DE69613984T2

DE69613984T2 - Für die protein-kinase a-spezifische modifizierte oligonukleotide und verfahren zur deren verwendung

Info

Publication number: DE69613984T2
Application number: DE69613984T
Authority: DE
Inventors: Sudhir Agrawal
Original assignee: Hybridon Inc
Current assignee: Aceragen Inc
Priority date: 1995-09-22
Filing date: 1996-09-19
Publication date: 2001-11-29
Anticipated expiration: 2016-09-20
Also published as: CA2232724A1; EP0846170B1; US5969117A; AU7241296A; DE69613984D1; EP0846170A1; WO1997011171A1; JPH11512601A; ATE203271T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft die Krebstherapie. Insbesondere betrifft die Erfindung die Hemmung der Vermehrung von Krebszellen unter Verwendung von modifizierten Antisense-Oligonukleotiden, die zu der für die Proteinkinase A RIα-Untereinheit kodierenden Nukleinsäure komplementär sind.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Entwicklung einer wirksamen Krebstherapie war ein Hauptziel der biomedizinischen Forschung. Operative /erfahren wurden entwickelt und für die Behandlung von Patienten eingesetzt, deren Tumore auf bestimmte anatomische Stellen begrenzt sind. Jedoch besitzen bei einer Darstellung nur etwa 25% der Patienten Tumore, die wirklich begrenzt und einer ausschließlich operativen Behandlung zugänglich sind (Slapak et al., in Harrison's Principles of Internal Medicine (Isselbacher et al., Hrsg.), McGraw-Hill, Inc., NY (1994), Seiten 1826- 1850). Die Elestrahlungstherapie ist ähnlich wie eine operative Behandlung eine lokale Maßnahme, deren Einsatz bei der Krebsbehandlung zu einem großen Ausmaß von der inhärenten Radiosensitivität des Tumors und des benachbarten normalen Gewebes abhängt. Jedoch ist eine Bestrahlungstherapie mit einer akuten Toxizität und langwierigen Folgekrankheiten assoziiert. Weiterhin ist bekannt, dass eine Bestrahlungstherapie eine mutagene, karzinogene und teratogene Wirkung aufweist (Slapak et al., ibid.)..
Eine systemische Chemotherapie alleine oder in Kombination mit einer operativen Behandlung und/oder Bestrahlungstherapie ist gegenwärtig die vorherrschende Behandlung, die für verstreute Malignizitäten verfügbar ist. Jedoch fehlt herkömmlichen Chemotherapeutika, die entweder enzymatische Wege blockieren oder zufällig mit DNA ungeachtet des zellulären Phänotyps interagieren, eine Spezifität für das Abtöten von neoplastischen Zellen. Somit ergibt sich aus der cytotoxischen Standard-Chemotherapie häufig eine systemische Toxizität. In jüngerer Zeit war die Entwicklung von Wirkstoffen, die die Replikation, Transkription oder Translation in transformierten Zellen blockieren und zugleich die Möglichkeit verhindern, dass die Zellen resistent werden, das Ziel vieler Chemotherapieverfahren.
Eine Strategie ist die Absenkung der Expression eines Gens, das mit dem neoplastischen Phänotyp einer Zelle assoziiert ist. Ein Verfahren zur Abschaltung eines einzelnen aktivierten Gens ist die Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden und ihrer Analoga für die Hemmung der Genexpression (Zamecnik et al. (1978), Proc, Natl. Acad. Sci. (USA) 75: 280-284). Ein Antisense-Oligonukleotid, dessen Ziel ein Gen ist, das am neoplastischen Zellwachstum beteiligt ist, sollte spezifisch nur mit der Expression dieses Gens interferieren, was zu einer Hemmung des Krebszellwachstums führt. Die Möglichkeit, die Expression derartiger Gene spezifisch zu blockieren oder abzusenken, stellt ein hilfreiches Mittel bereit, um die molekulare Basis e ner normalen Wachstumsregulierung zu untersuchen, sowie die Möglichkeit für ein therapeutisches Eingreifen (vgl. z. B. Cho-Chung (1993), Curr. Opin. Thera. Patents 3: 1737-1750). Die Identifizierung von Genen, die neoplastischen Zellen einen Wachstumsvorteil verleihen, sowie von anderen Genen, die kausal mit Krebs in Verbindung stehen und das Verstehen des (der) genetischen Mechanismus (Mechanismen), der (die) für ihre Aktivierung verantwortlich ist (sind), ermöglicht das Antisense-Verfahren für die Krebsbehandlung.
Ein solches Gen kodiert für die RIα-Untereinheit der zyklisches AMP (cAMP)-abhängigen Proteinkinase A (PKA) (Krebs (1972), Curr. Topics Cell. Regul. 5: 99-133). Proteinkinase bindet cAMP, von dem man annimmt, dass es eine Rolle bei der Steuerung der Zellvermehrung und Differenzierung spielt (vgl. z. B. Cho-Chung (1980), J. Cyclic Nucleotide Res. 6: 163-167). Es gibt zwei PKA-Typen, Typ I (PKA-I) und Typ II (PKA-II). Beiden ist eine C- Untereinheit gemeinsam, sie enthalten jedoch verschiedene R-Untereinheiten, RI bzw. RII (Beebe et a., in The Enzymes: Control by Phosphorylation, 17(A): 43-111 (Academic, New York, 1986)). Die R-Untereinheit-Isoformen unterscheiden sich in der Gewebeverteilung (Oyen et al. (1988). FEBS Lebt 229: 391-394; Clegg et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 3703-3707) und in ihren biochemischen Eigenschaften (Beebe et al., in The Enzymes: Control by Phosphorylation, 17(A):43-111 (Academic Press, NY, 1986); Cadd et al. (1990), J. Biol. Chem. 265: 19502-19506). Die zwei allgemeinen Isoformen der R-Untereinheit unterscheiden sich auch in ihrer subzellulären Lokalisierung: RI findet sich im ganzen Cytoplasma, während RII in den Nuklei, Nukleoli, im Golgi-Apparat und im Mikrotubulus-aufbauenden Zentrum auftritt (vgl. z. B. Lohmann, in Advances in Cyclic Nucleotide and Protein Phospho,ylation Research, 18: 63-117 (Raven, New York, 1984); und Nigg et al. (1985), Cell 41: 1039-10~ 1).
Eine Erhöhung der RIα-Expression wurde in menschlichen Krebszelllinien und in Primärtumoren im Vergleich zu normalen Gegenstücken, in Zellen nach einer Transformation mit dem Ki-ras-Onkogen oder dem transformierenden Wachstumsfaktor α und bei einer Stimulierung des Zellwachstums mit dem Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) oder Phorbolestern nachgewiesen (Lohmann, in Advances in Cyclic Nucleotide and Protein Phosphorylation Research, 18: 63-117 (Raven, New York, 1984); Cho- Chung (1990), Cancer Res. 50: 7093-7100). Im Gegensatz dazu wurde eine Verringerung der Expression von RIα mit einer durch stellenselektive cAMP-Analoga induzierten Wachstumshemmung in einem breiten Spektrum von menschlichen Krebszelllinien in Verbindung gebracht (Cho-Chung (1990), Cancer Res. 50: 7093-7100). Es wurde auch gezeigt, dass die Expression Ion RI/PKA-I und RIIIPKA-II ein umgekehrtes Verhältnis während einer Ontogenese und zellulären Differenzierung aufweist (Lohmann, in Advances in Cyclic Nucleotide and Protein Phosphorylation Research, Bd. 18: 63-117 (Raven, New York, 1984); Cho- Chung (1990), Cancer Res. 50 : 7093-7100). Die RL-Untereinheit von PKA wurde somit als Wachstumsinduzierendes Protein der Ontogenese bewertet, dessen konstitutive Expression normale Abläufe der Ontogenese stört, was zu einem pathogenen Wachstum wie Malignizität führt (Nesterova et al. (1995), Nature Medicine 1: 528-533). Gegen das RIα-Gen gerichtete Antisense-Oligonukleotide wurden hergestellt. Die US-PS 5,271,941 beschreibt Phosphodiester-verknüpfte Antisense-Oligonukleotide, die zu einer Region der ersten 100 N- terminalen Aminosäuren von RIα komplementär sind und die Expression von RIα in Leukämiezellen in vitro hemmen. Ferner stellte sich heraus, dass Antisense-Phosphorothioat-Oligodesoxynukleotide, die den N-terminalen 8-13 Kodons des RIα-Gens entsprechen, das Tumorwachstum in Nacktmäusen in vivo verringern (Nesterova et al. (1995), Nature Medicine 1: 528-533).
Leider waren Probleme mit der Verwendung von Phosphodiester-verbundenen (PO) Oligonukleotiden und manchen Phosphorothioat-verbundenen (PS) Oligonukleotiden verbunden. Man weiß, dass Nukleasen im Serum PO-Oligonukleotide schnell abbauen. Ein Austausch der Phosphodiester-Internukleotidbindungen durch Phosphorothioat-Internukleotidbindungen zeigte eine stabilisierende Wirkung auf Oligonukleotide in Zellen, Zellextrakten, Serum und anderen Nuklease-enthaltenden Lösungen (vgl. z. B. Bacon et al. (1990), Biochem. Biophys. Meth. 20: 259) und in vivo (Iversen (1993), Antisense Research and Application (Crooke, Hrsg.), CRC Press, 461). Jedoch stellte sich heraus, dass manche PS-Oligonukleotide eine immunstimulierende Wirkung aufweisen, die in manchen Fällen unerwünscht sein kann. Zum Beispiel beschreiben Galbraith et al. (Antisense Res. & Dev. (1994) 4: 201-206) die Aktivierung von Komplement durch manche PS-Oligonukleotide. Henry et al. (Pharm. Res. 1994) 11:PPDM8082) beschreiben, dass manche PS-Oligonukleotide möglicherweise mit der Blutgerinnung interferieren könnten.
Es besteht daher ein Bedarf für gegen Krebs bezogene Gene gerichtete, modifizierte Oligonukleotide, die eine Genexpression hemmen, wobei sie weniger Nebenwirkungen als herkömmliche Oligonukleotide erzeugen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft modifizierte Oligonukleotide, die für Genexpressionsstudien und für die Antisense-Therapie verwendbar sind. Erfindungsgemäß werden modifizierte Oligonukleotide bereitgestellt, die die Expression des RIα-Gens senken, während sie weniger Nebenwirkungen als herkömmliche Oligonukleotide hervorrufen. Insbesondere werden erfindungsgemäß modifizierte Oligonukleotide bereitgestellt, die eine verringerte Mitogenizität, eine verminderte Komplementäktivierung und verminderte antithrombotische Eigenschaften im Vergleich zu herkömmlichen Oligonukleotiden aufweisen.
Man weiß, dass Oligonukleotide, die ausschließlich Phosphodiester- oder ausschließlich Phosphorothioatbindungen aufweisen und gegen die ersten 100 Nukleotide der RIα-Nukleinsäure gerichtet sind, eine Zellvermehrung hemmen. Man weiß auch, dass manche PS-Oligonukleotide eine immunstimulierende Reaktion in Lebewesen verursachen, an die sie verabreicht wurden, die in manchen Fällen unerwünscht sein könnte. Man fand nun heraus, dass modifizierte Oligonukleotide, die zu dem Gen für die Proteinkinase A RIα-Untereinheit komplementär sind, das Wachstum von Tumoren in vivo hemmen und dass diese modifizierten Oligenukleotide wenigstens die anti-PKA-Aktivität eines vergleichbaren PO- oder PS- verknüpften Oligonukleotids aufweisen, jedoch weniger Nebenwirkungen hervorrufen.
Diese Ergebnisse wurden erfindungsgemäß genutzt, wobei die Erfindung in einem ersten Aspekt synthetische Hybrid-Oligonukleotide und Zusammensetzungen für eine spezifische Absenkung der Expression des Gens für Proteinkinase A Untereinheit RIα bei verringerten Nebenwirkungen umfasst. Eine solche Hemmung der Genexpression ist als Alternative für eine Mutantenanalyse bei der Bestimmung der biologischen Funktion und Rolle von Proteinkinase A-verwandten Genen bei der Zellvermehrung und beim Tumorwachstum einsetzbar. Eine derartige Hemmung der RIα-Genexpression kann auch für die therapeutische Behandlung von Erkrankungen und Krankheiten eingesetzt werden, die durch die Überexpression oder unangemessene Expression des Gens hervorgerufen werden.
Der Begriff "synthetisches Oligonukleotid" umfasst hier chemisch synthetisierte Polymere aus 3 bis 50, vorzugsweise etwa 15 bis etwa 30 und am besten 18 Ribonukleotid- und/oder Desoxyribonukfeoticl-Monomeren, die miteinander durch wenigstens eine und vorzugsweise mehr als eine 5' an 3'-Internukleotidbindung verbunden oder verknüpft sind.
Erfindungsgemäß bedeutet der Begriff "Oligonukleotidsequenz, die zu einer genomischen Region oder einem RNA-Molekül komplementär ist, das davon transkribiert wird" ein Oligonukleotid, das bei physiologischen Bedingungen, z. B. durch Watson-Crick-Basenpaarung (Interaktion zwischen einem Oligonukleotid und einer einzelsträngigen Nukleinsäure) oder durch Hoogsten-Basenpaarung (Interaktion zwischen einem Oligonukleotid und einer doppelsträngigen Nukleinsäure) oder auf irgendeine andere Art und Weise, einschließlich dem Fall, bei dem ein Oligonukleotid an RNA bindet, wodurch die Bildung eines Pseudoknotens hervorgerufen wird, an die Nukleinsäuresequenz bindet. Die Bindung durch Watson-Crick- oder Hoogslen-Basenpaarung wird üblicherweise unter physiologischen Bedingungen üblicherweise durch Messen der Interferenz mit der Funktion der Nukleinsäuresequenz bestimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Aspekts ist das Oligonukleotid ein Hybrid-Oligonukleotid mit einer Kernregion, das eine Region mit wenigstens zwei Desoxyribonukleotiden umfasst, die durch 5'- und 3-Ribonukleotidregionen flankiert wird, die jeweils wenigsten 4 Ribonukleotide aufweisen. Ein Hybrid-Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO: 4 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz ist eine spezifische Ausführungsform. In manchen Ausführungsformen umfassen die 3'- und 5'-flankierenden Ribonukleotidregionen eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids jeweils wenigstens 4 zusammenhängende, 2-O-substituüerte Ribonukleotide.
Erfindungsgemäß bedeutet der Begriff "2-O-substituiert" eine Substitution der 2'-Position des Pentoserests durch eine -O--Niederalkylgruppe mit 1-6 gesättigten oder ungesättigten Kohlenstoffatomen oder durch eine -O--Aryl- oder -Allylgruppe mit 2-6 Kohlenstoffatomen, wobei derartige Alkyl-, Aryl- oder Allylgruppen nicht-substituiert oder z. B. durch Halogen-, Hydroxy-, Trifluormethyl-, Cyano-, Nitro-, Acyl-, Acyloxy-, Alkoxy-, Carboxyl-, Carbalkoxyl- oder Aminogruppen substituiert sein können, oder durch eine Hydroxy-, Amino- oder eine Halogengruppe, jedoch nicht durch eine 2'-H-Gruppe.
In manchen Ausführungsformen umfassen die 3'- und 5'-flankierenden Ribonukleotidregionen eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids jeweils wenigstens ein 2'-O-Alkyl-substituiertes Ribonukleotid. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das 2-O-Alkyl-substituierte Nukleotid ein 2'-O-Methyl-Ribonukleotid. In anderen bevorzugten Ausführungsformen umfassen die 3'- und 5'-flankierenden Ribonukleotidregionen eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids wenigstens vier 2-O-Methyl-Ribonukleotide. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Ribonukleotide und Desoxyribonukleotide des Hybrid-Oligonukleotids durch Phosphorothioat-Internukleotidbindungen verknüpft. In spezifischen Ausführungsformen weist (weisen) diese Phosphorothioatregion oder -regionen etwa 4 bis etwa 18 Nukleoside auf, die jeweils miteinander durch 5' an 3'-Phosphorothioatbindungen miteinander verbunden sind und vorzugsweise etwa 5 bis etwa 18 solche Phosphorothioat-verknüpfte Nukleoside. Die Phosphorothioatbindungen können gemischte RP- und SP-Enantiomere sein oder sie können stereoregulär oder im wesentlichen stereoregulär in entweder der RP- oder der SP- Form vorliegen (vgl. Iyer et al. (1995), Tetrahedron Asymmetry 6: 1051-1054).
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt ist ein Verfahren zur Hemmung der Vermehrung von Krebszellen in vitro. Bei diesem Verfahren wird ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid an die Zellen verabreicht.
Ein weiterer Aspekt ist eine therapeutische Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid in einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Ein Verfahren zur Behandlung von Krebs in einem erkrankten Lebewesen mit weniger Nebenwirkungen ist ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt. Dieses Verfahren umfasst die Verabreichung einer erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzung an das Lebewesen, in dem das Gen für die Proteinkinase A-Untereinheit RIα überexprimiert wird.
Der Fachmann wird erkennen, dass die Elemente dieser bevorzugten Ausführungsformen miteinander kombiniert werden können und dass der Erfinder eine derartige Kombination vorsieht. Zum Beispiel können 2'-O-substituierte Ribonukleotidregionen durchaus eine bis ausschließlich nur nicht-ionische Internukleosidbindungen umfassen. Alternativ können nicht-ionische Regionen eine bis ausschließlich nur 2'-O-substituierte Ribonukleotide aufweisen. Außerdem können erfindungsgemäße Oligonukleotide Kombinationen einer oder mehrerer 2'-O-sibstituierter Ribonukleotidregionen oder einer oder mehrerer nicht-ionischer Regionen enthalten, wobei eine von beiden oder beide von Phosphorothioatregionen flankiert werden (vgl. Nucleosides & Nucleotides 14: 1031-1035 (1995) für relevante Syntheseverfahren).

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die vorstehenden und weitere erfindungsgemäße Gegenstände, die verschiedenen Merkmale davon sowie die Erfindung selbst können aufgrund der nachstehenden Beschreibung in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen besser verstanden werden, in denen:
Fig. 1 eine graphische Darstellung ist, die die Wirkung erfindungsgemäßer modifizierter Oligonukleolide auf die Tumorgröße in einer Maus im Vergleich zu verschiedenen Kontrollen zeigt.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM

Die hier zitierten Patente und wissenschaftliche Literatur stellen den Stand der Technik dar.
Synthetische Oligonukleotide der vorstehend beschriebenen Hybrid-Oligonukleotide.
Erfindungsgemäß werden solche synthetischen Hybrid-Oligonukleotide bereitgestellt, die eine Nukleotidsequenz aufweisen, die zu einer genomischen Region oder einem davon transkribierten RNA-Molekül komplementär ist, die/das für die RIα-Untereinheit der Proteinkinase A (PKA) kocüert. Diese Oligonukleotide sind etwa 15 bis etwa 30 Nukleotide lang, vorzugsweise etwa 15 bis 25 Nukleotide lang, am besten etwa 18 Nukleotide lang. Die Sequenz dieses Gens ist bekannt. Somit kann ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid irgendeine Nukleotidsequenz aufweisen, die zu irgendeiner Region des Gens komplementär ist. Ein nicht begrenzendes Beispiel eines erfindungsgemäßen 18mers weist die in der nachstehenden Tabelle 1 als SEQ ID NO: 4 aufgeführte Sequenz auf. Tabelle 1
= Mismatch-Base
* Ribonukleotid
Methylphosphonat-Nukleotid
Oligonukleatide mit mehr als 18 Nukleotiden sind auch erfindungsgemäß vorgesehen. Diese Oligonukleatide besitzen bis zu 25 weitere Nukleotide, die sich, ausgehend vom 3'- oder 5'- Terminus oder vorn 3'- und 5'-Terminus, beispielsweise des 18mers der SEQ ID NO: 4 erstrecken, ohne die Fähigkeit dieser Oligonukleotide, die Genexpression von RIα abzusenken, zu beeinträchtigen.
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können in an sich bekannter Weise hergestellt werden. Oligonukleotide mit Phosphorothioatbindungen können manuell oder durch automatische Synthese hergestellt werden und können sodann unter Einsatz bekannter Verfahren wie Phosphoramidit- (zusammengefasst in Agrawal et al. (1992), Trends Biotechnol. 10: 152- 158, vgl. z. B. Agrawal et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 7079-7083) oder H- Phosphonat- (vgl. z. B. Froehler (1986), Tetrahedron Lett. 27: 5575-5578) Chemie weiter behandelt werden. Die in Bergot et al. (1992), J Chromatog. 559: 35-42, beschriebenen Syntheseverfahren können ebenfalls verwendet werden. Beispiele anderer chemischer Gruppen umfassen Alkylphosphonate, Phosphorodithioate, Alkylphosphonothioate, Phosphoramidate, 2.'-O-Methylreste, Carbamate, Acetamidate, Carboxymethylester, Carbonate und Phosphattriester. Oligonukleotide mit diesen Bindungen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden (vgl. z. B. Goodchild (1990), Bioconjugate Chem, 2: 165- 187; Agrawal et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 7079-7083; Uhlmann et al. (1990), Chem. Rev. 90: 534-583; und Agrawal et al. (1992), Trends Biotechnol. 10: 152-158).
Bevorzugte erfindungsgemäße Hybrid-Oligonukleotide können andere Modifikationen aufweisen, die nicht wesentlich ihre Fähigkeit, die Genexpression von RIα spezifisch abzusenken, beeinträchtigen. Diese Modifikationen umfassen diejenigen, die intern oder an dem (den) Ende(n) des Oligonukleotidmoleküls vorliegen und umfassen Anfügungen an das Molekül an den Internukleosid-Phosphatbindungen wie Cholesterin- oder Diaminverbindungen mit einer verschiedenen Anzahl an Kohlenstoffresten zwischen den zwei Aminogruppen und Modifikationen an der terminalen Ribose, Desoxyribose oder am Phosphat, die gegenüberliegende Ketten oder assoziierte Enzyme oder andere Proteine, die an die RIα-Nukleinsäure binden, abspalten oder vernetzen. Beispiele solcher Oligonukleotide umfassen diejenigen mit einer modifizierten Base und/oder einem modifizierten Zucker wie Arabinose anstelle von Ribose oder ein 3', 5'-substituiertes Oligonukleotid mit einem Zucker, der an seiner 3'- oder 5'-Position oder an beiden Positionen mit einer chemischen Gruppe verbunden ist, die keine Hydroxyl- oder Phosphatgruppe (an seiner 3'- oder 5'-Position) ist. Andere modifizierte Oligonukleotide tragen eine Kappe mit einem raumgreifenden Substituenten, der Resistenz gegenüber einer Nuklease verleiht, an ihren 3'- und/oder 5-Ende(n) oder weisen eine Substitution in einem oder beiden Nicht-Brücken-Sauerstoffatomen pro Nukleotid auf. Solche Modifikationen können an manchen oder an allen Internukleosidbindungen sowie an einem oder beiden Enden des Oligonukleotids und/oder im Inneren des Moleküls vorliegen (Übersicht in Agrawal et al. (1992), Trends Biotechnol. 10: 152-158).
Erfindungsgemäß werden auch therapeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, die für die Behandlung einer unerwünschten, unkontrollierten Zellvermehrung oder von Krebs geeignet sind und wenigstens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid, das spezifisch die Expression des RIα-Gens absenken kann, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfassen. Vorzugsweise ist ein in der erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzung verwendetes Oligonukleotid zu wenigstens einem Teil der genomischen Region oder des Gens von RIα oder einem RNA-Transkript davon komplementär.
"Pharmazeutisch oder physiologisch verträglicher Träger" umfasst hier irgendein und alle Lösungsmittel (einschließlich in nicht begrenzender Weise Laktose), Dispersionsmedien, Beschichtungsmittel, antibakterielle und fungizide Wirkstoffe, isotonische und resorptionsverzögernde Stoffe und ähnliches. Die Verwendung derartiger Medien und Stoffe für pharmazeutisch wirksame Substanzen ist bekannt. Bis auf die Ausnahme, dass irgendein herkömmliches Medium oder Stoff mit dem aktiven Bestandteil inkompatibel ist, ist er für eine Verwendung in den erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen vorgesehen. Zusätzliche aktive Bestandteile können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingebaut werden.
Mehrere bevorzugte erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzungen, die für die Hemmung der Zellvermehrung in vitro oder in vivo oder für die Behandlung von Krebs beim Menschen durch die erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, umfassen etwa 25-75 mg eines lyophilisierten Oligonukleotids mit der in SEQ ID NO: 4 gezeigten Sequenz und 20-75 mg Laktose, USP, das mit steriler normaler Salzlösung in den hier beschriebenen therapeutisch wirksamen Dosen gelöst wird.
Erfindungsgemäß werden auch Verfahren zur Behandlung von Menschen bereitgestellt, die an Krankheiten oder Erkrankungen leiden, bei denen das RIα-Gen nicht richtig exprimiert oder überexprimiert wird. Eine solche Krankheit oder Erkrankung, die mit diesem Verfahren behandelt werden könnte, umfasst tumorbildende Krebstypen wie in nicht begrenzender Weise menschliches Kolonkarzinom, Brustkarzinom, Magenkarzinom und Neuroblastom. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine therapeutisch wirksame Menge einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung an den Menschen verabreicht. Solche erfindungsgemäßen Behandlungsverfahren können in Verbindung mit anderen therapeutischen Wirkstoffen erfolgen.
Der Begriff "therapeutisch wirksame Menge" bedeutet hier die Gesamtmenge eines jeden aktiven Bestandteils der pharmazeutischen Formulierung oder des Verfahrens, die ausreicht, um eine deutliche Verbesserung bei dem Lebewesen oder Patienten zu bewirken, d. h. eine Verminderung des Tumorwachstums oder der Expression von Proteinen, die den Krebs hervorrufen oder ihn auszeichnen. Im Zusammenhang mit einem einzelnen aktiven Bestandteil, der alleine verabreicht wird, betrifft der Begriff diesen Bestandteil alleine. In Bezug auf eine Kombination betrifft der Begriff die vereinigten Mengen der aktiven Bestandteile, die zu der therapeutischen Wirkung führen, egal, ob in einer Kombination, seriell oder gleichzeitig verabreicht.
Eine "therapeutisch wirksame Weise" betrifft den Weg, die Dauer und die Häufigkeit einer Verabreichung der pharmazeutischen Formulierung, was letztendlich zu einer deutlichen Besserung, wie vorstehend beschrieben, bei den Patienten führt. In manchen erfindungsgemäßen Ausführungsformen wird die pharmazeutische Formulierung durch eine Injektion, sublingual, rektal, intradermal, oral oder enteral durch einen Bolus, kontinuierlich, intermittierend oder kontinuierlich, gefolgt von intermittierenden Verabreichungsschemen verabreicht.
Die therapeutisch wirksame Menge des synthetischen Oligonukleotids in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung wird von der Art und Schwere des behandelten Zustands und von der Art früherer Behandlungen, die sich der Patient unterzogen hat, abhängen. Letztendlich wird der behandelnde Arzt die Menge des synthetischen Oligonukleotids bestimmen, mit dem jeder einzelne Patient behandelt wird. Anfänglich wird der behandelnde Arzt niedrige Dosen des synthetischen Oligonukleotids verabreichen und die Reaktion des Patienten überwachen. Größere Dosen des synthetischen Oligonukleotids können verabreicht werden, bis die optimale therapeutische Wirkung für den Patienten erreicht ist und an diesem Punkt wird die Dosis nicht weiter erhöht. Es ist vorgesehen, dass die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verabreichten Dosen der pharmazeutischen Zusammensetzungen etwa 0,1 bis 5,0 mg/kg Körpergewicht pro Tag und vorzugsweise 0,1 bis 2,0 mg/kg Körpergewicht pro Tag enthalten sollten. Bei einer systemischen Verabreichung wird die therapeutische Zusammensetzung vorzugsweise in einer ausreichenden Dosis verabreicht, um eine Blutmenge des Oligonukleotids von etwa 0,01 uM bis etwa 10 uM zu erreichen. Vorzugsweise sollte die Oligonukleotidkonzentration an der Stelle der falschen Genexpression etwa 0,01 uM bis etwa 10 uM, am besten etwa 0,05 uM bis etwa 5 uM betragen. Jedoch können für eine lokale Verabreichung viel niedrigere Konzentrationen wirksam sein und viel höhere Konzentrationen können toleriert werden. Die gleichzeitige oder sequenzielle Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer oder mehrerer der erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen kann erwünscht sein, falls für ein einzelnes Behandlungsereignis bestimmt.
Die Verabreichung erfindungsgemäßer pharmazeutischer Zusammensetzungen oder die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann in einer Reihe von herkömmlichen Wegen erfolgen, wie durch orale Aufnahme, enterale, rektale oder transdermale Verabreichung, Inhalation, sublinguale Verabreichung oder kutane, subkutane, intramuskuläre, intraokulare, intraperitoneale oder intravenöse Injektion oder durch irgendeinen anderen Verabreichungsweg, der für die Verabreichung therapeutischer Wirkstoffe bekannt ist.
Falls die Zusammensetzung oral, sublingual oder auf irgendeinem anderen Weg ohne eine Injektion verabreicht werden soll, umfasst die therapeutische Formulierung vorzugsweise einen physiologisch verträglichen Träger wie ein inertes Verdünnungsmittel oder einen assimilierbaren essbaren Träger, womit die Zusammensetzung verabreicht wird. Geeignete, pharmazeutisch verträgliche Exzipienzien umfassende Formulierungen für eine Verabreichung von Verbindungen an den Blutkreislauf auf einem Nicht-Injektions-Weg finden sich in Remington's Pharmaceutical Sciences (18. Auflage) (Genarro, Hrsg. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA). Das Oligonukleotid und andere Bestandteile können in einer Hart- oder Weichgelatinekapsel eingeschlossen werden, zu Tabletten gepresst werden oder direkt in die Nahrund des Lebewesens eingebaut werden. Die therapeutischen Zusammensetzungen können zusammen mit Exzipienzien eingebaut werden und in Form von ingestierbaren Tabletten, Lutschtabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirupen, Oblaten und ähnlichem verwendet werden. Bei einer oralen Verabreichung kann die therapeutische Zusammensetzung mit anderen Nahrungsmittelformen und pharmazeutisch verträglichen Geschmacksverstärkern gemischt werden. Bei einer enteralen Verabreichung kann die therapeutische Zusammensetzung in eine feste, halbfeste, Suspensions- oder Emulsionsform eingebrachl werden und mit irgendwelchen bekannten, pharmazeutisch verträglichen Zusatzstoffen vermischt werden. Orale Verabreichungssysteme mit einer verzögerten Freisetzung und/oder enterische Beschichtungen für oral verabreichte Dosierungsformen sind ebenfalls vorgesehen wie diejenigen, die in den US-PSen 4,704,295, 4,556,552, 4,309,404 und 4,309,406 beschrieben sind.
Falls eine therapeutisch wirksame Menge einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung durch Injektion verabreicht wird, wird das synthetische Oligonukleotid vorzugsweise in Form einer pyrogenfreien, parenteral verträglichen wässrigen Lösung vorliegen. Die Herstellung solcher parenteral verträglicher Lösungen unter Berücksichtigung des pH-Werts, der Isotonizität, Stabilität und ähnlichem ist dem Fachmann bekannt. Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung für eine Injektion sollte zusätzlich zu dem synthetischen Oligonukleotid einen isotonischen Träger wie Natriumchlorid-Injektionslösung, Ringer-Lösung, Traubenzucker-Injektionslösung, Traubenzucker- und Natriumchlorid-Injektionslösung, Ringer-Laktatlösung oder andere bekannte Träger enthalten. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auch Stabilisatoren, Konservierungsstoffe, Puffer, Antioxidanzien oder andere bekannte Zusätze enthalten.
Die für eine Injektion geeigneten pharmazeutischen Formen umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die extemporierte Herstellung steriler injizierbarer Lösungen oder Dispersionen. In allen Fällen muss die Form steril sein. Sie muss unter den Herstellungs- und Lagerbedingungen stabil sein und kann gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen geschützt sein. Der Träger kann ein Lösungs- oder Dispersionsmedium sein. Die Vermeidung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und fungizide Wirkstoffe erreicht werden. Eine Aufnahme des injizierbaren therapeutischen Wirkstoffs über einen verlängerten Zeitraum kam durch die Verwendung von Zusammensetzungen mit Stoffen erreicht werden, die eine Aufnahme verzögern. Sterile injizierbare Lösungen werden durch Einbau des Oligonukleotids in der erforderlichen Menge in das geeignete Lösungsmittel, gefolgt von einer Filtersterilisation hergestellt.
Die pharmazeutische Formulierung kann in einem Bolus, kontinuierlich oder intermittierend oder in einer Kombination aus kontinuierlichen und intermittierenden Dosen verabreicht werden, wie festgelegt durch den behandelnden Arzt und den Grad und/oder das Stadium der Krankheit. Die Therapiedauer bei einer Verwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung wird unterschiedlich sein und von den jeweiligen Eigenschaften des Oligonukleotids und der spezifischen zu erreichenden therapeutischen Wirkungen, den Begrenzungen, die bei der Herstellung einer solchen therapeutischen Formulierung für die Behandlung von Menschen inhärent sind, dem Schwierigkeitsgrad der zu behandelnden Krankheit und dem Zustand und der möglichen ideosynkratischen Reaktion jedes einzelnen Patienten abhängen. Letztendlich wird der behandelnde Arzt über die geeignete Dauer einer intravenösen Therapie unter Einsatz der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung entscheiden.
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen sind für die Hemmung oder Verminderung der Vermehrung von Krebs- oder Tumorzellen in vitro verwendbar. Ein erfindungsgemäßes synthetisches Oligonukleotid wird an die Zellen in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um die Bindung des Oligonukleotids an eine komplementäre genomische Region oder an ein davon transkribiertes RNA-Molekül zu ermöglichen, die/das für die RIα-Untereinheit kodiert. Auf diesem Weg wird die Expression von PKA gesenkt, wodurch die Zellvermehrung gehemmt oder vermindert wird.
Erfindungsgemäße Zusammensetzungen sind auch für die Behandlung von Krebs oder unkontrollierter Zellvermehrung in Menschen verwendbar. Bei diesem Verfahren wird eine therapeutische Formulierung, die ein erfindungsgemäßes Antisense-Oligonukleotid umfasst, in einem physiologisch verträglichen Träger bereitgestellt. Das Lebewesen wird sodann mit der therapeutischen Formulierung in einer Menge behandelt, die ausreicht, um die Bindung des Oligonukleotids an die genomische Region von PKA RIα oder ein davon transkribiertes RNA-Molekül in den infizierten Zellen zu ermöglichen. Auf diesem Weg hemmt oder senkt die Bindung des Oligonukleotids die Expression von RIα und somit die Aktivität von PKA.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Behandlungsverfahrens oder der Verwendung wird eine therapeutisch wirksame Menge wenigstens eines oder mehrerer erfindungsgemäßer therapeutischer Zusammensetzungen an ein Lebewesen verabreicht, das an Krebs erkrankt ist. Eine Krebs-Gegenreaktion, die sich durch eine Verringerung des Tumorwachstums oder der Tumorgröße oder eine Verringerung der RIα Expression auszeichnet, wird als positives Indiz für die Fähigkeit des Verfahrens und der pharmazeutischen Formulierung gewertet, Zellwachstum zu hemmen oder zu verringern und somit Krebs bei Menschen zu behandeln.
Wenigstens eine erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung kann entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren entweder alleine oder in Kombination mit anderen bekannten Krebstherapien verabreicht werden. Bei einer gemeinsamen Verabreichung mit einem oder mehreren anderen Therapien können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen entweder zugleich mit der (den) anderen Behandlung(en) oder in einer Sequenz verabreicht werden. Bei einer Verabreichung in einer Sequenz wird der behandelnde Arzt über die geeignete Sequenz einer Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in Kombination mit der anderen Therapie entscheiden.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die bevorzugten Ausführungsformen und sind nicht begrenzend zu verstehen, da alternative Verfahren eingesetzt werden können, um ähnliche Ergebnisse zu erhalten.

BEISPIEL 1

Synthese, Entschützung und Reinigung von Oligonukleotiden

Oligonukleotid-Phosphorothioate wurden mit Hilfe eines automatischen DNA-Synthesegeräts (Modell 8700, Biosearch, Bedford, MA) unter Einsatz eines beta-Cyanoethylphosphoramidat- Verfahrens in einem 10 uM-Maßstab synthetisiert. Für die Herstellung der Phosphorothioatbindungen wurde die intermediäre Phosphitbindung, die nach jeder Kopplung erhalten wurde, mit Hilfe von 3H-1,2-Benzodithiol-3H-on-1,1-dioxid oxidiert (vgl. Beaucage, in Protocols for Oligonucleoiides and Analogs: Synthesis and Properties, Agrawai (Hrsg.) (1993), Humana Press, Totowa, NJ, Seiten 33-62). Eine ähnliche Synthese erfolgte für die Herstellung von Phosphodiesterbindungen mit der Ausnahme, dass eine Standard-Oxidierung unter Einsatz von Standard-10d-Reagenz erfolgte. Die Synthese invertierter chimärer Oligonukleotide erfolgte in der gleichen Weise, mit der Ausnahme, dass Methylphosphonatbindungen unter Verwendung von Nukleosid-Methylphosphonamiditen (Glen Research, Sterling, VA) hergestellt wurden, gefolgt von einer Oxidation mit 0,1 M Iod in Tetrahydrofuran/2,6-Lutidin/Wasser (75 : 25 : 0,25) (vgl. Agrawal & Goodchild (1987), Tet. Lett. 28: 3539-3542). Hybrid- und invertierte Hybrid-Oligonukleotide wurden in ähnlicher Weise synthetisiert, mit der Ausnahme, dass das 2'-O-Methylribonukleotide enthaltende Segment mit Hilfe von 2-O-Methylribonukleosid-Phosphoramiditen zusammengebaut wurde, gefolgt von einer Oxidation zu einer Phospiorothioat- oder Phosphodiesterbindung, wie vorstehend beschrieben. Eine Entschützung und Reinigung der Oligonukleotide erfolgte in herkömmlicher Weise (vgl. Padmapriya et al. (1994), Antisense Res. & Dev. 4: 185-199), mit der Ausnahme von Olinukleotiden, die Methylphosphonat enthaltende Regionen aufwiesen. Bei diesen Oligonukleotiden wurde das CPG-gebundene Oligonukleotid mit konzentriertem Ammoniumhydroxid 1 Stunde bei Raumtemperatur behandelt und der Überstand entfernt und zu einem blassgelben Rest eingedampft, der sodann mit einem Gemisch aus Ethylendiamin/Ethanol (1 : 1 v/v) 6 Stunden bei Raumtemperatur behandelt wurde und erneut unter vermindertem Druck getrocknet wurde.

BEISPIEL 2

Untersuchungen der in vitro-Komplementaktivierung

Für die Bestimmung der relativen Wirkung einer invertierten hybriden oder invertierten chimären Struktur auf den Oligonukleotid-vermittelten Verlust von Komplement wurden die nachstehenden Experimente durchgeführt. Gesunden, erwachsenen, freiwilligen Personen wurde venöses Blut entnommen. Serum wurde für einen Hämolyse-Komplement-Test durch Sammeln von Blut in Vacutainer (Becton Dickinson #6430 Franklin Lakes, NJ) ohne käuflich verfügbare Zusätze hergestellt. Man ließ das Blut bei Raumtemperatur 30 Minuten gerinnen. Es wurde 15 Minuten auf Eis abgekühlt und sodann bei 4ºC zentrifugiert, um das Serum abzutrennen. Das geerntete Serum wurde für einen Test am gleichen Tag auf Eis gehalten oder alternativ bei -70ºC gelagert. Puffer oder eine Oligonukleotid-Probe wurde sodann mit dem Serum inkubiert. Die getesteten Oligonukleotide waren 25mer Oligonukleotid-Phosphodiester oder -Phosphorothioate, 25mer Hybrid-Oligonukleotide, 25mer invertierte Hybrid-Oligonukleotide, 2Smer chimäre Oligonukleotide und 25mer invertierte chimäre Oligonukleotide. Repräsentative Hybrid-Oligonukleotide bestanden aus 7 bis 13 2'-O-Methylribonukleotiden, die von zwei Regionen aus 6 bis 9 Desoxyribonukleotiden jeweils flankiert wurden. Repräsentative 25mer invertierte Hybrid-Oligonukleotide bestanden aus 17 Desoxyribonukleotiden, die von zwei Regionen aus jeweils 4 Ribonukleotiden flankiert wurden. Repräsentative 25mer chimäre Oligonukleotide bestanden aus 6 Methylphosphonat-Desoxyribonukleotiden und 19. Phosphorothioat-Desoxyribonukleotiden. Repräsentative invertierte chimäre Oligonukleotide bestanden aus 16 bis 17 Phosphorothioat-Desoxyribonukleotiden, flankiert von Regionen aus 2 bis 7 Methylphosphonat-Desoxyribonukleotiden oder aus 6 bis 8 Methylphosphonat-Desoxyribonukleotiden, flankiert von 9 bis 10 Phosphorothioat-Desoxyribonukleotiden oder 2 Phosphorothioat-Regionen mit 2 bis 12 Nukleotiden, flankiert von 3 Phosphorothioat-Regionen mit einer Größe von 2 bis 6 Nukleotiden. Ein Standard-CH50- Test (vgl. Kabat und Mayer (Hrsg.), Experimental Immunochemistry, 2. Auflage, Springfield, IL, CC Thomas, Seite 125) für eine Komplement-vermittelte Lyse von roten Blutkörperchen aus Schaf (Colorado Serum Co.) erfolgte bei einer Sensibilisierung mit einem Antikörper gegen rote Blutkörperchen aus Schaf (Hämolysin, Diamedix, Miami, FL), wobei eine zweifache Bestimmung von wenigstens fünf Verdünnungen jedes Testserums erfolgte und sodann die Hämoglobinfreisetzung in die zellfreien Überstände spektrophotometrisch bei 541 nm gemessen wurde.

BEISPIEL 3

In vitro-Mitogenizitätsuntersuchungen unter Verwendung von Milz aus Maus

Für die Bestimmung der relativen Wirkung einer invertierten hybriden oder invertierten chimären Struktur auf die Oligonukleotid-vermittelte Mitogenizität wurden die nachstehenden Experimente durchgeführt. Einer männlichen CD1-Maus (4-5 Wochen, 20-22 g; Charles River, Wilmington, MA) wurde die Milz entnommen. Einzelzellsuspensionen wurden durch vorsichtiges Zerschneiden mit den überfrorenen Kanten von Glasobjektträgern hergestellt. Die Zellen wurden sodann in RPMI-Vollmedien (RPMI-Medien, supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 50 uM 2-Mercaptoethanol (2-ME), 100 E/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin) kultiviert. Für eine Minimierung des Oligonukleotid- Abbaus wurde FBS zuerst für 30 Minuten auf 65ºC (Phosphodiester-enthaltende Oligonukleotide) oder 56ºC (alle anderen Oligonukleotide) erhitzt. Die Zellen wurden in 96 Loch- Kulturschalen bei 100 000 Zellen pro Loch (Volumen von 100 ul/Loch) gegeben. Ein Typ aller in dem vorstehenden Beispiel 2 beschriebener Oligonukleotide wurde in 10 ul TE-Puffer (10 mM TriE-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) zu jedem Loch hinzugegeben. Nach 44-stündiger Kultivierung bei 37ºC wurde 1 uCi tritiertes Thymidin (Amersham, Arlington Heights, IL) in 20 ul RPMI-Medium für eine 4-stündige Markierung hinzugegeben. Die Zellen wurden sodann in einem automatischen Zellernter (Skatron, Sterling, VA) geerntet und die Filter mit einem Scintillationszähler ausgezählt. In Kontrollexperimenten für eine Mitogenizität wurden die Zellen in identischer Weise behandelt, mit der Ausnahme, dass anstelle der Oligonukleotide entweder Medien (Negativkontrolle) oder Concanavalin A (Positivkontrolle) zu den Zellen hinzugegeben wurden.
Alle invertierten Hybrid-Oligonukleotide erwiesen sich als weniger immunogen als Phosphorothioat-Oligonukleotide. Invertierte Hybrid-Oligonukleotide mit Phosphodiesterbindungen in der 2'-O-Methy(-Region schienen etwas weniger immunogen zu sein als diejenigen mit Phosphorothioatbindungen in dieser Region. Kein signifikanter Unterschied in der Mitogenizität wurde beobachtet, falls die 2'-O-Methyl-Ribonukleotid-Region von 13 auf 11 oder 9 Nukleotide verkürzt wurde. Invertierte chimäre Oligonukleotide waren auch im allgemeinen weniger mitogen als Phosphorothioat-Oligonukleotide. Zusätzlich schienen diese Oligonukleotide weniger mitogen zu sein als herkömmliche chimäre Oligonukleotide, zumindest in den Fällen, bei denen die herkömmlichen chimären Oligonukleotide eine signifikante Anzahl von Methylphosphonatbindungen in der Nähe des 3'-Endes aufwiesen. Eine Erhöhung der Anzahl an Methylphosphonatbindungen in der Mitte des Oligonukleotids von 5 auf 6 oder 7 schien keine signifikante Wirkung auf die Mitogenizität zu haben. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Einbau einer invertierten hybriden oder invertierten chimären Struktur in ein Oligonukleotid seine Mitogenizität senken kann.

BEISPIEL 4

In vitro-Mitogenizitätsuntersuchungen unter Verwendung von menschlichem Blut

Für die Bestimmung der relativen Wirkung einer invertierten hybriden oder invertierten chimären Struktur auf die Oligonukleotid-induzierte Mitogenizität wurden die nachstehenden Experimente durchgeführt. Gesunden, erwachsenen, freiwilligen Personen wurde venöses Blut entnommen. Plasma für einen Test der Gerinnungszeit wurde durch Zugabe von Blut zu silikonisierten Vacutainern mit Natriumcitrat (Becton Dickinson #367705) hergestellt, gefolgt von zwei Zentrifugationsschritten bei 4ºC für die Herstellung von blutplättchenarmem Plasma. Plasma-Proben wurden auf Eis gehalten, mit verschiedenen vorstehend in Beispiel 2 beschriebenen Test-Oligonukleotiden versehen und entweder sofort getestet oder schnell auf Trockeneis für eine darauffolgende Lagerung bei -20ºC vor dem Gerinnungstest eingefroren. Die aktivierte partielle Thromboplastin-Zeit (aPTT) erfolgte zweifach auf einem Electra 1000C (Medical Laboratory Automation, Mount Vernon, NY) gemäß den Herstelleranleitungen, wobei Actin FSL (Baxter Dade, Miami, FL) und Calcium für eine Initiierung der Gerinnselbildung verwendet wurden, die photometrisch gemessen wurde. Eine Verzögerung der aPTT war ein Anzeichen für eine durch das Oligonukleotid hervorgerufene Gerinnungshemmungsnebenwirkung.
Herkömmliche Phosphorothioat-Oligonukleotide erzeugten die stärkste Verzögerung der aPTT aller getesteten Oligonukleotide. Herkömmliche Hybrid-Oligonukleotide erzeugten eine etwas geringere Verzögerung der aPTT. Im Vergleich mit herkömmlichen Phosphorothioat- oder herkömmlichen Hybrid-Oligonukleotiden erzeugten alle getesteten invertierten Hybrid- Oligonukleotide eine signifikant geringere Verzögerung der aPTT. Invertierte Hybrid-Oligonukleotide mit Phosphodiesterbindungen in der 2'-O-substituierten Ribonukleotid-Region wiesen die stärkste Verringerung in Bezug auf diese Nebenwirkung auf, wobei ein solches Oligonukleotid mit einer 2'-O-Methyl-RNA-Phosphodiester-Region aus 13 Nukleotiden eine sehr geringe Verzögerung der aPTT selbst bei Oligonukleotid-Konzentrationen von 100 ug/ml aufwies. Herkömmliche chimäre Oligonukleotide erzeugen eine viel geringere Verzögerung der aPTT als herkömmliche Phosphorothioat-Oligonukleotide. Im allgemeinen besitzen auch invertierte chimäre Oligonukleotide dieses Charakteristikum. Wenigstens ein invertiertes chimäres Oligonukleotid mit einer Methylphosphonat-Region aus 7 Nukleotiden, die von Phosphorothioat-Regionen aus 9 Nukleotiden flankiert wurde, ergab bessere Ergebnisse in diesem Test als die herkömmlichen chimären Oligonukleotide bei allen außer den höchsten getesteten Oligonukleotid-Konzentrationen. Diese Ergebnisse zeigen, dass invertierte Hybrid- und invertierte chimäre Oligonukleotide Vorteile bei einer Absenkung der Nebenwirkung einer Gerinnungshemmung bieten könnten, falls sie für eine Modulation der Genexpression in vivo verabreicht werden.

BEISPIEL 5

Untersuchungen der in vivo-Komplement-Aktivierung

Rhesusaffen (4-9 kg Körpergewicht) werden an die Laborbedingungen für wenigstens 7 Tage vor der Untersuchung angepasst. Am Tag der Untersuchung wird jedes Tier leicht mit Ketamin-HCl (10 mg/kg) und Diacepam (0,5 mg/kg) sediert. Es erfolgt eine Anästhesie mit operationstypischen Mengen, die durch einen kontinuierlichen Ketamin-Venentropf während des Verfahrens beibehalten wird. Die vorstehend in Beispiel 2 beschriebenen Oligonukleotide werden in normaler Salzlösung gelöst und intravenös über einen Kopfvenenkatheter durch eine Infusion verabreicht, wobei eine programmierbare Infusionspumpe bei einer Verabreichungsgeschwindigkeit von 0,42 mg/Minute eingesetzt wird. Im Fall jedes Oligonukleotids werden Dosen von 0, 0,5, 1, 2, 5, und 10 mg/kg an jeweils zwei Tiere durch eine 10- minütige Infusion verabreicht. Arterielle Blutproben werden 10 Minuten vor der Verabreichung des Oligonukleotids und 2, 5, 10, 20, 40 und 60 Minuten nach Beginn der Infusion sowie 24 Stunden später entnommen. Serum wird für die Bestimmung des Komplement- CH50 verwendet, wobei die herkömmliche komplementabhängige Lyse von Schaf-Erythrozyten eingesetzt wird (vgl. Kabat und Mayer, 1961, supra). Bei der höchsten Dosis erzeugt das Phosphorothioat-Oligonukleotid eine Verringerung des Serum-Komplement-CH50, die innerhalb der ersten 5 Minuten nach Beginn einer Infusion einsetzt. Man erwartet, dass invertierte Hybrid- und chimäre Oligonukleotide eine stark gesenkte oder nicht-nachweisbare Verringerung des Serum-Komplement-CH50 unter diesen Bedingungen aufweisen.

BEISPIEL 6

In vivo-Mitogenizitäts-Untersuchungen

CD1-Mäusen wird intraperitoneal eine Dosis von 50 mg/kg Körpergewicht eines vorstehend in Beispiel 2 beschriebenen Oligonukleotids injiziert. 48 Stunden später werden die Tiere getötet und die Milz entfernt und gewogen. Die Tiere, die mit invertierten Hybrid- oder invertierten Hybrid-Oligonukleotiden behandelt wurden, sollten erwartungsgemäß keine signifikante Erhöhung des Milzgewichts aufweisen, während die mit Oligonukleotid-Phosphorothioaten behandelten Tiere erwartungsgemäß eine moderate Erhöhung des Milzgewichts aufweisen sollten.

BEISPIEL 7

In vivo-Gerinnungs-Untersuchungen

Rhesusaffen werden wie in Beispiel 5 behandelt. Aus den entnommenen Blutproben wird Plasma für einen Gerinnungstest hergestellt und der Test wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. Man erwartet, dass eine Verzögerung der aPTT im Fall von invertierten Hybrid-Oligonukleotiden und invertierten chimären Oligonukleotiden im Vergleich zu herkömmlichen Oligonukleotid-Phosphorothioaten wesentlich geringer sein wird.

BEISPIEL 8

RNase H-Aktivitätsuntersuchungien

Für eine Bestimmung der Fähigkeit von invertierten Hybrid-Oligonukleotiden und invertierten chimären Oligonukleotiden, RNase H bei einer Bindung an ein komplementäres RNA-Molekül zu aktivieren, wurden die nachstehenden Experimente durchgeführt. Jeder Typ eines vorstehend in Beispiel 2 beschriebenen Oligonukleotids wurde zusammen mit einer molar entsprechenden Menge des komplementären Oligoribonukleotids (jeweils eine Konzentration von 0,266 uM) in einer Küvette mit einem Endvolumen von 1 ml RNase H-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 M KCl, 2% Glycerin, 0,1 mM DDT) inkubiert. Die Proben wurden auf 95ºC erhitzt und sodann allmählich auf Raumtemperatur abgekühlt, um eine Hybridisierung zu Duplexen zu ermöglichen. Hybridisierte Duplexe wurden 10 Minuten bei 37ºC inkubiert, sodann 5 Einheiten RNase H hinzugegeben und über einen Zeitraum von 3 Stunden Daten gesammelt. Daten wurden mit Hilfe eines Spektrophotometers (GBG 920, GBC Scientific Equipment, Victoria, Australia) bei 259 nm gesammelt. Spaltung durch RNase H wurde duch eine hyperchrome Verschiebung bestimmt.
Phosphodiester-Oligonukleotide waren sehr gute Co-Substrate für eine RNase H-vermittelte Spaltung von RNA, wobei die Halbwertszeit für die Spaltung 8, 8 Sekunden betrug. Phosphorothioat-Oligonuklecotide erzeugten eine erhöhte Halbwertszeit von 22,4 Sekunden. Das Einbringen eines 2'-O-Methylribonukleotid-Segments an einem Ende des Oligonukleotids verschlechterte weiter die RNase H-Aktivität (Halbwertszeit = 32,7 Sekunden). Im Gegensatz dazu führte das Einbringen eines 2'-O-Methyl-Segments in die Mitte des Oligonukleotids (invertierte Hybrid-Struktur) immer zu einer verbesserten RNase H-vermittelten Spaltung. Falls eine Region aus 13 2'-O-Methylribonukleosid-Phosphodiestern auf beiden Seiten durch Phosphorothioat-DNA flankiert wurde, wurde die beste RNase H-Aktivität mit einer Halbwertszeit von 7,9 Sekunden beobachtet. Das Einbringen großer Blöcke von Methylphosphonat-gekoppelten Nukleosiden am 3'-Ende des Oligonukleotids zeigte entweder keine Wirkung oder verursachte eine weitere Verschlechterung der RNase H-Aktivität selbst bei einer chimären Konfiguration. Das Einbringen von Methylphosphonat-verknüpften Nukleosiden am 5'-Ende verbesserte jedoch die RNase H-Aktivität, insbesondere in einer chimären Konfiguration mit einem einzelnen Methylphosphonat-Linker am 3'-Ende (beste Halbwertszeit = 8,1 Sekunden). Alle invertierten chimären Oligonukleotide mit Methylphosphonat-Kernregionen, die von Phasphorothioat-Regionen flankiert wurden, zeigten gute Ergebnisse mit RNase, wobei die Halbwertszeit 9,3 bis 14,4 Sekunden betrug. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Einbringen einer invertierten hybriden oder invertierten chimären Struktur in Phosphorothioat-enthaltende Oligonukleotide einen Teil oder die gesamte Fähigkeit des Oligonukleotids wiederherstellen kann, als Co-Substrat für RNase H zu wirken, eine möglicherweise wichtige Eigenschaft für einen wirksamen Antisense-Wirkstoff.

BEISPIEL 9

Untersuchungen der Schmelztemperatur

Für eine Bestimmung der Wirkung einer invertierten hybriden oder invertierten chimären Struktur auf die Stabilität des zwischen einem Antisense-Oligonukleotid und einem Zielmolekül gebildeten Duplex wurden die nachstehenden Experimente durchgeführt. Die Daten einer thermalen Aufschmelzung (Tm) wurden mit Hilfe eines Spektrophotometers (GBC 920, GBC Scientific Equipement, Victoria, Australia) gesammelt, bei dem sechs 10 mm-Küvetten in einem zweifachen Karussell befestigt sind. In den Tm-Experimenten wurde die Temperatur durch ein Peltier-Effekt-Temperatursteuergerät mit Hilfe eines Computers gesteuert und kontrolliert, wobei die von GBC gelieferte Software gemäß den Herstelleranleitungen verwendet wurde. Tm-Daten wurden mit Hilfe der Software sowohl durch das Verfahren einer ersten Ableitung als auch durch Mittelpunktverfahren analysiert. Die Tm-Experimente erfolgten in einem Puffer mit 10 mM PIPES, pH 7,0, 1 mM EDTA, 1 M NaCl. Ein gekühltes Wasserbad (VWR 1166, VWR, Boston, MA) wurde an das Peltier-Effekt-Temperatursteuergerät für eine Ableitung der Hitze angeschlossen. Die Konzentration eines Oligonukleotidstrangs wurde mit Hilfe der Absorption bei 260 nm bestimmt, wobei Extinktionskoeffizienten berücksichtigt wurden.

BEISPIEL 10

In vivo-Untersuchungen mit menschlichen Tumorzellen

LS-174T menschliche Kolonkarzinomzellen (1 · 10&sup6; Zellen, ATCC Nr. CL188, American Type Culture Collection, Rockville, MD) wurden subkutan (s.c.) in die linke Seite von athymischen weiblichen SCID-Mäusen eingesetzt. Eine einzelne Dosis von hybriden (Oligo 164, SEQ ID NO: 4), invertierten hybriden (Oligo 166, SEQ ID NO: 6) oder invertierten chimären (Oligo 190, SEQ ID NO: 1) Antisense-Oligonukleotiden gegen RIα oder eines Kontroll-Oligonükleotids (Oligo 169, SEQ ID NO: 7; Oligo 168, SEQ ID NO: 5; Oligo 188, SEQ ID NO: 3), wie gezeigt in Tabelle 1, (1 mg pro 0,1 ml Salzlösung pro Maus) oder Salzlösung (0,1 ml pro Maus) wurde s.c. in die rechte Seite von Mäusen injiziert, sobald die Tumorgröße 80 bis 100 mg nach etwa 1 Woche nach Beimpfen mit den Zellen erreicht hatte. Die Tumorvolumina wurden anhand einer täglichen Messung des größten und kleinsten Durchmessers und einer Berechnung gemäß der Formel 4/3 πr³, wobei r = (Länge + Breite)/4 bestimmt. Bei jedem angegebenen Zeitpunkt wurden zwei Tiere aus den Kontroll- und Antisense-behandelten Gruppen getötet und die Tumore entfernt und gewogen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt. Die Größe des Tumors in den mit dem invertierten Hybrid-Oligonukleotid 166 (SEQ ID NO: 6) behandelten Tier war überraschenderweise geringer ab dem dritten Tag nach der Injektion als bei dem mit dem Phosphorothioat-Oligonukleotid 164 (SEQ ID NO: 1) behandelten Tier. Dass diese Wirkung sequenzspezifisch war, wird auch in Fig. 1 gezeigt: das Kontroll-Oligonukleotid 168 (SEQ ID NO: 3) besitzt eine geringe Fähigkeit, die Tumorgröße bei einem Minimum im Vergleich zu den Hybrid- und invertierten Hybrid-Oligonukleotiden zu halten.
In einer weiteren Untersuchung wurde SCID-Mäusen mit LS-174T-menschlichen Tumoren mit einer Größe von 50 bis 150 mg oral Hybrid-Oligonukleotide verabreicht, die in physiologischer Salzlösung (0,9% NaCl) bei einer Konzentration von 25 mg/ml gelöst waren. Diese Oligonukleotide entsprachen den Sequenzen in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 9 und wiesen vier 2'-O-Methyl-substituierte Ribonukleotide an ihren 3'- und 5'-Termini auf. Das Oligonukleotid aus SEQ ID NO: 4 ist zu einem Teil der für Proteinkinase A kodierenden mRNA komplementär. Das Oligonukleotid aus SEQ ID NO: 9 ist eine Kontrolle mit einem Mismatch. Eine Salzlösung oder das eine oder das andere dieser Oligonukleotide wurden an jedes der nüchternen Tiere durch eine Sondenernährung bei 1 mg/kg, 10 mg/kg, 50 mg/kg oder 100 mg/kg Körpergewicht des Tiers verabreicht. Anderen Tieren wurden 10 mg/kg anti-PKA-Oligonukleotid aus SEQ ID NO: 4 durch eine intraperitoneale Injektion verabreicht. Die Dosen beruhten auf dem Körpergewicht der Vorbehandlung und wurden auf 0,01 ml genau abgerundet. Nach einer Verabreichung wurde jedes Tier in einen Metabolismus-Käfig gesetzt und mit käuflich erhältlichem Futter und Wasser ad libitum gefüttert.
Das Tumorwachstum wurde durch Messen der Tumorgröße mit Schiebelehren aufgezeichnet. Zwei senkrechte Durchmesser des Tumors wurden vor einer Behandlung und sodann einmal am Tag in einem Zeitraum von 7 Tagen nach der Behandlung gemessen. Das Tumorgewicht wurde wie folgt berechnet:
Tumorgewicht (mg) = 1/2 · A · B² · 1000,
wobei A der große Durchmesser (cm) und B der kleine Durchmesser (cm) ist.
Die Ergebnisse, berechnet als Prozentsatz im Hinblick auf einen Tumor einer mit einer Salzlösung behandelten Kontrolle, sind nachstehend in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2
Nicht nur das Tumorwachstum war bei jeder Dosis eines verabreichten Proteinkinase A-spezifischen Oligonukleotids beginnend 1 Tag nach der Behandlung gehemmt, sondern auch die Tumorgröße war geringer. Diese Ergebnisse zeigen die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens, menschliches Tumorwachstum bei Säugern zu hemmen.

BEISPIEL 11

Photoaffinitätsmarkierung und Immunopräzipitation von RIα-Untereinheiten

Die Tumore werden mit einem Teflon/Glas-Homogenisator in eisgekühltem Puffer 10 (Tris- HCl, pH 7,4 20 mM; NaCl, 100 mM; NP-40, 1%; Natriumdesoxycholat, 0,5%; MgCl&sub2;, 5 mM; Pepstatin, 0,1 mM; Antipain, 0,1 mM; Chymostatin, 0,1 mM; Leupeptin, 0,2 mM; Aprotinin, 0,4 mg/ml; und Sojabohnen-Trypsininhibitor, 0,5 mg/ml; filtriert durch eine Membran mit 0,45 um Porengröße) homogenisiert und 5 Minuten in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge bei 4ºC zentrifugiert. Die Überstände werden als Tumorextrakte verwendet.
Die Menge von PKA RIα-Untereinheiten in den Tumoren wird durch Photoaffinitätsmarkierung mit 8-N&sub3;-[³²P]rAMP, gefolgt von einer Immunopräzipitation mit RIα Antikörpern, wie beschrieben von Tortora et al. ((1990), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 705-708) bestimmt. Der photoaktivierte Einbau von 8-N&sub3;-[³²P]cAMP (60,0 Ci/mmol), die Immunopräzipitation unter Verwendung des anti-RIα- oder anti-RIIβ-Antiserums und von Protein A-Sepharose und die SDS-PAGE von solubilisierten Antigen-Antikörper-Komplexen erfolgt wie zuvor beschrieben (Tortora et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 705-708; Ekanger et al. (1985), J. Biol. Chem. 260: 3393-3401). Es wird erwartet, dass die Menge von RIα in den mit den erfindungsgemäßen hybriden, invertierten hybriden und invertierten chimären Oligonukleotiden behandelten Tumoren geringer sein wird als die Menge in Tumoren, die mit einer herkömmlichen Mismatch-Phosphorothioat- oder herkömmlichen Phosphodiester-Oligonukleotid-Kontrolle, Salzlösung oder anderen Kontrollen behandelt wurden.

BEISPIEL 12

cAMP-abhängige Proteinkinase-Tests

Extrakte (10 mg Protein) von Tumoren aus Antisense-, Kontroll-Antisense- oder mit einer Salzlösung behandelten Tieren werden auf DEAE-Cellulose-Säulen (1 · 10 cm) geladen und mit einem linearen Salzgradienten fraktioniert (Rohlffet al. (1993), J. Biol. Chem. 268: 5774- 5782). Die PKA-Aktivität wird ohne oder mit 5 uM cAMP wie nachstehend beschrieben bestimmt (Rohlffet al. (1993), J. Biol. Chem. 268: 5774-5782). Die cAMP-Bindeaktivität wird durch das zuvor beschriebene Verfahren gemessen und als spezifische Bindung wiedergegeben (Tagliaferri et al. (1988), J. Biol. Chem. 263: 409-416).
Nach zwei Waschschritten mit Dulbecco's phosphatgepufferter Salzlösung werden die Zellniederschläde (2 · 10&sup6; Zellen) in 0,5 ml 20 mM Tris (pH 7,5), 0,1 mM Natrium-EDTA, 1 mM Dithiothreit, 0,1 mM Pepstatin, 0,1 mM Antipain, 0,1 mM Chymostatin, 0,2 mM Leupeptin, 0,4 mg/ml Aprotinin und 0,5 mg/ml Sojabohnen-Trypsininhibitor bei 100 Schüben mit einem Dounce-Hornogenisator lysiert. Nach Zentrifugation (Eppendorf 5412) für 5 Minuten werden die Überstände auf 0,7 mg Protein/ml eingestellt und sofort getestet (Uhler et al. (1987), J. Biol. Chem. 262: 15202-15207). Die Tests (40 ul Gesamtvolumen) erfolgen für 10 Minuten bei 300ºC und enthielten 200 uM ATP, 2,7 · 10&sup6; cpm γ[³²P]ATP, 20 mM MgCl&sub2;, 100 uM Kemptid (Sigma K-1127) (Kemp et al. (1977), J. Biol. Chem. 252: 4888-4894), 40 mM Tris (pH 7,5), ± 100 uM Proteinkinase-Inhibitor (Sigma P-3294) (Cheng et al. (1985), Biochem. J. 231: 655-661), ± 8 uM cAMP und 7 ug Zellextrakt. Die Phosphorylierung von Kemptid wird durch punktförmiges Aufbringen von 20 ul fnkubationsgemisch auf Phosphocellulosefilter (Whatman, P81) und Waschen in Phosphorsäure wie beschrieben (Roskoski (1983), Methods Enzymol. 99: 3-6) bestimmt. Die Radioaktivität wird durch Flüssigscintillation unter Verwendung von Econofluor-2 (NEN Research Products NEF-969) gemessen. Man erwartet, dass die PKA- und cAMP-Bindungsaktivität in Extrakten aus mit erfindungsgemäßen hybriden, invertierten hybriden und invertierten chimären Oligonukleotiden behandelten Tumoren verringert sein wird.

ÄQUIVALENTE

Der Fachmann wird unzählige Äquivalente zu den hier beschriebenen spezifischen Substanzen und Verfahren erkennen oder er wird diese durch Routineexperimente bestimmen können. Solche Äquivalente liegen im Umfang der Erfindung und sind von den nachstehenden Ansprüchen abgedeckt.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Hybridon, Inc.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Proteinkinase A-spezifische modifizierte Oligonukleotide und Verfahren zu deren Verwendung
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 8
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADDRESSAT: Hale & Dorr
(B) STRASSE: 60 State Street
(C) STADT: Boston
(D) BUNDESLAND: MA
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 02109
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC Kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: PCT (noch zuzuteilen)
(B) ANMELDETAG: hiermit
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) DATEN DER VORANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: US 08/532,979
(B) ANMELDETAG: 22. September 1995
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) ANGABEN DES VERTRETERS:
(A) NAME: Kerner, Ann-Louise
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 33,523
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: HYZ-050PCT
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
(A) TELEFON: 617-526-6000
(B) TELEFAX: 617-526-5000
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
GCGTGCCTCC TCACTGGC 18
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
GCGCGCCTCC TGGCTGGC 18
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
GCATGCTTCC ACACAGGC 18
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA/RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
GCGUGCCTCC TCACUGGC 18
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(1) SEQUENGKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART.: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA/RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja
(xi) SEQUENTBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
GCGCGCCTCC TCGCUGGC 18
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA/RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
GCGTGCCUCC UCACTGGC 18
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ü) ART DES MOLEKÜLS: DNA/RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
GCGCGCCUCC UCGCTGGC 18
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA/RNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: ja
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
GCATGCAUCC UCACAGGC 18

Claims

1. Synthetisches, modifiziertes Oligonukleotid, das komplementär zu und fähig zur Absenkung der Expression einer Nukleinsäure ist, die für die Proteinkinase A-Untereinheit RIα kodiert, wobei das modifizierte Oligonukleotid etwa 18 bis etwa 30 Nukleotide besitzt und ein hybrides Oligonukleotid ist, das die in SEQ ID NO: 4 aufgeführte Nukleotidsequenz umfasst, uni das wenigstens zwei Desoxyribonukleotide umfasst, die von 3'- und 5'-flankierenden Ribenukleotid-Regionen flankiert werden, die jeweils wenigstens vier Ribonukleotide besitzen.

2. Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, das aus der in SEQ ID NO: 4 aufgeführten Nukleotidsequenz besteht.

3. Oligonukleolid gemäß Anspruch 1, wobei jede der flankierenden Ribonukleotid- Regionen wenigstens vier benachbarte 2'-O-substituierte Ribonukleotide umfasst.

4. Oligonukleotid gemäß Anspruch 1 oder 3, wobei jede der flankierenden Ribonukleotid-Regionen wenigstens ein 2'-O-Alkyl-Ribonukleotid umfasst.

5. Oligonukleotid gemäß Anspruch 4, wobei das 2'-O-Alkyl-Ribonukleotid ein 2'-O- Methyl-Ribonukleotid ist.

6. Oligonukleotid gemäß Anspruch 3, wobei jede der flankierenden Ribonukleotid- Regionen wenigstens vier 2-O-Methyl-Ribonukleotide umfasst.

7. Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Ribonukleotide und Desoxyribonukleotide durch Phosphorothioat-Internukleotid-Bindungen verknüpft sind.

8. Verfahren zur Hemmung der Proliferation von Krebszellen in vitro, das den Schritt der Verabreichung des Oligonukleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 an die Zellen umfasst.

9. Therapeutische Zusammensetzung, die das Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 in einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.

10. Verwendung eines Oligonukleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Erkrankungen und Störungen, die durch die Überexpression oder unangemessene Expression von RIα verursacht werden.