DE69836384T2

DE69836384T2 - Antisense-oligonukleotide gegen thymidylatsynthase

Info

Publication number: DE69836384T2
Application number: DE69836384T
Authority: DE
Inventors: Donald James London KOROPATNICK; Mark David London VINCENT; Nicholas Mark Carlsbad DEAN
Original assignee: Sarissa Inc; Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Sarissa Inc; Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-09-23
Filing date: 1998-09-17
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2018-09-18
Also published as: AU9090498A; US20050272683A1; ATE344835T1; DE69836384D1; CA2301957A1; EP1017800B1; EP1017800A1; WO1999015648A1; JP2001517681A; ES2280098T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Antisense-Oligodeoxynukleotide, die auf Sequenzen in der mRNA für Thymidylatsynthase (TS) ausgerichtet sind. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf Antisense-Oligodeoxynukleotide, die auf Sequenzen am 3'-Ende der TS-mRNA ausgerichtet sind und die sowohl für sich genommen zytostatisch bei Anwendung auf menschliche Tumorzellinien wirken, als auch die Toxizität von diesen Zellen verabreichten Antikrebsmedikamenten wie Tomudex^TM erhöhen. Im Gegensatz dazu bleiben Antisense-Oligodeoxynukleotide, die auf Sequenzen an oder nahe der Translationsendstelle am 5'-Ende der TS-mRNA ausgerichtet sind wirkungslos bzw. steigern die Zellvermehrung, wenn sie alleine verabreicht werden. Darüber hinaus induzieren Antisense-Nukleinsäuren, die auf diese 5'-Sequenzen (jedoch nicht auf 3'-Sequenzen) ausgerichtet sind, eine TS-Gentranskription. Die Erfindung betrifft auch ein Kombinationsprodukt, bestehend aus einem Antisense-Oligodeoxynuldeotid in Verbindung mit einem Antikrebswirkstoff wie Tomudex^TM (N-(5-[N-(3,4-Dihydro-2-methyl-4-oxochinazolin-6-ylmethyl)-N-methylamino]-2-thenoyl)-L-Glutaminsäure) oder der von Zeneca^TM entwickelten Substanz ZD 9331 ((S)-2-(2-Fluoro-4-[N-(4-hydroxy-2,7-dimethylchinazolin-6-ylmethyl)-N-(prop-2-ynyl)amino]benzamido)-4-(1H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)Buttersäure), sowie den Gebrauch eines solchen Kombinationsprodukts bei der Behandlung von Krebs.
Die Thymidylatsynthase (TS) (EC 2.1.1.45) katalysiert die Umwandlung von Deoxyuridylat in Thymidylat und ist ein Schlüsselenzym, das für die einzige zellinterne De-novo-Synthese von Thymidylat von großer Bedeutung ist (Danenberg, 1977). Die TS-Genexprimierung unterliegt strengen Regeln hinsichtlich des Zellzyklusabschnitts (Maley und Maley, 1960; Lochsin et al., 1979). Das TS-Gen ist Teil einer Gengruppe, deren Exprimierung an der G_i/S-Zellzyklusgrenze erhöht ist, und es wurde postuliert, dass die Transkription mehrerer S-Phasen-Gene (einschließlich Dihydrofolatreduktase und Thymidinkinase) teilweise durch die E2F-Familie der Transkriptionsfaktoren reguliert wird (Farnham et al., 1993; Mudrak et al., 1994). In der Tat induziert die Transfektion aktiver E2F1-Gene in Mauszellen die Exprimierung von TS und anderen S-Phasen- und zellzyklusgeregelten Genen (De Gregori et al., 1995). Während die Zellen den Zellzyklus von der G_o- bis zur S-Phase durchlaufen, erhöht sich der TS-mRNA-Spiegel auf ungefähr das 20-fache und die TS-Enzymaktivität steigt auf ca. das 10-fache (Navalgund et al., 1980). Die TS-Gentranskriptionsrate wird jedoch nur um das 2- bis 4-fache heraufreguliert, was darauf schließen läßt, dass Ereignisse nach der Transkription eine bedeutende Rolle in der TS-Regulation spielen (Ayusawa et al., 1986; Jenh et al., 1985; Johnson, 1994). Die Unterschiede in der TS-mRNA-Stabilität sind sehr wahrscheinlich nicht für die Regulierung bedeutend, da die TS-mRNA-Halbwertzeit ca. 8 Stunden sowohl in ruhenden als auch wachsenden Nagetierzellen beträgt (Jenh et al., 1985). Auf der anderen Seite scheint die TS-mRNA-Translation durch das TS-Protein selbst geregelt zu sein, das insbesondere an zwei Stellen innerhalb der eigenen mRNA eingreift, um die Proteinproduktion zu hemmen (Chu et al., 1991, 1993b, 1994; Voeller et al., 1995). Die Translation anderer mRNAs (einschließlich der c-myc-mRNA) kann auch durch Wechselwirkungen mit einem TS-Protein reguliert werden (Chu et al., 1995).
Aufgrund ihrer Rolle bei der Synthese von DNA-Vorläufern wurde die TS als mögliches Ziel für Chemotherapiewirkstoffe zur Krebsbekämpfung identifiziert (Hardy et al. 1987). Hohe TS-Spiegel korrelierten mit schlechten Prognosen bei Patienten mit Eierstockkrebs (Suzuki et al., 1994), Darmkrebs (Johnston et al., 1994), akuter nichtlymphoblastischer Leukämie im Kindesalter (Volm et al., 1994) sowie nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (Volm und Mattem, 1992). Der Prognosewert ist jedoch nicht bei allen Tumorarten hoch (Peters et al., 1986, 1994). Es wurden zwei Arten von TS-Hemmern entwickelt: (a) Nukleotidanaloga (einschließlich 5-FU und seiner Ribosid- und Deoxyribosid-Derivate), die innerhalb der Zellen zu 5-Fluorodeoxyuridylat (FdUMP) aktiviert werden müssen, um Wirkung zu zeigen (Heidelberger et al., 1983) und (b) 5,10-CH₂FH₄-Analoga (Antifolat-Analoga), einschließlich N-10-Propargyl-5,8-dideazafolat (CB3717) (Calvert et al., 1986) und Tomudex^TM (ZD 1694; N-[5-(N-[3,4-Dihydro-2-methyl-4-oxochinazolin-6-ylmethyl]-N-methylamino)-2-thenoyl]-L-Glutaminsäure) (Jackman et al., 1991a, 1991b). Obwohl Tomudex^TM und 5-FU die TS hemmen und starke zytotoxische und Antitumoraktivitäten aufweisen (Heidelberger et al., 1983; Keyomarsi et al., 1993), haben sie eine ungewöhnliche biochemische Wirkung. Bei Behandlung menschlicher Krebszelllinien mit 5-FU bzw. Tomudex^TM steigt der TS-Spiegel rapide an, was eventuell auf die Auflösung einer Translationshemmung durch das TS-Protein zurückzuführen ist (Keyomarsi et al., 1993; Chu et al., 1990; Chu et al., 1993a).
Es wurde vermutet, dass die Auflösung einer Translationshemmung, welche die Bindung und Deaktivierung der TS durch Chemotherapiewirkstoffe (einschließlich Tomudex^TM und 5-FU) begleitet, verhindert werden kann, indem die Zellen mit Wirkstoffen behandelt werden, die die spezielle Wechselwirkung zwischen der TS-mRNA und dem TS-Protein ersetzen und die Translation hemmen (Keyomarsi et al., 1993), jedoch wurden solche Wirkstoffe nicht beschrieben. In einem weiteren spekulativen Artikel wurde die Hypothese aufgestellt, dass Antisense-Nukleinsäuren, die sowohl zur Reduzierung der Regulationsfähigkeit der TS-mRNA für die Proteinproduktion als auch zur Wechselwirkung mit der TS-Protein-Bindestelle entworfen wurden, bei der Komplementierung der Wirksamkeit von auf TS ausgerichteten Medikamenten nützlich sein könnten (Rapaport et al., 1992).
Bei Ju, J. (Ju, J.: "Increased Drug Sensitivity of Tumor Cells by Manipulation of Cell Cycle Control Genes", 1996, Dissertation, University of Southern California, Seite 100-130) wurden die auf die Translationsinitiierungsstelle der Thymidylatsynthase(TS)-mRNA ausgerichteten Antisense-Oligonukleotide zur Hemmung der Translation in einem In-vitro-Translationssystem eingesetzt. Jedoch führte die Behandlung menschlicher Darmkrebs-HT29-Zellen mit Antisense-Oligodeoxynukleotiden zu einer Erhöhung der TS-Menge in den Zellen und verringerte deren Empfindlichkeit gegenüber 5-Fluoro-2'-Deoxyuridin (FdUrd). Im Gegensatz dazu reduzierte ein ein TS-Antisense-Genfragment (+1 bis +422) enthaltendes Plasmidkonstrukt, das dazu verwendet wurde, ein aus dem gleichen Bereich wie die getesteten Antisense-Oligonukleotide entnommenes Antisense-Produkt zu produzieren, die Exprimierung von TS-Protein und erhöhte die Empfindlichkeit der Zellen gegenüber FdUrd.
In früheren Patentanmeldungen, GB 9720107.3 und GB 9722012.3 legten wir offen, wie die Exprimierung der TS in menschlichen Brustkrebszellen (MCF-7) auf zwei Arten ausdrücklich herabreguliert werden kann. Zuerst transfizierten wir die Zellen sowohl transient als auch stabil mit Antisense-RNA-Moleküle exprimierenden Vektoren, die der Hybridisierung an drei verschiedenen Bereichen der TS-mRNA dienten.
Die Zielsequenzen waren: (1) Sequenzen, die an der Bildung einer mutmaßlichen die Translationsanfangsstelle umgebenden Stamm-Schleife-Struktur beteiligt sind, und unmittelbar daneben und 3' zu dieser Stelle liegen (diese Sequenzen sind auch an der Bindung von TS-Protein zur Modulation der Translation beteiligt), (2) die Exon1/Exon2-Grenze und (3) das 3'-Ende der reifen zytoplasmatischen mRNA. Antisense-TS-RNA wurde von diesen Vektoren exprimiert (überprüft durch Northern-Blot-Analyse und eine neuartige Modifizierung des Run-On-Transkriptionsassays zur Messung der Antisense-Transkription gegenüber konstitutiver TS-Genexprimierung) (Koropatnick et al., 1997). Dann transfizierten wir Zellen transient mit einzelsträngigen Oligodeoxynukleotiden, die auf die folgende Hybridisierung ausgerichtet waren: (a) die der Translationsanfangsstelle und der diese umgebenden Sequenzen, (b) die einer Sequenz proximal zur Translationsanfangsstelle, die an der vermeintlichen Stamm-Schleife-Struktur beteiligt ist, und (c) die der Translationsendstelle in der Nähe des 3'-Endes der reifen zytoplasmatischen RNA.
Die vorliegende Erfindung basiert auf unserer Erkenntnis, dass ein Antisense-Oligonukleotid, Oligo 83, das komplementär ist zur einer Sequenz im nicht-translatierten 3'-Bereich der T-mRNA, den TS-mRNA- und -Protein-Spiegel heabrregulierte, die Zellvermehrung hemmte und die Zytotoxizität durch TS-abhängige Chemoetherapiemedikamente erhöhte.
In einem ersten Aspekt der Erfindung schaffen wir ein Antisense-Oligodeoxyoligonukleotid, das an einer Ziel-Nukleinsäuresequenz in der Thymidylatsynthase hybridisiert und das die Produktion von Thymidylatsynthase in Säugetierzellen selektiv hemmt und nuklease-resistent ist. Die Oligonukleotide bestehen aus 8 bis 50 Nukleotiden und umfassen eine Nukleotidsequenz, die komplementär ist zur Sequenz an oder nahe der Translationsendstelle am 3'-Ende des TS-Gens, wobei die Sequenzen im Bereich zwischen den Basen 800 und 1536 liegen, wenn die Sequenznummerierung für menschliche Thymidylatsynthase-mRNA (cDNA) von Takeishi et al., 1985 verwendet wird. Die Sequenzen liegen bevorzugt im Bereich zwischen den Basen 1000 und 1530. Besonders bevorzugt liegen die Sequenzen im Bereich zwischen den Basen 1030 und 1460.
Ein Antisense-Oligodeoxyoligonukleotid ist ein Oligonukleotid, das dazu dient, an einen bestimmten Bereich einer Ziel-Nukleinsäurensequenz zu hybridisieren. Die Zielnukleinsäure ist das TS-Gen oder die für das TS-Gen transkribierte mRNA. Die Zielnukleinsäure ist bevorzugt die die mRNA-kodierende Thymidylatsynthase.
Die Auswirkungen von Antisense-Oligonukleotiden auf die Exprimierung der Thymidylatsynthase können mit dem Fachmann bekannten Verfahren gemessen werden. In der vorliegenden Anmeldung wurde die Auswirkung auf den mRNA-Spiegel mit der Northern-Blot-Analyse und dem Zellkern-Run-On-Transkriptionsassay gemessen, und die Auswirkung auf die Vermehrung menschlicher Tumorzellen wurde durch Zählung der Zellzahl mit einem Coulter-Zähler gemessen.
Antisense-Oligonukleotide gegen Thymidylatsynthase können die Exprimierung der Thymidylatsynthase hemmen, anregen oder ohne Auswirkung bleiben. Bevorzugte Antisense-Oligonukleotide sind jene, die die Exprimierung der Thymidylatsynthase hemmen.
Die Hemmung der Exprimierung der Thymidylatsynthase bedeutet hier eine mindestens 10%ige Hemmung bezogen auf die unbehandelte Kontrolle, gemessen am 4. Tag unter Verwendung des in Beispiel 1.2 beschriebenen Assays.
Die Hemmung der Thymidylatsynthase-Exprimierung beträgt bevorzugt mindestens 20% und besonders bevorzugt ist eine Hemmung von mindestens 40%.
Die Antisense-Oligonuldeotide haben bevorzugt eine Länge von ca. 8 bis ca. 50 Nukleotiden, besonders von ca. 12 bis ca. 40 Nukleotiden und besonders bevorzugt von ca. 16 bis ca. 30 Nukleotiden.
Einzelne Sequenzbeispiele der die Thymidylatsynthase-Aktivität regulierenden Antisense-Oligonukleotide sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Sequenzen der Antisense-Oligonukleotide, die die Thymidylatsynthase-Aktivität erfindungsgemäß laut Tabelle 1 hemmen, sind SEQ-ID Nr. 83 und Nr. 86. Die Bereiche der TS-mRNA, auf die die Oligonukleotide ausgerichtet sind, sind in 7 dargestellt. Tabelle 1:
Die Erfindung ist natürlich nicht nur auf diese bestimmten in Tabelle 1 aufgeführten, die Thymidylatesynthase-Produktion hemmenden Antisense-Oligonukleotide 83 und 86 beschränkt, sondern umfasst Oligonukleotide mit einer Länge von ca. 8 bis 50 Nukleotiden, die die Thymidylatsynthase-Produktion selektiv hemmen und die aus den oben beschriebenen Bereichen des TS-Gens gewählt werden.
Die Hybridisierung eines Antisense-Oligonukleotids an seiner Ziel-Nukleinsäuresequenz wird durch die Bildung von Wasserstoffbindungen zwischen komplementären Basen an jedem Nukleinsäurestrang vermittelt. Die Hybridisierung kann zwischen Nukleinsäuresträngen stattfinden, die je nach den angewandten Hybridisierungsbedingungen unterschiedliche Komplementaritäten aufweisen. Der Begriff „spezifisch hybridisierbar" dient der Beschreibung eines Oligonukleotids, dessen Komplementarität zur Gewährleistung einer stabilen, spezifischen Bindung an die Zielsequenz ausreicht, wobei eine unspezifische Bindung an Nicht-Zielsequenzen vermieden wird.
Antisense-Oligonukleotide können so aufgebaut sein, dass sie an jedem Bereich innerhalb des Thymidylatsynthase-mRNA-Moleküls hybridisieren, einschließlich dem Kodierungsbereich, dem 5' nicht-translatierten Bereich, dem 3' nicht-translatierten Bereich, dem 5'-Kappenbereich, den Intronen und Intron/Extron-Spleißstellen.
Die Hybridisierung des Antisense-Oligonukleotids an Thymidylatsynthase-mRNA kann sich auf alle Aspekte der mRNA-Funktion auswirken, zum Beispiel auf die mRNA-Translokation, das mRNA-Spleißen, die mRNA-Translation oder den Rückkoppel-Hemmmechanismus, durch durch die Bindung des Thymidylatsynthase-Proteins an die Bindestellen innerhalb des Thymidylatsynthase-mRNA-Moleküls reguliert wird.
Ein Oligonukleotid ist ein aus Nukleotid- oder Nukleosidmonomeren aufgebautes polymeres Molekül. Die Monomere können aus natürlich auftretenden Basen, Zuckern und Zwischenzuckerbindungen bestehen oder können auch nicht natürlich auftretende Derivate enthalten, die die Eigenschaften der Oligonukleotide verändern. Beispielsweise wurden mit Phosphorothioat modifizierte Oligonukleotide in der vorliegenden Anmeldung verwendet, um die Resistenz gegen Nukleaseabbau zu erhöhen.
Bevorzugte Oligonukleotide können Phosphothioate, Phosphotriester, Methylphosphonate oder kurzkettige Alkyl-, Cycloalkyl- oder Heteroatom-Zwischenzucker-Bindungen enthalten. Weitere bevorzugte Oligonukleotide können von Methoxyethoxy flankiert sein oder eine Peptidnukleinsäure-Hauptkette enthalten. Besonders bevorzugte Oligonukleotide enthalten Phosphorothioate (Summerton, J.E. und Weller, D.D., US-Patentnr. 5,034,506 ).
Die Oligonukleotide können durch Anwendung aller gängigen Syntheseverfahren hergestellt werden.
Beispiele solcher Verfahren finden sich in Standardlehrbüchern, wie z. B. "Protocols for Oligonucleotides and Analogues; Synthesis and Properties," Methods in Molecular Biology Series; Band 20; Hrsg. Sudhir Agrawal, Humana ISBN: 0-89603-247-7; 1993; 1. Auflage.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Rezeptur zur Verfügung gestellt, die ein Antisense-Oligonukleotid, das auf die oben beschriebene Thymidylatsynthase ausgerichtet ist, in einem pharmazeutisch zulässigen Verdünnungsmittel oder Träger enthält.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren für die Behandlung von Krebs (oder ein Verfahren für die Schaffung einer antiproliferativen Wirkung) geschaffen, das die Anwendung einer wirksamen Menge eines auf die oben beschriebene Thymidylatsynthase ausgerichtetes Oligonukleotids bei einem warmblütigen Tier umfasst, was jedoch nicht Teil der Erfindung darstellt. Die Erfindung sieht auch den Gebrauch eines solchen Oligonukleotids in der Herstellung eines neuen Medikaments für die Behandlung von Krebs (oder für die Behandlung einer proliferativen Krankheit) vor.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Kombinationsprodukt zur Verfügung gestellt, das ein auf die Thymidylatsynthase ausgerichtetes Antisense-Oligonukleotid in Verbindung mit einem Antikrebswirkstoff enthält. Das Antisense-Oligonukleotid und der Antikrebswirkstoff können jeweils separat, aufeinanderfolgend, gleichzeitig oder in einem Gemisch verabreicht werden.
Der Antikrebswirkstoff kann drei Hauptkategorien eines therapeutischen Mittels abdecken:

(B) Thymidylatsynthasehemmer wie Tomudex^TM (N-(5-[N-(3,4-Dihydro-2-methyl-4-oxochinazolin-6-ylmethyl)-N-methylamino]-2-thenoyl)-L-Glutaminsäure) ( europäische Patentanmeldung Nr. 0239362 , Beispiel 7, darin Verbindung Nr. 8); das Entwicklungsprodukt von Zeneca^TM ZD9331 ((S)-2-(2-Fluoro-4-[N-(4-hydroxy-2,7-dimethylquinazolin-6-ylmethyl)-N-(prop-2-ynyl)amino]benzamido)-4-(1H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)Buttersäure) ( europäische Patentanmeldung Nr. 0562734 , darin Beispiel 3); LY 231514 (Eli Lilly Research Labs, Indianapolis, IN); 1843U89 (Glaxo-Wellcome, Research Triangle Park, NC); AG337 und AG331 (beide von Agouron, La Jolla, CA) (Touroutoglou und Pazdur, Clin. Cancer Res., 2, 227-243, 1996).
(C) Zytostatika wie Antiöstrogene (zum Beispiel Tamoxifen, Toremifen, Raloxifen, Droloxifen, Idoxifen), Progestogene (zum Beispiel Megestrolazetat), Aromatase-Hemmer (zum Beispiel Anastrozol, Letrozol, Vorozol, Exemestan), Antiprogesterone, Antiandrogene (zum Beispiel Flutamid, Nilutamid, Bicalutamid, Cyproteronazetat), LHRH-Agonisten und Antagonisten (zum Beispiel Goserelinacetat, Leuprolid), Hemmer von Testosteron-5α-Dihydroreduktase (zum Beispiel Finasterid), Anti-Invasivmittel (zum Beispiel Metalloproteinase-Hemmer wie Marimastat und Hemmer der Urokinase-Plasminogen-Aktivator-Rezeptor-Funktion) und Hemmer der Wachstumsfaktorfunktion (solche Wachstumsfaktoren umfassen z. B. EGF, FGFs, den Plättchenwachstumsfaktor und Leberzellen-Wachstumsfaktor, solche Hemmer umfassen Wachstumsfaktorantikörper, Wachstumsfaktor-Rezeptor-Antikörper, Tyrosinkinase-Hemmer und Serin-/Threoninkinase-Hemmer).
(D) antiproliferative/antineoplastische Medikamente und Kombinationen davon, wie sie in der Onkologie eingesetzt werden, z. B. Antimetabolite (zum Beispiel Antifolate wie Methotrexat, Fluoropyrimidine wie 5-Fluorouracil, FUdR, ftorafur, FdUR, Purin- und Adenosin-Analoga, Zytosinarabinosid); Antitumor-Antibiotika (zum Beispiel Anthracycline wie Doxorubicin, Daunomycin, Epirubicin und Idarubicin;) Mitomycin-C, Dactinomycin, Mithramycin; Platinderivate (zum Beispiel Cisplatin, Carboplatin, Oxaliplatin); Alkyliermittel (zum Beispiel Stickstoffsenfgas, Melphalan, Chlorambucil, Busulphan, Cyclophosphamid, Ifosfamid, Nitroharnstoffe, Thiotepa); Mitosehemmer (zum Beispiel Vincaalkaloide wie Vincristin und Taxoide wie Taxol, Taxoter); Topoisomerase-Hemmer (zum Beispiel Epipodophyllotoxine wie Etoposid und Teniposid, Amsacrin, Topotecan).

Die Antikrebsbehandlung kann auch eine Strahlentherapie sein. Besonders bevorzugte Antikrebswirkstoffe sind Thymidylatsynthase-Hemmer wie z. B. Tomudex^TM (N-(5-[N-(3,4-Dihydro-2-methyl-4-oxochinazolin-6-ylmethyl)-N-methylamino]-2-thenoyl)-L-Glutaminsäure) ( europäische Patentanmeldung Nr. 0239362 , Beispiel 7, darin Verbindung Nr. 8) und das Entwicklungsprodukt von Zeneca^TM ZD9331 ((S)-2-(2-Fluoro-4-[N-(hydroxy-2,7-dimethylquinazolin-6-ylmethyl)-N-(prop-2-ynyl)amino]benzamido)-4-(1H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl)Buttersäure) ( europäische Patentanmeldung Nr. 0562734 , darin Beispiel 3).
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Rezeptur zur Verfügung gestellt, mit einem Kombinationsprodukt wie oben beschrieben und einem pharmazeutisch zulässigen Verdünnungsmittel oder Träger.
Alle oben beschriebenen pharmazeutischen Rezepturen können in einer Form vorliegen, die geeignet sind zur oralen Anwendung, zum Beispiel als Tablette, Kapsel, wässrige oder ölige Lösung, Suspension oder Emulsion; zur äußerlichen Anwendung, wie z. B. als Creme, Salbe, Gel oder wässrige oder ölige Lösung oder Suspension; zur nasalen Anwendung, wie z. B. als Schnupfmittel, Nasenspray oder Nasentropfen; zur vaginalen oder rektalen Anwendung, wie z. B. als Suppositorium; zur Anwendung durch Inhalieren, wie z. B. als feines Pulver wie Trockenpuder, in mikrokristalliner Form oder als flüssiges Aerosol; zur sublingualen oder bukkalen Anwendung, wie z. B. als Tablette oder Kapsel; oder insbesondere zur parenteralen Anwendung (einschließlich intravenöser, subkutaner, intramuskulärer, intravaskulärer oder Infusionsanwendung), wie z. B. als sterile wässrige oder ölige Lösung oder Suspension. Im Allgemeinen können die oben beschriebenen Rezepturen mit einer gängigen Methode unter Anwendung gängiger Trägerstoffe hergestellt werden.
Tomudex^TM wird bei Personen bequem verabreicht durch intravenöse Injektion einer sterilen wässrigen Lösung mit einer Dosis im Bereich von z. B. 1 bis 4 mg/m² Körperfläche alle drei Wochen, vorzugsweise mit einer Dosis von 3 mg/m² alle drei Wochen.
ZD 9331 wird bei Personen bequem verabreicht durch orale Einnahme einer festen Darreichungsform oder durch intravenöse Injektion einer sterilen wässrigen Lösung. Die orale Darreichungsform wird bei Menschen bequem verabreicht in einer Gesamtdosis im Bereich von z. B. 1 bis 100 mg/kg (d.h. ca. 35 mg/m² bis 3,5 g/m²) alle drei Wochen, entweder kontinierlich oder in Abständen, z. B. mit einem Dosierplan mit dreiwöchentlichem Dosierzyklus mit Tagesdosen an den Tagen 1 bis 5, gefolgt von dosenfreien Tagen bis zum nächsten Dosierzyklus, oder mit einem Dosierplan mit vierwöchentlichem Dosierzyklus mit Tagesdosen an den Tagen 1 bis 14, gefolgt von dosenfreien Tagen bis zum nächsten Dosierzyklus. Die orale Darreichungsform wird bei Menschen mit einer Gesamtdosis im Bereich von z. B. 1 bis 30 mg/kg pro drei- oder vierwöchigem Dosierzyklus verabreicht. Die sterile wässrige Lösung wird bei Menschen bequem verabreicht mit einer Gesamtdosis von bis zu 100 mg/m² alle drei Wochen, entweder kontinuierlich oder in Abständen, zum Beispiel mit einem Dosierplan mit einer Dosis pro dreiwöchentlichem Dosierzyklus, einem Dosierplan mit dreiwöchentlichem Dosierzyklus mit Tagesdosen an den Tagen 1 bis 5, gefolgt von dosenfreien Tagen bis zum nächsten Dosierzyklus, einem Dosierplan mit dreiwöchentlichem Dosierzyklus mit Dosen an den Tagen 1 und 8, gefolgt von dosenfreien Tagen bis zum nächsten Dosierzyklus, oder einem Dosierplan mit dreiwöchentlichem Dosierzyklus mit kontinuierlicher Infusion an den Tagen 1 bis 5, gefolgt von dosenfreien Tagen bis zum nächsten Dosierzyklus. Die sterile wässrige Lösung wird Menschen bevorzugt intravenös verabreicht mit einer Gesamtdosis im Bereich von Z. B. 20 bis 50 mg/m² alle drei Wochen, entweder kontinuierlich oder in Abstanden wie oben beschrieben.
Das Antisense-Oligonukleotid wird bei Menschen bequem durch intravenöse Injektion einer sterilen wässrigen Lösung mit einer Dosis pro Dosierzyklus im Bereich von z. B. 0,1 μg bis 1 g, bevorzugt mit einer Dosis zwischen 1 mg und 100 mg, verabreicht.
Die mit einem oder mehreren Trägerstoffen kombinierte Menge des Wirkstoffs zur Herstellung angemessener Darreichungsformen schwankt selbstverständlich je nach den bestimmten Bestandteilen des Kombinationsprodukts, dem behandelten Wirt und der bestimmten Verabreichungsmethode. Eine Rezeptur, die z. B. zur oralen Verabreichung bei Menschen bestimmt ist, enthält im allgemeinen z. B. zwischen 0,5 μg und 2 g Wirkstoff gemischt mit entsprechenden und angemessenen Mengen der Trägerstoffe, die zwischen 5 und 98 Gewichtsprozent der gesamten Rezeptur schwanken können. Eine Rezeptur zur parenteralen Verabreichung bei Menschen enthält typischerwise zwischen 0,1 μg und 50 mg. In Dosierungseinheiten abgegebene Darreichungsformen enthalten typischerweise ca. 1 μg bis 500 mg eines Wirkstoffs.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren für die Behandlung von Krebs (oder ein Verfahren für die Schaffung einer antiproliferativen Wirkung) geschaffen, das die Anwendung einer wirksamen Menge eines Kombinationsprodukts wie oben beschrieben bei einem warmblütigen Tier umfasst, was jedoch nicht Teil der Erfindung ist.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Kombinationsprodukts bei der Herstellung eines neuen Medikaments für die Behandlung von Krebs (oder für die Behandlung einer proliferativen Krankheit) zur Verfügung. Die in dieser Anmeldung verwendeten Abkürzungen sind unten aufgeführt.

TS: Thymidylatsynthase
CMV: Zytomegalievirus
5-FU: 5-Fluorouracil
LFA: Lipofektamin
PBS: phosphatgepufferte Kochsalzlösung
GAPDH: Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
FBS: Fötales Rinderserum
MT: Metallothionein
ODN: Oligodeoxynukleotid
bp: Basenpaar
DMEM: Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium
Oligo: Oligonukleotid

Die Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und Figuren beschrieben, jedoch hierdurch nicht eingegrenzt. Es zeigen:
1, dass die Vermehrung von MCF7-Zellen durch Transfektion mit Antisense-TS-Oligo 86 (auf die Translationsendstelle ausgerichtet) gehemmt wird, jedoch durch Transfektion mit Antisense-TS-Oligo 90 oder 92 (auf die Sequenzen an oder nahe der Translationsanfangsstelle ausgerichtet) erhöht wird.
Die Zellen wurden transient transfiziert mit 0,5 oder 1,0 μM Antisense-TS-Oligonukleotiden in Lipofektin^TM wie oben beschrieben. Die Zellzahlen wurden mit einem Coulter-Zähler in drei Glaskolben pro Ansatz nach viertägigem Wachstum bestimmt. Die Kontrollzellen wurden mit Lipofektin ohne Oligonukleotide behandelt.
Die Zellvermehrung wird als Prozent bezogen auf die Vermehrung der Kontrollzellen ausgedrückt.

*: signifikant höher als die Kontrolle (p < 0,05, einfache Analyse der Varianten),
**: signifikant niedriger als die Kontrolle (p < 0,05, einfache Analyse der Varianten),

2, dass die Vermehrung von HeLa-Zellen durch Transfektion mit Antisense-TS-Oligo 86 (auf die Translationsendstelle ausgerichtet) gehemmt wird, jedoch durch Transfektion mit Antisense-TS-Oligo 91 (auf die Translationsanfangsstelle ausgerichtet) erhöht wird.
HeLa-Zellen wurden mit 0,05 oder 0,10 μM Antisense-TS-Oligonukleotiden in Lipofektin^TM (10 μg/ml) vier Stunden lang wie beschrieben transfiziert. Es sei anzumerken, dass die Oligokonzentrationen weit unter denen für die MCF7-Zellen lagen. Die Wirksamkeit einer Lipofektin^TM-vermittelten DNA-Transfektion von HeLa-Zellen ist höher als bei MCF7-Zellen. Das Lipofektin^TM wurde entfernt, die Zellen wurden trypsiniert und 25.000 Lebendzellen pro Glaskolben wurden in Gewebekulturkolben gegeben. Die Zellzahlen wurden mit einem Coulter-Zähler in drei Glaskolben pro Ansatz nach 4-, 7- und 8-tägigem Wachstum bestimmt. Die Kontrollzellen wurden mit Lipofektin^TM ohne Oligonukleotide behandelt. Die Zellvermehrung wird als Prozent bezogen auf die Vermehrung der Kontrollzellen ausgedrückt.

*: signifikant höher als die Kontrolle (p < 0,05, t-Test),
**: signifikant niedriger als die Kontrolle (t-Test).

3 zeigt, dass die Vermehrung von HeLa-Zellen durch Transfektion mit Antisense-TS-Oligo 83 (auf eine 3' nicht-translatierte der Translationsendstelle nachgelagerten Sequenz ausgerichtet) gehemmt wird, jedoch von der Transfektion mit Antisense-TS-Oligo 81 (auf eine Sequenz im 3' nicht-translatierten Bereich der TS-mRNA ausgerichtet) nicht betroffen wird.
Die Versuchsdurchführung war wie in der Legende zu 2 beschrieben.
4 zeigt, dass die transiente Transfektion von HeLa-Zellen mit Oligo 86 (auf die TS-Translationsendstelle ausgerichtet) die Empfindlichkeit gegenüber Tomudex^TM erhöht und dass Oligo 91 (auf die TS-Translationsanfangsstelle ausgerichtet) die Empfindlichkeit gegenüber Tomudex^TM reduziert.
HeLa-Zellen wurden mit 0,05 und 0,10 μM Antisense-TS-Oligonukleotiden transfiziert und in Glaskolben bei niedriger Dichte gegeben, wie für 2 beschrieben. Es wurde Tomudex (0-8 nM) hinzugegeben (drei Glaskolben für jede Tomudex^TM-Konzentration), und die Zellen vermehrten sich 7 Tage lang. Die Zellzahl wurde zu diesem Zeitpunkt mit einem Coulter^TM-Zähler bestimmt. Die Überlebensrate ist grafisch als Prozentzahl der Vermehrung in mit Oligonukleotid transfizierten, jedoch nicht mit Tomudex^TM behandelten Zellen dargestellt. Somit zeigen diese Daten die Hemmung bzw. Erhöhung der Tomudex^TM-Wirkung unabhängig von der von Oligonukeotiden induzierten Vermehrungshemmung oder -steigerung in Abwesenheit von Tomudex^TM. Es sind die drei Mittelwerte dargestellt. Die Fehlerbalken waren jeweils kleiner als die Größe der Symbole. *: signifikant abweichend von der Kontrolle (p < 0,05, t-Test),
5 zeigt, dass die transiente Transfektion von HeLa-Zellen mit Oligo 83 (auf eine Sequenz im 3' nicht-translatierten Bereich der TS-mRNA ausgerichtet) die Empfindlichkeit gegenüber Tomudex^TM erhöht, während Oligo 81 (ausgerichtet auf eine 3' Sequenz, die derjenigen nachgelagert ist, auf die Oligo 83 ausgerichtet ist) die Empfindlichkeit gegenüber Tomudex^TM reduziert.
HeLa-Zellen wurden mit 0,10 μM Antisense-TS-Oligonukleotiden transfiziert und in Glaskolben bei niedriger Dichte gegeben, wie für 2 beschrieben. Es wurde Tomudex (0-10 nM) hinzugegeben (drei Glaskolben pro Tomudex^TM-Konzentration), und die Zellen vermehrten sich 4 Tage lang. Die Zellzahl wurde zu diesem Zeitpunkt mit einem Coulter^TM-Zähler bestimmt. Die Überlebensrate ist grafisch als Prozentzahl der Vermehurng in mit Oligonukleotid transfizierten, jedoch nicht mit Tomudex^TM behandelten Zellen dargestellt. Somit zeigen diese Daten die Erhöhung der Tomudex^TM-Abtötung unabhängig von der von Oligonukleotiden induzierten Vermehrungshemmung in Abwesenheit von Tomudex^TM auf. Es sind die drei Mittelwerte dargestellt. Die Fehlerbalken waren jeweils kleiner als die Größe der Symbole.

*: signifikant abweichend von der Kontrolle (p < 0,05, t-Test),

6 zeigt, dass Antisense-TS-Oligo 91, jedoch nicht Oligo 86, die TS-Gen-Transkription in menschlichen HeLa-Zellen stimuliert.
Die gleichen HeLa-Zellen, deren Daten in 2 dargestellt sind, wurden auf die Run-On-Transkription der Gene für TS, Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) und 18S-rRNA untersucht. Kurz gesagt, wurden die Zellen wurden mit 0,05 und 0,10 µM Antisense-TS-Oligonukleotiden in Lipofektin^TM (10 µg/ml) oder nur mit Lipofektin^TM (LFA-Kontrolle) 4 Stunden lang wie beschrieben transfiziert. Das Lipofektin^TM wurde entfernt, und die Zellen wurden trypsiniert und in Gewebekulturglaskolben gegeben. Vier Tage nach der Transfektion wurden die Zellkerne von ungefähr 5 × 10⁶ Zellen pro Behandlung isoliert und die begonnenen TS-, GAPDH- und 18S-rRNA-Transkripte durften [³²P]-CTP 30 Minuten lang einbauen. Mit Alkohol fällbare, radioaktiv markierte RNA wurde 48 Stunden an unmarkierte TS-, GAPDH- und 18S-rRNA- cDNA hybridisiert, in je drei Punkten auf einer Nylonmembran immobilisiert. Die relative Transkriptionsrate wird wie folgt dargestellt:
7 zeigt Teile der Sequenz menschlicher mRNA (cDNA) für Thymidylatsynthase (EC 2.1.1.45), Basen 1 bis 1536.
8 zeigt, dass Antisense-TS-ODN 83 die Proliferation von HeLa-Zellen hemmt. Die Zellproliferation von mit 50 nM Antisense-TS-ODN 83 (•) oder 50 nM scrambled-Kontroll-ODN 32 (o) transfizierten HeLa-Zellen wurde 1, 2, 5 und 6 Tage nach der Transfektion bestimmt. Die Datenpunkte zeigen den Durchschnittswert aus zwei Bestimmungen an und sind repräsentativ für qualitativ ähnliche Ergebnisse, die in 16 unabhängigen Experimenten ermittelt wurden.
9 zeigt, dass Antisense-TS-ODN 83 die Vermehrung von HeLa-Zellen nach der Transfektion unterdrückt, gefolgt von einer Erholung bis zur Kontrollproliferationsrate nach 48 Stunden. HeLa-Zellen wurden mit 50 nM Antisense-TSODN 83 oder 50 nM scrambled-Kontroll-ODN 32 wie in der Legende zu 1 beschrieben transfiziert. Die mit den mit ODN 32 transfizierten Zellen erhaltenen Werte wurden auf 100 % normiert, und jeder Balken zeigt die Prozente dieses gemessenen Werts nach Behandlung mit ODN 83 (Mittelwert +- SE aus 4 unabhängigen Experimenten). Sterne (*) bezeichnen signifikante Abweichungen (p < 0,02, t-Test),
10 & 11 zeigen, dass die Behandlung von HeLa-Zellen mit ODN 83 zu niedrigeren TS-mRNA-Spiegeln führt.
(10) HeLa-Zellen wurden mit ODN 83 oder scrambled-Kontroll-ODN 32 transfiziert oder nur mit Lipofektamin behandelt. Die Zellen wurden 1, 2 und 4 Tage nach der Transfektion geerntet und die Gesamtzell-RNA wurde isoliert, revers transkribiert und die TS- und GAPDH-cDNA wurde durch 24 PCR-Zyklen im gleichen Reaktionsgefäß amplifiziert. RT/PCR-Produkte von TS (208 bp) und GAPDH (752 bp) wurden mit der Southern-Blot-Analyse und Hybridisierung an spezifischen radioaktiv markierten Sonden bestätigt.
(11) TS:GAPDH-Verhältnis von RT/PCR-Produkten aus von HeLa-Zellen 1 Tag nach der Transfektion mit ODN 83 oder ODN 32 isolierter RNA. Es wurden 24, 25, 26 oder 27 Zyklen der PCR-Amplifizierung durchgeführt, die die gleiche Reduzierung des TS-GAPDH-Verhältnisses nach der Transfektion mit ODN 83 ergaben.
12 zeigt, dass die TS-Proteinspiegel (abgeleitet durch Messungen der 5-FdUMP-Bindung) durch Antisense-TS-ODN 83 zurückgingen, nicht jedoch durch das scrambled-Kontroll-ODN 32. Die Bindung von 5-FdUMP wurde in mit ODN 83 (schraffierte Balken) oder ODN 32 (offene Balken) transfizierten Zellen zu verschiedenen Zeit nach der Transfektion bestimmt.

(A) Die Ergebnisse sind als Prozent der 5-FdUMP-Bindung in mit Kontroll-ODN 32 +- SE transfizierten Zellen dargestellt (n=5). Die Werte für ODN 32 (n=5) wurden auf 100 % normiert und sind ohne Fehlerbalken dargestellt.
(B): Die Ergebnisse sind als gebundene pmol 5-FdUMP pro mg Gesamtprotein (× 10^–3) dargestellt, um aufzuzeigen, dass die Transfektion mit Kontroll-ODN 32 keine beachtliche Auswirkung auf die TS-Proteinspiegel hatte. Die Fehlerbalken geben den in einem t-Test berechneten Fehler an. Sie zeigen Fehler aufgrund von Unterschieden in den experimentellen Bedingungen in den 5 Messungen auf, die an unterschiedlichen Tag gemacht wurden, sowie aufgrund von Unterschieden aufgrund Transfektion mit unterschiedlichen ODNs. Die Sterne kennzeichnen signifikante Abweichungen (p < 0,02), die durch Anwendung eines gepaarten t-Tests bestimmt wurden.

13 zeigt, dass Antisense-TS-ODN 83 HeLa-Zellen gegenüber einer toxischen Wirkung von 5-FU, 5-FudR, Tomudex^TM und MTX sensibilisiert, nicht jedoch gegenüber Cisplatin oder Chlorambucil. HeLa-Zellen wurden mit ODN 83 (•) oder Kontroll-ODN 32 (o) transfiziert und mit unterschiedlichen Konzentration von 5-FU (A), 5-FudR (B), Tomudex^TM (C), MTX (D), Cisplatin (E) oder Chlorambucil (F) 4 Tage lang beginnend 24 Stunden nach der Transfektion behandelt. Datenpunkte sind als +- SE Mittelwerte aus 4 Messungen dargestellt. Falls Fehlerbalken nicht erscheinen, sind sie durch das Symbol verdeckt. Sterne (*) bezeichnen signfikante Abweichungen [p] < 0,02, t-Test.
Beispiel 1
Beispiel 1.1: Experimentelle Verfahren
Zellkultur:
MCF7-Zellen (menschliche Brustadenokarzinomzellen) wurde in mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM Glutamin, 10 mM Hepes (pH 7,4) und 0,1 % Gentamycin angereichertem DMEM kultiviert.
Vektorherstellung:
Die Expressionsvektoren pAS/TSS und pAS/exon1, 2 wurde so entworfen, dass sie nach der Transfektion in MCF7-Zellen einzelsträngige Antisense-RNA-Moleküle produzierten, die doppelsträngige 30-bp-Oligonukleotide enthielten, die an einer von zwei Stellen komplementär zu der TS-mRNA waren. Es wurden jeweils einem Strang der menschlichen TS-cDNA entsprechende Oligodeoxynukleotide in den Stellungen 111 bis 140 (pAS, TSS; ausgerichtet auf einen 30-bp-Bereich neben oder 2 bp entfernt von der Translationsanfangsstelle) bzw. 296 bis 325 (pAS/Exon1,2; ausgerichtet auf einen 30-bp-Bereich, der sich über die Exon1/Exon2-Grenze erstreckt) synthetisiert. Die Nummerierung der Basen wurde gemäß der GenBank-Identifizierungsnr. X02308 (Takeishi et al., 1985) durchgeführt. Um das Klonen zu erleichtern wurden sechs zusätzliche Nukleotide (5 am 5'-Ende, 1 am 3'-Ende) jedes Oligodeoxynukleotids eingebracht, um klebrige Hind-III- oder Xba-I-Enden herzustellen, wenn komplementäre Stränge angelagert wurden. Einzelsträngige Oligonukleotide (jeweils 4 mg) wurden in 3X SET (450 mM Nad, 60 mM Trish-HCl, 3 mM EDTA, pH 7,8) angelagert, indem die Mischung 5 Minuten lang bei 90 °C, 5 Minuten bei 50 °C und dann 16 Stunden bei 25 °C behandelt wurde. Doppelsträngige Produkte wurde mit Hilfe der Gelelektrophorese identifiziert und direktional in die Hind-III- und Xba-I-Stellen von pRC/CMV eingesetzt (Invitrogen Corp., San Diego, CA). Die Klonierungsrichtung wurde durch direkte Sequenzierung bestätigt.
Oligodeoxynukleotide:
Komplett mit Phosphorothioat substituierte 20mere Oligonukleotide (ODN) wurden von Isis Pharmaceuticals (Carlsbad, CA) synthetisiert. Die 6 endständigen Nukleotide am 5'- und 3'-Ende jedes ODN wurde 2'-Methoxyethoxy-modifiziert, um sie gegenüber intrazellulären Nukleasen widerstandsfähig zu machen und ihre Stabilität innerhalb der Zellen zu erhöhen (M'Kay et al., 1996), die internen 8 Nukleotide ohne Methoxyethoxy-Gruppen waren jedoch anfällig für RNase-H-Spaltung. Oligo 86 war komplementär zur TS-mRNA zwischen Rasenstellungen 1035 und 1054 (GenBank-Identifizierungsnr. X02308, Takeishi et al., 1985), die die TS-mRNA-Translationsendstelle umgeben (UAG an Basen 1045 bis 1047). Oligo 90 war komplementär zu den Hasenstellungen 111 bis 130, die am 3'- und proximalen Ende zur Translationsanfangsstelle liegen (AUG an Basen 106 bis 109). Oligo 92 war komplementär zu den Rasenstellungen 101 bis 120, einschließlich und um die Translationsanfangsstelle.
Transfektion:
Antisense-RNA-Expressionsvektoren wurden in MCF7-Zellen unter Verwendung von Lipofektamin (GIBCO BRL, Burlington, ON, Kanada), einer kationischen Liposomrezeptur, transfiziert. 1,5 × 10⁶ Zellen wurden in 100 × 15 mm Gewebekulturplatten gegeben und über Nacht zur Anhaftung stehengelassen. Die Zellen wurden einmal mit 3 ml OptiMEM (GIBCO BRL, Burlington, ON, Kanada) gewaschen und daraufhin 6 ml einer Mischung aus einer doppelsträngigen Expressionsvektor-DNA (0,83 µg/ml) mit Lipofektamin (1,67 µg/ml) in OptiMEM 6 Stunden lang bei 370 °C in einem 5 %igen CO₂-Brutschrank ausgesetzt. Das DNA-/Lipofektamin-Gemisch wurde entfernt und mit 10 ml DMEM mit Zusatzmitteln ersetzt. Die Kontrollzellen wurden mit einem pRC/CMV-Vektor ohne Einsatz transfiziert. Transient transfizierte Zellen wurden innerhalb von 1 bis 6 Tagen aufgebraucht. Stabil transfizierte Zellen ließ man zur Erholung in einem nicht-selektiven Komplettmedium ohne Geneticin 48 Stunden lang stehen, woraufhin die Zellen in der Gegenwart von Geneticin (400 µg pro ml, Aktivform [Gibco/BRL]) wuchsen, um eine Selektion der die pRC/CMV-Kontrollvektoren tragenden Kolonien oder der pRC/CMV-Vektoren zu ermöglichen, die RNA komplementär zu den die Translationsanfangsstelle umgebenden Sequenzen exprimieren (pAS/TSS). Einzelsträngige Oligodeoxynukleotide (0,5 µM oder 1,0 µM) wurden transient in 1,5 × 10⁶ von auf 100 × 15 mm Gewebekulturplatten haftenden MCF7-Zellen transfiziert, mit einem Gesamtvolumen von 5 ml in der Gegenwart von Lipofektamin (2 µg/ml) in OptiMEM. Die Kontrollzellen wurden mit Lipofektamin/OptiMEM ohne zusätzliche DNA behandelt. Die Zellen wurden nach 6 Stunden gewaschen, das Medium sowie die Zusatzstoffe wurden wie oben beschrieben hinzugegeben, und dann ließ man sie 48 Stunden vor Isolation der Zellkerne für Run-On-Transkriptionsmessungen wachsen.
Southern-Blot-Analyse:
Die Gesamt-DNA wurde aus pAS/TSS-transfizierten Zellen wie folgt isoliert. Die Zellen wurden in Lysepuffer (50 mM Tris-HCl [ph 8,0], 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% Natriumdodecylsulfat, 0,5 mg/ml Proteinase K) 6 Stunden lang bei 55 °C bebrütet. Ein Drittel des Volumens an 6 M NaCl wurde hinzugegeben, um Nicht-Nukleinsäuren durch 15-minütiges Zentrifugieren bei 10.000 X g zu fällen. Die DNA im Überschuss wurde in Isopropanol ausgefällt und mit 70 %igem Ethanol gewaschen. Die DNA wurde mit Hind III 16 Stunden lang gespalten und mit der Southern-Blot-Methode analysiert (Sambrook et al., 1989). Die Blots wurde mit einer mit einem zufallsverteilt bindenden (α^–32P]dCTP-Primer markierten pAS/TSS-Sonde (Church und Gilbert, 1984) hybridisiert, einem Leuchtschirm ausgesetzt und mit einem PhosphorImager^TM und dem ImageQuant^TM-Programm (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) quantifiziert. Die Nylonmembranen wurden entfernt und mit einer Alu-Sonde (300 bp eines menschlichen Alu-Restriktionsfragments in pBR322 eingesetzt [Jelinek et al., 1980]) rehybridisiert, um die Menge der menschlichen DNA in den einzelnen Spuren zu quantifizieren (Koropatnick et al., 1988).
Northern-Blot-Analyse:
Die RNA wurde mit RNeasy^TM-Säulen (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) von den mit dem pAS/TSS-Expressionsvektor transfizierten Zellen isoliert. Pro Spur wurden 10 oder 15 µg RNA auf einem 1,4 %igen Formaldehydgel (Sambrook et al., 1989) getrennt und auf eine Hybond^TM-N-Nylonmembran übertragen. Die Membranen wurden entweder mit einem pAS/TSS-erzeugten, zur Bindung an Antisense-RNA entworfenen Riboprobe-System (Promega Corp., Madison, WI) oder mit einem primer-markierten 1,9-kb-XHO-I-Fragment aus pcHTS-1 (einem die menschliche TS-cDNA enthaltendem eukaryoten Expressionsvektor: ein großzügiges Geschenk von Dr. K. Takeishi, University of Shizuoka, Shizuoka, Japan) (Takeishi et al., 1985) hybridisiert (Church und Gilbert, 1984). Die Blots wurden entfernt und mit cDNA-Sonden zum Nachweis von ribosomaler 18S-RNA oder Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) rehybridisiert. Die Bilder wurden mit einem PhosphorImager^TM (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) quantifiziert.
Isolierung der Zellkerne:
Die relative Transkriptionsrate wurde mit einem Zellkern-Run-on-Assay (Koropatnick et al., 1997), einer Modifizierung der Verfahren nach Kikuchi et al., (1992) und Almendral et al. (1988), bestimmt.
Naszierende Transkripte wurden in vitro (Marzluff und Huang, 1984) in parallelen Reaktionen mit MCF5-Zellkernen verlängert, die 48 Stunden nach der transienten Transfektion mit Kontroll- oder Antisense-TS-RNA-Expressionsvektoren oder einzelsträngigen Antisense-TS-Oligodeoxynukleotiden (oder nur mit Lipofektamin) isoliert wurden, und von mit Antisense-RNA-Expressionsvektoren stabil transfizierten Zellen. Die anhaftenden Zellen wurde zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen, mit einem Gummiwischer abgeschabt, in PBS pelletiert (5 Minuten 500 X g) und durch 5-minütige Inkubation bei 4 °C in 4 ml Lysepuffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 0,5 % NP-40) lysiert. Alle darauffolgenden Schritte wurden bei 4 °C durchgeführt. Die gesamte Zelllyse und Integrität der freigesetzten Zellkerne wurde lichtmikroskopisch überprüft, und die Kerne wurden durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 500 X g granuliert. Die Zellkerne wurden in 4 ml Lysepuffer durch Schütteln resuspendiert, durch Zentrifugieren pelletiert, in 200 µl Zellkernlagerpuffer (40 % Glycerol, 5 mM MgCl₂, 50 mM Tris-HCl [pH 8,0], 0,1 mM FDTA) in einem 15 ml großen konischen Polypropylen-Zentrifugenröhrchen resuspendiert und prompt in flüssigem Stickstoff gefroren und bei –120 °C bis zum Gebrauch bis zu einem Monat später gelagert.
Run-On-Transkription:
RNA-Verlängerungsreaktionen wurden 30 Minuten lang bei 30 °C mit 2 × 10⁷ Zellkernen/400-µl-Reaktionsansatz durchgeführt. Die Reaktionsgemische bestanden aus 200 µl Zellkernlagerpuffer plus 200 µl sterilem 2X Reaktionspuffer (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 5 mM MgCl₂, 0,3 M KCl, 1 mM ATP, 1 mM CTP, mM GTP, 5 mM Dithiothreitol, und 2 µl [α-³²P]UPT oder [α-³²P]CTP [= 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml]). Die Nukleotide, Radionuldeotide und Dithiotreitol wurden erst unmittelbar vor Gebrauch hinzugefügt. Naszierende RNA-Transkripte ließ man 30 Minuten bei 30 °C auf einer Schüttelplattform verlängern; daraufhin wurden 600 µl Rnase-freie DNase 1 (0,04 Einheiten RQ1 DNase I [RNase-frei; Promega Corp.], 0,5 M NaCl, 50 mM MgC₂, 2 mM CaCl₂, 10 mM Tris-HCl [pH 7,4]) zugesetzt. Die ³²P-markierte RNA wurde mit Trizol (Gibco/BRL) isoliert, und die endgültige gefällte RNA wurde in Church-Hybridisierungspuffer (1 mM EDTA, 0,5 M NaHPO₄ [pH 7,2], 7 Natriumlaurylsulfat [SLS]) auf eine Endkonzentration von 4 × 10⁶ cpm per ml gelöst.
Hybridisierung von radioaktiv markierter RNA an immobilisierte unmarkierte Sonden:
Zur Unterscheidung zwischen in isolierten Zellkernen aus transfizierten Zellen produzierten TS-Sense- und Antisense-RNA-Molekülen bestand die Ziel-DNA (immobilisiert auf Nitrozellulosefiltern in dreiPunkten pro Ansatz, 2 µg pro Punkt) aus einzelsträngigen synthetischen Oligonukleotiden anstatt aus TS-cDNA. Es wurden auch strangspezifische Oligonukleotidsonden verwendet, um den menschlichen Metallothionein-2(MT-2)-mRNA- und Antisense-RNA-Spiegel jeweils als positive und negative Kontrolle zu bewerten. Einzelsträngige Oligonukleotide wurden auf Nitrozellulosefiltern durch Lösen in 6XSSC (16 µp pro ml) und Aufbringen von 125 µl pro Punkt mit einem Dotblot-Gerät von BioRad immobisiert. Nicht markierte komplementäre cDNA-Sonden für GAPDH-mRNA (Denhardt et al., 1988) und ribosomale 18S-RNA (Behrend et al., 1994) wurden denaturiert und auf den gleichen Nitrozellulosefiltern unter Verwendung eines oben beschriebenen Protokolls (Koropatnick, 1988) immobilisert (5 µg pro Punkt, drei Punkte pro Ansatz). Die Hybridisierung der radioaktiv markierten RNA an diesen Punkten diente der Bewertung der Transkription von GAPDH- und 18S-rRNA-Genen und als interner Standard, gegenüber dem die Veränderungen in der TS-Gentranskription gemessen wurden. Bei mit einzelsträngigen Oligonukleotiden transfizierten Zellen wurde die TS-Gentranskription durch Hybridisierung radioaktiv markierter TS-RNA-Transkripte an immobiliserter Ziel-DNA bestehend aus einem aus pCHTS-1 isoliertem 1,9-kb-Xho-1-Fragment bewertet.
Nitrozellulosefilter mit drei Punkten von Oligonukleotid- und cNDA-Sonden zur Bewertung der Run-On-Transkription von Antisense-TS-RNA-Expressionsvektoren und endogenen TS-, MT2-, GAPDH- und 18S-rRNA-Genen wurden in Church-Puffer 20 Minuten lang bei 65 °C in einer Hybaid-Hybridisierungskammer vorhybridisiert. Anschließend wurde der Vorhybridisierungspuffer entfernt, es wurden 2 ml radioaktiv markierte RNA, resultierend aus einer 30-minütigen Run-On-Transkription in isolierten Zellkernen (in Church-Hybridisierungspuffer, 4 × 10⁶ cpm pro ml), hinzugegeben, und die Filter wurden 48 Stunden lang bei 65 °C hybridisiert. Daraufhin wurden die Filter zweimal bei 65 °C in Nachhybridisierungspuffer (40 mM Na₂HPO₄, 1% SDS; 20 Minuten pro Waschschritt) gewaschen. Der Nachhybridisierungspuffer wurde entfernt und 8 ml RNase A (1 µg pro ml in 6XSSC) wurden hinzugegeben und 30 Minuten bei 37 °C bebrütet, um die Signale der unhybridisierten radioaktiv markierten RNA zu reduzieren. Nach einem letzten Waschvorgang in Nachhybridisierungspuffer (10 Minuten, 37 °C) wurden die Filter trockengetupft und die gebundene Radioaktivität wurde abgebildet und mit einem PhosphorImager^TM und dem ImageQuant^TM-Programm (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) quantifiziert. Die relative Transkription von Antisense-TS-Expressionsvektoren, endogenen TS-Genen und MT2-Genen wurde wie folgt definiert:
TS-Oligonukleotid-Sonden:
Die fettgedruckten Basen (unten) bilden einen Teil der Restriktionsendonuklease-Stellen und sind keine Sense- oder Antisense-TS-Sequenzen. Die Nummerierung gibt die Entfernung vom Beginn der Transkriptionsanfangsstelle an.
TS-cDNA-Nukleotide 111 bis 140

Sense-TS (JK-5): CTAGATGTGGCCGGCTCGGAGCTGCCGCGCCGGCCA (SEQ.-ID-Nr.: 11)
Antisense-TS (JK-2) AG CTTGGC CGGCGC GGCAGCTC CGAGC C GGC CACAT (SEQ.-ID-Nr.: 12)

TS-cDNA-Nukleotide 296 bis 325

Sense-TS (JK-3): CTAGAGCTACAGCCTGAGAGATGAATTCCCTCTGCA (SEQ.-ID-Nr.: 13)
Antisense-TS (JK-4): AGCTTGCAGAGGGAATTCATCTCTCAGGCTGTAGCT (SEQ.-ID-Nr.: 14)

MT-2-Oligonukleotid-Sonden (Karin und Richards, 1982):
Sense- und Antisense-Oligonukleotidsequenzen wurden an den 5'- und 3'-Enden keine nicht-komplementären Sequenzen hinzugefügt. Die Nummerierung gibt die Entfernung von der Translationsanfangsstelle an.
MTcDNA-Nukleotide -14 bis 6

Sense-MT: CTCTTCAGCACGCCATGGAT (SEQ.-ID-Nr.: 15)

MT-cDNA-Nukleotide 204 bis 223

Antisense-MT: AGGGTCTACCTTTCTTGCGC (SEQ ID Nr.: 16)

Beispiel 1.2: Auf Antisense-Oligooxynukleotide ausgerichtete Bereiche an oder nahe der Translationsendstelle am 3'-Ende des TS-Gens als Verfahren zur Vermehrungshemmung bei menschlichen Tumorzellen

(B) Ein 20meres Antisense-Oligodeoxynukleotid (Oligo 86), das auf die Translationsendstelle am 3'-Ende der Thymidylatsynthase mRNA ausgerichtet ist, ist vermehrungshemmend (zytostatisch) für eine menschliche Brustkrebszelllinie (MCF7-Zellen). Antisense-Oligonukleotide der gleichen Länge (Oligo 90 und 92), die auf Bereiche an oder nahe der Translationsanfangsstelle am 5'-Ende der TS-mRNA ausgerichtet sind, sind nicht zytostatisch (1).
(C) Ein 20meres Antisense-Oligondeoxynukleotid, das auf die TS-mRNA Translationsanfangsstelle (Oligo 91 und 93) ausgerichtet ist, ist nicht vermehrungshemmend für eine menschliche Gebärmutterhalskrebszellenlinie (HeLA). Das Wachstum wurde sogar signifikant erhöht. Antisense-Oligondeoxynukleotide, die auf das 3'-Ende der TS-mRNA ausgerichtet sind, einschließlich der Translationsendstelle (Oligo 86), oder auf eine Sequenz im 3' nicht-translatierten Bereich (Oligo 83), hemmten die Vermehrung von HeLa-Zellen signifkant. Ein Antisense-TS-Oligonukleotid, das auf eine andere Sequenz im 3' nicht-translatierten Bereich der TS-mRNA (Oligo 81) ausgerichtet war, war ohne Wirkung auf die Vermehrung von HeLa-Zellen (2 und 3).

Somit waren keine auf die Translationsanfangsstelle ausgerichteten Antisense-TS-Oligodeoxynukleotide bei der Vermehrungshemmung zweier verschiedener menschlicher Tumorzelllinien (menschliche Brustkarzinom-MCF7-Zellen bzw. menschliche Gebärmutterhalskrebs-HeLa-Zellen) erfolgreich. Zwei verschiedene auf das 3'-Ende des TS-Gens ausgerichtete Antisense-TS-Oligodeoxynukleotide hemmten das menschliche Tumorzellwachstum stark.
Beispiel 1.3:

a) Auf die Thymidylatsynthase-Translationsendstelle ausgerichtete Antisense-Oligodeoxynukleotide als Verfahren zur Erhöhung der Empfindlichkeit menschlicher Tumorzellen gegenüber den toxischen Wirkungen von Tomudex^TM (ZD 1694). Die auf Sequenzen im 3' nicht-translatierten Bereich der TS-mRNA ausgerichteten Antisense-TS-Oligodeoxynukleotide (Oligo 86 und 83) erhöhten die Empfindlichkeit menschlicher Gebärmutterhalskrebszellen gegenüber Tomudex^TM. Die Empfindlichkeitserhöhung fand zusätzlich zur direkten zytostatischen Auswirkung von Oligo 86 und 83 statt (4 und 5).
(b) Auf die Thymidylatsynthase-Translationsanfangsstelle ausgerichtete Antisense-Oligodeoxynukleotide als Verfahren zur Erhöhung der Resistenz menschlicher Zellen gegenüber den toxischen Auswirkungen von Tomudex^TM (ZD 1694). Ein auf die Translationsanfangsstelle von TS-mRNA ausgerichtetes Antisense-TS-Oligodeoxynukleotid (Oligo 91) erhöhte die Widerstandskraft menschlicher Gebärmutterhalskrebszellen gegenüber den toxischen Wirkungen von Tomudex^TM (4).

Beispiel 1.4: Induzierung der Transkription von auf Antisense- Nukleinsäuren ausgerichteten Genen als Screening-Verfahren zur Identifizierung geeigneter Zielsequenzen für Antisense-Nukleinsäuren.
Menschliche Tumorzellen scheinen die Antisense-Deaktivierung spezifischer mRNA zu kompensieren, indem sie die Transkription von Genen, welche die Zielsequenzen produzieren, erhöhen; ein Prozess, der als „kompensatorische Transkription" bezeichnet werden kann und der eine Resistenz gegenüber der Wirksamkeit von Antisense-Nukleinsäuren hervorruft. Es wurde beobachtet, dass die TS-Gentranskription in menschlichen MCF7-Brustkrebszellen durch Behandlung mit Antisense-TS-RNA und mit auf Bereiche an oder nahe der TS-mRNA Translationsanfangsstelle ausgerichteten Oligodeoxynukleotiden hervorgerufen wird. Das gleiche Phänomen wurde bei menschlichen HeLa-Zellen beobachtet, die transient mit Antisense-TS-Oligo 91 (auf die Translationsanfangsstelle ausgerichtet) transfiziert wurden, jedoch nicht auf Oligo 86 hin (auf die Translationsendstelle ausgerichtet) (6). Eine erhöhte spezifische Gentranskription als Reaktion auf transfizierte Antisense-Nukleinsäuren würde darauf hindeuten, dass die Zielsequenz für die Erreichung einer herabregulierten Genexprimierung nicht geeignet ist. Auf der anderen Seite kann es sich um eine geeignete Sequenz zur Erreichung einer hochregulierten Genexprimierung handeln (zur Erhöhung der Widerstandskraft gegen Chemotherapie-Medikamente z. B. in gesundem Gewebe).
Zusammenfassend kann man sagen, dass die vorliegende Erfindung zeigt, dass auf selektierte Bereiche der Thymidylatsynthase-mRNA ausgerichtete Antisense-Oligonukleotide das Wachstum wirksam hemmen können, wenn sie allein verabreicht werden. Sie können auch die Zelltötung durch Tomudex^TM erhöhen. Umgekehrt können auf bestimmte mRNA-Bereiche ausgerichtete (z. B. die Translationsanfangsstelle) Antisense-Oligonukleotide entweder unwirksam bleiben oder das Wachstum und die Überlebensrate bei Einwirkung von Tomudex^TM erhöhen.
Die Wirkungslosigkeit kann mit der oligonukleotidinduzierten TS-Gentranskription verbunden sein. Es ist von kritischer Bedeutung, TS-mRNA-Bereiche zu identifizieren, auf die Antisense-Sequenzen zur Hemmung der Tumorzellvermehrung und zur Erhöhung der Toxizität von Antikrebsmedikamenten wirksam abzielen können. Darüber hinaus ist der Mechanismus, mit dem auf 5'-TS-mRNA-Bereiche abzielende Antisense-Sequenzen die TS-Gentranskription induzieren, mit wichtigen Konsequenzen für die Auswahl der Antisense-Ziele insbesondere in der TS-mRNA und für die Optimierung der Antisense-Strategien im Allgemeinen verbunden.
Beispiel 2
Beispiel 2.1: Experimentelle Verfahren
Oligonukleotide:
Vollständig mit Phosphorothioat substituierte 20-Basen-Oligonukleotide wurden von Isis Pharmaceuticals (Carlsbad, CA) synthetisiert. Die 6 Nukleotide am jeweiligen Ende des Oligomers wurden in der 2'-Stellung mit Methoxyethoxy modifiziert, was sowohl die Hybridisierung als auch die Resistenz gegenüber eines Angriffs durch Exonukleasen erhöhte. Die mittleren 8 Nukleotide wurde nicht mit Methoxyethoxy modifiziert, um einen Abbau durch die Endonuklease RNase-H und den Abbau von der am Oligomer hybridisierten mRNA zu gestatten. ODN 83 ist komplementär zur TS-mRNA, angefangen von einer Position 136 Basen der Translationsendstelle nachgelagert (5'-GCCAGTGGCAACATCCTTAA-3'). ODN 32 ist eine randomisierte Sequenz des ODN 83 (5'-ATGCGCCAACGGTTCCTAAA-3'), mit den gleichen Basenbestandteilen in zufälliger Reihenfolge. Eine Suche nach verfügbaren mRNA-Sequenzen mit dem Suchwerkzeug NCBI BLAST zeigte, dass ODN 83 Sequenzen von 10 oder mehr nur zur menschlichen TS-mRNA komplementären Basen enthielt, wohingegen ODN 32 Sequenzen von 10 oder mehr zu keiner bekannten mRNA komplementären Basen aufwies.
Radioisotop:
[6-³H]5-FUdR (spezifische Aktivität 18,6 Ci/mmol) wurde von Moravek Biochemicals (Brea, California, USA) gekauft. Dieses Isotop hatte nach der Herstellung eine Ausgangsreinheit von 99,98 %, eine Abbaurate von 0,5-1% pro Monat bei –20 °C und wurde innerhalb von 3 Monaten nach Herstellung verwendet.
Sonstiges Material::
Von Canadian Life Technologies (GIBCO) (Burlington, Ontario, Kanada) wurden Zellkulturchemikalien und -nährstoffe beschafft. Alle anderen Chemikalien wurden kommerziell gekauft. Kunststoffartikel wurden von VWR Canlab (Mississauga, Ontario, Kanada) und Fisher Scientific (Uniondale, Ontario, Kanada) beschafft.
Zellkultur:
Menschliche Gebärmutterhalskrebs-HeLa-Zellen wurden in D-MEM plus 10% fötalem Bovinserum und Penicillin (50 Einheiten/ml)/Streptomycin (50 µg/ml) gehalten. Die Kulturen wurden in einer befeuchteten Atmosphäre bei 5 % CO₂ und 37 °C bebrütet. Zellen mit schneller Vermehrung dienten dem Aufbau von experimentellen Zellkulturen, die man über Nacht vor Handhabung auf einer Platte stehen ließ.
Die Transfektion wurde mit Lipofektamin (LFA, GIBCO-BRL), einer kationischen Liposomrezeptur, durchgeführt. Für Vermehrungsversuche einzusetzende Zellen wurden mit einer Anfangszellzahl zwischen 0,6 und 1 × 10⁵ Zellen pro 25 cm Gewebekulturkolben plattiert, und LFA wurde mit 3 µg/ml verwendet. Bei Zell en in 75-cm-Kolben, die für Assays des mRNA- oder TS-Inhalts geerntet und extrahiert werden sollten, betrug die Anfangszellzahl ca. 8-10 × 10⁵, und die LFA-Konzentration lag bei 4 µg/ml. Vor der Transfektion wurden anhaftende HeLa-Zellen einmal mit PBS gewaschen und dann mit Antisense- oder scrambled-Kontroll-ODN (50 nM) in der entsprechenden LFA-Konzentration in serumfreiem D-MEM bei 37 °C 6 Stunden lang behandelt. Die Zellen wurden dann einmal mit PBS gewaschen und in der Gegenwart von D-MEM plus, 10 % FBS gezüchtet. Bei mit zytotoxischen Stoffen behandelten Zellen begann die Einwirkung 24 Stunden nach Entfernen von LFA/ODN durch Zugabe von 0,2 Volumenprozent Wachstumsmedium, das den Stoff in der 6-fachen Höhe der Endkonzentration enthielt. Zum Zeitpunkt der Zugabe des Medikaments und nach 4 Tagen Bebrütung wurde die Zellzahl in den Kolben (Mehrfachansätze) durch Zählen mit einem Partikelzähler (Coulter Electronics, Hialeh, Florida, USA) bestimmt. Die Vermehrung der mit Medikamenten behandelten Zellen (mehrfacher Anstieg der Zellzahl) wurde als Prozent derer der Kontrollzellen berechnet. Der IC₅₀- und IC₉₀-Wert wurde durch Interpolation der aufgeführten Daten bestimmt.
RT-PCR zur Bestimmung von TS-mRNA:
Die RNA wurde mit Trizol^TM (GIBCO-BRL) aus transfizierten Zellen isoliert. Die komplementäre DNA wurde aus 1 µg der gesamten RNA mit 200 U of "Moloney Murine Leukämie Virus"-Reverse-Transkriptase (GIBCO BRL) in 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 1 mM gemischte dNTPs, 100 pmol Primer und 10 mM Dithiothreitol bei 37 °C 1 Stunde lang synthetisiert. Das Enzym wurde bei 95 °C 5 Minuten lang deaktiviert. Die resultierenden cDNAs (in einem Volumen von 2,5 μl) wurden mit einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit 1,25 U Taq-DNA-Polymerase in 50 µl 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 0,2 mM gemischte dNTPs, 2 mM MgCl₂ und 50 pmol Primer spezifisch für TS- and GAPDH-cDNAs amplifiziert. Die TS- und GAPDH-cDNAs wurden zusammen im gleichen Reaktionsgefäß amplifiziert, um den Spiegel der Schlüssel-GAPDH-cDNA zur Bestimmung des relativen TS-mRNA-Spiegels zu verwenden. Vierundzwanzig bis 27 Zyklen der PCR-Amplifizierung (94 °C 45 s, 55 °C 30 s, 72 °C 90 s) produzierten Fragmente aus 208 bp und 752 bp mit Primer-Sets für TS (vorwärts 5'CACACTTTGGGAGATGCACA3' (SEQ-ID-Nr.: 17); rückwärts 5'CTTTGAAAGCACCCTAAACAGCCAT3' (SEQ-ID-Nr.: 18)) und GAPDH (vorwärts 5'TATTGGGCGCCTGGTCACCA3' (SEQ-ID-Nr.: 19); rückwärts 5'CCACCTTCTTGATGTCATCA3' (SEQ-ID-Nr.: 20)). PCR-Produkte wurden auf einem 1,2 %igen Agarosegel getrennt und auf eine Hybond-Nylonmembran (Amersham, Canada, Ltd., Oakville, Ontaria, Kanada) mit der Southern-Blot-Methode übertragen.
Die Blots wurden an mit [α-³²P]dCTP.Primer markierten Sonden (pcHTS-1, ein großzügiges Geschenk von Dr. K. Takeishi, University of Shizuoka, Shizuoka, Japan; oder einem die Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase [GAPDH] erkennenden cDNA-Insert) hybridisiert. Die Hybridisierungssignale wurden mit einem PhosphorImager^TM und mit ImageQuant^TM (Molecuar Dynamics, Sunnuvale, California, USA) quantifiziert.
TS-Bindeassay:
Der TS-Gehalt der Zellen wurde durch Bindung von [6-³H]5-FdUMP untersucht. Dieses Verfahren wurde dazu verwendet, die Gesamt-TS zu markieren, sofern die Zellen nicht mit 5-FU oder 5-FUdR vorbehandelt waren. Die Untersuchung wurde unter Verwendung von Zellen durchgeführt, die mit Antisense-ODN 83 oder dem scrambled-Kontroll-ODN 82 behandelt worden waren. Kurz gesagt, wurden die Zellen geerntet, indem sie in PBS geschabt wurden und das resultierende Pellet anschließend in 100 mM KH₂PO₄ (pH 7,4) resuspendiert wurde. Die Zellen wurden durch Gefrieren und Auftauen aufgebrochen und danach einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Die Gesamtproteinkonzentration wurde durch Coomassie-Färbung (BioRad-Reagenz) (MI) bestimmt und die Ergebnisse als pmol pro mg Gesamtprotein gebundenes 5-FdUMP angegeben. Die 5-FdUMP-Bindung wurde in paarweisen Lysaten aus mit ODN 83 oder ODN 32 transfizierten Zellen in separaten, an unterschiedlichen Tagen durchgeführten Bebrütungsreaktionen bestimmt; die Paare wurden jedoch immer zusammen unter den gleichen Reaktionsbedingungen untersucht. Das Bebrütungsgefäß enthielt jeweils 50 µg Gesamtprotein, 75 µM Methylen-FH₄, 100 mM Mercaptoethanol, 50 mM KH₂PO₄ (pH 7,4) und 15 nM [6-³H]5-FdUMP in einem Endvolumen von 200 µl. Die Inkubation wurde nach 30 Minuten bei 37 °C durch Zugabe von 5 Volumen albuminüberzogener Aktivkohle gestoppt. Nach 10 Minuten (Raumtemperatur) wurde dieser Schlamm zentifugiert (3000 X g, 30 Min. 22 °C) und der Überstand erneut zentrifugiert, um alle Partikel komplett zu entfernen. Zwei Aliquote von jeweils 300 µl wurden vom endgültigen, geklärten Überstand zur Szintillationszählung abgenommen.
Statistische Analyse:
Die Daten für die Zellvermehrung nach der Behandlung nur mit ODNs oder in Kombination mit zytotoxischen Medikamenten wurden als der Mittelwert +/– Standardfehler bzw. Standardabweichung wie im t-Test bestimmt dargestellt.
Zur Bestimmung der FdUMP-Bindung wurden Unterschiede zwischen gepaarten Proben von mit verschiedenen ODNs transfizierten Zellen unter Verwendung eines gepaarten t-Test untersucht. Die Kontrolle wurde somit für Unterschiede in den Versuchsbedingungen für jeden der 5 Zeitpunkte, zu denen die FdUMP-Bindung untersucht wurde, durchgeführt.
A priori wurde für alle Fälle bestimmt, dass statistisch signifikante Unterschiede bei einem Vertrauensniveau von p < 0,02 vorlägen.
Zitierte Literatur

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SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Ein Antisense-Deoxyoligonukleotid bestehend aus 8 bis 50 Nukleotiden, das eine Nukleotidsequenz umfasst, welche komplementär zu einer Sequenz an oder nahe der Translationsendstelle am 3'-Ende eines menschlichen Thymidylatsynthasegens ist, gekennzeichnet dadurch, dass das besagte Deoxyoligomikleotid die Thymidylatsynthaseproduktion in einer Säugetierzelle hemmt und nukleaseresistent ist.
Antisense-Deoxyoligonukleotid nach Anspruch 1, bestehend aus 12 bis 40 Nukleotiden.
Antisense-Deoxyoligonukleotid nach Anspruch 1, bestehend aus 16 bis 30 Nukleotiden.
Antisense-Deoxyoligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das [handschriftliche Einfügung:] eine der folgenden Nukleotidsequenzen umfasst: GCCAGTGGCAACATCCTTAA oder AAGCACCCTAAACAGCC.
Antisense-Deoxyoligonukleotid nach Anspruch 4, das die [handschriftliche Einfügung:] folgende Nukleotidsequenz umfasst: GCCAGTGGCAACATCCTTAA.
Antisense-Deoxyoligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das besagte Deoxyoligonukleotid Phosphorothiat-modifiziert ist.
Antisense-Deoxyoligonuklootid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, dass die 6 Endnukleotide an den 5'- und 3'-Enden des besagten Deoxyoligonukleotids 2'-methoxyethoxyliert sind
Antisense-Deoxyoligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, dass die besagte Nukleotidsequenz komplementär ist zu einem Bereich des Thymidylatsynthasegens zwischen den Nukleotidbasen 800 und 1536 der Sequenz in 7a.
Antisense-Deoxyoligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, dass die besagte Nukleotidsequenz komplementär ist zu einem Bereich des Thymidylatsynthasegens zwischen den Nukleotidbasen 1000 und 1530 der Sequenz in 7a.
Antisense-Deoxyoligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 9, gekennzeichnet dadurch, dass die besagte Nukleotidsequenz komplementär ist zu einem Bereich des Thymidylatsynthasegens zwischen den Nukleotidbasen 1030 und 1460 der Sequenz in 7a.
Antisense-Deoxyoligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 10, gekennzeichnet dadurch, dass die besagte Säugetierzelle eine Gebärmutterhalskrebszelle ist.
Antisense-Deoxyoligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 10, gekennzeichnet dadurch, dass die besagte Säugetierzelle eine Brustkrebszelle ist.
Antisense-Deoxyoligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 12, gekennzeichnet dadurch, dass die besagte Säugetierzelle eine menschliche Zelle ist.
Eine pharmazeutische Rezeptur bestehend aus dem Antisense-Deoxyoligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und einem pharmazeutisch zulässigen Verdünnungsmittel oder Träger.
Ein Kombinationsprodukt bestehend aus dem Antisense-Deoxyoligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 13 in Kombination mit einem Antikrebswirkstoff.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 15, gekennzeichnet dadurch, dass der Antikrebswirkstoff ein Thymidylatsynthasehemmstoff, ein zytostatischer Wirkstoff oder ein antiproliferatives Medikament ist.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 15 oder 16, gekennzeichnet dadurch, dass der Antikrebswirkstoff ein Thymidylatsynthasehemmstoff ist.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 15 oder 16, gekennzeichnet dadurch, dass der Antikrebswirkstoff ein zytostatischer Wirkstoff ist.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 15 oder 16, gekennzeichnet dadurch, dass der Antikrebswirkstoff ein antiproliferatives Medikament ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 15 bis 17, gekennzeichnet dadurch, dass der Antikrebswirkstoff eine N-(5-[N-(3,4-dihydro-2-methyl-4-oxoquinazolin-6-ylmethyl)-N-methylammo]-2-thenoyl)-L-Glutaminsäure ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 15 bis 17, gekennzeichnet dadurch, dass der Antikrebswirkstoff eine (S)-2-(2-fluoro-4-[N-(4-hydroxy-2,7-dimethylquinazolin-6-ylmethyl)-N-(prop-2-ynyl)amino]benzamido)-4-(1H1,2,3,4-tetrazol-5-yl)Buttersäure ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 15, 16 oder 19, gekennzeichnet dadurch, dass der Antikrebswirkstoff Methotrexat ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 15, 16 oder 19, gekennzeichnet dadurch, dass der Antikrebswirkstoff Fluoropyrimidin ist.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 23, gekennzeichnet dadurch, dass das besagte Fluoropyrimidin aus 5-Fluorouracil, FUdR, Ftorafur und FdUR gewählt wird.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 24, gekennzeichnet dadurch, dass das besagte Fluoropyrimidin 5-Fluorouracil ist.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 24, gekennzeichnet dadurch, dass das besagte Fluoropyrimidin 5-FUdR ist.
Eine pharmazeutische Rezeptur bestehend aus dem Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 15 bis 26 und einem pharmazeutisch zulässigen Verdünnungsmittel oder Träger.
Antisense-Deoxyoligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 13 für den Gebrauch bei der Behandlung von Krebs bei Säugetieren.
Antisense-Deoxyoligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 13 für den Gebrauch bei der Hemmung von Zellvermehrung bei Säugetieren.
Antisense-Deoxyoligonukleotid nach Anspruch 29, gekennzeichnet dadurch, dass es sich bei der besagten Zellvermehrung um die Vermehrung von Tumorzellen handelt.
Antisense-Deoxyoligonuldeotid nach einem der Ansprüche 1 bis 13 für den Gebrauch bei der Erhöhung der Empfindlichkeit einer Säugetierzelle gegen einen Antikrebswirkstoff.
Antisense-Deoxyoligonukleotid nach Anspruch 31, gekennzeichnet dadurch, dass die besagte Säugetierzelle eine Tumorzelle ist.
Antisense-Deoxyoligonukleotid nach Anspruch 31 oder 32, gekennzeichnet dadurch, dass der besagte Antikrebswirkstoff ein Fluoropyrimidin ist.
Antisense-Deoxyoligonukleotid nach Anspruch 33, gekennzeichnet dadurch, dass das besagte Fluoropyrimidin aus 5-Fluorouracil, FudR, Ftorafur und FdUR gewählt wird.
Antisense-Deoxyoligonukleotid nach einem der Ansprüche 28 bis 34, gekennzeichnet dadurch, dass das besagte Säugetier ein Mensch ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 15 bis 26 für den Gebrauch bei der Behandlung von Krebs bei Säugetieren.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 15 bis 26 für den Gebrauch bei der Hemmung der Zellvermehrung bei Säugetieren.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 37, gekennzeichnet dadurch, dass es sich bei der besagten Zellvermehrung um die Vermehrung von Tumorzellen handelt.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 15 bis 26 für den Gebrauch bei der Erhöhung der Empfindlichkeit einer Säugetierzelle gegen den Antikrebswirkstoff des besagten Kombinationsprodukts.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 15, 16 oder 19 für den Gebrauch bei der Erhöhung der Empfindlichkeit einer Säugetierzelle gegen den besagten Antikrebswirkstoff, gekennzeichnet dadurch, dass der besagte Antikrebswirkstoff ein Fluoropyrimidin ist.
Kombinationsprodukt nach Anspruch 40, gekennzeichnet dadurch, dass das besagte Fluoropyrimidin aus 5-Fluorouracil, FudR, Ftorafur und FdUR gewählt wird.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 39 bis 41, gekennzeichnet dadurch, dass die besagte Säugetierzelle eine Tumorzelle ist.
Kombinationsprodukt nach einem der Ansprüche 36 bis 42, gekennzeichnet dadurch, dass das besagte Säugetier ein Mensch ist.
Gebrauch des Antisense-Deoxyoligonukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 13 für die Bereitstellung eines Medikaments.
Gebrauch nach Anspruch 44, gekennzeichnet dadurch, dass das Medikament für die Behandlung von Krebs bei Säugetieren gedacht ist.
Gebrauch nach Anspruch 44, gekennzeichnet dadurch, dass das Medikament für die Hemmung der Zellvermehrung bei Säugetieren gedacht ist.
Gebrauch nach Anspruch 46, gekennzeichnet dadurch, dass es sich bei der besagten Zellvermehrung um die Vermehrung von Tumorzellen handelt.
Gebrauch nach Anspruch 44, gekennzeichnet dadurch, dass das besagte Medikament für die Erhöhung der Empfindlichkeit einer Säugetierzelle gegen einen Antikrebswirkstoff gedacht ist.
Gebrauch nach Anspruch 48, gekennzeichnet dadurch, dass die besagte Säugetierzelle eine Tumorzelle ist.
Gebrauch nach Anspruch 48 oder 49, gekennzeichnet dadurch, dass der besagte Antikrebswirkstoff ein Fluoropyrimidin ist.
Gebrauch nach Anspruch 50, gekennzeichnet dadurch, dass das besagte Fluoropyrimidin aus 5-Fluorouracil, FudR, Ftorafur und FdUR gewählt wird.
Gebrauch nach einem der Ansprüche 45 bis 51, gekennzeichnet dadurch, dass das Säugetier ein Mensch ist.
Gebrauch des Kombinationsprodukts nach einem der Ansprüche 15 bis 26 bei der Bereitstellung eines Medikaments.
Gebrauch nach Anspruch 53, gekennzeichnet dadurch, dass das Medikament für die Behandlung von Krebs bei Säugetieren gedacht ist.
Gebrauch nach Anspruch 53, gekennzeichnet dadurch, dass das Medikament für die Hemmung der Zellvermehrung bei Säugetieren gedacht ist.
Gebrauch nach Anspruch 55, gekennzeichnet dadurch, dass es sich bei der besagten Zellvermehrung um die Vermehrung von Tumorzellen handelt.
Gebrauch nach Anspruch 53, gekennzeichnet dadurch, dass das besagte Medikament für die Erhöhung der Empfindlichkeit einer Säugetierzelle gegen den besagten Antikrebswirkstoff des Kombinationsprodukts gedacht ist.
Gebrauch des Kombinationsprodukts nach einem der Ansprüche 15, 16 oder 19 für die Bereitstellung eines Medikaments zur Erhöhung der Empfindlichkeit einer Säugetierzelle gegen den besagten Antikrebswirkstoff des Kombinationsprodukts, gekennzeichnet dadurch, dass der besagte Antikrebswirkstoff ein Fluoropyrimidin ist.
Gebrauch nach Anspruch 58, gekennzeichnet dadurch, dass das besagte Fluoropyrimidin aus 5-Fluorouracil, FudR, Ftorafur und FdUR gewählt wird.
Gebrauch nach einem der Ansprüche 57 bis 59, gekennzeichnet dadurch, dass die besagte Säugetierzelle eine Tumorzelle ist.
Gebrauch nach einem der Ansprüche 54 bis 60, gekennzeichnet dadurch, dass das Säugetier ein Mensch ist.