e analisado por HPLC quanto à presença de GTF8117 (SEQ ID NO: 30) medindo a taxa de consumo da sacarose e a taxa de produção de frutose correspondente. Este ensaio bioquímico mediu 4,64 mg de GTF8117/mL (472 U/mL, baseado no consumo de sacarose) e 4,25 mg de GTF8117/mL (baseado na produção de frutose). O sobrenadante foi armazenado a -80°C.
[0270] GTF8117 (SEQ ID NO: 30) produzida neste Exemplo foi usada em um ou mais dos seguintes exemplos para sintetizar glucano para servir como um substrato para uma enzima com ramificação alfa-1,2. EXEMPLO 5 PRODUÇÃO DE GLICOSILTRANSFERASE GTF6831 EM B. SUBTILIS
[0271] A glicosiltransferase GTF6831 (SEQ ID NO: 32) foi produzida com o uso da linhagem SG1190, que é uma nove nove protease-knockout de B. subtilis, linhagem comK, contendo o plasmídeo pDCQ990-5. O meio do frasco de sementes, meio de fermentação e todas as condições de operação foram as mesmas, como descrito no Exemplo 4. A execução da fermentação durou 53 horas. A lise celular foi iniciada no tempo decorrido de fermentação de 41 horas e durou 12 horas. A quantidade total de glicose alimentada distribuída foi de 2147 gramas de solução 50% p/p.
[0272] Após a lise, o sobrenadante foi coletado e analisado por HPLC quanto à presença da enzima GTF6831 (SEQ ID NO: 32) medindo a taxa de consumo da sacarose residual e a taxa de produção de frutose correspondente. Este ensaio bioquímico mediu 108,7 U/mL de sobrenadante. A centrifugação do lisado produziu um sobrenadante que tem 114,5 U/mL de atividade; o sobrenadante foi armazenado a -80°C.
[0273] GTF6831 (SEQ ID NO: 32) produzida neste Exemplo foi usada em um ou mais dos seguintes exemplos para sintetizar glucano para servir como um substrato para uma enzima com ramificação alfa-1,2. EXEMPLO 6 EXPRESSÃO DA GLICOSILTRANSFERASE TRUNCADA, GTFJ18T1 E TESTE DE SUA ATIVIDADE DE RAMIFICAÇÃO ALFA-1,2
[0274] O exemplo a seguir descreve a expressão de uma glicosiltransferase inteira e uma versão truncada desta enzima em E. coli, e seus respectivos testes de atividade de ramificação alfa-1,2 em um esqueleto de glucano. A glicosiltransferase inteira produziu glucano com pouca ramificação alfa-1,2, enquanto que a versão truncada da glicosiltransferase produziu glucano com uma quantidade significativa de ramificação alfa-1,2.
[0275] A glicosiltransferase putativa (antigo GENBANK® gi: 356644413, gi novo: 504090610, n° de acesso. WP_014324604.1) de Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides J18 (designada GTFJ18) tem 2771 aminoácidos (SEQ ID NO: 1). Ela foi identificada como uma glicosil hidrolase a partir do sequenciamento completo do genoma da linhagem J18 isolada de Kimchi (Jung et al., J. Bacteriol. 194:730, 2012). A sequência inteira de GTFJ18 tem 68,6% de identidade de aminoácidos à proteína DsrE (2835 aminoácidos de comprimento) de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299 (n° de acesso no GENBANK® gi: 23320943, n° de acesso CAD22883.1). A proteína DsrE mostrou ser uma proteína bifuncional com dois domínios catalíticos (Bozonnet et al., J. Bacteriol. 184:5763,2002). O primeiro domínio catalítico “CD1” catalisa a síntese de ligações alfa-1,6 e o segundo domínio catalítico “CD2” catalisa a síntese de ligações alfa-1,2. Os domínios CD1 e CD2 são separadas por um domínio de ligação de glucano “GBD” (Fabre et al., J. Bacteriol. 187:296, 2005). Os domínios CD1 das proteínas DsrE e GTFJ18 compartilham 79,3% de identidade de aminoácidos e os domínios CD2 das duas proteínas compartilham 76,6% de identidade de aminoácidos.
[0276] Os 20 aminoácidos N-terminais de GTFJ18 (SEQ ID NO: 1) foram deduzidos como o peptídeo sinal pelo programa SignalP 4.0 (Petersen et al., ibid.). Para construir o plasmídeo de expressão de GTFJ18 inteiro, o DNA que codifica a proteína madura sem o peptídeo sinal foi sintetizado por GenScript USA Inc. O gene foi sintetizado foi subclonado nos sítios NheI e HindIII do vetor pET23D+ (NOVAGEN®; Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha). Um polinucleotídeo que codifica uma versão truncada de GTFJ18, denominado GTF18T1 (SEQ ID NO: 27), contendo o domínio CD2 C-terminal e a parte de um domínio GBD (no total, contendo resíduos de aminoácidos 1665 a 2771 de SEQ ID NO: 1) também foi subclonado no vetor pET23D+. Os plasmídeos carregando as sequências de genes que codificam tanto a proteína GTFJ18 inteira (SEQ ID NO: 1) como truncada (SEQ ID NO: 27) foram transformados em células hospedeiras de E. coli BL21 DE3, resultando em linhagens EC0059 e EC0059T1, respectivamente. Células de EC0059 e EC0059T1 foram cultivadas até OD de aproximadamente 0,5 mM 1 e induzidas com IPTG a 37°C por 3 horas ou, alternativamente, elas foram induzidas a 23°C durante a noite. As células foram coletadas por centrifugação a 4000 x g por 10 min e ressuspensas em tampão PBS pH 6,8. As células foram rompidas passando através de um Prensa Francesa a 14.000 psig (aproximadamente 96,53 MPa) duas vezes e os fragmentos celulares foram peletizados por centrifugação a 15.000 x g por 20 min. O sobrenadante de cada extrato bruto de enzima foi aliquotado e congelado a -80°C.
[0277] As atividades de ramificação alfa-1,2 de cada enzima (GTFJ18 ou GTFJ18T1) foram testadas individualmente no produto de glucano da glicosiltransferase, GTF5604, que é derivada de Streptococcus criceti HS-6 (n° de acesso no GENBANK® n° de acesso WP_004226213.1, gi antigo: 357235604) e divulgadas na publicação de pedido de patente internacional documento WO 2015/183714 (também citado no presente pedido como glicosiltransferase SG1018 ou GtfHS6). GTF5604 (SEQ ID NO: 33) tem 1338 aminoácidos com 36 aminoácidos N-terminal deduzidos como seu peptídeo sinal pelo o programa SignalP 4.0. A sequência de nucleotídeos nativa (posições 1289627-1293643 de n° de acesso no GENBANK NZ_AEUV02000002.1) que codifica GTF5604 inteira (SEQ ID NO: 33) incluindo seu peptídeo sinal nativo foi sintetizada por GenScript e clonada nos sítios SpeI and HindIII do plasmídeo de expressão de Bacillus replicável pHYT (Takara Bio Inc., Otsu, Japão) mediante o promotor aprE de B. subtilis. O constructo foi primeiro transformado em DH10B de E. coli e selecionado em placas com ampicilina (100 μg/mL). O clone confirmado, pDCQ918, foi então transformado em Bacillus subtilis linhagem BG6006 (amyE::xylRPxylAcomK-ermC, degUHy32, oppA, ΔspoIIE3501, ΔaprE, ΔnprE, Δepr, ΔispA, Δbpr, Δvpr, ΔwprA, Δmpr-ybfJ, ΔnprB) e selecionado em placas de tetraciclina (12,5 μg/mL), depois disso a linhagem transformada, denominada SG1018, foi cultivada em LB contendo 10 μg/mL de tetraciclina primeiro, seguido por subcultivo em meio de Grant II contendo 12,5 μg/mL de tetraciclina e cultivada a 37°C por 2 a 3 dias. As culturas foram centrifugadas a 15.000 g por 30 min a 4°C e o sobrenadante foi filtrado através de um filtro de 0,22 μm. Uma reação de síntese de glucano foi configurada contendo 10% (v/v) de sobrenadante SG1018 com 100 g/L de sacarose, citrato de sódio 10 mM pH 5 e CaCl2 1 mM. Toda sacarose foi consumida na reação após 6 horas a 37°C; o produto de glucano tinha um peso molecular de cerca de 3000 e consistiu em quase 100% de ligações alfa-1,6. A reação de síntese de glucano foi submetida à inativação por calor a 95°C por 30 min.
[0278] Uma reação de ramificação foi configurada com 70% (v/v) da reação de síntese de glucano inativada por calor. A enzima sendo testada quanto à atividade de ramificação fora do produto de glucano acima, GTFJ18 ou GTFJ18T1, foi fornecida como 10% (v/v) do extrato celular bruto preparado acima a partir de EC0059 ou EC0059T1, respectivamente, com 40 g/L de sacarose. Cada reação de ramificação foi incubada a 37°C ou 30°C por 22 horas e os produtos foram analisados por HPLC quanto ao consumo de sacarose e NMR quanto ao perfil de ligação.
[0279] Os dados de NMR foram obtidos em um espectrômetro DD2 Agilent (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA), operando a 500 MHz por 1H com o uso de uma sonda de gradiente de campo pulsado de tripla ressonância criogênica. A supressão de água foi obtida colocando cuidadosamente a frequência de transmissor observada na ressonância para o sinal de água residual em um experimento “presat”, e em seguida com o uso da primeira fatia de um experimento NOESY com um ciclo de fase completa (múltiplo de 32) e um tempo de mistura de 10 ms. Espectros unidimensionais 1H foram adquiridos com uma largura espectral de tempo de aquisição de 6410 Hz de 5,1 s, 65536 pontos de dados, 4 s de pré-saturação e um pulso de observação de 90 graus. A média do sinal tipicamente envolveu o acúmulo de 64 varreduras. A temperatura da amostra foi mantida a 25°C.
[0280] Amostras líquidas foram preparadas adicionando tanto 50 como 100 μL de reações de ramificação completas para um tubo de NMR de 5 mm, juntamente com 60 μL de D2O contendo sal de sódio de ácido 4,4-dimetil- 4-silapentano-1-ácido sulfônico sal de sódio (DSS) 12,4 mM como uma referência de deslocamento químico interno, e o equilíbrio (450 ou 400 μL) de D2O para um volume total de 560 μL. A ressonância DSS metila foi ajustada para 0 ppm.
[0281] Atribuições de deslocamento químico para diferentes ligações anoméricas foram tomadas a partir de Goffin et al. (Bull Korean Chem. Soc. 30:2535, 2009). Atribuições específicas de ramificação alfa-1,2 em um esqueleto alfa-1,6 foram tomadas de Maina et al. (Carb. Res. 343:1446,2008). A substituição alfa-1,2 no esqueleto 1,6 (isto é, ligação 1-2,6) leva a um deslocamento químico característico (5,18 ppm) para o H anomérico adjacente ao sítio de substituição. O H anomérico do açúcar 1,2-ligado (5,10 ppm) é obscurecido por leucrose nas misturas de reação, mas é diretamente observado em amostras purificadas.
[0282] O produto da reação de ramificação que compreende GTFJ18 continha 97% de ligações alfa-1,6 e apenas 0,6% de ligações alfa-1,2. O produto da reação de ramificação que compreende GTFJ18T1 (SEQ ID NO: 27) continha 82% de ligações alfa-1,6 e 18% de ligações alfa-1,2. Desta forma, a enzima truncada, GTFJ18T1 (SEQ ID NO: 27) mostrou atividade de ramificação alfa- 1,2 muito maior, em comparação à sua contraparte inteira, GTFJ18 . Embora não se pretenda estar vinculado a qualquer teoria no presente pedido, este resultado pode ser devido àquele de que o domínio CD1 na GTFJ18 era muito ativo e competiu com o domínio de ramificação de CD2 para o substrato de sacarose.
[0283] Desta forma, a GTFJ18T1 (SEQ ID NO: tem uma atividade significativa de ramificação alfa-1,2 e pode ser usada para modificar a estrutura de um substrato de glucano. A produção adicional desta enzima foi conduzida no Exemplo 7. EXEMPLO 7 PRODUÇÃO DA ENZIMA DE RAMIFICAÇÃO 1,2 GTFJ18T1 COM O USO DE E. COLI
[0284] A enzima de ramificação 1,2 GTFJ18T1 (SEQ ID NO: 27) divulgada no Exemplo 6 foi produzida com o uso da linhagem EC0059T1, que é uma linhagem BL21 DE3 de E. coli contendo a informação genética da enzima alvo em um plasmídeo. Inicialmente, um frasco congelado de EC0059T1 foi cultivado em 260 mL de meio de sementes contendo 10 g/L de extrato de levedura, 16 g/L de triptona, 5 g/L de NaCl, sem glicose e 100 mg/L de antibiótico ampicilina. A temperatura de crescimento foi de 30°C e o pH inicial foi 6,8. Um frasco de sementes de 1 L contendo 260 mL de meio de sementes para inoculação de dois tanques de fermentação foi colocado em um agitador- incubador e misturados a 250 rpm por 3,7 horas. Após esse tempo o inóculo cresceu a um valor de OD (600 nm) de 4,0 unidades. 125 mL do meio de sementes cultivadas foi usado para inocular cada um dos tanques de produção contendo 7 litros de meio de fermentação.
[0285] O meio de fermentação continha 5 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de fosfato de potássio monobásico, 1,9 g/L de NaCl, 1,0 g/L de TWEEN-80 e 0,1 mL/L de agente antiespuma BIOSPUMEX 153K. Estes componentes foram adicionados antes da esterilização do tanque/caldo. Após o ciclo de esterilização ter sido concluído e a temperatura de funcionamento nivelada e seu valor definido, nós adicionamos através de técnica estéril os seguintes compostos: 2/4 g/L de heptahidrato de sulfato de magnésio, 50 mg/L de heptahidrato de sulfato ferroso,100 mg/L de dihidrato de cloreto de cálcio, 10 mL/L de coquetel de elementos traço NIT, 100 mg/L de antibiótico ampicilina e 10 g/L de glicose. A solução de coquetel de elementos traço NIT continha: 10 g/L de monohidrato de ácido cítrico, 2 g/L de monohidrato de sulfato de manganês, 2 g/L de cloreto de sódio, 0,5 g/L de heptahidrato de sulfato ferroso, 0,2 g/L de heptahidrato de sulfato de zinco, 20 mg/L de pentahidrato de sulfato de cobre, 20 mg/L de dihidrato de molibdato de sódio e 2,94 mg/L de dihidrato de cloreto de cálcio.
[0286] A execução da fermentação foi controlada a 30°C, pH 6,8 e 25% de oxigênio dissolvido. Inicialmente, para as primeiras 5 horas, a fermentação decorreu em um modo de batelada, começando com uma concentração de glicose residual de 10 g/L. Após 5 horas de tempo decorrido fermentação, começamos com alimentação contínua de glicemia e iniciou- se um modo de batelada alimentada. A glicose foi cuidadosamente alimentada com o objetivo de manter um nível muito baixo, concentração de glicose residual (< 0,1 g/L). Em 17 horas de tempo decorrido de fermentação, induzimos a produção da proteína GTFJ18T1 (SEQ ID NO: 27) adicionando IPTG ao caldo, obtendo uma concentração residual de 0,5 mM. A indução durou 7 horas em um experimento e 16 horas no outro. Durante este tempo nós continuamos a alimentação de glicose, mantendo uma concentração residual muito baixa (< 0,1 g/L).
[0287] No final das duas fermentações (24 e 33 horas, respectivamente) o pélete celular foi recuperado a partir de aproximadamente 9 kg de caldo de fermentação em uma centrífuga RC-12 com o uso de garrafas de 2 litros. Um conjunto de dois sacos plásticos foi colocado dentro das garrafas para facilitar a recuperação da pasta celular. A centrifugação foi feita a 6728 RCF por 20 minutos. Depois que o líquido foi decantado dos sacos, o pélete celular foi congelado a -80°C; um total de 1943 gramas de pasta congelada foi recuperado. A pasta congelada foi subsequentemente adicionada a 3,2 litros de tampão (fosfato de potássio 50 mM, pH 6,0), e depois da pasta ter sido descongelada, a suspensão celular resultante foi homogeneizada com o uso de um homogeneizador APV-100 operado a uma pressão de aproximadamente 850 bar. O homogenato foi resfriado em gelo e, em seguida, decantado em seis garrafas de centrífuga de 1 litro. As garrafas foram centrifugadas por mais de uma hora em uma centrífuga RC-3 a 5890 RCF. O sobrenadante foi decantado em garrafas e armazenado congelado a -80°C; as alíquotas dos dois sobrenadantes de lisados de execução de fermentação foram analisados quanto à presença da enzima alvo, GTFJ18T1 (SEQ ID NO: 27), medindo a taxa de conversão de sacarose para frutose. Os ensaios bioquímicos mediram 5,8 U/mL e 9,90 U/mL de enzima ativa para as duas fermentações, respectivamente. Uma segunda centrifugação dos 5,8 U/mL de sobrenadante a 12.000 rpm com o uso de um rotor SS34 produziu um sobrenadante clarificado com 5,0 U/mL de atividade de GTFJ18T1 (armazenado congelado a -80°C).
[0288] GTFJ18T1 (SEQ ID NO: 27) produzida neste exemplo foi usada em um ou mais dos seguintes Exemplos. EXEMPLO 8 SEQUÊNCIAS DE GLICOSILTRANSFERASE DE FRUCTOBACILLUS TROPAEOLI F214-1, FTRGTFI (GTF9905)
[0289] Um gene de glicosiltransferase, FtrGtfI, foi identificado a partir de Fructobacillus tropaeoli F214-1. A sequência de ácido nucleico para o gene FtrGtfl (n° de acesso no GENBANK DF968096.1, SEQ ID NO: 17), e a sequência de aminoácidos da proteína hipotética codificada pelo gene1 FtrGtf (n° de acesso GAP05007.1, gi 902949905, SEQ ID NO: 4, “GTF9905” no presente pedido) foram encontradas no banco de dados do NCBI. Uma porção de SEQ ID NO: 4 alinhada com a SEQ ID NO: 28 na análise divulgada acima no Exemplo 1, identificando assim GTF9905 como uma enzima de ramificação alfa- 1,2 putativa. Acredita-se que a forma secretada madura de GTF9905 corresponda às posições 36-1672 de SEQ ID NO: 4. EXEMPLO 9 SEQUÊNCIAS PARA EXPRESSAR GTF9905 MADURA (FTRGTFI)
[0290] Uma sequência de nucleotídeos que codifica a versão madura de GTF9905 (Gtf1 de Fructobacillus tropaeoli F214-1) foi códon- otimizada para expressão em Bacillus subtilis, resultando em SEQ ID NO: 34. Esta sequência foi sintetizada por Generay (Xangai, China), e inserida no plasmídeo p2JM103BBI (Vogtentanz, Protein Expr. Purif. 55:40-52, 2007), resultando no plasmídeo pZQ2-CRC08152-FtrGtf1. pZQ2- CRC08152-FtrGtf1 contém (na direção 5’ para 3') um promotor aprE, uma sequência que codifica uma sequência sinal aprE usada para direcionar a secreção de proteína em Bacillus subtilis, um oligonucleotídeo que codifica Ala-Gly-Lys para facilitar a secreção da proteína alvo, e a sequência sintética (SEQ ID NO: 34) que codifica a forma madura de GTF9905 (isto é, posições 36-1672 de SEQ ID NO: 4)
[0291] O plasmídeo pZQ2-CRC08152-FtrGtf1 foi usado para transformar células de B. subtilis, e as células transformadas foram espalhadas em Luria em placas de Ágar suplementado com 5 ppm de cloranfenicol. Uma colônia com a inserção correta, como confirmado por PCR e sequenciamento, foi selecionada e submetida à fermentação para produção de GTF9905. EXEMPLO 10 PRODUÇÃO DE GTF9905 (FTRGTFI)
[0292] A colônia transformante de B. subtilis com a inserção correta foi selecionada em 5 mL de meio de caldo Luria suplementado com 5 ppm de cloranfenicol e cultivada durante a noite. 30 μL desta cultura foi então inoculada em um frasco de 250 mL contendo 30 mL de meio de Grant II suplementado com 5 ppm de cloranfenicol, que foi, em seguida, incubado a 30°C com agitação de 250 rpm por 48 horas. O sobrenadante de cultura resultante foi coletado por centrifugação a 24.000 x g por 1 h a 4°C e filtrado com filtro de 0,22 μm.
[0293] O sobrenadante, que continha GTF9905, foi primeiro dialisado com tampão K2HPO4 50 mM pH 6,8 em tubos de diálise (produto Thermo n° 68100), depois disso o sobrenadante dialisado foi liofilizado com o uso do sistema de liofilização FREEZONE 6 (Labconco) e armazenado a -80°C (22,5 U/mL).
[0294] GTF9905 produzida neste Exemplo foi usada em um ou mais dos seguintes Exemplos. EXEMPLO 11 ENSAIO DE ATIVIDADE DA ENZIMA GTF8117 E GTF6831
[0295] Ensaios de atividade de glicosiltransferase para GTF8117 e GTF6831 foram realizados incubando cada enzima GTF com 200 g/L de sacarose em tampão acetato 25 mM pH 5,5 na presença de 25 g/L de dextrano (MW aproximadamente1500, Sigma-Aldrich, Cat. n° 31394) a 37°C e 125 rpm de agitação orbital. Uma alíquota da mistura de reação foi retirada em 1 h, 2h e 3h de períodos de incubação e aquecida a 90°C por 5 min para inativar a GTF. O material insolúvel foi removido por centrifugação a 13.000 x g durante 5 minutos, seguido por filtração através de membrana de nylon de 0,22 μm. O filtrado resultante foi analisado por HPLC com séries de colunas ANIMEX HPX-87C a 85°C (Bio-Rad, Hercules, CA) para quantificar a concentração de sacarose. A concentração de sacarose em cada ponto no tempo foi representada em função do tempo de reação e a taxa de reação inicial foi determinada a partir da inclinação do gráfico linear. Uma unidade de atividade de GTF foi definida como a quantidade de enzima necessária para consumir um micromol de sacarose em um minuto sob as condições de ensaio. EXEMPLO 12 ENSAIO DE ATIVIDADE DE RAMIFICAÇÃO 1,2 DA ENZIMA GTF9905 E GTFJ18T1
[0296] Ensaios de atividade de glicosiltransferase para enzimas de ramificação GTF9905 e GTFJ18T1 foram realizados incubando cada enzima com 100 g/L de sacarose em tampão acetato 50 mM em pH 5,5 na presença de dextrano 40K (Sigma-Aldrich Cat n° D1662-100G) a 30°C e 125 rpm de agitação orbital. Uma alíquota da mistura de reação foi retirada em 1h, 2h e 3h de períodos de incubação e aquecida a 90°C por 5 min para inativar a enzima. O material insolúvel foi removido por centrifugação a 13.000 x g durante 5 minutos, seguido por filtração através de membrana de nylon de 0,2 μm. O filtrado resultante foi analisado por HPLC com séries de colunas ANIMEX HPX-87C a 85°C (Bio-Rad, Hercules, CA) para quantificar a concentração de sacarose. A concentração de sacarose em cada ponto no tempo foi representada em função do tempo de reação e a taxa de reação inicial foi determinada a partir da inclinação do gráfico linear. Uma unidade de atividade da enzima de ramificação 1,2 de GTF foi definida como a quantidade de enzima necessária para consumir um micromol de sacarose em um minuto sob as condições de ensaio. EXEMPLO 13 PRODUÇÃO DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2 SOLÚVEIS POR COMBINAÇÃO GRADUAL DE GLICOSILTRANSFERASE GTF8117 E ENZIMA DE RAMIFICAÇÃO ALFA-1 ,2 GTF9905
[0297] Primeiro, uma reação foi realizada para preparar glucano que foi usado na segunda parte deste Exemplo como um substrato para enzima de ramificação 1,2. Uma mistura de reação (20 mL) composta de sacarose (488 g/L) e GTF8117 (Exemplo 4, 9,4 U/mL) foi ajustada para pH 5,5 com ácido clorídrico 6,0 N e agitada a 47°C. Alíquotas foram retiradas em tempos predeterminados e suprimidas por aquecimento a 90°C por 20 min. As alíquotas tratadas por calor resultantes foram centrifugadas e os sobrenadantes analisados por HPLC para determinar a concentração de sacarose, glicose, frutose, leucrose, oligossacarídeos e polissacarídeos. Após 6 h, a mistura de reação foi aquecida a 90°C por 30 minutos, e uma alíquota da mistura de reação tratada por calor foi centrifugada e o sobrenadante resultante analisado quanto aos monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos solúveis (DP8+) (Tabela 1). Os polissacarídeos DP8+ pareciam conter cerca de 100% de ligações alfa-1,6. TABELA 1 ANÁLISE HPLC DE MONOSSACARÍDEOS, OLIGOSSACARÍDEOS E POLISSACARÍDEOS SOLÚVEIS PRODUZIDOS POR GLICOSILTRANSFERASE GTF8117
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[0298] Uma segunda reação foi então realizada para conduzir ramificação alfa-1,2 a partir dos produtos da primeira reação. A segunda reação de mistura foi preparada misturando 5,84 mL da primeira mistura de reação tratada por calor preparada acima com 2,92 mL de solução de sacarose (600 g/L de sacarose em água desionizada; concentração final de sacarose, 175 g/L), 0,67 mL de tampão acetato de sódio 0,75 M (pH 5,5, concentração final 50 mM), 0,070 mL de água desionizada e 0,50 mL de um lisado celular centrifugado contendo enzima de ramificação alfa-1,2 GTF9905 (Exemplo 10; concentração final de GTF9905, 1,13 U/mL), seguido por agitação a 30°C. Alíquotas foram retiradas em tempos predeterminados e suprimidas por aquecimento a 90°C por 20 min. As alíquotas tratadas por calor resultantes foram centrifugadas e os sobrenadantes analisados por HPLC para determinar a concentração de sacarose, glicose, frutose, leucrose, oligossacarídeos e polissacarídeos. Depois de 76,2 h, a mistura de reação foi aquecida a 90°C por 20 minutos, e uma alíquota da mistura de reação tratada por calor foi centrifugada. O sobrenadante resultante foi analisado quanto aos monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos solúveis (Tabela 2), e analisado por espectroscopia NMR 1H para determinar as ligações anoméricas dos oligossacarídeos e polissacarídeos (Tabela 3). TABELA 2 ANÁLISE HPLC DE MONOSSACARÍDEOS, OLIGOSSACARÍDEOS E POLISSACARÍDEOS SOLÚVEIS PRODUZIDOS POR UMA REAÇÃO DE RAMIFICAÇÃO ALFA-1,2
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TABELA 3 ANÁLISE DE LIGAÇÃO ANOMÉRICA DE OLIGOSSACARÍDEOS E POLISSACARÍDEOS SOLÚVEIS POR ESPECTROSCOPIA NMR 1H
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[0299] Desta forma, a GTF9905 tem uma atividade significativa de ramificação alfa-1,2 e pode ser usada para modificar a estrutura de um substrato de glucano. EXEMPLO 14 PRODUÇÃO DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2 SOLÚVEIS POR COMBINAÇÃO GRADUAL DE GLICOSILTRANSFERASE GTF6831 E ENZIMA DE RAMIFICAÇÃO ALFA-1 ,2 GTF9905
[0300] Primeiro, uma reação foi realizada para preparar glucano que foi usado na segunda parte deste Exemplo como um substrato para enzima de ramificação 1,2. Uma mistura de reação (20 mL) composta de sacarose (488 g/L) e GTF6831 (Exemplo 5, 4,6 U/mL) foi ajustada para pH 5,5 com ácido clorídrico 6,0 N e agitada a 47°C. Alíquotas foram retiradas em tempos predeterminados e suprimidas por aquecimento a 90°C por 20 min. As alíquotas tratadas por calor resultantes foram centrifugadas e os sobrenadantes analisados por HPLC para determinar a concentração de sacarose, glicose, frutose, leucrose, oligossacarídeos e polissacarídeos. Após 24,5 h, a mistura de reação foi aquecida a 90°C por 30 minutos, e uma alíquota da mistura de reação tratada por calor foi centrifugada e o sobrenadante resultante analisado quanto aos monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos solúveis (DP8+) (Tabela 4). TABELA 4 ANÁLISE HPLC DE MONOSSACARÍDEOS, OLIGOSSACARÍDEOS E POLISSACARÍDEOS SOLÚVEIS PRODUZIDOS POR GLICOSILTRANSFERASE GTF6831
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[0301] Uma segunda reação foi então realizada para conduzir ramificação alfa-1,2 a partir dos produtos da primeira reação. A segunda reação de mistura foi preparada misturando 5,84 mL da primeira mistura de reação tratada por calor preparada acima com 2,92 mL de solução de sacarose (600 g/L de sacarose em água desionizada; concentração final de sacarose, 175 g/L), 0,67 mL de tampão acetato de sódio 0,75 M (pH 5,5, concentração final 50 mM), 0,070 mL de água desionizada e 0,50 mL de um lisado celular centrifugado contendo enzima de ramificação alfa-1,2 GTF9905 (Exemplo 10, concentração final de GTF9905, 1,13 U/mL), seguido por agitação a 30°C. Alíquotas foram retiradas em tempos predeterminados e suprimidas por aquecimento a 90°C por 20 min. As alíquotas tratadas por calor resultantes foram centrifugadas e os sobrenadantes analisados por HPLC para determinar a concentração de sacarose, glicose, frutose, leucrose, oligossacarídeos e polissacarídeos. Depois de 76,2 h, a mistura de reação foi aquecida a 90°C por 20 minutos, e uma alíquota da mistura de reação tratada por calor foi centrifugada. O sobrenadante resultante foi analisado quanto aos monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos solúveis (Tabela 5), e analisado por espectroscopia NMR 1H para determinar as ligações anoméricas dos oligossacarídeos e polissacarídeos (Tabela 6). TABELA 5 ANÁLISE HPLC DE MONOSSACARÍDEOS, OLIGOSSACARÍDEOS E POLISSACARÍDEOS SOLÚVEIS PRODUZIDOS POR UMA REAÇÃO DE RAMIFICAÇÃO ALFA-1,2
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TABELA 6 ANÁLISE DE LIGAÇÃO ANOMÉRICA DE OLIGOSSACARÍDEOS E POLISSACARÍDEOS SOLÚVEIS POR ESPECTROSCOPIA NMR 1H
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[0302] Desta forma, foi ainda mostrado que GTF9905 tem uma atividade significativa de ramificação alfa-1,2 e pode ser usado para modificar a estrutura de um substrato de glucano. EXEMPLO 15 PRODUÇÃO DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2 SOLÚVEIS POR COMBINAÇÃO GRADUAL DE GLICOSILTRANSFERASE GTF6831 E ENZIMA DE RAMIFICAÇÃO ALFA-1 ,2 GTFJ18T1
[0303] Primeiro, uma reação foi realizada para preparar glucano que foi usado na segunda parte deste Exemplo como um substrato para enzima de ramificação 1,2. Uma mistura de reação (20 mL) composta de sacarose (488 g/L) e GTF6831 (Exemplo 5, 4,6 U/mL) foi ajustada para pH 5,5 com ácido clorídrico 6,0 N e agitada a 47°C. Alíquotas foram retiradas em tempos predeterminados e suprimidas por aquecimento a 90°C por 20 min. As alíquotas tratadas por calor resultantes foram centrifugadas e os sobrenadantes analisados por HPLC para determinar a concentração de sacarose, glicose, frutose, leucrose, oligossacarídeos e polissacarídeos. Após 22,5 h, a mistura de reação foi aquecida a 90°C por 30 minutos, e uma alíquota da mistura de reação tratada por calor foi centrifugada e o sobrenadante resultante analisado quanto aos monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos solúveis (DP8+) (Tabela 7). TABELA 7 ANÁLISE HPLC DE MONOSSACARÍDEOS, OLIGOSSACARÍDEOS E POLISSACARÍDEOS SOLÚVEIS PRODUZIDOS POR GLICOSILTRANSFERASE GTF6831
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[0304] Uma segunda reação foi então realizada para conduzir ramificação alfa-1,2 a partir dos produtos da primeira reação. A segunda reação de mistura foi preparada misturando 5,84 mL da primeira mistura de reação tratada por calor preparada acima com 2,09 mL de solução de sacarose (600 g/L de sacarose em água desionizada; concentração final de sacarose, 125 g/L), 0,67 mL de tampão acetato de sódio 0,75 M (pH 5,5, concentração final 50 mM), e 1,40 mL de um lisado celular centrifugado contendo enzima de ramificação alfa-1,2 GTFJ18T1 (Exemplo 7, concentração final de GTFJ18T1, 0,70 U/mL), seguido por agitação a 30°C. Alíquotas foram retiradas em tempos predeterminados e suprimidas por aquecimento a 90°C por 20 min. As alíquotas tratadas por calor resultantes foram centrifugadas e os sobrenadantes analisados por HPLC para determinar a concentração de sacarose, glicose, frutose, leucrose, oligossacarídeos e polissacarídeos. Depois de 51,5 h, a mistura de reação foi aquecida a 90°C por 30 minutos, e uma alíquota da mistura de reação tratada por calor foi centrifugada. O sobrenadante resultante foi analisado quanto aos monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos solúveis (Tabela 8), e analisado por espectroscopia NMR 1H para determinar as ligações anoméricas dos oligossacarídeos e polissacarídeos (Tabela 9). TABELA 8 ANÁLISE HPLC DE MONOSSACARÍDEOS, OLIGOSSACARÍDEOS E POLISSACARÍDEOS SOLÚVEIS PRODUZIDOS POR UMA REAÇÃO DE RAMIFICAÇÃO ALFA-1,2
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TABELA 9 ANÁLISE DE LIGAÇÃO ANOMÉRICA DE OLIGOSSACARÍDEOS E POLISSACARÍDEOS SOLÚVEIS POR ESPECTROSCOPIA NMR 1H
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[0305] Desta forma, foi ainda mostrado que GTFJ18T1 tem uma atividade significativa de ramificação alfa-1,2 e pode ser usado para modificar a estrutura de um substrato de glucano. EXEMPLO 16 PRODUÇÃO DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2 SOLÚVEIS POR COMBINAÇÃO SIMULTÂNEA DE GLICOSILTRANSFERASE GTF8117 E ENZIMA DE RAMIFICAÇÃO ALFA-1 ,2 GTF9905 (1)
[0306] Uma mistura de reação compreendendo sacarose (450 g/L), GTF8117 (Exemplo 4, 0,944 U/mL), e enzima de ramificação alfa-1,2 GTF9905 (Exemplo 10, 1,06 U/mL) em tampão acetato 54 mM, pH 5,5 foi agitada a 30°C. Alíquotas foram retiradas em tempos predeterminados e suprimidas por aquecimento a 90°C por 20 min. As alíquotas tratadas por calor foram centrifugadas e os sobrenadantes foram analisados por HPLC para determinar a concentração de sacarose, glicose, frutose, leucrose, oligossacarídeos e polissacarídeos. Após 74 h, a mistura de reação foi aquecida a 90°C por 20 minutos e centrifugada. O sobrenadante resultante foi analisado quanto aos monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos solúveis (DP8+) (Tabela 10), e analisado por espectroscopia NMR 1H para determinar as ligações anoméricas dos oligossacarídeos e polissacarídeos (Tabela 11). TABELA 10 ANÁLISE HPLC DE MONOSSACARÍDEOS, OLIGOSSACARÍDEOS E POLISSACARÍDEOS SOLÚVEIS PRODUZIDOS POR SÍNTESE DE GLUCANO SIMULTÂNEA E REAÇÕES DE
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TABELA 11 ANÁLISE DE LIGAÇÃO ANOMÉRICA DE OLIGOSSACARÍDEOS E POLISSACARÍDEOS SOLÚVEIS POR ESPECTROSCOPIA NMR 1H
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[0307] Desta forma, foi ainda mostrado que GTF9905 tem uma atividade significativa de ramificação alfa-1,2 e pode ser usado para modificar a estrutura de um substrato de glucano. EXEMPLO 17 PRODUÇÃO DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2 SOLÚVEIS POR COMBINAÇÃO SIMULTÂNEA DE GLICOSILTRANSFERASE GTF8117 E ENZIMA DE RAMIFICAÇÃO ALFA-1 ,2 GTF9905 (2)
[0308] Uma mistura de reação composta de sacarose (500 g/L), GTF8117 (Exemplo 4, 2,83 U/mL), e enzima de ramificação alfa-1,2 GTF9905 (Exemplo 10, 3,17 U/mL) em tampão acetato 54 mM, pH 5,5 foi agitada a 30°C. Alíquotas foram retiradas em tempos predeterminados e suprimidas por aquecimento a 90°C por 20 min. As alíquotas tratadas por calor foram centrifugadas e os sobrenadantes foram analisados por HPLC para determinar a concentração de sacarose, glicose, frutose, leucrose, oligossacarídeos e polissacarídeos. Após 28,5 h, a mistura de reação foi aquecida a 90°C por 20 minutos e centrifugada. O sobrenadante resultante foi analisado quanto aos monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos solúveis (DP8+) (Tabela 12), e analisado por espectroscopia NMR 1H para determinar as ligações anoméricas dos oligossacarídeos e polissacarídeos (Tabela 13). TABELA 12 ANÁLISE HPLC DE MONOSSACARÍDEOS, OLIGOSSACARÍDEOS E POLISSACARÍDEOS SOLÚVEIS PRODUZIDOS POR SÍNTESE DE GLUCANO SIMULTÂNEA E REAÇÕES DE RAMIFICAÇÃO ALFA-1 ,2
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TABELA 13 ANÁLISE DE LIGAÇÃO ANOMÉRICA DE POLISSACARÍDEOS SOLÚVEIS POR ESPECTROSCOPIA DE NMR 1H
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[0309] Desta forma, foi ainda mostrado que GTF9905 tem uma atividade significativa de ramificação alfa-1,2 e pode ser usado para modificar a estrutura de um substrato de glucano. EXEMPLO 18 PRODUÇÃO DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2 SOLÚVEIS POR COMBINAÇÃO SIMULTÂNEA DE GLICOSILTRANSFERASE GTF8117 E ENZIMA DE RAMIFICAÇÃO ALFA-1,2 GTFJ18T1 (1)
[0310] Uma mistura de reação composta de sacarose (450 g/L), GTF8117 (Exemplo 4, 0,944 U/mL), e enzima de ramificação alfa-1,2 GTFJ18T1 (Exemplo 7, 1,06 U/mL) em tampão acetato 54 mM, pH 5,5 foi agitada a 30°C. Alíquotas foram retiradas em tempos predeterminados e suprimidas por aquecimento a 90°C por 20 min. As alíquotas tratadas por calor foram centrifugadas e os sobrenadantes foram analisados por HPLC para determinar a concentração de sacarose, glicose, frutose, leucrose, oligossacarídeos e polissacarídeos. Após 71 h, a mistura de reação foi aquecida a 90°C por 20 minutos e centrifugada. O sobrenadante resultante foi analisado quanto aos monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos solúveis (DP8+) (Tabela 14), e analisado por espectroscopia NMR 1H para determinar as ligações anoméricas dos oligossacarídeos e polissacarídeos (Tabela 15). TABELA 14 ANÁLISE HPLC DE MONOSSACARÍDEOS, OLIGOSSACARÍDEOS E POLISSACARÍDEOS SOLÚVEIS PRODUZIDOS POR SÍNTESE DE GLUCANO SIMULTÂNEA E REAÇÕES DE
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TABELA 15 ANÁLISE DE LIGAÇÃO ANOMÉRICA DE OLIGOSSACARÍDEO E POLISSACARÍDEO SOLÚVEL POR ESPECTROSCOPIA NMR 1H
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[0311] Desta forma, foi ainda mostrado que GTFJ18T1 tem uma atividade significativa de ramificação alfa-1,2 e pode ser usado para modificar a estrutura de um substrato de glucano. EXEMPLO 19 PRODUÇÃO DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2 SOLÚVEIS POR COMBINAÇÃO SIMULTÂNEA DE GLICOSILTRANSFERASE GTF8117 E ENZIMA DE RAMIFICAÇÃO ALFA-1,2 GTFJ18T1 (2)
[0312] Uma mistura de reação composta de sacarose (450 g/L), GTF8117 (Exemplo 4, 0,472 U/mL), e enzima de ramificação alfa-1,2 GTFJ18T1 (Exemplo 7, 1,06 U/mL) em tampão acetato 54 mM, pH 5,5 foi agitada a 30°C. Alíquotas foram retiradas em tempos predeterminados e suprimidas por aquecimento a 90°C por 20 min. As alíquotas tratadas por calor foram centrifugadas e os sobrenadantes foram analisados por HPLC para determinar a concentração de sacarose, glicose, frutose, leucrose, oligossacarídeos e polissacarídeos. Após 131 h, a mistura de reação foi aquecida a 90°C por 20 minutos e centrifugada. O sobrenadante resultante foi analisado quanto aos monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos solúveis (DP8+) (Tabela 16), e analisado por espectroscopia NMR 1H para determinar as ligações anoméricas dos oligossacarídeos e polissacarídeos (Tabela 17). TABELA 16 ANÁLISE HPLC DE MONOSSACARÍDEOS, OLIGOSSACARÍDEOS E POLISSACARÍDEOS SOLÚVEIS PRODUZIDOS POR SÍNTESE DE GLUCANO SIMULTÂNEA E REAÇÕES DE
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131 0,0 0,0 0,0 0,0 2,5 11,2 0,4 107 20,5 182 TABELA 17 ANÁLISE DE LIGAÇÃO ANOMÉRICA DE OLIGOSSACARÍDEO E POLISSACARÍDEO SOLÚVEL POR ESPECTROSCOPIA NMR 1H
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[0313] Desta forma, foi ainda mostrado que GTFJ18T1 tem uma atividade significativa de ramificação alfa-1,2 e pode ser usado para modificar a estrutura de um substrato de glucano. EXEMPLO 20 ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2
[0314] Quatro reações de 500 mL (1-4) contendo 200 g/L de sacarose e 9,44 U/mL de GTF8117 (Exemplo 4) foram ajustadas em pH 5,5 e misturadas a 47°C em um agitador rotativo por 18 h. Alíquotas de cada mistura de produto foram removidas em tempos predeterminados, aquecida a 90°C por 20 min, resfriadas até ca. 25°C e, em seguida, centrifugadas; os sobrenadantes resultantes foram analisados por HPLC para determinar a concentração de sacarose, glicose, frutose e leucrose presente durante a conversão de sacarose para um polissacarídeo dextrano alfa-1,6-linear (Tabela 18). Após 18 h, as quatro misturas de reação foram aquecidas a 90°C por 20 min, resfriada até ca. 25°C e, em seguida, centrifugadas, os sobrenadantes resultantes foram combinados e armazenados a 5°C antes do uso em uma reação subsequente (abaixo) que adicionou a ramificação alfa-1,2 glicosil ao produto de reação polissacarídeo dextrano alfa-1,6-ligado. TABELA 18 ANÁLISE DE HPLC DE MONOSSACARÍDEOS E DISSACARÍDEOS SOLÚVEIS PRODUZIDOS POR CONVERSÃO DE SACAROSE EM POLISSACARÍDEO COM O USO DE GTF8117
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[0315] Duas caldeiras de resina encamisadas de 250 mL foram uma carregada com 100 mL do sobrenadante do produto de reação GTF8117 da acima (concentração final: 80 g/L de sólidos dissolvidos totais derivados de sacarose), 33,3 mL de uma solução estoque de sacarose 600 g/L (concentração final de 80 g/L de sacarose) e 91,7 mL de água destilada. As misturas foram aquecidas in situ a 80°C por 30 minutos, então resfriadas a 30°C, após o qual foram adicionados 25 mL de solução de enzima GTFJ18T1 (Exemplo 7, 0,5 U/mL de concentração final de GTFJ18T1) e o pH ajustado imediatamente para 5,5 com hidróxido de sódio 0,5% (estas duas reações são citadas abaixo como Reações 1 e 2). O pH da reação foi continuamente controlado a 5,5 com o uso de um eletrodo de pH conectado a uma bomba peristáltica que injetou hidróxido de sódio 0,5% na mistura de reação conforme necessário. Alíquotas foram retiradas em tempos predeterminados e suprimidas por aquecimento a 90°C por 20 min. As alíquotas tratadas por calor resultantes foram centrifugadas e os sobrenadantes analisados por HPLC para determinar a concentração de sacarose, glicose, frutose, leucrose, oligossacarídeos e polissacarídeos. Após 44 h, cada mistura de reação (Reações 1 e 2) foi aquecida a 90°C por 20 minutos e centrifugada. Os sobrenadantes resultantes foram analisados por HPLC quanto aos monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos solúveis (Tabela 19); por espectroscopia NMR 1H para determinar as ligações anoméricas dos oligossacarídeos e polissacarídeos (Tabela 20); e por cromatografia de exclusão por tamanho para peso molecular (Tabela 21). TABELA 19 ANÁLISE HPLC DE MONOSSACARÍDEOS E DISSACARÍDEOS SOLÚVEIS PRODUZIDOS EM REAÇÕES 1 E 2
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TABELA 20 ANÁLISE DE LIGAÇÃO ANOMÉRICA DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2 SOLÚVEIS PRODUZIDOS NAS REAÇÕES 1 E 1
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TABELA 21 ANÁLISE DE PESO MOLECULAR DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2 PRODUZIDOS NAS REAÇÕES 1 E 2
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[0316] Desta forma, foi ainda mostrado que GTFJ18T1 tem uma atividade significativa de ramificação alfa-1,2 e pode ser usado para modificar a estrutura de um substrato de glucano.
[0317] Os sobrenadantes das Reações 1 e 2 foram combinados, e os polissacarídeos ramificados alfa-1,2 nesses foram purificados e isolados por ultrafiltração (UF) com o uso de uma membrana de polietersulfona (PES) de corte de peso molecular de 5 kDa (MWCO) (Pall Centramate ™ LV). A análise HPLC do retentado UF não indicou nenhum monossacarídeo, dissacarídeo detectável ou oligossacarídeo DP2-DP8. O retentado foi ajustado para ca. 5%, em peso, de sólidos dissolvidos e a solução resultante liofilizada para produzir os polissacarídeos ramificados alfa-1,2-solúveis como um sólido seco. O produto polissacárido sólido foi analisado por espectroscopia NMR 1H (Tabela 22) e por GC/MS para determinar as ligações anoméricas dos polissacarídeos (Tabela 23). TABELA 22 ANÁLISE DE LIGAÇÃO ANOMÉRICA (1H NMR) DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2 SOLÚVEIS PRODUZIDOS NAS REAÇÕES 1 E 1 (COMBINADAS)
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TABELA 23 ANÁLISE DE LIGAÇÃO ANOMÉRICA (GC/MS) DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2 SOLÚVEIS PRODUZIDOS COM O USO DE GTFJJ18T1 NAS REAÇÕES 1 E 2
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EXEMPLO 21 ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2
[0318] Duas caldeiras de resina encamisadas de 250 mL foram cada uma carregada com 100 mL do sobrenadante do produto de reação GTF8117 produzido na primeira parte do Exemplo 20 acima (concentração final: 80 g/L de sólidos dissolvidos totais derivados de sacarose), 33,3 mL de uma solução estoque de sacarose 600 g/L (concentração final de 80 g/L de sacarose) e 91,7 mL de água destilada. As misturas foram aquecidas in situ a 80°C por 30 minutos, então resfriadas a 30°C, após o qual foram adicionados 25 mL de solução de enzima GTFJ18T1 (Exemplo 7, 0,5 U/mL de concentração final de GTFJ18T1) e o pH ajustado imediatamente para 5,5 com hidróxido de sódio 0,5% (estas duas reações são citadas abaixo como Reações 3 e 4). O pH da reação foi continuamente controlado a 5,5 com o uso de um eletrodo de pH conectado a uma bomba peristáltica que injetou hidróxido de sódio 0,5% na mistura de reação conforme necessário. Alíquotas foram retiradas em tempos predeterminados e suprimidas por aquecimento a 90°C por 20 min. As alíquotas tratadas por calor resultantes foram centrifugadas e os sobrenadantes analisados por HPLC para determinar a concentração de sacarose, glicose, frutose, leucrose, oligossacarídeos e polissacarídeos. Após 4 h, cada mistura de reação (Reações 3 e 4) foi aquecida a 90°C por 20 minutos e centrifugada. Os sobrenadantes resultantes foram analisados por HPLC quanto aos monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos solúveis (Tabela 24), por espectroscopia NMR 1H para determinar as ligações anoméricas dos oligossacarídeos e polissacarídeos (Tabela 25), e por cromatografia de exclusão por tamanho para peso molecular (Tabela 26). TABELA 24 ANÁLISE HPLC DE MONOSSACARÍDEOS E DISSACARÍDEOS SOLÚVEIS PRODUZIDOS EM REAÇÕES 3 E 4
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TABELA 25 ANÁLISE DE LIGAÇÃO ANOMÉRICA DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2 SOLÚVEIS PRODUZIDOS NAS REAÇÕES 3 E 4
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TABELA 26 ANÁLISE DE PESO MOLECULAR DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2 PRODUZIDOS NAS REAÇÕES 3 E 4
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[0319] Desta forma, foi ainda mostrado que GTFJ18T1 tem uma atividade significativa de ramificação alfa-1,2 e pode ser usado para modificar a estrutura de um substrato de glucano.
[0320] Os sobrenadantes das Reações 3 e 4 foram combinados, e os polissacarídeos ramificados alfa-1,2 nesses foram purificados e isolados por ultrafiltração (UF) com o uso de uma membrana de polietersulfona (PES) de corte de peso molecular de 5 kDa (MWCO) (Pall Centramate ™ LV). A análise HPLC do retentado UF não indicou nenhum monossacarídeo, dissacarídeo detectável ou oligossacarídeo DP2-DP8. O retentado foi ajustado para ca. 5%, em peso, de sólidos dissolvidos e a solução resultante liofilizada para produzir os polissacarídeos ramificados alfa-1,2-solúveis como um sólido seco. O produto polissacárido sólido foi analisado por espectroscopia NMR 1H (Tabela 27) e por GC/MS para determinar as ligações anoméricas dos polissacarídeos (Tabela 28). TABELA 27 ANÁLISE DE LIGAÇÃO ANOMÉRICA (1H NMR) DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2 SOLÚVEIS PRODUZIDOS NAS REAÇÕES 3 E 4 (COMBINADAS)
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TABELA 28 ANÁLISE DE LIGAÇÃO ANOMÉRICA (GC/MS) DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2 SOLÚVEIS PRODUZIDOS COM O USO DE GTFJJ18T1 NAS REAÇÕES 3 E 4 (COMBINADAS
Figure img0030
EXEMPLO 22 ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2
[0321] Duas caldeiras de resina encamisadas de 250 mL foram cada uma carregada com 175 mL do sobrenadante do produto de reação GTF8117 produzido na primeira parte do Exemplo 20 acima (concentração final: 140 g/L de sólidos dissolvidos totais derivados de sacarose), 4,2 mL de uma solução estoque de sacarose 600 g/L (concentração final de 10 g/L de sacarose) e 45,8 mL de água destilada. As misturas foram aquecidas in situ a 80°C por 30 minutos, então resfriadas a 30°C, após o qual foram adicionados 25 mL de solução de enzima GTFJ18T1 (Exemplo 7, 0,5 U/mL de concentração final de GTFJ18T1) e o pH ajustado imediatamente para 5,5 com hidróxido de sódio 0,5% (estas duas reações são citadas abaixo como Reações 5 e 6). O pH da reação foi continuamente controlado a 5,5 com o uso de um eletrodo de pH conectado a uma bomba peristáltica que injetou hidróxido de sódio 0,5 % na mistura de reação conforme necessário. Alíquotas foram retiradas em tempos predeterminados e suprimidas por aquecimento a 90°C por 20 min. As alíquotas tratadas por calor resultantes foram centrifugadas e os sobrenadantes analisados por HPLC para determinar a concentração de sacarose, glicose, frutose, leucrose, oligossacarídeos e polissacarídeos. Após 20 h, cada mistura de reação (Reações 5 e 6) foi aquecida a 90°C por 20 minutos e centrifugada. Os sobrenadantes resultantes foram analisados por HPLC quanto aos monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos solúveis (Tabela 29), por espectroscopia NMR 1H para determinar as ligações anoméricas dos oligossacarídeos e polissacarídeos (Tabela 30), e por cromatografia de exclusão por tamanho para peso molecular (Tabela 31). TABELA 29 ANÁLISE HPLC DE MONOSSACARÍDEOS E DISSACARÍDEOS SOLÚVEIS PRODUZIDOS EM REAÇÕES 5 E 6
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TABELA 30 ANÁLISE DE LIGAÇÃO ANOMÉRICA DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2 SOLÚVEIS PRODUZIDOS NAS REAÇÕES 5 E 6
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TABELA 31 ANÁLISE DE PESO MOLECULAR DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2 PRODUZIDOS NAS REAÇÕES 5 E 6
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[0322] Desta forma, foi ainda mostrado que GTFJ18T1 tem uma atividade significativa de ramificação alfa-1,2 e pode ser usado para modificar a estrutura de um substrato de glucano.
[0323] Os sobrenadantes das Reações 5 e 6 foram combinados, e os polissacarídeos ramificados alfa-1,2 nesses foram purificados e isolados por ultrafiltração (UF) com o uso de uma membrana de polietersulfona (PES) de corte de peso molecular de 5 kDa (MWCO) (Pall Centramate ™ LV). A análise HPLC do retentado UF não indicou nenhum monossacarídeo, dissacarídeo detectável ou oligossacarídeo DP2-DP8. O retentado foi ajustado para ca. 5%, em peso, de sólidos dissolvidos e a solução resultante liofilizada para produzir os polissacarídeos ramificados alfa-1,2-solúveis como um sólido seco. O produto polissacárido sólido foi analisado por espectroscopia NMR 1H (Tabela 32) e por GC/MS para determinar as ligações anoméricas dos polissacarídeos (Tabela 33). TABELA 32 ANÁLISE DE LIGAÇÃO ANOMÉRICA DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2 SOLÚVEIS PRODUZIDOS NAS REAÇÕES 5 E 6
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TABELA 33 ANÁLISE DE LIGAÇÃO ANOMÉRICA DE POLISSACARÍDEOS RAMIFICADOS ALFA-1,2 SOLÚVEIS PRODUZIDOS NAS REAÇÕES 5 E 6
Figure img0035
EXEMPLO 23 RESPOSTA GLICÊMICA EM CAMUNDONGOS
[0324] O objetivo do estudo foi avaliar de triagem foi avaliar a digestibilidade da amostra 105-1 (Exemplo 20), amostra 105-2 (Exemplo 21) e da amostra 105-3 (Exemplo 22) que foram, cada uma, produzidas com o uso de GTF8117 eGTFJ18T1, avaliando a resposta glicêmica de camundongos machos após uma dose única. Cada um dos sete grupos de camundongos C57BL/6 recebeu uma dose única de uma das três substâncias (amostra 105-1, 2, ou 3), substâncias de controle positivo ou negativo, ou um veículo de controle. O sangue foi obtido através da veia caudal a fim de medir os níveis de glicose com o uso de um glicosímetro. Múltiplas leituras foram obtidas no dia da exposição à substância de teste.
[0325] A rota de administração oral foi selecionada porque é a rota pretendida de exposição humana e a maneira mais eficiente para fornecer uma dose exata. Grupos de jovens adultos, 12 camundongos C57BL/6J foram dosados por gavagem oral com um dos seguintes tratamentos: uma substância de teste (amostra 105-1, amostra 105-2 ou amostra 105-3), uma substância de controle positivo (glicose (dados mostrados), ou um glucano alfa-ligado que não tem nenhuma ramificação alfa-1,2 (dados não mostrados), uma substância de controle negativo (Litesse® Ultra), ou um veículo de controle (água desionizada). O nível de dose foi de 2000 mg/kg para todos os tratamentos, exceto para a água de controle, que foi administrada no mesmo volume de dose (10 mL/kg) como os outros tratamentos (Tabela 34).
[0326] O experimento foi conduzido após habituar os animais ao procedimento de teste, incluindo gavagem diária com água e múltiplas leituras por glicosímetro de nível basal antes da dosagem. Três leituras por glicosímetro de nível basal foram realizadas dentro de aproximadamente 1 hora antes da dosagem (medições pré-dose 1-3), com aproximadamente 20 minutos entre cada uma das três leituras e entre a terceira leitura e dosagem. Leituras por glicosímetro pós-dose foram realizadas depois de aproximadamente 20, 40, 60 e 120 minutos. O glicosímetro ALPHA TRAK 2 foi usado para medir a glicose em pelo menos 0,3 microlitros de sangue obtido por picada na veia caudal com agulha estéril. A área sob a curva (AUC) foi calculado para 0 a 2 horas. A AUC foi calculada somando uma série de trapezoides, ao invés de um modelo de predição de uma curva suave. O valor basal final foi designado como “0 minutos pós-dose” para o propósito do cálculo.
[0327] Mediante as condições do estudo, a administração da amostra 105-1 ou amostra 105-2 em 2000 mg/kg por gavagem oral não resultou em qualquer aumento na glicose no sangue; a resposta glicêmica foi similar àquela da fibra alimentar Litesse® Ultra ou água desionizada (Tabela 35). A administração da amostra 105-3 em 2000 mg/kg por gavagem oral resultou em uma resposta glicêmica com um início mais lento e menor magnitude de pico do que a induzida por glicose livre (controle positivo) (o glucano alfa-1,3-ligado sem nenhuma ramificação alfa-1,2 induziu uma resposta glicêmica muito similar àquela induzida por glicose (dados não mostrados)). Uma resposta glicêmica (isto é, um aumento estatisticamente significativo nos níveis de glicose no sangue) foi considerada como sendo um indicador potencial da digestibilidade destas substâncias de teste em uma dose máxima de 2000 mg/kg. TABELA 34 DESENHO DO ESTUDO
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a Peso da substância de teste/peso corporal animal em kg. TABELA 35 LEITURAS DO GLICOSÍMETRO * (MG/DL)
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* Os dados (cada leitura de medição) são apresentados como “média (SD)”. # Estatisticamente significativo em p < 0,05 por ANOVA unidirecional seguido por teste de Dunnett, em comparação com a água de controle. a O valor basal final foi designado como “0 minutos pós-dose” para o propósito do cálculo AUC.
[0328] Desta forma, a amostra 105-3 pode ser caracterizada como uma composição de glucano de liberação lenta no presente pedido, e amostras 105-1 e 105-2 podem ser caracterizadas como tendo qualidades de fibra alimentar. É digno de nota que a amostra 105-3 tem menos de 10% de ramificação alfa-1,2 (Exemplo 22), enquanto que as amostras 105-1 e 105-2, cada uma, têm mais que 15% de ramificação alfa-1,2 (Exemplos 20-21). EXEMPLO 24 PREPARAÇÃO DE UM IOGURTE/SMOOTHIE PARA BEBER
[0329] O exemplo a seguir descreve a preparação de um iogurte/smoothie para beber contendo o presente glucano alfa-1,2 ramificado.
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[0330] Etapa n° Procedimento: FORMAÇÃO DE SOLUÇÃO DE PECTINA 1 Aquecer 50% da água da fórmula a 160°F (aproximadamente 71,1 °C). 2 Dispersar a pectina com alto cisalhamento; misturar por 10 minutos. 3 Adicionar os sucos concentrados e o iogurte; misturar por 5 a 10 minutos até que o iogurte se disperse. PASTA FLUIDA DE PROTEÍNA 4 Nos 50% da água do lote a 140°F (60°C), adicionar SUPRO XT40 e misturar bem. 5 Aquecer a 170°F (aproximadamente 76,7°C) e manter por 15 minutos. 6 Adicionar a pasta fluida de pectina/suco/iogurte à solução de proteína; misturar por 5 minutos. 7 Adicionar a frutose, glucano, aromas e cores; misturar por 3 minutos. 8 Ajustar o pH com o uso de ácido fosfórico até a faixa desejada (faixa de pH de 4,0 a 4,1). 9 Processar a Temperatura Ultra Alta (UHT) a 224°F (aproximadamente 106,7°C) por 7 segundos com homogeneização UHT após aquecer a 2500/500 psig (17,24/3,45 MPa) com o uso de uma unidade indireta de vapor (IDS). 10 coletar o produto em garrafas e resfriar em banho de gelo. 11 Armazenar o produto em condições refrigeradas. EXEMPLO 25 PREPARAÇÃO DE UMA PREPARAÇÃO DE ÁGUA COMPREENDENDO GLUCANO ALFA- 1,2 RAMIFICADO
[0331] O exemplo a seguir descreve a preparação de uma composição de água melhorada.
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[0332] Etapa n° Procedimento: 1 Adicionar os ingredientes secos e misturar por 15 minutos. 2 Adicionar o restante dos ingredientes secos; misturar por 3 minutos. 3 Ajustar o pH para 3,0 +/- 0,05 com o uso de ácido cítrico conforme mostrado na formulação. 4 Processar a Temperatura Ultra Alta (UHT) a 224°F (aproximadamente 106,7°C) por 7 segundos com homogeneização a 2500/500 psig (17,24/3,45 MPa). 5 coletar o produto em garrafas e resfriar em banho de gelo. 6 Armazenar o produto em condições refrigeradas. EXEMPLO 26 PREPARAÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO DE IOGURTE CREMOSO
[0333] O exemplo a seguir descreve a preparação de um iogurte cremoso contendo glucano alfa-1,2 ramificado.
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[0334] Etapa n° Procedimento: 1 Adicionar os ingredientes secos à base de leite líquido; misturar por 5 min. 2 Pasteurizar a 195°F (aproximadamente 90,6°C) por 30 segundos, homogeneizar a 2500 psig (aproximadamente 17,24 MPa) e resfriar a 105 a 110°C (aproximadamente 40,6 a 43,3°C). 3 Inocular com a cultura; misturar suavemente e adicionar à batelada de água ou caixa quente a 108°F (aproximadamente 42,2°C) até obter pH 4,5 a 4,6. PROCEDIMENTO DE PREPARAÇÃO DE FRUTA 1 Adicionar água ao tanque de batelada; aquecer a 140°F (aproximadamente 60°C). 2 Pré-misturar carboidratos e estabilizadores. Adicionar ao tanque de batelada e misturar bem. 3 Adicionar ácido para reduzir o pH para a faixa desejada (pH alvo 3,5 a 4,0). 4 Adicionar sabor. 5 Resfriar e refrigerar. EXEMPLO 27 PREPARAÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO DE BARRA PARA LANCHE MODELO
[0335] O exemplo a seguir descreve a preparação de uma barra para lanche modelo contendo glucano alfa-1,2 ramificado conforme atualmente divulgado.
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[0336] Etapa n° Procedimento: 1 Combinar o xarope de milho com solução líquida de glucano. Aquecer o xarope no micro-ondas por 10 segundos. 2 Combinar o xarope com óleos e sabor líquido na tigela de mistura. Misturar por 1 minuto na velocidade 2. 3 Adicionar todos os ingredientes secos na tigela e misturar por 45 segundos na velocidade 1. 4 Raspar e misturar por mais 30 segundos ou até que a massa esteja misturada. 5 Derreter a cobertura de chocolate. 6 Cobrir completamente a barra com a cobertura de chocolate. EXEMPLO 28 PREPARAÇÃO DE UMA ÁGUA
[0337] O exemplo a seguir descreve a preparação de uma água contendo glucano alfa-1,2 ramificado conforme atualmente divulgado.
Figure img0043
[0338] Etapa n° Procedimento: 1. Cisalhar altamente a água, óleo e CITREM por 20 segundos. 2. Adicionar ingredientes secos lentamente, alto cisalhamento por 2 a 4 minutos. 3. Repousar a massa por 60 minutos. 4. Depositar a massa sobre o conjunto de placa quente a 200°C superior e inferior, assar por 1 minuto e 30 segundos. 5. Deixar resfriar o pack o mais rápido possível. EXEMPLO 29 PREPARAÇÃO DE UM BISCOITO COM PEDAÇOS DE CHOCOLATE MACIO
[0339] O exemplo a seguir descreve a preparação de um biscoito com pedaços de chocolate macio contendo glucano alfa-1,2 ramificado conforme atualmente divulgado.
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[0340] Etapa n° Procedimento: 1. Bater junto os ingredientes do Estágio 1 sob velocidade rápida por 1 minuto. 2. Mistura com o Estágio 2 sob velocidade baixa por 2 minutos. 3. Adicionar o Estágio 3 sob velocidade lenta por 20 segundos. 4. Raspar a tigela; adicionar o Estágio 4 sob velocidade lenta por 20 segundos. 5. Dividir em pedaços de 30 g, achatar e colocar sobre tabuleiros de cozimento de silicone arrumado em fileiras. 6. Assar a 190°C por aproximadamente 10 minutos. EXEMPLO 30 PREPARAÇÃO DE UMA MASSA DE TORTA DE CROSTA PEQUENA DE GORDURA REDUZIDA
[0341] O exemplo a seguir descreve a preparação de uma massa de torta de crosta pequena de gordura reduzida contendo glucano alfa-1,2 ramificado conforme atualmente divulgado.
Figure img0045
[0342] Etapa n° Procedimento: 1. Misturar em seco a farinha, sal e o glucano (seco) 2. Esfregar suavemente na gordura até que a mistura se assemelhe a migalhas de pão finas. 3. Adicionar água suficiente para produzir uma massa lisa. EXEMPLO 31 PREPARAÇÃO DE UM AGLOMERADO DE CEREAL COM BAIXO TEOR DE AÇÚCAR
[0343] O exemplo a seguir descreve a preparação de um aglomerado de cereal com baixo teor de açúcar contendo glucano alfa-1,2 ramificado conforme atualmente divulgado.
Figure img0046
Figure img0047
[0344] Etapa n° Procedimento: 1. Picar os delicados. 2. Pesar a mistura de cereais e adicionar os sólidos finos. 3. Adicionar óleo vegetal sobre os cereais e misturar bem. 4. Preparar o xarope dissolvendo os ingredientes. 5. Deixar o xarope resfriar. 6. Adicionar a quantidade desejada de xarope à mistura de cereais. 7. Misturar bem para assegurar cobertura uniforme dos cereais. 8. Espalhar sobre uma bandeja. 9. Colocar em um secador/forno e deixar secar. 10. Deixar resfriar completamente antes de quebrar em aglomerados. EXEMPLO 32 PREPARAÇÃO DE UMA GELEIA DE PECTINA
[0345] O exemplo a seguir descreve a preparação de uma geleia de pectina contendo glucano alfa-1,2 ramificado conforme atualmente divulgado.
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[0346] Etapa n° Procedimento: 1. Misturar a seco a pectina e o xilitol (Componente A). 2. Aquecer o Componente B até que a solução começa a ferver. 3. Adicionar o Componente A gradualmente e, em seguida, ferver até dissolver completamente. 4. Adicionar o Componente C gradualmente para evitar o excesso de resfriamento do lote. 5. Ferver até 113°C. 6. Deixar esfriar a < 100°C e, em seguida, adicionar cor, sabor e ácido (Componente D). Depositar imediatamente nos moldes de amido. 7. Deixar até firmar, em seguida, retirar o amido. EXEMPLO 33 PREPARAÇÃO DE UMA BALA MASTIGÁVEL
[0347] O exemplo a seguir descreve a preparação de uma bala mastigável contendo glucano alfa-1,2 ramificado conforme atualmente divulgado.
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[0348] Etapa n° Procedimento: 1. Misturar o glucano, xilitol, água, gordura, GMS e lecitina juntos e, em seguida, cozinhar suavemente a 158°C. 2. Resfriar a massa para abaixo de 90°C e, em seguida, adicionar a solução de gelatina, sabor, cor e ácido. 3. Esfriar ainda mais e, em seguida, adicionar o xilitol CM50. Puxar a massa imediatamente por 5 minutos. 4. Deixar a massa resfriar novamente antes do processamento (cortar e enrolar ou drop rolling). EXEMPLO 34 PREPARAÇÃO DE UM SORVETE DE CAFÉ-CEREJA
[0349] O exemplo a seguir descreve a preparação de um sorvete de café-cereja contendo glucano alfa-1,2 ramificado conforme atualmente divulgado.
Figure img0050
Figure img0051
[0350] Etapa n° Procedimento: 1. Adicionar os ingredientes secos à água enquanto agitando vigorosamente. 2. Derreter a gordura. 3. Adicionar a gordura à mistura a 40°C. 4. Homogeneizar a 200 bar / 70 a 75°C. 5. Pasteurizar a 80 a 85°C / 20 a 40 segundos. 6. Resfriar até a temperatura de envelhecimento (5°C). 7. Envelhecer por no mínimo 4 horas. 8. Adicionar sabor à mistura. 9. Congelar em congelador contínuo até a saturação desejada (100% é recomendado). 10. Endurecer e armazenar a -25°C.

Claims (6)

1. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA COMPOSIÇÃO DE GLUCANO, que compreende ligações alfa-1,2, caracterizado pelo método compreender: (a) fornecer os seguintes componentes de reação: água, sacarose, um substrato de alfa-glucano que compreende ligações alfa-1,6, e um polipeptídeo que é capaz de formar uma ramificação alfa-1,2 a partir da glicose 1,6-ligada do substrato de alfa-glucano, em que o dito polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou as posições 36 a 1672 resíduos de aminoácidos da SEQ ID NO: 4; e (b) combinar os componentes de reação sob condições adequadas através das quais o polipeptídeo catalisa a síntese de uma ramificação alfa-1,2 a partir de uma glicose 1,6-ligada do substrato de alfa- glucano, formando, assim, uma composição de glucano que compreende uma ou mais ligações alfa-1,2.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo polipeptídeo compreender as posições 36 a 1672 de SEQ ID NO: 4.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo substrato de alfa-glucano ter um grau de polimerização de 8 a 500.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo substrato de alfa-glucano e sacarose estarem presentes em (b) em uma razão inclusiva entre 0,01:1 e 1:0,01.
5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelos componentes de reação compreenderem ainda uma alfa-glucanohidrolase.
6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreender isolar a composição de glucano.
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