DE3601136A1 - Hemmstoffe der reversen transkriptase fuer prophylaxe und therapie von retrovirus-infektionen in saeugetieren - Google Patents
Hemmstoffe der reversen transkriptase fuer prophylaxe und therapie von retrovirus-infektionen in saeugetierenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die Verwendung von anorganische
anionische Gruppen enthaltenden organischen Polymerisaten
zur Prophylaxe und Therapie von Retrovirus-Infektionen in
Säugern.
Retroviren sind Viren, deren genetische Information aus
Ribonucleinsäure (RNA) besteht. Wenn Retroviren Zellen infizieren,
so wird während des Virus-Vermehrungszyklus eine
Desoxyribonculeinsäure (DNA)-Kopie des Virugenoms in den
infizierten Zellen hergestellt. Diesen RNA-abhängigen DNA-
Syntheseprozeß bewältigt ein für Retroviren spezifisches,
Virusgenom-codiertes Enzym, die Reverse Transkriptase.
Die Reverse Transkriptase ist Bestandteil des Virons.
Retroviren verursachen Krankheiten, wie Leukämie und andere
Tumore bei Katzen, Mäusen, Rindern und beim Menschen
und Sarkome bei Vögeln. Insbesondere wird AIDS (Aquired
Immuno Deficiency Syndrom) beim Menschen durch ein Retrovirus,
das LAV/HTLV III, verursacht.
Zur Prophylaxe oder Therapie der genannten Virus-Infektionen
beim Menschen und bei anderen Säugern ist man
von der Überlegung ausgegangen, daß ein selektiver Schutz
gegen Virusvermehrung durch Hemmung der viralen RNA-abhängigen
DNA-Synthese durch die Virus-spezifische, Viruscodierte
Reverse Transkriptase, erzielt werden kann. Die
beiden wichtigsten aus dem Stand der Technik bekannten
Hemmstoffe der Reversen Transkriptase sind Foscarnet und
Suramin. Die Wirkung von Foscarnet (Phosphonoformiat) als
Hemmstoff der Reversen Transkriptase ist aus B. Öberg,
"Antiviral effects of Phosphonoformate (PFA, Foscarnet
Sodium)", Pharmac. Ther. 19 (1983), S. 387 bis 415 und aus
B. Sunquist et al., "Phosphonoformate Inhibits Reverse
Transcriptase", J. gen. Virol. 45 (1979), S. 273 bis 281,
bekannt.
Foscarnet hat die folgende Formel:
Foscarnet ist jedoch wegen seiner in klinischen Versuchen
ermittelten erheblichen Toxizität nicht für Prophylaxe
oder Therapie von Retrovirus-Infektionen geeignet.
Die Wirkung von Suramin als Hemmstoff der Reversen Transkriptase
ist aus H. Mitsuya et al., "Suramin Protection of
T-Cells in Vitro Against Infectivity and Cytopathic Effect
of HTLV-III", Science 226 (1984), S. 172 bis 174, bekannt.
Suramin wird zur Zeit auch zur Behandlung der Schlafkrankheit
verwendet. Suramin hat die folgende Formel:
Ähnlich wie Foscarnet ist jedoch auch Suramin toxisch für
den Säugetier-Organismus, so daß es gemäß klinischen Erprobungen
in der Konzentration, die für Porphylaxe und
Therapie von Retrovirus-Infektionen erforderlich ist,
nicht ohne Nebenwirkungen erfolgreich verwendet werden
kann.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde,
Hemmstoffe der Reversen Transkriptase bereitzustellen,
die gegenüber den bekannten Hemmstoffen geringere
Nebenwirkungen auf den Säugetier-Organismus haben und deshalb
für Porphylaxe und Therapie von Retrovirus-Infektionen
geeignet sind.
Diese Aufgabe wird durch den überraschenden Befund gelöst,
daß sich organische Polymerisate, die anorganische
anionische Gruppen enthalten als wirksame Hemmstoffe der Reversen
Transkriptase erweisen.
Gegenstand der Erfindung ist somit die Verwendung von organischen
Polymerisaten, die anorganische anionische Gruppen enthalten,
für Porphylaxe und Therapie von Retrovirus-
Infektionen in Säugern. Beispiele solcher Polymerisate
sind Polyvinylsulfate, Polyvinylphosphate oder Kohlenhydrate.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße
organische Polymerisat ein Kohlenhydrat, das keine
COOOH- und NH2-Gruppen enthält.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das genannte
polymere Kohlenhydrat aus Pentose-Monomeren aufgebaut,
die beispielsweise von Ribulose, Arabinose oder
Xylose abgeleitet sind.
Vorzugsweise sind diese Pentose-Monomere Xylose-Reste. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Xylose-Reste Xylopyranose-Reste.
Vorzugsweise sind diese Pentose-Monomere Xylose-Reste. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Xylose-Reste Xylopyranose-Reste.
Vorzugsweise ist das polymere, aus Pentose-Monomeren aufgebaute
Kohlenhydrat ein Pentosanpolysulfat.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das polymere Kohlenhydrat aus Hexose-Monomeren aufgebaut, die beispielsweise von Mannose, Fructose, Sorbose, Galactose oder Glucose abgeleitet sind.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das polymere Kohlenhydrat aus Hexose-Monomeren aufgebaut, die beispielsweise von Mannose, Fructose, Sorbose, Galactose oder Glucose abgeleitet sind.
Vorzugsweise sind die Hexose-Monomere Glucose-Reste.
Ferner sind die Glucose-Reste in den erfindungsgemäß zu
verwendenden Polymeren vorzugsweise Glucopyranose-Reste.
Vorzugsweise ist das polymere, aus Hexose-Resten aufgebaute
Kohlenhydrat ein Dextransulfat mit einem Molekulargewicht
von mindestens 6000.
Spezielle Beispiele für erfindungsgemäß
eingesetzte anorganische anionische Gruppen enthaltende
organische Polymerisate sind Dextransulfat MV.500 000
(im folgenden als NO.5M bezeichnet), Dextransulfat MW.8000
(im folgenden als N8T bezeichnet) oder Pentosanpolysulfat
MV.5000 (im folgenden als T bezeichnet).
Dextransulfat ist
der Schwefelsäureester des Dextrans, das von Bakterien der
Gattung Leuconostoc und anderen Lactobacillen aus Saccharose
synthetisiert wird. Dextran ist überwiegend aus α-1,6-
glykosidisch verknüpften α-D-Glucoseresten aufgebaut.
Das durchschnittliche Molekulargewicht der in NO.5M enthaltenen
Polymerisat-Moleküle beträgt 500 000.
Das durchschnittliche Molekulargewicht der Polymerisat-Moleküle in N8T beträgt etwa 8000.
Pentosanpolysulfat MW.5000 (T) ist ein β-D(1,4)-Cylopyranose- Polymerisat, dessen einzelne Monomere jeweils Sulfatreste tragen.
Das durchschnittliche Molekulargewicht der Polymerisat-Moleküle in N8T beträgt etwa 8000.
Pentosanpolysulfat MW.5000 (T) ist ein β-D(1,4)-Cylopyranose- Polymerisat, dessen einzelne Monomere jeweils Sulfatreste tragen.
Nachstehend wird die Erfindung anhand der bevorzugt eingesetzten
Stoffe NO.5M, N8T und T im einzelnen erläutert.
Diese Stoffe wurden in der Humanmedizin bereits als Hemmstoffe
der Blutgerinnung eingesetzt, wobei sich ihre pharmakologische
Verträglichkeit erwiesen hat. Außerdem ist
die Wirkung von NO.5M auf "Slow Virus Infections"
(langsame Virus-Infektionen) bekannt, die zu spongioformen
Encephalopathien führen, beispielsweise zu Scrapie beim
Schaf oder bei der Maus und zum Jakob Creutzfeldt-Syndrom
beim Menschen (Heino Diringer et al., "The Reticuloendothelial
System in Scrapie Pathogenesis", J. gen. Virol. 65 (1984),
Seiten 423-428; "Dextran Sulphate 500 Delays and Prevents
Mouse Scrapie by Impairment of Agent Replication in
Spleen", J. gen. Virol. 65 (1984), Seiten 1325-1330;
"Ein Modell für Alterungsprozesse und degenerative biochemische
Veränderungen des Gehirns - Scrapie", Funkt.
Biol. Med. 4 (1985), Seiten 129-140). Schließlich ist
die hemmende Wirkung von NO.5M auf die Replikation von
Encephalo-Myocarditis (EMC)-Viren, ECHO-Viren, Coxsackie
A9-Viren und von Herpes-Viren bekannt.
Die bekannten Wirkungen von NO.5M sowie der anderen besonders
bevorzugten Substanzen der vorliegenden Erfindung
legen jedoch die erfindungsgemäße Verwendung von anorganische
anionische Gruppen enthaltenden organischen Polymerisaten
nicht nahe. Sowohl in der Blutgerinnung als auch
bei den vorstehend genannten Virus-Infektionen spielt nämlich
die RNA-abhängige DNA-Synthese durch eine Virus-codierte
und Virus-spezifische Reverse Transkriptase keine
Rolle. Folglich konnte aus den bekannten Wirkungen der
Verbindungen auch nicht auf eine spezifische Hemmung der
Reversen Transkriptase von Retroviren geschlossen werden.
Die spezifische Hemmwirkung der erfindungsgemäß eingesetzten
Stoffe auf die RNA-abhängige DNA-Synthese wird in
vitro in einem Modellsystem untersucht, in dem die Reverse
Transkriptase des Schmidt-Ruppin D (SR-D)-Virus enthalten
ist.
Aus Ergebnissen eines solchen Testsystems, die eine Hemmwirkung der erfindungsgemäßen Substanzen auf die Reverse Transkriptase eines Vogel-Retrovirus zeigen, kann ohne weiteres auf eine Hemmwirkung bei Säuger-Retroviren geschlossen werden. Es wurde nämlich bereits in vielen Untersuchungen gezeigt, daß die Reversen Transkriptasen aus Vogel- und Säuger-Retroviren in ihren enzymatischen Eigenschaften nicht unterscheidbar sind.
Aus Ergebnissen eines solchen Testsystems, die eine Hemmwirkung der erfindungsgemäßen Substanzen auf die Reverse Transkriptase eines Vogel-Retrovirus zeigen, kann ohne weiteres auf eine Hemmwirkung bei Säuger-Retroviren geschlossen werden. Es wurde nämlich bereits in vielen Untersuchungen gezeigt, daß die Reversen Transkriptasen aus Vogel- und Säuger-Retroviren in ihren enzymatischen Eigenschaften nicht unterscheidbar sind.
Zunächst wird die Hemmwirkung der erfindungsgemäßen Substanzen
in einem Modellsystem untersucht, das neben der
SR-D Reversen Transkriptase poly(rA)-RNA, daran als "Primer"
angelagerte oligo(dT)-Fragmente und die zur DNA-Synthese
erforderlichen Nucleotide dATP, 3H-dTTT, dCTP und dGTP enthält.
Vor dem Start der Enzymreaktion wird einer der Hemmstoffe
Foscarnet, Suramin, Chondroitinsulfat (CS), DEAE-Dextran
(Diäthylaminoäthyl-Dextran, DN), Heparin (HE), Dextran (N),
Dextransulfat MW5000 (N5T), Dextransulfat MW8000 (N8T),
Dextransulfat MW500 000 (NO.5M) oder Pentosanpolysulfat
MW5000 (T) zugegeben.
Chondroitinsulfat ist ein hochmolekulares Mucopolysaccharid,
das aus Glucuronsäureresten oder Iduronsäureresten
und Chondrosaminresten verestert mit H2SO4 besteht. Als
Heparin werden aus tierischen Organen isolierbare hochmolekulare
Mucopolysaccharide bezeichnet, die aus D-Glucosaminresten
aufgebaut sind.
Das Ausmaß der Enzymreaktion wird bestimmt durch Messung der bei der Enzymreaktion in die neu synthetisierte DNA eingebauten Radioaktivität (3H-dTTP). Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe sind in Fig. 1 aufgetragen.
Das Ausmaß der Enzymreaktion wird bestimmt durch Messung der bei der Enzymreaktion in die neu synthetisierte DNA eingebauten Radioaktivität (3H-dTTP). Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe sind in Fig. 1 aufgetragen.
Hervorragende Hemmaktivitäten zeigen die Verbindungen
NO.5M und N8T. Eine geringere Hemmaktivität weisen die
Verbindungen Foscarnet, Surmain und T auf.
Eine mäßige bis schlechte Hemmwirkung zeigen die Verbindungen HE, N5T, DN, N und CS.
Die schlechte Hemmaktivität von HE, CS, DN und N wird dabei darauf zurückgeführt, daß Aminogruppen (HE), Carboxylgruppen (CS), positive Ladungen (DN) oder keine negativen Ladungen (N) in den Verbindungen enthalten sind.
Eine mäßige bis schlechte Hemmwirkung zeigen die Verbindungen HE, N5T, DN, N und CS.
Die schlechte Hemmaktivität von HE, CS, DN und N wird dabei darauf zurückgeführt, daß Aminogruppen (HE), Carboxylgruppen (CS), positive Ladungen (DN) oder keine negativen Ladungen (N) in den Verbindungen enthalten sind.
Die niedrige Hemmaktivität von N5T (MW5000) und die hohe
Hemmaktivität von T (MW5000) zeigt, daß die erfindungsgemäße
Hemmaktivität der anorganische anionische
Gruppen enthaltenden organischen Polymere nicht direkt mit
dem Molekulargewicht einzelner Polymere korreliert werden
kann. Aus den Versuchergebnissen kann lediglich geschlossen
werden, daß erfindungsgemäß zu verwendende Dextransulfate
ein Molekulargewicht von mindestens 6000 haben
sollten.
Die überlegenen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen
N8T, NO.5M und T gegenüber den Verbindungen des
Standes der Technik werden bei der Berechnung des Wirkungsindex
(LD50/Hemmkonzentration) deutlich. Die LD50-Werte
sind aus der Literatur bekannt. Die Hemmkonzentration für
eine 99%ige und 90%ige Hemmung der Aktivität der Reversen
Transkriptase werden aus Fig. 1 abgelesen.
Die in Tabelle I zusammengefaßten Ergebnisse der Berechnungen zeigen, daß der Wirkungsindex der erfindungsgemäßen Substanzen bis zu etwa 140 mal höher ist als der der bekannten Hemmstoffe der Reversen Transkriptase (Foscarnet und Suramin).
Die in Tabelle I zusammengefaßten Ergebnisse der Berechnungen zeigen, daß der Wirkungsindex der erfindungsgemäßen Substanzen bis zu etwa 140 mal höher ist als der der bekannten Hemmstoffe der Reversen Transkriptase (Foscarnet und Suramin).
Die in Fig. 2 und 3 gezeigten Versuchsergebnisse bestätigen
die in Fig. 1 gezeigten Versuchsergebnisse.
Dabei ist das vorstehend erläuterte Modellsystem dahingehend
abgewandelt, daß anstelle von poly(rA)-RNA nur die
endogene RNA, also Virus-eigenen RNA enthalten ist (Fig. 2).
In einem weiteren Modellsystem ist im Reaktionsgemisch zusätzlich
Actinomycin D enthalten (Fig. 3).
Actinomycin D hemmt dabei die neben der RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität in der Reversen Transkriptase enthaltene DNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität.
Actinomycin D hemmt dabei die neben der RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität in der Reversen Transkriptase enthaltene DNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität.
Die vorteilhafte Wirkung der erfindungsgemäß zu verwendenden
Substanzen beruht vermutlich darauf, daß sie als
anorganische anionische Gruppen enthaltende organische
Polymerisate eine strukturelle Verwandtschaft mit einzelsträngigen
Nucleinsäuren, also den natürlichen Substraten
der Reversen Transkriptase, aufweisen.
Neben den erfindungsgemäß zu verwendenden Substanzen in
einer geeigneten Konzentration enthalten die Arzneimittel
der vorliegenden Erfindung gegebenenfalls Substanzen wie
übliche pharmakologisch verträgliche Träger, Farbstoffe,
Geschmacksstoffe sowie Hilfs- und Zusatzstoffe.
Die Figuren zeigen:
Fig. 1 Ergebnisse der Inhibition der Poly(rA)/oligo-
(dT)10-stimulierten Reversen Transkriptase mit
den Stoffen Foscarnet, Suramin, CS, DN, HE, N,
N5T, N8T, NO.5M und T.
Die Abszisse zeigt die Konzentration des Stoffs in Mikrogramm/Mikroliter, die Ordinate zeigt im logarithmischen Maßstab die Anzahl der durch das 3H-dTTP verursachten radioaktiven Zerfälle pro Minute, die proportional zur synthetisierten DNA Menge sind.
Die Abszisse zeigt die Konzentration des Stoffs in Mikrogramm/Mikroliter, die Ordinate zeigt im logarithmischen Maßstab die Anzahl der durch das 3H-dTTP verursachten radioaktiven Zerfälle pro Minute, die proportional zur synthetisierten DNA Menge sind.
Fig. 2: Ergebnisse der Inhibition der oligo(dT)10-stimulierten
Reversen Transkriptase an endogener
RNA mit den in Fig. 1 genannten Hemmstoffen
(außer Foscarnet). Die Abszisse zeigt die Konzentration
des Hemmstoffs in Mikrogramm/Mikroliter,
die Ordinate zeigt (im linearen Maßstab)
die Anzahl der durch das 3H-dTTP verursachten
radioaktiven Zerfälle pro Minute.
Fig. 3: Ergebnisse der Inhibition der oligo(dT)10-stimulierten
Reversen Transkriptase an endogener RNA
in Anwesenheit von Actinomycin D.
Die Abszisse zeigt die Konzentration des Hemmstoffs in Mikrogramm/Mikroliter, die Ordinate die Anzahl der durch das 3H-dTTP verursachten radioaktiven Zerfälle pro Minute.
Die Abszisse zeigt die Konzentration des Hemmstoffs in Mikrogramm/Mikroliter, die Ordinate die Anzahl der durch das 3H-dTTP verursachten radioaktiven Zerfälle pro Minute.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Das im nachfolgenden Testsystem beispielhaft verwendete
Vogelretrovirus, das Schmidt-Ruppin D (SR-D)-Virus, wird
aus dem Kulturüberstand von Virus-produzierenden Zellen
isoliert. Dem Fachmann ist bekannt, daß auch die Reverse
Transkriptase anderer Retroviren im nachstehend erläuterten
Modellsystem verwendet werden kann. Das SR-D-Virus wurde
für das nachstehend beschriebene Modellsystem ausgewählt,
weil es von den Wirtszellen sezerniert wird und im
Verlauf der Virus-Synthese die Wirtszellen nicht zerstört
werden. Damit unterscheidet sich dieses Virus vom
sogenannten LAV/HTLV III-Virus, das seine Wirtszellen zerstört.
Isolate des LAV-HTLV III-Virus sind wegen dieses
zythopathischen Effektes mit zellulären DNA-Polymerasen
verunreinigt, wobei die DNA-Synthese-Aktivitäten sich
nicht ohne weiteres von der eigentlichen Reversen Transkriptase
unterscheiden lassen. Aus diesem Grund ist ein
Modellsystem zur Ermittlung von spezifischen Hemmwirkungen
zu untersuchender Substanzen, das die Reverse Transkriptase
des SR-D-Virus enthält, zuverlässiger, als ein
Modellsystem, das die aus LAV-HTLV III-Viren isolierte
Reverse Transkriptase enthält.
Es wurde jedoch bereits in vielen Versuchen gezeigt, daß die Reversen Transkriptasen aus Vogel- und Säugerviren in ihren enzymatischen Eigenschaften nicht unterscheidbar sind. Es lassen sich somit alle nachfolgend beschriebenen Erkentnisse ohne weitere Einschränkungen auf die Reverse Transkriptase von LAV-HTLV III- und anderen Retroviren übertragen.
Es wurde jedoch bereits in vielen Versuchen gezeigt, daß die Reversen Transkriptasen aus Vogel- und Säugerviren in ihren enzymatischen Eigenschaften nicht unterscheidbar sind. Es lassen sich somit alle nachfolgend beschriebenen Erkentnisse ohne weitere Einschränkungen auf die Reverse Transkriptase von LAV-HTLV III- und anderen Retroviren übertragen.
Die Isolierung des SR-D-Virus erfolgt im wesentlichen
nach K. Mölling ("Characterization of Reverse Transcriptase
und RNase H from Friend-Murine Leukemia Virus",
Virology 62 (1974), S. 46 bis 59; "Further Characterization
of the Friend-Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase-
RNase H Complex", J. of Virol. 18 (1976), S.
418 bis 425; "Two Avian Sarcoma Virus Mutants with
Defects in the DNA Polymerase-RNase H Complex", J. of
Virol. 32 (1979), S. 370 bis 378). Dementsprechend werden
normale Hühnerembryofibroblasten, die nach Standartmethoden
aus Hühnerembryonen isoliert werden, mit dem SR-D-
Virus infiziert. Das SR-D-Virus ist bei der American Type
Tissue Centure Collection (ATCC) Rockville, Maryland, USA,
erhältlich (ATCCVR354). In Abständen von 24 Stunden werden die Kulturüberstände
entnommen, bei -70°C eingefroren und die
Zellkulturen mit neuem Medium versehen. Auf diese Weise
werden etwa 5 Liter Zellkulturüberstand gesammelt. Die
Zellkulturüberstände werden anschließend aufgetaut und
durch Zentrifugation (10 000 Upm, 30 Min., 4°C in GSA
Sorvall Rotor) vorgereinigt. Anschließend werden die enthaltenen
Viruspartikel durch hochtourige Zentrifugation
pelletiert (20 000 Upm, 2 Stunden, 4°C im SW27 Beckman
Rotor). Nach Entfernen des Überstandes werden die abzentrifugierten
Viruspartikel in etwa einem Tausendstel des
Ausgangsvolumens (5 ml) physiologischem Puffer, wie TNE
(0,05 M Tris-Hydrochlorid, 0,1 M NaCl und 0,005 M EDTA,
pH 7,4) resuspendiert. Danach werden die Viruspartikel
durch Zentrifugation über einen 20 bis 70% Saccharose-
Gradienten in physiologischem Puffer, wie TNE (30 000 Upm,
8 Stunden, 4°C im SW27-Rotor) gereinigt. Viruspartikel mit
einer Schwimmdichte von 1,16 g/cm3 werden aus dem Gradienten
isoliert. Die so erhaltene hochreine Virussuspension
wird mit dem den Gradienten entsprechenden Puffer auf eine
Konzentration von etwa 1 mg/ml eingestellt und läßt sich
dann ohne große Enzymaktivitätsverluste in kleineren Portionen
mehrere Wochen bei -20°C lagern.
Im nachstehend beschriebenen Modellsystem erfolgt die
Bestimmung der Aktivität der Reversen Transkriptase
in Gegenwart eines Hemmstoffes im wesentlichen nach
K. Mölling, a. a. O.
Somit wird die Virion-assoziierte Reverse Transkriptase
zunächst durch Detergens-Behandlung für die Enzymreaktionspartner
zugänglich gemacht. Etwa 10 µg Viruspartikel
einer wie vorstehend beschriebenen erhaltenen
1 mg/ml Virus-Suspension werden mit 0,8% Nonidet
(NP-40®) (Fluka AG, Buchs) 10 Minuten
bei 4°C aufgeschlossen und anschließend einem Enzymtest
zugesetzt, der ein Gesamtvolumen von 100 µl hat
und folgende Bestandteile enthält: 50 mM Tris-HCl,
pH 7,8; 8 mM MgCl2, 80 mM KCl, 1 mM DTT (Dithiothreitol),
je 20 mµMol dATP, dGTP, dCTP und 0,2 mµMol
3H-TTP (sepz. Akt. 50 Ci/mMol). Je nach Zielsetzung
dieses Tests werden verschiedene Matrizen zugesetzt,
z. B. poly(rA) (Beipiels 2) oder endogene RNA (Beispiel
3 und Beispiel 4). Dem so erhaltenen Reaktionsansatz
werden die einzelnen Hemmstoffe zugefügt. Diese wurden
vorher in Stammlösungen von 10 mg/ml oder 1 mg/ml in
H2O angesetzt und lassen sich ebenfalls bei -20°C lagern.
Die Hemmstoffmengen werden in maximal 10 µl bei
einem Gesamtvolumen von 100 µl zugesetzt. Zum Vergleich
werden Suramin (Bayer, Leverkusen) und Foscarnet
(Astra Läkemedel AB, Södertälje, Schweden) mitgetestet.
Die Enzymreaktion wird anschließend 60 Minuten bei
37°C durchgeführt. Danach wird die Enzymreaktion durch
Zugabe von 10% Trichloressigsäure (TCA, 0,5 ml) beendet.
Die synthetisierte DNA wird durch die TCA in
20 Minuten bei 4°C gefällt und durch Filtration durch
ein Membranfilter von den nicht eingebauten 3H-dTTP-
Molekülen abgetrennt. Die Menge an radioaktiver DNA
auf dem Filter wird durch Flüssigkeitsszintillationsmessung
bestimmt. Als unspezifischer Hintergrund wird
diejenige Radioaktivität subtrahiert, die nach der
vorstehend beschriebenen Verfahrensweise in einem Test
in Abwesenheit von Virusproteinen auf dem Filter haftete
(ca. 1000 cpm, entsprechend etwa 1%). Um den
unspezifischen Hintergrund so niedrig zu halten, werden
die Filter mehrfach mit 5% TCA-Lösung (insgesamt
etwa 50 ml) und Pyrophosphat-Lösung (10 ml, gesättigte
Lösung) gewaschen.
Die Zahl der gemessenen radioaktiven Zerfälle (3H-cpm)
wird dann in Abhängigkeit von verschiedenen Konzentrationen
der Inhibitoren graphisch aufgetragen. Dabei
entspricht die Konzentration der Inhibitoren (µg/µl)
der Endkonzentration im Test.
Eine der wirksamsten Matrizen der Reversen Transkriptase
ist das synthetische Polymer poly(rA) von etwa 100 bis
200 Nucleotiden Länge, das mit oligo(dT)-Stücken ("Primern")
der Länge von 10 Nucleotiden gemischt wird (Boehringer
Mannheim).
Somit besteht die in diesem Testsystem verwendete Matrize aus einer synthetischen RNA, an die kurze DNA-Primer gebunden sind. Die Primer dienen der Reversen Transkriptase als Startstellen.
Die RNA-abhängige DNA-Synthese an dieser Matrize ist etwa 100fach effizienter als die an der endogenen RNA. poly(rA)oligo(dT)10 wird in einer Stammlösung von 1 mg/ml angesetzt. Pro Enzymtest wird eine Endkonzentration von 50 µg/ml verwendet. Der Enzymtest wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt.
Die Ergebnisse der Enzymreaktionen unter Zugabe der Hemmstoffe Foscarnet, Suramin, CS, DN, HE, N, N5T, N8T, NO.5M und T sind in Fig. 1 dargestellt. Mit Hilfe der graphischen Darstellung der Meßergebnisse in Fig. 1 können die Konzentrationen der zugegebenen Substanzen ermittelt werden, bei denen die Aktivität der Reversen Transkriptase zu 99% bzw. zu 90% gehemmt wird. Der Koeffizient aus den von den Substanzen aus der Literatur bekannten LD50-Werten und den aus Fig. 1 ermittelten Hemmkonzentrationen ist der Wirkungsindex der Substanzen (vgl. Tabelle I).
Somit besteht die in diesem Testsystem verwendete Matrize aus einer synthetischen RNA, an die kurze DNA-Primer gebunden sind. Die Primer dienen der Reversen Transkriptase als Startstellen.
Die RNA-abhängige DNA-Synthese an dieser Matrize ist etwa 100fach effizienter als die an der endogenen RNA. poly(rA)oligo(dT)10 wird in einer Stammlösung von 1 mg/ml angesetzt. Pro Enzymtest wird eine Endkonzentration von 50 µg/ml verwendet. Der Enzymtest wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt.
Die Ergebnisse der Enzymreaktionen unter Zugabe der Hemmstoffe Foscarnet, Suramin, CS, DN, HE, N, N5T, N8T, NO.5M und T sind in Fig. 1 dargestellt. Mit Hilfe der graphischen Darstellung der Meßergebnisse in Fig. 1 können die Konzentrationen der zugegebenen Substanzen ermittelt werden, bei denen die Aktivität der Reversen Transkriptase zu 99% bzw. zu 90% gehemmt wird. Der Koeffizient aus den von den Substanzen aus der Literatur bekannten LD50-Werten und den aus Fig. 1 ermittelten Hemmkonzentrationen ist der Wirkungsindex der Substanzen (vgl. Tabelle I).
Aus Tabelle I geht hervor, daß die erfindungsgemäß besonders
bevorzugten Substanzen einen bis zu etwa 140fach
höheren Wirkungsindex als die aus dem Stand der Technik
bekannten Substanzen Suramin und Foscarnet haben.
Gemäß Beispiel 2 wird die Hemmaktivität der in Beispiel 2
verwendeten Substanzen ermittelt, wobei jedoch anstelle
der poly(rA)-RNA die endogene RNA der Viruspartikel verwendet
wird. Pro 100 µl Enzymtest werden dabei 5µg
oligo(dT)10-Primer-Moleküle aus einer 1 mg/ml Stammlösung
zugegeben. Die durch Anlagerung der Primer-Moleküle an die
endogene RNA zusätzlich entstehenden Startstellen für die
DNA-Synthese durch die Reverse Transkription ermöglichen
eine etwa 2fach höhere DNA-Synthese-Aktivität an der RNA.
In diesen Enzymtest-Reaktionen wird somit die Aktivität
der Reversen Transkriptase an endogener RNA inhibiert und
gemessen.
Die Ergebnisse der Reaktionen sind in Fig. 2 zusammengefaßt.
Aus Fig. 2 geht hervor, daß die Hemmwirkung der getesteten
Substanzen im wesentlichen der in Fig. 1 dargestellten
entspricht.
Neben der RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität verfügt
die Reverse Transkriptase über eine DNA-abhängige DNA-
Polymerase-Aktivität. Letztere Aktivität läßt sich in
einem Modellsystem durch Zugabe von Actinomycin D, einem
in doppelsträngige DNA interkallierenden Antibiotikum,
spezifisch hemmen. Folglich wird in einem solchen System
nur die eigentliche Reverse Transkription, d. h. die RNA-
abhängige DNA-Polymerase-Aktivität der Reversen Transkriptase
gemessen.
Die Testreaktionen werden gemäß Beispiel 3 durchgeführt.
Es werden 10 µg pro 100 µg Testansatz Actinomycin D
(Boehringer Mannheim) aus einer 1 mg/ml Stammlösung zum
Reaktionsgemisch zugesetzt. Wie in Beispiel 3 dient bei
dieser enzymatischen Reaktion ausschließlich die endogene
virale RNA als Matrize und oligo(dT) als Primer Moleküle.
Die Ergebnisse dieser Testreihe sind in Fig. 3 zusammengefaßt.
Getestet wurden lediglich die Substanzen Foscarnet,
Suramin, N3T, NO.5M und T.
Aus Fig. 3 geht hervor, daß die Ergebnisse im wesentlichen
den in den Fig. 1 und 2 gezeigten Versuchsergebnissen entsprechen
und damit diese Versuchsergebnisse bzw. die
daraus ermittelten Wirkungsindices bestägigen.
Claims (12)
1. Verwendung von organischen Polymerisaten, die anorganische
anionische Gruppen enthalten, für Prophylaxe und
Therapie von Retrovirus-Infektionen in Säugern.
2. Ausführungsform nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das organische Polymerisat ein Kohlenhydrat ist, das
vorzugsweise keine COOH- und NH2-Gruppen enthält.
3. Ausführungsform nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß das polymere Kohlenhydrat aus Pentose-Monomeren
aufgebaut ist.
4. Ausführungsform nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß das polymere Kohlenhydrat aus Hexose-Monomeren
aufgebaut ist.
5. Ausführungsform nach Anspruch 3 oder 4, dadurch
gekennzeichnet, daß das polymere Kohlenhydrat aus Pyranoseresten
mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen besteht.
6. Ausführungsform nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet
daß die Pyranosereste Xylopyranosereste sind.
7. Ausführungsform nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß die Pyranosereste Glucopyranosereste sind.
8. Ausführungsform nach Anspruch 3, 5 und 6, dadurch gekennzeichnet,
daß das polymere Kohlenhydrat ein Pentosanpolysulfat
ist.
9. Ausführungsform nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
daß das polymere Kohlenhydrat Pentosanpolysulfat
MW5000 (T) ist.
10. Ausführungsform nach Anspruch 4, 5 und 7, dadurch gekennzeichnet,
daß das polymere Kohlenhydrat ein Dextransulfat
mit einem Molekulargewicht von mindestens 6000 ist.
11. Ausführungsform nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet,
daß das polymere Kohlenhydrat Dextransulfat
MW8000 (N8T) ist.
12. Ausführungsform nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet,
daß das polymere Kohlenhydrat Dextransulfat
MW500 000 (NO.5M) ist.
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| DE19863601136 DE3601136A1 (de) | 1986-01-16 | 1986-01-16 | Hemmstoffe der reversen transkriptase fuer prophylaxe und therapie von retrovirus-infektionen in saeugetieren |
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| DE3789561T DE3789561T2 (de) | 1986-01-16 | 1987-01-15 | Hemmer von "Reverse Transkriptase" zur Vorbeugung und Behandlung von Retrovirus-Infektionen bei Säugern. |
| AT87100477T ATE104148T1 (de) | 1986-01-16 | 1987-01-15 | Hemmer von ''reverse transkriptase'' zur vorbeugung und behandlung von retrovirusinfektionen bei saeugern. |
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