AT392081B

AT392081B - Verfahren zur herstellung eines arzneimittels zur behandlung von virusinfektionen

Info

Publication number: AT392081B
Application number: AT0329284A
Authority: AT
Inventors: Akira Kaji
Original assignee: Akira Kaji
Priority date: 1983-10-17
Filing date: 1984-10-16
Publication date: 1991-01-25
Also published as: DK493584D0; PH21629A; GB2148302B; IT8468021A0; NZ209840A; DK493584A; IT1179144B; SE8405133L; AU578625B2; DK168061B1; SG31088G; US4689320A; SE8405133D0; MTP957B; SE466482B; GB8425799D0; ATA329284A; FR2553420A1; DE3437852A1; CH667593A5

Description

AT 392 081 B

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Oligo- und Polydeoxynucleotide, die mit einem Bereich einer bei der Virusvermehrung synthetisierten mRNA (Messenger RNA) hybridisieren und ihre Anwendung als therapeutische Wirkstoffe. Insbesondere betrifft die Erfindung die Anwendung der genannten Oligo- und Polydeoxynucleotide als die Virusvermehrung inhibierende Wirkstoffe.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf Arzneimittel, die entweder ein einzelnes oder ein Gemisch der vorstehend genannten Oligo- und/oder Polydeoxynucleotide sowie ein pharmazeutisch verträgliches Excipiens enthalten. Sie bezieht sich darüber hinaus insbesondere auf Arzneimittel zur Behandlung von Virusinfektionen, die die vorstehend genannten Substanzen enthalten. Derartige Arzneimittel können beispielsweise als Injektions-Lösung, als Augentropfen oder als Suppositorien konfektioniert werden. Die genannten Arzneimittel können so eingesetzt werden, daß die verabreichte Wirkstoffmenge entweder 1 bis 20 000 μg pro kg und Tag beträgt.

Bislang werden zur Behandlung von Viruskrankheiten chemisch synthetisierte Arzneimittel und Antibiotika als antivirale Wirkstoffe zur Inhibition der Virusvermehrung verwendet. Das antivirale Spektrum der chemisch synthetisierten Arzneimittel ist jedoch verhältnismäßig schmal und häufig haben derartige Arzneimittel schädliche Nebenwirkungen. Andererseits haben die verwendeten Antibiotika den Nachteil, daß ständig neue Antibiotika sowie Anstrengungen zur Verminderung jeglicher schädlicher Nebenwirkungen dieser Antibiotika erforderlich sind, denn im Laufe der Zeit werden die Viren resistent und schließlich immun gegenüber den verwendeten Antibiotika.

Im Rahmen der neueren Entwicklung der Biotechnologie, insbesondere der Gentechnologie, wurde die Identifizierung von Virus-Struktur-Genen ein großer Forschungsbereich innerhalb der Studien von Mikroorganismen. 1977 beschrieben S. C. Inglis et al. die in vitro Translation cytoplasmatischer, aus mit Influenza A-Virus infizierten Hühner-Embryo-Fibroblasten extrahierter RNA im zellfreien Weizenkeim-Protein-Synthesesystem mit dem Ergebnis, daß die Synthese Virus-spezifischer Polypeptide, die dem hybridisierten v-RNA-Segment entsprechen, vermindert ist (Virology 78, Seiten 522 - 536 (1977)). Die in dieser Veröffentlichung beschriebenen Experimente wurden jedoch in einem zellfreien System ausgeführt und haben keine Beziehung zur Untersuchung von Arzneimitteln. Eine solche Strukturgen-Identifizierung wird auch beschrieben von B. M. Paterson et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 74, Seiten 4370 - 4374 (1977)). Die Experimente von Paterson et al. wurden ebenfalls im zellfreien System ausgeführt. In den beiden genannten Veröffentlichungen wurde für die Inhibition der Proteinsynthese eine riesige genetische Struktur wie RNA verwendet. Im ersten Fall wurde die RNA aus Influenzaviren extrahiert, im zweiten Fall aus dem Kaninchen-ß-Globin-Clon pßGl. Es konnte nicht erwartet werden, daß eine solche riesige Struktur die intrazelluläre Proteinsynthese inhibiert. 1978 berichteten P. C. Zamecnik et al. das ein zur 3'- und 5'-terminalen repetitiven Sequenz des Rous-Sarcoma-Virus (RSV) komplementäres Oligodeoxy-Nucleotid-Tridecamer ein wirksamer Inhibitor der Proteinsynthese ausgehend von viraler RNA sowohl im zellfreien Weizenkeim-System (Proc. Nad. Acad. Sei. USA. 75, Seiten 285 - 288 (1978)) als auch in einem in vitro-Gewebe-Kultur-System ist (Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 75, Seiten 280 - 284 (1978)). In der ersten Referenz wird das zellfreie System noch wie vorstehend beschrieben verwendet Bezüglich der Verwendung von DNA ist es jedoch leicht verbessert Hier wird ein kleineres DNA-Molekül zur Inhibition der Translation von mRNA verwendet In der zweiten Veröffentlichung werden Experimente durchgeführt, bei denen in einem Gewebekultursystem zur Hemmung der Virusreplikation und der Zell-Trans-Formation das Tridecamer verwendet wird. Die in diesen Arbeiten zur Inhibition der Replikation und der Transformation verwendete DNA wurde nicht aus einem spezifischen codierenden Bereich ausgewählt. Im gleichen Jahr berichteten auch W. D. Hastie et al., daß die Hybridisierung von Globin mRNA mit ihrer korrespondierenden cDNA in einem zellfreien System spezifisch die Translation der mRNA inhibiert (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, Seiten 1217 - 1221 (1978)). Neu ist in dieser Arbeit lediglich, daß eine bestimmte codierende DNA-Region für die Inhibition der Translation mittels Hybridisierung von mNA ausgewählt wurde. Die dort erwähnten Versuche wurden jedoch immer noch in einem zellfreien System ausgeführt. Seit diesen Veröffentlichungen im Jahre 1978 bestand ein Bedürfnis für die Entwicklung von Arzneimitteln aufgrund der genannten Hypothesen. Bis heute gibt es jedoch keine Veröffentlichungen, die die praktische Anwendung der genannten Theorie in in vivo-Experimenten beschreibt. 1983 wurde eine PCT-Patentanmeldung veröffentlicht, die sich auf Oligonucleotide als therapeutische Wirkstoffe und Verfahren zu ihrer Herstellung bezieht (Molecular Biosystems Inc., WO83/01451). In dieser Anmeldung wird jedoch lediglich offenbart, daß (-)-Strang-DNA aus einem bestimmten codierenden Bereich SV40-transformierte Zellen inhibierte.

Obwohl die in vivo-Expression im Beispiel 1 dieser Veröffentlichung häufig verwendet wird, legen die dort genannten Beschreibungen aus dem Gesamtzusammenhang heraus betrachtet, nur in vitro-Experimente in Zellkultur-Systemen nahe. Selbst wenn solche in vitro-Experimente als in vivo-Experimente betrachtet werden, fehlen doch entsprechende genaue Angaben für die Bedingungen und sind nichts weiter als die bloße Erwähnung der Erwartung gewünschter Wirkungen. Wie dem auch sei, diese Veröffentlichung legt zum ersten Mal die Anwendung von RNA-DNA-Hybridisierungstechniken in einem Arzneimittel nahe, jedoch fehlen darin detaillierte Beschreibungen zur Verwendung als Arzneimittel. Deshalb ist die in dieser Patentanmeldung gegebene Lehre lediglich eine Zusammenfassung des in den vorgenannten Veröffentlichungen beschriebenen Standes der Technik. -2-

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Deshalb bestand ein dringendes Bedürfnis für einen völlig neuen antiviralen Wirkstoff zur Inhibition der Virusvermehrung in vivo in einem lebenden Tier, dessen Funktionsprinzip auf der RNA-DNA-Hybridisierungstechnik und damit auf der Inhibition der Translation viraler mRNA beruht

Es wurde gefunden, daß die Virusvermehrung am Infektionsort mit einem Oligodeoxynucleotid oder einem Polydeoxynucleotid, welches mit einer während der Virusvermehrung synthetisierten mRNA hybridisiert, gehemmt werden kann, sofern die genannten Wirkstoffe an den Infektionsort gelangen. Durch die Verabreichung der Oligo- und Polydeoxynucleotide an Tiere mit einer Virusinfektion, wird ein antiviraler Wirkstoff bereitgestellt, der die Virusvermehrung in vivo inhibiert

Wie vorstehend beschrieben, war die Hybridisierung von viraler oder von Globin-RNA mit der entsprechenden DNA zur Inhibition der Protein-Synthese bekannt Die Mehrzahl der diesbezüglichen Experimente wurde jedoch in einem zellfreien System durchgefuhrt. Ausnahmen sind Zamecnik's Veröffentlichung (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, Seiten 280 - 284 (1978)) sowie die Veröffentlichung von Molecular Biosystems Inc. WO-Al-83/01451). In letzterer wird die in vitro-Inhibition der Virus-Vermehrung in einem Zellkultur-System beschrieben. In den in vitro-Experimenten von Zamecnik wird jedoch nicht DNA aus einem spezifischen codierenden Bereich des Virus verwendet Der Begriff "codierender Bereich" bezeichnet dabei den Bereich viraler Gene, der eine wichtige Rolle bei der Translation viraler Proteine spielt und der durch die RNA-Polymerase in mRNA transkribiert wird. In der Veröffentlichung von Molecular Biosystems Inc. werden keine genauen Hinweise auf die experimentellen Bedingungen gegeben. Der vorliegenden Erfindung liegen sowohl umfassende Forschungsarbeiten und Experimente in in vitro als auch in in vivo-Systemen unter Verwendung spezifischer Oligo- oder Polydeoxynucleotide aus einem spezifischen codierenden Bereich zugrunde. Diese haben es zum ersten Mal ermöglicht, die Virusvermehrung mittels der RNA-DNA-Hybridisierungs-Technik in einem praktisch für die Therapie verwertbaren Ausmaß zu inhibieren. Dadurch wird die Verwendung bestimmter Oligo- oder Polydeoxynucleotiden als Arzneimittel zur Inhibition der Virusvermehrung möglich. Damit unterscheidet sich die vorliegende Erfindung in zwei wichtigen Punkten vom Stand der Technik, nämlich dadurch, daß mit der Virus mRNA hybridisierende DNA aus einem spezifischen codierenden Bereich ausgewählt wurde und dieses ausgewählte Deoxynucleotid kurz und einzelsträngig ist und außerdem dadurch, daß die vorstehend genannten Wirkstoffe durch umfassende in vivo-Experimente bis zur praktischen Anwendbarkeit entwickelt wurden.

Erfindungsgemäß wird also ein Arzneimittel zur Behandlung von Virus-Infektionen bereitgestellt, welches als Wirkstoff in geeigneter Konzentration ein Oligo- oder Polydeoxynucleotid oder ein Gemisch dieser Moleküle zusammen mit einem gebräuchlichen flüssigen Vehiculum oder Excipiens enthält. Diese Oligo- oder Polydeoxynucleotide sind dadurch gekennzeichnet, daß sie komplementär zu einem Bereich einer bei der Virusvermehrung synthetisierten mRNA sind und deshalb mit dieser mRNA hybridisieren können. Vorzugsweise beträgt die Länge der erfindungsgemäßen Oligo- und Polydeoxynucleotide etwa 9 bis 100 Nucleotide.

Es wird zum ersten Mal beschrieben, daß die Proteinsynthese, ausgehend von einer synthetischen RNA als mRNA in einem in vitro-Protein-Synthese-System durch ein mit dieser synthetischen RNA hybridisierendes Oligodeoxynucleotid inhibiert wird (vgl. das nachstehend beschriebene Beispiel 25). Oligodeoxynucleotide, die nicht mit der RNA hybridisieren, inhibierten die Proteinsynthese in diesem System nicht.

Darüber hinaus wurde gefunden, daß der (-)-Strang der α-Globin- oder ß-Globin-DNA entsprechende Oligodeoxynucleotide die Translation der zugehörenden mRNA spezifisch inhibieren (vgl. das nachstehend beschriebene Beispiel 26). Ferner wurde gefunden, daß die ß-Globin-DNA in diesem in vitro-System die Translation von ß-Globin-mRNA spezifisch inhibiert. Wenn bei diesen Versuchen DNA verwendet wurde, die nicht mit der α-Globin-mRNA hybridisiert, wurde die Bildung von α-Globin nicht inhibiert. Ebenso wurde die ß-Globin-Synthese nicht durch DNA inhibiert, die nicht mit der ß-Globin-mRNA hybridisiert. Weiterführend wurde gefunden, daß nicht nur langkettige DNA, sondern auch Oligodeoxynucleotide in diesem System aufgrund der Hybridisierung eine stark inhibierende Wirkung haben.

Auf der Grundlage dieser Experimente wurden weitere Experimente mit Herpes-simplex-Virus (HSV)-Infektionen durchgeführt Es wurde gefunden, daß die Anzahl von Syncytien (Plaque-ähnliche Löcher, die durch HSV mittels der Fusion infizierter Zellen hervorgerufen werden), die durch HSV hervorgerufen wurden, durch Verabreichung von DNA oder von Oligodeoxynucleotiden, die mit der sofort synthetisierten frühen mRNA von HSV hybridisieren an mit diesem Virus infizierten Zellen deutlich vermindert ist

Bei den vorstehend beschriebenen Experimenten wurde CaC^ und Calcium-Phosphat zusammen mit der DNA verwendet, um die DNA-Aufnahme in die Zelle zu stimulieren. In anderen Experimenten wurde jedoch gefunden, daß die Oligodeoxynucleotide auch ohne diese Calciumsalze aufgenommen werden können und, daß sie auch unter diesen Bedingungen die Vermehrung von HSV hemmen und die entsprechenden cytopatischen Effekte unterdrücken (vgl. das nachstehend beschriebene Beispiel 7).

Aus diesen Experimenten wurde deutlich, daß (-)-Strang-DNA durch Hybridisierung an eine HSV-l-mRNA die Bildung von Syncytien durch dieses Virus inhibiert Aufgrund dieser Beobachtung wurde die genannte DNA HSV-infizierten Mäusen verabreicht Dadurch wurde gezeigt daß eine solche DNA als antivirales Arzneimittel für die Behandlung von Virusinfektionen in vivo verwendet werden kann.

Dabei ist bemerkenswert, daß im erfindungsgemäßen Arzneimittel als Wirkstoff nur die (-)-Strang-DNA, die der mRNA eines bestimmten Virus-Gens entspricht verwendet wird. Aus diesem Grund wird die Biosynthese zellulärer Proteine, die von anderen mRNA-Molekülen gesteuert wird, nicht durch die Verwendung der vorstehend -3-

AT 392 081B beschriebenen DNA-Moleküle beeinflußt.

Es gibt zwei Gruppen von Viren, nämlich DNA-Viren (Herpes simplex-Virus, Adeno-Virus, Vaccinia-Virus u. a.) und RNA-Viren (Influenza-Virus, Rhino-Virus, Polio-Virus u. a.). RNA-Viren tragen entweder einzelsträngige RNA oder doppelsträngige RNA als Genom. Einzelstrang-RNA-Viren werden in solche 5 klassifiziert, die (+)-Strang-RNA tragen und in solche, die (-)-Strang-RNA als Genom tragen.

Virale Proteine müssen immer durch Translation einer viralen mRNA mit (+)-Strang-Polarität synthetisiert werden. Viren mit einem doppelsträngigen DNA-Genom bilden ausgehend von ihrer (-)-Strang-DNA (+)-Strang-RNA (mRNA). Was die doppelsträngigen RNA-Viren betrifft, so wird (+)-strängige RNA (mRNA) ausgehend vom (-)-RNA-Strang gebildet. Das Genom (+)-strängiger RNA-Viren fungiert selbst als mRNA, während das 10 Genom (-)-strängiger RNA-Viren als Matrize für die Bildung (+)-strängiger RNA (mRNA) dient

Erfindungsgemäß wird, unabhängig vom Entstehungsmechanismus der mRNA, die Translation einer Virus-mRNA und damit die Synthese viraler Proteine durch eine hybridisierende (-)-Strang-DNA inhibiert. Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung kann allgemein zur Inhibition der Virusvermehrung verwendet werden. Die in den Beispielen beschriebene Verwendung von Herpes-simplex-Virus (Doppelstrang-DNA-Virus) und 15 Influenza-Virus (Einzelstrang-RNA-Virus) dient lediglich der Erläuterung. Durch die erfindungsgemäßen Wirkstoffe kann also die Vermehrung von Viren inhibiert werden, wie Influenza-Virus, Adeno-Virus, Leukämie-Virus, Dengue-Virus, Rabies-Virus, Hepatitis-Virus, Masem-Virus, Encephalitis-Virus, Parainfluenza-Virus, Rhino-Virus, Gelbfieber-Virus oder Epstein-Barr-Virus.

Damit können die erfindungsgemäßen Wirkstoffe allgemein für Prophylaxe oder Behandlung verschiedener 20 Virusinfektionen von Tier, Mensch und Pflanze verwendet werden. Die entsprechenden Arzneimittel sind folglich sehr nützlich für verschiedene Anwendungen.

Aufgrund des Wirkungsprinzips der erfindungsgemäßen Wirkstoffe, wird die Vermehrung von RNA- oder DNA-Viren sowie das Aufireten der entsprechenden cytopathischen Effekte blockiert, ohne dabei die Wirtszellen zu beeinflussen. Außerdem kann durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe die Infektion von noch 25 nicht infizierten Wirtszellen verhindert werden. Erfindungsgemäß konnte gezeigt werden, daß die alleinige Anwendung von mit der sofort synthetisierten frühen mRNA des Herpes-simplex-Virus hybridisierenden Oligodeoxynucleotiden weder Auswirkungen auf normale, nichtinfizierte Baby-Hamster-Nierenzellen (BHK-Zellen) noch Auswirkungen auf Mäuse hatte. Daraus wurde gefolgert, daß die Oligodeoxynucleotide weder gefährliche Auswirkungen auf normale Zellen und Tiere haben, noch daß sie die Wachstumsgeschwindigkeit 30 dieser Zellen in irgendeiner Weise beeinflussen.

Die erfindungsgemäßen (-)-strängigen Deoxynucleotide können durch enzymatische Hydrolyse von DNA, Denaturierung und anschließende Trennung durch Affinitätschromatographie erhalten werden. Andererseits können auch synthetische (-)-strängige Oligodeoxynucleotide verwendet werden. Die bei den Experimenten verwendeten, erfindungsgemäßen (-)-strängigen Deoxynucleotide können also durch Anwendung verschiedener Verfahren 35 erhalten worden.

Bei der Klonierung eines RNA-Virus-Gens kann die reverse Transkriptase verwendet werden. In manchen Fällen kann virale DNA verwendet werden, die in den infizierten Zellen vorliegt und vom ursprünglichen RNA-Virus-Genom abgeleitet ist Als Klonierungsvektor kann beispielsweise der λ-Phage (Charon-Phage) oder das Plasmid pBR 322 verwendet werden. Um eine einzelsträngige (-)-Strang-DNA zu erhalten, wird der M 13-Phage 40 als Vektor verwendet Erfindungsgemäß können klonierte Fragmente aus dem codierenden Bereich des gesamten Virus-Genoms verwendet werden. Bevorzugt für die Hemmung der Virus-Vermehrung und der damit einhergehenden cytopathischen Effekte ist jedoch die Verwendung von Oligo- oder Pölydeoxynucleotiden, die den sofort exprimierten frühen Virus-Genen entsprechen. Ein rekombinanter M 13-Phage, der (-)-strängige VirusDNA enthält, oder ein rekombinanter DNA-Vektor, der doppelsträngige Virus-DNA enthält, kann durch 45 Züchtung großer Mengen von E. coli-Bakterien die diese Vektoren tragen oder mit dem genannten M 13-Phagen infiziert sind, isoliert werden. Die die viralen Gene tragenden Vektoren wurden isoliert und zur Gewinnung der viralen Gene mitRestriktionsendonucleasen geschnitten. Das Gemisch der ausgeschnittenen Virus-Gene und der Vektor-DNA wurde anschließend einer Agarose-Gel-Elektrophorese oder einer Sephadex-Säulen-Chromatographie zur Trennung des Virusgens von der Vektor-DNA unterzogen. Die so erhaltenen DNA-Moleküle wurden durch 50 partiellen Abbau mit DNA-Restriktionsendonuclease oder durch Ultraschall-Behandlung verkürzt Mit Hilfe der

Gel-Elektrophorese oder der Sephadex-Chromatographie wurden Virus-DNA-Fragmente einer Kettenlänge von 9 bis 100 Nucleoüden isoliert

Es wird daraufhingewiesen, daß nur der (-)-Strang der Virus-DNA wirksam bei der Inhibition der Virus-Protein-Synthese ist DNA von Vektoren, wie pBR 322 oder des λ-Phagen oder von der replikativen Form des 55 M 13-Phagen ist doppelsträngige DNA. Deshalb muß diese doppelsträngige DNA vor der Isolierung der (-)- Strang-DNA zunächst in einzelsträngige DNA übergeführt werden. Zu diesem Zweck können verschiedene Methoden angewendet werden. Beispielsweise kann DNA durch 10 Minuten langes Erhitzen auf 100 °C und anschließendes schnelles Abkühlen denaturiert werden.

Aus einem Gemisch der voneinander getrennten (-)-strängigen und (+)-strängigen DNA kann der (-)-Strang 60 beispielsweise durch Affinitätschromatographie isoliert werden. Zu diesem Zweck wird zunächst der (+)-DNA-Strang durch Klonierung im M 13-Phagen hergestellt. Dieser wird nachfolgend zur Verwendung bei der Chromatographie an einen Träger konjugiert Ein Gemisch aus (-)- und (+)-Strang-DNA wird dann über eine -4-

AT 392 081B Säule, die dieses Konjugat enthält, Chromatographien. Der (-)-Strang der DNA wird an diese Säule gebunden, während der (+)-Strang durchläuft Der gebundene (-)-DNA-Strang wird anschließend von der Säule eluien.

In einem anderen Verfahren wird die (-)-Strang-DNA in Form von Oligo- oder Polydeoxynucleotiden durch chemische Synthese erhalten.

Eines der sofon exprimierten frühen Gene des Doppelstrang-DNA-tragenden Herpes-Simplex-Virus,

Vmw 175, hat beispielsweise die (+)-Strang-DNA-Sequenz 5-ATG.GCG.TCG.GAG----.) und die (-)-Strang- DNA-Sequenz (3’-TAC.CGC.AGC.CTC......). Nur die (-)-Strang-DNA mit der bei TAC beginnenden

Sequenz kann mit einer ausgehend von Vmw 175 synthetisierten mRNA hybridisieren. Deshalb wird für die Oligodeoxynucleotid-Synthese ein DNA-Fragment ausgewählt, das identisch mit einer Partialstruktur des (-)-DNA-Stranges ist. Das Influenza-Virus-Genom enthält das Hämagglutinin-Gen undNS-(nicht-Struktur)-Gene. Das Hämagglutinin-Gen verschiedener Serotypen des Influenza-Virus unterscheidet sich in der RNA-Sequenz. Deshalb wird erfindungsgemäß eine einzelsträngige DNA bevorzugt, die mit mRNA der NS-Gene hybridisiert Die Verwendung von (-)-Strang-DNA, die mit mRNA da1 NS-Gene hybridisiert, wird erfindungsgemäß deshalb gegenüber der Verwendung von (-)-Strang-DNA, die mit mRNA des Hämagglutinin-Gens hybridisiert, bevorzugt weil das Hämagglutinin-Gen sehr häufig mutiert. Eine (-)-Strang-DNA, die mit mRNA des Hämagglutinin-Gens eines bestimmten Influenza-Virus-Stammes hybridisiert, wird deshalb nicht mit mRNA des Hämaglutinin-Gens eines anderen Serotyps des Influenza-Virus kreuzhybridisieren.

Eine weitere Erläuterung des Influenza-Virus-Gens NS-1 befindet sich in der Veröffentlichung von Lamb et al., (Cell 21, Seite 47 (1980)). Die DNA-Sequenz, die mit einer mRNA des NS-1 Gens hybridisiert, ist 5'.....ACT.TGA.CAC.AGT.GTT.GGA.ATC.CAT.....-3'. Deshalb wird ein Teil dieser Sequenz oder die gesamte Sequenz ausgewählt und synthetisiert.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können auch gegen Viren, wie das Rous-Sarcoma-virus, verwendet werden, die im Bereich der Viehzucht eine wichtige Rolle spielen. Beispielsweise sollte durch eine Inhibition der Expression eines der Gene gag, pol oder env die Vermehrung dieses Virus inhibierbar sein. Wenn beispielsweise die Expression des gag-Gens inhibiert werden soll, wird ein hybridisierendes DNA-Molekül, ein Oligo- oder ein

Polydeoxynucleotid verwendet, das einen Teil der Sequenz 5'-.....AAT.CAT.CTT.TAT.GAC.GGC.- TTC.....-3’ enthält, ausgewählt und synthetisiert. Die genannte RNA-Sequenz von pl9 ist ein Teil des gag-Gens.

Aus den vorstehenden Erläuterungen ergibt sich, daß im Prinzip für die Inhibition da- Virusvermehrung mittels eines einzelsträngigen (-)-Strang-DNA-Moleküls ein solches Molekül verwendet werden muß, daß mit der mRNA des Virus hybridisiert.

Im allgemeinen bezeichnet der Ausdruck "Oligodeoxynucleotid" ein Molekül, das eine kleinere Anzahl von Deoxynucleotid-Einheiten enthält, während der Begriff "Polydeoxynucleotid" ein Molekül beschreibt, das eine größere Anzahl von Deoxynucleotid-Einheiten enthält. Im Falle der Oligodeoxynucleotide ist die Anzahl der Nucleotid-Einheiten in dieser Erfindung beispielsweise bis zu 25. Deshalb können Deoxynucleotide, die mehr als 25 Deoxynucleotid-Einheiten enthalten in dieser Erfindung als "Polydeoxynucleotide” bezeichnet werden. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel zur Behandlung von Virusinfektionen enthalten Oligo- und/oder Polydeoxynucleotide, oder ein Gemisch dieser Moleküle, zusammen mit einem geeigneten flüssigen Vehiculum oder Excipiens oder gegebenenfalls mindestens einem Zusatzstoff. Sie werden in an sich bekannten Verfahren beispielsweise als Flüssigpräparate, Injektionspräparate oder Suppositorien hergestellt. Gegebenenfalls können die Oligo- und/oder Polydeoxynucleotide entweder einzeln oder in Kombination mit anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen verwendet werden. Dabei ist es selbstverständlich, daß diese anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen der antiviralen Wirkung der genannten Oligo- und/oder Polydeoxynucleotide nicht entgegenstehen sollten.

Die Oligo- und/oder Polydeoxynucleotide können gegebenenfalls zu äußerlich anwendbaren Präparaten konfektioniert werden, wie Cremes, Salben, Tropfen oder Pflaster. Zu diesem Zweck werden die Oligo- und/oder Polydeoxynucleotide mit einem geeigneten pharmakologisch inerten Vehikulum oder Excipiens vermischt.

Die flüssigen Träger oder Excipientien sowie die gegebenenfalls verwendeten Zusatz-Stoffe, die erfindungsgemäß als Zusatz zu den antiviralen Wirkstoffen verwendet werden, sind bekannt und im Handel erhältlich.

Beispiele der in den antiviral wirksamen Arzneimitteln verwendeten flüssigen Träger-Excipientien und Hilfsstoffe sind destilliertes Wasser für Injektionszwecke, physiologische Kochsalzlösung, eine wäßrige Dextroselösung, Pflanzenöle für Injektionszwecke, Propylenglykol, Polyäthylenglykol und Benzylalkohol (für Injektions- und flüssige Präparate); Vaseline, Pflanzenöle, tierische Fette sowie Polyäthylenglykol (für äußerlich anwendbare Präparate); isotonisch wirksame Stoffe, die Löslichkeitseigenschaften verbessernde Stoffe, Stabilisatoren, Farbstoffe, Antiseptika, Gleitmittel, und ähnliche Zusatzstoffe. Bei den Infektionspräparaten ist der Wirkstoff vorzugsweise in einem sterilisierten flüssigen Vehiculum gelöst. Es ist selbstverständlich, daß die vorstehend genannten verschiedenen flüssigen Vehiculi, Excipientien und Hilfsstoffe weder die antivirale Wirkung der Oligo- und/oder Polydioxynucleotide inhibieren noch diese stören sollen.

Die Oligo- und/oder Polydeoxynucleotide der vorliegenden Erfindung werden zusammen mit den vorstehend genannten Vehiculi oder Excipientien und gegebenenfalls zusammen mit den vorstehend beschriebenen Hilfsstoffen in an sich bekannter Weise verarbeitet. Injektionspräparate und Suppositorien können 1 bis 10 mg -5-

AT 392 081B der Oligo- und/oder Polydeoxynucleotide pro Ampulle oder Kapsel enthalten. Bei menschlichen Patienten beträgt die tägliche Dosis etwa 0,1 bis 1000 mg, vorzugsweise 1 bis 100 mg (von 10 bis 20 μg/kg bis 1000 bis 2000 μg/kg Körpergewicht). Die jeweilige Dosis für bestimmte Patienten hängt jedoch von einer Vielzahl von Faktoren ab, beispielsweise von der Wirksamkeit des verwendeten bestimmten Oligo- und/oder Polydeoxynucleotids, vom Alter, vom Gewicht, vom allgemeinen Gesundheitszustand, vom Geschlecht, von der Ernährung, von der Zeit und der Art der Anwendung, von der Abbaugeschwindigkeit, von der Kombination mit anderen in Zusammenhang damit verwendeten Medikamenten sowie von der Schwere der entsprechenden Krankheit, gegen die diese Therapie angewendet wird.

Die eifindungsgemäßen antiviralen Arzneimittel werden intravenös angewendet oder direkt auf den mit dem Virus infizierten Körperteil des Patienten aufgebracht, so daß die Oligo- und/oder Polydeoxynucleotide in geeigneter Menge zu den infizierten Körperteilen gelangen.

Um das Verständnis der Grundlagen der vorliegenden Erfindung zu erleichtern, wird im folgenden eine kurze Zusammenfassung der Eigenschaften von für die Erfindung nützlichen Nucleinsäure-Molekülen gegeben: 1. Eigenschaften und Struktur von DNA: Eine für die vorliegende Erfindung geeignete DNA muß mit einer mRNA hybridisieren, die während der Virusvermehrung erzeugt wird:

mRNA ΛΛΛΛΛΛιΓ [ΑΛΛΛΛΛ» " wvw\4 "ΛΛΛΛΛ.1 l 'www/i (a) (b) νυ^ν^ΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛΛ/ννΐ/νΐΛΛΛΛ/\Λι

mit der mRNA hybridisierende DNA

mit der mRNA nicht hybridisierende DNA DNA (a), die ein Segment enthält, das vollständig mit der mRNA hybridisiert und DNA (b), die ein Segment enthält, das teilweise mit der mRNA hybridisiert, ist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet. Dieses Merkmal wird durch den Ausdruck "mit der mRNA hybridisierende DNA" wiedergegeben. 2. Der für die Hybridisierung mit der mRNA gemäß der vorliegenden Erfindung ausgewählte DNA-Bereich muß innerhalb des Segmentes liegen, das vollständig oder zumindest teilweise mit mRNA hybridisiert. (i) (ü) WWWi (c) (üi) ΛΛΛΛΛΛ, (ΛΛΛ/Vii ΛΛΛΛι (d) -6-

AT 392 081 B

Im Falle von (c) wird ein Bereich (i) oder (ii) für die Hybridisierung ausgewählt, der vollständig mit der mRNA hybridisiert und damit den Anforderungen entspricht. Im Fall von (d) dagegen wird ein Bereich (iii) für die Hybridisierung ausgewählt, der außerhalb des Segmentes liegt, welches vollständig oder teilweise mit der mRNA hybridisiert. Der letztere erfüllt die entsprechenden Anforderungen nicht.

Daraus ergibt sich, daß die erfindungsgemäß verwendeten Oligo- oder Polydeoxynucleotide (A) oder (B) für die Hybridisierung an mRNA und die dadurch verursachte Inhibition der Translation von mRNA, d. h. die Proteinsynthese, in ihrer DNA-Sequenz identisch mit dem Bereich einer mit der mRNA hybridisierenden DNA (c) sein muß (beispielsweise 5'.....ACT.TGA.CAC.....ACT.TGA.CAC.....ATC.CAT.....-31).

(A) (B) (i) - | ‘4 i 8 ~ Lj «-•vvvj '//////A V////////////////M jvwww. (C) DNA

Oligo-oder Poly-deoxynucleotid

Vorzugsweise ist die Deoxynucleotidkette (A) oder (B) so kurz wie möglich, denn die Synthese eines kurzen Deoxynucleotids ist leicht und wirtschaftlich. Die Verwendung bestimmter Eicosamere (d. h. von Oligonucleotiden, die aus 20 Nucleotid-Einheiten bestehen) zum Erhalt einer stabilen Hybridisierung an mRNA, wird in den Beispielen der vorliegenden Erfindung beschrieben.

Die vorteilhafte Wirkung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe ist aus den Diagrammen der Figuren 1 bis 4 und den folgenden Beispielen ersichtlich.

Figur 1 ist eine graphische Darstellung der Resultate von Experimenten, die die inhibitorischen Wirkungen des Oligodeoxynucleotids 20A auf die cytophatischen Effekte von HSV-1 zeigen.

Figur 2 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse von Experimenten, die die inhibitorischen Wirkungen des Oligodeoxynucleotids 20A auf die Virusvermehrung zeigen.

Figur 3 ist eine graphische Darstellung der Wirkung einer bestimmten Kombination von Oligodeoxynucleotiden zur Inhibition der Virus Vermehrung und der dadurch verursachten pathogenen Veränderungen im Vergleich mit der Verwendung eines einzelnen Oligodeoxynucleotids.

Figur4 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse von Experimenten, die durchgeführt wurden, um die in vivo-Wiiksamkeit der erfindungsgemäßen antiviralen Wirkstoffe zu zeigen.

Die Beispiele 1 bis 5 beziehen sich auf die Herstellung von erfindungsgemäßen Oligo- und Polydeoxynucleotiden.

Beispiel 1

Herpes simplex-Virus DNA wurde durch eine Phenol-Chloroform-Extraktion isoliert. Die isolierte DNA wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten.

Die gespaltene DNA wurde dann in Gegenwart von T 4-Phagen-Ligase mit vorher mit BamHI behandelter pBR 322 Plasmid-DNA vermischt.

Das entstandene, ligierte Plasmide enthaltende Gemisch wurde E. coli-Bakterien verabreicht und die Bakterien, die das rekombinante Plasmid enthielten, wurden durch Inkubation auf mit Ampicillin angereicherten Agarplatten, auf denen sie Kolonien bildeten sowie durch Untersuchung auf Tetracyclin-Sensitivität selektiert. Unter den Tetracyclin-sensitiven-Kolonien wurden die Bakterien, die Herpes simplex-Virus-DNA enthalten durch die Filter-Hybridisierungs-Methode mit ^P-markierter Herpes-Virus-DNA als Sondenmolekül selektiert. Um DNA des rekombinanten Plasmids zu enthalten, wurden 2 x 10^ -10^ E. coli-Zellen, die das rekombinante Plasmid enthalten, in 2 ml TSB eingebracht CTryptose-Sojabohnenöl-Briihe).

Das inoculierte Medium wurde bei 37 °C in einem 20 ml Probenröhrchen etwa 15 Stunden geschüttelt, bis die optische Dichte (OD) des Kulturmediums bei 540 nm einen Wert von 0,5 (OD54Q = 0,5) erreichte. Bei dieser optischen Dichte wurde Chloramphenicol zu einer Endkonzentration von 100 μg/ml zugegeben und die Inkubation wurde weitere 15 Stunden lang fortgesetzt Die Bakteriensuspension wurde anschließend zentrifugiert und das Pellet wurde in einen Puffer, der 25 % Saccharose sowie 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) enthielt, resuspendiert Die Suspension wurde bei 0 °C 5 Minuten stehengelassen. Zu dieser Suspension wurden 4 ml Triton X 100 zugegeben und die sich ergebende viskose Lösung wurde 30 Minuten bei 0 °C und 30 000 g zentrifugiert Zum Überstand dieser Lösung (8 ml) wurden 8 g CsCl und 1 ml einer Ethidiumbromidlösung -7-

AT 392 081 B (5 μg Ethidiumbromid/ml) zugegeben. Die Mischung wurde weiter 48 Stunden bei 100 000 g zentrifugiert. Die rohe Plasmid-Fraktion, die durch diese Zentrifugation erhalten wurde, wurde mit 2 Volumina Isopropylalkohol vermischt und ein paar Minuten stehengelassen. Die obere Schicht wurde abgenommen und die DNA enthaltende Lösung wurde gegen 0,1-molar Tris-HCl und 10 mM EDTA (pH 8,0) über Nacht dialysiert

Die dialysierte Lösung wurde konzentriert und die 200 μg DNA enthaltende Lösung wurde mit einem Überschuß des Restriktionsenzyms BamHI behandelt. Die gespaltene DNA wurde durch Agarose-Gel-Elektrqphorese getrennt und die Herpes Simplex-Virus-DNA wurde aus dem Gel mittels Elektroelution isoliert. Weiterhin wurde die DNA partiell mit DNase verdaut, 10 Minuten auf 100 °C erhitzt und anschließend schnell abgekühlt. Auf diese Weise wurde DNA mit einer Kettenlänge von 9 bis 100 Oligodeoxynucleotiden erhalten.

Beispiel 2

Die replikative Form der M 13-Phagen-DNA (Doppelstrang-DNA) wurde mit BamHI geschnitten. Die so gespaltete M 13-DNA wurde vorher mit BamHI gespaltener und wie vorstehend beschrieben isolierter Herpes simplex-Virus-DNA vermischt. Die Ligierung erfolgte mit T 4-Phagen-Ligase. E. coli wurden mit der ligierten DNA in Gegenwart von CaC^ transfiziert. Die transfizierten Bakterien wurden auf Agarplatten ausplattiert.

Dabei wurde ein Top-Agar verwendet, der IPTG (Isopropyl-ß-D-thioglactopyranosid) und X-gal (ein Indikator) enthielt Herpes simplex-Virus DNA enthaltende rekombinante M 13-Phagen bilden innerhalb von 24 Stunden farblose Plaques aus. M 13-Phagen ohne Insertion bilden keine Plaques aus. Deshalb wurden die farblosen Plaques ausgewählt Um rekombinante M 13-Phagen zu selektieren, die die (-)-Strang-HSV-DNA enthalten, wurden die Phagen auf ihre Fähigkeit der Hybridisierung mit markierter (+)-Strang-HSV-DNA, die chemisch synthetisiert wurde, Oberprüft. Auf diese Weise wurden M 13-Phagen selektiert, die einen Teil der (-)-Strang-DNA von HSV enthalten. Die gewünschten rekombinanten M 13-Phagen wurden vermehrt und einzelsträngige DNA wurde aus diesen Phagen isoliert Zur weiteren Reinigung der einzelsträngigen HSV-DNA kann die M 13-Phagen-DNA aus dem Gemisch mit Hilfe einer Spaltung mit einem Restriktionsenzym in Gegenwart bestimmter Oligodeoxynucleotide entfernt werden. Andererseits kann das DNA-Gemisch ohne Reinigung partiell mit DNase gespalten werden und Oligodeoxynucleotide mit einer Kettenlänge zwischen 9 und 100 können isoliert werden.

Beispiel.?

Eine DNA-Synthese-Vorrichtung (Applied Biosystem Company) wurde verwendet um (-)-Strang-DNA des sofort exprimierten frühen Gens Vmw 175 oder ICP 4 des Herpes-simplex-Virus zu synthetisieren. In diesem Beispiel wurde die DNA-Sequenz 3'-CGC.AGC.CTC.TTG.TTC.GTC.GC-5' synthetisiert, die mit der mRNA von Vmw 175 hybridisiert Dieses Deoxynucleotid ist ein Eicosamer und wird nachstehend einfach als 20 A bezeichnet

Beispiel 4

Eine DNA-Synthesevorrichtung (Applied Biosystem Company) wurde zur Synthese von (-)-Strang-DNA des sofort exprimierten frühen Gens Vmw 12 des Herpes-simplex-Virus verwendet. In diesem Beispiel war die synthetisierte DNA-Sequenz 3,-GCA.CCC.GGG.ACC-TTT-ACC-GC-5'. Diese hybridisiert mit mRNA von Vmw 12. Dieses Deoxynucleotid ist ein Eicosamer und wird nachstehend einfach als 20 B bezeichnet

Beispiel 5

Eine DNA-Synthesevorrichtung (Applied Biosystem Company) wurde zur Synthese einer (-)-Strang-DNA des NS 1-Gens des Influenza-Virus verwendet. In diesem Beispiel war die synthetisierte DNA-Sequenz 3'-CTA.AGT.TTG.TGA.CAC.AGT.TCA-5'. Diese hybridisiert mit mRNA von NS-1. Dieses Deoxynucleotid ist ein Heneicosamer und wird nachstehend einfach als 20 C bezeichnet

Beispiel 6

Dieses Beispiel bezieht sich auf einen Versuch, durch den bestätigt wird, daß das Oligodeoxynucleotid die Synthese von Virusprotein in vitro inhibiert

Tabelle I zeigt den inhibitorischen-Effekt von 20 A auf die Vmw 175-Bildung und die entsprechenden cytopatischen Effekte (Syncytium-Bildung) von HSV 1

TatelM 20 A/Bohrung Relative Mengen von Relative Ausprägung

Vmw 175 des cytopathischen

Effekts (Syncytium) 1 1 33,6 pg 0,48 0,35 -8-

AT 392 081 B BHK-Zellen (1,5 x 10^) wurden in jede Bohrung (1,5 cm im Durchmesser) einer Limbro-Platte plattiert und MEM angereichert mit 10 % Kälberserum wurde zugegeben. Die Zellen wurden dann in einer 5-prozentigen CC^-Atmosphäre bei 36 °C inkubiert. Nachfolgend wurden die Zellen mit 5 mol HSV-1 in Gegenwart oder Abwesenheit von 20 A infiziert. Nach 5 Stunden wurde das Medium entnommen. Die Zellen wurden dann 1 Stunde lang mit 35S-Methionin (100 μ(2ί/μ1) in Kontakt gebracht. Anschließend wurde 20 A abgebaut und die Proteine wurden über eine Polyacryl-amid-Gel-Elektrophorese mit nachfolgender Autoradiographie analysiert. Zur Auswertung des relativen cytopathischen Effekts wurden identische Bedingungen zu den vorstehend beschriebenen angewendet, mit der Ausnahme, daß die Anzahl der Syncytien 13 Stunden nach der Infektion bestimmt wurde. Unter diesen Bedingungen wurde kein Absinken der zellulären Protein-Synthese beobachtet.

Beispiel 7

Dieses Beispiel bezieht sich auf einen Versuch, durch den bestätigt wird, daß das Oligodeoxynucleotid von Zellen aufgenommen wird.

Dieses Beispiel zeigt, daß das einzelsträngige Oligodeoxynucleotid 20 A tatsächlich in kultivierte Zellen eindringt. BHK-Zellen (Baby-Hamster-Nieren-Zellen; 4,4 x 10^ Zellen) wurden mit 7,6 x 104 PFU- von HSV-l/ml infiziert. Kontrollzellen wurden nicht infiziert, jedoch mit der gleichen Menge Kulturmedium versehen. Die Zellen wurden 3 Stunden in einem COj-Inkubator bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen 7,66 pMol ^P-markiertem 20 A ausgesetzt. Nach der Behandlung mit dem markierten 20 A wurde das Kulturmedium entfernt und die Zellen wurden zweimal mit 0,3 ml PBS gewaschen.

Die Zellen wurden dann 30 Minuten bei 36 °C in einer Lösung mit 0,1 M NaCl, 33 μΜ ZnC^, 3360 Einheiten Nuclease S1 und 33,3 mM Natriumacetatpuffer (pH 4,5) stehengelassen.

Nachfolgend wurden die Zellen zweimal mit dem vorstehend beschriebenen Puffer, jedoch ohne Nuclease S1, gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in 0,3 ml einer Lösung mit 10 mM EDTA, 0,6 % Natriumdodecylsulfat und 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) aufgeschlossen. An diesem Punkt wurde TCA-unlösliches, Nuclease S1-sensitives radioaktives 20 A gemessen. Es wurde gefunden, daß mindestens 4,68 x 103 Moleküle 20 A pro Zelle während der Behandlungsdauer von 8 Stunden aufgenommen worden waren.

Die tatsächliche Menge ist wahrscheinlich 10 mal höher als dieser Wert, denn die terminalen 3%-Phosphate weiden schnell hydrolysiert

Das folgende Beispiel 8 veranschaulicht, daß 20 A eine inhibitorische Wirkung auf die Virusvermehrung hat Beispiel 8

Etwa 1,5 x 105 BHK-Zellen wurden pro Bohrung (1,5 cm im Durchmesser) einer Limbro-Platte ausgebracht. Diese Zellen wurde in 5 % COj 48 Stunden bei 36 °C inkubiert und mit HSV-1 (7,6 x 104 PFU/ml) in 160 μΐ MEM infiziert. Die Infektion wurde 3 Stunden bei 36 °C in 5 % CC>2 ausgeführt Nach der Infektion wurden die infizierten Zellen mit 20 A behandelt. Nach einer Behandlungsdauer von 8 Stunden wurde das Medium gegen normales MEM mit 10 % Kälberserum ausgetauscht 15 Stunden nach der Infektion wurde das Kulturmedium geerntet und die Virustiter wurden besdmmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengefaßt

Tabellen

Relative Virus-Menge

Menge von 20 A/Bohrung 0 100 0,112 μg 45 0,224 μg 35

Die Beispiele 9 bis 13 beziehen sich auf Experimente, durch die bestätigt wird, daß das Oligodeoxynucleotid die Zerstörung von Tier-Zellen in vitro durch das Virus inhibieren.

Beispiel 9 (a) Etwa 1,5 x 10^ BHK-Zellen wurden in jede Bohrung (1,5 cm im Durchmesser) einer Limbro-Platte für Zellkultur ausgebracht. Die Zellen wurden 47 Stunden bei 36 °C in 5 % CO2 inkubiert und anschließend mit 160 μ! HSV 1 (7,6 x 104 PFU/ml) 3 Stunden bei 36 °C infiziert. Zu diesen infizierten Zellen wurde ein -9-

AT 392 081B

Komplex aus Calciumphosphat und 20 A in verschiedenen Mengen zugegeben. Die Calcium-Konzentration der Medien betrug zwischen 1,36 mMol und 24,8 mMol, je nach 20 A-Konzentration. Der Komplex wurde, wie von Ruddle et al beschrieben, hergestellt (Loiter et al., Proc. Nat. Acad. Sei. 79, S. 422 (1982)). Die infizierten Zellen wurden 8 Stunden mit 20 A behandelt Das Kulturmedium wurde dann entfernt und gegen ein normales Kulturmedium ohne 20 A ausgetauscht Die Zellen wurden anschließend weitere 13 Stunden gezüchtet (b) Die Kontrollzellen wurden auf die gleiche Art und Weise behandelt, mit Ausnahme der Zugabe von 20 A (Ca-Phosphat-Kontrolle). (c) Als weitere Kontrolle wurde eine infizierte Kultur hergestellt, die weder mit Ca-Ionen noch mit 20 A behandelt wurde (Virus-Kontrolle). Die wie vorstehend beschrieben präparierten Gewebekultur-Zellen (a), (b) und (c) wurden fixiert gefärbt und die Anzahl der Syncytien wurde bestimmt

Das Ergebnis dieses Experiments ist in Figur 1 dargestellt Dabei gibt die X-Achse (Abszisse) die DNA-Menge als zugegebene Menge in μg pro Bohrung an (d. h. "pg DNA/Bohrung"). Die Y-Achse (Ordinate) gibt die Anzahl der in einer Zellkultur ausgebildeten Syncytien im Vergleich zu einem Wert an, der im Versuch (c) ("Virus-Kontrolle") erhalten wurde (d. h. "% Syncytien-Anzahl"), wobei der letztere Wert immer als 100 angenommen wurde. Die Kurve (a) (- · -) zeigt die Ergebnisse des Experimentes (a), die Kurve (b) (-- o ~) zeigt die Ergebnisse des Experimentes (b): Wie in Figur 1 gezeigt wurde die Ausbildung von Syncytien durch 20 A bemerkenswert inhibiert Calciumphosphat oder Calciumchlorid beeinflußten die Syncytien-Anzahl nicht

Beispiel 10 (a) etwa 1,5 x 10^ BHK-Zellen wurden pro Bohrung (1,5 cm im Durchmesser) einer Limbro-Platte ausgebracht. Die Zellen wurden 47 Stunden lang bei 36 °C mit 5 % C02-Atmosphäre inkubiert Zu diesen

Zellen wurden 160 μΐ HSV-1 (7,6 x 10^ PFU/ml) zugegeben. Die Infektion wurde 3 Stunden bei 36 °C durchgeführt. Zu auf diese Weise infizierten Zellen wurden verschiedene Mengen 20 A in Form eines Calciumchlorid-Komplexes zugegeben, so daß die End-Ca-Ionen-Konzentration 4,55 mM betrug. Die Behandlung wurde 8 Stunden fortgesetzt Die Zellen wurden dann weitere 14 Stunden inkubiert (b) Zusätzlich wurde eine zur vorstehend beschriebenen Kultur (a) identische Kultur hergestellt wobei jedoch ein Oligodeoxynucleotid, hergestellt wurde, das nicht mit der HSV-l-Sequenz 5'-CAC.GAC.AGA.GGG.CGA.-3’ verwandt war, und mit diesem inkubiert. Alle anderen Bedingungen waren identisch zum Versuch (a). (c) Es wurde eine ähnliche Kultur, jedoch ohne 20 A hergestellt und unter den vorstehend genannten Bedingungen inkubiert Diese wird nachstehend als "Virus-Kontrolle" bezeichnet

Die Zellen der vorstehend beschriebenen Versuche (a), (b) sowie (c) wurden fixiert, gefärbt und die Anzahl der Syncytien wurde bestimmt. Die Ergebnisse dieses Eyperiments sind in Figur 2 dargestellt. Dabei gibt die X-Achse (Abszisse) die pro Bohrung zugegebene DNA-Menge in pg an (d. h. "pg DNA/Bohrung") und die Y-Achse (Ordinate) gibt die Anzahl der in einer Zellkultur ausgebildeten Syncytien im Vergleich zu einem Wert an, der im Versuch (c) ("Viruskontrolle") erhalten wurde (d. h. ”% Anzahl der Syncytien"), wobei der letztere Wert immer als 100 angenommen wurde. Die Kurve (a) (- · -) zeigt die Resultate des Experimentes (a), die Kurve (b) (-- o --) zeigt die Ergebnisse des Experimentes (b).

Wie in Figur 2 gezeigt, hat 20 A eine inhibitorische Wirkung auf die Anzahl der von HSV-1 gebildeten Syncytien. Aus diesem Experiment kann geschlossen werden, daß 20 A die Syncytien-Bildung in Gegenwart von 4,55 mM Calcium-Ionen inhibiert Oligodeoxynucleotide, die nicht mit der bekannten DNA-Sequenz des Herpessimplex-Virus verwandt sind, hatten keine inhibitorische Wirkung. Aus diesem Experiment wurde deutlich, daß die (-)-Strang DNA des Herpes simplex-Virus spezifisch die cytopathischen Effekte des Herpes simplex-Virus inhibiert.

Beispiel 11

In Beispiel 9 wird die erzielte Wirkung unter Verwendung des synthetischen Eicosamers 20 A, das mit dem (-)-Strang der HSV-DNA verwandt ist, gezeigt. Dieses Experiement bezieht sich auf die Wirkung clonierter Herpes simplex-Virus-DNA. Es war auch unter Verwendung eines HSV 1-DNA-enthaltenden, rekombinanten pBR 322 Vektors möglich die Syncytium-Bildung durch HSV-1 zu inhibieren (1,45 Megadalton, erhalten durch Spaltung der HSV-l-DNA mit BamHI und Einbau der Fragmente in pBR 322). In diesem Experiment wurde die HSV-l-DNA nicht aus dem rekombinanten Plasmid ausgeschnitten. Die denaturierte und partiell gespaltene HSV-l-DNA-enthaltende, rekombinante pBR 322-DNA wurde wie in Beispiel 9 beschrieben, in jede Bohrung einer Limbro-Platte eingebracht (0,16 pg). Die Wirkung wurde wie in Beispiel 9 beschrieben ausgewertet und eine Inhibition der Syncytien-Bildung wurde beobachtet. Als Kontrolle wurde für dieses Experiment pBR 322 DNA verwendet In diesem Kontrollexperiment wurde keine Inhibition beobachtet

Beispiel 12

Dieses Beispiel zeigt einen synergistischen Effekt eines Gemisches aus Oligodeoxynucleotiden.

Etwa 1,5 x 105 BHK-Zellen wurden in jede Bohrung (1,5 cm im Durchmesser) einer Limbro-Platte ausgebracht Die Zellen wurden 47 bis 48 Stunden bei 36 °C in 5 % CO2 inkubiert und mit HSV-1 -10-

AT 392 081 B (7,6 x 10^ PFU/m) in 160 μΐ MEM infiziert. Die Infektion wurde 3 Stunden bei 36 °C in 5 % CO2 ausgeführt. Nach der Infektion wurde 20 A alleine oder im Gemisch mit 20 B (224:1) in einem Lösungsmittel gelöst und 0,3 ml dieser Lösung wurden in Gegenwart von 4,55 mM Calcium-Ionen zur Behandlung der Zellen verwendet. Die Behandlung der Zellen mit 20 A und 20 B wurde 8 Stunden durchgeführt.

Andere Zellen wurden wie vorstehend beschrieben behandelt, jedoch wurde kein 20 A und 20 B zugegeben. Dieser Versuch wird nachstehend als "Virus-Kontrolle" bezeichnet.

Die Zellen wurden fixiert, gefärbt und die Anzahl der Syncyüen wurde bestimmt. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Figur 3 dargestellt. Dabei steht die X-Achse (Abszisse) für die zu jeder Bohrung zugegebene DNA Menge in μg und die Y-Achse (Ordinate) gibt die Anzahl der in einer Zellkultur ausgebildeten Syncytien im Vergleich zu einem Wert an, der im Versuch "Virus-Kontrolle" erhalten wurde (d. h. "% Anzahl der Syncytien"), wobei der letztere Wert immer als 100 angenommen wurde. Die als "20 A" bezeichnete Kurve (- ° -) zeigt die Resultate der Experimente mit 20 A allein, die als "20 A + 20 B (224:1)" bezeichnete Kurve (—«—) zeigt die Resultate der Experimente mit 20 A und 20 B in einem Mischungsverhältnis von 224:1. Wie in Figur 3 gezeigt, war der beobachtete in vitro-Effekt bei Verwendung eines Gemisches von 20 A und 20 B stärker als bei Verwendung von 20 A allein. Aus diesem Ergebnis wird geschlossen, daß die gemeinsame Verwendung (-)-strängiger DNA-Moleküle die verschiedenen Bereiche der DNA-Sequenz (-)-strängiger DNA aus Herpes simplex-Virus entsprechen, die Wirksamkeit als antiviralem Wirkstoff Signifikat erhöht.

Beispiel 13

Dieses Beispiel zeigt die Wirkung von (-)-Strang-01igodeoxynucleotiden von NS-1 auf den von Influenza-Viren hervorgerufenen cytopathischen Effekt Die Ergebnisse der Untersuchung sind in der Tabelle III zusammengefaßt, das experimentelle Vorgehen wild nachstehend genauer beschrieben.

Tabelle ΙΠ

Oligodeoxynucleotide O-tg/ml)

Relativer Wert, bezogen auf die Anzahl überlebender Zellen 0,21 0,49 0,49 0,40 0 0,02 1,30 5,00

Schweine-Nieren-Kitazato (SKK)-Zellen (1,5 x 10^/0,1 ml) wurden in 5 % fötalem Kälberserum enthaltendem MEM gezüchtet und in je eine Bohrung (0,5 cm im Durchmesser) einer Mikrotiterplatte ausgebracht. Diese Zellen wurden 24 Stunden bei 35,5 °C in einer 5-prozentigen CC^-Atmosphäre im vorstehend genannten Medium inkubiert. Das Medium wurde dann entfernt und 100 μΐ eines Mediums, enthaltend verschiedene Mengen des Oligodeoxynucleotids 20 C, wurden in jede Bohrung zugegeben. Anschließend wurden die Zellen weitere 24 Stunden in einer 5-prozentigen COj-Atmosphäre inkubiert. Die Lösung wurde dann entfernt und 50 μΐ Medium, enthaltend 10 TCID50 Einheiten Influenza A-Virus, wurden zu jeder Bohrung zugegeben. Außerdem wurden 50 μΐ des Kulturmediums, enthaltend verschiedene Mengen 20 C zu jeder Bohrung zugegeben. Anschließend wurden die Zellen weitere 48 Stunden inkubiert Danach wurde das Medium entfernt und 100 μΐ Hank's Lösung, enthaltend 0,1 % Neutral-Rot, wurden zu jeder Bohrung zugegeben und die Zellen wurden 1 Stunde bei 35,5 °C in 5 % CC^-Atmosphäre inkubiert. Die Lösung wurde entnommen und die Zellen wurden mit 10 μΐ 80-prozentigem Äthanol gewaschen und anschließend wurden 50 μΐ 0,1 N HCl zugegeben. Die relative Anzahl der überlebenden Zellen wurde durch Messung der optischen Absorption bei 577 nm mit ELISA bestimmt. Die überlebenden Zellen nahmen Neutral-Rot auf, während die Nicht-überlebenden Zellen kein Neutral-Rot aufnahmen. Deshalb entspricht die höhere optische Dichte einer höheren Anzahl überlebender Zellen.

Die nachfolgenden Beispiele 14 bis 20 zeigen die in vivo-Wirkung der Oligodeoxynucleotide als antiviralem Wirkstoff.

Beispiel 14

Etwa 1 x 104 PFU HSV-1 (F-Stamm) in 30 μΐ MEM wurden in die Intracerebralhöhlen von 3 Wochen alten B ALB/c-Mäusen injiziert. Die Virus-Suspension enthielt verschiedene Mengen 20 A. Zusätzlich wurden täglich während 3 Tagen 200 μΐ einer MEM-Lösung, enthaltend 1 % Penicillin, Streptomycin und 2 mM Glutaminsäure und verschiedene Mengen 20 A in die Intraperitoneal-Höhlen injiziert, wobei 1 Tag nach der Injektion von -11-

AT 392 081 B HSV-1 begonnen wurde. Für den 7. Tag wurde die Mortalitätsrate in Prozent berechnet Das Ergebnis des Experiments ist in Figur 4 dargestellt Dabei gibt die X-Achse (Abszisse) die in jede Maus injizierte DNA-Menge in μg an, d. h. "pg DNA/Maus" und die Y-Achse (Ordinate) die Mortalitäts-Rate in % im Vergleich zu derjenigen an, die in einem Kontcoll-Veisuch erhalten wurde, bei dem die Mäuse eine Injektion derselben Lösung, jedoch ohne 20 A erhielten, wobei die Mortalitäts-Rate der Kontrolle immer als 100 angenommen wurde. Aus Figur 4 geht hervor, daß die Mortalitätsrate in Abhängigkeit von der angewendeten Menge von 20 A reduziert wurde.

Die Zeichnung gibt die Mortalitätsrate als Prozentsatz im Vergleich mit der Kontroll-Mäuse-Gruppe an, die überhaupt kein 20 A erhielt.

Beispiel 15

Etwa 1 x 104 PFU HSV-1 (F-Stamm) in 30 μΐ MEM-Lösung, die verschiedene Mengen 20 A enthielt, wurden in die Intracerebralhöhlen 3 Wochen alter BALB/c-Mäuse injiziert. Zusätzlich wurden einmal täglich 200 μΐ einer Lösung, enthaltend verschiedene Mengen 20 A, 1 % Penicillin und Streptomycin sowie 2 mM Glutaminsäure intraperitoneal injiziert. Dabei wurde 1 Tag nach der Injektion von HSV-1 begonnen.

Die Behandlung wurde während 6 aufeinanderfolgender Tage fortgesetzt. Die Mortalität der Mäuse wurde 64 bis 68 Stunden nach der HSV-l-Injektion bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.

Tabelle IV

Dosis

Mortalität der Mäuse 5/19 0,224 pg/Maus 0/9 2,240 pg/Maus 0/10

Wie aus der Tabelle entnommen werden kann, starben in der Kontrollgruppe 5 von insgesamt 19 Mäusen, wenn kein 20 A verabreicht wurde. Andererseits starben bei Verabreichung von 0,224 pg 20 A oder 2,240 pg 20 A zu diesem Zeitpunkt keine Mäuse (insgesamt wurden 19 Mäuse mit beiden Konzentrationen behandelt).

Beispiel 16

Etwa 5 x 104 PFU HSV-1 (F-Stamm) in 30 pl einer MEM-Lösung, die verschiedene Mengen 20 A enthielt, wurden in die Intraceiebral-Höhlen von 3 Wochen alten BALB/c-Mäusen injiziert. Die Mortalitätsrate der Mäuse wurde 64 bis 68 Stunden oder 71 bis 78 Stunden nach der Injektion untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt:

Tabelle V

Dosis Mortalität zwischen Mortalität zwischen 64 und 68 Stunden 71 und 78 Stunden - 3/10 3/10 1,12 pg/Maus 0/10 2/10 11,2 pg/Maus 0/10 0/10

Aus dieser Tabelle kann entnommen werden, daß in der Kontrollgruppe, die kein 20 A enthielt, 3 Mäuse von insgesamt 10 Mäusen starben. Andererseits war die Mortalität der Mäuse, die das Virus in Gegenwart von 20 A erhielten, stark reduziert.

Beisniel 17

Etwa 5 x 104 PFU HSV-1 (F-Stamm) in 30 pl MEM-Lösung, die bestimmte Mengen 20 A enthielt, wurde in die Intracerebralhöhlen von 3 Wochen alten BALB/c-Mäusen injiziert. Zusätzlich wurden ab dem Tag nach der Injektion 30 pl einer MEM-Lösung, enthaltend verschiedene Mengen 20 A, 1 % Penicillin und Streptomycin sowie 2 mM Glutaminsäure in die Intracerebralhöhlen injiziert

Die Behandlung wurde 2 Tage lang fortgesetzt und die Mortalität der Mäuse wurde zu verschiedenen -12-

AT 392 081 B

Zeitpunkten nach der Injektion des Virus untersucht Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengefaßt.

Tabellejyi

Mortalität

Dosis Zwischen Zwischen Zwischen 64 und 68 Stunden 71 und 78 Stunden 88 und 92 Stunden 3/10 7/10 2/20 5/20 1/10 1,12 pg/Maus 0/20

Wie aus dieser Tabelle entnommen werden kann, war die Mortalität bei den Kontrollmäusen, die kein 20 A erhielten, signifikant höher als bei den Mäusen, die mit 20 A behandelt wurden. Obwohl die Wirksamkeit von 20 A anscheinend bei 88 bis 92 Stunden nach der Injektion abnimmt, war die Mortalität bei den Kontrollmäusen selbst unter diesen Bedingungen noch höher.

Beispiel 18

Etwa 1 x 10^ PFU HSV-1 (F-Stamm) in 200 μΐ MEM-Lösung, die 1,12 μg 20 A enthielt, wurden in die Peritonealhöhlen 3 Wochen alter BALB/c-Mäuse injiziert. Zusätzlich wurden etwa 3 oder 2 Stunden vor der HSV-l-Injektion sowie 1 Tag nach der Injektion von HSV-1200 μΐ einer MEM-Lösung, enthaltend verschiedene Mengen 20 A, intraperitoneal in die infizierten Mäuse injiziert. Die intraperitoneale Injektion von 20 A wurde 2 Tage lang fortgesetzt. Die Mortalität wurde 211 und 259 Stunden nach der Injektion von HSV-1 untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengefaßt.

Tabelle Vn

Dosis Mortalität bei Mortalität bei 211 Stunden 259 Stunden 2/10 0/10 1/10 0,224 μg/Maus 0/10

Wie aus dieser Tabelle entnommen werden kann, starb eine von 10 Mäusen (bei 211 Stunden nach der Injektion) oder zwei von insgesamt 10 Mäusen (bei 259 Stunden nach der Injektion), wenn 20 A nicht verabreicht wurde. Andererseits starben unter den gleichen Versuchsbedingungen keine Mäuse, die 0,224 μg 20 A erhielten.

Beispiel 19

Die Cornea 3 Wochen alter BALB/c-Mäuse wurde durch 5-maliges Kratzen mit einer scharfen Injektions-Nadel verletzt. Auf diese verwundete Cornea wurden 30 μΐ MEM-Lösung, enthaltend 1 % Penicillin, Streptomycin, 2 mM Glutaminsäure, 5 % Kälberserum sowie 3 x 10^ PFU HSV-1 (F-Stamm) aufgebracht. Die so behandelten Mäuse wurden in vier Gruppen (A), (B), (C) und (D) wie nachstehend beschrieben eingeteilt, die Augen dieser Mäuse wurden untersucht und die Ergebnisse wurden photographisch festgehalten. (A) Auf die Cornea-Membran dieser Mäuse wurden 10 μΐ einer MEM-Lösung, enthaltend 22,4 pg 20 A/ml 2 Stunden vor dem Aufbringen von HSV-1 (F-Stamm) aufgetropft. Zusätzlich wurde eine solche Behandlung täglich ab dem auf die HSV-1 (F-Stamm) Verabreichung folgenden Tag durchgeführt. Zusätzlich erhielten diese Mäuse 5 Stunden vor der Injektion von HSV-1 (F-Stamm) Tropfen einer Lösung, enthaltend Cortison-Acetat (2 mg/kg Maus-Körpergewicht). Die Cortisonbehandlung wurde ebenso täglich fortgesetzt (B) In die Augen der Mäuse wurden 2 Stunden vor der Verabreichung von HSV-1 (F-Stamm) 10 μΐ einer MEM-Lösung, die 22,4 pg 20 A/ml enthielt, eingebracht. Die Behandlung mit 20 A wurde jeden zweiten Tag fortgesetzt (C) Diese Mäuse erhielten wie vorstehend in (A) beschrieben, 30 μΐ einer Cortison-Acetat enthaltenden Lösung (2 mg/kg Körpergewicht). (D) Auf die Cornea-Membran dieser Mäuse wurden 2 Stunden vor der Behandlung mit HSV-1 (F-Stamm) 10 pg einer MEM-Lösung aufgebracht. Zusätzlich wurde ab dem Tag nach der Behandlung mit HSV-1 (F- -13-

AT 392 081B

Stamm) eine ähnliche Behandlung mit MEM-Lösung jeden zweiten Tag durchgeföhrL

Der Zustand der Augen und der die Augen umgebenden Bereiche jeder Maus wurden unter besonderer Beachtung von Entzündungen und der Schließung der Augen mit pathologischen Symptomen untersucht. Die Untersuchung wurde am 4., 7. oder 12. Tag nach dar Behandlung durchgeführt. Die Mäuse der Gruppe (A) und der Gruppe (B) zeigten viel weniger pathologische Symptome an den Augen und den umgebenden Bereichen als die Mäuse der Gruppen (C) und (D), die nicht 20 A erhielten.

Weiterführend kann also gefolgert werden, daß die Wirksamkeit von 20 A nicht durch die Verwendung von Cortison beeinflußt wird.

Die folgenden Beispiele 20 und 22 erläutern die Herstellung verschiedener erfindungsgemäßer antiviraler Arzneimittel.

Beispiel 20

Ein Oligodeoxynucleotid identisch zum 20 A, das in Beispiel 3 erhalten wurde, wird gemäß der Triestermethode (unter Verwendung eines Triesters der entsprechenden Nucleotide in flüssiger Phase) synthetisiert. Zu 2 g so hergestelltem 20 A wird eine isotonische MEM-Lösung bis zu einem Endvolumen von 1 Liter Injektions-Lösung zugegeben. Anschließend wird die Lösung in Ampullen abgefüllt Dieses Injektions-Präparat enthält 2 mg 20 A/ml und wird subkutan in einer Dosis von 1 bis 5 ml so nahe als möglich zum infizierten Körperteil verabreicht, wenn ein Symptom beobachtet wild.

Beispiel 21

Ein Oligodeoxynucleotid identisch zum 20 B, das in Beispiel 4 erhalten wurde, wird nach der Triestermethode synthetisiert Zu 10 g des auf diese Weise synthetisierten 20 B wird eine isotonische MEM-Lösung bis zu einem Endvolumen von 1 Liter zugegeben. Dies ist eine Stammlösung für ein 1-prozentiges Augentropfen-Präparat Dieses Augentropfen-Präparat wird mehrfach täglich in einer Dosis von 2 bis 3 Tropfen verabreicht, wenn ein Symptom beobachtet wird.

Beispiel 22

Ein Oligodeoxynucleotid identisch zum 20 A, das in Beispiel 3 erhalten wurde, wird nach der Triester-Methode synthetisiert. 1 g des auf diese Weise synthetisierten 20 A wird zu einem feinen Pulver vermahlen und 999 g gereinigte Kakaobutter werden zu diesem feinen Pulver zugegeben. Das Gemisch wird in einem Wasserbad bei 60 °C geknetet und dann zu Suppositorien mit jeweils 2 g verformt. Jedes Suppositorium enthält 2 mg 20 A und wird entsprechend dem Symptom verwendet

Die folgenden Beispiele 23 und 24 erläutern die Sicherheit der erfindungsgemäßen antiviralen Wirkstoffe.

Beispiel 23

Wenn 20 A in einer Menge von 100 pg/kg intraperitoneal B ALB/c-Mäusen verabreicht wird, werden bei den Versuchs-Tieren keine Veränderungen beobachtet

Beispiel 24

Als Test für die Bestätigung der im vorstehenden Beispiel beschriebenen Wirkung, wurde der gleiche Test wie in Beispiel 19 beschrieben, ausgeführt, mit der Ausnahme, daß nicht HSV-1 verwendet wurde. Bei diesem Test wird kein Unterschied zwischen der Gruppe der Versuchstiere, der 20 A verabreicht wurde und der Gruppe, der 20 A nicht verabreicht wurde, gefunden.

Im Hinblick auf die vorstehend beschriebenen Beispiele ist es offensichtlich, daß die erfindungsgemäßen antiviralen Wirkstoffe in einer wirksamen Dosis des Oligo- und Polydeoxynucleotids sicher sind.

Die nachstehend beschriebenen Beispiele sollen zeigen, daß ein in vitro-Protein-Synthese-System tatsächlich durch die Hybridisierung des (-)-Strang-01igodeoxynucleotids mit der mRNA inhibiert wird. Diese Ergebnisse untermauern den theoretischen Hintergrund dieser Erfindung.

Beispiel 25 (Referenzbeispiel 1)

Dieses Beispiel erläutert die Inhibition der Polyphenylalanin-Synthese in Abhängigkeit von Poly U durch Oligodeoxyadenylsäure.

Das Reaktionsgemisch (40 μΐ) enthielt 140 pg Poly U, Phenylalanin (10^ cpm, 300 microcurie/Mikromol), E. coli Extrakt, hergestellt nach Nirenberg und Mathaei (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 47, Seite 1588 (1961)), 13 mM Magnesiumacetat, 1 mM ATP, 1 mM Creatingphosphat, 1 pg Creatingphosphokinase, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und verschiedene Mengen Oligodeoxyadenylsäure. Die Reaktionsgemische werden in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen eingebracht und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Menge synthetisierten Polyphenylalanins wurde durch Messung der in 95 °C heißer, 10-prozentiger Trichloressigsäure unlöslichen Radioaktivität bestimmt. Die Zählung wurde in einem Flüssig-Scintillations-Zähler durchgeführt. Die Hemmung in Prozent wurde als Verhältnis zum Polyphenylalanin-Synthese-Wert in -14-

AT 392 081B

Abwesenheit der Oligodeoxyadenylsäuie berechnet Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengefaßt

Tabelle vm

Inhibitor

Dosis Inhibition der poly-

Qxg) Phenylalanin-Synthese

Kontrolle - 0 poly-Deoxyadenylsäuie 50 98 oligo-Deoxyadenylsäure (lONucleotide) 100 88 oligo-Deoxyadenylsäure (9Nucleotide) 100 99 oligo-Deoxyadenylsäure (8Nucleotide) 100 15 oligo-Deoxyadenylsäure (7Nucleotide) 100 0

Aus Tabelle VIII geht hervor, daß die poly-Deoxyadenylsäure die mit Polyuridylsäure hybridisiert, ein bemerkenswert starker Inhibitor der Polyphenylalanin-Synthese ist Weiterhin kann aus dieser Tabelle entnommen werden, daß oligo-Deoxyadenylsäure mit einer Kettenlänge von mehr 9 Nucleotiden eine stark inhibitorische Wirkung hat

Beispiel 26 (Referenzbeispiel 2)

Das nachstehend beschriebene Experiment ist ein Nachweis dafür, daß Oligodeoxynucleotide eukariontische mRNA-Aktivität durch Ausbildung von Hybriden mit dieser mRNA inhibieren können. Das Reaktionsgemisch (30 μΐ) enthält 4,2 mM Calciumphosphat, 2 mM Dimethylthiothreit (DTT), 0,08 mM jeder Aminosäure (außer

Methionin), 6 mM Calciumacetat, 8 mM Magnesiumacetat, 4,5 μg Spermidin, 0,1 μα ^S-Methionin und 10 μΐ eines Kaninchen-Reükulocyten-Extraktes, das nach Jackson und Pelham hergestellt wurde (Europ. J. Biochem. 67, Seiten 247 - 256 (1976)). Der Inhibitor wurde in einer 21 mM HEPES-Lösung gelöst und wie in Tabelle IX beschrieben, dem Reaktionsgemisch zugesetzt

Tabelle IX

Inhibitor Dosis (Mfi) % Inhibition der a-Globin-Synthese % Inhibition der ß-Globin-Synthese Kontrolle - 0 0 genomische a-Globin- DNA 0,06 60 0 genomische ß-Globin- DNA 0,06 0 65 Kalbsthymus DNA 0,06 10 10 -15-

Claims

AT 392 081B Tabelle IX (Fortsetzung! Inhibitor Dosis (ßg) % Inhibition % Inhibition der α-Globin- der ß-Globin- Synthese Synthese 15 Oligodeoxynucleotid von genomischer a-Globin-DNA 0,06 88 0

15-Oligodeoxy-nucleotid vom M13 0,06 5 2 Wie aus Tabelle IX hervorgeht, inhibiert (-)-strängige α-Globin-DNA spezifisch die a-Globin-Synthese, während (-)-strängige ß-Globin-DNA spezifisch die ß-Globin-Synthese inhibiert. Mit Kalbsthymus-DNA wurde keine signifikante Inhibition beobachtet. Aus diesen Befunden kann geschlossen werden, daß (-)-Strang-DNA eines eukariontischen Gens spezifisch die Synthese des von diesem Gen codierten Proteins inhibiert. Oligodeoxynucleotide mit einer Kettenlänge von 15, die der NE^-terminalen Aminosäuresequenz des a-Globins entsprechen, inhibierten die Synthese von a-Globin. Diese Beobachtung deutet darauf hin, daß einzelsträngige (-)-Strang-DNA mit einer Kettenlänge von nur 15 Nucleotiden ausreicht, um spezifisch die Synthese des entsprechenden Proteins zu inhibieren. Das Kontroll-Oligonucleotid (M 13 Phagen-DNA mit einer Kettenlänge von 15 Nucleotiden) zeigte keine signifikante inhibitorische Wirkung. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Virusinfektionen, dadurch gekennzeichnet, daß man aus mindestens einem Fragment aus dem codierenden Bereich des Virus-Genoms ein Oligo- oder Polydeoxynucleotid isoliert, das mit einem Bereich einer bei der Virusvermehrung synthetisierten mRNA hybridisiert, und das Oligo- oder Polydeoxynucleotid gegebenenfalls mit einem zur Behandlung von Virusinfektionen geeigneten Excipiens versetzt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Oligo- oder Polydeoxynucleotid einsetzt das durch chemische Synthese hergestellt wurde. Hiezu
3 Blatt Zeichnungen -16-