ES2526264B1 - Secuencia de nucleótidos codificante de una enzima con actividad dextransacarasa, células que la expresan y su uso para la obtención de exopolisacáridos con actividad antiviral y composiciones que los contienen - Google Patents

Abstract

Secuencia de nucleótidos codificante de una enzima con actividad dextransacarasa, células que la expresan y su uso para la obtención de exopolisacáridos con actividad antiviral y composiciones que los contienen.#La presente invención trata de una nueva secuencia de nucleótidos que codifica para una enzima con actividad dextransacarasa aislada a partir de una cepa bacteriana de Lactobacillus sakei, más concretamente de fiambre de magro de cerdo, que presenta capacidad para producir un exopolisacárido. La invención se refiere también al procedimiento de obtención y purificación de dicho exopolisacárido así como al uso del exopolisacárido como agente antiviral en el tratamiento de especies piscícolas, principalmente salmónidos. La invención también protege composiciones farmacéuticas veterinarias o alimentarias que contienen dicho exopolisacárido.

Description

DESCRIPCIÓN

SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS CODIFICANTE DE UNA ENZIMA CON ACTIVIDAD DEXTRANSACARASA, CÉLULAS QUE LA EXPRESAN Y SU USO PARA LA OBTENCIÓN DE EXOPOLISACÁRIDOS CON ACTIVIDAD ACTIVIRAL Y 5 COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN

SECTOR Y OBJETO DE LA INVENCION

La presente invención se circunscribe dentro del sector de la biotecnología y se refiere a una 10 nueva cepa bacteriana y a una secuencia de nucleótidos codificante de una enzima con actividad dextransacarasa, con capacidad para producir un exopolisacárido con actividad antivírica y a un procedimiento para producir dicha enzima y dicho compuesto. Esta invención se refiere, además, a composiciones alimentarias o farmacéuticas veterinarias que contienen el exopolisacárido y que son de aplicación en el sector de la acuicultura para 15 combatir enfermedades infecciosas virales, principalmente en salmónidos.

ESTADO DE LA TECNICA

Las bacterias ácido lácticas son microorganismos considerados GRAS (Generally 20 Recognized as Safe) y algunas de estas bacterias son capaces de sintetizar polisacáridos extracelulares (EPS) tanto heteropolisacáridos como homopolisacáridos. Las propiedades de dichos EPS están determinadas por: (i) el tipo de enlace y unidades de monosacáridos que lo formen, (ii) su grado y tipo de ramificación, y (iii) tanto su masa molecular como su conformación. 25

Los α-glucanos son homopolisacáridos y se clasifican en función del tipo de enlace α-glicosídico que une las diferentes moléculas de glucosa. Los dextranos, presentan principalmente uniones α-(1→6) (Robyt y Walseth (1979) Carbohydr. Res. 68:95–111). Los reuteranos poseen uniones α-(1→4) (Kralj, van Geel-Schutten, Dondorff, Kirsanovs, van der 30 Maarel y Dijkhuizen (2004) Microbiology 150: 3681–3690). Los mutanos, contienen uniones α-(1→3) (Shiroza, Ueda, y Kuramitsu (1987) J. Bacteriol. 169:4263–4270) y los alternanos, como su nombre indica, alternan uniones α-(1→3) y uniones α-(1→6) (Arguello-Morales, Remaud-Simeon, Pizzut, Sarçabal, Willemot y Monsan (2000) FEMS Microbiol. Lett. 182:81–85). Las especies bacterianas capaces de sintetizarlos son bacterias lácticas pertenecientes 35 a los géneros Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus y Weisella (Amari, Gomez Arango,

Gabriel, Robert, Morel, Moulis, Gabriel, Remaun-Siméon y Fontagné-Faucher (2012) Appl. Microbiol. Biotechnol. DOI 10.1007/s00253-012-4447-8) (Rühmkorf, Bork, Mischnick, Rübsam, Becker y Vogel (2013) Food Microbiol. 34 (2013) 52-61).

Los α-glucanos son sintetizados por glucansacarasas también conocidas como 5 glucosiltransferasas. Estas enzimas pertenecen a la familia de las glicosil-hidrolasas (GH70) con cuatro tipos de dominios estructurales en base a su secuencia de aminoácidos: (i) un péptido señal en su extremo amino terminal, (ii) una región variable, (iii) un dominio catalítico y (d) una región carboxilo terminal (van Hijum, Kralj, Ozimek, Dijkhuizen y van Geel-Schutten (2006) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70:157–176). 10

Las dextransacarasas (EC 2.4.1.5) son enzimas secretadas al medio o que permanecen unidas a la superficie de la célula. Estas enzimas sintetizan dextrano utilizando como sustrato sacarosa y catalizando la siguiente reacción química: sacarosa+(1,6-α-D-glucosil)n→D-fructosa+(1,6-α-D-glucosil)n+1. Los dextranos presentan diferentes tipos de 15 ramificaciones: α-(1→3); α-(1→2) o α-(1→4) y presentan un elevado peso molecular (superior a 106 Da). En presencia de aceptores eficientes, como la maltosa, la reacción se desplaza hacia la síntesis de oligosacáridos de interés como prebióticos (Ruiz-Matute, Brokl, Sanz, Soria, Côté, Collins y Rastal (2011) J. Agric. Food Chem., 59:3693-3700). Las dextransacarasas de las especies de Streptococcus en general se producen de forma 20 constitutiva, mientras que las de las especies de Leuconostoc son inducidas por sacarosa, aunque se han conseguido mutantes constitutivos.

El dextrano sintetizado por Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F fue uno de los primeros biopolímeros producidos a escala industrial con varias aplicaciones en 25 biotecnología y medicina. El dextrano se lleva empleando hace mucho tiempo como espesante, como sustituto de plasma sanguíneo y como matriz en columnas de Sephadex® (Naessens, Cerdobbel, Soetaert y Vandamme (2005) J. Chem. Technol. Biotechnol. 80:845–860). En la actualidad, el número de bacterias productoras de dextrano ha ido en aumento junto a nuevas aplicaciones del mismo como prebiótico, agente bioactivo y/o agente 30 anticorrosión, en cosmética y en productos horneados (US0059633; US6399119; US8263380; US0165290).

Ciertos tipos de dextrano, como el dextrano sulfatado, también se han empleado para combatir ciertos virus como son el del dengue (Alen y Schols (2012) J. Tropical Medicine 35

doi:10.1155/2012/628475) ó el virus de la influenza (Yamada, Moriishi, Haredy, Takenaka, Mori, Yamanishi y Okamoto (2012) Antiviral Res. 96:344–352).

Por otra parte, actualmente en acuicultura las enfermedades infecciosas de origen vírico provocan grandes pérdidas económicas. Entre los virus de salmónidos más relevantes se 5 encuentran, el virus de la necrosis pancreática infecciosa (VNPI) y el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (VNHI) que son capaces de inducir persistencia, y en animales supervivientes a la infección se produce un estado de portador asintomático, que implica mayor dificultad para la erradicación del virus. Además, el VNPI se está aislando últimamente en el medio marino en especies de alto valor comercial, como el salmón del 10 Atlántico, al que causa altas mortalidades. El impacto económico es aún mayor si además se producen coinfecciones con otro virus, como por ejemplo el de la anemia infecciosa del salmón (VAIS), un orthomixovirus emergente en países productores.

Aunque existen vacunas de ácido desoxirribonucleico (ADN) probadas a nivel de laboratorio 15 que han mostrado ser eficaces (de las Heras, Rodríguez Saint-Jean y Pérez-Prieto (2010) Fish Shellfish Immunol. 27:120-129), en la actualidad sólo se está utilizando en piscifactorías una vacuna de ADN en Canadá contra el VNHI (Salonius, Simard, Harland y Ulmer (2007) Curr. Opin. Invest. Drugs 8:635–641).

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En base a lo anterior, la invención que aquí se presenta tiene gran interés dentro de la búsqueda de estrategias para combatir las infecciones víricas, como son las vacunas y los suplementos dietéticos incluyendo prebióticos, que ayuden a mejorar la resistencia contra las enfermedades infecciosas en acuicultura.

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EXPLICACION DE LA INVENCION

Breve descripción de la invención

Un objeto de la invención lo constituye una secuencia de nucleótidos, en adelante secuencia 30 de nucleótidos de la invención, caracterizada por que se corresponde con la secuencia SEQ ID NO: 4.

Una realización particular de la invención la constituye una secuencia de nucleótidos caracterizada por que presenta una identidad del 80% con la secuencia de nucleótidos SEQ 35

ID NO: 4 y por que codifica una enzima dextransacarasa útil para la obtención de exopolisacáridos.

Otro objeto de la invención la constituye un vector de expresión tipo procariota o eucariota, en adelante vector de expresión de la invención, que comprende la SEQ ID NO: 4, o una 5 secuencia de nucleótidos caracterizada por que presenta una identidad del 80% con la SEQ ID NO: 4 y que codifica una enzima dextransacarasa útil para la obtención de exopolisacáridos.

Una realización particular de la invención la constituye el vector de expresión de la 10 invención, que comprende la SEQ ID NO: 6.

Otro objeto de la invención lo constituye una enzima con actividad dextransacarasa útil para la obtención de un exopolisacárido, en adelante enzima dextransacarasa de la invención, que está codificada por la secuencia de nucleótidos de la invención, o por una secuencia de 15 nucleótidos caracterizada por que presenta una identidad del 80% con la SEQ ID NO: 4.

Otra realización particular de la invención la constituye la enzima dextransacarasa de la invención constituida por la SEQ ID NO: 5.

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Otro objeto de la invención lo constituye una célula útil para obtener exopolisacáridos, en adelante célula de la invención, que comprende una secuencia de nucleótidos de la invención, preferentemente la SEQ ID NO: 4, o un vector de expresión de la invención.

Otra realización particular de la invención la constituye la célula de la invención que se 25 corresponde con la cepa Lactobacillus sakei MN1 con CECT 8329.

Otro objeto de la invención lo constituye el uso de la célula de la invención para la obtención de una enzima con actividad dextransacarasa que comprende la SEQ ID NO: 5.

30

Otro objeto de la invención lo constituye el uso de la célula de la invención en un procedimiento útil para la obtención de un exopolisacárido.

Otro objeto de la invención lo constituye un procedimiento de obtención de un exopolisacárido celular, en adelante procedimiento de obtención de un exopolisacárido 35

celular de la invención, donde se usa la célula de invención y que comprende las siguientes etapas:

a) cultivar una bacteria L. sakei en medio de cultivo suplementado con al menos un azúcar, seleccionado de entre sacarosa y maltosa, hasta alcanzar la fase estacionaria de crecimiento del exopolisacárido; 5

b) eliminar las bacterias por centrifugación y separar el sobrenadante;

c) añadir un alcohol, preferentemente etanol, o una cetona, preferentemente acetona, para obtener un precipitado del exopolisacárido; y

d) centrifugar el precipitado del paso (c) para eliminar el sobrenadante, y obtener un exopolisacárido precipitado. 10

Otro objeto de la invención lo constituye un procedimiento de obtención de un exopolisacárido mediante una enzima dextransacarasa, en adelante procedimiento de obtención de un exopolisacárido enzimático de la invención, donde se utiliza una enzima de actividad dextransacarasa de la invención. 15

Otro objeto de la invención lo constituye un exopolisacárido, en adelante exopolisacárido de la invención, que se obtiene por cualquiera de los procedimientos de obtención un exopolisacárido de la invención.

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Otro objeto de la invención lo constituye el uso del exopolisacárido de la invención, en adelante uso del exopolisacárido de la invención, como agente antiviral frente a virus de especies piscícolas, preferentemente salmónidos.

Otro objeto de la invención lo constituye el uso del exopolisacarido de la invención para la 25 elaboración de una composición farmacéutica veterinaria o alimentaria útil para la prevención o tratamiento de infecciones virales de especies piscícolas.

Otro objeto de la invención lo constituye una composición veterinaria o alimentaria útil para la prevención o tratamiento de infecciones virales de especies piscícolas, en adelante 30 composición de la invención, que comprende un exopolisacárido de la invención.

Descripción detallada

La presente invención se basa en la identificación de una nueva enzima con actividad 35 dextransacarasa, obtenida a partir que una nueva cepa de Lactobacillus sakei aislada de

productos cárnicos (ver Ejemplo 1), que puede ser utilizada en un procedimiento para producir un exopolisacárido (ver Ejemplo 4), que sorprendentemente se ha observado que presenta actividad antiviral frente a virus de especies piscícolas (ver Ejemplo 7). La detección de la producción del exopolisacárido por la cepa bacteriana de la invención en placas conteniendo sacarosa indica que el enzima de secuencia SEQ ID NO: 5, que es 5 responsable de la síntesis u obtención de dicho exopolisacárido, es una dextransacarasa.

Las ventajas técnicas de la invención se describen a continuación:

a) con respecto al procedimiento de obtención y purificación del exopolisacárido:

- resulta económico, sencillo y presenta un alto rendimiento (2 g L-1 de cultivo); 10

b) con respecto al exopolisacárido:

- no presenta toxicidad en líneas celulares de peces,

- posee una elevada solubilidad en agua (superior a 10 mg mL-1),

- posee un alto grado de pureza (superior al 95%),

- posee un elevada masa molecular (superior a 2 x 106 Da); 15

c) con respecto al uso como antivírico del exopolisacárido:

- presenta un efecto antiviral in vitro frente a VNHI significativamente superior al que producen otros dextranos producidos por otras bacterias lácticas y algún dextrano comercial,

- su alta solubilidad permite una fácil administración a través de la incorporación como aditivos en alimentos funcionales para los peces o como productos veterinarios. 20

Las técnicas de cultivo en medio sólido permiten el crecimiento de determinadas bacterias. Más concretamente, la utilización de productos cárnicos, medios de cultivo CDM y sacarosa y el uso de microscopia electrónica de transmisión, han permitido el crecimiento de determinadas colonias mucosas bacterianas en dichos medios, la detección de productos 25 derivados de su metabolismo como exopolisacáridos y la identificación de la bacteria de la invención (ver Ejemplo 1 y Figura 1).

Por el término “exopolisacárido” se entiende un polímero compuesto de subunidades mayoritariamente monosacarídicas secretado por un organismo. 30

Por el término “medio de cultivo” se entiende un alimento sólido o líquido conteniendo los nutrientes requeridos para el crecimiento de la bacteria.

Por el término “sacarosa” se entiende un disacárido α-D-glucopiranosil-(1-2)-β-D-35 fructofuranósido.

Por el término “dextransacarasa o DsrLS” se entiende un enzima capaz de catalizar la síntesis de un exopolisacárido utilizando sacarosa como sustrato.

Como punto de partida de la presente invención, se sitúa en primer lugar una secuencia de nucleótidos, en adelante secuencia de nucleótidos de la invención, caracterizada por que se 5 corresponde con la secuencia SEQ ID NO: 4.

La secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4 del gen dsrLS de la cepa Lactobacillus sakei MN1 con CECT 8329 es sustancialmente diferente a los genes de otras bacterias incluyendo el gen gtfKg15 (Kralj, van Geel-Schutten, Dondorff, Kirsanovs, van der Maarel y Dijkhuizen 10 (2004) Microbiology 150:3681-3690) de la cepa productora de dextrano Lactobacillus sakei Kg15.

Una realización particular la constituye cualquier secuencia de nucleótidos que comprende una identidad del 80% con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4 y que codifica una 15 enzima dextransacarasa útil para la obtención de exopolisacáridos.

Es de esperar que la identidad global de los genes que codifican una enzima dextransacarasa útil para la obtención de exopolisacáridos, sea igual o mayor de un 50%, y más concretamente al nivel de la secuencia polinucleotídica correspondiente a la SEQ ID 20 NO: 4 sea del 80% o mayor. Además, el grado de identidad o la homología existente entre las secuencias de aminoácidos de la invención y otras secuencias de aminoácidos pueden determinarse por métodos conocidos en estado de la técnica.

El término “homología”, tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la 25 semejanza entre dos estructuras debida a una ascendencia evolutiva común, y más concretamente a la semejanza o identidad entre los nucleótidos de posiciones equivalentes en dos o más polinucleótidos.

El término “identidad”, tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción 30 de nucleótidos idénticos entre dos polinucleótidos que se comparan. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa BLASTP o BLASTN, ClustalW y FASTA. Puesto que dos proteínas se consideran homólogas si tienen el mismo origen evolutivo, en general, se asume que valores superiores de similitud o identidad del 80% indican estructuras 35

homólogas. Podemos considerar, por tanto, que porcentajes de identidad de, al menos, un 80% mantendrán las mismas propiedades de dicho polipéptido.

Con la información suministrada en la presente invención un experto en la materia es capaz de identificar secuencias de nucleótidos homólogas a las descritas en la presente invención. 5 Por tanto, la secuencia de nucleótidos de la invención, constituye la secuencia codificante de cualquier variante modificada con las características anteriormente descritas, cuya secuencia de nucleótidos se corresponde a:

a) moléculas de ácido nucleico de la secuencia polinucleotídica aislada o en su cadena complementaria, 10

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar con una secuencia polinucleotídica de (a), o

c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a la degeneración del código genético.

15

Otro objeto de la invención la constituye un vector de expresión tipo procariota o eucariota, en adelante vector de expresión de la invención, que comprende la SEQ ID NO: 4, o una secuencia de nucleótidos caracterizada por que presenta una Identidad del 80% con la SEQ ID NO: 4 y que codifica una enzima dextransacarasa útil para la obtención de exopolisacáridos. 20

Una realización particular de la invención la constituye el vector de expresión de la invención, que comprende la SEQ ID NO: 6.

Una realización particular del vector procariota se refiere al vector de expresión de la 25 invención constituido por el plásmido denominado pMN1, en adelante plásmido de la invención, presente en la cepa bacteriana de la invención (cepa Lactobacillus sakei MN1 con CECT 8329) y detectado mediante la técnica de hibridación de Southern. El plásmido es portador del gen dsrLS y se caracteriza por poseer una masa molecular de 15 kDa y un replicón caracterizado por comprender la SEQ ID NO: 6 y que incluye los genes repA y 30 repB. Sus productos génicos RepA y RepB se caracterizan por comprender las secuencias SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, y están implicados en la replicación del plásmido.

El replicón de pMN1 es sustancialmente diferente de otros replicones plasmídicos y pertenece a la familia del plásmido pUCL287 (Benachour, Frère, Flahaut, Novel y Auffray 35 (1997) Mol. Gen. Genet. 255: 504-513).

Por el término “replicón” se entiende la región mínima requerida para la replicación del plásmido e incluye el origen de replicación y los genes que codifican las proteínas RepA y RepB.

La secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4 de la invención puede obtenerse a partir de la 5 cepa bacteriana de la invención o de otras cepas bacterianas por procedimientos biotecnológicos de obtención y síntesis de secuencias de nucleótidos ampliamente conocidos en el estado de la técnica, así como secuencias de nucleótidos de elevada homología a la secuencia de nucleótidos de la invención que codifiquen enzimas con actividad dextransacarasa. 10

El análisis de secuencias de varios nucleótidos de genes codificantes de dextrancarasas bacterianas, permite la detección de una región conservada en la secuencia codificante del centro catalítico de las enzimas que permite el diseño de oligonucleótidos que se utilizan para amplificar fragmentos de ADN y detectar genes dsr. Concretamente, el uso de una 15 preparación de ADN genómico o de ADN plasmídico de la cepa bacteriana de la invención permite el diseño de los oligonucleótidos dsrF y dsrR que pueden ser utilizados para detectar genes dsr.

En bacterias lácticas – por ejemplo, bacterias de los géneros Lactobacillus y Leuconostoc y 20 preferentemente Lactobacillus plantarum MMB2 y Leuconostoc mesenteroides RTF10- podrían identificarse estas secuencias mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:

i. obtener preparaciones de ADN genómico de la bacteria objeto de estudio;

ii. generar un amplicón utilizando el oligonucleótido dsrF que comprende la secuencia 25 SEQ ID NO: 2 y el oligonucleótido dsrR que comprende la secuencia SEQ ID NO: 3 y los ADN obtenidos en (i) mediante la reacción de polimerización en cadena;

iii. determinar la secuencia de nucleótidos del amplicón;

iv. fraccionar los ADN obtenidos en (i) en gel de agarosa;

v. transferir los ADN fraccionados en (iv) a una membrana, y 30

vi. realizar una hibiridación de Southern utilizando los amplicones generados en (ii).

Otro objeto de la invención lo constituye una enzima con actividad dextransacarasa útil para la obtención de un exopolisacárido, en adelante enzima dextransacarasa de la invención, que está codificada por la secuencia de nucleótidos de la invención, o por una secuencia de 35 nucleótidos caracterizada por que presenta una identidad del 80% con la SEQ ID NO: 4.

Otra realización particular de la invención la constituye la enzima dextransacarasa de la invención constituida por la SEQ ID NO: 5.

Otro objeto de la invención lo constituye una célula útil para obtener exopolisacáridos, en adelante célula de la invención, que comprende una secuencia de nucleótidos de la 5 invención, preferentemente la SEQ ID NO: 4, o un vector de expresión de la invención.

Otro objeto particular lo constituye la célula de la invención que se corresponde con una cepa Lactobacillus sakei con capacidad para producir un exopolisacárido, preferentemente una cepa bacteriana Lactobacillus sakei que se aísla de fiambre de magro de cerdo. 10

Otra realización particular de la invención lo constituye la célula de la invención que se corresponde con la cepa Lactobacillus sakei MN1 con CECT 8329. Esta cepa bacteriana Lactobacillus sakei MN1 ha sido depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT 8329) siguiendo el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del 15 Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes, en fecha 22 de abril de 2013.

Estas células son útiles herramientas biotecnológicas para la producción del vector de expresión de la invención así como de la proteína de SEQ ID NO: 5 de la invención. 20

Otro objeto de la invención lo constituye el uso de la célula de la invención para la obtención de una enzima con actividad dextransacarasa que comprende la SEQ ID NO: 5.

Otro objeto de la invención lo constituye el uso de la célula de la invención en un 25 procedimiento útil para la obtención de un exopolisacárido.

Otro objeto de la invención lo constituye un procedimiento de obtención de un exopolisacárido celular, en adelante procedimiento de obtención de un exopolisacárido celular de la invención, donde se usa la célula de invención y que comprende las siguientes 30 etapas:

a) cultivar una bacteria L. sakei en medio de cultivo suplementado con al menos un azúcar, seleccionado de entre sacarosa y maltosa, hasta alcanzar la fase estacionaria de crecimiento del exopolisacárido;

b) eliminar las bacterias por centrifugación y separar el sobrenadante; 35

c) añadir un alcohol, preferentemente etanol, o una cetona, preferentemente acetona, para obtener un precipitado del exopolisacárido; y

d) centrifugar el precipitado del paso (c) para eliminar el sobrenadante, y obtener un exopolisacárido precipitado.

5

Otro objeto particular de la invención lo constituye el procedimiento de obtención de un exopolisacárido de la invención celular que incluye una fase de purificación posterior a la etapa (d) y que comprende las siguientes etapas:

i. resuspender el exopolisacárido precipitado según la etapa (d) en agua ultrapura;

ii. someter al exopolisacárido a una diálisis utilizando membranas de 12-13 kDa, con 10 cambios de agua; y

iii. congelar a una temperatura entre -60 y -80 ºC y liofilizar.

Otra realización particular de la invención la constituye el procedimiento de obtención de un exopolisacárido de la invención celular donde la cepa L. sakei de la etapa (a) es la cepa 15 Lactobacillus sakei MN1 con CECT 8329.

Por el término “alcohol” se entiende una molécula que contiene un grupo hidroxilo unido a un radical alifático o a alguno de sus derivados.

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Por el término “cetona” se entiende una molécula caracterizada por poseer un grupo funcional carbonilo unido a dos átomos de carbono.

Para el experto en la materia resultará obvio que el uso de la célula de la invención en el procedimiento de síntesis u obtención de la invención o de la enzima dextransacarasa de la 25 invención, con las modificaciones pertinentes, permitirá de igual manera la obtención de un exopolisacárido.

Para la obtención del dextrano (exopolisacárido), resulta necesaria la presencia de sacarosa (ver Figura 1A, derecha) en el medio de cultivo, ya que en ausencia de dicho azúcar las 30 bacterias muestran un fenotipo no mucoso (ver Figura 1A, izquierda).

En una realización preferida del procedimiento de obtención de exopolisacárido celular de la invención, se utiliza sacarosa como azúcar en la etapa (a), se añade etanol en la etapa (b) y se obtiene un exopolisacárido que es un dextrano (la eficiencia es buena, en cantidades superiores a 2 g L-1, y tras el proceso de purificación descrito se obtiene una cantidad de 0,7 35 g L-1).

Por el término “dextrano” se entiende un homopolisacárido formado por moléculas de glucosa unidas mediante enlaces α-(1,6) en su cadena principal y con un bajo porcentaje de ramificación α-(1,2), α-(1,3) ó α-(1,4). Ejemplo de un dextrano, aunque sin limitarse, es aquel que comprende cadenas prácticamente lineales de α-(1,6)-glucopiranosa (90%) con ramificaciones α-(1,3) (10%) y una masa molecular superior a 2 x 106 Da, y que presenta 5 una gran diferencia de tamaño con otros productos de similar naturaleza como el dextrano comercial T2000 y el dextrano de Lactobacillus sakei MN1.

La caracterización del exopolisacárido obtenido a través del procedimiento de obtención de un exopolisacárido celular de la invención, presenta un espectro de infrarrojos en el que se 10 observan dos bandas de absorción más intensa, una a 849 cm−1 y otra a 916 cm−1, ambas características de α–anómeros, así como una composición exclusivamente compuesta por moléculas de glucosa. Adicionalmente, genera derivados parcialmente metilados y acetilados de un (1→6)-glucano con aproximadamente 10% de sustituciones en la posición O-3 con cadenas laterales compuestas por un residuo único de glucosa. 15

Otro objeto de la invención lo constituye un procedimiento de obtención de un exopolisacárido mediante una enzima dextransacarasa, en adelante procedimiento de obtención de un exopolisacárido enzimático de la invención, donde se utiliza una enzima de actividad dextransacarasa de la invención. 20

Otro objeto de la invención lo constituye el exopolisacárido, en adelante exopolisacárido de la invención, obtenido a través del procedimiento de obtención de la invención, ya sea celular o enzimático, donde preferentemente el exopolisacárido es un dextrano.

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El exopolisacárido de la invención consigue un 50% de inhibición, frente a una dosis infectiva viral 50% (TCID50 mL-1) de 1000, con un tiempo de infección de 3 días a 15 ºC con VNPI, utilizando una concentración de 1000 µg mL-1. Estos resultados contrastan con los obtenidos con otros exopolisacáridos, ensayados en paralelo, como el dextrano comercial T2000 o el dextrano MMB2, que necesitan el triple y el doble de concentración, 30 respectivamente, para obtener resultados iguales (Tabla 1).

Además, el exopolisacárido de la invención consigue un 50% de inhibición, frente a una dosis infectiva viral 50% (TCID50 mL-1) de 1000, con un tiempo de infección de 7 días a 20ºC con VNHI, utilizando una concentración de 500 µg mL-1. Estos resultados contrastan con los 35

obtenidos por otros dextranos como el comercial T2000 o el MMB2 que necesitan entre 1,5 y 10 veces más concentración, respectivamente, para obtener resultados iguales (Tabla 2).

Así, otro objeto de la invención lo constituye el uso del exopolisacárido de la invención, en adelante uso del exopolisacárido de la invención, como agente antiviral frente a virus de 5 especies piscícolas, preferentemente salmónidos.

Ejemplos de especies piscícolas con aprovechamiento comercial, sobre las que puede ser de aplicación el exopolisacarido de la invención, son aunque sin limitarse,
Salmo trutta,
Oncorhynchus mykiss,
Oncorhynchus aguabonita, Oncorhynchus clarkii henshawi, 10
Oncorhynchus clarkii clarkii, Salmo salar, Psetta maxima,
Argyrosomus regius,
Sciaena umbra, Dicentrarchus labrax,
Dicentrarchus punctatus o Sparus aurata.

Por el término “agente antiviral” se entiende el compuesto o sustancia capaz de inhibir el ciclo de replicación viral. 15

Otro objeto particular de la invención lo constituye el uso del exopolisacárido de la invención donde el virus pertenece a los géneros Birnavirus o Rhabdovirus, y preferentemente es el virus de la necrosis pancreática infecciosa (VNPI) o el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (VNHI). 20

Otro objeto de la invención lo constituye el uso del exopolisacarido de la invención para la elaboración de una composición farmacéutica veterinaria o alimentaria útil para la prevención o tratamiento de infecciones virales de especies piscícolas.

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Otro objeto de la invención lo constituye una composición farmacéutica veterinaria o alimentaria útil para la prevención o tratamiento de infecciones virales de especies piscícolas, en adelante composición de la invención, que comprende un exopolisacárido de la invención.

30

Otro objeto particular de la invención lo constituye la composición de la invención donde el virus pertenece a los géneros Birnavirus o Rhabdovirus, y preferentemente es el virus de la necrosis pancreática infecciosa (VNPI) o el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (VNHI).

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El exopolisacárido de la invención puede utilizarse como un aditivo alimentario de los alimentos o piensos que se utilizan para la alimentación de los peces en piscifactorías, principalmente salmónidos, o elaborarse como composiciones farmacéuticas veterinarias para su administración para prevenir o tratar infecciones virales.

5

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1.- Identificación de una bacteria productora de exopolisacáridos. (A) Fotografía de las colonias de la cepa bacteriana de la invención, en adelante L. sakei MN1, crecidas en placas de medio definido CDM suplementadas con 0,8% glucosa (izquierda) o con 0,8% sacarosa 10 (derecha) condición óptima para la producción de exopolisacárido. (B) Análisis mediante microscopía electrónica de transmisión de las bacterias contenidas en las colonias mostradas en (A). Se muestran secciones ultrafinas de las bacterias teñidas con rojo de rutenio.

Figura 2.- Detección de genes codificantes de dextransacarasas en bacterias lácticas 15 mediante hibridación de Southern. Preparaciones de ADN plasmídico de Leuconostoc mesenteroides RTF10 (RTF10), Lactobacillus plantarum MMB2 (MMB2), Lactobacillus sakei MN1 (MN1) y de Escherichia coli V517 (C, estirpe utilizada como estándar de peso molecular, porque contiene varios plásmidos) teñidas con bromuro de etidio (A) o hibridadas con un fragmento de ADN de 696 pb, producto de amplificación del gen dsrLS con los 20 oligonucleótidos dsrR y dsrF (B). Se indica la migración electroforética, expresada en kilo pares de bases (kb), de los plásmidos presentes en la estirpe control Escherichia coli V517 y de los plásmidos de las bacterias lácticas detectados por hibridación y portadores de los genes codificantes de las enzimas productoras de dextrano.

25

Figura 3.- Análisis de la producción de exopolisacárido por L. sakei MN1 durante su crecimiento en medio CDM. Se muestra el crecimiento detectado espectrofotométricamente (DO600 nm, ●) y los niveles de exopolisacárido (barras grises).

Figura 4.- Caracterización fisicoquímica del dextrano producido por L. sakei MN1. (A) 30 Espectro de infrarrojos. (B) Tipo de enlaces deducidos por análisis de metilación. (C) Estructura del dextrano.

Figura 5.- Análisis por resonancia magnética nuclear del dextrano producido por L. sakei MN1. (A) Se muestra una comparación de los espectros 2D-DOSY del dextrano 35 producido por MN1 (MN1) y del dextrano comercial T2000 (T2000). El alineamiento se

realizó superponiendo los espectros y utilizando como referencia el agua deuterada (D2O) presente en las muestras. (B) Superposición de las proyecciones mostradas en (A) de las señales en la dimensión de difusión. Se indican los coeficientes de dispersión de MN1, T2000 y D2O.

5

A lo largo de la descripción y de las reivindicaciones la palabra “comprende” y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos o pasos. Para el experto en la materia, otros aspectos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.

10

MODO DE REALIZACION DE LA INVENCION

Los siguientes ejemplos se incluyen con fines ilustrativos y no limitativos.

EJEMPLO 1: Identificación y caracterización de la bacteria productora de 15 exopolisacárido aislada de fiambre magro de cerdo denominada L. sakei MN1.

1.1. Identificación

Para la identificación de bacterias productoras de exopolisacárido aisladas de productos 20 cárnicos se utilizó la técnica de cultivo en medio sólido. Se realizó la siembra en placas de Petri conteniendo medio de cultivo CDM (Sánchez et al. (2008) Appl. Environ. Microbiol. 74:1136-1144) y agar al 1,5%, en el cual dichas bacterias generan colonias con aspecto mucoso. Los resultados indicaron que para que dicha detección tuviese lugar, fue necesaria la presencia de sacarosa (ver Figura 1A, derecha) en el medio de cultivo, ya que en 25 ausencia de dicho azúcar las bacterias mostraron un fenotipo no mucoso (ver Figura 1A, izquierda). La producción fue confirmada mediante el análisis a nivel celular de las bacterias contenidas en las colonias por microscopia electrónica de transmisión (Notararigo et al. (2013) Carbohydr. Polym. 93:57-64). Sólo se detectó la presencia de moléculas de exopolisacárido asociadas a la pared bacteriana o rodeando las células en los cultivos 30 crecidos en presencia de sacarosa (ver Figura 1B).

1.2. Caracterización

Las bacterias contenidas en las colonias fueron identificadas molecularmente mediante: (i) la 35 extracción del ADN genómico; (ii) la amplificación del ADN codificante del ARNr 16S utilizando oligonucleótidos que contienen las secuencias flanqueantes conservadas; y (iii) la

determinación de la secuencia de nucleótidos del amplicón (SEQ ID NO: 1). La caracterización fue realizada por la empresa SECUGEN S.L. (Madrid). Los resultados obtenidos permitieron determinar que la bacteria pertenecía al género Lactobacillus y a la especie Lactobacillus sakei y se la denominó Lactobacillus sakei MN1.

5

EJEMPLO 2: Diseño de oligonucleótidos capaces de detectar genes codificantes de dextransacarasas, e identificación y caracterización del gen dsrLS de L. sakei MN1.

2.1. Diseño de oligonucleótidos capaces de detectar genes codificantes de dextransacarasas 10

La detección de la producción de EPS por L. sakei MN1 en placas conteniendo sacarosa indicaba que el enzima responsable de la síntesis era una dextransacarasa. Por este motivo se analizaron las secuencias de nucleótidos de 14 genes codificantes de dextransacarasas bacterianas depositadas en el banco de datos GenBank del National Center for 15 Biotechnology (NCBI, USA) utilizando el programa BLAST (NCBI, USA). La detección de una región conservada incluida en la secuencia codificante del centro catalítico de los enzimas permitió diseñar los oligonucleótidos dsrF (SEQ ID NO: 2) y dsrR (SEQ ID NO: 3), que fueron utilizados para amplificar un fragmento de ADN de 696 pb. Se empleó como molde una preparación de ADN genómico o de ADN plasmídico de L. sakei MN1 y el enzima 20 Phusion Hot Start High Fidelity Polymerase (Finnzymes). Las condiciones de la reacción de amplificación fueron las siguientes: (i) una desnaturalización inicial de 30 segundos a 98 ºC; (ii) 35 ciclos de desnaturalización 10 segundos a 98ºC, hibridación 20 segundos a 64,4 ºC y extensión 30 segundos a 72 ºC; y (iii) una extensión final de 10 minutos a 72 ºC. En las dos amplificaciones se detectó el amplicón esperado indicando que el gen poseía una 25 localización plasmídica. Además, también se obtuvo el amplicón cuando se analizó el genoma de dos bacterias lácticas, Lactobacillus plantarum MMB2 y Leuconostoc mesenteroides RTF10, productoras de exopolisacáridos y aisladas de productos cárnicos. Estos resultados mostraron la utilidad de los oligonucleótidos dsrR y dsrF para detectar genes dsr de igual modo que los oligonucleótidos degenerados descritos por Kralj y cols. 30 (Kralj,Van Geel-Schutten, Van der Maarel y Dijkhuizen (2003) Biocatalysis and Biotransformation, 21:181-187) utilizados para la detección de genes codificantes de dextransacarasas de bacterias lácticas pertenecientes al género Lactobacillus. La determinación de la secuencia de nucleótidos de los tres amplicones reveló una identidad total de los genes de MMB2 y RTF10 y tan sólo una homología del 56,5% con su homónimo 35 de MN1.

2.2. Identificación y caracterización

Se identificó y determinó la secuencia de nucleótidos del gen codificante de la dextransacarasa de L. sakei MN1. El gen fue denominado dsrLS y contuvo 5.304 nucleótidos (SEQ ID NO: 1). También a partir de dicha secuencia se infirió la secuencia de 5 1.767 aminoácidos de la dextransacarasa DsrLS (SEQ ID NO:5). El análisis de dichas secuencias frente a aquellas depositadas en los bancos de datos del NCBI (USA) con el programa BLAST reveló homologías con otros genes bacterianos, mostrando la mayor homología con el gen gtf1624 de L. curvatus TMW 1.624 (GenBank número de acceso HE972512.1) y su producto génico. Con respecto a la secuencia gtf1624 de (5094 nt), 10 presentó una diferencia de 215 nucleótidos y de 77 aminoácidos, respectivamente, con el gen y la proteína de L. sakei MN1. Dicha diferencia se situó entre las dos dextransacarasas en la región C-terminal. Por otro lado, el gen dsrLS y su producto de MN1 presentaron también elevada homología con el gen gtfkg15 (Kralj, van Geel-Schutten, Dondorff, Kirsanovs, van der Maarel y Dijkhuizen (2004) Microbiology 150:3681-3690;) y el enzima 15 codificado por él, sintetizado por L. sakei Kg15 productora de dextrano. La divergencia entre las moléculas de estas dos cepas fue de 525 nucleótidos y de 176 aminoácidos, de los cuáles, 26 se encontraron en la región N-terminal, 4 en la región central y 146 en la región C-terminal de la dextransacarasa. En consecuencia, la mayor divergencia de dsrLS con otras dextransacarasas estuvo localizada en el dominio C-terminal compuesto por regiones 20 repetidas. Esta región parece estar implicada en la procesividad del enzima, al ser responsable de la unión de la proteína al dextrano sintetizado por ella.

EJEMPLO 3: Identificación de los plásmidos portadores de los genes dsr

25

Con el objeto de determinar la localización de los genes dsr en los genomas de L. sakei MN1, L. plantarum MMB2 y L. mesenteroides RTF10, se procedió a realizar un análisis mediante la técnica de hibridación de Southern utilizando preparaciones de ADN plasmídico (ver Figura 2) procedente de las tres bacterias lácticas.

30

El ADN plasmídico fue preparado a partir de cultivos crecidos a una densidad óptica de 1 medida a 600 nm. Las bacterias sedimentadas por centrifugación fueron concentradas 5 veces por resuspensión en una solución de sacarosa al 25% conteniendo 30 mg mL-1 de lisozima, 120 U mL-1 de mutanolisina y 40 µg mL-1 RNasa A. La lisis celular se obtuvo mediante una incubación de 15 minutos a 37 ºC. La desnaturalización del ADN cromosómico 35 se realizó mediante un tratamiento de 7 minutos a temperatura ambiente con dodecil sulfato

sódico al 2% y 0,13 N de hidróxido sódico. La eliminación del ADN cromosómico y de restos celulares se realizó por precipitación con acetato sódico 1 M a pH 4,8 y centrifugación a 15.700 x g durante 15 minutos a 4 ºC. El ADN plasmídico, contenido en los sobrenadantes, fue concentrado por tratamiento con isopropanol al 42% y centrifugación a 15.700 x g durante 15 minutos a 4 ºC. Las formas circulares, y superenrolladas de los plásmidos 5 presentes en los precipitados fueron purificadas y desproteínizadas por resuspensión en agua, adición de 1,8 M de acetato amónico, 0,12 mg mL-1 de bromuro de etidio y una mezcla 1:1 de fenol:cloroformo/alcohol isoamílico (24/1) al 40% y centrifugación a 15.700 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los plásmidos contenidos en las fases acuosas fueron precipitados con etanol absoluto durante 12 horas a -20 ºC y centrifugación a 11.269 10 x g durante 45 minutos a -10 ºC, desecados y finalmente resuspendidos en 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA.

Las preparaciones plasmídicas fueron fraccionadas en gel de agarosa al 0,7%. El método empleado para realizar la hibridación de Southern fue el previamente descrito para la 15 detección de genes implicados en la síntesis de β-glucanos (Werning, Ibarburu, Dueñas, Irastorza, Navas, López, (2006) Journal of Food Protection 69:161-169), pero utilizando una temperatura de hibridación de 45 ºC. Como sonda para la hibridación se utilizó el amplicón obtenido con el ADN de L. sakei MN1 y los oligonucleótidos dsrF y dsrR. Se detectó hibridación con las tres preparaciones plasmídicas, siendo crítica para la detección la 20 temperatura de hibridación. En cada caso la banda detectada apareció localizada en una posición distinta (ver Figura 2B). La migración de las bandas de hibridación mostró correspondencia con plásmidos detectados por tinción del gel con bromuro de etidio (ver Figura 2A). La masa molecular de dichos plásmidos fue inferida por su migración y utilizando como referencia la de los plásmidos de la estirpe V517 de Escherichia coli (ver Figura 2A, 25 carril C). Así, se detectaron plásmidos de 15 kb, 19 kb y 22 kb portadores del gen dsr en los genomas de L. sakei MN1, L. plantarum MMB2 y L. mesenteroides RTF10, respectivamente.

El plásmido de L. sakei MN1 fue denominado pMN1 y posteriormente caracterizado por la determinación de la secuencia de nucleótidos localizada corriente arriba del gen dsrLS. El 30 análisis de la secuencia de una región de ADN de 1172 nt frente a aquellas depositadas en los bancos de datos del NCBI (USA) con el programa BLAST reveló homologías con los replicones de la familia del plásmido plásmido pUCL287 (Benachour, Frère, Flahaut, Novel y Auffray (1997) Mol. Gen. Genet. 255: 504-513), que replican por el mecanismo de tipo theta. Dicha región contiene el origen de replicación y los genes repA y repB, que codifican las 35

proteínas RepA y RepB implicadas en la iniciación de la replicación del plásmido y en los mecanismos de partición, que son responsables de su estabilidad segregacional.

EJEMPLO 4: Producción de EPS por L. sakei MN1.

5

Para determinar la producción de EPS por L. sakei MN1, se cultivó la bacteria a 30 ºC en medio Man Rogosa Sharpe (MRS, Pronadisa) con sacarosa al 2% hasta una densidad óptica de 1 medida a 600 nm y se realizó una dilución 1/100 de dicho cultivo en medio definido CDM suplementado con 0,8% de sacarosa. Se tomaron muestras cada hora, durante 8 horas, y se determinaron el crecimiento bacteriano y la producción de EPS (ver 10 Figura 3). Para determinar la producción de EPS se eliminaron las células por centrifugación a 9.300 x g durante 10 minutos a 4 ºC y a los sobrenandantes se les añadieron tres volúmenes de etanol absoluto para precipitar el EPS durante 12 horas a -20 ºC. Posteriormente los sobrenadantes fueron centrifugados a 9.300 x g durante 20 minutos a 4 ºC y lavados dos veces con etanol absoluto al 80 %. Una vez secos, fueron resuspendidos 15 en agua destilada estéril, calentados durante 10 minutos a 30 ºC y cuantificados mediante el método del fenol-sulfúrico descrito por Dubois y colaboradores (Dubois, Gilles, Hamilton, Rebers y Smith (1956) Analytical Chemistry, 28:350-356). Los resultados pusieron de manifiesto que después de 8 horas L. sakei MN1 fue capaz de producir cantidades de EPS superiores a 2 g L-1. 20

Para llevar a cabo una producción del compuesto, a gran escala y con un grado de pureza alto, se cultivó la bacteria a 30 ºC en medio MRS con sacarosa al 2% hasta una densidad óptica de 1 medida a 600 nm y se realizó una dilución 1/100 de dicho cultivo en medio definido CDM con 0,8% de sacarosa. Cuando la densidad óptica fue de 1, se eliminaron las 25 células por centrifugación a 16.000 x g durante 30 minutos a 4 ºC y a los sobrenandantes se les añadió un volumen de etanol absoluto para precipitar el EPS durante 24 horas a 4 ºC. Posteriormente, se centrifugaron a 10.651 x g durante 60 minutos a 4 ºC para eliminar el sobrenadante, y el EPS precipitado fue re-suspendido con agua ultrapura. Se realizó una diálisis de los EPS, durante 2 días, con varios cambios de agua usando membranas de 12-30 14 kDa. Se congelaron a -80 ºC y se liofilizaron. En estas condiciones, la producción de exopolisacárido puro es de aproximadamente 0,7 g L-1.

EJEMPLO 5: Caracterización fisicoquímica del EPS sintetizado por L. sakei MN1.

35

Para llevar a cabo una caracterización del EPS sintetizado por L. sakei MN1, según el ejemplo anterior se realizaron: (i) determinación de su espectro de infrarrojos, (ii) análisis de metilación del biopolímero y (iii) análisis de su composición de monosacáridos tal y como se describe en Notararigo et al. (Notararigo et al. (2013) Carbohydr. Polym. 93:57–64).

Para obtener el espectro de infrarrojos, las muestras se analizaron mediante la técnica del 5 KBr en un instrumento FTIR (espectrofotómetro de infrarrojos por transformada de Fourier) 4200 tipo A (Jasco Corporation, Tokyo, Japan) en el rango de 400–4000 cm−1. El detector empleado fue del tipo sulfato de triglicocola con una resolución de 4 cm−1. En el espectro del EPS de MN1 (Fig. 4A), se observaron entre otras bandas de absorción, una a 849 cm−1 y otra a 916 cm−1, ambas características de α–anómeros. 10

Con el fin de determinar la composición de monosacáridos del biopolímero, se hidrolizó el EPS con ácido trifluoroacético (TFA) 3M durante 1 h a 121 ºC. Los monosacáridos liberados se redujeron con NaBH4 y se acetilaron (Laine, Esselman y Sweeley (1972), Methods in Enzymology, 28:159-167). Los azúcares neutros fueron identificados y cuantificados 15 mediante cromatografía de gases. El análisis cromatográfico se llevó a cabo en un instrumento CG-EM 7980A-5975C de la casa Agilent, equipado con una columna HP-5MS (30m x 0,25 mm, 0,2 m espesor de la película), un inyector split/splitless y con helio como gas portador. Inyector y detector se programaron a una temperatura de 250 °C. El pico de cada azúcar en el cromatograma se identificó comparando su tiempo de retención con los 20 de patrones analizados en idénticas condiciones. La cuantificación se realizó atendiendo al área de los picos y a los factores de respuesta obtenidos con diferentes monosacáridos patrón. Los resultados obtenidos mostraron que los dextranos producidos, tanto por L. sakei MN1 como por las otras dos bacterias lácticas, estaban compuestos exclusivamente por moléculas de glucosa. 25

El EPS producido por L. sakei MN1 fue metilado mediante el método de Ciucanu y Kerek (Ciucanu y Kerek (1984), Carbohydr. Res. 131:209-217, modificado por Needs y Selvendran (1993), Carbohydr. Res. 245:1-10). El EPS metilado se hidrolizó para obtener monosacáridos parcialmente metilados que se derivatizaron para dar lugar a sus 30 correspondientes acetatos de alditol parcialmente metilados. La reducción y acetilación se realizó según el método de Laine et al. (Laine, Esselman y Sweeley (1972), Meth. Enzymol. 28:159-167) con una única modificación que consiste en reducir con NaBD4. Los acetatos de alditol parcialmente metilados se analizaron mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas en un instrumento Agilent 7980A-5975C equipado con una 35 columna HP-5MS (30m x 0,25mm, 0,2 m espesor de la película), con helio. El inyector y la

línea de transferencia se mantuvieron a 250 ºC durante el análisis. La relación de split durante la inyección fue de 50:1. Cada uno de los picos del cromatograma se identificó mediante su tiempo de retención y su espectro de masas. La cuantificación se realizó atendiendo al área de los picos (ver Figura 4B). El EPS producido por L. sakei MN1 generó derivados parcialmente metilados y acetilados de un (1→6)-glucano con aproximadamente 5 10% de sustituciones en la posición O-3 con cadenas laterales compuestas por un residuo único de glucosa. Ya que la banda correspondiente a los anómeros fue observada en el espectro de infrarrojo, este polímero puede ser descrito como un polisacárido de tipo dextrano (ver Figura 4C).

10

Los resultados de los análisis indicados mostraron un polisacárido extracelular constituido por cadenas prácticamente lineales de α-(1,6)-glucopiranosa (90%) con ramificaciones α-(1,3) (10%) denominado por sus características como dextrano.

EJEMPLO 6: Comparación del dextrano producido por L. sakei MN1 y un dextrano 15 comercial a través de análisis de resonancia magnética nuclear.

El tamaño molecular del dextrano producido por L. sakei MN1 y el dextrano comercial T2000 (Pharmacia fine chemicals AB Uppsala, Suecia) fue analizado por RMN mediante la técnica de DOSY (Espectroscopía de Difusión Ordenada). Para ello, se disolvieron 15 mg de los 20 polisacáridos en 0,5 mL de D2O. Los análisis de DOSY se realizaron con el protocolo estándar Bruker DOSY a 298 K con el programa de pulsos ledbpg2s en un espectrómetro Bruker Avance 500 MHz. Treinta y dos espectros de protón (1H) monodimensionales (1D) fueron recogidos con un gradiente de duración de =4 ms y con un tiempo de eco de Δ=400 ms. En la Figura 5 puede observarse que existe una gran diferencia de tamaño entre el 25 dextrano comercial T2000 y el dextrano de L. sakei MN1, ya que estos presentan unos logaritmos del coeficiente de difusión de -10,9 y -12,3, respectivamente. En consecuencia la masa molecular del dextrano producido por L. sakei MN1 es superior a 2 x 106 kDa.

EJEMPLO 7: Evaluación in vitro de los dextranos como antivirales frente a virus de 30 salmónidos.

Se realizó una evaluación in vitro frente a virus de salmónidos sobre cultivos celulares infectado utilizando varios dextranos purificados a partir de sobrenadantes de cultivos de L. sakei MN1 (MN1), L. plantarum MMB2 (MMB2) y L. mesenteroides RTF10 (RTF10), así 35 como del dextrano comercial T2000 (Pharmacia fine chemicals AB Uppsala, Suecia).

Asimismo, se eligieron las líneas celulares BF-2 (ATCC CRL 1681) obtenida de Lepomis macrochirus y EPC (ATCC CRL-2872) obtenida de epitelioma papuloso de ciprínidos Pimephales promelas. Las células se cultivaron en medio de crecimiento Leibovitz (L15, Gibco, Invitrogen, Barcelona) a 25ºC suplementado con 100 UI mL-1 de penicilina, 100 µg mL-1 de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina y 10% de suero fetal bovino (FBS, Gibco). 5 Para el mantenimiento de la monocapa celular, se utilizó el mismo medio pero disminuyendo el porcentaje de suero fetal al 2%.

7.1. Evaluación de la toxicidad de los dextranos utilizados

10

Se determinó la viabilidad celular de las líneas celulares BF-2 y EPC, tratadas y sin tratar, por ensayos colorimétricos según el método de Renault y cols. (Renault, Torchy y Kinkelin (1991) Dis. Aquat. Org. 10:23–29). A monocapas confluentes de células BF-2 y EPC, creciendo en placas de plástico desechable de 96 pocillos, se les retiró el medio de crecimiento y se reemplazó por diferentes concentraciones (desde 10 µg mL-1 hasta 5000 µg 15 mL-1) de los dextranos diluidos en medio de mantenimiento. A los controles de células se les añadió el mismo volumen de medio de mantenimiento sin compuesto. Las placas se incubaron a 20°C durante 3 días (células BF-2) ó 7 días (células EPC). Posteriormente, se eliminó el medio de cultivo y se tiñeron las monocapas con una solución de cristal violeta al 1% (w/v) en etanol durante 10 min. Tras lavado y secado al aire se midió la absorbancia en 20 un lector de microplacas (Bio-Rad®) a 590 nm. Los resultados se presentan como porcentajes de células supervivientes, donde el 100% representa la absorbancia de las células control. A la concentración citotóxica del compuesto que ocasionó un 50% de inhibición del crecimiento celular se le denomina CT50. Los resultados obtenidos revelaron que la CT50 para todos los dextranos ensayados era mayor que 5000 µg mL-1. 25

7.2. Estudio de la Inhibición de efectos citopáticos de los virus y determinación de dosis inhibitoria 50

Para evaluar la capacidad antiviral de los dextranos se utilizaron dos virus procedentes de la 30 colección Norteamericana ATCC. Estos virus fueron un Birnavirus (Virus de la necrosis pancreática infecciosa, VNPI, ATCC VR1318) y un Rhabdovirus (virus de la necrosis hematopoyética infecciosa, VNHI, ATCC VR714). Para el cultivo y la propagación de los virus a ensayar las células, a las 24 horas de su siembra y con una monocapa semiconfluente, fueron infectadas con una dosis infectiva viral 50% (TCID50 mL-1) de 1000. 35 Con esta dosis una infección de 3 días a 15 ºC con VNPI y de 7 días a 20 ºC con VNHI

conllevó unos efectos citopáticos (ECP) producidos por los virus que afectaron a toda la monocapa celular y provocaron una lisis total (control virus, CV). Después de las incubaciones de las células en presencia de los virus, se recogieron los sobrenadantes, se centrifugaron a baja velocidad (900 x g) durante 5 minutos para eliminar los restos celulares y se repartieron alícuotas de la suspensión de virus en criotubos que se conservaron a -80ºC 5 hasta su utilización. El título infectivo del pase de virus se determinó calculando la TCID50 mL-1.

La actividad antiviral de los dextranos ensayados se determinó por la capacidad de estos para inhibir los ECP de los virus y proteger la monocapa celular y se calculó mediante la 10 determinación del porcentaje de células viables. Brevemente, se infectaron células BF-2 y EPC (aproximadamente 105 mL-1) cultivadas en placas de 48 pocillos con una TCID50 mL-1 de virus de 1000 y diferentes concentraciones (de 10 a 5000 µg mL-1) de los dextranos diluidos en el medio de mantenimiento de las líneas celulares. Los cultivos se incubaron a las temperaturas óptimas para cada virus. Las monocapas se observaron diariamente al 15 microscopio y, cuando los efectos citopáticos (ECP) en las células infectadas y no tratadas fueron totales (4+ ó un 100 % de afectación de la monocapa celular), se determinó el porcentaje de células supervivientes mediante tinción con cristal violeta. Los resultados obtenidos respecto a los ECP y a los porcentajes de células supervivientes (% inhibición) se muestran en las Tablas 1 y 2. Todos los dextranos ensayados mostraron una actividad 20 antiviral similar frente al virus VNPI, requiriéndose una concentración de 1000 (MN1 y RTF10), 2000 (MMB2) o 3000 (T2000) µg mL-1 para obtener un 50% de inhibición (Tabla 1). Sin embargo, frente al virus VNHI el dextrano producido por L. sakei MN1 mostró la mayor actividad antiviral obteniéndose una inhibición del 50% con una concentración de tan sólo 500 µg mL-1 (Ver Tabla 2). Esta potente inhibición no se detectó con el dextrano T2000, ya 25 que se requirió una concentración 10 veces superior (5000 µg mL-1) para obtener el mismo efecto. Este hecho podría ser debido a la elevada masa molecular del dextrano purificado a partir de los sobrenadantes de MN1.

30

Tabla 1. Actividad antivírica de dextranos frente a VNPI en células BF-2.

MN1 MMB2 RTF10 T 2000

µg mL-1

ECP1 % Inhibición2 ECP1 % Inhibición2 ECP1 % Inhibición2 ECP1 % Inhibición2

5000

0 100 +- 75 0 100 +- 75

4000

0 100 +- 75 0 100 +- 75

3000

0 100 +- 75 +- 75 2+ 50

2000

+- 75 2+ 50 + 75 3+ 25

1000

2+ 50 3+ 25 2+ 50 3+ 25

750

3+ 25 3+ 25 3+ 25 4+ 0

500

3+ 25 4+ 25 3+ 25 DT 0

250

4+ 0 DT 0 4+ 0 DT 0

100

DT 0 DT 0 DT 0 DT 0

50

DT 0 DT 0 DT 0 DT 0

10

DT 0 DT 0 DT 0 DT 0

0

DT 0 DT 0 DT 0 DT

0

1ECP: DT, destrucción total de la monocapa. Los valores desde 4+ hasta 0 indican una gradación desde todas las células infectadas hasta la falta de infección.

2El efecto inhibitorio de los dextranos (% de inhibición) representa el porcentaje de células 5 supervivientes a la infección con el virus VNHI. El 100% representa la absorbancia de las células control no infectadas y tratadas del mismo modo que las células infectadas (control células) y el 0% corresponde a las células infectadas con virus y sin tratamiento.

Tabla 2. Actividad antivírica de dextranos frente a VNHI en células EPC. 10

MN1 MMB2 RTF10 T2000

µg mL-1

ECP1 % Inhibición2 ECP1 % Inhibición2 ECP1 % Inhibición2 ECP1 % Inhibición2

5000

0 100 +- 75 0 100 2+ 50

4000

0 100 +- 75 0 100 3+ 25

3000

0 100 +- 75 0 100 3+ 25

2000

+- 75 + 75 0 100 4+ 25

1000

+ 75 2+ 50 +- 100 4+ 25

750

+ 75 3+ 25 2+ 50 4+ 0

500

2+ 50 3+ 25 3+ 25 DT 0

250

3+ 25 4+ 25 3+ 25 DT 0

100

3+ 25 DT 0 4+ 25 DT 0

50

4+ 25 DT 0 DT 0 DT 0

10

DT 0 DT 0 DT 0 DT 0

0

DT 0 DT 0 DT 0 DT

0

1ECP: DT, destrucción total de la monocapa. Los valores desde 4+ hasta 0 indican una gradación desde todas las células infectados hasta la falta de infección.

2El efecto inhibitorio de los dextranos (% de inhibición) representa el porcentaje de células supervivientes a la infección con el virus VNHI. El 100% representa la absorbancia de las células control no infectadas y tratadas del mismo modo que las 5 células infectadas (control células) y el 0% corresponde a las células infectadas con virus y sin tratamiento.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES1.-Una secuencia de nucleótidos caracterizada por que se corresponde con la secuencia SEQ ID NO: 4.52.-Una secuencia de nucleótidos caracterizada por que presenta una identidad del 80% con la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1 y por que codifica una enzima dextransacarasa útil para la obtención de exopolisacáridos.3.-Vector de expresión tipo procariota o eucariota caracterizado por que comprende una 10secuencia de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1y 2.4.-Vector de expresión según la reivindicación 3 caracterizada por que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6.155.-Una enzima con actividad dextransacarasa útil para la obtención de un exopolisacárido, caracterizada por que está codificada por unasecuencia de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2.6.-Una enzima con actividad dextransacarasa según la reivindicación 5 caracterizada por 20que está constituida por la SEQ ID NO: 5.7.-Una célula caracterizada por que comprende una secuencia de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 2 o un vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 4.258.-Una célula según la reivindicación 7 caracterizada por que se corresponde con una cepa Lactobacillus sakei con capacidad para producir un exopolisacárido.9.-Una célula según la reivindicación 8, caracterizada por que la cepa bacteriana 30Lactobacillus sakei se aísla de fiambre de magro de cerdo.10.-Una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a la 9 caracterizada por que se corresponde con la cepa Lactobacillus sakeiMN1 con CECT 8329. 11.-Uso de una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a la 10 para la obtención de una enzima con actividad dextransacarasa según una cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6.12.-Uso de una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a la 10 en un 5procedimiento útil para la obtención de un exopolisacárido.13.-Procedimiento de obtención de un exopolisacárido según lareivindicación 12 caracterizado por que la célula es una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a la 10 y por que comprende las siguientes etapas:10a)cultivar una bacteria L. sakei en medio de cultivo suplementado con al menos un azúcar, seleccionado de entre sacarosa y maltosa, hasta alcanzar la fase estacionaria de crecimiento del exopolisacárido;b)eliminar las bacterias por centrifugación y separar el sobrenadante;c)añadir un alcohol o una cetona para obtener un precipitado del exopolisacárido; y15d)centrifugar el precipitado del paso (c) para eliminar el sobrenadante, y obtener un exopolisacárido precipitado.14.-Procedimiento de obtención de un exopolisacrárido según la reivindicación 13, caracterizada por que incluye una fase de purificación posterior a la etapa (d) que 20comprende las siguientes etapas:i.-resuspender el exopolisacárido precipitado según la etapa (d) en agua ultrapura;ii.-someter al exopolisacárido a una diálisis utilizando membranas de 12-13 kDa, con cambios de agua; y iii.-congelar a una temperatura entre -60 y -80 ºC y liofilizar.2515.-Procedimiento de obtención de un exopolisacárido según una cualquiera de las reivindicaciones 13 y 14 caracterizado por que la cepa L. sakei de la etapa (a) es la cepa Lactobacillus sakeiMN1 con CECT 8329.3016.-Procedimiento de obtención de un exopolisacárido según una cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6 caracterizado por que utiliza una enzima de actividad dextransacarasa.17.-Un exopolisacárido obtenido a través del procedimiento de obtención según una 35cualquiera de las reivindicaciones 13 a la 16. 18. Un exopolisacárido según la reivindicación 17, caracterizado por que es un dextrano.19.-Uso de un exopolisacárido según una cualquiera de las reivindicaciones 17 y 18para lapreparación de una composición farmacéuticapara la prevención o tratamiento de infecciones virales de especies piscícolas, preferiblemente salmónidos.520.-Uso según la reivindicación 19 caracterizado por que el virus pertenece a los géneros Birnaviruso Rhabdovirus, y preferentemente es el virus de la necrosis pancreática infecciosa (VNPI) o el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (VNHI).1021.-Composición farmacéutica veterinariao alimentaria útil para la prevención o tratamiento de infecciones virales de especies piscícolas caracterizada por que comprende un exopolisacárido según una cualquiera de las reivindicaciones 17 y 18.22.-Composición según la reivindicación 21caracterizada por que el virus pertenece a los 15géneros Birnavirus o Rhabdovirus, y preferentemente es el virus de la necrosis pancreática infecciosa (VNPI) o el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (VNHI).