ES2345877T3 - Usos de un glucano derivado de bacterias acido lacticas como agente contra la corrosion. - Google Patents
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Abstract
El uso de un glucano que comprende 15 - 26% de AGU con enlace α(1,3), 30 - 50% de AGU con enlace α(1,6), y 5 - 20% de AGU con enlace α-(1,3,6), como un agente anticorrosivo.
Description
Usos de un glucano derivado de bacterias ácido
lácticas como agente contra la corrosión.
La presente invención está en el campo de las
biomoléculas enzimáticamente producidas. La invención está
particularmente relacionada con el uso de glucanos derivados de
bacterias ácido lácticas.
Se sabe que diferentes bacterias producen
exopolisacáridos, es decir polisacáridos secretados en el medio de
cultivo. Los ejemplos bien conocidos de exopolisacáridos bacterianos
incluyen xantano de Xanthomonas campestris, gellan de
Sphingomonas paucimobilis y pullulan de Aureobasidium
pullulans. Las bacterias ácido lácticas que se sabe que
producen exopolisacáridos incluyen a las cepas Leuconostoc
mesenteroides que producen dextranos, poliglucosa anhidra con
enlaces \alpha(1\rightarrow6), y alternanos, es decir
poliglucosas anhidras que tienen enlaces alternantes
\alpha(1\rightarrow6) y \alpha(1\rightarrow3),
cepas de Estreptococo oral que producen glucanos responsables de la
formación de placa dental, y una cepa particular de
Lactobacillus reuteri que produce glucosa anhidra con
enlaces \alpha(1,6)- y \alpha(1,4) (Van
Geel-Schutten, y colaboradores., Appl. Environ.
Microbiol. (1999) 65, 3008 - 3014). Las propiedades de los
exopolisacáridos dependen del tipo de unidades de monosacárido, del
tipo de enlaces, del grado y tipo de ramificaciones, la longitud de
la cadena del polisacárido, el peso molecular y la conformación de
los polímeros.
Argiiello-Morales y
colaboradores. (FEMS Microbiol. Lett. 182 (2000) 81 - 85) describen
una alternanosucrasa del Leuconostoc mesenteroides NRRL
B-1355. Monchois y colaboradores. (Gene 182 (1996)
23 - 32; FEMS Microbiol. Lett. 159 (1998) 307 - 315) describen por
ejemplo dos diferentes dextranosucrasas del Lc. mesenteroides
NRRL B-1299. Un método para seleccionar cepas de
Leuconostoc mesenteroides que producen una alta proporción
de alternano con relación a dextrano es descrito en la patente
estadounidense No. 5.789.209. El estado del arte no divulga o
sugiere otras bacterias ácido lácticas diferentes a Leuconostoc o
Estreptococos que sean capaces de producir glucanos que tengan
enlaces tanto \alpha(1\rightarrow6) como
\alpha(1\rightarrow3).
Se encontró que diferentes cepas de bacterias
ácido lácticas eran capaces de producir una clase particular de
glucanos. Estos glucanos tienen en común que sus unidades de glucosa
anhidra (AGU) están enlazadas con enlaces glucosídicos
\alpha(1,3) y/o \alpha(1,6), es decir son
\alpha-glucanos en gran parte o completamente
desprovistos de enlaces \alpha(1,4). Estos glucanos pueden
ser de tipo alternano (enlaces alternantes \alpha (1,3) y
\alpha(1,6)), mutano (mezclados \alpha(1,3) y
\alpha(1,6), usualmente predominando \alpha(1,3))
o dextrano (principalmente enlaces \alpha(1,6), algunos
\alpha(1,3)), o de otro tipo. Los glucanos pueden ser
producidos a partir de sacarosa, utilizando enzimas sucrasa que son
activas en la bacteria ácido láctica. Pueden ser producidos a gran
escala y aislados en una forma comercialmente factible, ya que los
glucanos son producidos fuera de la célula bacteriana, o incluso en
ausencia de la bacteria, utilizando enzimas aisladas de sacarosa.
Los glucanos son producidos por cepas de grado alimenticio y tienen
interesantes propiedades, tales como utilidad prebiótica o
espesante de composiciones en base acuosa.
La invención está relacionada con el uso de
glucanos específicos como anticorrosivos.
Las cepas de Lactobacillus que contienen
una glucosiltransferasa (glucanosucrasa) capaz de producir un
glucano que tiene al menos 10 unidades de glucosa anhidra (AGU) que
tiene una columna vertebral que consiste esencialmente de AGU con
enlaces \alpha(1,3) y/o \alpha(1,6), en presencia
de sacarosa pueden encontrarse entre las fuentes actuales de
Lactobacilli, tales como fuentes alimenticias, ensilaje,
muestras de mamíferos, etc. Estas cepas que contienen las
glucosiltransferasas y que producen los glucanos pueden ser
identificadas por aislamiento de cepas de Lactobacillus a
partir de estas fuentes, cultivándolas sobre sacarosa y analizando
el producto polisacárido utilizando métodos analíticos adecuados
tales como cromatografía. Los genes que codifican estas
glucosiltransferasas pueden ser identificados por medio de
amplificación de fragmentos de secuencias de nucleótidos de la cepa
utilizando iniciadores con base en genes conocidos para
glucosiltransferasa y reteniendo las cepas positivas (ver los
ejemplos). Se aislaron e identificaron diferentes cepas que producen
glucano a partir de diferentes fuentes y diferentes especies de
Lactobacillus, tales como Lb. reuteri, Lb.
fermentum, Lb. sake y Lb. parabuechneri o especies
relacionadas. Se identificaron también las gluco-
siltransferasas de estas cepas que producen glucano y, se las secuenció parcial o completamente (ver los Ejemplos).
siltransferasas de estas cepas que producen glucano y, se las secuenció parcial o completamente (ver los Ejemplos).
Los nuevos glucanos pueden ser producidos por
medio de la actividad de la glucosiltransferasa (glucanosucrasa) de
una bacteria ácido láctica sobre un sustrato donante de sacarosa.
Los glucanos tienen un peso molecular promedio entre 10 kDa y 1
GDa, y consisten esencialmente de unidades de glucosa anhidra con
enlaces \alpha(1,3) y/o \alpha(1,6) (AGU), a las
cuales pueden estar unidas cadenas laterales que consisten también
de AGU con enlaces \alpha(1,3) y/o
\alpha(1,6).
En particular, los glucanos contienen ya sea 15
- 80% de AGU con enlaces \alpha(1,3), 2 - 80%,
especialmente 4 - 80% y más especialmente 15 - 80% de AGU con
enlaces \alpha(1,6) y 2 - 25% de AGU (ramificación) con
enlaces \alpha-(1,3,6), o 80 - 99% de AGU con enlaces
\alpha(1,6) y 1 - 20% de AGU (ramificación) con enlaces
\alpha(1,3) o \alpha(1,3,6), en particular 1 - 15%
de AGU con enlaces \alpha(1,3) y 5 - 15% de unidades con
enlaces \alpha(1,3) y \alpha(1,3,6) tomadas en
conjunto. La invención se relaciona con el uso de un glucano que
tiene un peso molecular promedio de 10 kDa - 50 MDa y que contiene
15 - 26% de AGU con enlaces \alpha(1,3), 30 - 50% de AGU
con enlaces \alpha(1,6), 5 - 20% de AGU con enlaces
\alpha(1,3,6) y 5 - 35% de AGU terminales.
Las enzimas que se originan en bacterias ácido
lácticas, o de fuentes recombinantes, capaces de producir los
glucanos descritos anteriormente partiendo de sacarosa pueden ser
clasificadas como glucanosucrasas o glucosiltransferasas. Se da
información más completa de las secuencias en las SEQ ID Nos 11 y
12.
Se pueden utilizar las enzimas como tales para
la producción de los glucanos descritos anteriormente, o para la
producción de oligosacáridos y polisacáridos que tienen una
estructura similar a la del glucano con enlaces
\alpha(1,3) y/o \alpha(1,6). Sus genes pueden ser
incorporados también en organismos huésped adecuados, para producir
sistemas alternativos de producción de glucano. Tales
microorganismos recombinantes, preferiblemente grado alimenticio,
por ejemplo bacterias, especialmente bacterias ácido lácticas,
levaduras, hongos, etc., que contienen los genes de las
glucanosucrasas descritas anteriormente son capaces de expresar las
glucanosucrasas.
Este glucano puede ser producido por una cepa de
Lactobacillus como se describió anteriormente, o por medio
de un microorganismo recombinante que expresa la glucosiltransferasa
o por medio de una glucosiltransferasa aislada y una fuente
adecuada de glucosa tal como por ejemplo sacarosa. La
glucosiltransferasa puede ser aislada por medios convencionales a
partir del cultivo de una bacteria ácido láctica positiva para
glucosiltransferasa, especialmente una especie de
Lactobacillus, o a partir de un organismo recombinante que
expresa al gen para la glucosiltransferasa.
El glucano y los glucooligosacáridos producidos
por las cepas de Lactobacillus pueden ser recuperados del
sobrenadante del cultivo de cepas de Lactobacillus descritas
anteriormente, que contienen la glucosiltransferasa. El glucano
puede incluir al menos 20, hasta aproximadamente 100.000 unidades
\alpha de glucosa anhidra con la estructura única descrita
anteriormente.
Las enzimas que producen glucano, o al menos las
más preferidas, son constitutivas en las cepas de
Lactobacillus, ya que siempre están presentes. Esto es
contrario a la mayoría de las cepas de Leuconostoc que producen
glucano (dextrano) del estado del arte, en donde las enzimas se
expresan únicamente sobre el crecimiento en presencia de sacarosa.
Esto permite una producción más eficiente de glucanos por parte de
los microorganismos.
Los glucanos de la invención son útiles como
agentes anticorrosión, por ejemplo para la protección de cascos de
buques. Para ese propósito, se pueden aplicar en forma de soluciones
o suspensiones, por medio de atomización, recubrimiento, inmersión
y otras técnicas conocidas en el arte del control de la
corrosión.
Los glucanos pueden utilizarse como tales.
También pueden ser modificados por medios físicos o químicos. Los
ejemplos adecuados de modificación clínica incluyen oxidación,
especialmente oxidación 2,3 ó 3,4 utilizando peryodato o
hipohalito, en glucanos que tienen enlaces
\alpha-1,6, u oxidación en posición 6 utilizando
nitroxilos con perácido o hipohalito en glucanos que tienen enlaces
\alpha-1,3. La oxidación con hipohalito resulta
en unidades de 2,3 ó
3,4-dicarboxi-anhidroglucosa
abiertas en el anillo (ver, por ejemplo,
EP-A-427349), mientras que la
oxidación con peryodato resulta en unidades de 2,3 ó
3,4-dialdehído-anhidroglucosa de
anillo abierto (ver, por ejemplo WO 95/12619), que pueden ser
oxidadas adicionalmente hasta unidades (parcialmente) carboxiladas
(ver, por ejemplo 00/26257). La oxidación mediada por nitroxilo
utilizando hipoclorito o un perácido resulta en unidades
6-aldehídodo- y
6-carboxi-anhidroglucosa (ver, por
ejemplo WO 95/07303).
Los glucanos oxidados tienen mayor solubilidad
en agua, viscosidad alterada y una fermentabilidad retardada y
pueden ser utilizados como agentes complejantes de metal, aditivos
detergentes, aditivos reforzadores, carbohidratos bioactivos,
emulsificantes y agentes enlazantes de agua. También pueden ser
utilizados como materiales de partida para conversión adicional en
derivados tal como entrecruzamiento y la introducción de hidrófobos.
Los glucanos oxidados acoplados a proteínas pueden ser utilizados
como emulsificantes y estabilizantes. Los glucanos oxidados
contienen preferiblemente 0.05 - 1.0 grupos carboxilo, más
preferiblemente 0.2 - 0.8 grupos carboxilo por unidad de glucosa
anhidra, por ejemplo como grupos 6-carboxilo sobre
unidades con enlace 1,3.
Cuando se desean glucanos modificados con alta
proporción de grupos carboxilo, se pueden combinar dos procesos de
oxidación o se puede combinar una oxidación con, por ejemplo,
carboximetilación (ver más adelante). Por lo tanto, se puede
preparar convenientemente un
\alpha-(1,3/1,6)-glucano que tiene un grado de
sustitución (DS) para grupos carboxilo entre 0,3 y 1,0 primero por
medio de oxidación mediada por nitroxilo, resultando en la
oxidación de unidades sustituidas en 1,3 hasta unidades de ácido
glucurónico, seguido por ejemplo por peryodato y oxidación con
clorito, resultando en la conversión de unidades sustituidas en 1,6*
en unidades dicarboxi-sustituidas de anillo
abierto. Se puede invertir también el orden de los procesos, o se
puede combinar un proceso de oxidación, tal como oxidación en
posición 6 mediada por nitroxilo con carboximetilación. También,
por medio de una adaptación apropiada de los procesos de oxidación
se puede obtener una mezcla de polímeros que contienen carboxilo y
aldehído.
Otras modificaciones útiles son alquilación,
acilación, hidroxialquilación, amino-alquilación,
carboxialquilación, fosforilación, sulfatación, así como
entrecruzamiento físico y químico. Se puede lograr la fosforilación
(ver: O. B. Wurzburg (1986), Modified Starches: properties and
uses. CRC Press Inc., Boca Raton, 97 - 112) por medio de
calentamiento en seco de glucanos con una mezcla de hidrógeno
fosfato monosódico y disódico o con tripolifosfato. Los glucanos
fosforilados son adecuados como aditivos para
"wet-end" en la elaboración de papel, como
aglomerantes en composiciones para recubrimiento de papel, como
agentes para urdir encolado, y como aglomerantes de núcleos para
moldes de arena para fundición de metal. La acilación, especialmente
acetilación o propionilación usando anhídrido acético o propiónico
respectivamente, resulta en productos adecuados como asistentes de
blanqueo y para uso en láminas. La acilación por ejemplo con
anhídridos alquenil succínicos o ácidos grasos (activados) resulta
en productos de superficie activa adecuados por ejemplo como
tensoactivos, emulsificantes, y estabilizantes. El
entrecruzamiento, por ejemplo por medio de acoplamiento de derivados
oxidados, o por reacción con un agente de entrecruzamiento tal como
ácido trifosfórico, epiclorohidrina o un dialdehído, puede ser
utilizado para ajustar las propiedades físicas de los glucanos, por
ejemplo para mejorar sus capacidades de enlazamiento de agua o de
espesamiento.
La hidroxialquilación se realiza comúnmente por
medio de reacción catalizada por una base con óxidos de alquileno,
tales como óxido de etileno, óxido de propileno o epiclorohidrina;
los productos hidroxialquilados tienen mejores características de
solubilidad y viscosidad. La carboximetilación se logra por reacción
de los glucanos con ácido monocloroacético o sus sales de metal
alcalino y resulta en polímeros aniónicos adecuados para diferentes
propósitos incluidos inhibidores de cristalización, y complejantes
metálicos. La amino-alquilación se puede lograr por
reacción de los glucanos con alquilen-iminas,
halo-alquil aminas u óxidos de
amino-alquileno, o por reacción de aductos de
epiclorohidrina de los glucanos con aminas adecuadas. Estos
productos pueden ser utilizados como polímeros catiónicos en una
variedad de aplicaciones, especialmente como un aditivo para
wet-end en la elaboración del papel para
incrementar la resistencia, para relleno y retención de finos, y
para mejorar la velocidad de drenaje de la pulpa de papel. Otras
aplicaciones potenciales incluyen encolado de textiles y
purificación de aguas residuales. Las modificaciones anteriormente
mencionadas pueden ser utilizadas ya sea separadamente o en
combinación dependiendo del producto deseado. Además, el grado de
modificación química es variable y depende del uso pretendido. Si
fuera necesario, se puede llevar a cabo una modificación del 100%,
es decir modificación de todas las unidades de glucosa anhidra. Sin
embargo, a menudo será suficiente una modificación parcial, por
ejemplo de menos de 1 (por ejemplo 0.2) unidad de glucosa anhidra
modificada por 100 unidades hasta niveles superiores, con el
propósito de obtener el efecto deseado.
Se forma otro tipo adecuado de derivados por
medio de hidrolizados de los presentes glucanos. Se puede realizar
la hidrólisis en una forma controlada en una forma ya conocida,
utilizando por ejemplo ácido diluido o enzimas glucanolíticas,
especialmente
\alpha-1,3-glucanasas o
\alpha-1,6-glucanasas. La
hidrólisis produce polisacáridos de longitud de cadena reducida
(grado de polimerización, DP, de más de 20) u oligosacáridos (DP de
menos de 20).
Los glucooligosacáridos que contienen la
estructura característica del glucano descrito anteriormente pueden
ser producidos utilizando una glucanosucrasa aislada o una cepa de
Lactobacillus, o un microorganismo recombinante que contiene (una
parte de) una glucosiltransferasa. La producción de los
glucooligosacáridos es diferente de la reacción de síntesis del
glucano. Además de la sacarosa, se puede utilizar el sustrato de la
glucanosucrasa, una molécula aceptora tal como maltosa o lactosa
como aceptor, para sintetizar oligosacáridos. La unión consecutiva
de unidades de glucosa en una forma determinada por medio de la
glucanosucrasa particular resulta en glucooligosacáridos con
enlaces \alpha(1,3) y/o \alpha(1,6), cuya longitud
de cadena se puede determinar por medio de la selección apropiada
de las condiciones de reacción. Tiempos de reacción más largos,
niveles más altos de sacarosa y niveles menores de aceptor
usualmente darán como resultado cadenas relativamente largas, que
tienen por ejemplo un grado de polimerización (DP) de más de 10,
hasta varios cientos si se desea, mientras que tiempos de reacción
más cortos, menores niveles de sacarosa y niveles más altos aceptor
resultarán en cadenas relativamente cortas, por ejemplo con un DP
aproximadamente de 3 a 10 o superior. Otra forma de producir
glucooligosacáridos es por medio de hidrólisis del glucano descrito
anteriormente. Esta hidrólisis se puede llevar a cabo por medio de
métodos conocidos de hidrólisis tales como hidrólisis enzimática con
enzimas tales como amilasa, dextranasa o pullulanasa o por medio de
hidrólisis ácida. Los glucooligosacáridos producidos contienen al
menos un enlace 1,6- ó 1,3-glucosídico que son
utilizados como prebióticos.
Se aislaron las diferentes cepas bacterianas
ácido lácticas a partir de una variedad de fuentes, incluidos los
alimentos fermentados, el tracto gastrointestinal de diferentes
especies humanas o animales, y ensilaje.
\vskip1.000000\baselineskip
Los genes de la glucanosucrasa fueron
identificados por medio de amplificación con PCR utilizando
iniciadores degenerados (GTFrev, 5' ADRTC NCCRT ARTAN AVNYK NG 3' y
GTFforw, 5'-GAYAAYWSNA AYCCNRYNGT
NC-3'; N = A, C, G o T, Y = T o C, K = G o T, W = A
o T, S = C o G, R = A o G), con base en secuencias conservadas de
aminoácidos de diferentes genes publicados de glucanosucrasa. Se
obtuvo un producto de amplificación con el tamaño predicho de
aproximadamente 660 pb y se lo clonó en Escherichia coli Top
10 utilizando pCR-XL-TOPO
(Invitrogen). El análisis de la secuencia confirmó que parte de un
gen gtf había sido aislado. Se utilizó el producto amplificado de
660 pb para diseñar iniciadores para PCR inverso. Para PCR inverso
se digirió ADN cromosómico con 10 enzimas diferentes ligadas,
produciendo moléculas circulares de ADN. La PCR con los iniciadores
divergentes con los productos circulares de ligación como molde
produjo amplicones de diferentes tamaños, aquellos productos fueron
clonados en pCR-XLTOPO (Invitrogen) y secuenciados
(GATC, Konstanz, Alemania). Si fuera necesario, se llevaron a cabo
reacciones adicionales de PCR inverso para obtener el(los)
gen(es) completo(s). Se secuenciaron dos veces ambas
cepas de los genes completes para la glucanosucrasa.
Se depositó la cepa 180 de L. reuteri
como LMG P-18389 en la BCCM/LMG Culture Collection
en Gent, Bélgica. Se cultivó la cepa en 18 litros de medio
MRS-s (en g por kg): extracto de levadura (22),
acetato de sodio trihidratado (5), citrato de sodio dihidratado
(2.42),cloruro de amonio (1.32), fosfato ácido dipotásico (2),
sulfato de magnesio heptahidratado (0.2), sulfato de manganeso
heptahidratado (0.05), sorbitan monooleato (1), vitaminas (en mg
por kg: B1: 14.4, B2: 3.6, B3: 72, H 0.216), sacarosa (100), agua
del grifo (restante), durante 21 h a 37ºC bajo condiciones
anaeróbicas (pH 5.5). Ver también: Van Geel-Schutten
y colaboradores., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1998) 50, 697 -
703. Durante el cultivo, se produjeron 13 g/l de polisacárido. Se
aisló este polisacárido como se describe en la referencia citada
anteriormente. Se determinó la composición de monosacáridos del
polisacárido por medio de hidrólisis de la parte soluble del
polisacárido y cromatografía de intercambio aniónico de alto
rendimiento. Fue caracterizado como un glucano. Este glucano no se
formó cuando se cultivó la cepa sobre glucosa en vez de sobre
sacarosa. El análisis de metilación (Van
Geel-Schutten y colaboradores. 1999) reveló la
presencia de 17 - 24% de unidades de glicosilo con enlaces
\alpha(1,3), 34 - 44% de unidades de glicosilo con enlaces
\alpha(1,6), 7 - 15% de unidades de glicosilo con enlaces
\alpha(1,3,6) y 7 - 35% de unidades glicosilo terminales.
Se determinó que el peso molecular promedio del glucano era de 3.6
x 10^{7} Da y el Rg era de 45 nm.
Se estableció el peso molecular promedio del
polisacárido utilizando el sistema SEC-MALLS: se
disolvieron 0.0522 g del glucano en 10 ml de DMSO/agua (90/10) y se
calentó durante 1 hora a 80ºC, se filtró a través de un filtro de
0.45 \mum y se inyectó sobre el sistema SEC-MALLS
y se analizó utilizando las siguientes condiciones:
- Eluyente:
- DMSO/agua (90/10) con NaNO_{3} 0,1 M
- Velocidad de flujo:
- 0.5 ml/min
- Volumen de inyección:
- 0.247 ml
- Columna:
- PLgel Guard, mezclada con A y mezclada con D
- Temperatura:
- 90ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Detección: MALLS (DAWN-DSP),
50ºC, A_{2} = 0, dn/dc = 0.074, celda F2, RI; SDS PAGE seguido por
coloración con PAS (Van Geel-Schutten y
colaboradores. 1999) reveló la presencia de una sucrasa extracelular
con un peso molecular de aproximadamente 190 kDa. Parte del gen que
codifica la enzima sucrasa fue aislado utilizando técnicas de PCR y
secuenciado. Sobre la secuencia deducida de aminoácidos del
fragmento, se encontraron grandes homologías con otras
glucanosucrasas. Esta información parcial de la secuencia es
presentada en la SEQ ID No. 1 (ADN) y 2 (proteína). La información
de la secuencia completa se presenta en las SEQ ID Nos. 11 y 12.
Se ha analizado el glucano producido por la cepa
180 L. reuteri para su aplicación sobre cascos de buques
para la prevención de la corrosión (ver el Ejemplo 4).
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa ML1 de L. reuteri, depositada
como LMG P-20347 en la BCCM/LMG Culture Collection
en Gent, Bélgica, fue cultivada durante la noche bajo condiciones
anaeróbicas a 37ºC sobre MRS suplementado con sacarosa (ver el
Ejemplo 2). Se removieron las células por centrifugación y se
añadieron dos volúmenes de etanol al sobrenadante. Se recolectaron
los polisacáridos precipitados por centrifugación y se resuspendió
en 2 - 3 litros de agua desmineralizada y se precipitó nuevamente
con dos volúmenes de etanol. El glucano producido por esta cepa (7
g) fue caracterizado por medio de análisis de metilación y análisis
de composición de monosacáridos como se describe en el Ejemplo 2.
Se encontró que el polímero consiste de 48 - 53% unidades de
glicosilo con enlaces \alpha(1-3), 3 - 8%
de unidades glicosilo con enlaces
\alpha(1-6), 12 - 20% de unidades glicosilo
con enlaces \alpha(1-3-6)
(unidades de ramificación) y 20 - 30% de unidades de glucosa
enlazadas en posición 1 (terminal). No se produjeron glucanos
durante el cultivo sobre glucosa. Se estableció que el peso
molecular promedio del polisacárido era de 7.6 x 10^{6} Da
utilizando el sistema SEC-MALLS como se describe en
el ejemplo 2. Estos fueron los primeros ejemplos de la producción
de polímeros tipo mutante por parte de lactobacilos. Se ha
analizado la aplicación del glucano producido por la cepa ML1 de
L. reuteri como agente anticorrosivo y mostró una excelente
utilidad para la prevención de la corrosión por ejemplo sobre cascos
de buques.
SDS PAGE seguido por coloración con PAS (Van
Geel-Schutten y colaboradores. 1999) reveló la
presencia de una sucrasa extracelular con un peso molecular de
aproximadamente 190 kDa. Se encontró que esta cepa produce dos
glucanosucrasas.
Se expusieron laminas planas de acero al carbono
de 1 cm^{2} embebidas en una matriz epóxica a un medio
ligeramente corrosivo (150 ml de LiClO_{4} 0.1 M) con o sin la
adición de un polisacárido bacteriano (0.2 g) durante varios días.
Se examinaron luego las laminas visual y electroquímicamente cada
cierto tiempo. Tanto el potencial de corrosión (E_{corr} en mV
con referencia a Ag/AgCl) como la resistencia a la polarización
(R_{p} en k\Omega/cm^{2}) son ambos una medida del efecto
anticorrosión. Después de una adaptación inicial de 3 - 10 horas,
estos parámetros alcanzaron un valor estable. Se llevaron a cabo los
experimentos con un heteropolisacárido de Lactobacillus
sake, y un homopolisacárido de la invención (de LB 180 de
acuerdo con el ejemplo 2), así como sin polisacárido. Los
resultados aparecen resumidos en la tabla a continuación. Se
aprecia que las propiedades anticorrosión del glucano de la
invención son superiores. Se encontró que el homopolisacárido de ML
1 (ejemplo 3) tiene al menos un desempeño anticorrosión como el del
polisacárido de LB 180.
\vskip1.000000\baselineskip
Se resuspende un gramo (6.15 mmol de unidades de
glucosa anhidra) del
\alpha-1,3/1,6-glucano producido
por la cepa LB 33 en 100 ml de agua. Luego se añaden
2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxilo
(TEMPO; 0.01 g, 0.065 mmol) y bromuro de sodio (100 mg, 1 mmol) y
se enfría la suspensión a 0ºC. También puede llevarse a cabo la
reacción sin bromuro. Se añade una solución de hipoclorito (3 ml,
solución al 15%, 6.3 mmol) de pH 10.0 (0ºC). Se mantiene constante
el pH por medio de la adición de NaOH 0.1 M. Después de 1 h, se
vierte la solución en 150 ml de etanol al 96%, provocando que se
precipite el producto. Se centrifuga el precipitado, se resuspende
en etanol/agua (70/30 v/v) y se centrifuga nuevamente. Luego, se
resuspende el precipitado en etanol al 96%, se centrifuga y se
seca. Se determina el contenido de ácido urónico por medio del
análisis del ácido urónico de acuerdo con Blumenkrantz y
Abdoe-Hansen (Anal. Biochem. 54 (1973), 484). Se
generó una curva de calibración utilizando ácido poligalacturónico
(5, 10, 15 y 20 \mug). Con esta curva de calibración se determina
el contenido de ácido urónico en una muestra de 20 \mug del
producto. La mayor parte de los grupos 6-hidroxilo
han sido oxidados hasta grupos carboxilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseñaron dos iniciadores con sitios de
restricción apropiados; el iniciador C-terminal
contenía en todos los casos una etiqueta His. Se clonaron primero
los productos PCR en pCR-XL-TOPO. Se
removieron los productos PCR de
pCR-XL-TOPO utilizando las enzimas
apropiadas y ligadas en los sitios apropiados de un vector de
expresión (por ejemplo pET15b (Novagen)). Para la expresión de
parte del gen para la glucosiltransferasa de LB 180 (para mejor
expresión, no se clonó la región N-terminal que
codifica al dominio variable N-terminal de la
glucanosucrasa) en E. coli, se llevó a cabo una reacción PCR
utilizando Forw180 (5'-GATGCATGAG
CTCCCATGGG CATTAACGGC CAACAATATT ATTATTGACC
C-3') que contienen sitios SacI (negrilla) y NcoI
(subrayado), y Rev180 (5'-ATATC
GATGG GCCCCGGATC CTATTAGTGA TGGTGATGGT GATGTTTTTG GCCGTTTAAA TCACCAGGTT TTAA
TGG-3'), que contiene ApaI (negrilla), BamHI (subrayado) y una etiqueta 6x His (cursiva) como iniciadores. Se clonó el producto PCR en pCR-XL-TOPO. Se removió el producto PCR de pCRXL-TOPO utilizando NcoI/BamHI y se lo ligó en los sitios correspondientes de pET15b (Novagen). El plásmido resultante (pET15b180) que contiene parte del gen para glucanosucrasa de 704 aminoácidos que codifica una glucanosucrasa sin el dominio variable N-terminal fue transformado en B121 DE3 star de E. coli (Invitrogen).
GATGG GCCCCGGATC CTATTAGTGA TGGTGATGGT GATGTTTTTG GCCGTTTAAA TCACCAGGTT TTAA
TGG-3'), que contiene ApaI (negrilla), BamHI (subrayado) y una etiqueta 6x His (cursiva) como iniciadores. Se clonó el producto PCR en pCR-XL-TOPO. Se removió el producto PCR de pCRXL-TOPO utilizando NcoI/BamHI y se lo ligó en los sitios correspondientes de pET15b (Novagen). El plásmido resultante (pET15b180) que contiene parte del gen para glucanosucrasa de 704 aminoácidos que codifica una glucanosucrasa sin el dominio variable N-terminal fue transformado en B121 DE3 star de E. coli (Invitrogen).
Se recolectaron células de E. coli que
albergan al pET15b180 por medio de centrifugación después de 16 h
de crecimiento bajo condiciones aeróbicas a 37ºC. Se lavó el
precipitado con amortiguador de acetato de sodio 50 mM pH 5.5 que
contiene CaCl_{2} 1 mM y Tween 80 al 1% (v/v) y se centrifugó la
suspensión nuevamente. Se resuspendieron las células precipitadas
con amortiguador de acetato de sodio 50 mM pH 5.5 que contiene
CaCl_{2} 1 mM y Tween 80 al 1% (v/v), y
\beta-mercaptoetanol 7.2 mM. Se rompieron las
células por medio de sonicación y se removieron los restos
celulares y las células intactas por centrifugación durante 15
minutos a 4ºC a 14.000 rpm (Eppendorf). Se utilizó el extracto
resultante libre de células como fuente de enzimas para producir
glucanos de alto peso molecular de sacarosa en amortiguador de
acetato de sodio 50 mM pH 5.5 que contiene CaCl_{2} 1 mM y Tween
80 al 1% (v/v) y 10 g/l de sacarosa. Después de 16 horas de
incubación, se aislaron los glucanos utilizando precipitación con
etanol. Cuando se utilizaron los extractos libres de células de
B121 DE3 star de E. coli (Invitrogen) que albergan al
plásmido pET15b (sin inserto) como fuente de la enzima, no se
produjeron glucanos a partir de la sacarosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Las SEQ ID Nos 1 y 2 presentan las secuencias de
nucleótidos y aminoácidos, respectivamente, de una parte de la
glucanosucrasa de la cepa Lb180 como se la determinó originalmente
(Ejemplo 2). La secuencia parcial muestra 53% (199/223) de
identidad de secuencia y 68% de similitud con la dextranosucrasa
DSRB742 de Leuconostoc mesenteroides (Lc. mes.), con
2 huecos (entre los aminoácidos F172 y N173), y 52% de identidad con
algunas otras dextranosucrasas y alternanosucrasas de Lc.
mes.
Las SEQ ID Nos 11 y 12 presentan las secuencias
de nucleótidos y de aminoácidos, respectivamente, de la
glucanosucrasa de la cepa Lb180 (Ejemplo 2). La secuencia muestra
la identidad de secuencia (74%) de 1322/1768 y la similitud (82%)
de 1476/1768 con 15/1768 huecos con glucanosucrasa de LB 121 de
Lb. reuteri como se divulga en WO 01/90372. Los sitios -35 y
-10 TTGAAA y TATAA se localizan en las posiciones de los nucleótidos
561 y 599, respectivamente. El sitio de enlazamiento del ribosoma
(RBS) GAAGGAG está en 574 y el codón de inicio ATG en 587. Las
repeticiones invertidas AAGCAGCTC y GAGCTGCTT están en 6025 y 6051.
Los codones de detención posibles (TAA, TAG, TGA) están indicados
con un * (5963).
\vskip1.000000\baselineskip
Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
\vskip1.000000\baselineskip
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<110> TNO
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevos glucanos y nuevas
glucanosucrasas derivadas de bacterias ácido lácticas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Nuevos glucanos y
glucanosucrasas
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 665
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus reuteri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus reuteri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 674
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa LB 33 de Lactobacillus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 224
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa LB 33 de Lactobacillus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 671
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa 86 de Leuconostoc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 223
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa 86 de Leuconostoc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 746
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa 86 de Leuconostoc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa 86 de Leuconostoc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 670
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa 86 de Leuconostoc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 223
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cepa 86 de Leuconostoc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\newpage
| SEQ ID No. 11 ADN |
| SEQ ID No. 12 PRT |
| Cepa 180 de Lactobacillus reuteri |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| SEQ ID No. 13 ADN |
| SEQ ID No. 14 PRT |
| Cepa ML1 de Lactobacillus reuteri |
| SEQ ID No. 15 ADN |
| SEQ ID No. 16 PRT |
| Cepa ML1 (ML4) de Lactobacillus reuteri |
\vskip1.000000\baselineskip
| SEQ ID No. 17 ADN |
| Cepa LB33 de Lactobacillus |
-
28
\newpage
| SEQ ID No. 18 PRT |
| Cepa LB33 de Lactobacillus |
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
| SEQ ID No. 19 ADN |
| SEQ ID No. 20 PRT |
| Cepa KG15 de Lactobacillus sake |
\vskip1.000000\baselineskip
| SEQ ID No. 21 ADN |
| SEQ ID No. 22 PRT |
| Cepa LB33 de Lactobacillus fermentum |
Claims (3)
1. El uso de un glucano que comprende 15 - 26%
de AGU con enlace \alpha(1,3), 30 - 50% de AGU con enlace
\alpha(1,6), y 5 - 20% de AGU con enlace \alpha-(1,3,6),
como un agente anticorrosivo.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
donde el glucano tiene un peso molecular promedio entre 10 kDa y 50
MDa.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó
2, en donde el glucano puede ser producido por medio de la actividad
de la glucosiltransferasa de la cepa 180 de Lactobacillus
reuteri depositada como LMG P-18389.
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