WO2003106681A2 - Antisense oligonukleotide gegen pim1 - Google Patents

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WO2003106681A2
WO2003106681A2 PCT/EP2003/006158 EP0306158W WO03106681A2 WO 2003106681 A2 WO2003106681 A2 WO 2003106681A2 EP 0306158 W EP0306158 W EP 0306158W WO 03106681 A2 WO03106681 A2 WO 03106681A2
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cell
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nucleotides
pain
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Özlem Altan
Jens Kurreck
Arnold GRÜNWELLER
Volker Erdmann
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Grünenthal GmbH
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA

Definitions

  • the invention relates to antisense oligodeoxynucleotides against PIM1, corresponding nucleotide constructs, cells containing them, pharmaceuticals and diagnostics, their use in pain therapy and methods for diagnosing symptoms associated with PIM and for identifying pain-modulating substances.
  • Treating pain effectively is a major challenge for molecular medicine.
  • Acute and transient pain is an important signal from the body to protect people from severe damage from the environment or overloading the body.
  • chronic pain that lasts longer than the cause of the pain and the expected time frame of healing has no known biological function and affects hundreds of millions of people worldwide.
  • Around 7.5 million people suffer from chronic pain in the Federal Republic of Germany alone.
  • the PIM1 kinase is a promising starting point for the development of new ones Pain medications.
  • the cDNA sequence of PIM1-Kinase, human can be found in the databases under AN: NM_002648.
  • the amino acid sequence of PIM1-Kinase, human can be found in the databases under AN: NP_002639.
  • the cDNA sequence of PIM1 kinase, rat can be found in the databases under AN: NM_017034.
  • the amino acid sequence of PIM1-kinase, rat can be found in the databases under AN: NP_058730.
  • the cDNA sequence of PIM1-Kinase, mouse can be found in the databases under AN: NM_008842.
  • the amino acid sequence of PIM1-kinase, mouse can be found in the databases under AN: NP 032868.
  • Antisense oligodeoxynucleotides can be used for the treatment, in particular of chronic pain, by breaking down or changing the mRNA of selected targets - in the case of this invention the PIM1 kinase described above - whose expression is down-regulated and thus the number of Reduce target proteins per cell.
  • the ODN attach to the mRNA and thus on the one hand block the translation and on the other hand initiate the degradation of the mRNA by RNase H, which cleaves RNA in a DNA / RNA duplex.
  • PN3 / SNS channel in rats to prevent the development of hyperalgesia and allodynia due to chronic nerve or tissue damage.
  • the invention therefore relates to an oligonucleotide or a base sequence according to one of the sub-items (b) to (j) in one of the figures 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 or 16 or a sequence (s) differing in a maximum of one different base, the deviation in the base is not in the sequence area shown in sub-item (a).
  • oligonucleotide means a molecule with between 2 and 40 nucleotides.
  • Another object of the invention is an oligonucleotide containing or corresponding to a base sequence according to one of sub-items (b) to (j) in one of Figures 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11, 12, 13, 14, 15 or 16.
  • Another object of the invention is an oligonucleotide containing or corresponding to a base sequence according to sub-item (k) in one of Figures 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 , 15 or 16 or one or a maximum of two different bases, preferably one, different sequence, the difference (s) in the base (s) not shown in sub-item (a) Sequence area is located.
  • Another object of the invention is an oligonucleotide containing or corresponding to a base sequence according to sub-item (k) in one of Figures 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15 or 16.
  • a preferred subject of the invention is also an oligonucleotide according to the invention according to one of the aforementioned forms of oligonucleotides according to the invention, in which the Oligonucleotide has a length of 15 to 30, preferably 15 to 25, in particular 17 to 19 or exactly 18, nucleotides.
  • oligonucleotide A an especially preferred oligonucleotide according to the invention (hereinafter called oligonucleotide A) according to one of the aforementioned forms of oligonucleotides according to the invention, in which - possibly in a base - the one contained in the oligonucleotides or corresponding to the base sequence of one of the figures 1 , 2, 3, 4, 9, 10, 11, 12, 15 or 16.
  • oligonucleotide B a particularly preferred oligonucleotide according to the invention according to one of the aforementioned forms of oligonucleotides according to the invention, in which - optionally in a base - the base sequence contained in the oligonucleotides or corresponding to one of the figures 1 is shown , 2, 3, 4, 11 or 12, preferably 1, 3 or 11, in particular 1 or 3.
  • a preferred object of the invention is an oligonucleotide according to the invention which has at least one modified or unmodified ribose, at least one modified or unmodified phosphodiester bond and / or at least one modified or unmodified base.
  • a very particularly preferred object of the invention is an oligonucleotide according to the invention in which at least one of the Nucleotides, in particular several of the nucleotides, are “Locked Nucleic Acids"("LNA”) or at least one of the nucleotides, in particular all nucleotides, are phosphorothioates, preferably one in which several of the nucleotides are “Locked Nucleic Acids"("LNA”) are.
  • “Locked nucleic acids”("LNA”) are ribonucleotides that contain a methylene bridge that connects the 2'-oxygen of the ribose with the 4'-carbon (see Fig. 27).
  • LNA Locked nucleic acids
  • Oligonucleotides in which the “LNA” are located at the 5 ′ and 3 ′ ends of the oligonucleotide are preferred, preferably the last 2-5 nucleotides, in particular the last 4 or 5 nucleotides, in each case at the 3 ′ and 5 ′ End of the oligonucleotide "LNA's",
  • oligonucleotides modified with LNA or phosphorothioates it is particularly preferred if it is an inventive one Oligonucleotide A or oligonucleotide B according to the invention, preferably an oligonucleotide B according to the invention (see above).
  • a particular separate subject of the invention is preferably nucleic acids, in particular oligonucleotides, in which several of the nucleotides are “Locked Nucleic Acids” ("LNA”) in which the "LNA” are located at the 5 'and 3' ends of the oligonucleotide the last 2-5 nucleotides, in particular the last 4 or 5 nucleotides, at the 3 'and 5' ends of the oligonucleotide are "LNA", and / or in which> 6, in particular> 8 contiguous nucleotides in the oligonucleotide are none " LNA ".
  • LNA Locked Nucleic Acids
  • a very particularly preferred object of the invention is an oligonucleotide according to the invention which is present as si-RNA.
  • si-RNAs can be found in US 6,506,559, EP 1 144 623, WO 01/75164 or WO02 / 44321, which are hereby part of the present disclosure.
  • polynucleotide construct containing at least one oligonucleotide according to the invention.
  • polynucleotide construct is to be understood in a very broad sense. It includes RNA and DNA and nucleotides with a length of at least 20 nucleotides.
  • the (recombinant) polynucleotide construct is a general term for any type of DNA or RNA molecule which has arisen from the in vitro linkage of DNA or RNA molecules.
  • Polvnucleotide is understood to mean the following:
  • the nucleotide on which it is based is a basic building block of nucleic acids, which is basically composed of nucleic acid, pentose and phosphoric acid. This corresponds to a high-molecular polynucleotide from several
  • Nucleotides that are linked together via phosphoric acid pentose esterification also includes modified ones Polynucleotides that maintain the base sequence, but have a modified backbone instead of the phosphoric acid pentose.
  • Another preferred object is also a polynucleotide construct containing in two separate areas the two partial nucleotide sequences Sections I and III according to one of the sub-items (I) - (n) or the two partial nucleotide sequences Helix I and Helix III according to one of the sub-items (o) - (q) in one of the figures 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 or 15 or nucleotide partial sequences differing from these partial nucleotide sequences in each case at most in one base. More detailed information about the division of the two areas can be found in FIG. 24) (Helix I and Helix 111 / ribozyme) and in Santoro et al. (1997) FIG. 2 p. 4264 (section I and section III / DNA enzyme), the content of the latter reference expressly belonging to the disclosure of the present application.
  • Another preferred object is also a polynucleotide construct coding for at least one oligonucleotide according to the invention.
  • this includes a DNA to be read or a vector containing DNA or RNA, the product of which is or can be an oligonucleotide according to the invention.
  • Another preferred object is also a polynucleotide construct according to the invention, which is a ribozyme, a DNA enzyme, a vector, in particular an expression vector, or a PNA.
  • - (Cloning unit) vector General term for nucleic acid molecules that serve as carriers of foreign genes or parts of these genes during cloning.
  • - Expression vector Name for specially constructed cloning vectors which, after introduction into a suitable host cell, the transcription and translation of the cloned into the vector
  • peptide-linked amino acids form a chain, the amino acids carrying as a side chain a base capable of hybridizing with DNA or 10 RNA.
  • sequence of nucleotides or amino acids In the specific sense of this invention, this means the nucleic acid sequence.
  • Ribozyme Name for a catalytically active ribonucleic acid (e.g. ligase, endonuclease, polymerase, exonuclease), see e.g. Hammerhead ribozymes as shown in Fig. 24 or 25 and the description of the figures or s. Vaish, N.K. et al. (1998), Nucl. Acids Res. 26, 5237-5242.
  • a catalytically active ribonucleic acid e.g. ligase, endonuclease, polymerase, exonuclease
  • DNA enzyme 10-23 Name for a DNA molecule that contains catalytic activity (e.g. ligase, endonuclease, polymerase, exonuclease), see e.g. DNA enzyme 10-23 according to Fig. 26 as well as the description of the figure or s. Santaro and Joyce (1997) Proc.
  • catalytic activity e.g. ligase, endonuclease, polymerase, exonuclease
  • RNA / DNA general term for ribozymes or DNA enzymes (see above).
  • Another preferred object is also a polynucleotide construct according to the invention containing the two partial nucleotide sequences as described above in two separate areas, whereby it is a ribozyme, preferably a "hammerhead” ribozyme, or a DNA enzyme, preferably a DNA enzyme of the type 10-23 or 8-17.
  • a ribozyme preferably a "hammerhead” ribozyme
  • a DNA enzyme preferably a DNA enzyme of the type 10-23 or 8-17.
  • polynucleotide construct is a ribozyme containing at least the nucleotide partial sequences Helix I and Helix III according to one of the sub-items (o) to (q), preferably (o), in one of the figures 1 , 3, 4, 5, 6, 8, 11 or 12; preferably 1, 3 or 11, in particular 11; or preferably 4, 6, 8 or 12, in particular 4 or 12.
  • FIG. 24 shows a general representation of a "hammerhead” ribozyme according to Vaish, NK et al. (1998), Nucl. Acid Res. 26, 5237-5242 with the "recognizing arms” Helix I and Helix III, in each of which the According to the invention, helices I and III according to sub-items (o) - (q) are inserted in one of the figures 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 or 15 in order to obtain the “ Hammerhead "ribozymes.
  • the section Helix I in each of Figures 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 or 15 replaces any nucleotides in Helix I according to Figure 24 so that the first nucleotide at the 3 'end of Helix I in each of Figures 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 or 15 the first arbitrary nucleotide "N" on The 3 'end of the helix I of Figure 24 is replaced and the following arbitrary nucleotides "N" in Helix I Fig. 24 in the direction 5'- End are replaced by the nucleotides shown in one of the sub-items (o) to (q) Helix I in each of Figures 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 or 15 are.
  • nucleotides "A” and “C” at the 5 'end of the helix III in one of Figures 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 or 15 each replace the nucleotides "A "and” C "in Helix III in Fig. 24 and the following arbitrary nucleotides” N "in Helix III Fig. 24 are replaced towards the 5 'end by the nucleotides which are in one of the sub-items (o) - (q) Helix III is shown in one of Figures 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 or 15.
  • FIG. 26 shows a general representation of a DNA enzyme of the type '10-23 'according to Santoro et al., 1997, Fig. 2, p. 4264.
  • the upper strand marked with an arrow, is the RNA strand to be cleaved, where the arrow indicates the cleavage site and the lower one is a representation of the DNA enzyme.
  • Section III according to sub-items (I to n) in one of Figures 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 or 15 respectively, ie 7 more Nucleotides at sub-point I, 8 further nucleotides at sub-point m and 9 further nucleotides at sub-point n.
  • Section III and section 1 are the so-called "recognizing arms" of the DNA enzyme (see Example 3 below) preferred DNA enzyme of the type "10-23" for sub-item (s) according to Fig. 1 would have the following sequence, the underlined section being base-paired with the RNA:
  • This DNA enzyme would be referred to as DK24 (9/9), the name indicating that the enzyme is directed against the GU site of the Oligo K24 and contains 9 nucleotides (Sections I and III) in the "recognizing arms" , e.g. B. according to section I and section III of sub-item (s) in Fig. 1). The same applies to all DNA enzymes according to sub-items (I to n) in one of the figures 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 or 15.
  • Another preferred object is also a polynucleotide construct according to the invention, this having at least one modified or unmodified ribose, at least one modified or unmodified phosphodiester bond and / or at least one modified or unmodified base.
  • Another preferred object is also an oligonucleotide according to the invention or a polynucleotide construct according to the invention, this being attached to a support; especially protein, preferably tet-, transportin or ferritin; bound and / or packaged in a liposome.
  • Another preferred object is also a cell containing at least one oligonucleotide according to the invention and / or a polynucleotide construct according to the invention.
  • Another preferred subject matter is also a medicament containing at least one oligonucleotide according to the invention, a polynucleotide construct according to the invention and / or a cell according to the invention and optionally suitable auxiliaries and / or additives.
  • the pharmaceuticals according to the invention can be administered as liquid dosage forms in the form of injection solutions, drops or juices, as semi-solid dosage forms in the form of granules, tablets, pellets, patches, capsules, plasters or aerosols and, depending on the galenic form, may contain them in addition to the at least one object according to the invention Carrier materials, fillers, solvents, diluents, dyes and / or binders.
  • excipients and the amounts to be used depends on whether the medicinal product is oral, peroral, parenteral, intravenous, intraperitoneal, intradermal, intramuscular, intranasal, buccal, rectal or local, for example on infections on the skin, mucous membranes and on the eyes to be applied. Are suitable for oral administration
  • Objects according to the invention in a depot in dissolved form or in a plaster, optionally with the addition of agents which promote skin penetration, are suitable percutaneous application preparations.
  • Forms of preparation that can be used orally or percutaneously can release the articles according to the invention with a delay.
  • the amount of active ingredient to be administered to the patient varies depending on the weight of the patient, the type of application, the indication and the severity of the disease. Usually 2 to 500 mg / kg of at least one according to the invention Applied object. If the medicinal product is to be used in particular for gene therapy, physiological saline, stabilizers, proteinase, DNAse inhibitors etc. are recommended as suitable auxiliaries or additives.
  • Another preferred subject matter is also a diagnostic agent containing at least one oligonucleotide according to the invention, a polynucleotide construct according to the invention and / or a cell according to the invention and optionally suitable additives.
  • - Medicinal product a substance as defined in Article 1 ⁇ 2 of the German Medicines Act (AMG). That is, substances or preparations made of substances which are intended to be used on or in the human or animal body
  • Another preferred subject is the use of at least one oligonucleotide according to the invention, one according to the invention Polynucleotide construct and / or a cell according to the invention
  • Another preferred subject is also the use of at least one oligonucleotide according to the invention, a polynucleotide construct according to the invention and / or a cell according to the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of urinary incontinence; also of neurogenic bladder symptoms; Pruritus, tumors, inflammation; especially PIM1 kinase-associated inflammation with symptoms such as asthma; as well as all disease symptoms related to PIM1.
  • Another preferred subject is also the use of at least one oligonucleotide according to the invention, a polynucleotide construct according to the invention and / or a cell according to the invention for gene therapy, preferably in vivo or in vitro gene therapy.
  • Gene therapy is a form of therapy in which the introduction of nucleic acids into cells expresses an effector gene, usually a protein, but also an antisense RNA, or a pre-synthesized antisense oligodeoxynucleotide is introduced.
  • an effector gene usually a protein, but also an antisense RNA, or a pre-synthesized antisense oligodeoxynucleotide is introduced.
  • a basic distinction is made between in vivo and in vitro methods.
  • cells are removed from the organism and transfected with vectors ex vivo, in order to subsequently be reintroduced into the same or into another organism.
  • vectors for example to fight tumors, are applied systemically (e.g. via the bloodstream) or directly into the tumor.
  • Another preferred subject is also a method for identifying pain-modulating substances, characterized in that the identification is based on a quantification of the At least one, preferably labeled, oligonucleotide according to the invention or at least one polynucleotide construct according to the invention is bound to an RNA.
  • Another preferred subject is also a method for identifying pain-modulating substances with the following method steps:
  • Oligonucleotide and / or a polynucleotide construct according to the invention (a ') parallel genetic engineering manipulation of at least one identical cell (control cell) either • omitted,
  • the term pain modulating refers to a potential regulating influence on the physiological pain process, in particular an analgesic effect.
  • the term substance encompasses any compound suitable as an active pharmaceutical ingredient, in particular thus low-molecular active ingredients, but also others such as nucleic acids, fats, sugars, peptides or proteins such as antibodies.
  • Incubation under suitable conditions is to be understood here so that the substance to be examined can react with the cell or the corresponding preparation in an aqueous medium for a defined time before the measurement.
  • the aqueous medium can be tempered, for example between 4 ° C. and 40 ° C., preferably at room temperature or at 37 ° C.
  • the incubation time can be varied between a few seconds and several hours, depending on the interaction of the substance with the protein.
  • the aqueous medium can contain suitable salts and / or buffer systems so that, for example, a pH of between 6 and 8, preferably pH 7.0-7.5, prevails in the medium during the incubation. Suitable substances such as coenzymes, nutrients etc. can also be added to the medium.
  • suitable conditions depending on the interaction of the substance with the protein to be investigated on the basis of his experience, the literature or fewer, simple preliminary tests in order to obtain a measurement value that is as clear as possible in the process.
  • a cell that has synthesized a protein is a cell that has already expressed this protein endogenously or one that has been genetically modified so that it expresses this protein and accordingly contains the potein before the start of the method according to the invention.
  • the cells can be cells from possibly immortalized cell lines or native cells originating from tissues and isolated from them, whereby the cell cluster is usually dissolved.
  • the preparation from these cells includes in particular homogenates from the cells, the cytosol, a membrane fraction of the cells with membrane fragments, a suspension of isolated cell organelles etc.
  • the yardstick by which the method allows the discovery of interesting substances is either the binding to the protein, which can be demonstrated, for example, by displacement of a known ligand or the extent of bound substance, or the change in a functional parameter due to the interaction of the substance with the protein ,
  • This interaction can be, in particular, regulation, inhibition and / or activation of receptors, ion channels and / or enzymes, and changed functional parameters can be, for example, gene expression, the ionic environment, the pH or the membrane potential, or the change in the enzyme activity or the concentration of the 2 nd messenger.
  • a further preferred embodiment of this method provides that the cell is genetically manipulated before process steps (a) and (a ').
  • a further preferred embodiment of this method provides that the genetic engineering manipulation allows the measurement of at least one of the functional parameters changed by the test substance.
  • Another preferred embodiment of this method provides that the genetic engineering manipulation expresses a form of a member of the Pim kinase family, preferably the PIM-1 kinase, which is not endogenously expressed in the cell, or introduces a reporter gene.
  • a further preferred embodiment of this method provides that the measurement of the binding takes place via the displacement of a known labeled ligand of a member of the Pim kinase family, preferably the PIM-1 kinase.
  • Another preferred embodiment of this method provides that> 8 h, preferably> 12 h, in particular> 24 h, elapse between the parallel process steps (a) and (a ') and process step (b).
  • Another preferred subject is also a method for diagnosing clinical pictures which are associated with altered expression of genes of the Pim kinase family, characterized in that the diagnosis is carried out by quantifying the binding of an oligonucleotide according to the invention and / or at least one polynucleotide according to the invention. Constructed to an RNA.
  • oligonucleotides and also polynucleotide constructs are produced by methods known to the person skilled in the art. Nucleotides, in particular also oligonucleotides, for example in the manner of Merryfield synthesis, are thereby attached to an insoluble support (HG Gassen et al., Chemical and Enzymatic Synthesis of Genefragments (Verlag Chemie, Weinheim 1982)) or synthesized in another way (Beyer / Walter; Textbook of Organic Chemistry, 20th edition, (S. Hirzel Verlag, Stuttgart 1984), p. 816 ff.).
  • Another object of the invention is a method for the treatment, in particular pain treatment, of a non-human mammal or human, which requires treatment of pain, in particular chronic pain, by administration of a medicament according to the invention, in particular those containing an oligonucleotide according to the invention and / or a polynucleotide construct according to the invention.
  • a medicament according to the invention in particular those containing an oligonucleotide according to the invention and / or a polynucleotide construct according to the invention.
  • Another subject is also corresponding methods for the treatment of pruritus and / or urinary incontinence.
  • Oligodeoxynucleotide sequence against the mRNA of the PIM1 from the rat often referred to here as Oligo K3, Oligonucleotide No. 3 or K3.
  • Sub-items (a) - (z) show shortened sections from this antisense oligodeoxynucleotide sequence K3, sub-item (aa) shows the full antisense oligodeoxynucleotide sequence with which the " messengerger walk screening" was carried out.
  • the upper strand which is marked with a arrow, is the RNA strand to be cleaved, the arrow indicating the cleavage site and the lower one is a representation of the DNA enzyme.
  • the gap in the upper strand is therefore a so-called GUC site (see above).
  • "R" in the lower strand "A" and 5 'to the "R” in the lower strand there is a "G".
  • oligonucleotides according to the invention were produced in particular in accordance with subgroup (aa) x, y or z of FIGS. 1 or 2 or in accordance with FIG. 3. Most of these were LNA constructs, which were ordered from PROLIGO in Boulder, Co, USA and with which LNA were located in different places. Furthermore, an unchanged oligonucleotide according to subgroup (aa) of Figure 1 was synthesized and a phosphorothioate corresponding to the base sequence was ordered from MWG Biotech AG in Ebersberg Germany.
  • Vanilloid receptor-1 is essential for inflammatory thermal hyperalgesia. Nature 405, 183-187.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Antisense Oligodesoxynucleotide gegen PIM1, entsprechende Nukleotid-Konstrukte, diese enthaltende Zellen, Arzneimittel und Diagnostika, deren Verwendung in der Schmerztherapie and Verfahren zur Diagnose mit PIM1 verbundener Symptome und zur Identifizierung schmerzmodulierender Substanzen.

Description

Antisense Oliqonukleotide gegen PIM1
Die Erfindung betrifft Antisense Oligodesoxynucleotide gegen PIM1 , entsprechende Nukleotid-Konstrukte, diese enthaltende Zellen, Arzneimittel und Diagnostika, deren Verwendung in der Schmerztherapie und Verfahren zur Diagnose mit PIM verbundener Symptome und zur Identifizierung schmerzmodulierender Substanzen.
Die effektive Behandlung von Schmerz ist eine große Herausforderung für die molekulare Medizin. Akuter und transitorischer Schmerz ist ein wichtiges Signal des Körpers, um den Menschen vor schwerem Schaden durch die Umgebung oder Überbelastung des Körpers zu bewahren. Im Gegensatz dazu hat der chronische Schmerz, der länger anhält als die Ursache des Schmerzes und der erwartungsgemäße Zeitrahmen der Heilung keine bekannte biologische Funktion und betrifft Hunderte von Millionen Menschen weltweit. Rund 7,5 Mio. Menschen leiden allein in der Bundesrepublik Deutschland an chronischen Schmerzen.
Unglücklicherweise ist die pharmakologische Behandlung des chronischen Schmerzes noch unbefriedigend und bleibt daher eine Herausforderung für die aktuelle medizinische Forschung. Die derzeit existierenden Analgetika sind häufig nicht ausreichend wirksam und haben z. T. schwere Nebenwirkungen.
Daher werden vielfach neue Targets, körpereigene Strukturen, über die eine schmerzmodulierende Einwirkung, beispielsweise niedermolekularer Wirkstoffe oder anderer Verbindungen wie Antisense Oligodesoxynukleotide (ODN), möglich erscheint, für die Behandlung insbesondere chronischer Schmerzen gesucht. Die PIM1-Kinase ist ein vielversprechender Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Schmerzmedikamente. Die cDNA-Sequenz von PIM1-Kinase, human findet sich in den Datenbanken unter AN: NM_002648. Die Aminosäure-Sequenz von PIM1-Kinase, human findet sich in den Datenbanken unter AN: NP_002639. Die cDNA-Sequenz von PIM1-Kinase, Ratte findet sich in den Datenbanken unter AN: NM_017034. Die Aminosäure-Sequenz von PIM1- Kinase, Ratte findet sich in den Datenbanken unter AN: NP_058730. Die cDNA-Sequenz von PIM1-Kinase, Maus findet sich in den Datenbanken unter AN: NM_008842. Die Aminosäure-Sequenz von PIM1-Kinase, Maus findet sich in den Datenbanken unter AN: NP 032868.
Antisense Oligodesoxynukleotide (ODN), Ribozyme und andere katalytische Nukleinsäuren können zur Behandlung, insbesondere des chronischen Schmerzes durch Abbau oder Veränderung der mRNA ausgewählter Targets - im Falle dieser Erfindung die vorangehend beschriebene PIM1-Kinase - eingesetzt werden, deren Expresssion herunterregulieren und damit die Anzahl der Targetproteine pro Zelle verringern. Die ODN lagern sich an die mRNA an und blockieren so zum einen die Translation und initiieren zum anderen den Abbau der mRNA durch RNase H, die RNA in einer DNA/RNA Duplex spaltet. Porreca et al. (1999) konnten zeigen, dass intrathekal applizierte ODNs gegen den
PN3/SNS-Kanal bei Ratten die Entwicklung von Hyperalgesie und Allodynie durch chronische Nerven- oder Gewebeschädigung verhindern.
Auch wenn die Sequenz des PIM1 Gens bekannt ist, so kommt es doch für eine effektive Blockierung und Spaltung der mRNA insbesondere auf die Auswahl der richtigen Antisense-Oligodesoxynukleotide, Ribozyme und anderen katalytische Nukleinsäuren an. Die mRNA des Targets ist meist gefaltet und nur an wenigen Stellen für eine Anlagerung und nachfolgende Spaltung zugänglich. Über die richtige Auswahl der ODN ist aber im Stand der Technik nichts bekannt. Aufgabe der vorliegenden Schrift war entsprechend die Entwicklung von Antisense Oligodesoxynukleotiden und katalytischer Nukleinsäuren sowie entsprechender Ribozyme gegen die mRNA des PIML Ein Gegenstand der Erfindung ist daher ein Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine(r) Basensequenz gemäß einem der Unterpunkte (b) bis (j) in einer der Abbildungen 1 , 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 oder 16 oder eine(r) sich in maximal einer abweichenden Base davon unterscheidende(n) Sequenz, wobei sich die Abweichung in der Base nicht im Unterpunkt (a) abgebildeten Sequenzbereich befindet. Dabei bedeutet Oligonukleotid im Sinne dieser Erfindung ein Molekül mit zwischen 2 und 40 Nukleotiden. .
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine(r) Basensequenz gemäß einem der Unterpunkte (b) bis (j) in einer der Abbildungen 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 oder 16.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine(r) Basensequenz gemäß Unterpunkt (k) in einer der Abbildungen 1 , 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 oder 16 oder eine(r) sich in maximal zwei abweichenden Base, vorzugsweise einer, davon unterscheidende(n) Sequenz, wobei sich die Abweichung(en) in der(n) Base(n) nicht im im Unterpunkt (a) abgebildeten Sequenzbereich befindet(n).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine(r) Basensequenz gemäß Unterpunkt (k) in einer der Abbildungen 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 oder 16.
Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist auch ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid gemäß einer der vorgenannten erfindungsgemäßen Formen der Oligonukleotide, bei dem das Oligonukleotid ein Länge von 15 bis 30, vorzugsweise 15 bis 25, insbesondere 17 bis 19 oder genau 18, Nukleotiden aufweist.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes besonders bevorzugtes Oligonukleotid (im folgenden Oligonukleotid A genannt) gemäß einer der vorgenannten erfindungsgemäßen Formen der Oligonukleotide, bei dem - gegebenenfalls in einer Base abweichend - die in den Oligonukleotiden enthaltene oder diesen entsprechende der Basensequenz einer der Abbildungen 1 , 2, 3, 4, 9, 10, 11 , 12, 15 oder 16 zu entnehmen ist. Damit sind insbesondere Oligonukleotide gemeint, die als besonders effektiv erkannt wurden bzw. entsprechende Sequenzen gegebenenfalls leicht abweichend enthalten, mit hoher Bindung an die mRNA des PIM1 zu binden (s. Oligos K2, K3, K6, K17 und K24 bzw. die entsprechenden humanen Sequenzen).
Ein weiterer besonders bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes besonders bevorzugtes Oligonukleotid (im folgenden Oligonukleotid B genannt) gemäß einer der vorgenannten erfindungsgemäßen Formen der Oligonukleotide, bei dem - gegebenenfalls in einer Base abweichend -die in den Oligonukleotiden enthaltene oder diesen entsprechende Basensequenz einer der Abbildungen 1 , 2, 3, 4, 11 oder 12, vorzugsweise 1 , 3 oder 11 , insbesondere 1 oder 3, zu entnehmen ist.
Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid das mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Ribose, mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Phosphodiesterbindung und/oder mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Base aufweist.
Ein ganz besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid, bei dem mindestens eines der Nukleotide, insbesondere mehrere der Nukleotide, „Locked Nucleic Acids" („LNA") sind oder mindestens eines der Nukleotide, insbesondere alle Nukleotide, Phosphorothioate sind, vorzugsweise ein solches, bei dem mehrere der Nukleotide „Locked Nucleic Acids" („LNA") sind. „Locked nucleic acids" („LNA") sind Ribonukleotide, die eine Methylen-Brücke enthalten, die den 2'-Sauerstoff der Ribose mit dem 4'-Kohlenstoff verbindet (s. Abb. 27). Einen Überblick über LNA geben Braasch D.A. und Corey, D.R. (2001), Locked nucleic acids (LNA); fine-tuning the recognition of DNA und RNA. Chem. Biol. 8, 1-7. Dieser Artikel ist ausdrücklich Mitbestandteil der vorliegenden Beschreibung und Offenbarung. LNA werden beispielsweise von der Firma Proligo, Boulder, CO, USA angeboten. Auch Phosphorothiate sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise bei MWG-Biotech AG, Ebersberg, Germany bestellt werden.
Bevorzugt sind hierbei Oligonukleotide, in denen die „LNA" am 5'- und 3'- Ende des Oligonukleotids liegen, vorzugsweise jeweils die letzten 2-5 Nukleotide, insbesondere jeweils die letzten 4 oder 5 Nukleotide, am 3'- und 5'-Ende des Oligonukleotids „LNA's" sind,
und/oder
in denen > 6, insbesondere > 8 zusammenhängende Nukleotide im Oligonukleotid keine „LNA" sind, vorzugsweise bei denen von den im Sequenzbereich gemäß jeweiligen Unterpunkt (a) abgebildeten Nukleotiden des Oligonukleotids gemäß einer der Abbildungen 1 bis 16 Unterpunkt (b) bis (k) nur jeweils höchstens eines oder keines der Nukleotide eine „LNA" ist.
Bei den mit LNA oder Phosphorothioaten modifizierten Oligonukleotiden ist es besonders bevorzugt, wenn es sich um ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid A oder erfindungsgemäßes Oligonukleotid B, vorzugsweise ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid B (s.o.).
Generell ist ein besonderer separater Gegenstand der Erfindung Nukleinsäuren, insbesondere Oligonukleotide, bei denen mehrere der Nukleotide „Locked Nucleic Acids" („LNA") sind, in denen die „LNA" am 5'- und 3'-Ende des Oligonukleotids liegen, vorzugsweise jeweils die letzten 2- 5 Nukleotide, insbesondere jeweils die letzten 4 oder 5 Nukleotide, am 3'- und 5'-Ende des Oligonukleotids „LNA" sind, und/oder in denen > 6, insbesondere > 8 zusammenhängende Nukleotide im Oligonukleotid keine „LNA" sind. Die bisher bezüglich der LNA ausgeführten Ausführungsformen gelten auch für diesen Gegenstand.
Ein ganz besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid, das als si-RNA vorliegt. Beispiele für si-RNAs finden sich in der US 6,506,559, der EP 1 144 623, der WO 01/75164 oder der WO02/44321 , die hiermit Teil der vorliegenden Offenbarung sind.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Polynukleotid-Konstrukt enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid. Hier ist Polynukleotidkonstrukt in einem sehr weiten Sinne zu verstehen. Es umfaßt RNA und DNA und Nukleotide ab einer Länge von mindestens 20 Nukleotiden. Dabei versteht man unter (rekombinantes) Polvnukleotid- Konstrukt eine generelle Bezeichnung für jede Art von DNA- bzw. RNA- Molekülen, die durch die in vitro-Verknüpfung von DNA-, RNA-Molekülen entstanden sind. Unter Polvnukleotid versteht man folgendes: Das zugrundeliegende Nukleotid ist ein grundsätzlich aus Nukleinbase, Pentose und Phosphorsäure bestehender Grundbaustein der Nukleinsäuren. Diese entspricht einem hochmolekularen Polynukleotid aus mehreren
Nukleotiden, die über Phosphorsäure-Pentose-Veresterung miteinander verknüpft sind. Unter die Erfindung fallen aber auch modifizierte Polynukleotide, die zwar die Basenabfolge beibehalten, aber über ein modifiziertes Rückrat statt der Phosphorsäure-Pentose verfügen.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Polynukleotid-Konstrukt enthaltend in zwei voneinander getrennten Bereichen die beiden Nukleotidteilsequenzen Abschn. I und Abschn. III gemäß einem der Unterpunkte (I) - (n) oder die beiden Nukleotidteilsequenzen Helix I und Helix III gemäß einem der Unterpunkte (o) - (q) in einer der Abbildungen 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 , 12, 13 oder 15 oder von diesen Nukleotidteilsequenzen jeweils maximal in einer Base abweichende Nukleotidteilsequenzen. Genaueres über die Aufteilung der beiden Bereiche kann man der Fig. 24) (Helix I und Helix 111 /Ribozym) und bei Santoro et al. (1997) FIG.2 S. 4264 (Abschnitt I und Abschnitt lll/DNA- Enzym) entnehmen, wobei der Inhalt der letzteren Literaturstelle ausdrücklich mit zur Offenbarung der vorliegenden Anmeldung gehört.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Polynukleotid-Konstrukt kodierend für mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid. Darunter ist insbesondere eine abzulesende DNA oder ein Vektor enthaltend DNA oder RNA ist, dessen Produkt ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid ist oder sein kann.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt, bei dem es sich um ein Ribozym, ein DNA-Enzym, einen Vektor, insbesondere einen Expressionsvektor, oder eine PNA handelt.
Dabei heißt generell im Sinne dieser Erfindung::
- (Klonierunqs)vektor: Generelle Bezeichnung für Nukleinsäure-Moleküle, die beim Klonieren als Träger von Fremdgenen oder Teilen dieser Gene dienen. - Expressionsvektor: Bezeichnung für speziell konstruierte Klonierungsvektoren, die nach Einbringen in eine geeignete Wirtszelle die Transcription und Translation des in den Vektor einklonierten
5 Fremdgens erlauben.
- PNA: International gebräuchliche Abkürzung für peptidic Nucleic Acids. Hierbei bilden peptidisch verknüpfte Aminosäuren eine Kette, wobei die Aminosäuren als Seitenkette eine für die Hybridisierung mit DNA oder l o RNA fähigen Base trägt.
- Sequenz: Abfolge von Nukleotiden oder Aminosäuren. Im spezifischen Sinne dieser Erfindung ist damit die Nukleinsäuresequenz gemeint.
15 - Ribozym: Bezeichnung für eine katalytisch aktive Ribonukleinsäure (z.B. Ligase, Endonuklease, Polymerase, Exonuklease), s. z.B. Hammerhead-Ribozyme gemäß Abb. 24 oder 25 sowie die Beschreibung der Abbildungen oder s. Vaish, N.K. et al. (1998), Nucl. Acids Res. 26, 5237- 5242.
20
- DNA-Enzym: Bezeichnung für ein DNA-Molekül, das katalytische Aktivität beinhaltet (z.B. Ligase, Endonuklease, Polymerase, Exonuklease), s. z.B- DNA-Enzym 10-23 gemäß Abb. 26 sowie die Beschreibung der Abbildung oder s. Santaro und Joyce (1997) Proc.
25 Natl. Acad. Sei. USA 94, 4262-4266.
- katalytische RNA/DNA: generelle Bezeichnung für Ribozyme bzw. DNA- Enzyme (s.o.).
30 Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt enthaltend in zwei voneinander getrennten Bereichen die beiden Nukleotidteilsequenzen-wie oben beschrieben, wobei es sich um ein Ribozym, vorzugsweise ein „hammerhead" Ribozym, oder ein DNA-Enzym, vorzugsweise ein DNA-Enzym vom Typ 10-23 oder 8-17, handelt. Hier ist es besonders bevorzugt und ausgewählt, wenn es sich um ein DNA-Enzym enthaltend mindestens die Nukleotidteilsequenzen Abschn. I und Abschn. III gemäß einem der Unterpunkte (I) bis (n), vorzugsweise (n), in einer der Abbildungen 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 , 12 oder 13,
- vorzugsweise 1 , 3, 7 oder 11 , insbesondere 1 oder 3, oder - vorzugsweise 4, 6, 8 oder 12, insbesondere 4 oder 12 handelt. Ebenso ist es besonders bevorzugt und ausgewählt, wenn es sich bei dem Polynukleotid-Konstrukt um ein Ribozym enthaltend mindestens die Nukleotidteilsequenzen Helix I und Helix III gemäß einem der Unterpunkte (o) bis (q), vorzugsweise (o), in einer der Abbildungen 1 , 3, 4, 5, 6, 8, 11 oder 12; vorzugsweise 1 , 3 oder 11 , insbesondere 11 ; oder vorzugsweise 4, 6, 8 oder 12, insbesondere 4 oder 12 handelt.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist insbesondere Fig 24 zu entnehmen. Fig. 24 zeigt in allgemeiner Darstellung ein „Hammerhead"-Ribozym nach Vaish, N.K. et al. (1998), Nucl. Acid Res. 26, 5237 - 5242 mit den „erkennenden Armen" Helix I und Helix III, in die jeweils die erfindungsgemäß Helices I und III gemäß der Unterpunkte (o) -(q) in einer der Abbildungen 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 , 12, 13 oder 15 eingefügt werden, um zu den erfindungsgemäßen „Hammerhead"-Ribozymen zu kommen. Dabei ersetzt der Abschnitt Helix I in jeweils einer der Abbildungen 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 , 12, 13 oder 15 die beliebigen Nukleotide in Helix I nach Abbildung 24 so, daß das erste Nukleotid am 3'-Ende von Helix I in jeweils einer der Abbildungen 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 , 12, 13 oder 15 das erste beliebige Nukleotid „N" am 3'-Ende der Helix I der Abbildung 24 ersetzt und die folgenden beliebigen Nukleotide „N" in Helix I Abb. 24 in Richtung 5'- Ende durch die Nukleotide ersetzt werden, die in einem der Unterpunkte (o) bis (q) Helix I in jeweils einer der Abbildungen 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 , 12, 13 oder 15 gezeigt sind. Die Nukleotide „A" und "C" am 5'-Ende der Helix III in einer der Abbildungen 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 , 12, 13 oder 15 ersetzen jeweils die Nukleotide „A" und „C" in Helix III in Abb. 24 und die folgenden beliebigen Nukleotide „N" in Helix III Abb. 24 werden in Richtung 5'-Ende durch die Nukleotide ersetzt, die in einem der Unterpunkte (o)-(q) Helix III in jeweils einer der Abbildungen 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 oder 15 gezeigt sind.
Entsprechendes gilt für alle Ribozyme gemäß Unterpunkten (o bis q) in jeweils einer der Abbildungen 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 , 12, 13 oder 15.
Konkret ist eine bevorzugte Ausführungsform insbesondere Fig 26 zu entnehmen. Fig. 26 zeigt in allgemeiner Darstellung ein DNA-Enzym des Typs '10-23' gemäß Santoro et al., 1997, Fig. 2, S. 4264. Der obere, mit einem Pfeil gekennzeichnete Strang ist der zu spaltende RNA-Strang, wobei der Pfeil die Spaltstelle angibt und der untere ist eine Darstellung des DNA-Enzyms. In Bezug auf die vorliegende Anmeldung ist dabei im oberen Strang das ,N" = „U" und das „R" = „G", wobei 3'-wärts vom ,N" ein
„C" liegt. Die Spaltstelle auf dem oberen Strang ist daher eine sogenannte GU-Site (s.o.). Entsprechend ist „R" im unteren Strang = „A" und 5'-wärts vom „R" im unteren Strang befindet sich entsprechend ein „G". Dem schließen sich 5-wärts die weiteren Nukleotide aus Abschnitt I gemäß den Unterpunkten (I bis n) in jeweils einer der Abbildungen 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 , 12, 13 oder 15 an, d.h. 5 weitere Nukleotide bei Unterpunkt I, 6 weitere Nukleotide bei Unterpunkt m und 7 weitere Nukleotide bei Unterpunkt n. In Abschnitt III gemäß Abbildung 25 - dem zweiten mit der RNA basengepaarten Abschnitt - schließen sich dann direkt an das am Abschnitt III anliegende ungepaarte „A" aus 5'-Richtung 3'-wärts die Nukleotide aus
Abschnitt III gemäß den Unterpunkten (I bis n) in jeweils einer der Abbildungen 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 , 12, 13 oder 15 an, d.h. 7 weitere Nukleotide bei Unterpunkt I, 8 weitere Nukleotide bei Unterpunkt m und 9 weitere Nukleotide bei Unterpunkt n. Abschnitt III und Abschnitt 1 sind die sogenannten „erkennenden Arme" des DNA-Enzyms (s. später folgendes Beispiel 3). Das im Rahmen der Erfindung besonders bevorzugte DNA-Enzym des Typs „10-23" für Unterpunkt (n) nach Abb. 1 hätte damit folgende Sequenz, wobei der unterstrichene Abschnitt mit der RNA basengepaart wäre:
GCTGGGTGA (=R) -GGCTAGCTACAACGA-GGTGACAGG
Dieses DNA-Enzym würde als DK24 (9/9) bezeichnet werden, wobei die Bezeichnung aussagt, daß das Enzym gegen die GU-Site des Oligos K24 gerichtet ist und in den "erkennenden Armen" jeweils 9 Nukleotide (Abschnitt I und III) enthält, z. B. gemäß Abschnitt I und Abschnitt III von Unterpunkt (n) in Fig. 1). Entsprechendes gilt für alle DNA-Enzyme gemäß Unterpunkten (I bis n) in jeweils einer der Abbildungen 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 , 12, 13 oder 15.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt, wobei dieses mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Ribose, mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Phosphodiesterbindung und/oder mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Base aufweist.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid oder erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt, wobei dieses an einen Träger; insbesondere Protein, vorzugsweise tet-, Transportin oder Ferritin; gebunden und/oder in einem Liposom verpackt ist. Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch eine Zelle enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid und/oder ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Arzneimittel enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid, ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt und/oder eine erfindungsgemäße Zelle sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können als flüssige Arzneiformen in Form von Injektionslösungen, Tropfen oder Säfte, als halbfeste Arzneiformen in Form von Granulaten, Tabletten, Pellets, Patches, Kapseln, Pflaster oder Aerosolen verabreicht werden und enthalten neben den mindestens einem erfindungsgemäßen Gegenstand je nach galenischer Form gegebenenfalls Trägermaterialien, Füllstoffe, Lösungsmittel, Verdünnungsmittel, Farbstoffe und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie die einzusetzenden Mengen derselben hängt davon ab, ob das Arzneimittel oral, peroral, parenteral, intravenös, intraperitoneal, intradermal, intramuskulär, intranasal, buccal, rectal oder örtlich, zum Beispiel auf Infektionen an der Haut, der Schleimhäute und an den Augen, appliziert werden soll. Für die orale Applikation eignen sich
Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten, Tropfen, Säften und Sirupen, für die parenterale, topische und inhalative Applikation Lösungen, Suspensionen, leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen sowie Sprays. Erfindungsgemäße Gegenstände in einem Depot in gelöster Form oder in einem Pflaster, gegebenenfalls unter Zusatz von die Hautpenetration fördernden Mitteln, sind geeignete perkutane Applikationszubereitungen. Oral oder perkutan anwendbare Zubereitungsformen können die erfindungsgemäßen Gegenstände verzögert freisetzen. Die an den Patienten zu verabreichende Wirkstoffmenge variiert in Abhängigkeit vom Gewicht des Patienten, von der Applikationsart, der Indikation und dem Schweregrad der Erkrankung. Üblichweise werden 2 bis 500 mg/kg wenigstens eines erfindungsgemäßen Gegenstandes appliziert. Wenn das Arzneimittel insbesondere zur Gentherapie verwendet werden soll, empfehlen sich als geeignete Hilfsoder Zusatzstoffe beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung, Stabilisatoren, Proteinase-, DNAse-lnhibitoren etc.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Diagnostikum enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid, ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt und/oder eine erfindungsgemäße Zelle sowie gegebenenfalls geeignete Zusatzstoffe.
Dabei bedeuten
- Arzneimittel: ein Stoff entsprechend der Definition im Artikel 1 §2 des deutschen Gesetzes über den Verkehr mit Arzneimitteln (AMG). Das heißt, Stoffe oder Zubereitungen aus Stoffen, die dazu bestimmt sind, durch Anwendung am oder im menschlichen oder tierischen Körper
1. Krankheiten, Leiden, Körperschäden oder krankhafte Beschwerden zu heilen, zu lindern, zu verhüten oder zu erkennen,
2. die Beschaffenheit, den Zustand oder die Funktionen des Körpers oder seelische Zustände erkennen zu lassen,
3. vom menschlichen Körper erzeugte Wirkstoffe oder Körperflüssigkeiten zu ersetzen,
4. Krankheitserreger, Parasiten oder körperfremde Stoffe abzuwehren, zu beseitigen oder unschädlich zu machen oder 5. die Beschaffenheit, den Zustand oder die Funktionen des Körpers oder seelische Zustände zu beeinflussen.
- Diagnostikum: Verbindung oder Verfahren, das verwendet werden kann, um eine Krankheit zu diagnostizieren
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Oligonukleotid, eines erfindungsgemäßen Polynukleotid-Konstrukt und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle zur
Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Schmerz, insbesondere von chronischem Schmerz, taktiler Allodynie, thermisch ausgelöstem Schmerz, und/oder Entzündungsschmerz.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids, eines erfindungsgemäßen Polynukleotid-Konstrukts und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Harninkontinenz; auch von neurogenen Blasensymptomen; Pruritus, Tumoren, Entzündungen; insbesondere von PIM1-Kinase-assoziierten Entzündungen mit Symptomen wie Asthma; sowie von allen mit PIM1 zusammenhängenden Krankheitssymptomen.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids, eines erfindungsgemäßen Polynukleotid-Konstrukts und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle für die Gentherapie, vorzugsweise In-vivo oder In-vitro Gentherapie. Unter Gentherapie versteht man eine Therapieform, bei der durch die Einführung von Nukleinsäuren in Zellen ein Effektorgen, meist ein Protein, aber auch eine Antisense RNA, exprimiert wird oder ein vorsynthetisiertes Antisense Oligodesoxynukleotid eingebracht wird. Man unterscheidet prinzipiell In- vivo- und In-vitro-Verfahren. In In-vitro-Verfahren werden Zellen aus dem Organismus entfernt und ex-vivo mit Vektoren transfiziert, um anschließend wieder in denselben oder in einen anderen Organismus eingebracht zu werden. Bei der In-vivo-Gentherapie werden Vektoren, beispielsweise zur Bekämpfung von Tumoren, systemisch (z.B. über die Blutbahn) oder direkt in den Tumor appliziert.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Verfahren zur Identifizierung schmerzmodulierender Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifizierung über eine Quantifizierung der Bindung mindestens eines, vorzugsweise markierten, erfindungsgemäßen Oligonukleotids oder mindestens eines erfindungsgemäßen Polynukleotid- Konstrukts an eine RNA erfolgt.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Verfahren zur Identifizierung schmerzmodulierender Substanzen mit folgenden Verfahrensschritten:
(a) gentechnische Manipulation mindestens einer Zelle (Testzelle) mit mindestens einem erfindungsgemäßen
Oligonukleotid und/oder einem erfindungsgemäßen Polynukleotid-Konstrukt, (a') parallele gentechnische Manipulation mindestens einer identischen Zelle (Kontrollzelle) entweder • unterbleibend,
• unter Durchführung der Manipulation parallel ohne Oligonukleotid oder Polynukleotid-Konstrukt oder
• mit einem veränderten, nicht mehr erfindungsgemäßen Oligonukleotids oder Polynukleotidkonstrukts,
(b) parallele Inkubation einer zu testenden Substanz unter geeigneten Bedingungen mit mindestens einer Test-Zelle und mindestens einer Konrollzelle und/oder einer Präparation aus solchen Zelle, die mindestens ein Protein, ausgewählt aus der PIM-Familie, vorzugsweise der PIM1-
Kinase, synthetisiert hat
(c) Messung der Bindung der Testsubstanz an dem von den Zellen synthetisierten Protein oder Messung mindestens eines der durch die Bindung der Testsubstanz an das Protein veränderten funktioneilen Parameter, (d) Identifizierung der Substanzen über das Ausmaß der Differenz zwischen dem Meßwert bei der Testzelle und dem bei der Kontrollzelle.
Dabei bezieht sich der Begriff schmerzmodulierend auf einen potentiellen regulierenden Einfluß auf das physiologische Schmerzgeschehen, insbesondere auf eine analgetische Wirkung. Der Begriff Substanz umfaßt jede als Arzneimittel-Wirkstoff geeignete Verbindung, insbesondere also niedermolekulare Wirkstoffe, aber auch andere wie Nukleinsäuren, Fette, Zucker, Peptide oder Proteine wie Antikörper. Die Inkubation unter geeigneten Bedingungen ist hier so zu verstehen, daß die zu untersuchende Substanz mit der Zelle oder der entsprechenden Präparation in einem wässrigen Medium eine definierte Zeit vor der Messung reagieren kann. Dabei kann das wässrige Medium temperiert werden, beispielsweise zwischen 4°C und 40°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur oder bei 37°C. Die Inkubationszeit kann zwischen wenigen Sekunden und mehreren Stunden variiert werden, je nach der Wechselwirkung der Substanz mit dem Protein. Bevorzugt sind aber Zeiten zwischen 1 min und 60 min. Das wäßrige Medium kann geeignete Salze und/oder Puffersysteme enthalten, so daß bei der Inkubation beispielsweise ein pH zwischen 6 und 8, vorzugsweise pH 7,0 - 7,5 im Medium herrscht. Dem Medium können weiter geeignete Substanzen, wie Coenzyme, Nährstoffe etc. beigefügt werden. Die geeigneten Bedingungen können vom Fachmann in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Wechselwirkung der Substanz mit dem Protein aufgrund seiner Erfahrung, der Literatur oder weniger, einfacher Vorversuche leicht festgelegt werden, um im Verfahren einen möglichst deutlichen Meßwert zu erhalten. Eine Zelle, die ein Protein synthetisiert hat, ist ein Zelle, die dieses Protein bereits endogen exprimiert hat oder eine solche, die gentechnisch verändert wurden, so daß sie dieses Protein exprimiert und entsprechend vor Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens das Potein enthält. Die Zellen können Zellen aus evt. immortalisierten Zellinien sein oder native aus Geweben stammende und aus diesen isolierte Zellen sein, wobei der Zellverband meist aufgelöst ist. Die Präparation aus diesen Zellen umfaßt insbesondere Homogenate aus den Zellen, das Cytosol, eine Membranfraktion der Zellen mit Membranfragmenten, eine Suspension isolierter Zellorganellen etc.
Der Maßstab über den das Verfahren die Auffindung interessanter Substanzen erlaubt, ist entweder die Bindung an das Protein, die z.B. durch Verdrängung eines bekannten Liganden oder das Ausmaß gebundener Substanz nachgewiesen werden kann, oder die Veränderung eines funktionellen Parameters durch die Wechselwirkung der Substanz mit dem Protein. Diese Wechselwirkung kann insbesondere in einer Regulation, Hemmung und/oder Aktivierung von Rezeptoren, lonenkanälen und/oder Enzymen liegen und veränderte funktioneile Parameter können beispielsweise die Genexpression, das lonenmilieus, der pH oder das Membranpotentials, bzw. die Veränderung der Enzymaktivität oder der Konzentration der 2nd messenger sein. Dabei heißt:
- qentechnisch manipuliert: Manipulation von Zellen, Geweben oder Organismen derart, daß hier genetisches Material eingebracht wird
- endogen exprimiert: Expression eines Proteins, die eine Zelllinie unter geeigneten Kulturbedingungen aufweist, ohne daß dieses entsprechende Protein durch gentechnische Manipulation zur Expression veranlasst wurde
Eine weitere bevorzugter Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, daß die Zelle bereits vor den Verfahrensschritten (a) und (a') gentechnisch manipuliert wird. Eine weitere bevorzugter Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, daß die gentechnische Manipulation die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktioneilen Parameter erlaubt.
Eine weitere bevorzugter Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, daß durch die gentechnische Manipulion eine in der Zelle nicht endogen exprimierte Form eines Mitglieds der Pim-Kinase-Familie, vorzugsweise die PIM-1-Kinase, exprimiert oder ein Reportergen eingeführt wird.
Eine weitere bevorzugter Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, daß die Messung der Bindung über die Verdrängung eines bekannten markierten Liganden eines Mitglieds Pim-Kinase-Familie, vorzugsweise der PIM-1-Kinase, erfolgt.
Eine weitere bevorzugter Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, daß zwischen den parallelen Verfahrensschritten (a) und (a') und dem Verfahrensschritt (b) > 8 h, vorzugsweise > 12 h, insbesondere > 24 h, vergehen.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Verfahren zur Diagnose von Krankheitsbildern, die mit veränderter Expression von Genen der Pim- Kinase-Familie verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Diagnose über eine Quantifizierung der Bindung eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids und/oder mindestens eines erfindungsgemäßen Polynukleotid-Konstrukts an eine RNA erfolgt.
Die Oligonukleotide und auch Polynukleotidkonstrukte werden nach dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt. Dabei werden Nukleotide, insbesondere auch Oligonukleotide, beispielsweise nach Art der Merryfield- Synthese, an einem unlöslichen Träger (H.G. Gassen et al., Chemical and Enzymatic Synthesis of Genefragments (Verlag Chemie, Weinheim 1982)) oder auf andere Art synthetisiert (Beyer/Walter; Lehrbuch der Organischen Chemie, 20. Auflage, (S. Hirzel Verlag, Stuttgart 1984), S. 816 ff.).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung, insbesondere Schmerzbehandlung, eines nichthumanen Säugetieres oder Menschen, das oder der eine Behandlung von Schmerzen, insbesondere chronischer Schmerzen, benötigt, durch Verabreichung eines erfindungsgemäßen Arzneimittels, insbesondere solche enthaltend eine erfindungsgemäßes Oligonukleotid und/oder ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt. Ein weiterer Gegenstand sind auch entsprechende Verfahren zur Behandlung von Pruritus und/oder Harninkontinenz.
Die folgenden Beispiele und Abbildungen sollen die Erfindung erläutern, ohne daß der Gegenstand der Erfindung darauf beschränkt wäre.
Abbildungen und Beispiele
Abbildungen
Abbildungen, Abb., Figur und Fig. sind als synonym zu betrachten. Ebenso synonym sind im Zusammenhang mit den Abbildungen Subtyp und Unterpunkt. Ein „X" in den abgebildeten Sequenzen steht für ein beliebiges zur entsprechenden Base auf der mRNA von PIM1 komplementäres Nukleotid. Die Abbildungen zeigen:
Figur 1) Generell Nukleotidsequenzen ausgehend von einer Antisense
Oligodesoxynukleotidsequenz gegen die mRNA des PIM1 aus der Ratte, hier häufig als Oligo K3, Oligonukleotid Nr. 3 oder K3 bezeichnet. Unterpunkte (a) -(z) zeigen verkürzte Ausschnitte aus dieser Antisense- Oligodesoxynukleotidsequenz K3, Unterpunkt (aa) zeigt die volle Antisense-Oligodesoxynukleotidsequenz, mit der das „messenger walk screening" durchgeführt wurde.
Figur 2)
Die dem Oligo K6 entsprechende Sequenz eines Antisense- Desoxyoligonukleotids gegen humanes PIML Die Untertypen (a) - (aa) entsprechen bezüglich Art und generellem Inhalt den bereits zu Figur 1 beschriebenen.
Figur 3)
Generelle Nukleotidsequenzen ausgehend von einer Antisense Oligodesoxynukleotidsequenz gegen die mRNA des PIM1 aus der Ratte,
Figur 24):
Allgemeine Darstellung eines „Hammerhead"-Ribozyms mit den „erkennenden Armen" Helix I und Helix III.
Figur 26):
Darstellung des DNA-Enzyms des Typs '10-23' gemäß Santoro et al., 1997, Fig. 2, S. 4264:
Der obere, mit einem Pfel gekennzeichnete Strang ist der zu spaltende RNA-Strang, wobei der Pfeil die Spaltstelle angibt und der untere ist eine Darstellung des DNA-Enzyms. In Bezug auf die vorliegende Anmeldung ist dabei im oberen Strang das ,N" = „U" und das „R" = „G", wobei 3'-wärts vom ,N" ein „C" liegt. Die Spaltstelle auf dem oberen Strang ist daher eine sogenannte GUC-Site (s.o.). Entsprechend ist „R" im unteren Strang = „A" und 5'-wärts vom „R" im unteren Strang befindet sich entsprechend ein „G".
Fig. 27) Schematische Darstellung einer „Locked Nucleic Acid" LNA:
Beispiele:
Beispiel 4:
In vivo Experimente
In 20 mänlichen Sprague-Dawley-Ratten wurden an den linken L5/L6 Spinal-Nerven Spinal-Nerven-Ligaturen gemäß Kim und Chung (1992) angelegt. Zur selben Zeit wurden Spinal-Katheter gemäß Pogatzki et al.6 (2000) implantiert. 4 bis 6 Tage nach der Operation wurde die taktile Schwellen-Basislinie (Rückzugs-Schwellen/withdrawal threshholds) an der ipsi- und contralateralen Hinterpfote durch ein elektronisches vonFrey- Anesthesiometer (IITC Life Science, USA) gemessen. Der korrekte Sitz der Spinal-Katheter wurde durch Lidocain-Gabe (10μl, 2%) bestätigt, die in einer kurzfristigen Lähmung beider Hinterglieder resultierte. Nach dem Test und Messung der Basislinie wurden je 45μg PIM-1 Antisense- (AS, n=10) oder Mismatch (MS, n=10)-Oligonukleotide in 0.9% NaCI einmal am ersten Tag und b.i.d. an den folgende 4 Tagen gegeben. Die taktilen Rückzugs- Schwellen (withdrawal threshholds) wurden 30 Minuten nach der ersten täglichen Oligo-Gabe gemessen. Die Ergebnisse sind als % maximal possible effect (%MPE; % des maximal möglichen Effekts) auf der ipsilateralen Seite angegeben, in dem man die Basisline als 0% und die Rückzugs-Schwelle einer Kontroll-Gruppe als 100%MPE annimmt. Beispiel 5:
„Locked Nucleotides"/Gegen Abbau geschützte Oligonukleotide bzw. Oligonukleotid-Konstrukte
Es wurden verschiedene erfindungsgemäße Oligonukleotide insbesondere gemäß Untergruppe (aa) x, y oder z der Abbildungen 1 oder 2 oder gemäß Abbildung 3 hergestellt. Die meisten von diesen waren LNA-Konstrukte, die bei PROLIGO in Boulder, Co, USA bestellt wurden und bei denen LNA an verschiedenen Stellen saßen. Weiter wurde ein unverändertes Oligonukleotid gemäß Untergruppe (aa) der Abbildungen 1 synthetisiert und ein von der Basensequenz entsprechendes Phosphorothioat bei MWG Biotech AG in Ebersberg Deutschland bestellt.
Literatur
Davis, J. B.; Gray, J.; Gunthorpe, M. J.; Hatcher, J. P.; Davey, P. T. Overend, P.; Harries, M. H.; Latcham, J.; Clapham, C; Atkinson, K. Hughes, S. A.; Rance, K.; Grau, E.; Harper, A. J.; Pugh, P. L. Rogers, D. C; Bingham, S.; Randall, A.; Sheardown, S. A. (2000) Vanilloid receptor-1 is essential for inflammatory thermal hyperalgesia. Nature 405, 183-187.
Kim, S. H.; Chung, J. M. (1992) An experimental model for peripheral mononeuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat. Pain 50, 355-363.
Pogatzki, E. M.; Zahn, P. K.; Brennan, T. J. (2000) Lumbar catheterization of the subarachnoid space with a 32-gauge polyurethane catheter in the rat. Eur. J. Pain 4, 111-113.
Porreca, F.; Lai, J.; Bian, D.; Weger-, S.; Ossipov, M. H.; Eglen, R. M.; Kassotakis, L.; Novakovic, S.; Rabert, D. K.; Sangameswaran, L.; Hunter, J. C. (1999) A comparison of the potential role of the tetrodotoxin-insensitive sodium chaneis, PN3/SNS and NaN/SNS2, in rat modeis of chronic pain. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96, 7640-7644.
Santoro, S. W.; Joyce, G. F. (1997) A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94, 4262-4266.
Vaish, N.K. et al. (1998), Nucl. Acids Res. 26, 5237 - 5242.

Claims

Patentansprüche
1. Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine(r) Basensequenz gemäß einem der Unterpunkte (a) bis (aa) in einer der Abbildungen
1 oder 2 oder eine(r) sich in maximal einer abweichenden Base davon unterscheidende(n) Sequenz.
2. Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine(r) Basensequenz gemäß einer der Auflistungen in Abbildung 3 oder eine(r) sich in maximal zwei abweichenden Basen, vorzugsweise einer, davon unterscheidende(n) Sequenz.
3. Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine(r) Basensequenz gemäß einer der Auflistungen in Abbildung 3.
4. Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine(r) Basensequenz gemäß Unterpunkt (x), (y), (z) oder (aa) in einer der Abbildungen 1 oder 2 oder eine(r) sich in maximal zwei abweichenden Basen, vorzugsweise einer, davon unterscheidende(n) Sequenz.
5. Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine(r) Basensequenz gemäß Unterpunkt (x), (y), (z) oder (aa) in einer der Abbildungen 1 oder 2.
6. Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid eine Länge von 15 bis 30, vorzugsweise 15 bis 25, insbesondere 17 bis 22 oder genau 18 oder 20, Nukleotiden aufweist.
7. Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß - gegebenenfalls in einer Base abweichend - die in den Oligonukleotiden enthaltene oder diesen entsprechende der Basensequenz einer der Abbildungen 1, 2 oder 3 zu entnehmen ist.
8. Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Ribose, mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Phosphodiesterbindung und/oder mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Base aufweist.
9. Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der Nukleotide, insbesondere mehrere der Nukleotide, „Locked Nucleic Acids" („LNA") sind oder mindestens eines der Nukleotide, insbesondere alle Nukleotide, Phosphorothioate sind, vorzugsweise daß mehrere der Nukleotide „Locked Nucleic Acids" („LNA") sind.
10. Oligonukleotid gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die „LNA" am 5'- und 3'-Ende des Oligonukleotids liegen, vorzugsweise jeweils die letzten 2-5 Nukleotide, insbesondere jeweils die letzten 4 oder 5 Nukleotide, am 3'- und 5'-Ende des Oligonukleotids „LNA" sind
und/oder
daß > 6, insbesondere > 8 zusammenhängende Nukleotide im Oligonukleotid keine „LNA" sind, vorzugsweise daß von den im Sequenzbereich gemäß jeweiligem Unterpunkt (a) abgebildeten Nukleotiden des Oligonukleotids gemäß einer der Abbildungen 1 bis 16 Unterpunkt (b) bis (k) nur jeweils höchstens eines oder keines der
Nukleotide eine „LNA" ist.
11. Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das betroffenen Oligonukleotid ein Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7, vorzugsweise 7, ist.
12. Polynukleotid-Konstrukt enthaltend mindestens ein Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11.
13. Polynukleotid-Konstrukt gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Ribozym, ein DNA-Enzym, einen Vektor, insbesondere einen Expressionsvektor, oder eine PNA handelt.
14. Polynukleotid-Konstrukt gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Ribozym, vorzugsweise ein
„hammerhead" Ribozym, oder ein DNA-Enzym, vorzugsweise ein DNA-Enzym vom Typ 8-17 handelt.
15. Polynukleotid-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Ribose, mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Phosphodiesterbindung und/oder mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Base aufweist.
16. Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 oder Polynukleotid-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß dieses an einen Träger; insbesondere Protein, vorzugsweise tet-, Transportin oder Ferritin; gebunden und/oder in einem Liposom verpackt ist.
17. Zelle enthaltend mindestens ein Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 oder 16 und/oder ein Polynukleotid-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16.
18. Arzneimittel enthaltend mindestens ein Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 oder 16, ein Polynukleotid-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16 und/oder eine Zelle gemäß Anspruch 17 sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe.
19. Diagnostikum enthaltend mindestens ein Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 oder 16, ein Polynukleotid-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16 und/oder eine Zelle gemäß Anspruch 17 sowie gegebenenfalls geeignete Zusatzstoffe.
20. Verwendung eines Oligonukleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 oder 16, eines Polynukleotid-Konstrukts gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16 und/oder einer Zelle gemäß Anspruch 17 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Schmerz, insbesondere von chronischem Schmerz, taktiler Allodynie, thermisch ausgelöstem Schmerz, und/oder Entzündungsschmerz.
21. Verwendung eines Oligonukleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 oder 16, eines Polynukleotid-Konstrukts gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16 und/oder einer Zelle gemäß Anspruch 17 zur
Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Harninkontinenz; auch von neurogenen Blasensymptomen; Pruritus, Tumoren, Entzündungen; insbesondere von PIMI-Kinase- assoziierten Entzündungen mit Symptomen wie Asthma; sowie von allen mit PIM1 zusammenhängenden Krankheitssymptomen.
22. Verwendung eines Oligonukleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 oder 16, eines Polynukleotid-Konstrukts gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16 und/oder einer Zelle gemäß Anspruch 17 für die Gentherapie, vorzugsweise In-vivo oder In-vitro Gentherapie.
23. Verfahren zur Identifizierung schmerzmodulierender Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifizierung über eine Quantifizierung der Bindung mindestens eines, vorzugsweise markierten, Oligonukleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 oder 16 und/oder eines Polynukleotid-Konstrukts gemäß einem der
Ansprüche 12 bis 16 an eine RNA erfolgt.
24. Verfahren zur Identifizierung schmerzmodulierender Substanzen mit folgenden Verfahrensschritten:
(a) gentechnische Manipulation mindestens einer Zelle (Testzelle) mit mindestens einem Oligonukleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 oder 16 und/oder eines Polynukleotid-Konstrukts gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16,
(a') parallele gentechnische Manipulation mindestens einer identischen Zelle (Kontrollzelle) entweder
• unterbleibend,
• unter Durchführung der Manipulation parallel ohne Oligonukleotid oder Polynukleotid-Konstrukt oder
• mit einem veränderten, nicht mehr den Ansprüchen 1 bis 11 oder 16 entsprechenden Oligonukleotid oder Polynukleotidkons.ru kt,
(b) parallele Inkubation einer zu testenden Substanz unter geeigneten Bedingungen mit mindestens einer Test-Zelle und mindestens einer Konrollzelle und/oder einer Präparation aus solchen Zelle, die mindestens ein Protein, ausgewählt aus der PIM-Kinase-Familie, vorzugsweise der PIM-1-Kinase, synthetisiert hat
(c) Messung der Bindung der Testsubstanz an dem von den Zellen synthetisierten Protein oder Messung mindestens eines der durch die Bindung der Testsubstanz an das
Protein veränderten funktioneilen Parameter,
(d) Identifizierung der Substanzen über das Ausmaß der Differenz zwischen dem Meßwert bei der Testzelle und dem bei der Kontrollzelle.
25. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle bereits vor den Verfahrensschritten (a) und (a') gentechnisch manipuliert wird.
26. Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die gentechnische Manipulation die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktioneilen Parameter erlaubt.
27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß durch die gentechnische Manipulion eine in der Zelle nicht endogen exprimierte Form eines Mitglieds der PIM- Kinase-Familie, vorzugsweise der PIM-1-Kinase, exprimiert oder ein Reportergen eingeführt wird.
28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung der Bindung über die Verdrängung eines bekannten markierten Liganden eines Mitglieds der PIM-Kinase-Familie, vorzugsweise der PIM-1-Kinase, erfolgt.
29. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 29 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den parallelen Verfahrensschritten (a) und (a') und dem Verfahrensschritt (b) > 8 h, vorzugsweise > 12 h, insbesondere > 24 h, vergehen.
30. Verfahren zur Diagnose von Krankheitsbildern, die mit veränderter Expression von Genen der PIM-Kinase-Familie verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Diagnose über eine Quantifizierung der Bindung eines Oligonukleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 oder 16 und/oder mindestens einem Polynukleotid-Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16 an eine RNA erfolgt.
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Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005033310A1 (de) * 2003-10-01 2005-04-14 Grünenthal GmbH Pim-1-spezifische dsrna-verbindungen
DE102004004894A1 (de) * 2004-01-30 2005-08-18 Grünenthal GmbH Verfahren zur Wirkstoffidentifizierung bei Harninkontinenz unter Verwendung von PIM-Kinasen
WO2006124626A2 (en) * 2005-05-14 2006-11-23 University Of Maryland Baltimore Inhibition of the 44 kilodalton isoform of pim-1 kinase restores apoptosis induced by chemotherapeutic drugs in cancer cells
US9200004B2 (en) 2013-01-15 2015-12-01 Incyte Holdings Corporation Thiazolecarboxamides and pyridinecarboxamide compounds useful as Pim kinase inhibitors
US9278950B2 (en) 2013-01-14 2016-03-08 Incyte Corporation Bicyclic aromatic carboxamide compounds useful as Pim kinase inhibitors
US9540347B2 (en) 2015-05-29 2017-01-10 Incyte Corporation Pyridineamine compounds useful as Pim kinase inhibitors
US9556197B2 (en) 2013-08-23 2017-01-31 Incyte Corporation Furo- and thieno-pyridine carboxamide compounds useful as pim kinase inhibitors
US9580418B2 (en) 2014-07-14 2017-02-28 Incyte Corporation Bicyclic aromatic carboxamide compounds useful as Pim kinase inhibitors
US9822124B2 (en) 2014-07-14 2017-11-21 Incyte Corporation Bicyclic heteroaromatic carboxamide compounds useful as Pim kinase inhibitors
US9862705B2 (en) 2015-09-09 2018-01-09 Incyte Corporation Salts of a pim kinase inhibitor
US9920032B2 (en) 2015-10-02 2018-03-20 Incyte Corporation Heterocyclic compounds useful as pim kinase inhibitors
US10596161B2 (en) 2017-12-08 2020-03-24 Incyte Corporation Low dose combination therapy for treatment of myeloproliferative neoplasms

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996039427A1 (en) * 1995-06-05 1996-12-12 Trustees Of Dartmouth College Ligand-stimulated gene expression
EP0911391A2 (de) * 1997-10-24 1999-04-28 Smithkline Beecham Corporation Klon HWHHJ20
US6013639A (en) * 1995-01-31 2000-01-11 Hoechst Aktiengesellschaft G cap-stabilized oligonucleotides
US6143540A (en) * 1999-01-26 2000-11-07 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Molecules of the HKID-1-related protein family and uses thereof
WO2002093173A2 (de) * 2001-05-11 2002-11-21 Grünenthal GmbH Screeningverfahren mit pim1-kinase oder pim3-kinase

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NO953680D0 (no) * 1995-09-18 1995-09-18 Hans Prydz Cellesyklusenzymer
US20020068709A1 (en) * 1999-12-23 2002-06-06 Henrik Orum Therapeutic uses of LNA-modified oligonucleotides
DE10037759A1 (de) * 2000-08-03 2002-07-04 Gruenenthal Gmbh Screeningverfahren

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6013639A (en) * 1995-01-31 2000-01-11 Hoechst Aktiengesellschaft G cap-stabilized oligonucleotides
WO1996039427A1 (en) * 1995-06-05 1996-12-12 Trustees Of Dartmouth College Ligand-stimulated gene expression
EP0911391A2 (de) * 1997-10-24 1999-04-28 Smithkline Beecham Corporation Klon HWHHJ20
US6143540A (en) * 1999-01-26 2000-11-07 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Molecules of the HKID-1-related protein family and uses thereof
WO2002093173A2 (de) * 2001-05-11 2002-11-21 Grünenthal GmbH Screeningverfahren mit pim1-kinase oder pim3-kinase

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AGRAWAL S: "Antisense Oligonucleotides: Towards Clinical Trials" TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, ELSEVIER, AMSTERDAM,, GB, Nr. 14, 1996, Seiten 376-387, XP002080233 ISSN: 0167-7799 *
BERTRAND J -R ET AL: "Covalent coupling of a PIM-1 oncogene targeted PNA with an antennapedia derived peptide." NUCLEOSIDES NUCLEOTIDES & NUCLEIC ACIDS, Bd. 22, Nr. 5-8, Seiten 1611-1613, XP009022233 ISSN: 1525-7770 (ISSN print) *
BRAASCH D A ET AL: "Locked nucleic acid (LNA): Fine-tuning the recognition of DNA and RNA" CHEMISTRY AND BIOLOGY, CURRENT BIOLOGY, LONDON, GB, Bd. 8, Nr. 1, Januar 2001 (2001-01), Seiten 1-7, XP002255827 ISSN: 1074-5521 in der Anmeldung erw{hnt *
CHEN X P ET AL: "PIM SERINE/THREONINE KINASES REGULATE THE STABILITY OF SOCS-1 PROTEIN" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, Bd. 99, Nr. 4, 19. Februar 2002 (2002-02-19), Seiten 2175-2180, XP002951644 ISSN: 0027-8424 *
GOTTIKH M ET AL: "IN VITRO INHIBITION OF THE PIM-1 PROTOONCOGENE BY CHIMERIC OLIGODEOXYRIBONUCLEOTIDES COMPOSED OF ALPHA- AND BETA-ANOMERIC FRAGMENTS" GENE, ELSEVIER BIOMEDICAL PRESS. AMSTERDAM, NL, Bd. 149, Nr. 1, 1994, Seiten 5-12, XP000644529 ISSN: 0378-1119 *
KONIETZKO UWE ET AL: "Pim kinase expression is induced by LTP stimulation and required for the consolidation of enduring LTP" EMBO JOURNAL, OXFORD UNIVERSITY PRESS, SURREY, GB, Bd. 18, Nr. 12, 15. Juni 1999 (1999-06-15), Seiten 3359-3369, XP002203187 ISSN: 0261-4189 *
REEVES R ET AL: "Primary structure of the putative human oncogene, pim-1" GENE, ELSEVIER BIOMEDICAL PRESS. AMSTERDAM, NL, Bd. 90, Nr. 2, 15. Juni 1990 (1990-06-15), Seiten 303-307, XP002122335 ISSN: 0378-1119 *
VAISH NARENDRA K ET AL: "Recent developments in the hammerhead ribozyme field" NUCLEIC ACIDS RESEARCH, Bd. 26, Nr. 23, 1. Dezember 1998 (1998-12-01), Seiten 5237-5242, XP002263636 ISSN: 0305-1048 in der Anmeldung erw{hnt *
WANG Z ET AL: "cDNA cloning, sequencing and characterization of bovine pim-1." VETERINARY IMMUNOLOGY AND IMMUNOPATHOLOGY. NETHERLANDS 26 JAN 2001, Bd. 78, Nr. 2, 26. Januar 2001 (2001-01-26), Seiten 177-195, XP002273164 ISSN: 0165-2427 *
WINGETT D ET AL: "CHARACTERIZATION OF THE TESTES-SPECIFIC PIM-1 TRANSCRIPT IN RAT" NUCLEIC ACIDS RESEARCH, OXFORD UNIVERSITY PRESS, SURREY, GB, Bd. 20, Nr. 12, 1992, Seiten 3183-3189, XP001148988 ISSN: 0305-1048 *
WOOLF T M ET AL: "SPECIFICITY OF ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES IN VIVO" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE. WASHINGTON, US, Bd. 89, 1. August 1992 (1992-08-01), Seiten 7305-7309, XP000574994 ISSN: 0027-8424 *

Cited By (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005033310A1 (de) * 2003-10-01 2005-04-14 Grünenthal GmbH Pim-1-spezifische dsrna-verbindungen
DE102004004894A1 (de) * 2004-01-30 2005-08-18 Grünenthal GmbH Verfahren zur Wirkstoffidentifizierung bei Harninkontinenz unter Verwendung von PIM-Kinasen
WO2006124626A2 (en) * 2005-05-14 2006-11-23 University Of Maryland Baltimore Inhibition of the 44 kilodalton isoform of pim-1 kinase restores apoptosis induced by chemotherapeutic drugs in cancer cells
WO2006124626A3 (en) * 2005-05-14 2007-05-03 Univ Maryland Inhibition of the 44 kilodalton isoform of pim-1 kinase restores apoptosis induced by chemotherapeutic drugs in cancer cells
US9676750B2 (en) 2013-01-14 2017-06-13 Incyte Corporation Bicyclic aromatic carboxamide compounds useful as pim kinase inhibitors
US9278950B2 (en) 2013-01-14 2016-03-08 Incyte Corporation Bicyclic aromatic carboxamide compounds useful as Pim kinase inhibitors
US10517858B2 (en) 2013-01-15 2019-12-31 Incyte Holdings Corporation Thiazolecarboxamides and pyridinecarboxamide compounds useful as PIM kinase inhibitors
US11229631B2 (en) 2013-01-15 2022-01-25 Incyte Corporation Thiazolecarboxamides and pyridinecarboxamide compounds useful as Pim kinase inhibitors
US10828290B2 (en) 2013-01-15 2020-11-10 Incyte Corporation Thiazolecarboxamides and pyridinecarboxamide compounds useful as pim kinase inhibitors
US9200004B2 (en) 2013-01-15 2015-12-01 Incyte Holdings Corporation Thiazolecarboxamides and pyridinecarboxamide compounds useful as Pim kinase inhibitors
US9550765B2 (en) 2013-01-15 2017-01-24 Incyte Holdings Corporation Thiazolecarboxamides and pyridinecarboxamide compounds useful as Pim kinase inhibitors
US9849120B2 (en) 2013-01-15 2017-12-26 Incyte Holdings Corporation Thiazolecarboxamides and pyridinecarboxamide compounds useful as Pim kinase inhibitors
US10265307B2 (en) 2013-01-15 2019-04-23 Incyte Corporation Thiazolecarboxamides and pyridinecarboxamide compounds useful as Pim kinase inhibitors
US10000507B2 (en) 2013-08-23 2018-06-19 Incyte Corporation Furo- and thieno-pyridine carboxamide compounds useful as pim kinase inhibitors
US9556197B2 (en) 2013-08-23 2017-01-31 Incyte Corporation Furo- and thieno-pyridine carboxamide compounds useful as pim kinase inhibitors
US9822124B2 (en) 2014-07-14 2017-11-21 Incyte Corporation Bicyclic heteroaromatic carboxamide compounds useful as Pim kinase inhibitors
US9890162B2 (en) 2014-07-14 2018-02-13 Incyte Corporation Bicyclic aromatic carboxamide compounds useful as pim kinase inhibitors
US9580418B2 (en) 2014-07-14 2017-02-28 Incyte Corporation Bicyclic aromatic carboxamide compounds useful as Pim kinase inhibitors
US9802918B2 (en) 2015-05-29 2017-10-31 Incyte Corporation Pyridineamine compounds useful as Pim kinase inhibitors
US9540347B2 (en) 2015-05-29 2017-01-10 Incyte Corporation Pyridineamine compounds useful as Pim kinase inhibitors
US11066387B2 (en) 2015-09-09 2021-07-20 Incyte Corporation Salts of a Pim kinase inhibitor
US10336728B2 (en) 2015-09-09 2019-07-02 Incyte Corporation Salts of a Pim kinase inhibitor
US9862705B2 (en) 2015-09-09 2018-01-09 Incyte Corporation Salts of a pim kinase inhibitor
US11505540B2 (en) 2015-09-09 2022-11-22 Incyte Corporation Salts of a Pim kinase inhibitor
US10450296B2 (en) 2015-10-02 2019-10-22 Incyte Corporation Heterocyclic compounds useful as Pim kinase inhibitors
US11053215B2 (en) 2015-10-02 2021-07-06 Incyte Corporation Heterocyclic compounds useful as Pim kinase inhibitors
US9920032B2 (en) 2015-10-02 2018-03-20 Incyte Corporation Heterocyclic compounds useful as pim kinase inhibitors
US10596161B2 (en) 2017-12-08 2020-03-24 Incyte Corporation Low dose combination therapy for treatment of myeloproliferative neoplasms
US11278541B2 (en) 2017-12-08 2022-03-22 Incyte Corporation Low dose combination therapy for treatment of myeloproliferative neoplasms

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