DE69931809T2

DE69931809T2 - Antibakterielle protonierte oligonukleotide

Info

Publication number: DE69931809T2
Application number: DE69931809T
Authority: DE
Inventors: M. Roderic Wilsonville DALE; Amy Bethel ARROW; L. Steven Lake Oswego GATTON; Terry West Linn THOMPSON
Original assignee: Oligos Etc Inc
Current assignee: Lakewood-Amedex Inc Sarasota Fla Us
Priority date: 1998-12-30
Filing date: 1999-12-15
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2019-12-16
Also published as: CA2358570C; DE69931809D1; EP1140965B1; CA2358570A1; EP1140965A1; ATE328893T1; US6211349B1; AU2187300A; JP2002534433A; WO2000040591A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet modifizierter Nukleinsäuren und insbesondere auf Nukleinsäuren, die als antibiotische Mittel verwendet werden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es wurde ehemals angenommen, dass pathogene Bakterien, die für Infektionskrankheiten verantwortlich sind, durch die Verwendung einer Batterie von Antibiotika, wie zum Beispiel Penicillin, Streptomycin, Tetracyclin und andere, kontrollierbar wären. Seitdem die weit verbreitete Verwendung von Antibiotika in den 1950ern begann, haben sich jedoch mehr und mehr Bakterien weiterentwickelt, um gegenüber einem oder mehreren Antibiotika resistent zu werden. Stämme, die gegen mehrere Medikamente resistent sind, sind zunehmend häufig, insbesondere in Krankenhäusern.
Gegenwärtig zeigen nosokomiale Staphylococcen-Infektionen Resistenz gegenüber mehreren Medikamenten. Siehe zum Beispiel Archer et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother. 38: 2231–2237. Zu diesem Zeitpunkt ist das übrig bleibende Antibiotikum, das die Fähigkeit zeigt die meisten Stämme von Staphylococcen abzutöten, Vancomycin. Es wurden jedoch bereits Vancomycin resistente Stämme von sowohl Staphylococcus als auch Enterococcus von Zabransky et al., 1995, J. Clin. Microbiol. 33(4): 791–793 isoliert und berichtet. Ferner wurde die Übertragung der Resistenz von Enterococcen auf Staphylococcen zuvor von Woodford et al., 1995, J. Antimicrob. Chemother. 35: 179–184 dokumentiert. Streptococcus pneumoniae ist ein Hauptgrund für Morbidität und Mortalität in den Vereinigten Staaten (M. M. W. R., Feb. 16, 1996, Vol. 45, No. RR-1). Jedes Jahr verursachen diese Bakterien 3000 Fälle von Meningitis, 50.000 Fälle von Bakterämie, 500.000 Fälle von Lungenentzündungen und 7.000.000 Fälle von Mittelohrentzündungen. Die Sterblichkeitsraten sind trotz Antibiotikatherapie für Bakterämie größer als 40% und für Meningitis größer als 55%. In der Vergangenheit waren Streptococcus pneumoniae gleichmäßig gegenüber Antibiotika empfindlich; es sind jedoch Antibiotika resistente Stämme aufgetreten und werden in einigen Gemeinden weit verbreitet.
Zusätzlich gibt es Umstände, wo die Resistenz gegen Antibiotika kein Problem ist und dennoch ein bestimmtes Bakterium gegenüber einer Behandlung, die konventionelle Antibiotika verwendet, unempfänglich bleibt. Das ist der Fall mit Escherichia coli 0157:H7, einem Verursacher von Lebensmittelvergiftung und Todesfällen aufgrund ungegartem Fleisch. Das Landwirtschaftsministerium schätzt, dass aufgrund dieser Bakterien jeden Tag 10 Personen sterben und weitere 14.000 krank werden. Unglücklicherweise sind konventionelle Antibiotika gegen diesen Organismus vollständig unwirksam.
Die Geschichte der Antibiotikabehandlung von pathogenen Bakterien ist zyklisch. Bakterien sind bemerkenswert anpassungsfähige Organismen und für jedes neue Antibiotikum, das entwickelt worden ist, treten durch die weit verbreitete Verwendung des Antibiotikums resistente Bakterienstämme auf. Daher besteht konstanter Bedarf neue Antibiotika herzustellen, um die nächste Generation von Antibiotika resistenten Bakterien zu bekämpfen. Herkömmliche Verfahren zur Entwicklung neuer Antibiotika haben sich verlangsamt und in den letzen zwei Jahren wurde nur ein neues Antibiotikum von der FDA zugelassen. Ferner „gibt es keine neuen antimikrobiellen Klassen mit Aktivität gegen resistente Gram positive Bakterien am Horizont" gemäß Kristinsson (Microb. Drug Resistance 1(2): 121 (1995)).
Die Antisense-Therapie verwendet Nukleinsäuren, um spezifisch die ungewollte Expression von Genen in Zellen zu hemmen. Antisense Nukleinsäuren können verwendet werden, um an eine RNA, typischerweise eine messenger RNA, zu hybridisieren und deren Funktion zu hemmen, indem sie RNAse H aktivieren oder physikalisch die Bindung von Ribosomen oder Proteinen blockieren, und somit die Translation der mRNA verhindern. Antisense Nukleinsäure schließen RNAs mit katalytischer Aktivität (Ribozyme) ein, die selektiv an Komplementärsequenzen einer Ziel-RNA binden können und das Ziel physikalisch zerstören, indem sie eine Spaltreaktion vermitteln.
Antisense Nukleinsäuren, die an die DNA an der richtigen Stelle binden, können ebenfalls verhindern, dass die DNA in RNA transkribiert wird. Es wird angenommen, dass diese Antisense Nukleinsäuren an Doppelstrang-DNA binden (und Dreifach-Strang DNA bilden) und dadurch die Genexpression hemmen.
Nukleinsäuren haben ebenfalls als Aptamere Verwendung gefunden, in denen der Wirkmechanismus das Ergebnis der Interaktion mit anderen Molekülen als DNAs oder RNAs, zum Beispiel Proteinen, ist.
Es wurde ebenfalls gezeigt, dass Nukleinsäuren als Antwort auf die Gegenwart eines CG Motivs das Immunsystem stimulieren (Yamamoto et al., 1994, Antisense Res. Devel. 4: 119–122; Krieg et al., 1995, Nature 374: 546–549). Der Mechanismus dieser Stimulation ist nicht klar, aber scheint keinen Antisense-Mechanismus einzuschließen.
Es wurde gezeigt, dass das Schicksal von internalisierten Nukleinsäuren für den Erfolg einer Therapie mit Nukleinsäure kritisch ist (Bennett, 1993, Antisense Res. Devel. 3: 235–241). Der schnelle intrazelluläre Abbau von Nukleinsäuren kann ein Hindernis für ihre Verwendung sein. Eines der Hauptprobleme bei der Verwendung von natürlich auftretenden Phosphodiester Nukleinsäuren ist ihr schneller Abbau durch Nukleasen in Säugetierzellen oder in Serum enthaltendem Kulturmedium (Cohen, 1989, Oligodeoxynucleotides; Antisense Inhibitors of Gene Expression, Boca Raton, FL, CRC Press). Es gibt reichlich Belege, dass die Modifikation des Rückgrats von Nukleinsäuren unterschiedliche Grade an Nukleaseresistenz verleiht. Hoke et al., 1991, Nucl. Acids Res. 19: 5743, verglichen Nukleinsäuren mit Phosphodiester-Rückgrat mit vollständig mit Phosphorthioat-Rückgrat modifizierten Nukleinsäuren und mit Nukleinsäuren mit chimärem Phosphodiester und Phosphorthioat Rückgrat. Hoke et al. zeigten, dass die Phosphorthioat-Nukleinsäuren bis zu 45 Mal langsamer abgebaut wurden als die Nukleinsäuren mit Phosphodiester oder chimärem Rückgrat.
Es gibt Berichte, dass chimäre Nukleinsäuren, deren Enden mit nukleaseresistenten Rückgratbindungen gesichert sind, gegenüber dem Abbau resistent sind (Cohen, 1989, Oligodeoxynucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression, Boca Raton, FL, CRC Press). Hoke et al. lehren jedoch, dass capped Nukleinsäuren schnell durch intrazelluläre Endonukleasen abgebaut werden und daher das capping von Nukleinsäuren mit nukleaseresistenten Modifikationen nicht ausreichend sein mag, um in Zellen die pharmakologischen Aktivitäten von Nukleinsäuren aufrecht zu erhalten. Schließlich kommen Hoke et al. zu dem Schluss, dass, obwohl das capping von Nukleinsäuren in der Zellkultur Schutz vor Exonukleasen verleihen kann, die Wirkung intrazellulärer Endonukleasen ausreichend ist, um diese capped Nukleinsäuren abzubauen, wenn sie in eine Zelle gelangen.
Eine weitere Beschränkung der therapeutischen Verwendungen von Nukleinsäuren war ihre schlechte Bioverfügbarkeit. Die orale Bioverfügbarkeit kann durch sauren Abbau im Darm, enzymatische Spaltung im Darm, schlechte Absorption im Darm und die Wirkungen der ersten Passage durch die Leber beeinflusst werden (Hughes et al., 1995, Pharmaceutical Research 12: 817). Crooke berichtete sehr begrenzte (< 5%) Bioverfügbarkeit von Nukleinsäuren in Nagetieren (S. Crooke, 1997, in Antisense Nucleic Acid and Antisense RNA: Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, B. Weiss ed., CRC Press Boca Raton, FL., S. 17). Der normale pH der gastrischen Salzsäure (HCl) im Magen beträgt zwischen 1 und 2 (A. Goth, 1974, Medical Pharmacology: Principles and Concepts, The C. V. Mosby Company, Saint Louis, MO). Nukleinsäuren sind gegenüber Säure-Depurination und der Spaltung des DNA oder RNA Rückgrats empfindlich. Das Aussetzen von Nukleinsäuren gegenüber einem pH von 1–2 für eine so kurze Zeit wie 10 Minuten bei Raumtemperatur verursacht Depurination.
Die einzige gegenwärtige Bemühung Nukleinsäuren als Antibiotika zu verwenden, hat ihre Verwendung als Antisense Moleküle, die darauf gerichtet sind an spezifische bakterielle Gene zu hybridisieren und deren Expression und dadurch das Bakterienwachstum zu hemmen, eingeschlossen. Siehe Lupski et al., Pat. No. 5,294,533 ('533 patent) und PCT Veröffentlichung Nr. WO 96/29399. Obwohl dieses Verfahren wirksam sein kann, ist es im Umfang seiner Verwendung und der Stärke der Wirkung beschränkt und die Verwendung eines Antisense Moleküls ist auf einen bestimmten Zielorganismus oder nahe verwandte Organismen begrenzt.
Es besteht ein Bedarf für eine neue Klasse von Breitspektrum-Antibiotika, die gegen einen weiten Bereich von Bakterien, einschließlich Bakterien, die gegenüber vielen konventionellen Antibiotika resistent sind, wirksam ist. Zusätzlich besteht der Bedarf für ein solches Breitspektrum-Antibiotikum, das für den damit behandelten Wirt nicht toxisch ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liefert protonierte/azidifizierte Nukleinsäuren, die in vitro und in vivo sowohl gegen Medikamenten resistente als auch Medikamenten empfindliche Bakterien wirksame Antibiotika sind. Diese modifizierten Nukleinsäuren sind als bakterizide oder bakteriostatische Mittel unabhängig von der spezifischen Sequenz oder Länge des Nukleinsäuremoleküls wirksam. Die Nukleinsäuren der Erfindung sind protoniert/azidifiziert und können nukleaseresistente Rückgrate, säureresistente Rückgrate und, in ihrer bevorzugten Ausführungsform, sowohl säureresistente als auch nukleaseresistente Rückgrate besitzen. Die Nukleinsäuren der Erfindung sind protoniert/azidifiziert, um, wenn sie in Wasser aufgelöst sind, einen pH von 4 bis ungefähr 1, bevorzugter einen pH weniger als 2 bis ungefähr 1 zu ergeben.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung die therapeutische Verwendung von protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren als antibakterielle Mittel bereit. Insbesondere sind die protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren der Erfindung gegen alle Bakterienarten wirksame antibakterielle Mittel und können sowohl pharmazeutisch als auch kosmetisch angewandt werden, um bakterielle Infektionen in Menschen oder anderen Tieren zu behandeln oder zu verhindern. Die bevorzugte Behandlungsmethode umfasst die Verabreichung von protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren an das Tier in einer Menge, die ausreichend ist, um Bakterienwachstum zu hemmen oder zu verhindern, um die Symptome des bakteriellen Wachstums zu lindern oder in einer Menge, die wirksam ist, um eine bakterielle Infektion zu behandeln.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die therapeutische Verwendung von Nukleinsäuren zur Behandlung oder zum Verhindern von Krankheiten, die virale Infektionen, entzündliche Krankheiten, Krebs, Pilzinfektionen etc. einschliessen, bereit, wobei besagte Nukleinsäuren zusätzlich protoniert sind, um gleichzeitig eine bakterielle Infektion zu behandeln oder zu verhindern.
Die Erfindung stellt ferner die Verwendung der beschriebenen antibakteriellen Nukleinsäure in Zusammenhang mit einem annehmbaren pharmazeutischen Trägerstoff bereit, um medizinische Zusammensetzungen für die Behandlung von bakteriellen Infektionen in Tieren und bevorzugter Säugetieren einschließlich Menschen herzustellen.
Die Erfindung stellt ferner die Verwendung der beschriebenen antibakteriellen Nukleinsäure in einer topischen Hautcreme mit einem annehmbaren kosmetischen Trägerstoff bereit. Solche topischen Hautcremes können Zusatzstoffe, wie zum Beispiel Weichmacher, Feuchtigkeitsstoffe, Duftstoffe und ähnliche enthalten.
Die Erfindung liefert ferner Desinfektionslösungen, die die beschriebene antibakterielle Nukleinsäure beinhalten. Das Desinfektionsmittel kann aufgrund seiner Nicht-Toxizität für die Verwendung auf der Haut geeignet sein oder kann für die Desinfektion einer Oberfläche, wie zum Beispiel der eines Krankenhausinstruments, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung liefert ebenfalls mehrere Verfahren, um Nukleinsäuren zu protonieren/azidifizieren, um dieser bakteriostatische oder bakterizide Wirkungen für pathogene Bakterien zu verleihen. Die resultierenden protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren können verwendet werden, um Tiere, einschließlich Menschen, die eine Krankheit haben, die durch ein bakterielles Pathogen verursacht wird, zu behandeln.
Es ist ein Ziel der Erfindung, protonierte/azidifizierte Nukleinsäuren zu verwenden, um das Wachstum jedweder Bakterien, einschließlich klinisch relevanter pathogener Bakterien, zu hemmen.
Es ist ein Vorteil der Erfindung, dass der Wirkmechanismus der protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren relativ unspezifisch zu sein scheint, was diesen erlaubt, gegen jedes Bakterium, einschließlich klinisch relevanter pathogener Bakterien, wirksam zu sein.
Es ist ein anderer Vorteil der Erfindung, dass die protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren für ein Subjekt, das mit den modifizierten Nukleinsäuren behandelt wird, nicht toxisch sind.
Es ist ein weiterer Vorteil, dass die antibakterielle Wirksamkeit der protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren weder längen- noch sequenzabhängig ist.
Es ist ein Merkmal der Erfindung, dass die protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten, die durch bakterielle Pathogene verursacht werden, wirksam sind.
Diese und andere Ziele, Vorteile und Merkmale der Erfindung werden dem Durchschnittsfachmann beim Lesen der Details der Nukleinsäuren und deren Verwendungen, wie sie ausführlicher unten beschrieben werden, ersichtlich.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Es ist selbstverständlich, dass diese Erfindung nicht auf die besondere Methodik, Protokolle, Zelllinien, Tierarten oder -gattungen, Konstrukte und Reagenzien, die beschrieben werden, begrenzt ist, da diese natürlich variieren können. Es ist ebenfalls selbstverständlich, dass die hierin verwendete Terminologie nur zum Zwecke der Beschreibung von besonderen Ausführungsformen dient und es nicht beabsichtigt ist, den Umfang der vorliegenden Erfindung, die nur durch die angehängten Ansprüche beschränkt wird, zu beschränken.
Es muss angemerkt werden, dass, wie hierin und in den angehängten Ansprüchen verwendet, die Singularform „ein", „und", und „der, die, das" Pluralentsprechungen einschließen, außer der Kontext verlangt ganz klar etwas anderes. Somit kann die Bezugnahme auf „Bakterien" zum Beispiel eine Vielzahl von Bakterienarten einschließen und „ein Oligonukleotid" kann eine Vielzahl von Oligonukleotiden und Äquivalenten davon, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, einschließen und so weiter.
Solange nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, die hierin verwendet werden, dieselbe Bedeutung wie sie gewöhnlich von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden werden. Obwohl jedwede Verfahren, Vorrichtungen und Materialien, die ähnlich oder gleich zu denen, die hierin beschrieben sind, in der Praxis oder beim Testen der Erfindung verwendet werden können, werden nun die bevorzugten Verfahren, Vorrichtungen und Materialien beschrieben.
DEFINITIONEN
Der Ausdruck „Nukleinsäure" und „Nukleinsäuremolekül" wie hierin austauschbar verwendet, bezieht sich auf ein Molekül, das aus Nukleotiden, d.h. Ribonukleotiden, Desoxyribonukleotiden oder beiden, besteht. Der Ausdruck schließt Monomere und Polymere von Ribononukleotiden und Desoxyribonukleotiden ein, wobei die Ribonukleotide und/oder Deoxyribonukleotide miteinander, im Fall der Polymere über 5'-3' Bindungen, verbunden sind. Die Bindungen können jedoch jede der Bindungen, die auf dem Gebiet der Nukleinsäuresynthese bekannt sind, einschließen, einschließlich zum Beispiel Nukleinsäuren, die 5'-2' Bindungen umfassen. Die Nukleotide, die in dem Nukleinsäuremolekül verwendet werden, können natürlich auftretend sein oder können synthetisch hergestellte Analoge sein, die in der Lage sind, Basenpaarbindungen zu natürlich auftretenden Basenpaaren zu bilden. Beispiele von nicht natürlich auftretenden Basen, die in der Lage sind, Basenpaarbindungen zu bilden, schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf Aza- und Deazapyrimidin Analoge, Aza- und Deazapurin Analoge und andere heterozyklische Basenanaloge, wobei ein oder mehrere der Kohlenstoff- und Stickstoffatome der Purin- und Pyrimidinringe durch Heteroatome, zum Beispiel Sauerstoff, Schwefel, Selen, Phosphor und ähnliche, ersetzt worden sind.
Die Nukleinsäuren der Erfindung sind Oligonukleotide, die von ungefähr 2 bis ungefähr 100 Nukleotide, bevorzugter von 2 bis 80 Nukleotide und noch bevorzugter von ungefähr 4 bis ungefähr 35 Nukleotide umfassen.
Der Ausdruck „Monomer" wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül und Derivate davon, die aus einem einzelnen Nukleotid bestehen.
Die Ausdrücke „modifiziertes Oligonukleotid", „modifiziertes Monomer" und „modifiziertes Nukleinsäuremolekül" wie hierin verwendet, beziehen sich auf Nukleinsäuren mit einer oder mehreren chemischen Modifikationen der natürlichen Molekularstruktur von einer oder jeder der Nukleinsäurebasen, Zuckerreste und Internukleosidphosphatbindungen auf molekularem Level, sowie Moleküle, die hinzugefügte Substituenten, wie zum Beispiel Diamine, Cholesteryl oder andere lipophile Gruppen, besitzen oder eine Kombination von Modifikationen an diesen Stellen. Die Internukleosidphosphatbindungen können Phosphodiester, Phosphotriester, Phosphoramidat, Siloxan, Carbonat, Carboxymethylester, Acetamidat, Carbamat, Thioether, verbrücktes Phosphoramidat, verbrücktes Methylenphosphonat, Phosphorthioat, Methylphosphonat, Phosphordithioat, verbrücktes Phosphorthioat und/oder Sulfon Internukleotidbindungen, oder 3'-3', 2'-5', oder 5'-5'-Bindungen sein und Kombinationen von ähnlichen solchen Bindungen (um modifizierte Oligonukleotide mit gemischtem Rückgrat herzustellen). Die Modifikationen können intern (einzeln oder wiederholt) oder an dem Ende/den Enden des Oligonukleotidmoleküls sein und können Zusätze zu dem Molekül der Internukleosidphosphatbindungen einschließen, wie zum Beispiel Cholesteryl, Diaminverbindungen mit einer variierenden Anzahl von Kohlenstoffresten zwischen den Aminogruppen und endständige Ribose, Deoxyribose und Phosphatmodifikationen, die die entgegen gesetzte Kette oder assoziierte Enzyme oder andere Proteine abspalten oder quer vernetzen. Elektrophile Gruppen, wie zum Beispiel Ribose-Dialdehyd, kann kovalent an eine Epsilon Aminogruppe des Lysyl-Restes von so einem Protein binden. Eine nukleophile Gruppe, wie zum Beispiel N-Ethylmaleimid, das mit einem Oligomer verzahnt ist, kann kovalent an das 5'-Ende einer mRNA oder an eine andere elektrophile Stelle angeheftet werden. Der Ausdruck modifizierte Oligonukleotide schließt ebenfalls Oligonukleotide ein, die Modifikationen der Zuckerreste, wie zum Beispiel 2'-substituierte Ribonukleotide oder Deoxyribonukleotidmonomere, umfassen, von denen jedes über 5' 3'-Bindungen verbunden sein kann. Modifizierte Oligonukleotide können ebenfalls aus PNA- oder Morpholin-modifizierten Rückgraten bestehen, wobei die Zielspezifität der Sequenz beibehalten wird.
Der Ausdruck „Nukleinsäurerückgrat" wie hierin verwendet bezieht sich auf die Struktur des chemischen Restes, der Nukleotide in einem Molekül verbindet. Dies kann Strukturen, die aus jedem und allen Mitteln zur chemischen Verbindung von Nukleotiden gebildet werden, einschließen. Ein modifiziertes Rückgrat, wie hierin verwendet, schließt Modifikationen der chemischen Bindung zwischen den Nukleotiden sowie andere Modifikationen, die verwendet werden können, um die Stabilität und Affinität zu erhöhen, wie zum Beispiel Modifikationen der Zuckerstruktur, ein. Zum Beispiel kann ein α-Anomer von Desoxyribose, in dem die Base mit Bezug auf das natürliche β-Anomer invertiert ist, verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die 2'-OH Gruppe der Zuckergruppe zu 2'-O-Alkyl oder 2'-O-Alkyl-n(O-Alkyl) verändert sein, was Resistenz gegenüber dem Abbau verleiht, ohne die Affinität einzuschließen.
Der Ausdruck „Azidifizierung" und „Protonierung/Azififizierung", wie hierin austauschbar verwendet, bezieht sich auf das Verfahren, durch welches Protonen (oder positive Wasserstoffionen) an Protonenakzeptorstellen der Nukleinsäure hinzugefügt werden. Die Protonenakzeptorstellen schließen die Aminogruppen an den Basenstrukturen der Nukleinsäure und das Phosphat der Phosphodiesterbindungen ein. Wenn der pH-Wert abnimmt, steigt die Anzahl dieser Akzeptorstellen, die protoniert sind, was zu einer stärker protonierten/azidifizierten Nukleinsäure führt.
Der Ausdruck „protonierte/azidifizierte Nukleinsäure" bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die, wenn sie in Wasser mit einer Konzentration von ungefähr 16 A₂₆₀ pro ml aufgelöst wird, einen pH-Wert besitzt, der kleiner als der physiologische pH-Wert ist, d.h. niedriger als ungefähr pH 7. es ist beabsichtigt, dass modifizierte Nukleinsäuren, nukleaseresistente Nukleinsäuren und Antisense Nukleinsäuren durch diese Definition erfasst werden. Im allgemeinen werden Nukleinsäuren durch die Zuführung von Protonen an die reaktiven Stellen einer Nukleinsäure protoniert/azidifiziert, obwohl andere Modifikationen, die den pH der Nukleinsäure erniedrigen, ebenfalls verwendet werden können und beabsichtigt ist, dass sie von diesem Ausdruck umfasst werden.
Der Ausdruck „mit blockiertem Ende" wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäure mit einer chemischen Modifikation auf molekularem Level, die den Abbau ausgewählter Nukleotide, zum Beispiel durch die Einwirkung einer Nuklease, verhindert. Diese chemische Modifikation ist so positioniert, dass sie den wesentlichen Anteil der Nukleinsäure, zum Beispiel die kodierende Region eines Antisense Oligonukleotids, schützt. Ein blockiertes Ende kann ein 3' blockiertes Ende oder ein 5' blockiertes Ende sein. Zum Beispiel kann sich ein 3' blockiertes Ende an der äußersten 3'-Position des Moleküls befinden oder es kann im Inneren des 3'-Endes liegen, vorausgesetzt, dass es 3' zu der wesentlichen Sequenz der Nukleinsäure liegt.
Der Ausdruck „im wesentlichen nukleaseresistent" bezieht sich auf Nukleinsäuren, die verglichen mit natürlich auftretenden oder unmodifizierten Nukleinsäuren resistent gegenüber dem Abbau durch Nukleasen sind. Modifizierte Nukleinsäuren der Erfindung sind mindestens 1,25 Mal resistenter gegenüber dem Abbau durch Nukleasen als ihre nicht modifizierten Gegenstücke, bevorzugter mindestens 2 Mal resistenter, noch bevorzugter mindestens 5 Mal resistenter und am bevorzugtesten mindestens 10 Mal resistenter als ihre nicht modifizierten Gegenstücke. Solche im wesentlichen nukleaseresistenten Nukleinsäuren schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf Nukleinsäuren mit modifizierten Rückgraten, wie zum Beispiel Phosphorthioate, Methylphosphonate, Ethylphosphotriester, 2'-O-Methylphosphorthioate, 2'-O-Methyl-p-Ethoxyribonukleotide, 2'-O-Alkyle, 2'-O-Alkyl-n-(O-Alkylen, 2'-Fluor, 2'-Deoxy-Erythropentofuranosyle, 2'-O-Methylribonukleoside, Methylcarbamate, Methylcarbonate, invertierte Basen (zum Beispiel invertierte T's) oder chimäre Versionen dieser Rückgrate.
Der Ausdruck „im wesentlichen säureresistent" wie hierin verwendet, bezieht sich auf Nukleinsäuren, die verglichen mit nicht modifizierten Nukleinsäuren gegenüber dem Abbau durch Säuren resistent sind. Typischerweise wird die relative Säureresistenz einer Nukleinsäure durch den Vergleich des Abbaus einer resistenten Nukleinsäure in Prozent mit dem Abbau ihres nicht modifizierten Gegenstücks in Prozent gemessen (d.h. eine entsprechende Nukleinsäure mit „normalem" Rückgrat, Basen und Phosphodiesterbindungen). Eine Nukleinsäure, die säureresistent ist, ist vorzugsweise mindestens 1,5 Mal resistenter, mindestens 2 Mal resistenter, noch bevorzugter mindestens 5 Mal resistenter und am bevorzugtesten mindestens 10 Mal resistenter gegenüber Säureabbau als ihre nicht modifizierten Gegenstücke.
Der Ausdruck „LD₅₀" wie hierin verwendet ist die Dosis einer aktiven Substanz, die in allen behandelten Versuchstieren zu 50 Prozent Letalität führt. Obwohl sich dies gewöhnlich auf invasive Verabreichung, wie zum Beispiel orale, parenterale und ähnliche bezieht, kann es sich ebenfalls auf die Toxizität beziehen, wenn weniger invasive Verfahren der Verabreichung, wie zum Beispiel die topische Anwendung der aktiven Substanz, verwendet werden.
Der Ausdruck „Alkyl" wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine verzweigte oder unverzweigte gesättigte Kohlenwasserstoffkette, die 1–6 Kohlenstoffatome enthält, wie zum Beispiel Methyl, Ethyl, Propyl, tert-Butyl, n-Hexyl und ähnliche.
Die Ausdrücke „Behandlung", „behandeln" und ähnliche werden hierin verwendet, um allgemeinen das Erzielen einer gewünschten pharmakologischen und/oder physiologischen Wirkung zu bedeuten. Die Wirkung kann hinsichtlich des vollständigen oder teilweisen Verhinderns einer Krankheit oder eines Symptoms davon prophylaktisch sein und/oder kann mit Bezug auf eine teilweise oder vollständige Heilung einer Krankheit und/oder eines nachteiligen Effektes, der auf diese Krankheit zurückzuführen ist, therapeutisch sein. „Behandlung" wie hierin verwendet, deckt jede Behandlung einer Krankheit in einem Säugetier, insbesondere einem Menschen, ab und schließt ein:

(a) Verhindern, dass eine bakterielle Krankheit in einem Subjekt, das gegenüber der Krankheit prädisponiert sein kann, aber für das bis jetzt noch nicht diagnostiziert wurde, dass es diese Krankheit hat, auftritt;
(b) Hemmen einer bakteriellen Krankheit, d.h. Aufhalten ihrer Entwicklung; oder
(c) Lindern einer bakteriellen Krankheit, d.h. Verursachen der Regression und/oder Linderung der Krankheit.

Die Erfindung richtet sich auf das Behandeln von Patienten mit jedem infektiösem Bakterium.
DIE ERFINDUNG IM ALLGEMEINEN
Diese Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass protonierte/azidifizierte Nukleinsäuren jeder Sequenz und Länge eine neue Klasse von Antibiotika darstellen, die sowohl gegen medikamentenresistente als auch Antibiotika empfindliche Bakterien in vitro und in vivo wirksam sind. Insbesondere sind die protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren der Erfindung wirksame antibakterielle Mittel gegen alle Bakterienarten und können verwendet werden, um bakterielle Infektionen in Menschen und Tieren zu behandeln oder diesen vorzubeugen. Somit schließt die vorliegende Erfindung protonierte, nukleaseresistente Nukleinsäuren und Verfahren zu ihrer Herstellung, so dass sie beim Abtöten von Bakterien oder der Hemmung von bakteriellem Wachstum wirksam sind, ein. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung spezifisch auf das Verfahren der Protonierung, um die antibakterielle Wirkung von Nukleinsäuren gegen pathogene Bakterien zu ermöglichen.
Zusätzlich können Nukleinsäuren, die gegenwärtig therapeutisch für die Behandlung von anderen Krankheiten oder Störungen, zum Beispiel Antisense Nukleinsäuren, die sich gegen ein spezifisches Gen richten, ebenfalls protoniert/azidifiziert werden, wodurch solchen Nukleinsäuren die zusätzliche therapeutische Wirkung der antibakteriellen Aktivität verliehen wird. Somit schließt die vorliegende Erfindung ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren zur Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten, einschließlich viralen Infektionen, Krebs, Pilzinfektionen, etc., die zusätzlich protoniert sind, um gleichzeitig eine bakterielle Infektion zu behandeln oder dieser vorzubeugen, ein.
Protonierung/Azidifizierung kann verwendet werden, um einer Nukleinsäure die Fähigkeit zu verleihen, als antibakterielles Mittel zu wirken. Die Azidifizierung von Nukleinsäuren ist der Prozess, durch welchen Protonen (oder positive Wasserstoffionen) an den reaktiven Stellen einer Nukleinsäure hinzugefügt werden. Mit Ansteigen der Anzahl von reaktiven Stellen, die protoniert sind, sinkt der pH und die bakterienhemmende Aktivität der Nukleinsäure wird erhöht. Dementsprechend sind die Nukleinsäuren gemäß der Erfindung protoniert/azidifiziert, um, wenn sie in Wasser aufgelöst sind, einen pH-Wert von 4,0 bis ungefähr 1 oder, in einer bevorzugteren Ausführungsform, einen pH von 3,0 bis ungefähr 1 oder in einer noch bevorzugteren Ausführungsform einen pH von 2,0 bis ungefähr 1 zu ergeben.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren der Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung im wesentlichen nukleaseresistent, im wesentlichen säureresistent und vorzugsweise sowohl im wesentlichen nuklease- als auch im wesentlichen säureresistent. Diese Ausführungsform schließt Nukleinsäuren, die vollständig mit Phosphorthioatbindungen, 2'-O-Methyl-Phosphodiestern, 2'-O-Alkylen, 2'-O-Alkyl-n(O-Alkyl)en, 2'-Fluor, 2'-Deoxy-Erythropentofuranosylen, p-Isopropylnukleinsäuren, Phosphoramidaten, chimären Bindungen und anderen Rückgratmodifikationen derivatisiert sind, ein. Diese Ausführungsform schließt ebenfalls andere Modifikationen, die die Nukleinsäuren im wesentlichen resistent gegenüber endogener Nukleaseaktivität machen, ein. Verfahren, um Nukleinsäuren nukleaseresistent zu machen, schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf die kovalente Modifizierung der Purin- oder Pyrimidinbasen, die die Nukleinsäure umfasst. Zum Beispiel können die Basen methyliert, hydroxymethyliert oder auf andere Weise substituiert (z. B. glykosyliert) werden, so dass die Nukleinsäuren, die die modifizierten Basen umfassen, im wesentlichen nukleaseresistent gemacht werden.
In der bevorzugtesten Ausführungsform besitzt die protonierte/azidifierte Nukleinsäure ein Rückgrat, das im wesentlichen gegenüber Säureabbau, Exonukleaseverdau und Endonukleaseverdau resistent ist.
Typischerweise kann die relative Nukleaseresistenz einer Nukleinsäure durch den Vergleich des Abbaus einer resistenten Nukleinsäure in Prozent mit dem Abbau ihres unmodifizierten Gegenstücks (d.h. eine entsprechende Nukleinsäure mit „normalem" Rückgrat, Basen und Phosphodiesterbindung) in Prozent gemessen werden. Der Abbau in Prozent kann durch die Verwendung einer analytischer HPLC bestimmt werden, um den Verlust an Volllängennukleinsäuren abzuschätzen, oder durch alle anderen geeigneten Verfahren (z. B. durch Visualisierung der Produkte auf einem Sequenziergel unter Verwendung von Färbung, Autoradiographie, Fluoreszenz, etc. oder Messen einer Verschiebung in der optischen Dichte). Der Abbau wird im Allgemeinen als Funktion der Zeit gemessen.
Der Vergleich zwischen unmodifizierten und modifizierten Nukleinsäuren kann durch das zueinander in Verhältnis setzen des Prozentsatzes an intakter modifizierter Nukleinsäure zu dem Prozentsatz an intakter unmodifizierter Nukleinsäure hergestellt werden. Zum Beispiel wird, wenn nach 15 Minuten der Exposition gegenüber einer Nuklease 25% einer nicht modifizierten Nukleinsäure intakt sind (d.h. 75% abgebaut) und 50% einer modifizierten Nukleinsäure (d.h. 50% abgebaut) intakt sind, gesagt, dass die modifizierte Nukleinsäure 2 Mal (50% geteilt durch 25%) resistenter gegenüber Nukleaseabbau ist als die unmodifizierte Nukleinsäure. Im allgemeinen wird eine im wesentlichen nukleaseresistente Nukleinsäure mindestens nach 15 Minuten der Aussetzung gegenüber einer Nuklease ungefähr 1,25 Mal resistenter gegenüber Nukleaseabbau sein als eine nicht modifizierte Nukleinsäure mit einer entsprechenden Sequenz, typischerweise mindestens ungefähr 1,5 Mal resistenter, vorzugsweise ungefähr 1,75 Mal resistenter und bevorzugter mindestens ungefähr 10 Mal resistenter.
Der Säureabbau in Prozent kann durch Verwendung einer analytischen HPLC, um den Verlust an Volllängennukleinsäuren abzuschätzen, bestimmt werden oder durch jedes andere geeignete Verfahren (z. B. durch Visualisierung der Produkte auf einem Sequenziergel unter Verwendung von Färbung, Autoradiographie, Fluoreszenz, etc. oder Messen einer Verschiebung in der optischen Dichte). Der Abbau wird im Allgemeinen als eine Funktion der Zeit gemessen.
Der Vergleich zwischen nicht modifizierten und modifizierten Nukleinsäuren kann durch das zueinander in Verhältnis setzen des Prozentsatzes an intakter modifizierter Nukleinsäure zu dem Prozentsatz an intakter nicht modifizierter Nukleinsäure hergestellt werden. Zum Beispiel kann gesagt werden, dass, wenn nach 30 Minuten der Exposition gegenüber einer Umgebung mit niedrigem pH, 25% einer nicht modifizierten Nukleinsäure intakt sind (d.h. 75% abgebaut) und 50% einer modifizierten Nukleinsäure intakt sind (d.h. 50% abgebaut), dass die modifizierte Nukleinsäure 2 Mal (50% geteilt durch 25%) resistenter gegenüber Nukleaseabbau ist als die nicht modifizierte Nukleinsäure. Im allgemeinen sind im wesentlichen „säureresistente" Nukleinsäuren nach 30 Minuten der Exposition gegenüber einem pH von ungefähr 1,5 bis ungefähr 4,5 bei 37°C mindestens ungefähr 1,25 Mal resistenter gegenüber Säureabbau als nicht modifizierte Nukleinsäure mit einer entsprechenden Sequenz, typischerweise mindestens 1,5 Mal resistenter, vorzugsweise ungefähr 1,75 Mal resistenter und noch bevorzugter mindestens ungefähr 10 Mal resistenter.
Die vorliegend beschriebenen gereinigten Nukleinsäuren können als das einzige therapeutische Mittel verwendet werden oder können mit zusätzlichen antibakteriellen Mitteln komplexiert werden. Zum Beispiel können die beschriebenen nukleaseresistenten antibakteriellen Nukleinsäuren mit einem konventionellen Antibiotikum oder einer anderen chemischen Gruppe, die die bakterielle Genexpression hemmt, verbunden werden. Alternativ können die gereinigten Nukleinsäuren in einer therapeutischen Zusammensetzung mit Mitteln, die für die Linderung von anderen Störungen und/oder Symptomen entwickelt wurden, z. B. abschwellende Mittel, Antihistaminika, Mittel gegen Übelkeit, Sedativa, Schmerzmittel und ähnliche, eingeschlossen werden. Zusätzlich kann die antibakterielle Nukleinsäure mit einer Vielzahl von gut etablierten Verbindungen oder Strukturen komplexiert sein, die z. B. die in vivo Stabilität der Nukleinsäure weiter erhöhen oder auf andere Weise ihre pharmakologischen Eigenschaften verbessern (z. B. Erhöhen der in vivo Halbwertszeit, Verringern der Toxizität, Verbessern der Bioverfügbarkeit, etc.).
Die Sequenz der Nukleinsäuren der Erfindung kann variieren, da die antibakterielle Wirkung der modifizierten Nukleinsäuren nicht von der Sequenz abhängig ist. Zum Beispiel können Nukleinsäuren, die auf das Behandeln einer bakteriellen Infektion gerichtet sind, zu einem bekannten bakteriellen Gen, das für bakterielles Wachstum benötigt wird, komplementär sein. In einem anderen Beispiel können die Nukleinsäuren der Erfindung keine substantielle Sequenzhomologie mit irgendeiner Sequenz in dem Genom des Bakteriums besitzen, das die Infektion, die behandelt oder verhindert wird, verursacht. In noch einem anderen Beispiel können Nukleinsäuren, die auf andere therapeutische Ziele, z. B. Viren, Krebszellen, Pilzinfektionen, gerichtet sind, ebenfalls gemäß der Erfindung protoniert/azidifiziert werden, um zusätzlich zu ihrer primären therapeutischen Funktion gleichzeitig als antibakterielle Mittel zu wirken.
Die bakterizide und/oder bakteriostatische Aktivität der Nukleinsäuren der Erfindung kann unter Verwendung jedes einer Vielzahl von Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann verfügbar sind, gemessen werden. Ein Beispiel für so ein Verfahren ist die Messung der antibakteriellen Aktivität durch die Verwendung eines MIC (minimale inhibitorische Konzentration) Tests, für den anerkannt ist, dass er die in vivo Wirksamkeit der Behandlung einer bakteriellen Infektion mit Antibiotika vorhersagen kann. Die Nukleinsäuren der Erfindung zeigen in diesem Test sogar ohne Vorbehandlung der Bakterien, um die Membran zu permeabilisieren, und ohne PEG-Modifizierung der Nukleinsäuren antibakterielle Aktivität.
In dieser Erfindung kann die Protonierung/Azidifizierung der Nukleinsäuren mit einer Reihe von chemischen Veränderungen verwendet werden, obwohl eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine protonierte/azidifizierte Nukleinsäure mit der chemischen Struktur 5'-Butanol-2'-O-Alkyl RNA-Butanol-3' oder 2'-O-Alkyl-O-Alkyl ist, die einen pH von 3 bis 1 besitzt, wenn sie in Wasser aufgelöst wird. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine protonierte/azidifizierte Nukleinsäure mit der chemischen Rückgratstruktur 5'-Butanol-2'-O-Methyl RNA-Butanol-3', die einen pH von 3 bis 1 besitzt, wenn sie in Wasser aufgelöst wird.
Nukleinsäuresynthese
Nukleinsäuren können mit kommerziell erworbenen DNA Synthesegeräten im < 1 μM bis > 1 mM Maßstab unter Verwendung von Standard Phosphoramidit Chemie und Verfahren, die auf dem Gebiet gut bekannt sind, wie zum Beispiel solche, die in Stec et al., 1984, J. Am. Chem. Soc. 106: 6077–6089, Stec et al., 1985, J. Org. Chem. 50(20): 3908–3913, Stec et al., 1985, J. Chromatog. 326: 263–280, LaPlanche et al., 1986, Nuc. Acid. Res. 14(22): 9081–9093, und Fasman, 1989, Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 1989, CRC Press, Boca Raton, Florida, offenbart sind, synthetisiert werden.
Nukleinsäuren können mit jedem Verfahren, das dem Durchschnittsfachmann bekannt ist, gereinigt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden sie durch Chromatographie auf kommerziell erhältlichen Umkehrphasen- oder Ionenaustauschermedien, zum Beispiel Waters Protein Pak, Pharmacia's Source Q, etc., gereinigt. Die Gipfelfraktionen können kombiniert und die Proben über Umkehrphasenchromatographie auf einem Poly(Styrol-Divinylbenzol) basiertem Medium, Hamilton's PRP1 oder PRP3 oder Polymer Labs' PLRP Harzen entsalzt und konzentriert werden. Alternativ können Ethanol-Präzipitation, Diafiltration oder Gelfiltration gefolgt von Lyophilisierung oder Lösungsmittelabdampfung unter verringertem Druck in kommerziell erhältlichen Instrumenten, wie zum Beispiel Savant's Speed Vac, verwendet werden. Optional können kleine Mengen der Nukleinsäuren unter Verwendung von Polyacrylamidgelen elektrophoretisch gereinigt werden.
Lyophilisierte oder getrocknete Präparationen von Nukleinsäuren können in pyrogen-freier, steriler, physiologischer Salzlösung (d.h. 0,85% Salzlösung) in sterilem Sigma Wasser aufgelöst und durch einen 0,45 Mikrometer Gelman Filter (oder einen sterilen 0,2 Mikrometer pyrogen-freien Filter) filtriert werden. Die beschriebenen Nukleinsäuren können teilweise oder vollständig mit jeder einer umfassenden Auswahl von chemischen Gruppen oder Bindungen einschließlich, aber nicht begrenzt auf Phosphoramidate, Phosphorthioate, Alkylphosphonate, 2'-O-Methyl, 2'-modifizierte RNA, Morpholinogruppen, Phosphatester, Propingruppen oder Chimäre von jeder Kombination der obigen Gruppen oder anderen Bindungen (oder Analogen davon) ersetzt werden.
Um die vorliegend beschriebenen antibakteriellen Nukleinsäuren zu reinigen, kann eine Reihe von Standardverfahren verwendet werden. In Kürze, die antibakteriellen Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können durch Chromatographie auf kommerziell erhältlichen Umkehrphasenmedien (zum Beispiel siehe die RAININ Instrument Co., Inc. Gebrauchsanweisung für DYNAMAX^®-300A, Rein-DNA Umkehrphasensäulen, 1989 oder aktuelle Updates davon, die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind) oder Ionenaustauschermedien wie z. B. Waters' Protein Pak oder Pharmacia's Source Q (siehe im allgemeinen Warren and Vella, 1994, „Analysis and Purification of Synthetic Nucleic Acids by High-Performance Liquid Chromatography", in Methods in Molecular Biology, vol. 26; Protocols for Nucleic acid Conjugates, S. Agrawal, ed. Humana Press, Inc., Totowa, NJ; Aharon et al., 1993, J. Chrom. 698: 293–301; und Millipore Technical Bulletin, 1992, Antisense DNA: Synthesis, Purification, and Analysis) gereinigt werden. Die Gipfelfraktionen können kombiniert und die Proben konzentriert und über Alkohol (Ethanol, Butanol, Isopropanol und Isomere und Mischungen davon, etc.) Präzipitation, Umkehrphasenchromatographie, Diafiltration oder Gelfiltration konzentriert und entsalzt werden.
Eine Nukleinsäure wird als rein angesehen, wenn sie so isoliert worden ist, so dass sie unter anderem im wesentlichen frei von unvollständigen Nukleinsäureprodukten ist, die während der Synthese der gewünschten Nukleinsäure hergestellt wurden. Vorzugsweise ist eine gereinigte Nukleinsäure auch im wesentlichen frei von Verunreinigungen, die die antibakterielle Aktivität des Oligonukleotids behindern oder auf andere Weise maskieren könnten. Eine gereinigte Nukleinsäure ist, nach der Azidifizierung mit einem der offenbarten Verfahren oder durch ein anderes Verfahren, das dem Durchschnittsfachmann bekannt ist, eine protonierte/azidifizierte Nukleinsäure, die isoliert worden ist, so dass sie unter anderem im wesentlichen frei von einem Überschuss an protonierendem/azidifizierendem Mittel ist. Wenn eine Nukleinsäure in der Lage ist, an eine Zielzelle zu binden oder in diese einzutreten, um eine physiologische Aktivität von Interesse zu modulieren, sollte diese im allgemeinen als im wesentlichen frei von Verunreinigungen, die die Nukleinsäure weniger nützlich machen würden, angesehen werden.
In besonderen Ausführungsformen bestehen die Nukleinsäuren der Erfindung aus einem oder mehreren der folgenden: teilweise oder vollständig substituierte Phosphorthioate, Phosphonate, Phosphatester, Phosphoramidate, 2'-modifizierte RNAs, 3'-modifizierte RNAs, Peptidnukleinsäuren, Propine oder Analoge davon. Die Nukleinsäuren können vollständig oder teilweise durch einen chemischen Rest einschließlich, aber nicht begrenzt auf Phosphodiesterbindungen, Phosphotriesterbindungen, Phosphoramidatbindungen, Siloxanbindungen, Carbonatbindungen, Carboxymethylesterbindungen, Acetamidatbindungen, Carbamatbindungen, Thioetherbindungen, verbrückte Phosphoramidatbindungen, verbrückte Methylenphosphonatverbindungen, Phosphorthioatbindungen, Methylphosphonatbindungen, Phosphordithioatbindungen, Morpholino, verbrückte Phosphorthioatbindungen, Sulfon Internukleotidbindungen, 3'-3' Bindungen, 5'-2' Bindungen, 5'-5' Bindungen, 2'-Deoxy-Erythropentofuranosyle, 2'-Fluore, 2'-O-Alkyl Nukleotide, 2'-O-Alkyl-n(O-Alkyl)Phosphodiester, Morpholinobindungen, p-Ethoxy Oligonukleotide, PNA-Bindungen, p-Isopropyl Oligonukleotide oder Phosphoramidate, derivatisiert sein.
Protonierte/azidifizierte Nukleinsäuren
Im Anschluss an oder während der obigen Synthese- und Reinigungsschritte, können die protonierten/azidifizierten Formen der beschriebenen Nukleinsäuren durch das Aussetzen der gereinigten oder teilweise gereinigten oder unbearbeiteten Nukleinsäuren gegenüber einem niedrigen pH oder einer sauren Umgebung erzeugt werden. Gereinigte oder unbearbeitete Nukleinsäuren können mit Säure, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Phosphorsäure, Salpetersäure, Salzsäure, Essigsäure, etc. protoniert/azidifiziert werden. Zum Beispiel kann die Säure mit Nukleinsäuren in Lösung kombiniert werden oder alternativ können die Nukleinsäuren in einer sauren Lösung aufgelöst werden. Ein Säureüberschuss kann durch Chromatographie oder in einigen Fällen durch das Trocknen der Nukleinsäure entfernt werden.
Andere Verfahren, um protonierte Nukleinsäuren herzustellen, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, werden ebenso als innerhalb des Umfangs der Erfindung liegend betrachtet. Wenn die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung einmal protoniert worden sind, können sie von allen nicht gewünschten Bestandteilen, wie zum Beispiel einem Überschuss an Säure, getrennt werden. Der Durchschnittsfachmann würde viele Methoden kennen, um die Nukleotide von nicht gewünschten Bestandteilen zu trennen. Zum Beispiel kann die Oligonukleotidlösung nach der Protonierung einer Chromatographie unterzogen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Oligonukleotidlösung nach der Protonierung über ein Poly(Styrol-Divinylbenzol) basiertes Harz (z. B. Hamilton's PRP-1 pr 3 und Polymer Labs' PLRP) laufen gelassen.
Die protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren können direkt verwendet werden oder, in einer bevorzugten Ausführungsform, weiter verarbeitet werden, um allen Überschuss an Säure und Salz über Präzipitation, Umkehrphasenchromatographie, Diafiltration oder Gelfiltration zu entfernen. Die protonierten/azidifizierten Oligos können durch Präzipitation, Lyophilisierung, Lösungsmittelabdampfung etc. konzentriert werden. Wenn sie in Wasser oder einer Salzlösung suspendiert werden, zeigen die azidifizierten Nukleinsäurezubereitungen der Erfindung typischerweise einen pH von zwischen 1 und 4,0, abhängig von dem Grad der Protonierung/Azidifizierung, der dadurch bestimmt werden kann, wie viel Säure in dem Azidifizierungsprozess verwendet wird. Alternativ können Nukleinsäuren durch die Passage über eine Kationenaustauschersäule, die mit Wasserstoffionen geladen ist, protoniert werden.
Säure- und nukleaseresistente Nukleinsäuren
Im Allgemeinen zeigen Nukleinsäurepräparationen nahe pH 2 bis 1 bessere antibakterielle Aktivität als Nukleinsäuren bei oder nahe pH 4,5. Viele Oligo Rückgrate sind bei pH 2 nicht stabil und erfahren Depurination, obwohl eine Reihe von Rückgraten bei einem pH von 4 bis 5 relativ stabil sind. Es wurde entdeckt, dass 2'-O-Alkyl, 3'-O-Alkyl und 2'-O-Alkyl-n(O-Alkyl) Nukleinsäuren bei dem gewünschten pH von 2 bis 1 stabil sind.
In einer Ausführungsform verwendet die Erfindung Nukleinsäuren, die im wesentlichen nukleaseresistent sind. Dies schließt Nukleinsäuren ein, die vollständig mit Phosphorthioatbindungen, 2'-O-Methylphosphodiestern, 2'-O-Alkyl, 2'-O-Alkyl-n(O-Alkyl), 2'-Fluor, 2'-Deoxy-Erythropentofuranosyl, p-Ethoxy, Morpholino Nukleinsäuren, p-Isopropyl Nukleinsäuren, Phosphoramidaten, chimären Bindungen und jeder anderen Rückgratmodifikation sowie anderen Modifikationen, die die Nukleinsäure im wesentlichen gegenüber endogener Nukleaseaktivität resistent machen, derivatisiert sind. Zusätzliche Verfahren, um Nukleinsäuren nukleaseresistent zu machen, schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf das kovalente Modifizieren der Purin- oder Pyrimidinbasen, die die Nukleinsäure umfasst. Zum Beispiel können Basen methyliert, hydroxymethyliert oder auf andere Weise substituiert (z. B. glykosyliert) werden, so dass die Nukleinsäuren, die die modifizierten Basen umfassen, im wesentlichen nukleaseresistent gemacht werden.
Obwohl 2'-O-Alkyl substituierte Nukleinsäure und Moleküle mit ähnlichen Modifikationen eine bemerkenswerte Säurestabilität und Endonukleaseresistenz zeigen, sind sie empfindlich gegenüber 3'-Exonukleasen. Um die Exonukleaseresistenz von 2'-O-Alkyl substituierten Nukleinsäuren zu verstärken, werden die 5' und 3' Enden der Ribonukleinsäuresequenz vorzugsweise an eine Exonuklease blockierende Funktionalität angeheftet. Zum Beispiel können an jedem Ende des Oligoribonukleotids ein oder mehrere Phosphorthioatnukleotide platziert werden. Zusätzlich können an jedem Ende des Oligoribonukleotids ein oder mehrere invertierte Basen platziert werden oder es können an einem oder mehreren Enden des Oligoribonukleotids ein oder mehrere Alkyl, zum Beispiel Butanol substituierte Nukleotide oder chemische Gruppen platziert werden. Ein enzymresistentes Butanol hat vorzugsweise die Struktur OH-CH₂CH₂CH₂CH₂(4-Hydroxybutyl), auf das ebenfalls als C4 Spacer Bezug genommen wird. Dementsprechend ist eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine protonierte/azidifizierte Nukleinsäure, die eine antibakterielle Nukleinsäure, die die folgende Struktur:
A-B-C
besitzt, umfasst, wobei „B" ein 2'-O-Alkyl oder 2'-O-Alkyl-O-Alkyl Oligoribonukleotid zwischen ungefähr 1 und ungefähr 78 Basen Länge und „A" und „C" entsprechend 5' und 3' Enden blockierende Gruppen sind (z. B. ein oder mehrere Phosphorthioatnukleotid(e) (aber typischerweise weniger als sechs), invertierte Basenbindungen, oder Alkyl, Alkenyl oder Alkynylgruppen oder substituierte Nukleotide). Eine unvollständige Liste von blockierenden Gruppen schließt invertierte Basen, Dideoxynukleotide, Methylphosphate, Alkylgruppen, Arylgruppen, Cordycepin, Cytosinarabinosid, 2'-Methoxy-Ethoxy Nukleotide, Phosphoramidate, eine Peptidbindung, eine Dinitrophenylgruppe, 2'- oder 3'-O-Methylbasen mit Phosphorothioatbindungen, 3'-O-Methylbasen, Fluorescein, Cholesterol, Biotin, Acridin, Rhodamin, Psolaren und Glyceryl ein.
Therapeutische Verwendung von antibakteriellen Nukleinsäuren
Wenn in der therapeutischen Behandlung einer Krankheit verwendet, kann eine angemessene Dosierung einer antibakteriellen protonierten/azidifizierten Nukleinsäure oder Mischung davon durch jede einer Reihe von gut etablierten Methoden bestimmt werden. Zum Beispiel werden gewöhnlich Tierversuche verwendet, um die maximal tolerierbare Dosis oder MTD eines bioaktiven Mittels pro Kilogramm Körpergewicht zu bestimmen. Im Allgemeinen ist mindestens eine der getesteten Tierarten ein Säugetier. Der Durchschnittsfachmann extrapoliert regelmäßig die Dosen für die Wirksamkeit und zum Vermeiden von Toxizität auf andere Arten, einschließlich Menschen. Zusätzlich können therapeutische Dosen ebenfalls abhängig von Faktoren, wie zum Beispiel dem Schweregrad der Infektion und der Größe oder der Art des Wirtes, verändert werden.
Wo die therapeutische Verwendung der vorliegend beschriebenen antibakteriellen Nukleinsäuren in Betracht gezogen wird, werden die antibakteriellen Nukleinsäuren vorzugsweise in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger über orale, intranasale, rektale, topische, intraperitoneale, intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intrakraniale, subdermale, transdermale, intratracheale Verfahren oder ähnliche verabreicht.
Typischerweise, aber nicht notwendigerweise ist die bevorzugte Formulierung für eine bestimmte antibakterielle Nukleinsäure abhängig von dem Ort in einem Wirt, für den erwartet wird, dass ein bestimmter infektiöser Organismus dort anfänglich eindringen würde, oder für den erwartet würde, dass dort ein bestimmter infektiöser Organismus kolonisiert oder sich konzentriert. Zum Beispiel werden topische Infektionen vorzugsweise mit Rezepturen behandelt oder verhindert, die für die topische Anwendung entworfen sind. Zum Beispiel wird die azidifizierte Nukleinsäure in einer bevorzugten Ausführungsform in einer Wasser, Ethanol und Propylenglykol Basis für die topische Verabreichung formuliert. Alternativ, wenn das Zielpathogen den Magendarmtrakt besiedelt, können Präparationen von säurestabilen protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren durch orale Dosierung bereitgestellt werden. Zusätzlich können pulmonale Infektionen sowohl parenteral, als auch durch die direkte Anwendung von geeignet formulierten Formen der antibakteriellen Nukleinsäuren auf die Lunge durch Inhalationstherapie oder intranasale Verabreichung behandelt werden.
Wenn geeignet formulierte Nukleinsäuren parenteral verabreicht werden, können sich die Nukleinsäuren zu relativ hohem Grad in den Nieren, der Leber, der Milz, den Lymphknoten, der Nebenniere, der Aorta, der Bauchspeicheldrüse, dem Knochenmark, dem Herzen und den Olivas anreichern. Nukleinsäuren neigen ebenfalls dazu, sich in einem geringeren Ausmaß in Skelettmuskeln, der Blase, dem Magen, dem Esophagus, dem Duodenum, dem Fettgewebe und der Trachea anzureichern. Noch niedrigere Konzentrationen werden typischerweise in dem zerebralen Cortex, dem Gehirnstamm, dem Cerebellum, dem Rückenmark, dem Knorpelgewebe, der Haut, der Schilddrüse und der Prostata gefunden (siehe im allgemeinen Crooke, 1993, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Ration, FL). Interessanterweise neigen pathogene Bakterien ebenfalls dazu, sich in vielen der obigen Organe anzureichern. Folglich können die vorliegend beschriebenen antibakteriellen Nukleinsäuren verwendet werden, um die bakteriellen Infektionen in speziellen Zielorganen und Geweben anzusteuern.
Vorzugsweise schließen tierische Wirte, die unter Verwendung der Nukleinsäure in der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, ein, sind aber nicht begrenzt auf Invertebraten, Vertebraten, Vögel, Säugetiere wie z. B. Schweine, Ziegen, Schafe, Rinder, Hunde, Katzen und insbesondere Menschen. Es wird ebenfalls in Erwägung gezogen, dass die vorliegend beschriebenen protonierten/azidifizierten antibakteriellen Nukleinsäuren bei der Bekämpfung von bakterieller Verunreinigung von Laborkulturen, Konsumgütern (Nahrungsmitteln oder Brauereiprodukten) oder industriellen Prozessen wirksam sind.
Angesichts der Tatsache, dass eine bakterielle Infektion bei immungeschwächten Individuen, wie zum Beispiel Patienten, die an einem erworbenen Immunschwächesyndrom (AIDS) leiden, HIV-infizierten Individuen, Patienten, die einer Chemo- oder Bestrahlungstherapie unterzogen werden, etc., eine besonders problematische Komplikation ist, ist eine zusätzliche Ausführungsform der vorliegend beschriebenen Erfindung die Verwendung der vorliegend beschriebenen antibakteriellen Nukleinsäuren, um immungeschwächte Patienten zu behandeln.
Eine andere Ausführungsform der vorliegend beschriebenen Erfindung ist die Verwendung einer therapeutischen Nukleinsäure, die ein virales, Krebs-, Pilz- oder anderes Ziel besitzt, wobei die Nukleinsäure zusätzlich protoniert/azidifiziert ist, so dass sie ebenfalls als eine antibakterielle Nukleinsäure dienen kann. Das Oligo wird fortfahren, auf das Primärziel abzuzielen, wird aber zusätzlich dann als antibakterielles Mittel wirken.
Beispiele von bakteriellen Organismen, gegen die die Verfahren der Erfindung wirksam sind, schließen Gram positive Bakterien, Gram negative Bakterien, säurefeste Bakterien, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae und Escherichia coli ein. Die Verfahren der Erfindung sind wirksam gegen Infektionen durch alle bakteriellen Organismen, einschließlich Mitgliedern der folgenden Gattungen: Aerococcus, Listeria, Streptomyces, Chlamydia, Actinomadura, Lactobacillus, Eubacterium, Arachnia, Mycobacterium, Peptostreptococcus, Staphylococcus, Corynebacterium, Erysipelothrix, Dermatophilus, Rhodococcus, Ribodobacterium, Pseudomonas, Streptococcus, Bacillus, Peptococcus, Pneumococcus, Micrococcus, Neisseria, Klebsiella, Kurthia, Nocardia, Nocardiopsis, Serratia, Rothia, Escherichia, Propionibacterium, Actinomyces, Helicobacter, Enterococcus, Shigella, Vibrio, Clostridia, Salmonella, Yersinia und Haemophilus.
Pharmazeutische Zusammensetzungen und Abgabe
Die vorliegend beschriebenen protonierten/azidifizierten antibakteriellen Nukleinsäuren können mit einer Reihe von physiologischen Trägermolekülen formuliert werden. Die vorliegend beschriebenen antibakteriellen Nukleinsäuren können ebenfalls mit Molekülen, die ihre Fähigkeit, in Zielzellen zu gelangen, verstärken, komplexiert werden. Beispiele von solchen Molekülen schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf Kohlenhydrate, Polyamine, Aminosäuren, Peptide, Lipide und Moleküle, die für bakterielles Wachstum unerlässlich sind. Zum Beispiel können die antibakteriellen Nukleinsäuren mit einem Lipid, kationischem Lipid oder anionischem Lipid (das für protonierte/azidifizierte Nukleinsäuren bevorzugt sein kann) kombiniert werden. Die resultierenden Nukleinsäure/Lipid-Emulsion oder liposomale Suspension kann unter anderem die in vivo Halbwertszeit der Nukleinsäure wirksam erhöhen. Beispiele von geeigneten anionischen Lipiden, die für die Verwendung mit protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren geeignet sind, schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf Cardiolipin, Dimyristoyl-, Dipalmitoyl- oder Dioleoylphosphatidylcholin oder -phosphatidylglycerol, Palmitoyloleoylphosphatidylcholin oder -Phosphatidylglycerol, Phosphatidsäure, Lysophosphatidsäure, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol und anionische Formen von Cholesterol. Die Verwendung von kationischen, anionischen und/oder neutralen Lipidzusammensetzungen oder Liposomen wird allgemein in den internationalen Veröffentlichungen Nr. WO 90/14074, WO 91/16024, WO 91/17424 und US-Patent Nr. 4,897,355 beschrieben. Durch das Einbauen der antibakteriellen Nukleinsäuren in lipid-assoziierte Strukturen können die protonierten/azidifizierten antibakteriellen Nukleinsäuren durch den Einbau von geeigneten Mitteln, die auf ein Ziel gerichtet sind (d.h. spezifischen Antikörpern oder Rezeptoren), in den Nukleinsäure-/Lipidkomplex gegen bestimmte Arten von bakteriellen Zellen gerichtet werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Nukleinsäuren der Erfindung in Mischung mit einem pharmazeutischen Träger enthalten, können gemäß konventionellen pharmazeutischen Mischungstechniken hergestellt werden. Der Träger kann, abhängig von der Form der Präparation, die für die Verabreichung gewünscht wird, zum Beispiel intravenös, oral, topisch, aerosol (für topische oder pulmonale Abgabe), Zäpfchen, Parenteral- oder Spinalinjektion, eine Reihe von Formen annehmen.
Bei der Herstellung der Zusammensetzungen in oraler Dosierungsform kann jedes der üblichen pharmazeutischen Medien verwendet werden, wie zum Beispiel im Fall von oralen flüssigen Präparationen (wie zum Beispiel Suspensionen, Elixieren und Lösungen) Wasser, Glykol, Öle, Alkohole, Geschmacksstoffe, Konservierungsmittel, Farbstoffe und ähnliche; oder im Fall von oralen Festpräparationen (wie z. B. Pulvern, Kapseln und Tabletten) Trägerstoffen wie zum Beispiel Stärken, Zuckern, Verdünnungsmitteln, Granulierungsmitteln, Gleitmitteln, Bindemitteln, Auflösungsmitteln und ähnlichen. Aufgrund der Einfachheit ihrer Verabreichung stellen Tabletten und Kapseln die vorteilhaftesten oralen Dosierungseinheitsformen dar, wobei offensichtlich feste pharmazeutische Trägerstoffe verwendet werden. Wenn gewünscht, können Tabletten mittels Standardtechniken zuckerbeschichtet oder magensaftresistent beschichtet werden. Orale Dosierungsformen von antibakteriellen Nukleinsäuren sind insbesondere für die Behandlung von bakteriellen Infektionen des gastrointestinalen Trakts und Magengeschwüren, die durch bakterielle Infektionen verursacht werden (z. B. Heliobacter pylori Infektion und ähnliche), nützlich.
Für die parenterale Verabreichung durch Injektion können die Präparationen eine wässrige Lösung einer wasserlöslichen oder gelösten und pharmazeutisch annehmbaren Form der antibakteriellen Nukleinsäure in einer angemessenen Salzlösung umfassen. Injizierbare Suspensionen können ebenfalls unter Verwendung von angemessenen flüssigen Trägerstoffen, Suspendierungsmitteln, Mitteln zum Einstellen der Isotonizität, Konservierungsstoffen und ähnlichen hergestellt werden. Gegenwärtige Verfahren zur Herstellung von parenteral verabreichbaren Zusammensetzungen und Einstellungen, die für die Verabreichungen an Subjekte notwendig sind, sind bekannt, oder dem Durchschnittsfachmann offensichtlich und werden detaillierter zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Science, 15th Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1980) beschrieben. Die vorliegend beschriebenen Nukleinsäuren sollten parenteral in Konzentrationen unter der maximal tolerierbaren Dosis (MTD), die für die antibakterielle Nukleinsäure bestimmt worden ist, verabreicht werden.
Für die topische Verabreichung kann der Träger, abhängig von der Präparation, die eine Creme, ein Verband, ein Gel, eine Lotion, eine Salbe oder eine Flüssigkeit sein kann, eine Reihe von Formen annehmen.
Aerosole können durch das Auflösen oder Suspendieren der Nukleinsäure in einem Treibmittel, wie zum Beispiel Ethylalkohol, oder in einer Treibmittel- und Lösungsmittelphase hergestellt werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen für die topische oder Aerosolform enthalten im allgemeinen von ungefähr 0,01 Gew.-% (der Nukleinsäure) bis ungefähr 40 Gew.-%, vorzugsweise ungefähr 0,02 bis ungefähr 10 Gew.-% und bevorzugter ungefähr 0,05 bis ungefähr 5 Gew.-%, abhängig von der bestimmten verwendeten Form.
Zäpfchen werden durch das Mischen der Nukleinsäure mit Lipidträgern, wie zum Beispiel Kakaobutterfett, Kakaobutter, Glycerin, Gelatine oder Polyoxyethylenglykolen hergestellt.
Die vorliegend beschriebenen antibakteriellen Nukleinsäuren können durch nahezu jedes Mittel, das verwendet wird, um konventionelle Antibiotika zu verabreichen, an den Körper verabreicht werden. Eine Reihe von Abgabesystemen sind auf dem Gebiet der Abgabe von bioaktiven Verbindungen an Bakterien in einem Tier gut bekannt. Diese Systeme schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf intravenöse, intramuskuläre oder intratracheale Injektion, Nasenspray, Aerosole für die Inhalation und orale oder Zäpfchenverabreichung. Das spezifische Abgabesystem, das verwendet wird, hängt von der Lokalisation der Bakterien ab und den Ort der Bakterien zu bestimmen und ein angemessenes Abgabesystem auszuwählen gehört zu den Fähigkeiten des Durchschnittsfachmanns.
Die Nukleinsäuren der Erfindung haben den Vorteil, dass sie in allen Verabreichungsformen sehr wenig toxisch sind. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass die parenterale Verabreichung einer Lösung von Oligonukleotid gemäß der Erfindung in Mäusen bei 10 mg/Maus nicht toxisch ist, was eine LD₅₀ von weniger als eins bei 400 mg/kg bedeutet.
Kosmetische Verwendung von antibakteriellen Nukleinsäuren
Die protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren der Erfindung können in kosmetischen Produkten, wie zum Beispiel Lotionen, Cremes und topischen Lösungen verwendet werden. Die Nukleinsäuren der Erfindung können sowohl als antibakterielles Mittel, wie zum Beispiel in einer Lotion, als auch als Konservierungsmittel, um das Wachstum von Bakterien in der kosmetischen Präparation zu verhindern und/oder zu verzögern, verwendet werden. Somit können die Nukleinsäuren mit jeder bekannten kosmetischen Präparation verwendet werden, vorausgesetzt die Zusammensetzung der Präparation besitzt einen ausreichend niedrigen pH, um die Aktivität der protonierten Nukleinsäuren beizubehalten, d.h. 7,0 oder darunter. Die Nukleinsäuren sind in einer Menge vorhanden, die ausreichend ist, um eine antibakterielle Wirkung zu haben, und beträgt vorzugsweise zwischen 0,25 Gew.-% und 10 Gew.-%, bevorzugter zwischen 0,5 Gew.-% und 5 Gew.-%.
Die kosmetische Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann jeden eine Reihe von Zusatzstoffen enthalten, die selber aktive Inhaltsstoffe sind, wie zum Beispiel Glykol- oder Alpha-Hydroxysäuren, Vitamin A Palmitat (Retinyl Palmitat) und/oder Vitam E Acetat (Tocopheryl Acetat). Jedes von diesen ist vorzugsweise in einer Menge von ungefähr 0,5 bis ungefähr 5 Gew.-% vorhanden. Zusätzlich kann ein UV absorbierendes oder blockierendes Material, wie zum Beispiel PABA, verwendet werden.
Andere Verbindungen können ebenfalls zugesetzt werden, um zusätzlich befeuchtende Wirkungen zu haben und die Konsistenz der Zusammensetzung zu verbessern. Beispiele von solchen Verbindungen schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf: Cetylesterwachs, Stearylalkohol, Cetylalkohol, Glycerin, Methylparaben, Propylparaben, Quaternium-15, Befeuchtungsmittel, flüchtige Methylsiloxanflüssigkeiten und Polydiorganosiloxan-Polyoxyalkylen. Siehe z. B. U.S. Patente Nr. 5,153,230 und 4,421,769. Wenn es für die Zusammensetzung wünschenswert ist, zusätzliche Reinigungswirkung zu besitzen, können Chemikalien, wie zum Beispiel Natriumlaurylsulfat oder ein Metallsalz einer Carbonsäure zugegeben werden.
Die Nukleinsäuren der Erfindung können insbesondere in topischen Anti-Akne Zusammensetzungen nützlich sein, da sie eine gute Wirksamkeit gegen ein breites Spektrum von Bakterien besitzen, die Haut nur wenig reizen und chemisch stabil sind. Solche Zusammensetzungen sind vorzugsweise wässrig, da ölbasierte Zusammensetzungen den Aknezustand verschlimmern können.
Eine große Vielzahl von nicht flüchtigen Weichmachern sind hierin nützlich, wobei nicht begrenzende Beispiele dafür in McCutcheon's Vol. 2, Functional Materials, North American Edition, (1992), pp. 137–168, das hierin durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit eingeschlossen ist, und CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition (1992), das Hautkonditionierungsmittel auf den Seiten 572–575 und hautschützende Mittel auf Seite 580 auflistet, aufgelistet sind.
Von den nicht flüchtigen Weichmachermaterialien, die hierin nützlich sind, werden insbesondere Silikone, Kohlenwasserstoffe, Ester und Mischungen davon bevorzugt.
Beispiele von Silikonweichmachern schließen Polyalkylsiloxane, zyklische Polyalkylsiloxane und Polyalkylarylsiloxane ein. Die hierin nützlichen Polyalkylsiloxane schließen zum Beispiel Polyalkylsiloxane mit Viskositäten von ungefähr 0,5 bis ungefähr 100.000 Centistokes bei 25°C ein. Solche Polyalkylsiloxane entsprechen der allgemeinen chemischen Formel R₃SiO[R₂SiO]_xSiR₃, wobei R eine Alkylgruppe (vorzugsweise ist R Methyl oder Ethyl, noch bevorzugter Methyl) und x eine ganze Zahl von 0 bis ungefähr 500, die ausgewählt wird, um das gewünschte Molekulargewicht zu erreichen, ist. Kommerziell erhältliche Polalkylsiloxane schließen die Polydimethylsiloxane ein, die auch als Dimethicone bekannt sind, wobei nicht limitierende Beispiele von diesen die Vicasil^® Serien, die von der General Electric Company und die Dow Corning^® 200 Serie, die von der Dow Corning Corporation verkauft werden, einschließen. Spezifische Beispiele von Polydimethylsiloxanen, die hierin als Weichmacher nützlich sind, schließen Dow Corning^® 200 Flüssigkeit, die eine Viskosität von 0,65 Centistokes und einen Siedepunkt von 100°C besitzt, Dow Corning^® 225 Flüssigkeit, die eine Viskosität von 10 Centistokes und einen Siedepunkt größer als 200°C besitzt, und Dow Corning^® 200 Flüssigkeiten, die Viskositäten von 50, 350 und 12.500 Centistokes besitzen und Siedepunkte größer als 200°C besitzen, ein. Zyklische Polyalkylsiloxane, die hierin nützlich sind, schließen diejenigen ein, die der allgemeinen chemischen Formel [SiR₂O]_n entsprechen, wobei R eine Alkylgruppe ist (vorzugsweise ist R Methyl oder Ethyl, bevorzugter Methyl) und n eine ganze Zahl von ungefähr 3 bis ungefähr 8 ist, bevorzugter ist n eine ganze Zahl von ungefähr 3 bis ungefähr 7 und am bevorzugtesten ist n eine ganze Zahl von ungefähr 4 bis ungefähr 6. Wenn R Methyl ist, wird auf diese Materialien typischerweise als Cyclomethicone Bezug genommen. Kommerziell erhältliche Cytomethicone schließen Dow Corning^® 244 Flüssigkeit, die hauptsächlich das Cyclomethicon Tetramer (d.h. n = 4) enthält und die eine Viskosität von 2,5 Centistokes und einen Siedepunkt von 172°C besitzt, Dow Corning^® 344 Flüssigkeit, die hauptsächlich das Cyclomethicon Pentamer (d.h. n = 5) enthält und die eine Viskosität von 2,5 Centistokes und einen Siedepunkt von 178°C besitzt, Dow Corning^® 245 Flüssigkeit, die hauptsächlich eine Mischung des Cyclomethicon Tetramers und des Pentamers (d.h. n = 4 und 5) enthält und die eine Viskosität von 4,2 Centistokes und einen Siedepunkt von 205°C besitzt, und Dow Corning^® 345 Flüssigkeit, die hauptsächlich eine Mischung des Cyclomethicon Tetramers, Pentamers und Hexamers (d.h. n = 4,5 und 6) enthält und die eine Viskosität von 4,5 Centistokes und einen Siedepunkt von 217°C besitzt, ein. Ebenfalls nützlich sind Materialien, wie zum Beispiel Trimethylsiloxysilikat, das ein polymeres Material entsprechend der allgemeinen chemischen Formel [(CH₂)₃SiO_½]x[SiO₂]_y ist, wobei x eine ganze Zahl von ungefähr 1 bis ungefähr 500 und y eine ganze Zahl von ungefähr 1 bis ungefähr 500 ist. Ein kommerziell erhältliches Trimethylsiloxysilikat wird als eine Mischung mit Dimethicon als Dow Corning^® 593 Flüssigkeit verkauft. Ebenfalls hierin nützlich sind Dimethiconole, bei denen es sich um Hydroxy-terminierte Dimethylsilikone handelt. Diese Materialien können durch die allgemeinen chemischen Formeln R₃SiO[R₂SiO]_xSiR₂OH und HOR₂SiO[R₂SiO]_xSiR₂OH dargestellt werden, wobei R eine Alkylgruppe ist (vorzugsweise ist R Methyl oder Ethyl, bevorzugter Methyl) und x eine ganze Zahl von 0 bis ungefähr 500 ist, die ausgewählt wird, um das gewünschte Molekulargewicht zu erzielen. Kommerziell erhältliche Dimethiconole werden typischerweise als Mischungen mit Dimethicon oder Cyclomethicon verkauft (z. B. Dow Corning^® 1401, 1402 und 1403 Flüssigkeiten). Ebenfalls hierin nützlich sind Polyalkylarylsiloxane, wobei Polymethylphenylsiloxane, die bei 25°C Viskositäten von ungefähr 15 bis ungefähr 65 Centistokes besitzen, bevorzugt werden. Diese Materialien sind zum Beispiel als SF 1075 Methylphenylflüssigkeit (verkauft von der General Electric Company) und 556 Cosmetic Grade Phenyltrimethicon Flüssigkeit (verkauft von der Dow Corning Corporation) erhältlich.
Hierin nützliche Kohlenwasserstoffe schließen gerad- und verzweigtkettige Kohlenwasserstoffe ein, die ungefähr 10 bis ungefähr 30 Kohlenstoffatome besitzen, bevorzugter von ungefähr 12 bis ungefähr 24 Kohlenstoffatome und am bevorzugtesten von ungefähr 16 bis ungefähr 22 Kohlenstoffatome. Nicht beschränkende Beispiele von diesen Kohlenwasserstoffmaterialien schließen Dodekan, Squalan, Cholesterol, 5-hydrogeniertes Polyisobutylen, Docosan (d.h. ein C₂₂ Hydrokarbon), Hexadekan und Isohexadekan (ein kommerziell erhältlicher Kohlenwasserstoff, der als Permethyl^® 101A von Presperse, South Plainsfield, N. J. verkauft wird) ein. Andere Kohlenwasserstoffmaterialien, die hierin nützlich sind, schließen Paraffine und Mineralöle, wie zum Beispiel USP leichtes Mineralöl (zum Beispiel Klearol^® erhältlich von der Witco Corp., Melrose Park, Ill.) und USP Schwermineralöl (zum Beispiel Klearol^® erhältlich von der Witco Corp., Melrose Park, Ill.) ein.
Ebenfalls nützlich als nicht flüchtige Weichmacher sind Ester, einschließlich Ester von monofunktionellen und difunktionellen Fettsäuren, die mit Alkoholen und Polyolen (d.h. Alkoholen, die zwei oder mehr Hydroxygruppen besitzen) verestert worden sind. Eine große Zahl von Estern sind hierin nützlich, wobei langkettige Ester von langkettigen Fettsäuren bevorzugt werden (d.h. C10-40 Fettsäuren verestert mit C10-40 Fettalkoholen). Nicht beschränkende Beispiele von Estern, die hierin nützlich sind, schließen solche ein, die aus der Gruppe bestehend aus Diisopropyladipat, Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, Myristylpropionat, Ethylenglykoldistearat, 2-Ethylhexylpalmitat, Isodecylneopentanoat, C_12-15 Alkohol Benzoat, Di-2-Ethylhexylmaleat, Cetylpalmitat, Myristylmyristat, Stearylstearat, Cetylstearat, Behenylbehenat und Mischungen davon ausgewählt werden.
Verwendung von antibakteriellen Nukleinsäuren in Desinfektionsmitteln
Die Nukleinsäuren gemäß der Erfindung können ebenfalls als Desinfektionsmittel und insbesondere als flüssige Desinfektionspräparate, die biostatische oder vorzugsweise biozide Eigenschaften besitzen, Verwendung finden. Die Desinfektionslösung enthält mindestens eine ausreichende Menge an Nukleinsäuren gemäß der Erfindung und kann ebenfalls andere aktive Inhaltsstoffe mit biostatischen und/oder bioziden Eigenschaften enthalten. Zum Beispiel kann das Desinfektionsmittel Nukleinsäuren gemäß der Erfindung mit einer geeigneten Konzentration einer quaternären Ammoniumverbindung, wie zum Beispiel Dimethylbenzyldodecylammoniumchlorid, Dimethylbenzyldecylammoniumchlorid, Dimethylbenzyldecylammoniumbromid, Dimethylbenzyloctylammoniumchlorid und Cocosalkyldimethylbenzylammoniumchlorid, enthalten.
In einem anderen Beispiel können geeignete Mikrobizide Biguanidinverbindungen, wie zum Beispiel Oligohexamethylenbiguanidsalze und Bisbiguanide, verwendet werden. Siehe z. B. US Patent-Nr. 5,030,659. Zusätzliche biozide Inhaltsstoffe schließen Aldehyde, Phenolderivate und Halogephenylderivate ein. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,767,054. Wie von dem Durchschnittsfachmann erkannt werden wird, können andere Verbindungen mit so einer Aktivität ebenfalls in Verbindung mit den Nukleinsäuren gemäß der Erfindung eingesetzt werden.
Zusätzlich zu den beschriebenen aktiven Bestandteilen können die Desinfektionspräparate der Erfindung abhängig von der beabsichtigten Verwendung der Rezeptur andere typische Bestandteile enthalten. Insbesondere kann ein Säuerungsmittel verwendet werden, um den pH Bereich der Desinfektionslösung unter 7 zu halten. Für die Nukleinsäuren und/oder die anderen aktiven Inhaltsstoffe können geeignete Lösungsmittel verwendet werden, bei denen es sich vorzugsweise Wasser- oder wassermischbare organische Lösungsmittel handelt. Lösungen wie diese können einfach unter Verwendung von Druckluft oder allen anderen Treibmitteln, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, versprüht werden.
Diese Präparationen der Erfindung sind insbesondere für die Oberflächendesinfektion in medizinischen Umgebungen, wie zum Beispiel Krankenhäusern, Tierkliniken, Zahnarzt- und Arztpraxen und ähnlichen geeignet. Die Verwendung von Lösungen gemäß der Erfindung bei der Sterilisierung von Operationsinstrumenten ist insbesondere bevorzugt. Diese Präparate sind ebenfalls an öffentlichen Orten, wie zum Beispiel in Schulen, öffentlichen Verkehrsmitteln, Restaurants, Hotels und Wäschereien nützlich. Die Desinfektionsmittel finden ebenfalls Verwendung im Hausgebrauch als Reinigungsmittel für Toiletten, Waschbecken und den Küchenbereich.
Die protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren der Erfindung können ebenfalls in Desinfektionslösungen für die Haut verwendet werden. Solche Zusammensetzungen enthalten die Nukleinsäure gemäß der Erfindung in einer Lösung, die sich in einem Trägerstoff, der für die topische Verwendung geeignet ist, befindet. Das Desinfektionsmittel kann von schnell trocknender Art sein, wobei es wünschenswert ist, dass sich die Nukleinsäure in einer Ethanolbasis befindet. Solche Lösungen enthalten vorzugsweise auch einen Weichmacher für die Haut, da der Alkohol dazu neigt, die Haut extrem auszutrocknen. Beispiele von geeigneten Weichmachern schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf einen polyhydrischen Alkohol, wie zum Beispiel Polyethylenglykol, Glycerin, Diglycerin, Propylenglycol, Butylenglycol, Erythritol, Dipropylenglycol und Sorbitol. Die Menge des Weichmachers kann im Bereich von 0,1 bis 3,0 Gew.-% und bevorzugter im Bereich von 0,2 bis 1,5 Gew.-% liegen. Wenn der Gehalt an Weichmacher weniger als 0,1 Gew.-% beträgt, ist er nicht sehr wirksam und bei mehr als 3,0% ist die Lösung übermäßig klebrig.
Desinfektionslösungen für die Haut sind insbesondere für die Desinfektion der Hände nach medizinischer Behandlung oder der Abfallentsorgung nützlich. Desinfektion kann ebenfalls bei Operationen sowohl für das medizinische Personal als auch zur Sterilisation des Ortes der Operation am Patienten nützlich sein.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele werden angeführt, um den Durchschnittsfachmann mit einer vollständiger Offenbarung und einer Beschreibung auszustatten, wie der Gegenstand der Erfindung herzustellen und zu verwenden ist, und es ist nicht beabsichtigt, dass sie den Umfang von dem, was als die Erfindung betrachtet wird, einschränken. Es wurden Bemühungen angestellt, um mit Bezug auf die verwendeten Zahlen (zum Beispiel Mengen, Temperatur, Konzentrationen etc.) Genauigkeit sicherzustellen, aber einige experimentelle Fehler und Abweichungen sollten erlaubt sein. Sofern nicht anders angezeigt, sind Anteile Gewichtsanteile, Molekulargewicht ist durchschnittliches Molekulargewicht, Temperatur ist in Grad Celsius angegeben und der Druck ist bei oder nahe dem atmosphärischen Druck.
BEISPIEL 1: SYNTHESE VON NUKLEINSÄUREN
Nukleinsäuren wurden unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Phosphoramiditen auf kommerziell erworbenen DNA-Synthesegeräten im Maßstab von < 1 μM bis 1 > mM unter Verwendung von Standard Phosphoramiditchemie und Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, wie zum Beispiel die, die in Stec et al., 1984, J. Am. Chem. Soc. 106: 6077–6089, Stec et al., 1985, J. Org. Chem. 50(20): 3908–3913, Stec et al., 1985, J. Chromatog. 326: 263–280, LaPlanche et al., 1986, Nuc. Acid. Res. 14(22): 9081–9093 und Fasman, 1989, Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, CRC Press, Boca Raton, FL, offenbart sind, synthetisiert.
Nukleinsäuren wurden gemäß den Protokollen der Phosphoramidithersteller entschützt. Ungereinigte Nukleinsäuren wurden entweder unter reduziertem Druck getrocknet oder präzipitiert und dann getrocknet. Unter Verwendung des kommerziell erhältlichen DNA-Mate (Barkosigan Inc.) Reagenz oder konventioneller Techniken, wie zum Beispiel kommerziell erhältlichem Austauschharz, zum Beispiel Dowex (Dupont), oder durch Zugabe von Natriumsalzen gefolgt von Präzipitation, Diafiltration oder Gelfiltration etc. wurden die Natriumsalze der Nukleinsäuren hergestellt oder diese wurden in das Reinigungsverfahren eingebaut.
BEISPIEL 2: REINIGUNG VON NUKLEINSÄUREN
Eine Reihe von Standardverfahren wurden verwendet, um die vorliegend beschriebenen antibakteriellen Nukleinsäuren zu reinigen/herzustellen. In Kürze, die antibakteriellen Nukleinsäuren wurden über Chromatographie auf kommerziell erhältlichen Umkehrphasen- (zum Beispiel siehe die RAININ Instrument Co., Inc. Gebrauchsanweisung für die DYNAMAX^®-300A, Rein-DNA Umkehrphasensäulen, 1989 oder aktuelle Updates davon) oder Ionenaustauschmedien, wie zum Beispiel Waters' Protein Pak oder Pharmacia's Source Q (siehe im allgemeinen Warren und Vella, 1994, „Analysis and Purification of Synthetic Nucleic Acids by High-Performance Liquid Chromatography", in Methods in Molecular Biology, vol. 26; Protocols for Nucleic Acid Conjugates, S. Agrawal, ed. Humana Press, Inc., Totowa, NJ; Aharon et al., 1993, J. Chrom. 698: 293–301; und Millipore Technical Bulletin, 1992, Antisense DNA: Synthesis, Purification, and Analysis) gereinigt. Die Gipfelfraktionen wurden kombiniert und die Proben über Alkohol (Ethanol, Butanol, Isopropanol und Isomere und Mischungen davon, etc.) Präzipitation, Umkehrphasenchromatographie, Diafiltration oder Gelfiltration konzentriert und entsalzt.
BEISPIEL 3: PROTONIERUNG/AZIDIFIZIERUNG VON NUKLEINSÄUREN
Nach oder während den obigen Schritten können protonierte/azidifizierte Formen der beschriebenen Nukleinsäuren durch das Aussetzen der gereinigten, teilweise gereinigten oder unbearbeiteten Nukleinsäuren gegenüber einer (z. B. sauren) Umgebung mit niedrigem pH erzeugt werden. Gereinigte oder unbearbeitete Nukleinsäuren wurden mit Säuren, einschließlich Phosphorsäure, Salpetersäure, Salzsäure und Essigsäure protoniert/azidifiziert.
Gepolte Fraktionen eines über einen starken Anionenaustauscher (SAX)-gereinigten Oligonukleotids (mit ungefähr 2–25 A₂₆₀ pro ml) wurden auf eine PRP (Hamilton Co.) Säule gepumpt. Diesem folgte sofort ein Überschuss an verdünnter Säure (z. B. 25 mM HCl) bis der Eluent sauer war. Die Säule wurde dann mit gereinigtem Wasser (kein Salz oder Puffer) gewaschen, bis die Leitfähigkeit und der pH des Eluenten im wesentlichen auf den Hintergrundlevel zurückkehrte. Das Oligonukleotid wurde dann in einem kommerziell erhältlichen Vakuumverdampfer getrocknet. Alternativ wurde das Oligonukleotid in verdünnter Säure suspendiert und entweder über die PRP oder eine ähnliche Säule wie oben beschrieben chromatographiert oder über eine Größenausschlusssäule (z. B. BioRad Biogel P2 oder P4) unter Verwendung von Wasser als Lösungsmittel chromatographiert. Alternativ kann eine entsalzte Nukleinsäure in alkalischer Salzlösung (z. B. 0,4 M NaCl und pH 12, 25 mM NaOH) aufgelöst, über eine PRP Säule laufen gelassen, mit Säure gefolgt von Wasser gewaschen und dann wie oben beschrieben eluiert werden. Alternativ kann eine Nukleinsäure über eine Kationenaustauschersäule, die in der H+ Form ist, chromatographiert, gesammelt und wie oben beschrieben getrocknet werden.
Nukleinsäuren wurden ebenfalls durch direkte Zugabe einer Säure, z. B. HCl (0,1 N), zu der Nukleinsäurelösung (ungefähr 300 A₂₆₀ pro ml) azidifiziert, bis der pH der Lösung pH 1 bis pH 3 erreichte. Die azidifizierten Nukleinsäuren können dann über eine säurestabile Größenausschlusssäule, wie zum Beispiel eine BioRad Biogel P2 oder P4 Säule, laufen gelassen werden.
Lyophilisierte oder getrocknete Präparationen der Nukleinsäuren, die in den bakteriellen Experimenten verwendet werden sollten, wurden in pyrogen-freier, steriler, physiologischer Salzlösung (d.h. 0,85% Salz) in sterilem Sigma Wasser aufgelöst und durch einen 0,45 Mikrometer Gelman Filter (oder vor den Tierversuchen durch einen sterilen 0,2 Mikrometer pyrogen-freien Filter) gefiltert.
Wenn in Wasser oder Salzlösung suspendiert, zeigen die Nukleinsäuren Präparationen typischerweise einen pH zwischen 1 und 4,5, abhängig von dem Grad an Protonierung/Azidifizierung, der dadurch bestimmt wird, wie viel Säure in dem Azidifizierungsprozess verwendet wird.
BEISPIEL 4: BAKTERIELLE WACHSTUMSSTUDIEN
Wachstumsstudie bei begrenztem Nährstoffangebot
Für die Wachstumsstudie bei begrenztem Nährstoffangebot wurden die Zellen von den Platten genommen und in PBS suspendiert, um eine Endkonzentration von 10⁵ CFU/ml und ein Endvolumen von 1 ml zu ergeben. Mueller-Hinton Brühe wurde zugegeben (40 μl für S. aureus ACC # 13301, 20 μl für P. aeruginosa ACC # 10145). 100 μl Wasser oder 100 μl Nukleinsäure (32 A₂₆₀ Einheiten, 2'-O-Methyl Ribonukleotide, Phosphodiesterbindung, mit invertierten T's am 5' und 3' Ende blockierte Sequenz CGCCATTGG, SEQ ID Nr. 1) wurde zugegeben und die Röhrchen bei 35°C ohne Schütteln für ungefähr 24 Stunden inkubiert. Der A₆₂₅ wurde gemessen und die Inhibition in Prozent als Prozent der Kontrolle berechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:
Studie bei stationärem Wachstum
Ein Assay bei stationärem Wachstum wurde ebenfalls durchgeführt, um die Wirkung des pH auf die antibakterielle Aktivität der Nukleinsäuren zu studieren. Die Zellen wurden von den Platten genommen und in Salzlösung suspendiert, um eine Endkonzentration von 10⁷ CFU/ml S. aureus in 1 ml von PBS zu ergeben. 100 μl Wasser oder 100 μl Nukleinsäure (32 A₂₆₀ Einheiten, 2'-O-Methyl Ribonukleotide, Phosphodiesterbindung, mit invertierten T's am 5' und 3' Ende blockierte Sequenz CGCCATTGG, SEQ ID Nr. 1) wurde zugegeben und die Röhrchen bei 35°C ohne Schütteln für ungefähr 24 Stunden inkubiert. Aliqouts wurden direkt oder nach Verdünnungen ausplattiert, bei 37°C inkubiert und die Kolonien nach 24 Stunden gezählt. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle:
Aus diesen Ergebnissen wurde geschlussfolgert, dass das Erniedrigen des pH eines Nukleotid diesem bakterizide und bakteriostatische Wirkung verlieh. Als nächstes wurde die Wirkung der Sequenzidentität und Länge untersucht.
BEISPIEL 5: WIRKUNGEN DER SEQUENZ AUF DIE ANTIBAKTERIELLE AKTIVITÄT
Zuerst wurde ein Assay bei stationärem Wachstum durchgeführt, um die Wirkung der Sequenzlänge zu studieren. Die Zellen wurden von den Platten genommen und in Salzlösung suspendiert, um eine Endkonzentration von 10⁷ CFU/ml Strep. mutans in 1 ml von PBS zu ergeben. 50 μl Wasser oder 50 μl Nukleinsäuren verschiedener Länge (16 A₂₆₀ Einheiten) wurden zugegeben und die Röhrchen bei 35°C ohne Schütteln für ungefähr 24 Stunden inkubiert. Jede der verwendeten Nukleinsäuren bestand aus 2'-O-Methyl substituierten Ribonukleotid Phosphodiestern, verbunden mit invertierten T's am 5' und 3'-Ende zur Blockierung. Die Sequenzen waren 114.6-CGCCAT (SEQ ID Nr. 2); 114.12-ACGCGCCATTGG (SEQ ID Nr. 3); 114.21-GGAACGCGCCATTGGTATATC (SEQ ID Nr. 4). Die Längen, die in der folgenden Tabelle für jede Nukleinsäure angegeben sind, schließen die invertierten T's an den 5' und 3' Enden ein. Aliquots wurden direkt oder nach Verdünnungen ausplattiert, bei 37°C inkubiert und die Kolonien nach 24 Stunden gezählt. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle:
Als nächstes wurde ein Wachstumsassay unter begrenztem Nährstoffangebot durchgeführt, um die Wirkung von Nukleotid Homopolymeren (AAAAAAAAAAAA, SEQ ID Nr. 5; UUUUUUUUUUUU, SEQ ID Nr. 6; GGGGGGGGGGGG; SEQ ID Nr. 7; CCCCCCCCCCCC, SEQ ID Nr. 8) zu studieren. Jedes verwendete Homopolymer bestand aus 2'-O-Methyl substituierten Ribonukleotiden, die über Phosphodiester verbunden waren, wobei sowohl das 3' als auch das 5' Ende mit Butanol blockiert waren. Die Zellen wurden von den Platten genommen und suspendiert, um eine Endkonzentration von 10⁵ CFU/ml in 1 ml PBS zu ergeben. Mueller-Hinton Brühe wurde zugegeben (40 μl für S. aureus ACC # 13301, 20 μl für P. aeruginosa ACC # 10145). 100 μl Wasser oder 100 μl Nukleinsäure bei einem pH von 1,5 (32 A₂₆₀ Einheiten) wurde zugegeben und die Röhrchen bei 35°C ohne Schütteln für ungefähr 24 Stunden inkubiert. Die A₆₂₅ wurde gemessen und die Inhibition in Prozent berechnet als Prozent der Kontrolle. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle:
Als nächstes wurde ein Wachstumsassay unter begrenztem Nährstoffangebot durchgeführt, um Wirkung von Monomeren, Dimeren und Trimeren zu studieren. Jede verwendete Nukleinsäure bestand aus 2'-O-Methyl substituierten Ribonukleotiden, die über Phosphodiester verbunden waren, wobei sowohl das 3' als auch das 5' Ende mit Butanol blockiert waren. Die Nukleinsäure, die als 114.12 bezeichnet wird, hatte die Sequenz ACGCGCCATTAT, SEQ ID Nr. 9. Die Zellen wurden von den Platten genommen und suspendiert, um in 1 ml PBS eine Endkonzentration von 10⁵ CFU/ml zu ergeben. Mueller-Hinton Brühe wurde zugegeben (40 μl für S. aureus ACC # 13301, 20 μl für E. coli ACC # 35218). 25 μl Wasser oder 25 μl Nukleinsäure bei einem pH von 1,5 (8 A₂₆₀ Einheiten) wurde zugegeben und die Röhrchen bei 35°C ohne Schütteln für ungefähr 24 Stunden inkubiert. Die A₆₂₅ wurde gemessen und die Inhibition in Prozent berechnet als Prozent der Kontrolle. Aliquots wurden direkt oder nach Verdünnungen ausplattiert, bei 37°C inkubiert und die Kolonien nach 24 Stunden gezählt, um CFUs zu bestimmen. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle:
Ein Assay bei stationärer Phase wurde durchgeführt, um die Wirkung der Monomere, Dimere und Trimere zu studieren. Jede verwendete Nukleinsäure bestand aus 2'-O-Methyl substituierten Ribonukleotiden, die über Phosphodiester verbunden waren, wobei sowohl das 3' als auch das 5' Ende mit Butanol geblockt waren. Die Nukleinsäure, die als 114.12 bezeichnet wird, besaß die Sequenz ACGCGCCATTAT, SEQ ID Nr. 9. Die Zellen wurden von den Platten genommen und in Salzlösung suspendiert, um für S. aureus in 1 ml von PBS ein A₆₂₅ von 0,08, für E. coli 0,12 und für K. pneumoniae 0,1 zu ergeben. 25 μl Wasser oder 25 μl Nukleinsäure (8 A₂₆₀ Einheiten) wurden zugegeben und die Röhrchen bei 35°C ohne Schütteln für ungefähr 24 Stunden inkubiert. Die Aliqouts wurden direkt oder nach Verdünnungen ausplattiert, bei 37°C inkubiert und die Kolonien nach 24 Stunden gezählt, um CFUs zu bestimmen. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle:
Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass die Fähigkeit von protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren als antibakterielle Mittel zu wirken unabhängig von der Sequenzidentität ist. Ferner sind Homopolymere und so kurze Nukleinsäuren wie Monomere ebenfalls wirksam. Diese Ergebnisse zeigen, dass es, obwohl die Sequenz eine Rolle bei der Aktivität des Oligonukleotids spielen kann, einen anderen Mechanismus der antibakteriellen Wirkung gibt, der nicht Antisense abhängig und daher sequenzunabhängig ist.
BEISPIEL 6: IN VIVO ASSAYS
Es werden mehrere Beispiele von in vivo Studien bereitgestellt, um die Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung als ein antibakterielles Mittel zu bestimmen. Die folgenden Experimente konzentrieren sich auf topische Haut und die äußere Ohrepidermis, sowie Beispiele der systemischen Behandlung von Sepsis.
Wirksamkeit bei topischen bakteriellen Infektionen der Haut
Hautgeschwüre, die Furunkel genannt werden, wurden mit protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren behandelt. Ein Furunkel ist eine lokale pyogene Infektion, die typischerweise in einem Haarfollikel ihren Ursprung findet. Ein Furunkel ist ein rundes, weiches, eitergefülltes Gebiet der Haut, das eine weiße Kappe entwickelt, die zerreißt, wenn sie beansprucht wird. Oftmals kann ein Furunkel eine Infektion des Haarfollikels im tiefsten Teil sein. Ein Furunkel wird normalerweise in 10–25 Tagen heilen. Ohne Behandlung müssen Furunkel normalerweise entleert werden, bevor sie heilen. Das tritt am häufigsten knapp unter 2 Wochen auf. Wenn das Furunkel eine tiefe Läsion ist, kann zusätzlich zu einem kleineren operativen Eingriff, um das Furunkel zu öffnen und den Eiter abzulassen, eine systemische Antibiotikatherapie erforderlich sein, um die Bakterien zu beseitigen. Zusammengefasst sind Furunkel schmerzhafte Schwellungen der Haut, die durch eine tiefe Hautinfektion mit Bakterien verursacht werden und die unbehandelt selten in weniger als 10 Tagen zurückgehen.
Die Wirksamkeit von protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren bei der Behandlung von Staphylococcen Furunkeln
Protonierte/azidifizierte Nukleinsäuren haben ihre Wirksamkeit bei der Behandlung eines 1,5 cm Furunkels am Rücken eines 36-Jahre-alten männlichen Subjekts mit gutem Gesundheitszustand gezeigt. Innerhalb von 8 Stunden linderten die protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren schnell und dramatisch sowohl den Schmerz als auch die Schwellung des Furunkels.
Protonierte/azidifizierte Nukleinsäuren (pH 1,5, Sequenz ACGCGCCATTAT, SEQ ID Nr. 9) wurde verwendet, um ein 1,5 cm Furunkel einen Tag nach seinem Auftreten zu behandeln. Die Nukleinsäure bestand aus 2'-O-Methyl substituierten Ribonukleotiden, die über Phosphodiester verbunden waren, wobei die Enden mit einem invertierten T an sowohl dem 5' als auch dem 3' Ende geblockt waren. Genauer wurden 100 μl protonierter/azidifizierter Nukleinsäure in Wasser aufgelöst (18,9 mMolar), um das 1,5 cm Furunkel zu behandeln, das mit einer 2–3 mM Pustel erhoben, rot und geschwollen und für das Subjekt sehr schmerzhaft war. Nach 8 Stunden Behandlung hatte sich das Furunkel spontan entleert und hatte sich signifikant auf eine Größe von ungefähr 0,5 cm verkleinert mit einer gleichzeitigen Verringerung der Schwellung und Rötung. Die Schmerzen des Subjekts waren erheblich gelindert. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine zweite 50 μl Applikation von protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren angewendet.
16 Stunden nach der anfänglichen Behandlung gab es nahezu keine Schwellung, keinen Schmerz oder keine Entzündung. Von dem ursprünglichen Furunkel verblieb nur ein kleines blass rosa Gebiet von < 0,5 cm. 24 Stunden nach der Behandlung der Infektion wurde eine letzte Anwendung von protonierter/azidifizierter Nukleinsäure angewendet, um das Beschleunigen des Heilungsprozesses fortzusetzen. Die verbleibenden Reste des Furunkels heilten nach der dritten Applikation innerhalb eines Tages von selbst.
Zusammenfassend wurde gezeigt, dass protonierte/azidifizierte Nukleinsäuren bei der schnellen Behandlung eines Staphylococcen Furunkels und unter Verwendung von Wasser als Transportmedium sehr wirksam sind. Die protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren waren insbesondere bei der schnellen Linderung von sowohl dem Schmerz als auch der Schwellung des Furunkels wirksam.
Wirksamkeit bei der topischen Behandlung von Ohrinfektionen
Protonierte/azidifizierte Nukleinsäuren waren bei der Behandlung von epidermalen Infektionen des äußeren Ohrs bei Chinchillas, die durch Pseudomonas aeruginosa Bakterien verursacht wurden, sehr wirksam. Alle infizierten Ohren der Chinchillas, die fortgesetzte protonierte/azidifizierte Nukleinsäurebehandlung erhielten, waren 4 Tage nach Beginn der Behandlung vollständig geheilt.
Die Ohren von Chinchillas wurden mit Pseudomonas aeruginosa Bakterien infiziert. Genauer wurde durch verlängerte Aussetzung der Ohren gegenüber Wasser die Mazeration der Epidermisschicht der Chinchillaohren verursacht. Das hilft dabei eine empfängliche Umgebung für die Pseudomonas Infektion in der epidermalen Schicht der Haut, die die Ohrkanäle der Chinchillas auskleidet, zu erzeugen. Baumwolltupfer wurden mit einer Suspension von gewaschenem Pseudomonas aeruginosa gesättigt und in die Ohrkanäle der Chinchillas eingeführt. Die Tupfer wurden nach 48 Stunden entfernt.
Die Behandlung der Chinchillas begann an Tag 3 nach der Infektion, sobald durch eine otoskopische Untersuchung bestimmt wurde, dass die Ohren einen „Grad 3" Schweregrad besitzen. Die Chinchillas erhielten zwei tägliche topische Anwendungen von entweder 400 μl protonierter/azidifizierter Nukleinsäure der Sequenz ACGCGCCATTAT, SEQ ID Nr. 9, bei einem pH von 1,5, in Wasser (2,8 mMolar) oder 400 μl der protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren identischer Sequenz (2 mMolar) in einer Trägermischung (Wasser/Ethanol/Propylenglykol). Die Nukleinsäure bestand aus 2'-O-Methyl substituierten Ribonukleotiden, die über Phosphodiester verbunden waren und deren Enden an sowohl an dem 5' als auch 3' Ende mit Butanol geblockt waren. Die Chinchillas wurden täglich untersucht, um, basierend auf dem Grad der Schwere der Ohrinfektionen, die Wirksamkeit der Behandlung zu beurteilen.
Die Ergebnisse der protonierten/azidifizierten Nukleinsäurebehandlung zeigten, dass, wie durch otoskopische Untersuchungen gezeigt, alle der behandelten Chinchillaohren eine deutliche Verringerung in der Schwere der Ohrinfektionen zeigten. Signifikante Verbesserungen konnten nach 3 Behandlungen mit protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren beobachtet werden. Die Chinchillas erhielten für zusätzliche 4 bis 5 Tage eine Behandlung. Unbehandelte Kontrollchinchillas zeigten über diesen Zeitrahmen keine Verbesserung. Im Gegensatz dazu waren alle Ohrinfektionen, die eine anhaltende Behandlung mit protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren erhielten, am Tag 7 nach der Infektion vollständig geheilt (d.h. 4 Tage nachdem die Behandlung mit protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren begann).
Zusätzlich gab es leichte Unterschiede beim Fortschritt der Heilung zwischen protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren, die in den zwei Transportmedien, Wasser oder Trägermischung (Wasser/Ethanol/Propylenglykol), aufgelöst waren. Basierend auf der otoskopischen Untersuchung waren die protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren in der Trägermischung etwas wirksamer bei der Behandlung der Ohrinfektionen.
Zusammenfassend haben protonierte/azidifizierte Nukleinsäuren ihre Wirksamkeit bei der Behandlung von Infektionen des äußeren Ohrs von Chinchillas, die durch Pseudomonas aeruginosa verusacht werden, gezeigt. Das ist bedeutsam, da dieses infektiöse Bakterium natürlicherweise ein Antibiotika resistentes Bakterium ist.
Wirksamkeit bei der Behandlung einer Strep. pyogenes Hautinfektion bei einem Hund
Ein 35 Pfund schwerer, 2 Jahre alter weiblicher Neufundländer erlitt einen Schnitt am Bauch und entwickelte eine Strep. pyogenes Infektion. Das Gebiet war geschwollen, entzündet und bei Berührung schmerzhaft. Die Behandlung mit Neosporin^® (Warner-Lambert, Co.) über 3 Tage verfehlte es, eine Verbesserung zu erzielen. Zwei, 12 Stunden getrennte, direkte Behandlungen der Verletzung mit 2'-O-Methyl substituierten Ribonukleotiden mit der Sequenz ACGCGCCATTAT (SEQ ID Nr. 9), pH 1,5, die über Phosphodiester verbunden waren, wobei die Enden an sowohl dem 5' als auch dem 3' Ende mit Butanol geblockt waren, beseitigte die Infektion, die Schwellung, die Entzündung und die Berührungsempfindlichkeit vollständig.
Wirksamkeit von protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren in einem Verbrennungsmodell einer topischen Pseudomonas Infektion
Protonierte/azidifizierte Nukleinsäuren haben ihre Wirksamkeit bei der Behandlung von topischen Hautinfektionen in immungeschwächten Mäusen gezeigt. Mäuse wurden vor einer Verbrennung der Haut mit Cyclophosphamid behandelt (200 mg/kg, I. P.), um ihr Immunsystem zu hemmen. Drei Tage später wurden Verbrennungen induziert, gefolgt von der Anwendung von 10⁹ CFU Pseudomonas aeruginosa, die topisch auf die Verbrennungsstelle aufgetragen wurden, um eine Infektion zu erzeugen. Die Behandlung mit Nukleinsäure erfolgte 4 und 8 Stunden nach der Infektion. Die Nukleinsäure, die in dem Experiment verwendet wurde, besaß einen pH von 1,5, hatte die Sequenz ACGCGCCATTAT, SEQ ID Nr. 9, und bestand aus 2'-O-Methyl substituierten Ribonukleotiden, die über Phosphodiester verbunden waren und deren Ende sowohl an dem 5' als auch dem 3' Ende mit Butanol geblockt waren. Einhundert Prozent (100) der behandelten Tiere überlebten und waren frei von systemischem Pseudomonas Infektionen, während 90% der Kontrolltiere systemische Infektionen entwickelten und verstarben. Die protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren waren in der Lage, die topische Infektion zu heilen. Zusätzlich war die topische Anwendung von Nukleinsäuren in der Lage, die topische Pseudomonas Infektion daran zu hindern, bis zu einer tödlichen systemischen Infektion fortzuschreiten.
Wirksamkeit von protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren in einem Verbrennungsmodell einer systemischen Pseudomonas Infektion
Mäuse wurden nach Induktion einer Hautverbrennung s.c. mit 10⁶ oder 10⁷ CFU Pseudomonas aeruginosa behandelt. Zwei Stunden nach der Infektion wurde die Behandlung mit azidifizierten Nukleinsäuren begonnen. Vierzig Prozent (40%) der Dosis wurden i.v. verabreicht, während der Rest s.c. gegeben wurde. Die Nukleinsäure, die in dem Experiment verwendet wurde, besaß einen pH von 1,5, hatte die Sequenz ACGCGCCATTAT, SEQ ID Nr. 9, und bestand aus 2'-O-Methyl substituierten Ribonukleotiden, die über Phosphodiester verbunden waren und deren Enden sowohl an dem 5' als auch dem 3' Ende mit Butanol geblockt waren. Die Prozedur wurde 6 Stunden später wiederholt. An Tag zwei und drei wurden zwei Mal täglich zusätzliche subkutane Injektionen gegeben. Alle der 45 Kontrolltiere starben und 100 der 40 behandelten Mäuse überlebten und waren gesund. Diese behandelten gesunden Mäuse wurden getötet und auf Sepsis überprüft. In der Milz, der Leber oder dem Blut wurden keine Pseudomonas Bakterien entdeckt.
Zusammenfassend war eine protonierte/azidifizierte Nukleinsäure bei der Behandlung einer systemischen Pseudomonas Infektion, die, wenn sie unbehandelt geblieben wäre, tödlich gewesen wäre, 100% wirksam.
BEISPIEL 7: TOXIZITÄT VON PROTONIERTEN/AZIDIFIZIERTEN NUKLEINSÄUREN
Fünfundvierzig Tiere (Mäuse, männlich/C57 Balb/c) erhielten subkutan, über intraperitoneale Injektion oder topische Anwendung eine Behandlung mit protonierter/azidifizierter Nukleinsäure. Die Mäuse wurden zufällig ausgewählt und waren zum Zeitpunkt der Durchführung der Studie ungefähr 6 bis 8 acht Wochen alt (25–30 g Körpergewicht). Die Mäuse wurden zu fünft in einer Box gehalten und in einem Raum mit kontrollierter Umgebung mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser gehalten.
Die Mäuse (fünf pro Gruppe) bekamen für 14 Tage täglich protonierte/azidifizierte Nukleinsäuren mit einem pH von 1,5 mit der Sequenz ACGCGCCATTAT, SEQ ID Nr. 9, oder Wasser injiziert. Die Nukleinsäure bestand aus 2'-O-Methyl substituierten Ribonukleotiden, die über Phosphodiester verbunden waren, und deren Enden sowohl an dem 5' als auch dem 3' Ende mit Butanol geblockt waren. Die Behandlung erfolgte über intraperitoneale Verabreichung, subkutane Verabreichung oder wurde topisch verabreicht.
Alle Mäuse wurden während dem Behandlungszeitraum täglich auf Lebensfähigkeit und Zeichen der Toxizität untersucht. 24 Stunden nach der letzen Injektion wurden Nekropsien durchgeführt. Bei der Nekropsie wurde eine vollständige Untersuchung von allen Körperhöhlungen und Organen durchgeführt. Ausgewählte Organe wurden fixiert und für die histopathologische Bewertung gefärbt. Die Zusammenfassung der Ergebnisse ist wie folgt.
Mortalität und klinische Manifestationen
Während der Studie blieben selbst bei der höchsten Dosis von 100 mg/kg alle Mäuse voll aktiv und wach mit keinen klinischen Anzeichen abnormalen Verhaltens während dem Verlauf der Studie.
Klinische Chemie
Bei allen getesteten klinisch chemischen Parametern gab es keine Abweichungen bei Leberenzymen (alkalische Phosphatase, ALT, AST) und Gesamtbilirubingehalt. Die mittleren Serum alkalische Phosphatase, ALT und ASL Mengen zeigten keine signifikanten Unterschiede von den Trägerkontrollwerten, was vermuten lässt, dass es keinen Beweis für Toxikose gibt. Die indirekten und direkten Bilirubinwerte zeigten keine Unterschiede zu denen der Träger-behandelten Kontrollen, was auf keine renalen oder hepatischen Abnormalitäten hindeutet.
Grobe Nekropsie
Während der Studie zeigte die Untersuchung, dass es an der Stelle der Injektion keine deutlichen Auffälligkeiten gab, was vermuten lässt, dass es selbst mit der höchsten Dosis an Nukleinsäure keine lokalen entzündlichen Reaktionen gibt. Es gab keine sichtbaren Zeichen von Vergrößerung oder Nekrose von irgendeinem Organ. Insbesondere gab es selbst bei über 14 aufeinanderfolgende Tage verabreichten Dosen von 100 mg/kg pro Tag verglichen mit den Kontrolltieren keine Vergrößerung der Milz, Leber oder der Nieren.
Histopathologie
Schnitte von verschiedenen Geweben zeigten keine Unterschiede zwischen den Kontroll- und behandelten Tieren. Zusammengefasst waren die Schlüsselergebnisse:

(1) es gab in der behandelten Gruppe gegenüber der Kontrollgruppe keine signifikanten Anstiege in irgendeinem Enzymlevel;
(2) es gab keine Zeichen von groben Abnormalitäten in irgendeinem der Tiere, die mit Oligos behandelt wurden;
(3) alle Tiere blieben während der Studie gesund und wachsam; und
(4) alle Verabreichungswege (intraperitoneal, subkutan, topisch) lieferten ähnliche Ergebnisse.

Die Ergebnisse zeigen, dass die protonierten/azidifizierten Nukleinsäuren selbst nach 14 Tagen einer täglichen Verabreichung von 100 mg pro Kilogramm und unabhängig von dem Verabreichungsweg nicht toxisch waren.
SEQUENZLISTE

Claims

Ein antibakterielles, modifiziertes Oligonukleotid umfassend ungefähr 2 bis ungefähr 100 Nukleotide und ferner umfassend: (a) eine 2' oder 3' Substitution an einer oder mehreren Ribosegruppen, die für ein im wesentlichen säureresistentes modifiziertes Oligonukleotid sorgt, (b) eine 3' endständige Substitution, die für ein im wesentliches nuklease-resistentes modifiziertes Oligonukleotid sorgt, und (c) ein oder mehrere exogene Protonen, die in reaktive Stellen des modifizierten Oligonukleotids eingeführt sind, mit der Wirkung, dass besagtes Oligonukleotid einen pH von 4,0 bis ungefähr 1 ergibt, wenn es in Wasser aufgelöst wird, für die Verwendung als antibakterielles Mittel.
Das modifizierte Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das im wesentlichen säureresistente modifizierte Oligonukleotid eine pH-Stabilität von mindestens einer Stunde bei einem pH von ungefähr 1 bis ungefähr 4 bei 37°C besitzt.
Das modifizierte Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das nuklease-resistente modifizierte Oligonukleotid eine Nukleaseresistenz von mindestens zwei Mal der einer natürlich auftretenden Nukleinsäure, die die gleiche Anzahl von Nukleotiden besitzt, besitzt.
Das modifizierte Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das modifizierte Oligonukleotid in einer Lösung bei einem pH von ungefähr 1 bis 4,0 protoniert wird.
Das modifizierte Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, ferner umfassend eine 5' endständige Substitution.
Das modifizierte Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei besagtes modifiziertes Oligonukleotid Internukleosidbindungen umfasst, die vollständig oder teilweise von einer chemischen Gruppe abgeleitet sind, die aus der Gruppe bestehend aus Phosphodiesterbindungen, Phosphoramidatbindungen, Siloxanbindungen, Carbonatbindungen, Carboxymethylesterbindungen, Acetamidatbindungen, Carbamatbindungen, Thioetherbindungen, verbrückten Phosphoramidatbindungen, verbrückten Methylenphosphonatbindungen, Phosphorthioatbindungen, Methylphosphonatbindungen, verbrückten Phosphorthioatbindungen, Sulfoninternukleotidbindungen, 3'-3' Bindungen, 2'-5' Bindungen, 5'-5' Bindungen, 2'-Deoxy-Erythropentofuranosyl, 2'-Fluoro, 2'-O-Alkyl Nukleotiden, 2'-O-Alkyl-n(O-Alkyl) Phosphodiestern, Morpholinbindungen, p-Ethoxy Oligonukleotiden, PNA-Bindungen und p-Isopropyl Oligonukleotiden ausgewählt wird.
Das modifizierte Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei die 3' endständige Substitutionsgruppe Butanol ist.
Das modifizierte Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das modifizierte Oligonukleotid Modifikationen der Zuckerreste, wie zum Beispiel 2'-substituierte Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotidmonomere, von denen jedes über 5'-3'-Bindungen verbunden sein kann, umfasst.
Das modifizierte Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das modifizierte Oligonukleotid 2'-5' Internukleosidbindungen und eine 3' Substitution an einer oder mehreren Ribosegruppen umfasst.
Das modifizierte Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei die 2' oder 3' Substitution eine O-Alkylgruppe ist.
Das modifizierte Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei die Substitution ein O-Alkyl-n(O-Alkyl) ist.
Eine Zusammensetzung umfassend das modifizierte Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Zusammensetzung in Lösung mit einem pH von ungefähr 1 bis 4,0 vorliegt.
Eine Zusammensetzung umfassend das modifizierte Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Zusammensetzung ein Feststoff ist, und wobei die Zusammensetzung einen pH von ungefähr 1 bis 4 besitzt, wenn sie in Wasser mit einer Konzentration von ungefähr 0,05 Gew.-% bis ungefähr 5 Gew.-% der Nukleinsäure aufgelöst wird.
Ein antibakterielles, modifiziertes Nukleinsäuremonomer umfassend: (a) eine 2' oder 3' Substitution einer Ribosegruppe, die für ein im wesentlichen säureresistentes modifiziertes Nukleinsäuremonomer sorgt, (b) eine 3' endständige Substitution, die für ein im wesentlichen nuklease-resistentes modifiziertes Nukleinsäuremonomer sorgt, und (c) ein oder mehrere exogene Protonen, die in reaktive Stellen des modifizierten Nukleinsäuremonomers eingeführt sind, mit der Wirkung das besagtes Nukleinsäuremonomer einen pH von 4,0 bis ungefähr 1 ergibt, wenn es in Wasser aufgelöst wird, für die Verwendung als antibakterielles Mittel.
Das modifizierte Nukleinsäuremonomer gemäß Anspruch 14, wobei das nuklease-resistente modifizierte Nukleinsäuremonomer für mindestens eine Stunde bei einem pH von ungefähr 1 bis ungefähr 4 bei 37°C pH-Stabilität besitzt.
Das modifizierte Nukleinsäuremonomer gemäß Anspruch 14, wobei das nuklease-resistente modifizierte Nukleinsäuremonomer eine Nukleaseresistenz von mindestens zwei Mal der eines natürlich auftretenden Nukleotids besitzt.
Das modifizierte Nukleinsäuremonomer gemäß Anspruch 14, wobei das modifizierte Nukleinsäuremonomer in einer Lösung bei einem pH von ungefähr 1 bis 4,0 protoniert wird.
Das modifizierte Nukleinsäuremonomer gemäß Anspruch 14, ferner umfassend eine 5' endständige Substitution.
Das modifizierte Nukleinsäuremonomer gemäß Anspruch 14, wobei die 3' endständige Substitutionsgruppe Butanol ist.
Das modifizierte Nukleinsäuremonomer gemäß Anspruch 14, wobei die 2' oder 3' Substitution eine O-Alkylgruppe ist.
Das modifizierte Nukleinsäuremonomer gemäß Anspruch 14, wobei die 2' oder 3' Substitution eine O-Alkyl-n(O-Alkyl) Gruppe ist.
Eine Zusammensetzung umfassend das modifizierte Nukleinsäuremonomer gemäß einem der Ansprüche 14 bis 22, wobei die Zusammensetzung in einer Lösung mit einem pH von ungefähr 1 bis 4,0 vorliegt.
Eine Zusammensetzung umfassend das modifizierte Nukleinsäuremonomer gemäß einem der Ansprüche 14 bis 22, wobei die Zusammensetzung ein Feststoff ist, und wobei die Zusammensetzung einen pH von ungefähr 1 bis 4 besitzt, wenn sie in Wasser mit einer Konzentration von ungefähr 0,05 Gew.-% bis ungefähr 5 Gew.-% der Nukleinsäure aufgelöst wird.
Ein Aerosol umfassend ein Oligonukleotid, wobei das Oligonukleotid ein antibakterielles, modifiziertes Oligonukleotid ist umfassend: (a) eine 2' oder 3' Substitution an einer oder mehreren Ribosegruppen, die für ein im wesentlichen säureresistentes, modifiziertes Oligonukleotid sorgt, (b) eine 3' endständige Substitution, die für ein im wesentlichen nuklease-resistentes modifiziertes Oligonukleotid sorgt, und (c) ein oder mehrere exogene Protonen, die in reaktive Stellen des modifizierten Oligonukleotids eingeführt sind, mit der Wirkung, dass besagtes Oligonukleotid einen pH von 5,0 bis ungefähr 1 ergibt, wenn es in Wasser aufgelöst wird.
Verwendung eines Oligonukleotids für die Herstellung eines antibakteriellen Medikaments, wobei besagtes Oligonukleotid ein antibakterielles, modifiziertes Oligonukleotid ist umfassend: (a) eine 2' oder 3' Substitution an einer oder mehreren Ribosegruppen, die für ein im wesentlichen säureresistentes modifiziertes Oligonukleotid sorgt, (b) eine 3' endständige Substitution, die für ein im wesentlichen nuklease-resistentes modifiziertes Oligonukleotid sorgt, und (c) ein oder mehrere exogene Protonen, die in reaktive Stellen des modifizierten Oligonukleotids eingeführt sind, mit der Wirkung dass besagtes Oligonukleotid einen pH von 5,0 bis ungefähr 1 ergibt, wenn es in Wasser aufgelöst wird.