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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung betrifft eine Genexpressionsmodulation. Insbesondere betrifft
die Erfindung eine Genexpressionsmodulation einer das Gen codierenden
DNS-Methyltransferase, und die Genexpressionsmodulation, die durch
die Enzym-DNS-Methyltransferase
reguliert wird.
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Zusammenfassung
des Standes der Technik
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Die
Genexpressionsmodulation ist ein zunehmend an Bedeutung gewinnender
Ansatz geworden, verschiedene Zellprozesse sowie die ihnen zugrunde
liegenden biochemischen Abläufe
zu verstehen. Dieses Verständnis
bereichert die Wissenschaft und trägt dazu bei, neue Entdeckungen
zu machen, wie Abweichungen in derartigen Abläufen zu ernsthaften Krankheitszuständen führen können. Letztendlich
können
diese Entdeckungen zur Entwicklung wirksamer therapeutischer Behandlungen
für diese
Erkrankungen führen.
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Eine
Art von besonders interessantem Zellprozess ist, wie die Zelle die
Expression ihrer Gene reguliert. Eine abweichende Genexpression
scheint verantwortlich zu sein für
eine große
Vielfalt von ererbten genetischen Störungen, und sie hat außerdem in
zahlreichen Krebsarten und anderen Krankheiten Implikation gefunden.
Eine Regulierung der Genexpression stellt einen komplexen Prozess
dar und zahlreiche Aspekte dieses Prozesses werden nach wie vor
nicht verstanden. Eines der Mysterien dieses Prozesses besteht in
der Tatsache, dass, während
die genetische Information in sämtlichen
Geweben dieselbe ist, die einen Mehrzellenorganismus bilden, die
Expression von Funktionen, die durch das Genom codiert ist, in unterschiedlichen Geweben
stark variiert.
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In
einigen Fällen
ist es bekannt, dass gewebespezifische Transkriptionsfaktoren in
diesem Phänomen eine
Rolle spielen (Siehe Maniatis et al., Science 236: 1237 – 1245 (1987);
Ingarham et al., Annual Review of Physiology 52: 772 – 791 (1990)).
Es existieren jedoch mehrere wichtige Fälle, die durch die Wirkung
von Transkriptionsfaktoren alleine nicht so ohne weiteres erklärbar sind.
Beispielsweise lehrt Midgeon, Trends Genet. 10: 230 – 235 (1994),
dass eine X-Inaktivierung die Inaktivierung eines Allels eines Gens
mit sich bringt, das auf dem interaktiven X-Chromosom vorhanden
ist, während
das Allel alleine auf dem aktiven X-Chromosom weiterhin ausgedrückt bleibt.
Peterson und Sapienza, Annu. Rev. Genet. 27: 7 – 31 (1993), beschreiben außerdem einen "elterlichen Stempel" ("Parental Imprinting"), demnach ein Allel
eines Gens, das von einem Elternteil ererbt ist, aktiv ist, während das
andere Allel, das von dem anderen Elternteil ererbt ist, inaktiv
ist. In beiden dieser Fälle
existieren beide Allele in einer Umgebung, die dieselben Transkriptionsfaktoren
enthält, wobei
jedoch ein Allel ausgedrückt
ist, während
das andere still ist. Es müssen
deshalb andere Faktoren als Transkriptionsfaktoren in diese Phänomene einbezogen
sein.
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Forscher
haben außerdem
untersucht, welcher Typ von "epigenetischer
Information" in
diese zusätzliche
Steuerung des Expressionsmuster des Genoms einbezogen ist. Holliday,
Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 326: 329 – 338 (1990)
diskutiert die mögliche
Rolle für
eine DNS-Methylation in einem derartigen epigenetischem Erbe. DNS
enthält
einen Satz von Modifikationen, der in der genetischen Sequenz nicht
codiert ist, sondern der DNS unter Verwendung einer unterschiedlichen
enzymatischen Maschinerie kovalent letztlich zugefügt ist.
Diese Modifikationen nehmen die Form einer Methylation in der 5-Position
von Zytosinbasen in CpG-Dinukleotiden ein. Zahlreiche Untersuchungen
sind vorgeschlagen worden, demnach diese Methylation sehr wohl bei
der Regulierung der Genexpression einbezogen sein kann, während ihre
präzise
Rolle schwer bestimmbar geblieben ist. Beispielsweise werfen Lock
et al., Cell 48: 39 – 46
(1987) Fragen auf, ob das Timing der Hypermethylation und X-Inaktivierung
konsistent ist mit einer verursachenden Rolle für Methylation. In ähnlicher
Weise offenbaren Bartolomei et al., EMBO J. 12: 3669 – 3677 (1993),
Timing-/Ursachenfragen für
die Rolle der Methylation beim elterlichen Aufdrücken.
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Einige
dieser Nachteil existierender Studien bezüglich der Rolle der DNS-Methylation
in der Genexpression beruhen in den Werkzeugen, die aktuell zum
Durchführen
der Untersuchungen zur Verfügung
stehen. Zahlreiche Untersuchungen haben 5-azaC verwendet, um DNS-Methylation
zu unterbinden. 5-azaC ist jedoch ein Nukleosidanalog, das mehrfache
Auswirkungen auf Zellmechanismen anderer Art als DNS-Methylation aufweist,
wodurch es schwierig ist, Daten zu interpretieren, die aus diesen
Untersuchungen erhalten werden. In ähnlicher Weise bildet 5-azadC
einen Mechanismus auf Grundlage eines Hemmstoffs bei der Integration
in DNS; dieses kann jedoch ein Einfangen von DNS-Methyltransferase-
(nachfolgend als DNS-MeTase bezeichnet) Molekülen auf der DNS hervorrufen,
woraus Intoxizitäten
resultieren können,
die eine Dateninterpretation schwierig machen.
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Vor
kurzem haben Szyf et al., J. Biol. Chem. 267: 12831 – 12836
(1995), einen Ansatz offenbart, der vielversprechend ist unter Verwendung
der Expression von Antisense-RNS komplementär zu dem DNS-MeTase-Gen zur
Untersuchung der Auswirkung von Methylation auf Krebszellen. Szyf
und von Hofe, US-Patent Nr. 5578716, und Ramchandani et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 94: 684 – 689
(1997), offenbaren die Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden
komplementär
zu dem DNS-MeTase-Gen zum Hemmen von Tumorerzeugung. Diese Entwicklungen
haben wirksame neue Werkzeuge zum Sondieren der Rolle der Methylation in
zahlreichen Zellprozessen bereitgestellt. Außerdem haben sie vielversprechende
neue Ansätze
zur Entwicklung therapeutischer Verbindungen mit sich gebracht,
die geeignet sind, DNS-Methylation
zu modulieren. Die Verheißung
dieser Ansätze
unterstreicht die Wichtigkeit der Entwicklung von Antisense-Oligonukleotiden
komplementär
zu DNS-Methyltransferase-Sequenzen, die optimale Aktivität zum Hemmen
der DNS-Methyltransferasegenexpression aufweisen. Es besteht deshalb
ein Bedarf an derartigen optimierten Antisense-Oligonukleotiden.
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KURZE ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt Antisense-Oligonukleotide komplementär zu DNS-Methyltransferase-Sequenzen
bereit, die optimale Aktivität
zum Hemmen der DNS-Methyltransferasegenexpression besitzen. In bestimmten
Ausführungsformen
sind die optimierten Antisense-Oligonukleotide dadurch gekennzeichnet, dass
sie Nukleinsäuresequenzen
besitzen, die eine überraschend
hohe Wirksamkeit aufweisen. In einigen dieser Ausführungsformen
sind die optimierten Antisense-Oligonukleotide in Übereinstimmung
mit der Erfindung außerdem
dadurch gekennzeichnet, dass sie unterschiedliche chemische Modifikationen
aufweisen, die ihre Wirksamkeit zusätzlich erhöhen. Schließ lich stellt die Erfindung
Verfahren zum Verwenden dieser Antisense-Oligonukleotide als analytische
und diagnostische Werkzeuge bereit, wie etwa Potentiatoren von transgenetischen
Anlagen und Tierstudien und für
Gentherapieansätze
sowie für
potenzielle therapeutische Mittel.
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In
einem ersten Aspekt stellt die Erfindung neuartige optimierte Antisense-Oligonukleotide
bereit, die die Genexpression von DNS-MeTase bei Pegeln geringerer
Konzentration von Oligonukleotid hemmen als bislang bekannte Oligonukleotide.
Diese Antisense-Oligonukleotide sind komplementär zu Nukleinsäuresequenzen
von RNS oder doppelsträngiger
DNS, die DNS-MeTase
codiert. Bevorzugt enthalten diese Antisense-Oligonukleotide eine
oder mehrere modifizierte Internukleosidverknüpfungen und sie können optional
entweder Desoxyribonukleoside, Ribonukleoside oder 2'-O-substituierte
Ribonukleoside oder eine beliebige Kombination hieraus enthalten.
Besonders bevorzugte Antisense-Oligonukleotide in Übereinstimmung
mit diesem Aspekt der Erfindung enthalten schimäre Oligonukleotide und hybride
Oligonukleotide.
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In
einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Untersuchen
der Rolle von DNS-MeTase im Zellwachstum bereit, einschließlich dem
Wachstum von Tumorzellen. In dem Verfahren in Übereinstimmung mit diesem Aspekt
der Erfindung wird der interessierende Zelltyp in Kontakt gebracht
mit einem Antisense-Oligonukleotid in Übereinstimmung mit der Erfindung,
was zu einem Hemmen der Explosion von DNS-MeTase in der Zelle führt. Die
Antisense-Oligonukleotide können
an unterschiedlichen Punkten in dem Zellzyklus verabreicht werden
oder im Zusammenhang mit Förderstoffen
oder Hemmstoffen für
das Zellwachstum zum Ermitteln der Rolle von DNS-MeTase beim Wachstum
des interessierenden Zelltyps.
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In
einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren
zum Hemmen des Tumorwachstums bereit, aufweisend das Verabreichen
an ein Säugetier,
einschließlich
eines Menschen, von Antisense-Oligonukleotiden in Übereinstimmung
mit der Erfindung. In dem Verfahren in Übereinstimmung mit diesem Aspekt
der Erfindung wird eine therapeutisch wirksame Menge an Antisense-Oligonukleotid
in Übereinstimmung
mit der Erfindung für
eine therapeutisch wirksame Zeitdauer einem Säugetier verabreicht, einschließlich einem
Menschen, das bzw. der in seinem Körper Tumorzellen zeigt.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
die optimale Ziel-DNS-MeTasenukleotidsequenz für bestimmte bevorzugte Oligonukleotide
komplementär
zu DNS-MeTase-RNS,
die in den Sequenzlisten angeführt
sind als SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4,
SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6 und SEQ ID Nr. 7.
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2 zeigt
die Nukleotidsequenz von bestimmten bevorzugten Oligonukleotiden
komplementär
zu DNS-MeTase-RNS, die in den Sequenzlisten aufgeführt sind
als SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 10, SEQ ID Nr. 11, SEQ
ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 13, SEQ ID Nr. 14, SEQ ID Nr. 15, SEQ ID Nr.
16, SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 18, SEQ ID Nr. 19 und SEQ ID Nr. 20.
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3 zeigt
IC50-Werte für verschiedene bevorzugte Antisense-Oligonukleotide
komplementär
zu DNS-MeTase-mRNS, gemessen durch Reduktion von DNS-MeTase-mRNS-Pegeln
in menschlichen A549-Lungenkrebszellen in vitro.
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4 zeigt die Pegel von DNS-MeTase-mRNS
in menschlichen MDS-231-Brustkarzinomzellen, die behandelt sind
mit den optimierten Antisense-Oligonukleotiden gemäß der Erfindung
(-|-) im Vergleich zu bislang bekannten Oligonukleotiden (-|-).
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
Erfindung betrifft die Modulation von Genexpression. Insbesondere
betrifft die Erfindung die Modulation von Genexpression der Gen-codierenden
DNS-Methyltransferase (DNS-MeTase),
und die Modulation der Genexpression, die durch die Enzym-DNS-MeTase
reguliert wird. Die Patente und Veröffentlichungen, die in dieser
Anmeldung identifiziert sind, sind dem Fachmann auf diesem Gebiet
der Technik geläufig
und werden deshalb insgesamt unter Bezugnahme in diese Anmeldung
integriert.
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Die
Erfindung stellt Antisense-Oligonukleotide komplementär zu optimalen
Ziel-DNS-MeTase-Sequenzen bereit, die optimale Aktivität zum Hemmen
der DNS-Methyltransferase-Genexpression haben. In bestimmten Ausführungsformen
sind die optimierten Antisense-Oligonukleotide dadurch gekennzeichnet,
dass sie Nukleinsäuresequenzen
aufweisen, die überraschend
hohe Wirksamkeit bereitstellen. In einigen dieser Ausführungsformen
sind die optimierten Antisense-Oligonukleotide in Übereinstimmung
mit der Erfindung außerdem
dadurch gekennzeichnet, dass sie bestimmte chemische Modifikationen
aufweisen, die ihre Wirksamkeit zusätzlich verbessern. Schließlich stellt
die Erfindung Verfahren zur Verwendung dieser Antisense-Oligonukleotide als
analytische und diagnostische Werkzeuge bereit, als Potenziatoren
für Transgenanlagen
und Tierstudien und für
Gentherapieansätze,
und als potentielle therapeutische Mittel.
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Gemäß einem
ersten Aspekt stellt die Erfindung optimale Ziel-DNS-MeTase-Nukleotid-Sequenzen bereit,
die als bevorzugte Ziele für
die Hybridisierung von optimierten Antisense-Oligonukleotiden bevorzugt verwendet
werden. Eine zwischenmolekulare Basenpaarung spielt eine wichtige
Rolle beim Sequestrieren von Sequenzen unter Verhinderung der zwischenmolekularen
Paarung, die für
Antisense-Aktivität
essentiell ist. Es wird davon ausgegangen, dass eine Duplexbildung
zwischen Antisense-Oligonukleotiden und Zielsequenzen beschränkt ist
auf diejenigen Bereiche, die eine zugängliche Teilstruktur bereitstellen,
die als Ort für
die Nukleation geeignet ist und deshalb ungepaarte Basen aufweist.
Die Duplexbildung schreitet ausgehend vom Nukleationsort durch einen "Zippering"-Prozess fort und
stoppt, wenn dieser Prozess eine Energiebarriere erreicht. Diese
Barrieren können
beispielsweise die Enden von Stielen oder scharfen Kehren in der
gefalteten RNS umfassen. Die Suszeptilität einer Zielsequenz in Bezug
auf eine Antisense-Interaktion variiert deshalb stark von einem
Teil der Sequenz zu einem anderen und steht direkt in Beziehung
zu einem speziellen Sequenzpotenzial zum Einbau bzw. Zusammenbau
in ein Heteroduplex.
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Ohne
eine Bindung an eine bestimmte Theorie anzustreben, geht der Erfinder
davon aus, dass diese Bemühungen
zur Identifizierung von DNS-MeTase-Sequenzen führen, die für eine Duplexbildung offen
sind.
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Beispiele
optimaler Ziel-DNS-MeTase-Nukleotid-Sequenzen, die als bevorzugtes
Ziel für
die Hybridisierung von optimierten Antisense-Oligonukleotiden verwendet
werden, sind unten ge zeigt. Zusätzliche
optimale Ziel-DNS-MeTase-Nukleotid-Sequenzen besitzen Sequenzen, die zumindest
ein Nukleotid enthalten, das mit den nachfolgend gezeigten Zielsequenzen überlappt.
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Der
erste Aspekte der Erfindung stellt außerdem neuartige optimierte
Antisense-Oligonukleotide bereit, die die Genexpression von DNS-MeTase
hemmen. Diese Antisense-Oligonukleotide sind komplementär zu optimalen
Ziel-Nukleinsäuresequenzen
von RNS oder doppelsträngiger
DNS zur Codierung von DNS-MeTase, bevorzugt menschlicher DNS-MeTase,
und sie sind dadurch gekennzeichnet, dass ihr Fähigkeit zum Hemmen der DNS-Methyltransferasegenexpression
mit einem IC50 von weniger als 100 nM, bevorzugt
90 nM oder weniger, besonders bevorzugt 80 nM oder weniger, noch
stärker
bevorzugt 70 nM oder weniger und noch stärker bevorzugt 60 nM oder weniger
und besonders bevorzugt 50 nM oder weniger beträgt. Bevorzugt wird dieser Hemmvorgang
gemessen durch Ermitteln der Pegel von DNS-Methyltransferase-mRNS
in menschlichen A549-Lungenkrebszellen in vitro. Für die Zwecke
der Erfindung bedeutet "komplementär" eine ausreichende
Komplementarität
in Bezug auf die Fähigkeit,
unter physiologischen Bedingungen in eine optimale Ziel-DNS-MeTase-Nukleotid-Sequenz
zu hybridisieren, bei der es sich um einen Genombereich handeln
kann, ein Gen oder ein RNS-Transkript hiervon. Diese Hybridisierung
ist üblicherweise
das Ergebnis einer basenspezifischen Wasserstoffverbindung zwischen
komplementären
Strängen,
bevorzugt zur Bildung von Watson-Chrick- oder Googsteen-Basenpaaren,
obwohl andere Modi der Wasserstoffbindung ebenso wie Basenstapel
ebenfalls zur Hybridisierung führen
können.
Die Antisense-Oligonukleotide gemäß der Erfindung können eine
oder mehrere modifizierte Basen aufweisen, die für Hybridisierung geeignet sind.
Der Begriff "modifizierte
Base" bedeutet vorliegende
eine andere Base als die fünf
traditionellen Stickstoffbasen: Adenin, Thymin, Guanin, Uridin und
Zytosin. Diese modifizierten Basen sind geeignet für eine Hybridisierung
mit einer komplementären
traditionellen Base oder mit einer modifizierten Base. Beispielsweise
ein Antisense-Oligonukleotid in Übereinstimmung
mit der Erfindung kann Inosin, 5-Bromozytosin oder 5-Fluorozytosin oder
ein solches enthalten, das geeignet ist für eine Hybridisierung an eine
Guaninbase in der Ziel-DNS-MeTase-Sequenz. Modifizierte
Basen in Übereinstimmung
mit der Erfindung umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, 4-Acetylzytidin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)Uridin,
2'-O-Methylzytidin,
5-Carboxymethylaminomethyl-2-Thioridin, 5-Carboxymethylaminomethyluridin,
Dihydrouridin, 2'-O-Methylpseudouridin,
Beta,D-Galactosylqueosin, 2'-O-Methylguanosin,
Inosin, N6-Isopentenyladenosin, 1-Methyladenosin, 1-Methylpseudouridin,
1-Methylguanosin, 1-Methylinosin, 1,2-Dimethylguanosin, 2-Methyladenosin,
2-Methylguanosin, 3-Methylzytidin, 5-Methylzytidin, N6-Methyladenosin, 7-Methylguanosin,
5-Methylaminomethyluridin, 5-Methoxyaminomethyl-2-Thiouridin, Beta,D- Mannosylqueosin,
5-Methoxycarbonylmethyluridin, 5-Methoxyuridin, 2-Methylthio-N6-Isopentenyladenosin,
N6-((9-Beta-D-Ribofuranosyl-2-Methylthiopurin-6-yl)Carbarnoyl)Threonin, N-((9-Beta-D-Ribofuranosylpurine-6-yl)N-Methyl-Carbamoyl)Threonin,
Uridin-5-Oxyessigsäuremethylester, Uridin-5-Oxyessigsäure (v),
Wybutoxosin, Pseudouridin, Keosin, 2-Thiocytidin, 5-Methyl-2-Thiouridin,
2-Thiouridin, 4-Thiouridin, 5-Methyluridin, N-((9-Beta-D-Ribofuranosylpurin-6-yl)Carbamoyl)Threonin,
2'-O-Methyl-5-Methyluridin,
2'-O-Methyluridin,
Wybutosin und 3-(3-Amino-3-Carboxypropyl)Uridin, (acp3)u. In der
Praxis kann diese Komplementarität
ermittelt werden aus der Beobachtung einer spezifischen DNS-MeTase-Genexpressionshemmung,
wie vorstehend erläutert.
Bevorzugt enthalten diese Antisense-Oligonukleotide eine oder mehrere modifizierte
Internukleosidverknüpfungen
und sie können
optional entweder Desoxyribonukleoside, Ribonukleoside oder 2'-O-substituierte
Ribonukleoside oder eine beliebige Kombination hieraus enthalten.
Besonders bevorzugt umfassen Antisense-Oligonukleotide in Übereinstimmung
mit diesem Aspekt der Erfindung schimäre Oligonukleotide und hybride
Oligonukleotide.
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Für die Zwecke
der Erfindung umfasst der Begriff "Oligonukleotid" Polymere aus zwei oder mehr Desoxyribonukleosiden,
Ribonukleosiden bzw. 2'-O-substituierte
Ribonukleosidreste oder eine Kombination hieraus. Bevorzugt besitzen
diese Oligonukleotide von etwa 8 bis etwa 50 Nukleosidreste, bevorzugt
von etwa 21 bis etwa 50 Nukleosidreste, stärker bevorzugt von etwa 21
bis etwa 25 Nukleosidreste, und besonders bevorzugt von etwa 13
bis etwa 19 Nukleosidreste. Die Nukleosidreste können miteinander durch eine
beliebige Anzahl bekannter Internukleosidverknüpfungen verbunden sein. Diese
Internukleosidverknüpfungen
erfassen ohne Beschränkung
Phosphorothioat, Phosphorodithioat, Alkylphosphonat, Alkylphosphonothioat, Phosphotriester,
Phosphoramidat, Siloxan, Karbonat, Carboxymethylester, Acetamidat,
Carbamat, Thioether, gebrücktes
Phosphoramidat, gebrücktes
Methylenphosphonat, gebrücktes
Phosphorothioat und Schwefelinternukleotidverknüpfungen. In bestimmten bevorzugten
Ausführungsformen
kann es sich bei diesen Internukleosidverknüpfungen um Phosphodiester,
Phosphotriester, Phosphorothioat oder Phosphoramidatverknüpfungen
oder eine Kombination hieraus handeln. Der Begriff Oligonukleotid
umfasst außerdem
solche Polymere, die chemisch modifizierte Basen oder Zucker aufweisen
und/oder zusätzliche
Substituenten aufweisen, einschließlich, ohne Beschränkung, lipophile
Gruppen, interkalierende Mittel, Diamine und Adamantan. Für die Zwecke der
Erfindung bedeutet der Begriff "2'-O-substituiert" eine Substitution
der 2'-Position
des Pentoseanteils durch eine niedrige -O-Aklylgruppe, enthaltend
1-6 gesättigte
oder ungesättigte
Kohlenstoffatome, oder mit einer -O-Aryl- oder Allyl-Gruppe, aufweisend
2-6 Kohlenstoffatome, wobei diese Alkyl-, Aryl- oder Allyl-Gruppe
unsubstituiert oder substituiert sein kann, beispielsweise mit Halo-,
Hydroxy-, Trifluoromethyl-, Cyano-, Nitro-, Acyl-, Acyloxy-, Alkoxy-,
Carboxal-, Carbalkoxyl- oder Amino-Gruppen; oder diese 2'-Substitution kann
in Gestalt einer Hydroxy-Gruppe (zur Erzeugung eines Ribonukleosids),
einer Amino- oder Halo-Gruppe,
nicht jedoch mit einer 2'-H-Gruppe
vorliegen.
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Optimierte
Antisense-Oligonukleotide komplementär zu RNS oder doppelsträngiger DNS,
die DNS-MeTase codiert, in Übereinstimmung
mit der Erfindung sind nachfolgend gezeigt. Zusätzliche bevorzugte Oligonukleotide
weisen Nukleotidsequenzen auf von etwa 13 bis etwa 19 Nukleotiden
der nachfolgend gezeigten Nukleotidsequenzen.
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Besonders
bevorzugte Antisense-Oligonukleotide in Übereinstimmung mit diesem Aspekt
der Erfindung umfassen schimäre
Oligonukleotide und hybride Oligonukleotide.
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Für die Zwecke
der Erfindung bezieht sich ein "schimäres Oligonukleotid" auf ein Oligonukleotid
mit mehr als einem Typ einer Internukleosidverknüpfung. Eine bevorzugte Ausführungsform
eines derartigen schimären
Oligonukleotids ist ein schimäres
Oligonukleotid, aufweisend einen Phosphorothioat-, Phosphodiester- oder
Phosphorodithioat-Bereich, bevorzugt aufweisend von etwa 2 bis etwa
12 Nukleotide, und einen Alkylphosphonat- oder Alkylphosphonothioat-Bereich.
Bevorzugt enthalten diese schimären
Oligonukleotide zumindest drei aufeinander folgende Internukleosidverknüpfungen,
die ausgewählt
sind aus Phosphodiester- und Phosphorothioat-Verknüpfungen
oder Kombinationen hieraus.
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Für die Zwecke
der Erfindung bezieht sich ein "hybrides
Oligonukleotid" auf
ein Oligonukleotid, das mehr als einen Nukleosidtyp aufweist. Eine
bevorzugte Ausführungsform
eines derartigen hybriden Oligonukleotids umfasst einen Ribonukleotid-
oder einen 2'-O-substituierten
Ribonukleotid-Bereich, bevorzugt aufweisend von etwa 2 bis etwa
12 2'-O-substituierte
Nukleotide, und einen Desoxyribonukleotid-Bereich. Be vorzugt enthält ein derartiges
hybrides Oligonukleotid zumindest drei aufeinander folgende Desoxyribonukleoside
und es enthält
außerdem
Ribonukleosid, 2'-O-substituierte
Ribonukleoside oder Kombinationen hieraus. In einer bevorzugten
Ausführungsform
ist der Desoxyribonukleotid-Bereich auf jeder Seite flankiert durch
einen 2'-O-substituierten
Bereich. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich
bei den 2'-O-substituierten
Bereichen um 2'-O-Methyl-Bereiche,
besonders bevorzugt aufweisend vier 2'-O-Methyl-Nukleoside. In bestimmten
bevorzugten Ausführungsformen
ist das gesamte Skelett des Oligonukleotids ein Phosphorothioat-Skelett.
Die Überlegenheit
von hybriden Oligonukleotiden in Übereinstimmung mit der Erfindung
ist nachfolgend in dieser Beschreibung nachgewiesen.
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Die
exakte Nukleotidsequenz und chemische Struktur eines Antisense-Oligonukleotids
in Übereinstimmung
mit der Erfindung kann variiert werden, solange das Oligonukleotid
seine Fähigkeit
beibehält, DNS-MeTase-Expression
auf hohem Niveau an Wirksamkeit zu hemmen, wie vorstehend erläutert. Dies
lässt sich
problemlos ermittelt durch Testen, ob das bestimmte Antisense-Oligonukleotid
in einem DNS-MeTase-mRNS-Assay, einem DNS-MeTase-Enzym-Assay, einem
weichen Agar-Wachstums-Assay oder einem in vivo Tumorwachstums-Assay
aktiv ist, die sämtliche
im Einzelnen in dieser Beschreibung erläutert sind.
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Antisense-Oligonukleotide
in Übereinstimmung
mit der Erfindung können
problemlos synthetisiert werden auf einem geeigneten festen Träger unter
Verwendung an sich bekannter chemischer Ansätze, umfassend H-Phosphonatchemie,
Phosphoramiditchemie oder eine Kombination aus H-Phosphonatchemie,
Phosphoramiditchemie (d. h., H-Phosphonatchemie für einige
Zyklen und Phosphoramiditchemie für andere Zyklen). Geeignete
feste Träger
umfassen beliebige der festen Standardträger, die für die feste Phase der Oligonukleotidsynthese
verwendet werden, wie etwa Glas mit kontrollierter Pore (CPG). (Siehe
beispielsweise Pon, Methods in Molec. Biol. 20: 465 (1993).
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Antisense-Oligonukleotide
in Übereinstimmung
mit der Erfindung sind für
unterschiedliche Zwecke nützlich.
Beispielsweise können
sie als "Sonden" der physiologischen
Funktion von DNS-MeTase verwendet werden, indem sie dazu eingesetzt
werden, die Aktivität
von DNS-Methyltransferase in einer experimentellen Zellenkultur
oder einem tierischen System zu hemmen und den Hemmeffekt dieser
DNS-MeTase-Aktivität
zu evaluieren. Bewirkt wird dies durch Zumessen eines Antisense-Oligonukleotids
in Übereinstimmung
mit der Erfindung einer Zelle oder einem Tier und Beobachten von
beliebigen phänotypischen
Effekten. In diesem Gebrauch sind Antisense-Oligonukleotide in Übereinstimmung
mit der Erfindung bevorzugt gegenüber traditionellen "Gen-Knockout"-Ansätzen, weil
sie problemloser einsetzbar sind und verwendet werden können, DNS-MeTase-Aktivität in ausgewählten Stufen
der Entwicklung oder Differenzierung zu hemmen. Antisense-Oligonukleotide
in Übereinstimmung
mit der Erfindung können
deshalb als Sonden dienen, die Rolle von DNS-Methylation in verschiedenen
Entwicklungsstufen zu testen.
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Schließlich sind
erfindungsgemäße Antisense-Oligonukleotide
nützlich
in therapeutischen Ansätzen
in Bezug auf benigne und maligne Tumore und andere menschliche Erkrankungen,
die die Unterdrückung
von Genexpression vorsehen. Die Antitumornützlichkeit von Antisense-Oligonukleotiden
in Übereinstimmung
mit der Erfindung ist in dieser Beschreibung an anderer Stelle erläutert. Außerdem können Antisense-Oligonukleotide
in Übereinstimmung
mit der Erfindung verwendet werden, um silen zierte Gene zu aktivieren,
um eine fehlende Genfunktion bereitzustellen und dadurch Krankheitssymptome
zurückzudrängen. Beispielsweise
werden die Krankheiten Beta-Thalassemia und Sichelzellenanämie hervorgerufen
durch aberrante Expression des adulten Betaglobingens. Die meisten
Individuen, die an diesen Krankheiten leiden, weisen normale Kopien des
fetalen Gens für
Betaglobin auf. Das fetale Gen ist jedoch hypermethyliert und silent.
Die Aktivierung des fetalen Globingens kann die benötigte Globinfunktion
bereitstellen, wodurch die Krankheitssymtome verbessert werden.
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Für den therapeutischen
Einsatz können
erfindungsgemäße Antisense-Oligonukleotide
optional mit beliebigen, an sich bekannten pharmazeutisch verträglichen
Trägern
oder Verdünnungen
formuliert werden. Die Formulierung kann außerdem einen oder mehrere DNS-MeTase-Hemmstoffe
und/oder ein oder mehrere zusätzliche
Anti-DNS-MeTase-Antisense-Oligonukleotide umfassen oder ein beliebiges
anders pharmakologisch aktives Mittel.
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In
einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Untersuchen
der Rolle von DNS-MeTase im Zellwachstum bereit, einschließlich dem
Wachstum von Tumorzellen. In dem Verfahren in Übereinstimmung mit diesem Aspekt
der Erfindung wird der interessierende Zelltyp mit einem erfindungsgemäßen Antisense-Oligonukleotid
in Kontakt gebracht, was zum Hemmen der Expression der DNS-MeTase
in der Zelle führt.
Die Antisense-Oligonukleotide können
an unterschiedlichen Punkten in dem Zellzyklus verabreicht werden
oder in Verbindung mit Förderstoffen
oder Hemmstoffen des Zellwachstums, um die Rolle von DNS-MeTase
beim Wachstum des interessierenden Zellentyps zu ermitteln.
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In
einem dritten Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zum Hemmen von
Tumorwachstum bereit, aufweisend das Verabreichen von erfindungsgemäßen Antisense-Oligonukleotiden
an ein Säugetier,
einschließlich
eines Menschen. In dem Verfahren in Übereinstimmung mit diesem Aspekt
der Erfindung wird eine therapeutisch wirksame Menge eines Antisense-Oligonukleotids
in Übereinstimmung
mit der Erfindung für
eine therapeutisch wirksame Zeitdauer einem Säugetier verabreicht, einschließlich einem
Menschen, das bzw. der in seinem Körper Tumorzellen aufweist.
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Vorliegend
wird der Begriff "Tumorwachstum" verwendet, um sich
auf das Wachstum einer Tumorzelle Bezug zu nehmen. Bei einer "Tumorzelle" handelt es sich
um eine neoplastische Zelle. Die Tumorzelle kann benign sein, d.
h. eine solche, die keine Metastasen bildet und benachbartes normales
Gewebe nicht zerstört und
die in dieses nicht eindringt, oder malign, d. h. eine solche, die
in umgebendes Gewebe eindringt, in der Lage ist, Metastasen zu erzeugen
oder nach einer versuchten Entfernung rekuriert oder wahrscheinlich
den Tod des Gastes hervorruft.
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Die
Begriffe "therapeutisch
wirksame Menge" und "therapeutisch wirksame
Zeitdauer" werden
vorliegend verwendet, um bekannte Behandlungen mit Dosierungen für eine Zeitdauer
zu bezeichnen, die wirksam ist, Tumorzellenwachstum zu verringern.
Bevorzugt sollte diese Verabreichung parenteral, oral, sublingual, transdermal,
topical, intranasal oder intrarektal erfolgen. Wenn eine systemische
Verabreichung vorliegt, wird die therapeutische Zusammensetzung
bevorzugt mit einer ausreichenden Dosierung verabreicht, um einen Blutpegel
von Antisense-Oligonukleotid von etwa 0,01 uM bis etwa 10 uM zu
erzielen. Für
eine lokalisierte Verabreichung können viel ge ringere Konzentrationen
als diese wirksam sein und viel höhere Konzentrationen können toleriert
werden. Bevorzugt liegt die gesamte Dosierung des DNS-MeTase-Hemmstoffs
im Bereich von etwa 0,1 mg Oligonukleotid pro Patient pro Tag bis
etwa 200 mg Oligonukleotid pro kg Körpergewicht pro Tag.
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In Übereinstimmung
mit einer weiteren Ausführungsform
können
eine oder mehrere Oligonukleotide einem Tier verabreicht werden.
Dieser Aspekt der Erfindung stellt Verfahren zum Hemmen des Tumorwachstums
bereit, aufweisend das Verabreichen von mehr als einem erfindungsgemäßen Antisense-Oligonukleotid an
ein Tier oder einen Menschen, entweder sequenziell oder gleichzeitig
in einer therapeutisch wirksamen Menge und für eine therapeutisch wirksame
Zeitdauer.
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Die
nachfolgenden Beispiele dienen dazu, bestimmte bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung zu erläutern
und sind als nicht beschränkend
anzusehen.
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Beispiel 1
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Hemmung der DNS-MeTase-Expression,
gemessen in Kernextrakten, zubereitet aus menschlichen Zellen und Mauszellen
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Kernextrakte
werden zubereitet aus der 1 × 108-Mid-Log-Phase von menschlichen H446-Zellen
oder Maus-Y1-Zellen, die unter Standardzellkulturbedingungen wachsen
gelassen wurden. Zellen wurden mit einem Medium behandelt, dem 1
mg/ml eines Antisense-Oligonukleotids zugesetzt war komplementär zu einer Sequenz
des DNS-MeTase-RNS-Transkrips oder eines Randomer- (negativ Kontrollen-)
Oligonukleotids. Die Zellen wurden geerntet und zweimal mit Phosphat
bepufferter Salzlösung
(PBS) gewaschen, woraufhin das Zellpellet in einem in 0,5 ml Puffer
A resuspendiert wurde (10 mM Tris pH 8,0, 1,5 mM MgCl2,
5 mM KCl2, 0,5 mM Dtt, 0,5 mM PMSF und 0,5%
Nonidet P40), um den Kern von den übrigen Zellbestandteilen zu
trennen. Die Kerne wurden pelletiert durch Zentrifugation in einer
Eppendorf-Mikrozentrifuge
mit 2000 UpM für
15 Minuten bei 4°C.
Der Kern wurde einmal in Puffer A gewaschen und repelletiert, daraufhin
resuspendiert in 0,5 ml Puffer B (20 mM Tris pH 8,0, 0,25% Glyzerol,
1,5 mM MgCl2, 0,5 mM PMSF, 0,2 mM EDTA,
0,5 mM DTT und 0,4 mM NaCl). Die resuspendierten Kerne wurden auf
Eis für
15 Minuten inkubiert und daraufhin mit 15000 UpM in Drehung versetzt,
um Kernschmutz zu pelletieren. Das Kernextrakt in dem Überstand
wurde von dem Pellet getrennt und verwendet für Assays für die DNS-MeTase-Aktivität. Für jedes
Assay, das dreifach ausgeführt
wurde, wurden 3 ug Kernextrakt in einem Reaktionsgemisch verwendet,
das 0,1 ug eines synthetischen 33-Basenpaars hemimethylierten DNS-Molekülsubstrats
enthielt mit 0,5 uCi S-[Methyl-3H] Adenosyl-L-Methionin
(78,9 Ci/mmol) als Methyldonor in einem Puffer, der 20 mM Tris-HCL
(pH 7,4), 10 mM EDTA, 25% Glyzerol, 0,2 mM PMSF und 20 mM 2-Mercaptoethanol enthielt.
Das Reaktionsgemisch wurde für
1 Stunde bei 37°C inkubiert,
um die anfängliche
Rate der DNS-MeTase
zu messen. Die Reaktion wurde gestoppt durch Zusetzen von 10% TCA,
um die DNS zu fällen,
woraufhin die Proben bei 4°C
für 1 Stunde
inkubiert wurden und die TCA-Prezipitate wurden durch GFC-Filter
(Fischer, Hampton, NH) gewaschen. Kontrollen wurden DNS-inkubiert
in einem Reaktionsgemisch bei Abwesenheit von Kernextrakt und Kernextrakt
wurde inkubiert in das Reaktionsgemisch in Abwesenheit von DNS.
Die Filter wurden in Scintillationsbehälter gelegt, enthaltend 5 ml Scintillationscocktail
und trizierte Methylgruppen, eingebaut in die DNS, wurden in einem
Scintillationszähler in Übereinstimmung
mit Standardverfahren gemessen. Um Unterdrückung von DNS-MeTase-Expression
zu messen, wurde die spezifische Aktivität des Kernextrakts aus Oligonukleotid
behandelten Zellen mit der spezifischen Aktivität des Extrakts von unbehandelten
Zellen verglichen. Die Behandlung der Zellen mit Antisense-Oligonukleotiden
gemäß der Erfindung
resultiert in einer Verringerung der DNS-MeTase-Aktivität in dem Kernextrakt.
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Beispiel 2
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Hemmung der DNS-MeTase-Expression,
gemessen durch mRNS in A549-Zellen
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In
einer Kultur wachsende A549-Zellen wurden mit DNS-Methylransferase-Antisense-Oligonukleotiden
in Anwesenheit von 6,25 ug/ml Lipofection (GIBCO BRL) in einem Optimem-Serum-freien
Medium (GIBCO) für
4 Stunden behandelt. Zellen wurden daraufhin einmal mit PBS gewaschen,
woraufhin die Zellen in DMEM-Medium
(GIBCO) rückgeführt wurden,
das 10% fetales Kalbserum enthielt. 24 Stunden nach Zusetzen des
Oligonukleotids wurde die gesamte Zell-RNS aus A549-Zellen isoliert,
auf einem denaturierten Agarosegel einwirken gelassen, übertragen
auf eine Nylonmembran (Norhtern Blot). Membranen wurden daraufhin
hybridisiert mit einer speziellen radioaktiv markierten DNS-Methyltransferase-Sonde,
gewaschen und genutzt, um einen Röntgenstrahlfilm zu belichten.
Der Pegel der DNS-Methylranseraseexpression in der Kontrolle und
in den behandelten Zellen wurde ermittelt durch Quantifizierung
des DNS-Methylransferasesignals. Membranen wurden daraufhin gestrippt
und rehybridisiert mit einer Sonde, die spezifisch ist für G3PDH
(Glyceraldehyd 3-Phosphat, Dehydrogenase) als nicht-Antisense-Ziel-Gen
zur Kontrolle auf nicht spezifische Effekte und zum Belasten der
gesamten RNS. DNS-Methyltransferasepegel wurden ermittelt durch
Teilen des Signals, das gewonnen wurde für die DNS-Methyltransferase,
durch dasjenige, das erhalten wurde für G3PDH.
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Beispiel 3
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Analyse der Zell-DNS-Methylation
in Zellen, die mit Antisense-Oligonukleotiden behandelt worden waren
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Kernextrakte
werden zubereitet aus Randomer-Oligonukleotid-behandelten Zellen und aus Antisense-Oligonukleotid-behandelten
Zellen (1 uM Oligonukleotid), wie im Beispiel 1 erläutert. Das
DNS-Pellet wird resuspendiert in einem 0,5 ml DNA-Extraktionspuffer
(0,15 M NaCl, 1% SDS, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA), 100 ug
Proteinase K wurde zugesetzt und die Suspension wurde bei 50°C für 16 Stunden
inkubiert. Die DNS wurde in Phenol-Chloroform extrahiert durch Zusetzen
von 0,25 ml Phenol und 0,25 ml Chloroform. Die Suspension wird gemischt
und die organischen und wässrigen
Phasen werden durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge für 10 Minuten
bei 15000 UpM getrennt. Ein ml absoluter Ethanol wurde der wässrigen Phase
zugesetzt und die DNS wurde gefällt
durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge für 15 Minuten bei 15000 UpM.
Das DNS-Pellet wurde in 70% Ethanol gewaschen und durch Zentrifugation
re-pelletiert. Die DNS wird resuspendiert in 100 ul 20 mM TRis-HCl,
pH 8,0, 1 mM EDTA.
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Zwei
ug DNS wurden inkubiert bei 37°C
für 15
Minuten mit einer zehntel Einheit DNase, 2,5 ul 32P-dGTP
3000 Ci/mmol, Amersham (Cleveland, OH) und dann 2 Einheiten Kornberg
DNS-Polymerase (Boehringer
Mannheim, Mannheim, Deutschland) zugesetzt und das Reaktionsgemisch
wurde inkubiert für
zusätzliche
25 Minuten bei 30°C.
Fünfzig
ul H2O wurden daraufhin zugesetzt und nicht
inkorporierte Radioaktivität
wird entfernt durch Schleudern in einer Mikroschleuder S-300 HR-Säule (Pharmacia,
Piscataway, NJ). Markierte DNS (20 ul) wurde digestiert mit 80 ug
Mikrokokkennuklease (Pharmacia, Piscataway, NJ) in dem vom Hersteller
empfohlenen Puffer für
10 Stunden bei 37°C.
Gleiche Mengen Radioaktivität
wurden auf TLC-Phosphorzelluloseplatten geladen (Merck, Darmstadt,
Deutschland) und die 3'-Mononukleotide
wurden getrennt durch Chromatographie in einer Richtung in 66:33:1-Isobutansäure-/H2O/NH4OH. Die Chromogramme wurden auf XAR-Film
(Eastmann Kodak, Rochester, NY) belichtet und die Autoradiogramme
wurden durch Laserdichtemessung abgetastet (Scanalytics, CSPI, Billerica,
MA). Flecke entsprechend Cytosin und 5-Methylcytosin wurden quantifiziert
und der Prozentsatz an nicht methylierten CG-Dinukleotiden wurden
ermittelt. Es wurde erwartet, dass die Ergebnisse eine Gesamtreduktion
in Prozent der nicht methylierten CG-Dinukleotide in Antisense-Oligonukleotid-behandelten
Zellen zeigen, relativ zu Randomer-behandelten Zellen.
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Um
die Demethylierung spezifischer Gene festzustellen, wurde eine Prozedur
ausgeführt,
die allgemein beschrieben ist in J. Biol. Chem. 270: 12690 – 12696
(1995). Kurz gesagt, wurde die Genom-DNS (10 ug) extrahiert und
einer Digestion durch 25 Einheiten HindIII unterworfen, gefolgt
durch eine Digestion durch entweder 25 Einheiten MspI (CG-methylationsunempfindlich)
oder 25 Einheiten HpaII (CG-methylationsempfindlich) für 8 Stunden
bei 37°C.
Die digestierte DNS wurde auf einem 1,5%-igen Agarosegel getrennt
und Southern Blotting unterworfen sowie einer Hybridisierung mit
spezifischen Sonden. Von den Ergebnissen wurde erwartet, dass sie
zeigen, dass Gene, die ordinär
stark methyliert in den Testzellen waren, untermethyliert werden,
während
die Methylationspegel für
Gene, die nicht originär
schwer in den Testzellen methyliert waren, nicht signifikant betroffen
waren.
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Beispiel 4
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Hemmung von
In Vitro Tumorwachstum durch Antisense-Oligonukleotide
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Y1-
oder H446-Zellen wurden auf einer 6-Well-Platte mit einer Dichte
von 80000 Zellen/Well plattiert. Antisense-Oligonukleotid-Phosphorothioate
komplementär
zu einem DNS-MeTase nicht codierten Bereich (etwa 0,5 bis 20 uM)
wurden den Zellen zugesetzt. Die Zellen wurden in ähnlicher
Weise täglich
für 7 Tage
behandelt. Daraufhin werden die Zellen geerntet und 3000 lebende
Zellen werden auf weiches Agar plattiert, wie beispielsweise erläutert in
Freedman and Shin, Cell 3: 355 – 359
(1974). Zwei Wochen nach dem Plattieren wurde die Anzahl von Kolonien,
die sich in dem weichen Agar gebildet hatten, durch visuelle Untersuchung markiert.
Im Fall aktiver Antisense-Oligonukleotide
wurde eine Dosis-abhängige
Verringerung der Anzahl der Kolonien beobachtet.
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Beispiel 5
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Hemmung von
Tumorwachstum In Vivo
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Zehn
bis zwölf
Wochen alte weibliche nackte BRLB/c-Mäuse (Taconic Labs, Great Barrington,
NY) wurden subkutan in den Flankenbereich einer Injektion unterzogen
mit 2 × 106 vorkonditionierten menschlichen A549-Lungenkarzinomzellen
bzw. menschlichen Colo205-Colonkrebszellen. Die Vorkonditionierung
dieser Zelle erfolgte mit einem Minimum von drei aufeinander folgenden
Tumortransplantationen in dieselbe Art der nackten Mäuse. Daraufhin
wurden Tumorfragmente von ungefähr
25 mgs entnommen und subkutan in den Mäusen implantiert, in den linken
Flankenbereich unter der Foren-Narkose (Abbott Labs., Geneva, Schweiz). Wenn
die Tumore ein mittleres Volumen von 100 mm3 erreichten,
wurden die Mäuse
intravenös
behandelt durch tägliche
Bolusinfusion in die Schwanzvene mit Oligonukleotid salzpräparationen,
enthaltend 2 mg/kg Oligonukleotid in Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung. Die optimale finale Konzentration des Oligonukleotids
wurde festgelegt durch Dosisreaktionsexperimente in Übereinstimmung
mit Standardprotokollen. Das Tumorvolumen wurde berechnet in Übereinstimmung
mit Standardmethoden nach jedem zweiten Tag nach der Infusion (beispielsweise
Meyer et al. Int. J. Cancer 43: 851 – 856 (1989)). Die Behandlung
mit den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden
verursachte eine signifikante Verringerung des Tumorgewichts und
des Tumorvolumens relativ zu Kontrollen, die mit einer randomisierten
oder einer reversen Antisense-Sequenz (Daten nicht gezeigt) behandelt
worden waren. Außerdem
wurde die Aktivität
des DNS-MeTase-Enzyms gemessen und als relativ zu den Randomer behandelten
Kontrollen als signifikant verringert ermittelt. Diese Ergebnisse
zeigen, dass die Oligonukleotide in Übereinstimmung mit der Erfindung
geeignet sind, MeTase-enzymatische Aktivität und Tumorwachstum zu hemmen.
