DE69736243T2

DE69736243T2 - 2-CYCLOPENTEN-1-ON UND SEINE DERIVATE ALS INHIBITOREN VON NF-kappa B

Info

Publication number: DE69736243T2
Application number: DE69736243T
Authority: DE
Inventors: Gabriella Maria Santoro; Antonio Rossi; Giuliano Elia
Original assignee: Consiglio Nazionale delle Richerche CNR
Current assignee: Consiglio Nazionale delle Richerche CNR
Priority date: 1996-12-13
Filing date: 1997-12-11
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2017-12-12
Also published as: CA2274108C; EP0951281B9; AU5855798A; IT1289250B1; EP0951281A2; US20020137800A1; JP2001505900A; DK0951281T3; WO1998025593A3; DE69736243D1; WO1998025593A2; EP0951281B1; EP1704855A2; ITRM960867A1; ATE331504T1; ITRM960867A0; PT951281E; US6696498B2; US6392100B1; CA2274108A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft 2-Cyclopenten-1-on und seine Derivate als Inhibitoren des Transkriptionsfaktors Nukleärer Faktor-kappaB (NF-kB). Insbesondere betrifft die Erfindung 2-Cyclopenten-1-on und seine Derivate umfassend den Cyclopentenon-Nukleus als Inhibitoren des Faktors NF-kB mit anti-entzündlicher, anti-proliferativer, immunsuppressiver, zytoprotektiver und antiviraler Aktivität.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
NF-kB (Nukleärer Faktor – kB) ist ein eukaryotischer Transkriptionsfaktor der rel-Familie, der normalerweise im Cytoplasma in einem inaktiven Komplex vorliegt, dessen vorherrschende Form ein Heterodimer ist, das aus p50- und p65-Untereinheiten zusammengesetzt ist und an inhibitorische Protein der IkB-Familie, üblicherweise IkB-alpha, gebunden ist (D. Thanos und Maniatis und Cell80: 529–532, 1995).
NF-kB wird in Reaktion auf unterschiedliche Reize aktiviert, zu denen Phorbol-Ester, entzündliche Cytokine, UV-Bestrahlung, bakterielle und virale Infektionen zählen. Die Stimulierung löst die Freisetzung von NF-kB aus IkB in Reaktion auf die Phosphorylierung und den folgenden Abbau des Proteins IkB-alpha aus (P. A. Baeuerle und T. Henkel, Annu. Rev. Immunol. 12: 141–179, 1994). Wenn er einmal aktiviert ist, transloziert NF-kB in den Nukleus, wo er an spezifischen kB-Stellen an DNA bindet und die Transkription einer Vielzahl von Genen induziert, die Proteine codieren, die bei der Steuerung der Immun- und Entzündungsreaktionen beteiligt sind, unter ihnen eine Vielzahl von Interleukinen, der Tumornekrosefaktor-alpha, die NO-Synthase und die Cyclo-Oxygenase 2 (S. Grimm und P. A. Baeuerle, Biochem. J. 290: 297–308, 1993). Entsprechend wird NF-kB als ein früher Mediator der Immun- und Entzündungsreaktionen betrachtet und er ist bei der Steuerung der Zellproliferation und bei der Pathogenese verschiedener Erkrankungen des Menschen, zu denen rheumatoide Arthritis (H. Beker et al., Clin. Exp. Immunol. 99: 325, 1995), Ischämie (A. Salminen et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 212: 939, 1995), Arteriosklerose (A. S. Baldwin, Annals Rev. Immunol. 14: 649, 1996) gehört, ebenso wie bei der Pathogenese des erworbenen Immundefizienzsyndroms (AIDS) infolge der verstärkten Transkription des menschlichen Immundefizienzvirus (HIV-1) in Gegenwart von aktiviertem NF-kB beteiligt. Die Erhöhung der Transkription von HIV-1 Virus-RNAs durch NF-kB wird durch die Anwesenheit von kB-Stellen in den (LTR) Sequenzen (langen terminalen Wiederholungssequenzen) des viralen Genoms bedingt (M. J. Lenardo und D. Baltimore, Cell 58: 227–229, 1989).
Es ist auch bekannt, das Prostaglandine (PGs) eine Klasse von natürlich auftretenden zyklischen Fettsäuren mit 20 Kohlenstoffen sind, die durch verschiedene Arten von eukaryontischen Zellen in Reaktion auf äußere Reize synthetisiert werden und eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von physiologischen Reaktionen spielen. Seit ihrer Entdeckung wurde gezeigt, dass PGs als Mikroumgebungshormone und intrazelluläre Signalvermittler dienen und eine große Anzahl von physiologischen und pathologischen Prozessen steuern, einschließlich der Zellproliferation und -differenzierung, der Immunantwort, von Entzündungen, des Zellschutzes und der Fieberreaktion. Insbesondere PGs vom Typ A und J, die eine Cyclopentenon-Struktur besitzen, sind starke Inhibitoren der viralen Replikation („Stress Proteins: Induction and Function" Schlesinger MJ, Garaci E., Santoro M. G., Herausgeber, Springer-Verlag, Heidelberg-Berlin, 27–44, 1990). Insbesondere ist vor kurzem gezeigt worden, dass Cyclopentenon-Prostaglandine die Replikation des HIV-1-Virus inhibieren, indem die Transkription viraler RNAs blockiert wird (C. Rozera et al. J. Clin. Invest. 97: 1795, 1996).
Es ist auch bekannt, dass die Hitzeschockproteine (HSPs), die auch als Stressproteine bezeichnet werden (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 8407–8411, 1989), eine Familie von Polypeptiden sind, die durch eukaryontische und prokaryontische Zellen in Reaktion auf Hitzeschock oder andere Arten von Umweltstress synthetisiert werden. Die HSPs werden durch eine zelluläre Untergruppe von Genen codiert, die als Stressgene identifiziert sind.
Die Autoren haben gezeigt, dass das Cyclopentenon-Prostaglandin PGA die Aktivierung von NF-kB in menschlichen Zellen inhibiert, indem die Phosphorylierung und der Abbau des inhibitorischen IkB-alpha-Proteins inhibiert wird (A. Rossi, G. Elia und M. G. Santoro, Cold Spring Harbour, New York 1.–5. Mai, 1996, Zusammenfassung S. 255).
Die Autoren haben vor kurzem ebenfalls gezeigt, dass die Inhibierung der Aktivierung von NF-kB einer der molekularen Mechanismen ist, der von Cyclopentenon-Prostaglandinen verwendet wird, um eine selektive und reversible Blockierung der Transkription von RNAs des HIV-Virus zu bedingen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Man hat nun festgestellt, das 2-Cyclopenten-1-on, die Struktur, die den zentralen Nukleus von PGA darstellt, eine Aktivität aufweist, die analog zu PGA ist, d. h. in der Lage ist, NF-kB-Aktivierung zu inhibieren, obwohl es nicht die entsprechende Säurefunktion und die aliphatischen Seitenketten aufweist. Man hat daher festgestellt, dass die Seitenketten, die in den PGA mit ihren Substituenten und Doppelbindungen vorhanden sind, insbesondere die Säurefunktion, die die Fettsäurenatur von Prostaglandinen mit sich bringt, beseitigt werden können, ohne die hierin oben beschriebene spezifische Aktivität wesentlich zu modifizieren. Man hat auch gefunden, dass die alpha,β-ungesättigte Carbonylgruppe in dem Cyclopentenon-Ring die Schlüsselstruktur ist, die für die NF-kB-Inhibierung erforderlich ist.
Darüber hinaus hat man festgestellt, dass die Inhibierung von NF-kB durch die Cyclopentenon-Gruppe mit der Fähigkeit in Beziehung steht, den HSF-Transkriptionsfaktor (Hitzeschocktranskriptionsfaktor) zu aktivieren, der für die Synthese von HSPs (Hitzeschockproteinen) verantwortlich ist.
Mit Blick auf die Tatsache, dass die NF-kB-Inhibierung mit HSF-Aktivierung verbunden ist, ist es offenkundig, dass Moleküle, die den Cyclopentenon-Kern enthalten, der NF-kB inhibiert, Induktoren des HSF-Faktors sein werden und sie werden deshalb Induktoren von Hitzeschockproteinen sein. Es ist deshalb ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, das 2-Cyclopenten-1-on und seine substituierten Derivate, die den Cyclopentenon-Kern enthalten, als Inhibitoren von NF-kB zu verwenden, wobei die Substituenten ausgewählt sind aus jenen, die die NF-kB-inhibitorische Wirkung nicht beeinträchtigen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das 2-Cyclopenten-1-on und seine pharamkologisch akzeptablen Derivate als Inhibitoren für NF-kB. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das 2-Cyclopenten-1-on und seine Derivate als Inhibitoren von NF-kB mit anti-entzündlicher, anti-proliferativer, immunsuppressiver, zytoprotektiver und antiviraler Aktivität.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind pharmazeutische Zusammensetzungen, die 2-Cyclopenten-1-on und/oder seine pharmazeutisch akzeptablen Derivate umfassen, um Medikamente mit anti-entzündlicher, anti-proliferativer, immunsuppressiver, zytoprotektiver und antiviraler Aktivität herzustellen. Insbesondere mit antiviraler Aktivität gegen das HIV-1-Virus und Viren, deren Transkription durch NF-kB gesteuert wird, einschließlich Herpesviren.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A zeigt die Dosis-abhängige Inhibierung der NF-kB-Aktivierung durch 2-Cyclopenten-1-on.
1B zeigt die Aktivierung des HSF-Faktors (Hitzeschocktranskriptionsfaktors) durch 2-Cyclopenten-1-on verbunden mit NF-kB-Inhibierung.
1C zeigt die Spezifität der chemischen Struktur, die für die NF-kB-Inhibierung verantwortlich ist.
1D zeigt die Spezifität der chemischen Struktur, die für die HSF-Aktivierung verantwortlich ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das 2-Cyclopenten-1-on ist ein bekanntes Produkt, das gemäß dem in Beilstein beschriebenen Verfahren (Daene, Eder, A. 539 [1939] 207, 211) synthetisiert werden kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist 2-Cyclopenten-1-on, bevorzugterweise bei Konzentrationen, die von 100 bis 500 μM reichen, in der Lage, NF-kB-Aktivierung in menschlichen Zellen zu inhibieren (1A).
Inhibitionstests wurden in lymphoiden menschlichen Zellen vom Typ T (Jurkat-Zelllinie), ebenso wie in anderen menschlichen Zelllinien durchgeführt. NF-kB-Aktivierung wurde mit 12-o-Tetradecanoyl-Phorbol-13-Acetat (TPA) stimuliert. 2-Cyclopenten-1-on war auch bei der Inhibierung von NF-kB-Aktivierung nach anderen Arten der Stimulierung wirksam, einschließlich Stimulierung durch Tumornekrosefaktor-alpha oder Virusinfektion, und bei verschiedenen Arten von menschlichen Zellen wirksam (Daten nicht gezeigt). Es wird gezeigt, dass NF-kB-Inhibierung mit der Aktivierung des HSF-Faktors verbunden ist (1B). Es wird auch bewiesen, dass die Fähigkeit, den NF-kB-Faktor zu inhibieren, für 2-Cyclopenten-1-on spezifisch ist, wohingegen ähnliche Moleküle, wie beispielsweise Cyclopentanon und Cyclopenten NF-kB nicht inhibieren (1C) und HSF nicht aktiveren (1D).
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse ist es möglich, 2-Cyclopenten-1-on ebenso wie seine pharmazeutisch akzeptablen Derivate als aktive Substanzen zu verwenden, um Medikamente herzustellen, insbesondere Medikamente, die den NF-kB-Faktor inhibieren und insbesondere:

– anti-entzündliche und immunsuppressive Medikamente mit Blick auf die Rolle von NF-kB bei der Stimulierung der Entzündungs- und Immunreaktionen;
– zytoprotektive Medikamente mit Blick auf die Rolle von NF-kB bei ischämischen und oxidativen Schäden;
– anti-proliferative Medikamente mit Blick auf die Rolle von NF-kB bei Zellproliferation;
– antivirale Medikamente mit Blick auf die Rolle von NF-kB bei der Aktivierung der Transkription viraler RNAs.

Die folgenden Beispiele werden angegeben, um die Erfindung zu veranschaulichen. Sie sollten auf jeden Fall als den Umfang der Erfindung selbst nicht-beschränkend betrachtet werden.
Die bei diesen Beispielen verwendeten Reagenzien, einschließlich 2-Cyclopenten-1-on, Cyclopenten, Cyclopentanon und 12-o-Tetradecanoyl-Phorbol-13-Acetat (TPA) waren Produkte von Sigma Aldrich. ³²P und ³⁵S wurden von AMERSHAM hergestellt. Fötales Kälberserum und Zellkulturmedien wurden von GIBCO hergestellt.
BEISPIEL 1
Die Wirkung der Behandlung mit 2-Cyclopenten-1-on auf die Aktivierung von NF-kB durch TPA wurde in Jurkat-Zellen getestet durch Verwendung der hierin im Folgenden beschriebenen und in 1 gezeigten Verfahrensweisen.
Dosis-Wirkungs-Beziehung
Die Zellen wurden gemäß den von C. Amici et al. (Cancer Research 55, 4452–4457, 1995) beschriebenen Verfahren hergestellt.
Die Zellen wurden mit 2-Cyclopenten-1-on bei unterschiedlichen Konzentrationen (125 bis 100 μM) für eine Stunde behandelt und dann mit TPA (25 ng/ml) stimuliert.
Nach drei Stunden wurden Ganzzellextrakte hergestellt und einem EMSA (Elektrophoresemobilitätsverschiebungstest) unterworfen, wie für NF-kB in U. Zabel et al. (J. Biol. Chem. 266: 242, 1991) und für HSF in C. Amici et al. (Cancer Res. 55: 4452, 1995) beschrieben, um die Aktivierung von NF-kB bzw. HSF zu bestimmen. Die Positionen des Komplexes NF-kB-DNA (NF-kB) und der nicht-spezifischen Bindung (ns) sind in 1A angegeben.
Die Positionen des Komplexes HSF-DNA (HSF), der HSF-DNA-konstitutiven Aktivität (CHBA) und der nicht-spezifischen Protein-DNA-Wechselwirkungen (ns) sind in 1B angegeben. Die Spur „Kontrolle" gibt die nicht-TPA-stimulierten Zellen als Kontrolle für nicht-aktivierten NF-kB an.
Wie offenkundig ist, ist 2-Cyclopenten-1-on in der Lage, die Aktivierung von NF-kB durch TPA selbst bei der niedrigeren Konzentration von 125 μM zu inhibieren. Bei der Konzentration von 500 μM fehlt die NF-kB-Bande (1A). Entsprechend der NF-kB- Inhibierung ist die Aktivierung von HSF in der gleichen Probe beginnend mit der Konzentration von 125 μM offenkundig (1B).
Spezifität der inhibitorischen Wirkung (1C)
Die Zellen wurden für eine Stunde mit der gleichen Konzentration (500 μM) von: 2-Cyclopenten-1-on (Spur 3), Cyclopentanon (Spur 4) oder Cyclopenten (Spur 5) behandelt und dann mit TPA (25 ng/ml) stimuliert. C stellt die nicht-TPA-stimulierte Kontrolle dar. Nach drei Stunden wurden die Ganzzellextrakte hergestellt und einem EMSA unterzogen, um die Aktivierung von NF-kB (1C) bzw. von HSF (1D) zu verifizieren. Wie offenkundig (i) aktiviert TPA NF-kB (Spur 2); (ii) inhibiert 2-Cyclopenten-1-on TPA-induzierte NF-kB-Aktivierung (Spur 3); inhibieren Cyclopentanon (Spur 4) und Cyclopenten (Spur 5) NF-kB-Aktivierung nicht.
Zusätzlich, wie in 1D gezeigt, ist in den gleichen Proben die Inhibierung von NF-kB, gezeigt in 1C, mit der Aktivierung von HSF verbunden. Diese Ergebnisse zeigen klar, dass die alpha,β-ungesättigte Carbonylgruppe die Schlüsselstruktur ist, die die Aktivierung von HSF auslöst und ihre Anwesenheit notwendig ist, um die NF-kB-Aktivierung zu inhibieren.

Claims

Zusammensetzung, die 2-Cyclopenten-1-on oder ein substituiertes Derivat davon mit einem Cyclopentenon-Kern umfasst, mit der Maßgabe, dass das Derivat nicht ein Prostaglandin oder ein Derivat mit einem Cyclopentenon-Kern mit zwei nebeneinander liegenden aliphatischen Seitenketten ist, für die Verwendung zur Behandlung einer Erkrankung, die mit einem Inhibitor von NF-kB behandelt werden kann.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Erkrankung (a) eine ansteckende virale Krankheit; (b) eine entzündliche Erkrankung; (c) eine mit einem immunosuppressiven Mittel behandelbare Erkrankung; (d) eine Erkrankung mit Zellvermehrung; (e) eine mit einem zytoprotektiven Mittel behandelbare Erkrankung; (f) Ischämie; (g) oxidative Zellschädigung; (h) Arteriosklerose; (i) rheumatische Arthritis; (j) AIDS; oder (k) eine Herpesvireninfektion ist.
Zusammensetzung nach einem der vorausgegangenen Ansprüche, wobei das 2-Cyclopenten-1-on oder das substituierte Derivat in einer Konzentration von zwischen 100 und 500 μM vorliegt.
Verwendung von 2-Cyclopenten-1-on oder einem substituierten Derivat davon mit einem Cyclopentenon-Kern, bei der Herstellung eines Medikaments, mit der Maßgabe, dass das Derivat nicht ein Prostaglandin oder ein Derivat mit einem Cyclopentenon-Kern mit zwei nebeneinander liegenden aliphatischen Seitenketten ist, wobei das Medikament für die Behandlung einer Erkrankung ist, die mit einem Inhibitor von NF-kB behandelt werden kann, wobei die Erkrankung: (a) eine ansteckende virale Krankheit; (b) eine entzündliche Erkrankung; (c) eine mit einem immunosuppressiven Mittel behandelbare Erkrankung; (d) eine Erkrankung mit Zellvermehrung; (e) eine mit einem zytoprotektiven Mittel behandelbare Erkrankung; (f) Ischämie; (g) oxidative Zellschädigung; (h) Arteriosklerose; (i) rheumatische Arthritis; (j) AIDS; oder (k) eine Herpesvireninfektion ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei das 2-Cyclopenten-1-on oder das substituierte Derivat in einer Konzentration von zwischen 100 und 500 μM benutzt wird.