WO2005033310A1 - Pim-1-spezifische dsrna-verbindungen - Google Patents

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WO2005033310A1
WO2005033310A1 PCT/EP2004/010757 EP2004010757W WO2005033310A1 WO 2005033310 A1 WO2005033310 A1 WO 2005033310A1 EP 2004010757 W EP2004010757 W EP 2004010757W WO 2005033310 A1 WO2005033310 A1 WO 2005033310A1
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WO
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pim
dsrna
double
stranded rna
cell
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PCT/EP2004/010757
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Volker Erdmann
Arnold GRÜNWELLER
Jens Kurreck
Thomas Christoph
Clemens Gillen
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Grünenthal GmbH
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    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • the invention relates to small, in particular interference-triggering, double-stranded RNA molecules (dsRNA) which are complementary to PIM-1 kinase mRNA, and to objects according to the invention expressing dsRNA, such as, for example, host cells.
  • dsRNA double-stranded RNA molecules
  • the dsRNA according to the invention and corresponding host cells are suitable as medicaments or for the production of medicaments, in particular for the treatment of pain or other pathological conditions associated with PIM-1.
  • pain is an "unpleasant sensory and emotional experience that is linked to acute or potential tissue damage or is described in terms of such damage”.
  • Treating pain effectively is a major challenge for molecular medicine.
  • Acute and transient pain is an important signal from the body to protect people from severe damage from the environment or overloading the body.
  • chronic pain longer than the cause of the pain and the expected time frame for healing, has no known biological function and affects hundreds of millions of people worldwide.
  • Around 7.5 million people suffer from chronic pain in the Federal Republic of Germany alone.
  • the Pharmacological treatment of chronic pain is still unsatisfactory and therefore remains a challenge for current medical research.
  • the currently existing analgesics are often not sufficiently effective and have e.g. T. severe side effects.
  • PIM-1 kinase PIM-1 kinase
  • pain modulating refers to a potential regulating influence on the physiological pain process, in particular an analgesic effect.
  • the PIM-1 kinase belongs to the family of serine threonine kinases, which is highly conserved in evolution in multicellular organisms.
  • the following PIM kinases belong to the PIM kinase family: PIM-1, PIM-2, PIM-3, PIM-4. (Saris et al. EMBO J. 10, 655, 1991).
  • Kinase is an enzyme that transfers phosphate groups from ATP or another nucleoside triphosphate to another molecule.
  • PIM-1 plays a role in the control of cell growth, cell differentiation and apoptosis.
  • PIM-1 is also described as a proto-oncogene (Cuypers et al., 1984, Cell 37, 141).
  • PIM-1 PIM-1 phosphorylates about HP1 and other targets such as cdc25 (Koike, et. Al. 2000 FEBS Lett. 467.17, Mochizuki, et. Al. 1999, J. Biol Chem. 274, 18659).
  • cdc25 increases its phosphatase activity both in vivo and in vitro. This cdc25 activation amplification in turn creates a connection between PIM-1 activity and cell transformation.
  • HP1 heterochromatin protein 1
  • PIM kinases interacts with the Socs-1 protein, an inhibitor of JAK activation. Phosphorylation of SOCS-1 by PIM-1 appears to prolong the half-life of the Socs-1 protein, which in turn appears to increase the inhibitory effect of Socs-1 on the JAK-STAT activation process (Chen et al., PNAS 99, 2175, 2002).
  • the cDNA sequence of human PIM-1 kinase can be found in the databases under accession number NM 002648, the amino acid sequence of human PIM-1 kinase under NP_002639.
  • the cDNA sequence of PIM1 kinase, rat can be found in the databases under NM_017034, its amino acid sequence under NP_058730.
  • the cDNA sequence of PIM-1 kinase, mouse is available under NM_0O8842, its amino acid sequence under NP_032868.
  • the P1M-1 kinase is a highly interesting target protein for drug research.
  • drug research is to provide substances that cancels any cellular malregulation of the PIM-1 kinase, for example, low-molecular-weight active substances.
  • low-molecular-weight active substances for example, low-molecular-weight active substances.
  • German patent application DE 10226702.2 discloses antisense oligonucleotides against PIM-1, namely as pain therapeutic agents. All- However, such antisense oligonucleotides have the disadvantage that they have poor cell permeability and low intracellular efficiency.
  • PIM-1-specific dsRNAs are provided to solve the problem, which are capable of triggering the phenomenon of RNA interference.
  • RNA interference was noticed in the course of immunological research.
  • an RNA-based defense mechanism has been discovered, which occurs in the realm of fungi as well as in the plant and animal kingdom and acts like an "immune system of the genome".
  • the system was originally independent of one another in different species, first in C elegans, before the underlying mechanisms of the processes could be identified as identical: RNA-mediated virus resistance in plants, PTGS (“posttranscriptional gene silencing”) in plants, and RNA interference in eukaryotes are based on a common mode of operation.
  • RNA interference is based on double-stranded RNA molecules (dsRNA), which trigger the sequence-specific suppression of gene expression (Zamore (2001) Nat. Struct. Bio !. 9: 746-750; Sharp (20O1) Genes Dev. 5: 485-490: Hannon (2002) Nature 41: 244-251).
  • dsRNA double-stranded RNA molecules
  • the activation of protein kinase R and RNaseL causes non-specific effects in the transfection of mammalian cells with long dsRNA, such as an interferon response (Stark et. AI. (1998) Annu. Rev. Biochem. 67: 227-264; He and cat ( 2002) Viral Immunol. 15: 95-119).
  • siRNA small interfering RNA
  • dsRNA molecules have also been used in vivo (McCaffrey et. al. (2002), Nature 418: 38-39; Xia et. al. (2002 ), Nature Biotech. 20: 1006-1010; Brummelkarnp et. Al. (2002), Cancer Cell 2: 243-247).
  • the double-stranded RNA (dsRNA) contains a sequence with the general structure 5 '- (Ni 7 - 29 ) -3', where N is any base and stands for nucleotides.
  • the general structure consists of a double-stranded RNA with a macromolecule made up of ribonucleotides, the ribonucleotide consisting of a pentose (ribose), an organic base and a phosphate.
  • the organic bases in the RNA consist of the purine bases adenine (A) and guanine (G) as well as the pyrimidine bases cytosine (C) and uracii (U).
  • the dsRNA according to the invention contains such nucleotides or nucleotide analogs with a directed structure.
  • the dsRNAs according to the invention preferably have the general structure 5 '- (N ⁇ g. 25 ) -3', more preferably 5 '- (N ⁇ 9-24 ) -3', even more preferably 5 '- (N 2 ⁇ -23 ) -3' where N is any base.
  • At least 90%, preferably 95% and in particular 100% of the nucleotides of a dsRNA according to the invention will be complementary to a section of the (m) RNA sequence of PIM-1.
  • 90% complementary means that with a length of a dsRNA according to the invention of, for example, 20 nucleotides, it has at most 2 nucleotides without corresponding complementarity with the corresponding section on the (m) RNA.
  • the general structure of the sequence of the double-stranded RNA according to the invention is preferably, however, completely complementary to a section of the (m) RNA of PIM-1.
  • the entire length of the gene, including the introns is transcribed into a long RNA molecule, the primary transcript, for the production of an mRNA.
  • the conversion into the mRNA takes place by processing the primary transcript at the 5 'end with an addition of an atypical nucleotide with a methylated guanine and a polyadenylation at the 3' end.
  • the intron sequences are removed by RNA splicing and the exons are connected to one another.
  • Target sequences for dsRNA according to the invention can be both the primary transcript and the processed mRNA of the PIM-1 kinase or other kinases of this family.
  • the primary transcript and the processed mRNA are collectively referred to below as (m) RNA.
  • one strand of the double-stranded RNA according to the invention can thus be complementary to the primary or processed RNA transcript of the PIM-1 gene.
  • all 17 to 29, preferably 19 to 25 base pairs long segments occurring in the coding region of the (m) RNA can serve as the target sequence for a dsRNA according to the invention.
  • Those target sequences for dsRNAs according to the invention which lie between positions 50, 70 or 100 and 900 (in each case based on nucleotide A of the AUG start triplet of the coding region of the (m) RNA of PIM-1 from the different species) are particularly preferred.
  • the starting nucleotide of which is a nucleotide with the position 75 to 900 in the coding region of the PIM-1 - (m) RNA corresponds and whose end nucleotide is 17 to 25, preferably 19 to 25 and very particularly preferably 21 to 23 nucleotides further downstream of the starting nucleotide on the PIM-1- (m) RNA.
  • dsRNAs according to the invention can also be directed against nucleotide sequences on the PIM-1- (m) RNA which are not in the coding region, in particular in the non-coding 5 'region of the (m) RNA, for example against non-coding Areas of the (m) RNA with regulatory functions on.
  • the target sequence of dsRNA according to the invention on the PIM-1- (m) RNA can therefore be in the translated and untranslated region of the (m) RNA and / or in the region of the control elements.
  • the target sequence of a dsRNA according to the invention can also lie in the overlap region of the non-translated and translated sequence, in particular the target sequence can comprise at least one nucleotide upstream from the start triplet of the coding region of the (m) RNA.
  • dsRNAs according to the invention which are directed against sections in the coding region of the PIM-1- (m) RNA which begin with the start sequence AA are very particularly preferred.
  • the 5 'end of the target sequence of a dsRNA according to the invention eg. To nucleotides AA at the 5'-terminus
  • inventive dsRNA also, for example, in a sequence sequence 5'-AAN ⁇ 5- 23 and the complementary strand 3 '-TTH ⁇ 5 .2 3 , reflected.
  • dsRNAs are particularly preferred which are complementary to (m) RNA sections and are thus directed against them, which, for example, the sequence sequence AACGACCUGCA, AAGCUGGCG, AAGGAGAA, AAGGAGCCC, AA-CUUGCCGGUGG, AAACACGU, AAGGACCGGA, ACCGGUGCUCG , AAGAAGGUGA, AAGAUCUCUUCGA, AAAGGGGAGC, AAGAGGAG- CUGG, AACUGCGGGGU, AAGGACGAAAACA, AAAACAUCCUU, AACAUC- CUUA, AAUCGCGGCGA, AAGCUCAUC, AAGGACACCGUC, AAGAGAUCAU- CA, AAUGUCAGCAUCU, AACCUUCGAAGA, AAGAAAUCCAG or AAC CAUCCAU, preferably as a 5'-terminal sequence in the Section of the PIM-1- (m) RNA against which the dsRNA molecules according to the invention are directed, or in principle at any
  • An effective blocking and cleavage of the (m) RNA of PIM-1 by dsRNA according to the invention is particularly achieved in that certain selection rules are taken into account when choosing the target sequence for dsRNA according to the invention.
  • a particularly preferred embodiment of the present invention is therefore a dsRNA which has a GC content of at least 38%, in a more preferred embodiment of at least 40% and in one even more preferred embodiment of at least 45% (selection rule 1).
  • dsRNA molecules according to the invention have at most two consecutive guanidine residues in their sequence (selection rule 2).
  • Another particularly preferred embodiment of the present invention is a target sequence which occurs only once in the genome of the target organism in the target gene, but not at other locations in the genome (selection rule 3).
  • dsRNA molecules according to the invention for example dsRNAs with the properties in accordance with the selection rules (1), (2) and / or (3).
  • the target sequence of a dsRNA according to the invention on the PIM-1- (m) RNA is preferably selected from a group consisting of the following sequences: (a) 5'-AAC GUG GAG AAG GAC CGG AUU-3 '; (b) 5'-AAC UCG AGU GCC CAU GGA AGU-3 '; (c) 5'-AAC CGC GAC AUC AAG GAC GAA-3 ', (d) 5'-AAU AUU CCU UUC GAG CAU GAC-3'; (e) 5'-AAG GGU CUC UUC AGA AUG UCA-3 '; (f) 5'-CCG CGA CAT CAA GGA CGA A-3 '; (g) 5'-GAT ATG GTG TGT GGA GATA-3 'and (h) 5'-AAG UGU ACU UUA GGC AAA GGG-3'.
  • a modified nucleotide can preferably occur in a dsRNA according to the invention.
  • the term “modified nucleotide” means that the respective nucleotide is chemically modified.
  • the person skilled in the art understands by the term “chemical modification” that the modified nucleotide by replacing, adding or removing individual or more atoms or groups of atoms in comparison to naturally occurring nucleotides is changed.
  • At least one modified nucleotide in the dsRNA according to the invention serves on the one hand for stability and on the other hand to prevent dissociation. Between 2 and 10, preferably between 2 and 5 nucleotides are preferably modified in a dsRNA according to the invention.
  • the modification of the nucleotides of the dsRNA leads to a deactivation of a protein kinase (PKR) dependent on double-stranded RNA in the cell.
  • PPKR protein kinase
  • At least one 2'-hydroxy group of the nucleotides of the dsRNA in the double-stranded structure is advantageously replaced by a chemical group, preferably a 2'-amino or a 2'-methyl group.
  • At least one nucleotide in at least one strand of the double-stranded structure can also be a so-called "locked nucleotide" with a sugar ring chemically modified, preferably by a 2'-O, 4'-C-methylene bridge.
  • several nucleotides of the dsRNA according to the invention are “locked” nucleotides ".
  • dsRNA according to the invention can be prevented by modifying the backbone.
  • a dsRNA according to the invention which is modified in the form of phosphorothioate, 2'-O-methyl-RNA, LNA, LNA / DNA gapmer) and therefore has a longer half-life in vivo.
  • the ends of the double-stranded RNA can preferably be modified in order to counteract degradation in the cell or dissociation into the single strands, in particular in order to avoid premature degradation by nucleases.
  • a regularly undesired dissociation of the single strands of dsRNA occurs especially when using low concentrations of the same or short chain lengths.
  • the cohesion of the double-stranded structure of dsRNA according to the invention brought about by the nucleotide pairs can be increased by at least one, preferably more chemical linkage (s).
  • a dsRNA according to the invention has a higher stability against enzymatic and chemical degradation in the cell or in the organism or ex vivo and therefore has a longer half-life.
  • the chemical linkage of the single strands of a dsRNA according to the invention is expediently formed by a covalent or ionic bond, hydrogen bond (s), hydrophobic interactions, preferably van der Waals or stacking interactions, or by metal ion coordination. According to a particularly advantageous design feature, it can be produced at at least one, preferably at both, ends of the dsRNA according to the invention.
  • the chemical linkage is formed by means of one or more connecting groups, the connecting groups preferably being poly (oxyphosphinicooxy-1,3-propane-diol) and / or polyethylene glycol chains.
  • the chemical linkage can also be formed by purine analogs used in the double-stranded structure, for example instead of purines.
  • the chemical linkage is formed by azabenzene units introduced into the double-stranded structure. It can also be formed in the double-stranded structure by using branched nucleotide analogues instead of native nucleotides.
  • the chemical linkage can be formed by thiophosphoryl groups attached to the ends of the double-stranded region.
  • the chemical linkage is preferably produced at the ends of the double-stranded region by triple helix bonds.
  • the chemical linkage can expediently be induced by ultraviolet light.
  • hairpin loops can be formed at the ends of the strands.
  • a loop structure is preferably formed at the 5 'and / or 3' end.
  • Such a loop structure has no hydrogen bonds, typically no complementarity, between nucleotide bases.
  • Such a “loop” typically has a length of at least 5, preferably at least 7 nucleotides and in this way connects the two complementary single strands of a dsRNA according to the invention.
  • the nucleotides are preferably modified in such a way that the hydrogen bond is strengthened, for example by increasing the hydrogen bond capacity between the bases by possibly modified nucleotides. This increases the stability of the interaction between the strands and protects them from attack by RNAsen.
  • a dsRNA according to the invention is preferably against the (m) RNA of the PIM kinases, in particular the PIM-1 kinase, of mammals, such as humans, monkeys, rats, dogs, cats, mice, rabbits, guinea pigs, hamsters, cattle, pigs, Sheep and goat, judged.
  • a dsRNA according to the invention preferably suppresses the translation of PIM-1 in a cell by at least 50%, more preferably 60%, even more preferably 70%, and most preferably at least 90%, ie the cell preferably contains at most half of the native (without treatment with dsRNA) occurring cellular PIM kinase concentration.
  • the suppression of the translation of PIM kinases into cells after adding dsRNA molecules according to the invention is based on the phenomenon of RNA interference caused by molecules according to the invention.
  • the dsRNA according to the invention is then a so-called siRNA, which can trigger the phenomenon of RNA interference and bind PIM kinase (m) RNA.
  • the measurement of the translation triggered by dsRNA according to the invention Suppression in cells can be carried out using Northem blot, quantitative real-time PCR or at the protein level with P1M-1 -specific antibodies.
  • dsRNAs according to the invention can have so-called “blunt ends” (smooth ends) or overhanging ends.
  • overhanging terms of a dsRNA according to the invention can have at least two overhanging nucleotides, preferably 2 to 10, in particular 2 to 5, overhanging nucleotides at the 3 'terminus, but optionally also alternatively at the 5' terminus.
  • the overhanging nucleotides of the dsRNA according to the invention directed against PIM-1 (m) RNA can in principle be overhanging ends of any sequence.
  • dT deoxy thymidine
  • uracil can also be used if necessary.
  • dTdT each attached to the 3 'terminus of the dsRNA according to the invention, are particularly preferred.
  • a preferred embodiment of the dsRNA according to the invention is directed against a target sequence of the PIM1 mRNA which has the general structure 5'-AAG UGU ACU UUA GGC AAA GGG-3 '(rat; or the corresponding human sequence: not shown).
  • a particularly preferred dsRNA of the present invention is therefore a duplex molecule (dsRNA), the sense strand of which is the sequence 5'-GUG UAC UUU AGG CAA AGG GdTdT-3 'and the antisense strand is the sequence 5'-CCC UUU GCC UAA AGU ACA CdTdT-3 '.
  • This example of a dsRNA according to the invention is directed against the aforementioned section of the PIM-1 mRNA (rat) and in each case has the overhanging ends dTdT at the 3 'terminus.
  • the dsRNA according to the invention is produced by methods known to those skilled in the art. Nucleotides, in particular also oligonucleotides, are thereby synthesized for example according to the type of Merryfield synthesis, on an insoluble carrier (HG Gassen, Chemical and Enzymatic Synthesis of Genfragments (Verlag Chemie, Weinheim 1982)) or in another way (Beyer Walter, Textbook of Organic Chemistry, 20th edition, (p Hirzel Verlag, Stuttgart 1984), p. 816 ff.). For example, siRNA molecules can be produced synthetically and can be obtained from various suppliers, for example IBA GmbH (Göttingen, Germany).
  • the expression of the dsRNA according to the invention takes place in that the 1st template (sense dsRNA) and the 2nd template (antisense dsRNA) under the control of two identical or different promoters in one or two vectors stand.
  • the vector (s) can serve as a medium for the expression of the two single strands in a cell, the two complementary strands then being isolated by appropriate purification processes and made available for subsequent use.
  • corresponding vectors encoding dsRNA according to the invention can also be used to express the dsRNA according to the invention in vivo, the vectors being provided for gene therapy processes.
  • Double-stranded RNA according to the invention can be enclosed in micellar structures which have a positive influence on the permeation of dsRNA through cell membranes in vitro and in vivo.
  • the dsRNA is preferably present in liposomes.
  • the liposomes are artificial, spherical self-contained membranes made of phospholipids, in which both hydrophilic substances are encapsulated in the aqueous interior and lipophilic substances can be incorporated into the interior of the lipid membrane.
  • the requirement for the use of liposomes for experimental or therapeutic purposes is their compatibility with cells and tissues.
  • the dsRNA according to the invention which is preferably present in the liposomes, can alternatively or cumulatively also with a peptide sequence, preferably with a lysine and arginine-rich sequence, for example a sequence from the viral TAT protein (for example containing AS 49-57) . modified to be able to permeate the cell membrane more easily in connection with such a transporter peptide.
  • a peptide sequence preferably with a lysine and arginine-rich sequence, for example a sequence from the viral TAT protein (for example containing AS 49-57) . modified to be able to permeate the cell membrane more easily in connection with such a transporter peptide.
  • the dsRNA can likewise be enclosed in viral natural capsids or in artificial capsids produced by chemical or enzymatic means or structures derived therefrom.
  • the features mentioned enable the dsRNA to be introduced into predetermined target cells.
  • the dsRNA according to the invention is bound to, associated with or surrounded by at least one viral coat protein derived from a virus, derived therefrom or synthetically produced.
  • the coat protein can be derived from the polyomavirus.
  • the dsRNA can have the virus protein 1 (VP1) and / or the virus protein 2 (VP2) of the polyomavirus as the coat protein.
  • VP1 virus protein 1
  • VP2 virus protein 2
  • the use of such coat proteins is e.g. known from DE 19618797 A1, the disclosure of which is fully incorporated in this regard.
  • the aforementioned configurations can improve the introduction of the dsRNA according to the invention into the cell.
  • the present invention further relates to host cells, with the exception of human germ cells and human embryonic stem cells, which are transformed with at least one dsRNA according to the invention or with the DNA molecules on which the single strands are based.
  • DsRNA molecules according to the invention can be introduced into the respective host cell using customary methods, for example transformation, transfection, transduction, electroporation or particle gun, as such or in the form of vectors which inducibly express the strands of a dsRNA according to the invention.
  • at least two different dsRNAs are introduced into the cell, with one strand of each dsRNA being complementary to a section of the (m) RNA of the PIM-1.
  • the complementary region of the dsRNA to a section of the (m) RNA of PIM-1 typically contains 17 to 30 consecutive pairs of nucleotides.
  • All cells of a pro- or eukaryotic nature can be considered as host cells, for example bacteria, fungi, yeasts, plant or animal cells.
  • Preferred host cells are bacterial cells such as Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus or Pseudomonas, eukaryotic microorganisms such as Aspergillus or Saccharomyces cerevisiae or the common baker's yeast (Stinchcomb et. Al. (1997) Nature 282: 39).
  • cells from multicellular organisms are selected for the transformation of dsRNA constructs according to the invention.
  • any higher eukaryotic cell culture is available as a host line, although cells from mammals, for example monkeys, rats, hamsters, mice or humans, are very particularly preferred.
  • a large number of established cell lines are known to the person skilled in the art. In a list that is by no means exhaustive, the following cell lines are mentioned: 293T (embryo kidney cell line) (Graham et al., J. Gen. Viroi. 36: 59 (1997), BHK (baby hamster kidney cells), CHO (cells from the hamster ovaries, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Accad.
  • HeLa human carcinoma cells
  • further cell lines for example HEK293, SF9 or COS cells, which have been established especially for laboratory use.
  • Human cells in particular neuronal stem cells and cells of the “pain pathway”, preferably primary sensory neurons, are very particularly preferred.
  • Human cells, in particular autologous cells of a patient are suitable after (above all ex vivo) transformation with dsRNA molecules according to the invention or vectors according to the invention very particularly as medicaments for, for example, gene therapy purposes, that is to say after cell removal, possibly ex vivo expansion, transformation with dsRNA according to the invention, selection and retransplantation on in the patient.
  • Another object of the present invention is therefore a medicament containing at least one dsRNA according to the invention, a vector coding for this and / or a cell containing this dsRNA or this vector, and optionally suitable auxiliaries and / or additives.
  • Medicinal products a substance corresponds to the definition in Article 1 ⁇ 2 of the German Act on the Transport of Medicinal Products (AMG).
  • AMG German Act on the Transport of Medicinal Products
  • the medicaments according to the invention can be administered as liquid medicinal forms in the form of injection solutions, drops or juices, as semi-solid medicinal forms in the form of granules, tablets, pellets, patches, capsules, plasters or aerosols and contain, in addition to the at least one object according to the invention, depending on the pharmaceutical Form, if necessary, carrier materials, fillers, solvents, diluents, dyes and / or binders.
  • carrier materials if necessary, carrier materials, fillers, solvents, diluents, dyes and / or binders.
  • excipients and the amounts to be used depends on whether the medicinal product is oral, parenteral, intravenous, intraperitonal, intradermal, intramuscular, intranasal, buccal, rectal or local, for example for infections of the skin, mucous membranes and eyes , should be applied.
  • Preparations in the form of tablets, dragees, capsules, granules, drops, juices and syrups are suitable for oral administration, solutions, suspensions, easily reconstitutable dry preparations and sprays for parenteral, topical and inhalative administration.
  • Objects according to the invention in a depot in dissolved form or in a plaster, optionally with the addition of agents which promote skin penetration, are suitable percutaneous application accessories.
  • Forms of preparation which can be used orally or percutaneously can release the articles according to the invention with a delay.
  • the amount of active ingredient to be administered to the patient varies depending on the weight of the patient, the type of application, the indication and the severity of the disease. Usually 2 to 500 mg / kg of at least one object according to the invention are applied. If the medicinal product is to be used in particular for gene therapy, physiological saline, stabilizers, proteinase, DNAse inhibitors etc. are recommended as suitable auxiliaries or additives.
  • the objects according to the invention are suitable as medicaments or for the production of a medicament, for example for inhibiting nociception, due to reduced expression of the PIM1 kinase.
  • the expression level of PIM1 can be downregulated as a protein involved in pain.
  • Articles or pharmaceutical compositions containing the same can also be used for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer, in particular for the treatment of prostate cancer, leukemia or Kaposi's sarcoma.
  • This is based on the fact that the expression of PIM1 mRNA of mammals, in particular humans, can be down-regulated by objects according to the invention. This downregulation abolishes the (co) oncogenic effect of PIM1, which can result, for example, from an interaction as a result of the overexpression of PIM-1 and c-myc (van der Houven et al., Carciogenesis, 19, 847, 1998).
  • Medicaments based on objects according to the invention can also be used for the treatment of asthma or allergies.
  • PIM1 obviously plays an important role in the IL-5 signaling pathway. This signal transduction in turn is involved in the development and maturation of eosinophils that influence the pathophysiology of asthma. Down-regulation of PIM1 therefore interrupts the chain of effects in asthma etiology.
  • objects according to the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of urinary incontinence; also of neurogenic bladder symptoms; Pruritus or inflammation (chronic or acute) used.
  • Chronic inflammation can be attributed to a wide variety of causes and can also include autoimmune diseases (e.g. multiple sclerosis or psoriasis; neurodermatitis) or chronic infections.
  • objects according to the invention can be used to treat all disease symptoms associated with PIM-1, in particular all of them lation of PIM1 related diseases or disorders.
  • Another object of the invention is a method for the treatment, in particular pain treatment, of a non-human mammal or human being which needs treatment for pain, in particular chronic pain, or the other aforementioned diseases, pathophysiologies or disorders.
  • a medicament according to the invention in the administration routes disclosed above.
  • the packaging of the drug is selected depending on the route of administration.
  • Another preferred subject is the use of a nucleic acid encoding the dsRNA according to the invention, a vector according to the invention and / or a cell according to the invention for gene therapy, preferably in vivo or // 7- ' fro gene therapy.
  • Gene therapy is understood to mean a form of therapy in which, for example, a protein or — in the present case an RNA — is expressed by its effector gene by introducing nucleic acids into cells, in this case the dsRNA according to the invention.
  • a basic distinction is made between in vivo and / ⁇ -v / ro processes.
  • cells are removed from the organism and transfected ex vivo with vectors in order to be subsequently reintroduced into the same or into another organism.
  • vectors (containing the gene expressing the desired RNA molecule) are applied systemically (for example via the bloodstream) or directly into the tumor, for example to combat tumors.
  • the patient is administered a vector which contains both the transcription element for the sense strand of the dsRNA and the transcription element for the antisense strand of the -dsRNA under the control of suitable promoters.
  • the two transcription elements can also lie on different vectors, both of which must be administered.
  • Such inventive Moderate vectors containing nucleic acid which codes for dsRNA according to the invention can be used for in-vivo or in-vitro gene therapy processes.
  • Another preferred subject is a method for identifying substances according to the invention that modulate PIM-1 expression, with the following method steps:
  • method type I (a) incubation of at least one test cell with at least one dsRNA molecule to be tested, (a ') parallel incubation of a control cell without addition of the dsRNA molecule to be tested, (b) measurement of the PIM-1 kinase expression by determining the concentration the PIM-1 kinase mRNA or the translated PIM1 kinase, and (c) identification of the dsRNA to be tested via the extent of the difference between the measured value in the test cell and that in the control cell. or
  • method type II genetic engineering manipulation of at least one cell (test cell) with at least one dsRNA construct according to the invention, (a ') parallel genetic engineering manipulation of at least one identical cell (control cell) either • not taking place, • while performing the manipulation in parallel without dsRNA or dsRNA Construct or • with a modified dsRNA no longer according to the invention, (b) parallel incubation of the cells provided according to (a) and (a ') under suitable conditions, (c) measurement of the PIM-1 kinase expression by determining the concentration of the PIM-1 kinase mRNA or the PIM-1 kinase , (d) Identification of the substances via the extent of the difference between the measured value in the test cell and that in the control cell.
  • Incubation under suitable conditions is to be understood here so that the substance to be examined can react with the cell or the corresponding preparation in an aqueous medium for a defined time before the measurement.
  • the aqueous medium can be tempered, for example between 4 ° C. and 40 ° C., preferably at room temperature or at 37 ° C.
  • the incubation time can be varied between a few seconds and several hours, depending on the interaction of the substance with the protein. However, cells between 1 min and 60 min are preferred.
  • the aqueous medium can contain suitable salts and / or buffer systems so that, for example, a pH of between 6 and 8, preferably pH 7.0-7.5, prevails in the medium during the incubation. Suitable substances such as coenzymes, nutrients etc.
  • a cell that has synthesized PIM-1 kinase is a cell that has already expressed this protein endogenously or one that has been genetically modified so that in any case the cell used expresses the PIM-1 kinase and correspondingly before the start of the method according to the invention contains the PIM-1 kinase or, preferably, the P1M-1 kinase is inducibly expressed during or before the incubation steps.
  • - Genetically manipulated manipulation of cells, tissues or organisms in such a way that genetic material is introduced here.
  • - Endogenously expressed Expression of a protein which has a cell line under suitable culture conditions, without this corresponding protein having been induced to express it by genetic engineering.
  • the cells can be cells from possibly immortalized cell lines or native cells originating from tissues and isolated from them, the cell structure usually being dissolved.
  • the yardstick by means of which the method according to the invention allows the discovery of dsRNA according to the invention is the change in functional parameters as a result of the interaction of dsRNA according to the invention with the PIM-1 mRNA.
  • This interaction leads in particular to a down-regulation of the expression level of the PIM-1 on the mRNA and consequently also on the protein level.
  • the blocking or degradation of the mRNA can be detected, for example, using a Northern biot. All other methods known in the prior art for measuring the mRNA content in the incubated cells can also be used.
  • the protein expression of PIM-1 in the incubated cells can be determined by Western blots.
  • control cells can be incubated without dsRNA or preferably with dsRNA, which, however, is not directed against the PlM-1 mRNA.
  • a preferred embodiment of this method provides that the genetic engineering manipulation results in a form of a not endogenously expressed in the cell Members of the PIM kinase family, preferably the PIM-1 kinase, is expressed, possibly in combination with a reporter gene.
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention according to method type II provides that> 8 h, preferably> 12 h, in particular ⁇ 24 h, elapse between the parallel method steps (a) and (a ') and the method step (b).
  • the objects according to the invention can be introduced into the cell in the manner set out above.
  • 1A and B show fluorescence micrographs (A) and corresponding Western blot analyzes (B) of cells used to compare the activities of PsiR4 with regard to the inhibition of the expression of P1M-1 with a PIM-1 GFP coding plasmid and various concentrations of PsiR4 were co-transfected.
  • PsiR4 was used in concentrations between 1, 5 and 50 nM.
  • PsiR4inv served as a control, with PsiR4inv being the inverted sequence of PsiR4.
  • the siRNA according to the invention suppresses PIM-GFP expression (reduces the number of visible cells) even at a concentration of 5 nM.
  • Western blot analysis (B) confirms the fluorescence microscopic experiments.
  • 1C shows a Northern blot analysis of the specific degradation of PIM-1 mRNA in cotransfection experiments.
  • An actin served as a control for the amount of RNA specific probe.
  • C stands for the PIM-1 GFP control
  • + stands for the effect of 50 nM PsiR4 on PIM-1 mRNA
  • - stands for the effect of 50 nM PsiR4inv on PIM-1 mRNA.
  • PsiR4inv is an inverted control sequence.
  • Figure 2A shows the effect of 5'-sense Cy3 labeling of PsiR4 on PIM-1 GFP expression.
  • A shows the GFP fluorescence of COS-7 cells in the upper row.
  • the second row shows the Cy3 fluorescence from COS-7 cells.
  • Co-transfection experiments with 10 nM or 50 nM PsiR4-Cy3 are shown, as indicated. The controls were carried out with PIM-1-GFP alone.
  • Figure 2B shows a Western blot analysis of down-regulation of PIM-1 GFP with PsiR4 (-) and PsiR4-Cy3 (+) at the concentrations of 0 nM, 5nM and 50 nM.
  • FIG. 3 shows a fluorescence microscopic image of the colocalization of PIM-1-GFP and PsiR4-Cy3 24 hours after the co-transfection of COS-7 cells.
  • the marked arrow no. 1 indicates cells that express PIM-1 GFP in the absence of a detectable amount of siRNA.
  • the marked arrow No. 2 indicates cells that do not express PIM-1 GFP, but a visible portion of siRNA.
  • the marked arrow No. 3 indicates cells that express PIM-1-GFP and contain a recognizable amount of siRNA.
  • the superimpositions were carried out with Adobe Photoshop 7.0.
  • 4 shows a fluorescence microscopic image of the localization of PsiR4-Cy3 24 hours after lipofection in living F-11 cells. The left picture shows F-11 cells in phase contrast, while the right figure shows the same cells that contain PsiR4-Cy3.
  • FIG. 5 shows fluorescence micrographs of F-11 cells with neurite-like structures which have been transfected with PsiR4-Cy3. The location of siRNA in the neurite-like structures is marked by arrows.
  • FIG. 6A shows a graphical representation of a quantitative evaluation of an intrathecally administered PIM-1siR4 in the Bennet model (rat). The number of paw lifts on a 4 ° C cold plate on 4 consecutive days is shown. The administration of a NaCI solution served as a control. In the illustration, the days (time axis) are plotted on the X axis and the paw raises per 2 minutes on the Y axis. The dots each show the mean of two independent experiments with the specified standard deviation.
  • FIG. 6B shows a graphical representation of a quantitative evaluation of an intrathecally administered PIM-1siR4KTR in the Bennet model (rat). The number of paw lifts on a 4 ° C cold plate on 4 consecutive days is shown. The administration of a NaCI solution served as a control. In the illustration, the days are plotted on the X axis and the paw raises per 2 minutes on the Y axis. The dots show the Average of two independent experiments with the specified standard deviation.
  • FIG. 7 shows by comparative investigations in a Northern blot that the dsRNA molecules used in lanes 3 and 6 (hPsiR3 and hPsiR6) can effectively suppress the expression level of human PIM1 mRNA in Heia cells (specific effect) .
  • the experiments were carried out with 100 nM dsRNA each (c: control, different dsRNAs were applied to lanes 1 to 9, pool: mixture of the dsRNA molecules of all lanes).
  • the effect of the dsRNAs used on actin was determined to determine non-specific effects.
  • FIG. 8 shows the effect of the two dsRNA molecules hPsiR3 and hPsiR ⁇ identified according to FIG. 7 in a Northern blot analysis.
  • Different concentrations (100, 50 or 10 nM) of hPsiR3 or hPsiR ⁇ were applied in order to determine their dose-dependent effect.
  • "c” denotes the control.
  • actin was examined in order to be able to rule out non-specific effects. This shows a strong, dose-dependent down-regulation of the endogenous human PIM1 mRNA, with hPsiR ⁇ in particular already having an extremely strong suppressive effect in shows low nM range.
  • the sequence section of the PIM-1 mRNA serving as the target sequence from which the PIM-1 siRNA molecules were derived is shown above.
  • the aforementioned duplex sequences are, among others, the double-stranded RNA molecules actually tested in vivo and in vitro in Examples 1 to 5 below.
  • siRNAs used according to Example 6 are directed against the following target sequences on the human PIM1 mRNA: hPsiR3: 5'-CCG CGA CAT CAA GGA CGA A- 3 'hPsiR6: 5' -GAT ATG GTG TGT GGA GAT A- 3 ' example 1
  • a set of 5 siRNAs was constructed according to the criteria of the Dharmacon's homepage (www.dharmacon.com).
  • siRNAs were transfected in various concentrations in COS-7 cells and the effect on PIM-1-GFP expression was examined with fluorescence microscopy and Western blot analysis.
  • the siRNAs PsiR1, PsiR2 and PsiR3 showed no significant down-regulation of the PIM-1-GFP reporter gene in concentrations up to 100 nM. Only PsiR4 led to a strong P1M-1 down regulation at low concentrations. Therefore PsiR4 was examined in detail.
  • the down-regulation efficiency of PsiR4 compared to a control siRNA consisting of the inverted PsiR4 sequence was investigated in a concentration range of 1-50 nM.
  • siRNAs for example with a fluorescent dye
  • the labeling at the 5 end of the sense strand was carried out with Cy3 to label PsiR4.
  • the effect of PsiR4-Cy3 labeling on the siRNA function was examined first.
  • the reporter gene PIM-1-GFP was co-transfected with different concentrations of PsiR4-Cy3 and the efficiency of the labeled and unlabeled siRNA was compared with regard to PIM-1 expression.
  • F-11 cells were transfected to investigate the intracellular localization of PsiR4-Cy3 in detail. These cells are larger than COS-7 cells and allow the siRNA to be localized in living cells by fluorescence microscopy. A punctiform perinuclear localization of PsiR4-Cy3 was observed after lipofection (FIG. 4). This staining pattern is probably due to the endosomal uptake of siRNA by F-11 cells. The accumulation around the nucleus is an indication that siRNAs are imported into the nucleus to perform functions in heterochromatin formation. It became PsiR4-Cy3 not only located at the nucleus alone, but also found in the neurite-like structures (FIG. 5).
  • Neuropathic pain occurs among other things after damage to peripheral or central nerves and can accordingly be induced and observed in animal experiments by targeted lesions of individual nerves.
  • An animal model is the nerve lesion according to Bennett (Bennett and Xie (1988) Pain 33: 87-107).
  • Bennett Pain 33: 87-107.
  • the sciatic nerve is unilaterally provided with loose ligatures. The development of signs of neuropathy pain is observed and can be quantified using thermal or mechanical allodynia.
  • the allodynia was tested on a metal plate, which was heated to a temperature of 4 ° C using a water bath.
  • the rats were divided into groups of 9 or 10 before the intravenous application of the respective solution Divided animals.
  • the rats were placed on the cold metal plate, which was in a plastic cage. Then, over a period of two minutes before the application of a solution, it was counted how often the animals with their damaged paw jerk back violently from the cooled metal plate (previous value).
  • the PIM-1 siRNA (1ng) according to the invention showed a strong analgesic effect in this pain model, as is shown by the reduction in the withdrawal reactions of up to about 1/3 compared to the NaCI control on days 2 to 4 (FIG. 6A). In comparison, the PIM-1 control siRNA was ineffective (FIG. 6 B).

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt doppelsträngige RNA-Moleküle (dsRNAs) bereit, die für die PIM-1-Kinase spezifisch sind. Ferner werden entsprechend transfizierte Wirtszellen bereitgestellt. Gemäss einem weiteren Aspekt werden Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung von Schmerz und anderen mit PIM-1 zusammenhängenden Krankheiten offenbart, die die erfindungsgemässen Gegenstände enthalten.

Description

Anmelder: Grünenthal GmbH
P1M-1 -spezifische dsRNA-Verbindungen
Die Erfindung betrifft kleine, insbesondere Interferenz-auslösende, doppelstrangige RNA-Moleküle (dsRNA), die zu PIM-1-Kinase-mRNA komplementär sind, und erfindungsgemäße dsRNA exprimierende Gegenstände, wie bspw. Wirtszellen. Die erfindungsgemäße dsRNA und entsprechende Wirtszellen eignen sich als Arzneimittel bzw. zur Herstellung von Arzneimitteln, insbesondere zur Behandlung von Schmerzen oder anderen mit PIM-1 assoziierten krankhaften Zuständen.
Schmerz ist nach der Definition der Internationalen Gesellschaft zum Studium des Schmerzes (IASP) ein „unangenehmes Sinnes- und Gefühlserlebnis, das mit ei- ner akuten oder potentiellen Gewebsschädigung verknüpft ist oder mit Begriffen solcher Schädigungen beschrieben wird".
Die effektive Behandlung von Schmerz ist eine große Herausforderung für die molekulare Medizin. Akuter und transitorischer Schmerz ist ein wichtiges Signal des Körpers, um den Menschen vor schwerem Schaden durch die Umgebung oder Überbelastung des Körpers zu bewahren. Im Gegensatz dazu hat der chronische Schmerz, der länger als die Ursache des Schmerzes und der erwartungsgemäße Zeitrahmen der Heilung ist, keine bekannte biologische Funktion und betrifft Hunderte von Millionen Menschen weltweit. Rund 7,5 Mio. Menschen lei- den allein in der Bundesrepublik Deutschland an chronischen Schmerzen. Die pharmakologische Behandlung des chronischen Schmerzes ist noch unbefriedigend und bleibt daher eine Herausforderung für die aktuelle medizinische Forschung. Die derzeit existierenden Analgetika sind häufig nicht ausreichend wirksam und haben z. T. schwere Nebenwirkungen.
Zahlreiche Proteine sind als Ansatzpunkte in der Schmerzforschung bekannt. Hierzu gehört auch die Familie der PIM-Kinasen, wobei beispielsweise unter diesen Proteinen die PIM-1-Kinase (PIM-1) als potentielles Target für schmerzmodulierende Substanzen beschrieben ist. Somit stellt die PIM-1-Kinase also einen vielversprechenden Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Schmerzmedikamente dar. Dabei bezieht sich der Begriff schmerzmodulierend auf einen potentiellen regulierenden Einfluss auf das physiologische Schmerzgeschehen, insbesondere auf eine analgetische Wirkung.
Die PIM-1 -Kinase gehört zur Familie der Serin Threonin-Kinasen, die in der Evolution in mehrzelligen Organismen hochkonserviert ist. Zur PIM-Kinase-Familie gehören folgende PIM-Kinasen: PIM-1, PIM-2, PIM-3, PIM-4. (Saris et al. EMBO J. 10, 655,1991). Die Kinase ist ein Enzym, das Phosphatgruppen von ATP oder einem anderen Nucleosidtriphosphat auf ein anderes Molekül überträgt. In der Kontrolle des Zellwachstums, Zelldifferenzierung und der Apoptose spielt die PIM- 1 eine Rolle. Weiterhin ist PIM-1 als Proto-Onkogen beschrieben (Cuypers et al., 1984, Cell 37, 141). Bei Tumoren des hämatopoietischen Systems wird regelmäßig eine Überexprimierung von PIM-1 beobachtet (Nagarajan et al., 1986, PNAS 83, 2556). Eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren kann die Expression der PIM-1 stimulieren und die Transkription, Posttranskription, Translation und Posttranslation regulieren. Auch wird der PIM-1 -Kinase eine wichtige Rolle außerhalb des hämatopoietischen Systems zugeordnet. PIM-1 phosphoryliert etwa HP1 und andere Targets, wie z.B. cdc25 (Koike, et. al. 2000 FEBS Lett. 467,17, Mochizuki, et. al. 1999, J. Biol Chem. 274, 18659). Durch die Phosphorylierung von cdc25 wird dessen Phosphatase-Aktivität sowohl in-vivo als auch in-vitro erhöht. Durch diese cdc25-Aktivierungsverstärkung besteht wiederum ein Zusammenhang zwischen der PIM-1 -Aktivität und der Zelltransformation. Die Phosphorylierung von HP1 (Heterochromatinprotein 1) scheint für die Transkriptionsrepression, die HP1 physiologisch ausübt, eine bedeutende Rolle zu spielen.
Schließlich bleibt zu erwähnen, dass die Familie der PIM-Kinasen mit dem Socs- 1 -Protein, einem Inhibitor der JAK-Aktivierung, interagiert. Durch die Phosphorylierung von SOCS-1 durch PIM-1 scheint die Halbwertszeit des Socs-1 -Proteins verlängert zu werden, wodurch wiederum die inhibitorische Wirkung von Socs-1 auf den JAK-STAT-Aktivierungsvorgang verstärkt zu sein scheint (Chen et al., PNAS 99, 2175, 2002).
Die cDNA-Sequenz von humaner PIM-1 -Kinase findet sich in den Datenbanken unter Zugangsnummer NM 002648, die Aminosäure-Sequenz von humaner PIM- 1 -Kinase unter NP_002639. Die cDNA-Sequenz von PIM1 -Kinase, Ratte, findet sich in den Datenbanken unter NM_017034, deren Aminosäure-Sequenz unter NP_058730. Die cDNA-Sequenz von PIM-1 -Kinase, Maus, ist unter NM_0O8842 verfügbar, deren Aminosäure-Sequenz unter NP_032868.
Da also die Familie der PIM-Kinasen im allgemeinen und die PIM-1 -Kinase im besonderen an einer Vielzahl von pathologischen Zuständen durch ihre Regulationsfunktion beteiligt ist, bspw. auch an der Entstehung chronischer Schmerzen, ist die P1M-1 -Kinase ein hochinteressantes Zielprotein für die Arzneimittelforschung. Hierbei sollen von der Arzneimittelforschung Substanzen bereitgestellt werden, die etwaige zelluläre Fehlregulationen der PIM-1 -Kinase aufheben, bspw. niedermolekulare Wirkstoffe. Die Auffindung und Charakterisierung derartiger an PIM-1 bindender niedermolekularer Wirkstoffe hat bisher jedoch noch nicht zu vielversprechenden Kandidatenmolekülen geführt.
In der deutschen Patentanmeldung DE 10226702.2 werden Antisense- Oligonukleotide gegen PIM-1 offenbart, und zwar als Schmerztherapeutika. Aller- dings weisen derartige Antisense-Oligonukleotide den Nachteil auf, dass sie eine schlechte Zellpermeabilität und eine geringe intrazelluläre Effizienz besitzen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, weitere Substanzen zur Verfügung zu stellen, die die Wirkung von PIM-1 effizient modulieren können, gleichwohl aber ohne zusätzliche konjugierte Komponenten Zellpermeabilität besitzen und gale- nisch gut einsetzbar sind.
Die vorstehend genannte Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekenn- zeichneten Gegenstände der vorliegenden Erfindung gelöst. Erfindungsgemäß werden zur Lösung der Aufgabe PIM-1 -spezifische dsRNAs zur Verfügung gestellt, die das Phänomen der RNA-Interferenz auszulösen vermögen.
Auf das Phänomen der RNA-Interferenz wurde man im Zuge der immunologi- sehen Forschung aufmerksam. In den letzten Jahren wurde ein RNA-basierter Abwehrmechanismus entdeckt, der sowohl im Reich der Pilze, als auch im Pflanzen- und Tierreich vorkommt und wie ein „Immunsystem des Genoms" wirkt. Das System wurde ursprünglich unabhängig voneinander in verschiedenen Spezies, zuerst in C. elegans, beschrieben, ehe man die zugrundeliegenden Mechanismen der Vorgänge als identisch identifizieren konnte: RNA-vermittelte Virus-Resistenz in Pflanzen, PTGS („posttranscriptional gene silencing") bei Pflanzen, und RNA- Interferenz bei Eukaryonten basieren demnach auf einer gemeinsamen Funktionsweise.
Die in vitro Technik der RNA-Interferenz (RNAi) beruht auf doppelsträngigen RNA-Molekülen (dsRNA), welche die sequenzspezifische Suppression der Genexpression auslösen (Zamore (2001) Nat. Struct. Bio!. 9: 746-750; Sharp (20O1) Genes Dev. 5:485-490: Hannon (2002) Nature 41: 244-251). Die Aktivierung von Proteinkinase R und RNaseL bewirkt bei der Transfektion von Säugerzellen mit langer dsRNA unspezifische Effekte, wie z.B. eine Interferon-Antwort (Stark et. AI. (1998) Annu. Rev. Biochem. 67: 227-264; He und Katze (2002) Viral Immunol. 15: 95-119). Diese unspezifischen Effekte werden bei Verwendung von kürzerer, bspw. 21- bis 23-merer, sog. siRNA (engl. „small interfering RNA") umgangen, da unspezifische Effekte durch siRNA, die kürzer als 30 bp ist, nicht ausgelöst werden (Elbashir et. al. (2001) Nature 411: 494-498). Kürzlich wurden dsRNA- Moleküle auch in vivo zur Anwendung gebracht (McCaffrey et. al. (2002), Nature 418: 38-39; Xia et. al. (2002), Nature Biotech. 20: 1006-1010; Brummelkarnp et. al. (2002), Cancer Cell 2: 243-247).
Die erfindungsgemäße doppelstrangige RNA (dsRNA) enthält eine Sequenz mit der allgemeinen Struktur 5'-(Ni7-29)-3', wobei N irgendeine Base ist und für Nukleotide steht. Die allgemeine Struktur setzt sich aus einer doppelsträngigen RNA mit einem aus Ribonukleotiden aufgebauten Makromolekül zusammen, wobei das Ribonukleotid aus einer Pentose (Ribose), einer organischen Base und einem Phosphat besteht. Hierbei bestehen die organischen Basen in der RNA aus den Purinbasen Adenin (A) und Guanin (G) sowie den Pyrimidinbasen Cytosin (C) und Uracii (U). Die erfindungsgemäße dsRNA enthält derartige Nukleotide oder Nukleotidanalogen mit einer gerichteten Struktur.
Vorzugsweise weisen erfindungsgemäße dsRNAs die allgemeine Struktur 5'-(Nιg. 25)-3', stärker bevorzugt 5'-(Nι9-24)-3', noch stärker bevorzugt 5'-(N2ι-23)-3' auf, wobei N irgendeine Base ist. Hierbei werden zumindest 90%, vorzugsweise 95% und insbesondere 100% der Nukleotide einer erfindungsgemäßen dsRNA komplementär zu einem Abschnitt der (m)RNA-Sequenz von PIM-1 sein. 90% komplementär bedeutet hierbei, dass bei einer Länge einer erfindungsgemäßen dsRNA von bspw. 20 Nukleotiden diese höchstens 2 Nukleotide ohne entsprechende Komplementarität mit dem entsprechenden Abschnitt auf der (m)RNA aufweist. Die Sequenz der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA ist mit ihrer allgemeinen Struktur vorzugsweise aber vollständig komplementär zu einem Abschnitt der (m)RNA von PIM-1. In einer eukaryontischen Zelle wird für die Herstellung einer mRNA das Gen in seiner gesamten Länge, also einschließlich der Introns, in ein langes RNA- Molekül transkribiert, das Primärtranskript. Die Umwandlung in die mRNA erfolgt durch Prozessierung des Primärtranskripts am 5'-Ende mit einer Addition eines untypischen Nukleotids mit einem methylierten Guanin und einer Polyadenylie- rung am 3'-Ende. Bevor die RNA den Zellkern verlässt, werden durch RNA- Spleißen die Intron-Sequenzen entfernt und die Exons miteinander verbunden. Zielsequenzen für erfindungsgemäße dsRNA können sowohl das Primärtranskript als auch die prozessierte mRNA der PIM-1 -Kinase oder anderer Kinasen dieser Familie sein. Das Primärtranskript und die prozessierte mRNA werden im folgenden zusammenfassend als (m)RNA bezeichnet. Im Ergebnis kann ein Strang der doppelsträngigen erfindungsgemäßen RNA also zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des PIM-1-Gens komplementär sein.
Grundsätzlich können alle im codierenden Bereich der (m)RNA auftretenden 17 bis 29, vorzugsweise 19 bis 25 Basenpaare langen Abschnitte als Zielsequenz für eine erfindungsgemäße dsRNA dienen. Besonders bevorzugt sind hierbei solche Zielsequenzen für erfindungsgemäße dsRNAs, die zwischen Position 50, 70 oder 100 und 900 (jeweils bezogen auf das Nukleotid A des AUG Starttripletts des codierenden Bereichs der (m)RNA von PIM-1 aus den verschiedenen Spezies) liegen. Bevorzugt sind daher solche 17 bis 25, insbesondere 19 bis 25 und ganz besonders 21 bis 23 Basenpaare langen Abschnitte auf der (m)RNA als Zielsequenz für erfindungsgemäße dsRNA, deren Anfangsnukleotid einem Nukleotid mit der Position 75 bis 900 im codierenden Bereich der PIM-1-(m)RNA entspricht und deren Endnukleotid 17 bis 25, vorzugsweise 19 bis 25 und ganz besonders bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide weiter stromabwärts vom Anfangsnukleotid auf der PIM-1-(m)RNA liegt. Gleichwohl können erfindungsgemäße dsRNAs auch gegen Nukleotidsequenzen auf der PIM-1-(m)RNA, die nicht im codierenden Bereich liegen, gerichtet sein, insbesondere im nicht-codierenden 5'-Bereich der (m)RNA, bspw. also gegen nicht-codierende Bereiche des (m)RNA mit Regulationsfunkti- on. Die Zielsequenz erfindungsgemäßer dsRNA auf der PIM-1-(m)RNA kann also im translatierten und nicht-translatierten Bereich der (m)RNA und/oder im Bereich der Steuerungselemente liegen. Auch kann die Zielsequenz einer erfindungsgemäßen dsRNA im Überlappungsbereich von nicht-translatierter und translatierter Sequenz liegen, insbesondere kann die Zielsequenz mindestens ein Nukleotid stromaufwärts vom Starttriplett des kodierenden Bereichs der (m)RNA umfassen.
Ganz besonders bevorzugt sind solche erfindungsgemäßen dsRNAs, die gegen Abschnitte im codierenden Bereich der PIM-1-(m)RNA gerichtet sind, welche mit der Startsequenz AA beginnen. Das 5'-Ende der Zielsequenz einer erfindungsgemäßen dsRNA (bspw. mit den Nukleotiden AA am 5'-Terminus) spiegelt sich in der dazugehörigen erfindungsgemäßen dsRNA ebenfalls, bspw. in einer Sequenzfolge 5'-AANι5-23 und dem dazu komplementären Strang 3'-TTH^5.23, wider. Hierbei werden dsRNAs ganz besonders bevorzugt, die zu (m)RNA-Abschnitten komplementär sind und damit gegen diese gerichtet sind, welche bspw. die Sequenzfolge AACGACCUGCA, AAGCUGGCG, AAGGAGAA, AAGGAGCCC, AA- CUUGCCGGUGG, AAACACGU, AAGGACCGGA, AAUGGCACUCG, AAGUG- GUCC, AAGAAGGUGA, AAGAUCUCUUCGA, AAAGGGGAGC, AAGAGGAG- CUGG, AACUGCGGGGU, AAGGACGAAAACA, AAAACAUCCUU, AACAUC- CUUA, AAUCGCGGCGA, AAGCUCAUC, AAGGACACCGUC, AAGAGAUCAU- CA, AAUGUCAGCAUCU, AACCUUCGAAGA, AAGAAAUCCAG oder AAC- CAUCCAU, vorzugsweise als 5'-terminale Sequenz in dem Abschnitt der PIM-1- (m)RNA, gegen den erfindungsgemäße dsRNA-Moleküle gerichtet sind, oder aber grundsätzlich an beliebiger Position in dieser Zielsequenz, enthalten.
Vorzugsweise wird eine effektive Blockierung und Spaltung der (m)RNA von PIM- 1 durch erfindungsgemäße dsRNA besonders dadurch erreicht, dass bei der Wahl der Zielsequenz für erfindungsgemäße dsRNA gewisse Auswahlregeln berücksichtigt werden. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegen- den Erfindung ist daher eine dsRNA, die einen GC-Gehalt von mindestens 38%, in einer stärker bevorzugten Ausführungsform von mindestens 40% und in einer noch stärker bevorzugten Ausführungsart von mindestens 45% aufweist (Auswahlregel 1). In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weisen erfindungsgemäße dsRNA-Moleküle höchstens zwei aufeinanderfolgende Guanidin-Reste in ihrer Sequenz auf (Auswahlregel 2). Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Zielsequenz, die im Genom des Zielorganismus nur einmal im Target-Gen auftritt, nicht aber an anderen Stellen im Genom (Auswahlregel 3).
Verschiedene Kombinationen der vorgenannten Eigenschaften sind bei erfin- dugnsgemäßen dsRNA-Molekülen möglich, bspw. dsRNAs mit der Eigenschaften entsprechend den Auswahlregeln (1), (2) und/oder (3).
Die Zielsequenz einer erfindungsgemäßen dsRNA auf der PIM-1-(m)RNA ist vorzugsweise ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus den folgenden Sequen- zen: (a) 5'-AAC GUG GAG AAG GAC CGG AUU-3'; (b) 5'-AAC UCG AGU GCC CAU GGA AGU-3'; (c) 5'-AAC CGC GAC AUC AAG GAC GAA-3', (d) 5'-AAU AUU CCU UUC GAG CAU GAC-3'; (e) 5'-AAG GGU CUC UUC AGA AUG UCA- 3'; (f) 5'-CCG CGA CAT CAA GGA CGA A-3'; (g) 5'-GAT ATG GTG TGT GGA GATA-3' und (h) 5'-AAG UGU ACU UUA GGC AAA GGG-3'.
Bei einer erfindungsgemäßen dsRNA kann vorzugsweise ein modifiziertes Nukleotid auftreten. Der Begriff „modifiziertes Nukleotid" bedeutet erfindungsgemäß, dass das jeweilige Nukleotid chemisch modifiziert ist. Der Fachmann versteht unter dem Begriff „chemische Modifikation", dass das modifizierte Nukleotid durch Ersetzen, Anfügen oder Entfernen einzelner oder mehrerer Atome oder Atomgruppen im Vergleich zu natürlich vorkommenden Nukleotiden verändert ist. Mindestens ein modifiziertes Nukleotid in erfindungsgemäßer dsRNA dient einerseits der Stabilität und andererseits der Verhinderung der Dissoziation. Vorzugsweise sind zwischen 2 und 10, bevorzugt zwischen 2 und 5 Nukleotide in einer erfin- dungsgemäßen dsRNA modifiziert. Die Modifizierung der Nukleotide der dsRNA führt zu einer Deaktivierung einer von doppelsträngiger RNA abhängigen Proteinkinase (PKR) in der Zelle. Die PKR induziert Apoptose. Vorteilhafterweise ist mindestens eine 2'-Hydroxygruppe der Nukleotide der dsRNA in der doppelsträngigen Struktur durch eine chemische Gruppe, vorzugsweise eine 2'-Amino- oder eine 2'-Methylgruppe, ersetzt. Mindestens ein Nukleotid in mindestens einem Strang der doppelsträngigen Struktur kann auch ein sogenanntes „locked nucleotide" mit einem, vorzugsweise durch eine 2'-O, 4'-C-Methylenbrücke, chemisch modifizierten Zuckerring sein. Vorteilhafterweise sind mehrere Nukleotide der erfindungsgemäßen dsRNA „locked nuc- leotides".
Darüber hinaus kann durch Modifizierung des Rückgrates einer erfindungsgemäßen dsRNA ein vorzeitiger Abbau derselben verhindert werden. Insbesondere bevorzugt ist eine erfindungsgemäße dsRNA, die in Form von Phosphorthioat, 2'- O-Methyl-RNA, LNA, LNA/DNA-Gapmeren) modifiziert ist und daher eine längere Halbwertszeit in-vivo aufweist.
Vorzugsweise können die Enden der doppelsträngigen RNA (dsRNA) modifiziert werden, um einem Abbau in der Zelle oder einer Dissoziation in die Einzelstränge entgegenzuwirken, insbesondere um einen vorzeitigen Abbau durch Nukleasen zu umgehen. Eine regelmäßig nicht gewünschte Dissoziation der Einzelstränge von dsRNA tritt insbesondere bei Verwendung niedriger Konzentrationen derselben oder kurzer Kettenlängen auf. Zur besonders wirksamen Hemmung der Dissoziation kann der durch die Nukleotidpaare bewirkte Zusammenhalt der dop- pelsträngigen Struktur von erfindungsgemäßer dsRNA durch m ndestens eine, vorzugsweise mehr chemische Verknüpfung/en erhöht werden. Eine erfindungsgemäße dsRNA, deren Dissoziation vermindert ist, weist eine höhere Stabilität gegen enzymatischen und chemischen Abbau in der Zelle bzw. im Organismus oder ex vivo auf und besitzt daher eine höhere Halbwertszeit. Die chemische Verknüpfung der Einzelstränge einer erfindungsgemäßen dsRNA wird zweckmäßigerweise durch eine kovalente oder ionische Bindung, Wasser- stoffbrückenbindung(en), hydrophobe Wechselwirkungen, vorzugsweise van-der- Waals- oder Stapelungswechselwirkungen, oder durch Metallionen-Koordination gebildet. Sie kann nach einem besonders vorteilhaften Ausgestaltungsmerkmal an mindestens einem, vorzugsweise an beiden, Ende/n der erfindungsgemäßen dsRNA hergestellt werden. Es hat sich weiter als vorteilhaft erwiesen, dass die chemische Verknüpfung mittels einer oder mehrerer Verbindungsgruppen gebildet wird, wobei die Verbindungsgruppen vorzugsweise Poiy-(oxyphosphinicooxy-1 ,3- propan-diol)- und/oder Polyethylenglycol-Ketten sind. Die chemische Verknüpfung kann auch durch in der doppelsträngigen Struktur bspw. anstelle von Purinen benutzte Purin-Analoga gebildet werden. Alternativ kann es von Vorteil sein, wenn die chemische Verknüpfung durch in der doppelsträngigen Struktur eingeführte Azabenzol-Einheiten gebildet wird. Sie kann außerdem in der doppelsträngigen Struktur durch den Einsatz verzweigter Nukleotid-Analoga anstelle von nativen Nukleotiden gebildet werden.
Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, dass zur Herstellung der chemischen Verknüpfung mindestens eine der folgenden Gruppen benutzt wird: Methylblau; bi- funktioneile Gruppen, vorzugsweise Bis-(2-chlorethyl)-amin; N-acetyl-N'-(p- glyoxybenzoyl)-cystamin; 4-Thiouracil; Psoralen. Ferner kann die chemische Verknüpfung durch an den Enden des doppelsträngigen Bereichs angebrachte Thi- ophosphoryl-Gruppen gebildet werden. Vorzugsweise wird die chemische Verknüpfung an den Enden des doppelsträngigen Bereichs durch Tripelhelix- Bindungen hergestellt. Die chemische Verknüpfung kann zweckmäßigerweise durch ultraviolettes Licht induziert werden.
Eine weitere Möglichkeit zur Verhinderung frühzeitiger Dissoziation erfindungs- gemäßer dsRNA in der Zelle besteht darin, dass an den Enden der Stränge jeweils Haamadelschleife(n) ausgebildet sein können. In einer besonderen Ausfüh- rungsform weist eine erfindungsgemäße dsRNA daher eine Haamadelstruktur auf, um die Dissoziationskinetik zu verlangsamen. Bei einer derartigen Struktur ist vorzugsweise am 5'- und/oder 3'-Ende eine Loop-Struktur ausgebildet. Eine derartige Loop-Struktur weist keine Wasserstoffbrücken, typischerweise also keine Komplementarität, zwischen Nukleotidbasen auf. Typischerweise weist ein derartiger „Loop" eine Länge von mindestens 5, vorzugsweise mindestens 7 Nukleotiden auf und verbindet auf diese Weise die beiden komplementären Einzelstränge einer erfindungsgemäßen dsRNA.
Im Falle nicht-kovalenter Verknüpfung der beiden Stränge der erfindungsgemäßen dsRNA sind, um eine Dissoziation der Stränge zu verhindern, vorzugsweise die Nukleotide so modifiziert, dass eine Verstärkung der Wasserstoffbrückenbindung erreicht wird, bspw. durch Erhöhung der Wasserstoffbrücken- bindungskapazität zwischen den Basen durch ggf. modifizierter Nukleotide. Da- durch wird die Stabilität der Wechselwirkung zwischen den Strängen erhöht und gegen einen Angriff von RNAsen geschützt.
Eine erfindungsgemäße dsRNA ist vorzugsweise gegen die (m)RNA der PIM- Kinasen, insbesondere der PIM-1 -Kinase, von Säugern, wie Mensch, Affe, Ratte, Hund, Katze, Maus, Kaninchen, Meerschweinchen, Hamster, Rind, Schwein, Schaf und Ziege, gerichtet. Vorzugsweise unterdrückt eine erfindungsgemäße dsRNA die Translation von PIM-1 in einer Zelle mindestens zu 50%, stärker bevorzugt 60%, noch stärker bevorzugt 70%, und am stärksten bevorzugt zu mindestens 90%, d.h. die Zelle enthält vorzugsweise höchstens die Hälfte der nativ (ohne Behandlung mit erfindungsgemäßer dsRNA) auftretenden, zellulären PIM- Kinase-Konzentration. Die Suppression der Translation von PIM-Kinasen in Zellen nach Zugabe erfindungsgemäßer dsRNA-Moleküle beruht auf dem durch erf n- dungsgemäße Moleküle hervorgerufenen Phänomen der RNA-Interferenz. Bei der erfindungsgemäßen dsRNA handelt sich dann um sogenannte siRNA, die das Phänomen der RNA-Interferenz auslösen und PIM-Kinase-(m)RNA binden kann. Die Messung der durch erfindungsgemäße dsRNA ausgelösten Translations- suppression in Zellen kann über Northem-Blot, quantitative Real-Time PCR oder auf Proteinebene mit P1M-1 -spezifischen Antikörpern erfolgen.
Wenn die Stränge erfindungsgemäßer dsRNA an ihren Termini nicht durch Loop- Strukturen miteinander verbunden sind, können erfindungsgemäße dsRNAs, insbesondere humane erfindungsgemäße dsRNAs, sogenannte "blunt ends" (glatte Enden) aufweisen oder aber überhängende Enden. Grundsätzlich können überhängende Termini einer erfindungsgemäßen dsRNA (ein- oder beidseitig) mindestens zwei überhängende Nukleotide aufweisen, vorzugsweise 2 bis 10, insbe- sondere 2 bis 5 überhängende Nukleotide am 3'-Terminus, gegebenenfalls allerdings auch alternativ am 5'-Terminus. Die überhängenden Nukleotide der gegen PIM-1-(m)RNA gerichteten erfindungsgemäßen dsRNA können grundsätzlich ü- berhängende Enden beliebiger Sequenz sein. Bevorzugt ist dabei die Verwendung von dT (desoxy Thymidin), ggf. kann aber auch Uracil eingesetzt werden. Bei überhängenden Enden sind dTdT, jeweils am 3'-Terminus der erfindungsgemäßen dsRNA angehängt, besonders bevorzugt.
Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen dsRNA ist gegen eine Zielsequenz der PIM1-mRNA gerichtet, welche die allgemeine Struktur 5'-AAG UGU ACU UUA GGC AAA GGG-3' (Ratte; oder der entsprechenden humanen Sequenz: nicht dargestellt) aufweist. Eine besonders bevorzugte dsRNA der vorliegenden Erfindung ist daher ein Duplexmolekül (dsRNA), dessen Sense-Strang die Sequenz 5'-GUG UAC UUU AGG CAA AGG GdTdT-3' und dessen Antisense- Strang die Sequenz 5'-CCC UUU GCC UAA AGU ACA CdTdT-3' aufweist. Die- ses Beispiel einer erfindungsgemäßen dsRNA ist gegen den vorgenannten Abschnitt der PIM-1-mRNA (Ratte) gerichtet und hat jeweils am 3'-Terminus die ü- berhängenden Enden dTdT.
Die erfindungsgemäße dsRNA wird nach dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt. Dabei werden Nukleotide, insbesondere auch Oligonukleotide, bei- spielsweise nach Art der Merryfield-Synthese, an einem unlöslichen Träger (H.G. Gassen, Chemical and Enzymatic Synthesis of Genfragments (Verlag Chemie, Weinheim 1982)) oder auf andere Art synthetisiert (Beyer Walter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 20. Auflage, (S. Hirzel Verlag, Stuttgart 1984), S. 816 ff.). siRNA-Moleküie können also bspw. synthetisch hergestellt werden und können über verschiedene Anbieter, bspw. IBA GmbH (Göttingen, Deutschland), bezogen werden. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform zur rekombinanten Herstellung erfindungsgemäßer dsRNA-Moleküle erfolgt die Expression der erfindungsgemäßen dsRNA dadurch, daß das 1. Template (sense dsRNA) und das 2. Template (antisense dsRNA) unter der Kontrolle von zwei identischen oder verschiedenen Promotoren in einem oder zwei Vektoren stehen. Die Vektor(en) kann/können als Medium zur Expression der beiden Einzelstränge in einer Zelle dienen, wobei die beiden komplementären Stränge dann durch entsprechende Aufreinigungsverfahren isoliert und für den nachfolgenden Einsatz bereitgestellt werden. Andererseits können entsprechende erfindungsgemäße dsRNA codierende Vektoren auch herangezogen werden, um die erfindungsgemäße dsRNA in vivo zu exprimieren, wobei die Vektoren für gentherapeutische Verfahren bereitgestellt werden.
Erfindungsgemäße doppelstrangige RNA (dsRNA) kann in micellare Strukturen eingeschlossen sein, die die Permeation von dsRNA durch Zellmembranen in- vitro und in-vivo positiv beeinflussen. Hierbei liegt die dsRNA vorzugsweise in Li- posomen vor. Die Liposomen sind künstliche, kugelig in sich geschlossene Membranen, aus Phospholipiden, in die sowohl hydrophile Substanzen in den wässrigen Innenraum verkapselt, als auch lipophile Substanzen in den Innenbereich der Lipidmembran inkorporiert werden können. Die Voraussetzung für die Verwendung von Liposomen für experimentelle oder therapeutische Zwecke ist deren Verträglichkeit mit Zellen und Geweben. Die erfindungsgemäße dsRNA, die vorzugsweise in den Liposomen vorliegt, kann alternativ oder kumulativ auch mit einer Peptidsequenz, vorzugsweise mit einer Lysin- und Arginin-reichen Sequenz, bspw. einer Sequenz aus dem viralen TAT-Protein (bspw. enthaltend AS 49-57), modifiziert sein, um dann in Verbindung mit einem solchen Transporterpeptid die Zellmembran leichter zu permeieren zu können.
Die dsRNA kann gleichfalls in virale natürliche Kapside oder in auf chemischem oder enzymatischem Weg hergestellte künstliche Kapside oder davon abgeleitete Strukturen eingeschlossen sein. Die genannten Merkmale ermöglichen ein Einschleusen der dsRNA in vorgegebene Zielzellen. Nach einer weiteren besonders vorteilhaften Ausgestaltung ist vorgesehen, dass die erfindungsgemäße dsRNA an mindestens ein von einem Virus stammendes, davon abgeleitetes oder ein synthetisch hergestelltes virales Hüllprotein gebunden, damit assoziiert oder da- von umgeben ist. Das Hüllprotein kann vom Polyomavirus abgeleitet sein. Die dsRNA kann als Hüllprotein das Virus-Protein 1 (VP1) und/oder das Virus-Protein 2 (VP2) des Polyomavirus aufweisen. Die Verwendung derartiger Hüllproteine ist z.B. aus der DE 19618797 A1 bekannt, deren Offenbarung insoweit vollumfänglich einbezogen wird. Die vorgenannten Ausgestaltungen können das Einführen der erfindungsgemäßen dsRNA in die Zelle verbessern.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Wirtszellen, ausgenommen humane Keimzellen und humane embryonale Stammzellen, die mit mindestens einer erfindungsgemäßen dsRNA oder mit den den Einzelsträngen zugrundeliegenden DNA-Molekülen transformiert sind. Erfindungsgemäße dsRNA-Moleküle können in die jeweilige Wirtszelle über übliche Methoden, bspw. Transformation, Transfektion, Transduktion, Elektroporation oder Partikel-Gun eingebracht werden, und zwar als solche oder in Form von Vektoren, die die Stränge einer erfindungsgemäßen dsRNA induzierbar exprimieren. Bei der Trans- formation werden mindestens zwei voneinander verschiedene dsRNAs in die Zelle eingeführt, wobei ein Strang jeder dsRNA komp ementär ist zu einem Abschnitt der (m)RNA der PIM-1. Der komplementäre Bereich der dsRNA zu einem Abschnitt der (m)RNA von PIM-1 enthält typischerweise 17 bis 30 aufeinanderfolgende Nukleotidpaare. Als Wirtszellen kommen alle Zellen pro- oder eukaryontischer Natur in Betracht, bspw. von Bakterien, Pilzen, Hefen, pflanzlichen oder tierischen Zellen. Bevorzugte Wirtszellen sind Bakterienzellen, wie Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryontische Mikroorganismen, wie Aspergillus oder Sac- charomyces cerevisiae oder die gewöhnliche Bäckerhefe (Stinchcomb et. al. (1997) Nature 282: 39). In einer bevorzugten Ausführungsform werden jedoch zur Transformation erfindungsgemäßer dsRNA-Konstrukte Zellen aus multizellulären Organismen gewählt. Im Prinzip ist jede höhere eukaryontische Zellkultur als Wirtszeile verfügbar, wenn auch Zellen von Säugern, bspw. Affen, Ratten, Hams- tern, Mäusen oder Menschen, ganz besonders bevorzugt sind. Dem Fachmann ist eine Vielzahl von etablierten Zellinien bekannt. In einer keineswegs abschließenden Aufzählung werden die folgenden Zellinien genannt: 293T (Embryonen- nierenzellinie) (Graham et al., J. Gen. Viroi. 36: 59 (1997), BHK (Babyhamsternie- renzellen), CHO (Zellen aus den Hamsterovarien, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Accad. Sei. USA 77: 4216, (1980)), HeLa (humane Karzinomzellen) und weitere - insbesondere für den Laboreinsatz etablierte - Zellinien, bspw. HEK293-, SF9- oder COS-Zellen. Ganz besonders bevorzugt sind humane Zellen, insbesondere neuronale Stammzellen und Zellen des "Schmerz- Weges", vorzugsweise primäre sensorische Neuronen. Humane Zellen, insbesondere autologe Zellen eines Pati- enten, eignen sich nach (vor allem ex vivo) Transformation mit erfindungsgemäßen dsRNA-Molekülen oder erfindungsgemäßen Vektoren ganz besonders als Arzneimittel für bspw. gentherapeutische Zwecke, also nach Durchführung einer Zellentnahme, ggf. ex vivo Expansion, Transformation mit erfindungsgemäßer dsRNA, Selektion und Retransplantation in den Patienten.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Arzneimittel, enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße dsRNA, einen für diese codierenden Vektor und/oder eine diese dsRNA oder diesen Vektor enthaltende Zelle, sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe. Arzneimittel: ein Stoff entsprechen der Definition im Artikel 1 §2 des deutschen Gesetzes über den Verkehr mit Arzneimitteln (AMG). Das heißt, Stoffe oder Zubereitungen aus Stoffen, die dazu bestimmt sind, durch Anwendungen am oder im menschlichen oder tierischen Körper 1. Krankheiten, Leiden, Körperschäden oder krankhafte Beschwerden zu heilen, lindern, zu verhüten oder zu erkennen, 2. die Beschaffenheit, den Zustand oder die Funktionen des Körpers oder seelische Zustände erkennen zu lassen. 3. vom menschlichen Körper erzeugte Wirkstoffe oder Körperflüssigkeiten zu ersetzen, 4. Krankheitserreger, Parasiten oder körperfremde Stoffe abzuwehren, zu beseitigen oder unschädlich zu machen oder 5. die Beschaffenheit, den Zustand oder die Funktionen des Körpers oder seelische Zustände zu beeinflussen.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können als flüssige Arzneiformen in Form von Injektionslösungen, Tropfen oder Säfte, als halbfeste Arzneiformen in Form von Granulaten, Tabletten, Pellets, Patches, Kapseln, Pflaster oder Aerosolen verabreicht werden und enthalten neben den mindestens einem erfindungsgemä- ßen Gegenstand je nach galenischer Form gegebenenfalls Trägermaterialien, Füllstoffe, Lösungsmittel, Verdünnungsmittel, Farbstoffe und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie die einzusetzenden Mengen derselben hängt davon ab, ob das Arzneimittel oral, parenteral, intravenös, intraperitonal, intradermal, intramuskulär, intranasal, buccal, rectal oder örtlich, zum Beispiel auf Infektionen an der Haut, der Schleimhäute und an den Augen, appliziert werden soll. Für die orale Applikation eignen sich Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten, Tropfen, Säften und Sirupen, für die parenterale, topische und inhalative Applikation, Lösungen, Suspensionen, leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen sowie Sprays. Erfindungsgemäße Gegenstände in einem De- pot in gelöster Form oder in einem Pflaster, gegebenenfalls unter Zusatz von die Hautpenetration fördernden Mitteln, sind geeignete perkutane Applikationszube- reitungen. Oral oder perkutan anwendbare Zubereitungsformen können die erfindungsgemäßen Gegenstände verzögert freisetzen. Die an den Patienten zu verabreichende Wirkstoffmenge variiert in Abhängigkeit vom Gewicht des Patienten, von der Applikationsart, der Indikation und dem Schweregrad der Erkrankung. Üblicherweise werden 2 bis 500 mg/kg wenigstens eines erfindungsgemäßen Gegenstandes appliziert. Wenn das Arzneimittel insbesondere zur Gentherapie verwendet werden soll, empfehlen sich als geeignete Hilfs- oder Zusatzstoffe beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung, Stabilisatoren, Proteinase-, DNAse-lnhibitoren etc.
Die erfindungsgemäßen Gegenstände eignen sich als Arzneimittel oder zur Herstellung eines Arzneimittels, bspw. zur Inhibition der Nozizeption, aufgrund reduzierter Expression der PIM1-Kinase. Mittels erfindungsgemäßer dsRNA kann kann das Expressionsniveau von PIM1 als am Schmerzgeschehen beteiligtes Protein herunterreguliert werden. Daraus resultiert die Verwendung mindestens einer erfindungsgemäßen dsRNA, eines Vektors, codierend für erfindungsgemäße dsRNA, und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, enthaltend mindestens einen der vorgenannten Erfindungsgegenstände, zur Herstellung eines Arznei- bzw. Schmerzmittels, zur Be- handlung von Schmerz, insbesondere von chronischem Schmerz, taktiler Allody- nie, thermisch ausgelöstem Schmerz, und/oder Entzündungsschmerz.
Weiterhin können erfindungsgemäße Gegenstände bzw. pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend dieselben, auch zur Herstellung eines Arzneimit- tels zur Behandlung von Krebserkrankungen, insbesondere zur Behandlung von Prostatakrebs, Leukämien oder Kaposi-Sarkom, eingesetzt werden. Dies beruht darauf, dass durch erfindungsgemäße Gegenstände die Expression von PIM1- mRNA des Säugers, insbesondere des Menschen, herunterreguliert werden kann. Durch diese Herunterregulation wird die (co)onkogene Wirkung von PIM1 aufge- hoben, die sich bspw. aus einem Zusammenspiel infolge der Überexpression von PIM-1 und c-myc ergeben kann (van der Houven et al., Carciogenesis, 19, 847, 1998). Infolge der starken Überexpression von PIM-1 im Cytoplasma von Tumorgewebe aus der Prostata (gegenüber nicht tumorigenem Gewebe) ergibt sich eine bevorzugte Verwendung erfindungsgemäßer Gegenstände zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Prostatakrebs. Dies gilt auch für deren Ver- wendung zur Behandlung von Kaposi-Sarkom, da Genexpressionsprofil- Untersuchungen zeigen, dass PIM-Kinasen auch in derartigen Tumorgeweben deutlich hochreguliert sind, eine Herunterregulation mit erfindungsgemäßen Gegenständen also einen Antitumor-Effekt ausüben würde. Schließlich ergibt sich ein therapeutisches Potential für erfindungsgemäße Gegenstände auch bei Leu- kämie-Erkrankungen, da das humane PIM-1-Gen in einer Chromosomenregion von Chromosom 6 liegt, die translokationssensibel ist (Nagarajan et al., PNAS 83, 2556, 1986). Darüber hinaus tritt auch eine signifikante Überexpression von PIM- 1 regelmäßig bei myeloischer oder lymphoischer akuter Leukämie auf.
Arzneimittel auf der Basis erfindungsgemäßer Gegenstände können auch zur Behandlung von Asthma oder Allergien Einsatz finden. So etwa spielt PIM1 offensichtlich im IL-5-Signaltransduktionsweg eine bedeutende Rolle. Diese Signaltransduktion ist wiederum an der Entwicklung und Reifung von Eosinophi- len beteiligt, die die Pathophysiologie von Asthma mitbeeinflussen. Eine Herunter- regulation von PIM1 unterbricht daher die Wirkungskette bei der Asthma- Ätiologie.
Darüber hinaus wird die Verwendung erfindungsgemäßer Gegenstände zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Harninkontinenz; auch von neu- rogenen Blasensymptomen; Pruritus oder Entzündungen (chronisch oder akut) eingesetzt. Chronische Entzündungen können auf die unterschiedlichsten Ursachen zurückzuführen sein und können auch Autoimmunerkrankungen (bspw. multiple Sklerose oder Psoriasis; Neurodermitis) oder chronische Infektionen umfassen. Insgesamt können mit erfindungsgemäßen Gegenständen alle mit PIM-1 zusammenhängenden Krankheitssymptome, insbesondere alle mit der Hochregu- lation von PIM1 zusammenhängenden Krankheiten oder Störungen behandelt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung, insbe- sondere Schmerzbehandlung, eines nicht-humanen Säugetieres oder Menschen, das oder der eine Behandlung von Schmerzen, insbesondere chronischer Schmerzen, benötigt, oder der anderen vorgenannten Krankheiten, Pathophysio- lien oder Störungen, durch Verabreichung eines erfindungsgemäßen Arzneimittels auf den vorstehend offenbarten Verabreichungswegen. Abhängig vom Verab- reichungsweg wird die Konfektionierung des Arzneimittels gewählt.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist die Verwendung einer die erfindungsgemäße dsRNA kodierenden Nukleinsäure, eines erfindungsgemäßen Vektors und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle für die Gentherapie, vorzugsweise In- vivo- oder //7- 'fro-Gentherapie. Unter Gentherapie versteht man eine Therapieform, bei der durch die Einführung von Nukleinsäuren in Zellen bspw. ein Protein oder - im vorliegenden Fall eine RNA - durch sein Effektorgen exprimiert wird, hier also die erfindungsgemäße dsRNA. Man unterscheidet prinzipiell In-vivo und /π-v/ro-Verfahren. Bei /π-v/ϊro-Verfahren werden Zellen aus dem Organismus ent- fernt und ex vivo mit Vektoren transfiziert, um anschließend wieder in denselben oder in einen anderen Organismus eingebracht zu werden. Bei der In-vivo- Gentherapie werden Vektoren (enthaltend das das gewünschte RNA-Molekül exprimierende Gen), beispielsweise zur Bekämpfung von Tumoren, systemisch (z.B. über die Blutbahn) oder direkt in den Tumor appliziert. Gemäß einer bevor- zugten Ausführungsform wird dem Patienten ein Vektor verabreicht, der sowohl das Transkriptionselement für den Sense-Strang der dsRNA, als auch das Transkriptionselement für den Antisense-Strang der -dsRNA unter der Kontrolle geeigneter Promotoren enthält. Gemäß einer alternativen bevorzugten Ausführungsform können die beiden Transkriptionselemente auch auf verschiedenen Vektoren liegen, die beide verabreicht werden müssen. Derartige erfindungsge- mäße Vektoren, enthaltend Nukleinsäure, die für erfindungsgemäße dsRNA codiert, können für In-Vivo- oder In-Vitro-Gentherapieverfahren eingesetzt werden.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist ein Verfahren zur Identifizierung von die PIM-1 -Expression modulierenden erfindungsgemäßen Substanzen mit folgenden Verfahrensschritten:
Gemäß Verfahrenstyp I (a) Inkubation mindestens einer Testzelle mit mindestens einem zu testenden dsRNA-Molekül, (a') parallele Inkubation einer Kontrollzelle ohne Zugabe des zu testenden dsRNA-Moleküls, (b) Messung der PIM-1-Kinase-Expression durch Konzentrationsbestimmung der PIM-1-Kinase-mRNA oder der translatierten PIM1- Kinase, und (c) Identifizierung der zu testenden dsRNA über das Ausmaß der Differenz zwischen dem Messwert bei der Testzelle und dem bei der Kontrollzelle. oder
Gemäß Verfahrenstyp II (a) gentechnische Manipulation mindestens einer Zelle (Testzelle) mit mindestens einem erfindungsgemäßen dsRNA-Konstrukt, (a') parallele gentechnische Manipulation mindestens einer identischen Zelle (Kontrollzelle) entweder • unterbleibend, • unter Durchführung der Manipulation parallel ohne dsRNA oder dsRNA-Konstrukt oder • mit einer veränderten nicht mehr erfindungsgemäßen dsRNA, (b) parallele Inkubation der gemäß (a) und (a') bereitgestellten Zellen unter geeigneten Bedingungen, (c) Messung der PIM-1-Kinase-Expression durch Konzentrationsbestimmung der PIM-1-Kinase-mRNA oder der PIM-1 -Kinase. (d) Identifizierung der Substanzen über das Ausmaß der Differenz zwischen dem Messwert bei der Testzelle und dem bei der Kontrollzelle.
Die Inkubation unter geeigneten Bedingungen ist hier so zu verstehen, dass die zu untersuchende Substanz mit der Zelle oder der entsprechenden Präparation in einem wässrigen Medium eine definierte Zeit vor der Messung reagieren kann. Dabei kann das wässrige Medium temperiert werden, beispielsweise zwischen 4°C und 40°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur oder bei 37°C. Die Inkubationszeit kann zwischen wenigen Sekunden und mehreren Stunden variiert wer- den, je nach der Wechselwirkung der Substanz mit dem Protein. Bevorzugt sind aber Zellen zwischen 1 min und 60 min. Das wässrige Medium kann geeignete Salze und/oder Puffersysteme enthalten, so dass bei der Inkubation beispielsweise ein pH zwischen 6 und 8, vorzugsweise pH 7,0 - 7,5 im Medium herrscht. Dem Medium können weiter geeignete Substanzen, wie Coenzyme, Nährstoffe etc. beigefügt werden. Die geeigneten Bedingungen können vom Fachmann in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Wechselwirkung der Substanz mit dem Protein aufgrund seiner Erfahrung, der Literatur oder weniger, einfacher Vorversuche leicht festgelegt werden, um im Verfahren einen möglichst deutlichen Messwert zu erhalten. Eine Zelle, die PIM-1 -Kinase synthetisiert hat, ist eine Zel- le, die dieses Protein bereits endogen exprimiert hat oder eine solche, die gentechnisch verändert wurde, so dass in jedem Fall die eingesetzte Zelle die PIM-1- Kinase exprimiert und entsprechend vor Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens die PIM-1-Kinase enthält oder, bevorzugt, die P1M-1-Kinase induzierbar während oder vor den Inkubationschritten exprimiert wird. In diesem Zusammenhang bedeutet - genetisch manipuliert: Manipulation von Zellen, Geweben oder Organismen derart, dass hier genetisches Material eingebracht wird. - endogen exprimiert: Expression eines Proteins, die eine Zellinie unter geeigneten Kulturbedingungen aufweist, ohne das dieses entsprechende Pro- tein durch gentechnische Manipulation zur Expression veranlasst wurde.
Die Zellen können Zellen aus evt. immortalisierten Zellinien oder native aus Geweben stammende und aus diesen isolierte Zellen sein, wobei der Zeilverband meist aufgelöst ist. Besonders relevant ist der Einsatz von Testzellen, die aus Tumorzellen stammen (z.B. Heia-Zellen) oder von am Schmerzgeschehen beteiligten Zellen, insbesondere Neuronen.
Der Maßstab, mit dessen Hilfe das erfindungsgemäße Verfahren die Auffindung erfindungsgemäßer dsRNA erlaubt, ist die Veränderung funktioneller Parameter infolge der Wechselwirkung erfindungsgemäßer dsRNA mit der PIM-1-mRNA. Diese Wechselwirkung führt insbesondere zu einer Herunterregulation des Expressionsniveaus der PIM-1 auf der mRNA- und folglich auch auf der Proteinebene. Auf der mRNA-Ebene kann die Blockierung bzw. der Abbau der mRNA bspw. mit Hilfe eines Northern-Biots detektiert werden. Auch alle anderen im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Messung des mRNA-Gehalts in den inkubierten Zellen können herangezogen werden. Darüber hinaus oder alternativ kann die Proteinexpression von PIM-1 in den inkubierten Zellen über Western-Blots bestimmt werden. Diese Techniken erlauben einen Vergleich der Expression von PIM-1 in den mit der zu testenden dsRNA inkubierten Zellen im Vergleich zur Si- tuation bei den inkubierten Kontrollzellen. Die Kontrollzellen können dabei ohne dsRNA inkubiert werden oder bevorzugt mit dsRNA, die allerdings nicht gegen die PlM-1-mRNA gerichtet ist.
Eine bevorzugte Ausführungsform diese Verfahrens sieht vor, dass durch die gen- technische Manipulation eine in der Zelle nicht endogen exprimierte Form eines Mitglieds der PIM-Kinase-Familie, vorzugsweise die PIM-1 -Kinase, exprimiert wird, ggf. in Kombination mit einem Reportergen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß Verfahrenstyp II sieht vor, dass zwischen den parallelen Verfahrensschritten (a) und (a') und dem Verfahrensschritt (b) > 8 h, vorzugsweise > 12 h, insbesondere ≥ 24 h, vergehen.
Das Einbringen der erfindungsgemäßen Gegenstände in die Zelle kann dabei auf die vorstehend dargelegte Art und Weise erfolgen.
Die Figuren zeigen:
Fig. 1 A und B zeigen fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen (A) und kor- respondierende Westem-Blot-Anaiysen (B) von Zellen, die zum Vergleich der Aktivitäten von PsiR4 bezüglich der Hemmung der Expression von P1M-1 mit einem PIM-1-GFP kodierenden Plasmid und verschiedenen Konzentrationen von PsiR4 kotransfiziert wurden. PsiR4 wurde in Konzentrationen zwischen 1, 5 und 50 nM verwendet. PsiR4inv diente als Kontrolle, wobei PsiR4inv die invertierte Sequenz von PsiR4 darstellt. Wie die fluoreszenzmikroskopische Analyse in (A) zeigt, unterdrückt die erfindungsgemäße siRNA die PIM-GFP- Expression (reduziert die Zahl der sichtbaren Zellen) bereits bei einer Konzentration von 5 nM. Die Western-Blot-Analyse (B) bestätigt die fluoreszenzmikroskopischen Experimente.
Fig. 1 C zeigt eine Northern-Blot-Analyse der spezifischen Degradati- on von PIM-1-mRNA in Kotransfektions-Experimenten. Als Kontrolle für die Menge von RNA diente eine Aktin- spezifische Sonde. C steht für die PIM-1-GFP Kontrolle, + steht für den Effekt von 50 nM PsiR4 auf PIM-1-mRNA und - steht für den Effekt von 50 nM PsiR4inv auf PIM-1-mRNA. PsiR4inv ist eine invertierte Kontroll-Sequenz.
Fig. 2 A zeigt die Wirkung von 5'-Sense-Cy3-Markierung von PsiR4 auf die PIM-1-GFP-Expression. A zeigt in der oberen Reihe die GFP-Fluoreszenz von COS-7 Zellen. In der zweiten Reihe ist die Cy3-Fluoreszenz von COS-7 Zellen dargestellt. Dargestellt sind Kotransfektions-Experimente mit 10 nM oder 50 nM PsiR4-Cy3, wie angegeben. Die Kontrollen wurden allein mit PIM-1-GFP durchgeführt.
Fig. 2B zeigt eine Westem-Blot-Analyse der Herunterregulierung von PIM-1-GFP mit PsiR4 (-) und PsiR4-Cy3 (+) mit den Konzentrationen von 0 nM, 5nM und 50 nM.
Fig. 3 zeigt eine fluoreszenzmikroskopische Abbildung der Kolokalisation von PIM-1-GFP und PsiR4-Cy3 24 Stunden nach der Kotransfektion von COS-7 Zellen. Der markierte Pfeil Nr. 1 kennzeichnet Zellen, die PIM-1-GFP exprimieren in Abwesenheit einer feststellbaren Mengen von siRNA. Der markierte Pfeil Nr. 2 kennzeichnet Zellen, die nicht PIM-1- GFP exprimieren, aber einen sichtbaren Anteil von siRNA. Der markierte Pfeil Nr. 3 kennzeichnet Zellen, die PIM-1-GFP exprimieren und eine erkennbare Menge von siRNA enthalten. Die Übereinanderlagerungen wurden mit Adobe Photo- shop 7.0 durchgeführt. Fig. 4 zeigt eine fluoreszenzmikroskopische Abbildung der Lokalisation von PsiR4-Cy3 24 Stunden nach der Lipofektion in lebenden F-11 Zellen. Das linke Bild zeigt F-11 Zellen im Phasenkontrast, während die rechte Figur die gleichen Zellen zeigt, die PsiR4-Cy3 enthalten.
Fig. 5 zeigt fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von F-11 Zellen mit neuritenartigen Strukturen, die mit PsiR4-Cy3 transfiziert wurden. Die Lokalisation von siRNA in den neuritenartigen Strukturen ist durch Pfeile markiert.
Fig. 6 A zeigt eine graphische Darstellung einer quantitativen Auswertung einer intrathekal verabreichten PIM-1siR4 im Bennet-Modell (Ratte). Gezeigt ist jeweils die Anzahl der Pfotenhebungen auf einer 4°C kalten Platte an 4 aufeinanderfolgenden Tagen. Als Kontrolle diente die Verabreichung einer NaCI-Lösung. In der Darstellung sind auf der X-Achse die Tage (Zeitachse) aufgetragen und auf der Y-Achse die Pfotenhebungen pro 2 Minute. Die Punkte zeigen jeweils den Mit- telwert zweier unabhängiger Experimente mit der angegebenen Standardabweichung.
Fig. 6 B zeigt eine graphische Darstellung einer quantitativen Auswertung einer intrathekal verabreichten PIM-1siR4KTR im Bennet-Modell (Ratte). Gezeigt ist jeweils die Anzahl der Pfotenhebungen auf einer 4°C kalten Platte an 4 aufeinanderfolgenden Tagen. Als Kontrolle diente die Verabreichung einer NaCI-Lösung. In der Darstellung sind auf der X-Achse die Tage aufgetragen und auf der Y-Achse die Pfotenhebungen pro 2 Minute. Die Punkte zeigen jeweils den Mittelwert zweier unabhängiger Experimente mit der angegebenen Standardabweichung.
Figur 7 stellt durch vergleichende Untersuchungen in einem Northern- Blot dar, dass die in den Spuren 3 bzw. 6 verwendeten dsRNA-Moleküle (hPsiR3 bzw. hPsiR6) das Expressionsniveau von humaner PIM1-mRNA in Heia-Zellen wirksam unterdrücken können (spezifischer Effekt). Die Experimente wurden mit jeweils 100 nM dsRNA durchgeführt (c: Kontrolle, auf den Spuren 1 bis 9 wurden verschiedene dsRNAs aufgetragen, Pool: Gemisch aus den dsRNA-Molekülen aller Spuren). Als weitere Kontrolle wurde die Wirkung der eingesetzten dsRNAs auf Actin zur Bestimmung unspezifischer Effekte ermittelt.
Figur 8 zeigt die Wirkung der beiden gemäß Figur 7 identifizierten dsRNA-Moleküle hPsiR3 bzw. hPsiRδ in einer Northern-Blot- Analyse. Aufgetragen wurden verschiedene Konzentrationen (100, 50 bzw. 10 nM) von hPsiR3 bzw. hPsiRβ, um deren do- sisabhängige Wirkung bestimmen zu können. Wiederum bezeichnet „c" die Kontrolle. Weiterhin wurde die Expression von Actin untersucht, um unspezifische Effekte ausschließen zu können. Hierbei zeigt sich eine starke, dosisabhängige Herunterregulation der endogenen humanen PIM1-mRNA, wobei insbesondere hPsiRδ eine ausgesprochen stark supprimie- rende Wirkung bereits im niedrigen nM-Bereich zeigt. Tabelle 1 Charakteristische siRNAs gegen PIM-1
Figure imgf000028_0001
siRNA gegen PIM-1 (Ratte)
PIM-1siR4 AA-N19 mRNA Target 5' → 3'
5' AAG UGU ACU UUA GGC AAA GGG 3' siRNA Duplex
5' GUG UAC UUU AGG CAAAGG G dTdT 3' 3' dTdT CACAUGAAA UCC GUU UCC C 5'
PIM-1siR4 KTR
AA-N19 mRNA Target 5' → 3'
5' AAG GGA AAC GGA UUU CAU GUG 3'
siRNA Duplex
5' GGG AAA CGG AUU UCA UGU G dTdT 3' 3' dTdT CCC UUU GCC UAA AGU ACA C 5'
Für die beiden erfindungsgemäßen siRNA-Duplex-Sequenzen ist jeweils voran- stehend der als Zielsequenz dienende Sequenzabschnitt der PIM-1-mRNA dargestellt, von der die PIM-1 siRNA-Moleküle abgeleitet wurden. Die vorgenannten Duplex-Sequenzen sind unter anderen die tatsächlich in vivo und in vitro in den nachfolgenden Beispielen 1 bis 5 getesteten Doppelstrang-RNA-Moleküle. siRNA gegen PIM-1 (human)
Die gemäß Beispiel 6 eingesetzten siRNAs (hPsiR3 bzw. hPsiR6) sind gegen die folgenden Zielsequenzen auf der humanen PIM1-mRNA gerichtet: hPsiR3: 5' -CCG CGA CAT CAA GGA CGA A- 3' hPsiR6: 5' -GAT ATG GTG TGT GGA GAT A- 3' Beispiel 1
Erzeugung von PIM-1 spezifischer siRNA
Es wurde ein Satz von 5 siRNAs gemäß den Kriterien der Dharmacon's homepa- ge konstruiert (www.dharmacon.com).
Diese siRNAs wurden in verschiedenen Konzentrationen in COS-7 Zellen transfi- ziert und die Wirkung auf die PIM-1-GFP-Expression wurde mit Fluoreszenzmikroskopie und Western-Blot-Analyse untersucht. Die siRNAs PsiR1 , PsiR2 und PsiR3 zeigten keine wesentliche Herunterregulierung des PIM-1-GFP- Reportergens in Konzentrationen bis zu 100 nM. Nur PsiR4 führte bei geringen Konzentrationen zu einer starken P1M-1 -Herunterregulierung. Daher wurde PsiR4 im Detail untersucht. Es wurde der Herunterregulierungseffizienz von PsiR4 im Vergleich zu einer Kontroll-siRNA, bestehend aus der invertierten PsiR4- Sequenz, in einem Konzentrationsbereich von 1 - 50 nM untersucht. Im Zuge der Fluoreszenzmessung wurde eine Verringerung der Zellen mit einem grünen Fluo- reszenzphänotyp bei einer Konzentration von 5 nM beobachtet, während die in- vertierte Kontrolle keinen nachweisbaren Herunterregulierungseffekt bis zu einer Konzentration von 50 nM (Fig. 1A) zeigte. Die Western-Blot-Experimente bestätigten die durch Fluoreszenzdarstellung erhaltenen Effekte (Fig. 1B) mit einer unabhängigen Methode. PIM-1 unterzieht sich einer Autophosphorylierung und ist daher in Figur 1B durch Doppelbanden dargestellt, die unterschiedliche Phospho- rylierungsstadien des Proteins darstellen. Bei einer Konzentration von 1 nM zeigte PsiR4 keine Wirkung, jedoch wurde die PIM-1-GFP-Expression bei einer Konzentration von 5 nM klar reduziert. Höhere siRNA Konzentrationen führten zu mehr als 90% Auslöschung von PIM-1-GFP, während die Kontroll-siRNA keinen deutlichen Effekt zeigte. Um nachzuweisen, dass die beobachtete Auslöschung nach siRNA-Gabe auf dem Abbau der PIM-1 mRNA beruht, wurde eine Northem-Blot-Analyse mit einer PIM-1 -spezifischen Sonde durchgeführt. PIM-1 mRNA wurde in Gegenwart von PsiR4 abgebaut, blieb jedoch unverändert in Gegenwart der invertierten Kontroll- siRNA bei einer Konzentration von 50 nM (Fig. 1 C) sichtbar.
Beispiel 2
Wirksamkeit einer Cy3-markierten PIM-1 -siRNA
Die Markierung von siRNAs beispielsweise mit einem Fluoreszenzfarbstoff ist an 4 unterschiedlichen Positionen möglich: an den 5- und 3 -Enden des Sense- bzw. Antisense-Stranges. Hierin wurde die Markierung am 5 -Ende des Sense- Stranges mit Cy3 zur Markierung von PsiR4 durchgeführt. Um die zelluläre Aufnahme, Verteilung und Lokalisierung zu untersuchen, wurde zunächst die Wirkung der PsiR4-Cy3-Markierung auf die siRNA-Funktion untersucht. Hierzu wurde das Reporter-Gen PIM-1-GFP mit unterschiedlichen Konzentrationen von PsiR4- Cy3 kotransfiziert und die Effizienz der markierten und nicht-markierten siRNA in Hinblick auf die PIM-1 -Expression verglichen. Eine zelluläre Aufnahme bei niedrigen nanomolaren Konzentrationen von PsiR4-Cy3 war zu beobachten, und diese Aufnahme stieg konstant bis zu einer Konzentration von 50 nM an (Fig. 2 A). Die Western-Blot-Analyse bestätigte die Auslöschung von PIM-1 mit PsiR4-Cy3 auf Proteinebene (Fig. 2B). Im Vergleich zu nicht-markiertem PsiR4 wurde eine nur geringe, jedoch reproduzierbare negative Auswirkung der Farbstoff-Markierung auf die siRNA-Effizienz beobachtet. Bei geringen nanomolaren Konzentrationen war die nicht-markierte siRNA wirksamer, jedoch war der Herunterregulierungsef- fekt für beide bei einer Konzentration von 5 nM bereits zu beobachten. Beispiel 3
Zelluläre Aufnahme von PsiR4
Die zelluläre Aufnahme von PsiR4-Cy3 in COS-7 Zellen wurde durch Lipofektion untersucht. Zellen mit Cy3-Fluoreszenz wurden bereits 15 Minuten nach der Transfektion beobachtet. Die Anzahl an transfizierten Zellen stieg bis zu 4 Stunden nach der Lipofektion an und erreichte danach ein Plateau (Daten nicht gezeigt). Während dieses Zeitraumes nahmen mehr als 95% der Zellen PsiR4-Cy3 auf. Weiterhin wurden PIM-1-GFP und eine niedrige Konzentration von PsiR4- Cy3 (10nM) kotransfiziert, um sicherzustellen, dass eine deutliche Anzahl an Zellen weiterhin PIM-1-GFP in Gegenwart von siRNA exprimiert. Unter diesen Bedingungen wurde beobachtet, dass die meisten Zellen, die PsiR4-Cy3 enthalten, keinen GFP-Phänotyp zeigten (Fig. 3, markierter Pfeil Nr. 2 kennzeichnet einige Beispiele) und umgekehrt die meisten Zellen, die einen deutlichen GFP-Phänotyp aufwiesen, keine PsiR4-Cy3-Fluoreszenz zeigten (Fig. 3, markierter Pfeil Nr. 1). Einige der Zellen enthielten Cy3-markierte siRNA und einen GFP-Phänotyp (Fig. 3 markierter Pfeil Nr. 3).
Beispiel 4
Lokalisierung von PsiR4 in F-11 Zellen
Zur Untersuchung der intrazellulären Lokalisierung von PsiR4-Cy3 im Detail wur- den F-11 Zellen transfiziert. Diese Zellen sind größer als COS-7 Zellen und erlauben die siRNA durch Fluoreszenzmikroskopie in lebenden Zellen zu lokalisieren. Es wurde eine punktförmige perinukleäre Lokalisierung von PsiR4-Cy3 nach der Lipofektion beobachtet (Fig. 4). Dieses Färbungsmuster beruht wahrscheinlich auf der endosomalen Aufnahme von siRNA durch F-11 Zellen. Die Akkumulierung um den Kern ist ein Hinweis darauf sein, dass siRNAs in den Kern importiert werden, um Funktionen bei der Heterochromatin-Bildung auszuüben. Es wurde PsiR4-Cy3 nicht nur allein am Kern lokalisiert, sondern auch in den neuritenartigen Strukturen (Fig. 5) gefunden.
Beispiel 5
Wirksamkeit der PlM-1-siRNA und der PIM-1-Kontrolle-siRNA bei der Schmerzbehandlung in vivo
Schmerzmodell der Ratte nach Bennett
Neuropathischer Schmerz tritt u.a. nach Schädigung peripherer oder zentraler Nerven auf und lässt sich dementsprechend tierexperimentell durch gezielte Läsionen einzelner Nerven induzieren und beobachten. Ein Tiermodell ist die Nerven- läsion nach Bennett (Bennett und Xie (1988) Pain 33: 87-107). Im Bennett-Modell wird der Ischiasnerv unilateral mit losen Ligaturen versehen. Es wird die Entwicklung von Anzeichen des Neuropathieschmerzes zu beobachtet und kann mittels thermischer oder mechanischer Allodynie quantifiziert werden.
Hierzu wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten (Janvier, Frankreich) mit einem Gewicht von 140 bis 160 Gramm zunächst mit Pentobarbital (50 mg pro kg Körpergewicht der Ratte Nembutal®, i.p., Sanofi, Wirtschaftsgenossenschaft deutscher Tierärzte eG, Hannover, Deutschland) betäubt. Anschließend wurden e n- seitige mehrfache Ligaturen am rechten Hauptischiasnerv der Ratten vorgenommen. Hierzu wurde der Ischiasnerv auf der Höhe der Oberschenkelmitte freigelegt und vier lockere Ligaturen (softcat®chrom USP 4/0, metric2, Braun Melsungen, Deutschland) wurden so um den Ischiasnerv gebunden, daß die epineurale Durchblutung nicht unterbrochen wurde. Der Operationstag war Tag 1.
Die Allodynie wurde ab Tag 2 auf einer Metallplatte getestet, die mit Hilfe eines Wasserbads auf eine Temperatur von 4°C temperiert wurde. Die Ratten wurden vor der intravenösen Applikation der jeweiligen Lösung in Gruppen von 9 oder 10 Tieren aufgeteilt. Zur Überprüfung der Allodynie wurden die Ratten auf die kalte Metallplatte gesetzt, die sich in einem Plastikkäfig befand. Dann wurde über einen Zeitraum von zwei Minuten vor der Applikation einer Lösung gezählt, wie häufig die Tiere mit ihrer geschädigten Pfote von der gekühlten Metallplatte heftig zu- rückzucken (Vorwert). Dann wurden die Lösungen, enthaltend 3,16 μg (5 μl) erfindungsgemäße siRNA in 15 μl NaCI oder 1ng (5 μl) Kontroll-RNA (Sense-Strang der siRNA), in 15 μl NaCI i.t. appliziert, und die Anzahl der Wegzieh reaktionen wurde jeweils nach 60 min wiederum für 2 Minuten gezählt (Testwert). Die Messungen wurden an 4 aufeinanderfolgenden Tagen (Tage 2 bis 5) durchgeführt. Tiere, denen reine NaCI-Lösung appliziert wurde, dienten sowohl bei den Experimenten mit siRNA als auch mit Kontroll-RNA als Vergleichsgruppe.
Die erfindungsgemäße PIM-1 -siRNA (1ng) zeigte in diesem Schmerzmodell eine starke analgetische Wirkung, wie die Verminderung der Wegziehreaktionen von bis zu etwa 1/3 gegenüber der NaCI-Kontrolle an den Tagen 2 bis 4 zeigt (Fig. 6 A). Im Vergleich dazu war die PIM-1 -Kontroll-siRNA unwirksam (Fig. 6 B).
Nachfolgend sind die Ergebnisse der Exprimente gemäß Ausführungsbeispiel 5 zusammengefasst.
Effekt der intrathekal gegebenen PIM-1 siRNAs im Bennettmodell (Ratte) Messung der Kälte-Allodynie (Anzahl der Pfotenhebungen auf einer 4°C kalten Platte pro 2 Minuten).
Substanzen Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5
NaCI-Messwert 35 34 35 34 35
NaCI-s.e.m. 0,93 1 ,11 0,92 0,81 0,55
PIM-1 siRNA (1ng) 20 20 25 27 32
PIM-1 siRNA s.e.m. 1,76 2,69 2,25 2,46 2,65
Effekt der intrathekal gegebenen PIM-1 -Kontroll-siRNA im Bennettmodell (Ratte). Messung der Kälte-Allodynie (Anzahl der Pfotenhebungen auf einer 4°C kalten Platte pro 2 Minuten).
Substanzen Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5
NaCI-Mess ert 35 34 35 34 35
NaCI-s.e.m. 0,93 1,11 0,92 0,81 0,55
PI -1 siRNA-Ktr (1ng) 28 29 34 39 37
PI -1 siRNA-Ktr s.e.m. 3,69 5,01 3,23 2,73 2,27
Beispiel 6 Wirksamkeit einer humanen Pim-1 -siRNA
Wie in den Figuren 7 und 8 dargestellt, wurden zu Heia-Zellen verschiedene dsRNA-Sequenzen, die gegen Abschnitte der humanen PIM-1 -mRNA gerichtet waren, gegeben und in einer nachfolgenden Northern-Blot-Analyse das Expressi- onsniveau der humanen PIM1-mRNA analysiert. Hierbei zeigten die in den Spuren 3 bzw. 6 (hPsiR3 bzw. hPsiRδ) verwendeten siRNAs starke Effekte bei der Herunterregulation der humanen PIM1-mRNA (s. Figur 7). In einem ähnlichen Experiment wurde die konzentrationsabhängige Wirkung der beiden vorgenannten Sequenzen auf die hPIM1-mRNA untersucht (s. Figur 8). Hierbei zeigt hPsiRδ bereits bei geringster Dosierung (10 nM) eine starke Wirkung auf das Expressionsniveau. Die entsprechenden Ergebnisse wurden in Westem-Blot- Untersuchungen bestätigt.

Claims

Patentansprüche
1. Doppelstrangige RNA, enthaltend eine Sequenz mit der allgemeinen Struktur 5 -(N17-25)-3', die zumindest 90% komplementär zu einem Abschnitt der (m)RNA-Sequenz von PIM-1 ist, wobei N irgendeine Base ist.
2. Doppelstrangige RNA nach Anspruch 1 , enthaltend eine Sequenz mit der allgemeinen Struktur 5 -(N19.25)-3\
3. Doppelstrangige RNA nach Anspruch 1 oder 2, enthaltend eine Sequenz mit der allgemeinen Struktur 5'-(N2ι-23)-3'.
4. Doppelstrangige RNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Sequenz mit der allgemeinen Struktur vollständig komplementär zu einem Ab- schnitt der (m)RNA von PIM-1 ist.
5. Doppelstrangige RNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die doppelstr ngige RNA (dsRNA) gegen Nukleotidabschnitte zwischen Nukleotid- position 50 und Nukleotidposition 890 im codierenden Bereich der PIM-1- (m)RNA gerichtet ist.
6. Doppelstrangige RNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die dsRNA gegen Nukleotidabschnitte der codierenden Region von PIM-1- (m)RNA, die mindestens 50, vorzugsweise mindestens 70, und noch stärker bevorzugt mindestens 100 Nukleotide vom AUG-Starttriplett des codierenden Bereichs der (m)RNA stromabwärts und/oder mindestens 50 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 70 noch stärker bevorzugt mindestens 100 Nukleotide vom Stopcodon des codierenden Bereichs der (m)RNA stromaufwärts entfernt liegen, gerichtet ist.
7. Doppelstrangige RNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die dsRNA gegen einen Nukleotidabschnitt mit der Sequenz AA am 5'-Terminus gerichtet ist.
8. Doppelstrangige RNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die dsRNA zu Nukleotidabschnitten im nicht-codierenden 5'-Bereich der PIM-1- (m)RNA komplementär ist.
9. Doppelstrangige RNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die dsRNA mindestens eine der folgenden Eigenschaften aufweist: (a) der GC- Gehalt beträgt mindestens 38%, (b) höchstens 2 aufeinanderfolgende Gua- nidinreste treten in der dsRNA auf, und (c) die Zielsequenz ist im Genom des Wirtsorganismus nur im Targetgen vorhanden.
10. Doppelstrangige RNA gemäß Anspruch 1, wobei die Zielsequenz auf der PIM-1-(m)RNA ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 5'-AAC GUG GAG AAG GAC CGG AUU-3'; 5'-AAC UCG AGU GCC CAU GGAAGU-3'; 5'-AAC CGC GAC AUC AAG GAC GAA-3'; 5'-AAU AUU CCU UUC GAG CAU GAC-3'; 5'-AAG GGU CUC UUC AGA AUG UCA-3'; 5'-CCG CGA CAT CAA GGA CGA A-3'; 5'-GAT ATG GTG TGT GGA GAT A-3'; und 5'-AAG UGU ACU UUA GGC AAA GGG-3' .
11. Doppelstrangige RNA nach Anspruch 10, deren Sense-Strang die Sequenz 5'-GUGUACUUUAGGCAAAGGGdTdT-3' aufweist und deren Antisense- Strang die Sequenz 5'-CCCUUUGCCUAAAGUACACdTdT-3' aufweist.
12. Doppelstrangige RNA nach einem der vorhergenden Ansprüche 1 bis 11, wobei die dsRNA chemisch modifiziert ist.
13. Doppelstrangige RNA nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die doppelstrangige RNA die Expression von PIM-1 in der Zelle um mindestens 50% reduziert.
14. Doppelstrangige RNA gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 13, wobei die dsRNA gegen Nukleotidabschnitte der (m)RNA von PIM-1 von Säugetieren, insbesondere des Menschen, gerichtet ist.
15. Doppelstrangige RNA gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 14, wobei die dsRNA „blunt ends" oder mindestens ein überhängendes Ende aufweist.
16. Doppelstrangige RNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der 3'- Terminus oder der 5'-Terminus eines Strangs oder beider Einzelstränge ü- berhängenden Enden der zum Doppelstrang verknüpften Einzelstränge aufweist.
17. Doppelstrangige RNA gemäß Anspruch 15 oder 16, wobei die überhängenden Enden mindestens 2 überhängende Nukleotide, vorzugsweise 2 bis 10, insbesondere 2 bis 5 überhängende Nukleotide am 3'-Terminus oder am 5'- Terminus aufweisen.
18. Doppelstrangige RNA gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die ü- berhängenden Nukleotide deoxidierte Thymidine und/oder Uracile sind.
19. Vektor, enthaltend eine für mindestens eine doppelstrangige RNA nach einem der Ansprüche 1 bis 18 codierende Nukleinsäuresequenz.
20. Zelle, enthaltend einen Vektor gemäß Anspruch 19.
21. Arzneimittel, enthaltend mindestens eine dsRNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, einen Vektor gemäß Anspruch 19 und/oder eine Zelle gemäß Anspruch 20, sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe.
22. Verwendung einer dsRNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, eines Vektors gemäß Anspruch 19 und/oder einer Zelle gemäß Anspruch 20 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von allen mit der (patho) physiologischen Funktion von PIM-1 zusammenhängenden Krankheitssymptomen, insbesondere von Schmerz, ganz besonders von chronischem Schmerz, tak- tiler Allodynie, thermisch ausgelöstem Schmerz und/oder Entzündungsschmerz, von Allergie und Asthma, von Harninkontinenz, auch von neuroge- nem Blasensymptom, Pruritus, Tumoren, Entzündungen.
23. Verwendung einer dsRNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, eines Vek- tors gemäß Anspruch 19 und/oder einer Zelle gemäß Anspruch 20 für die In- Vivo- oder In-Vitro-Gentherapie.
24. Verfahren zur Hemmung der Expression von PIM-1 in einer Zelle, wobei eine dsRNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 oder ein (induzierbarer) Vektor gemäß Anspruch 19 in eine Zelle eingeführt wird.
25. Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei eine dsRNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 in micellare Strukturen, vorzugsweise Liposomen, oder in virale natürliche Kapside oder in auf chemischem oder enzymatischem We- ge hergestellte Kapside oder davon abgeleitete Strukturen eingeschlossen wird.
26. Verfahren zur Identifizierung von dsRNA mit schmerzmodulierender Funktion, wobei die Bindungskonstante der Bindung einer vorzugsweise markier- ten dsRNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 als Testsubstanz in einem Bindungsassay an eine (m)RNA von PIM-1 gemessen wird.
7. Verfahren zur Identifizierung von die PIM-1 -Expression modulierenden Substanzen mit folgenden Verfahrensschritten: (a) Inkubation mindestens einer Testzelle mit mindestens einem zu testenden dsRNA-Molekül, (a') parallele Inkubation einer Kontrollzelle ohne Zugabe des zu testenden dsRNA-Moleküls, (b) Messung der PIM-1-Kinase-Expression durch Konzentrationsbe- Stimmung der PIM-1-Kinase-mRNA oder der translatierten PIM- 1 -Kinase, und (c) Identifizierung der zu testenden dsRNA über das Ausmaß der Differenz zwischen dem Messwert bei der Testzelle und dem bei der Kontrollzelle. oder
(a) gentechnische Manipulation mindestens einer Zelle (Testzelle) mit mindestens einem erfindungsgemäßen dsRNA-Konstrukt, (a') parallele gentechnische Manipulation mindestens einer identi- sehen Zelle (Kontrollzelle) entweder • unterbleibend, • unter Durchführung der Manipulation parallel ohne dsRNA oder dsRNA-Konstrukt oder • mit einer veränderten nicht mehr erfindungsgemäßen dsRNA, (b) parallele Inkubation der gemäß (a) und (a') bereitgestellten Zellen unter geeigneten Bedingungen, (c) Messung der PIM-1-Kinase-Expression durch Konzentrationsbestimmung der PIM-1-Kinase-mRNA oder der PIM-1-Kinase, und (d) Identifizierung der Substanzen über das Ausmaß der Differenz zwischen dem Messwert bei der Testzelle und dem bei der Kontrollzelle.
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