DE60037938T2 - Antisense-therapie für trpm-2 - Google Patents

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Description

  • Diese Anmeldung beansprucht die Priorität aus der US Provisional Patent Application No. 60/121,726, eingereicht am 26. Februar 1999.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Diese Anmeldung betrifft Antisense-Behandlungen für Krebs, welche ein Antisense-Oligonukleotid verwenden, das an Testosterone-Repressed Prostate Message-2 (TRPM-2) bindet.
  • Prostatakrebs ist der häufigste Krebs, an dem Männer leiden, und die zweihäufigste Ursache von Krebstod bei Männern in der westlichen Welt. Da Prostatakrebs ein Androgen-empfindlicher Tumor ist, wird in einigen therapeutischen Behandlungsschemata bei Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs ein Androgen-Entzug zum Beispiel über Kastration verwendet. Ein Androgen-Entzug führt im Prostata-Tumor zu einer umfangreichen Apoptose und daher zu einem Rückgang der Krankheit. Jedoch ist die Kastrations-induzierte Apoptose nicht vollständig und letztendlich findet ein Fortschreiten von überlebenden Tumorzellen zur Androgen-Unabhängigkeit statt. Dieses Fortschreiten ist das Haupthindernis, um das Überleben und die Lebensqualität zu verbessern, und deshalb sind Anstrengungen unternommen worden, um Androgen-unabhängige Zellen anzusteuern. Diese Anstrengungen haben sich auf nicht-hormonelle Therapien konzentriert, die gegen Androgen-unabhängige Tumorzellen gerichtet sind (Yagoda et al, Cancer 71 (Supp. 3): 1098-1109 (1993); Oh et al., J. Urol. 60: 1220-1229 (1998)), jedoch hat bisher kein nicht-hormonelles Mittel das Überleben verbessert. Es sind deshalb alternative Ansätze angezeigt.
  • Es wurde beobachtet, dass nach einem Androgen-Entzug zahlreiche Proteine in zunehmenden Mengen durch Prostata-Tumorzellen exprimiert werden. Es wird angenommen, dass mindestens einige dieser Proteine mit dem beobachteten apoptotischen Zelltod in Verbindung stehen, der beim Androgen-Entzug beobachtet wird. (Raffo et al., Cancer Res.: 4448-4445 (1995); Krajewska et al., Am. J. Pathol. 148: 1567-1576 (1996); McDonnell et al., Cancer Res. 52: 6940-6944 (1992)). Die Funktionen von vielen der Proteine wird jedoch nicht klar verstanden. TRPM-2 (auch als sulfatiertes Glycoprotein-2 (SGP-2) oder Clusterin bekannt) befindet sich innerhalb der letztgenannten Kategorie.
  • TRPM-2 ist ein ubiquitäres Protein mit einem vielfältigen Bereich an vorgeschlagenen Aktivitäten. In Prostata-Epithelzellen nimmt die Expression von TRPM-2 unmittelbar nach der Kastration zu, wobei sie Spitzenkonzentrationen in Ratten-Prostatazellen 3 bis 4 Tage nach der Kastration zusammenfallend mit dem Beginn eines massiven Zelltods erreicht. Diese Ergebnisse haben bei einigen Forschern zu dem Schluss geführt, dass TRPM-2 ein Marker für den Zelltod und ein Promotor der Apoptose ist. Andererseits erhebt die Beobachtung, dass Sertoli-Zellen und einige Epithelzellen, die hohe Konzentrationen an TRPM-2 ohne ein erhöhtes Maß an Zelltod exprimieren, die Frage, ob diese Schlussfolgerung richtig ist.
  • Sensibar et al. berichteten in Cancer Research 55: 2431-2437 (1995) über in-vitro-Experimente, die durchgeführt wurden, um die Rolle von TRPM-2 beim Prostata-Zelltod klarer aufzuklären. Sie verwendete LNCaP-Zellen, die mit einem Gen transfiziert waren, das TRPM-2 codiert, und beobachteten, ob die Expression dieses Proteins die Auswirkungen von Tumornekrosefaktor α (TNFα) verändert, für welchen LNCaP-Zellen sehr empfindlich sind, wobei der Zelltod normalerweise innerhalb von 12 Stunden stattfindet. Es wurde gezeigt, dass die Behandlung der transfizierten LNCaP-Zellen mit TNFα eine vorübergehende Zunahme der TRPM-2-Konzentrationen über eine Zeitspanne von wenigen Stunden zur Folge hatte, aber diese Konzentrationen waren zu dem Zeitpunkt verschwunden, zu dem eine DNA-Fragmentierung, welche dem Zelltod vorangeht, beobachtet wurde. Die Verwendung eines Antisense-Moleküls, welches den Basen 1–22 der TRPM-2-Sequenz entspricht, aber nicht anderer TRPM-2-Antisense-Oligonukleotide, hatte eine wesentliche Verringerung der Expression von TRPM-2 und eine Zunahme des apoptotischen Zelltods in LNCaP-Zellen zur Folge, welche TNFα ausgesetzt wurden. Dies führte Sensibar et al. zu der Hypothese, dass die Überexpression von TRPM-2 Zellen vor der zytotoxischen Wirkung von TNF schützen könnte und dass eine Verarmung an TRPM-2 für den Beginn des Zelltods verantwortlich ist, obwohl der Wirkungsmechanismus unklar verbleibt.
  • Während Sensibar et al. Information über die mögliche Rolle von TRPM-2 liefern, offenbaren sie jedoch nur Ergebnisse eines Modellsystems, in dem die Expression von TRPM-2 auf einem transfizierten Gen beruht. Weiter sind die Expressionsniveaus von TRPM-2 in LNCaP-Zellen, die in anderen Labors gewachsen sind, sehr niedrig oder abwesend. Die Situation, die sich in vivo ergibt, wenn Prostata-Tumorzellen einem Androgen-Entzug unterzogen werden, ist viel komplexer, wobei als Ergebnis zahlreiche Proteine ihre Expressionsniveaus ändern. So ist es aus den Daten von Sensibar et al. nicht möglich vorherzusagen, ob TRPM-2 die gleichen Funktion erfüllen würde, wenn es in Kombination mit anderen Proteinen vorliegen würde, oder ob Änderungen der Konzentrationen an TRPM-2 nach Androgen-Entzug in vivo irgendwelche therapeutischen Vorteile liefern könnten. Die Tatsache, dass TRPM-2 in beträchtlichen Mengen in Prostata-Tumorzellen in verschiedenen Stadien nach Androgen-Entzug exprimiert wird, einschließlich Stadien, bei denen ein signifikanter apoptotischer Zelltod stattfindet, legt nämlich nahe, dass die Rolle von TRPM-2 in vivo komplizierter sein kann. Während der Stand der Technik Daten mit Bezug auf gewisse Aspekte des apoptotischen Zelltods in Prostata-Tumorzellen liefert, bietet er demgemäß weder eine Lehre noch einen Vorschlag für eine Methode, um für eine Verzögerung des Beginns der Androgen-Unabhängigkeit zu sorgen.
  • Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein derartiges Verfahren bereitzustellen.
  • Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, therapeutische Antisense-Moleküle für die Verzögerung des Beginns der Androgen-Unabhängigkeit in Prostata-Tumorzellen bereitzustellen.
  • Es ist ein zusätzliches Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verbesserung der Chemoempfindlichkeit oder Strahlungsempfindlichkeit von Krebszellen aus einem Krebs, der TRPM-2 exprimiert, bereitzustellen.
  • Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, therapeutische Antisense-Moleküle für die Inhibierung der Expression von TRMP-2 bereitzustellen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde nun festgestellt, dass eine Antisense-Therapie, welche die Expression von TRPM-2 verringert, für therapeutische Vorteile bei der Behandlung von Krebs sorgt. Insbesondere kann eine derartige Antisense-Therapie bei der Behandlung von Prostatakrebs und Nierenzellenkrebs angewandt werden.
  • Die Hinzufügung von Antisense-TRPM-2-Oligodesoxynukleotid (ODN) zu Prostata-Tumorzellen in vivo ist wirksam für die Verzögerung des Beginns der Androgen-Unabhängigkeit. So stellt die Erfindung in einem Aspekt ein Verfahren zur Behandlung von Prostatakrebs bei einem Patienten bereit, der an Prostatakrebs leidet, welches die Schritte der Einleitung eines Androgen-Entzugs, um den apoptotischen Zelltod von Prostata-Tumorzellen in dem Patienten zu induzieren, und der Verabreichung eines Antisense-Oligonukleotids an den Patienten umfasst, welches wirksam ist, um die Expression von TRPM-2 durch die Tumorzellen zu hemmen, wodurch das Fortschreiten von Prostata-Tumorzellen zu einem Androgen-unabhängigen Zustand bei einem Patienten verzögert wird. Weiter verstärkt die kombinierte Verwendung von Antisense-TRPM-2 plus zytotoxischer Chemotherapie (z. B. Taxane) synergistisch die Chemoempfindlichkeit in Hormon-resistentem Prostatakrebs. In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein zweites Antisense-ODN, das die Expression eines von TRPM-2 verschiedenen antiapoptotischen Proteins hemmt, zusammen mit dem Antisense-TRPM-2-ODN verabreicht.
  • Es wurde auch gefunden, dass Antisense-TRPM-2 vorteilhafte Wirkungen bei anderen Krebstypen aufweist. Speziell verstärkt Antisense-TRPM-2-ODN die Chemoempfindlichkeit bei humanem Nierenzellenkrebs, einer normalerweise chemoresistenten Krankheit, für die es kein aktives chemotherapeutisches Mittel mit einer objektiven Antwortrate von mehr als 10% gibt. Die Strahlungsempfindlichkeit wird ebenfalls erhöht, wenn Zellen, die TRPM-2 exprimieren, mit Antisense-TRPM-2-ODN behandelt werden. So können die Antisense-TRPM-2-ODNs verwendet werden, um eine Vielfalt von Krebstypen zu behandeln, bei denen die Expression von TRPM-2 beobachtet worden ist.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt die Verzögerung des Beginns der Androgen-Unabhängigkeit, die unter Verwendung von Antisense-TRPM-2-ODN erzielt wird;
  • 2 zeigt die Positionen von 10 Antisense-Oligonukleotiden, die bezüglich der Fähigkeit ausgewertet wurden, die TRPM-2-Expression zu hemmen und den Beginn der Androgen-Unabhängigkeit hinauszuzögern;
  • 3 zeigt die Expressionsniveaus von TRPM-2-mRNA in Anwesenheit verschiedener Antisense-ODNs;
  • 4 zeigt die Niveaus von TRPM-2-mRNA in Shionogi-Zellen, die in vitro mit verschiedenen Mengen von Antisense-TRPM-2-ODN oder einer Fehlpaarungskontrolle behandelt wurden;
  • 5 zeigt die Dosis-Antwort-Kurve für Kombinationen von Taxol und Antisense-TRPM-2-ODN;
  • 6 zeigt die Dosis-Antwort-Kurve für Kombinationen von Taxol, Antisense-TRPM-2-ODN und Antisense Bcl-2-ODN;
  • 7A zeigt die Abnahme der TRPM-2-mRNA-Konzentrationen bei humanem Nierenzellenkrebs nach Behandlung mit Antisense-TRPM-2-ODNs;
  • 7B zeigt die Zunahme der Chemoempfindlichkeit von humanem Nierenzellenkrebs gegenüber Taxol nach Behandlung mit Antisense-TRPM-2-ODNs;
  • 8 zeigt die TRPM-2-Expression in PC-3-Prostata-Krebszellen nach verschiedenen Strahlungsdosen;
  • die 9A und 9B zeigen die vergleichende Strahlungsresistenz von humanen Prostata-Zelllinien, welche TRPM-2 überexprimieren (LNCaP/T) und normal (LNCaP/P) exprimieren.
  • 10 zeigt die erhöhte Empfindlichkeit von PC-3-Zellen für Strahlung nach Behandlung mit Antisense-TRPM-2-ODN; und
  • die 11A und 11B zeigen die erhöhte Empfindlichkeit von PC-3-Zellen für Strahlung nach Behandlung mit Antisense-TRPM-2-ODN.
  • Die 12A und 12B zeigen die erhöhte Empfindlichkeit von Shionogi-Tumorzellen für die chemotherapeutischen Mittel Paclitaxel und Mitoxantron, wenn sie mit Antisense-TRPM-2-ODN verabreicht werden.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Antisense-TRPM-2-ODNs und die Verwendung dieser Zusammensetzungen bei der Behandlung von Krebs. Die Erfindung kann bei der Behandlung von Krebstypen angewandt werden, bei denen die Krebszellen TRPM-2 exprimieren. Drei wichtige Klassen von Krebszellen, die TRPM-2 exprimieren, sind Prostatakrebszellen, humane Nierenzellenkrebs(RCC)-Zellen und einige Brustkrebszellen.
  • In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verstärkung des Kastrations-induzierten Tumorzelltods und die Verzögerung des Fortschreitens der Prostata-Tumorzellen zu Androgen-Unabhängigkeit; ein therapeutisches Verfahren für die Behandlung von Patienten, einschließlich Menschen, die an Prostatakrebs leiden; und therapeutische Mittel, die zur Verwendung in derartigen Verfahren wirksam sind, bereit. Das therapeutische Verfahren der Erfindung wird am häufigsten bei der Behandlung von Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs verwendet werden.
  • Die Verstärkung des Kastrations-induzierten Tumorzelltods und die Verzögerung des Fortschreitens von Androgen-empfindlichen Prostatakrebszellen zu Androgen-unabhängigen wird durch Hemmung der Expression von TRMP-2 durch die Zellen erzielt. Es wurden Experimente in drei Modellsystemen, dem in-vivo-Shionogi-Tumormodell, dem humanen TRPM-2-transfizierten LNCaP-Modell und dem humanen PC-3-Modell, durchgeführt, welche zusammengenommen demonstrieren, dass eine derartige Hemmung, die zur Verzögerung der Androgen-Unabhängigkeit führt, durch Behandlung von Androgen-empfindlichen Prostata-Tumorzellen mit Antisense-Oligodesoxynukleotiden (ODNs) erzielt werden kann.
  • In dem ersten Experiment wurde die Fähigkeit eines Maus-TRPM-2-Antisense-Moleküls (SEQ. ID. No. 1) bewertet, den Beginn der Androgen-Unabhängigkeit im Shionogi-Tumormodell zu verzögern. Das Shionogi-Tumormodell ist ein Xenotransplantat eines Androgen-abhängigen Maus-Mammakarzinoms, das subkutan in männlichen syngenen Wirten wächst. Shionogi-Tumorzellen sind hoch tumorigen und lokal invasiv. Es wurde gezeigt, dass die Zellen auf eine Weise auf Androgen-Entzug antworten, welche das beobachtete Verhalten von Prostata-Tumorzellen nachahmt, und sie sind als gültiges Modell für Prostatakrebs bei Menschen akzeptiert worden. (Bruchovsky et al., Cancer Res. 50: 2275-2282 (1990); Rennie et al., Cancer Res. 48: 6309-6312 (1988); Bruchovsky et al., Cell 13: 272-280 (1978); Gleave et al. in Genitourinary Oncology, S. 367-378, Lange et al., Hrsg., Lippencott (1997); Gleave et al., J. Urol. 157: 1727-1730 (1997); Bruchovsky et al., The Prostate 6: 13-21 (1996)). So führt ein Androgen-Entzug auf hoch reproduzierbare Weise zur Apoptose und Tumorregression. Beide sind Änderungen der Expression von TRPM-2 und Bcl-2 in humanem Prostatakrebs nach Kastration und beim Fortschreiten zu Androgen-Unabhängigkeit jenen ähnlich, die in Shionogi-Tumorzellen beobachtet werden. So ahmt das Shionogi-Tumormodell viele der Eigenschaften von Prostatakrebszellen nach. Weiter liefert das Shionogi-Tumormodell ein sehr nützliches Modell für die Bewertung der Fähigkeit von Verbindungen, den Beginn der Androgen-Unabhängigkeit zu verzögern. Trotz vollständiger Tumorregression nach Kastration treten nach einem Monat unweigerlich rasch wachsende Androgen-unabhängige Shionogi-Tumoren auf, was einen zuverlässigen Endpunkt liefert, Mittel zu bewerten, welche das Fortschreiten zu Androgen-Unabhängigkeit verzögern. Im Allgemeinen finden Ereignisse, die im Shionogi-Tumormodell innerhalb eines Monats stattfinden, bei menschlichen Patienten innerhalb von etwa zwei Jahren statt.
  • Die Fähigkeit der die Expression von TRPM-2 hemmenden Antisense-ODNs, den Beginn der Androgen-Unabhängigkeit zu verzögern, wurde durch Messen des Tumorvolumens nach Kastration im Shionogi-Tumormodell bewertet. Die Testtiere (n = 7) wurden intraperitoneal einmal täglich mit 12,5 mg/kg Wiederholungsdosen von Antisense-TRPM-2-ODNs (SEQ. ID. No. 1) in einer gepufferten Kochsalzlösung behandelt. Als Kontrolle wurden Tiere (n = 7) mit einem Fehlpaarungs-ODN (SEQ. ID. No. 2) behandelt. Wie in 1 gezeigt, zeigten sowohl die Test- als auch die Kontrollgruppe die erwartete Abnahme des Tumorvolumens unmittelbar nach Kastration, aber die Tumoren in den mit Antisense-TRPM-2-ODN behandelten Mäusen gingen schneller zurück als die der Kontrollen. Die Kontrollgruppe zeigte auch die erwartete Zunahme des Tumorvolumens, die mit der Entwicklung der Androgen-Unabhängigkeit verbunden ist. Im Gegensatz dazu fand 49 Tage nach der Kastration wenig Tumorneuwachstum in den Mäusen statt, die unter Verwendung des Antisense-TRPM-2-ODN behandelt wurden. Tumoren kehrten in der Tat in den mit Antisense-TRPM-2-ODN-behandelten Mäusen zurück, aber die mittlere Zeit bis zum Auftreten ist etwa zweimal so lang wie bei der Kontrollgruppe. So ist die Hemmung von TRPM-2 nicht nur für eine Erhöhung des Ausmaßes des Zelltods wirksam, der unmittelbar nach Androgen-Entzug stattfindet, sondern auch für Verzögerung des Beginns der Androgen-Unabhängigkeit. Die schnellere Abnahme des Tumorvolumens bei Mäusen, die mit Antisense-TRPM-2-ODNs behandelt wurden, beruhte auf dem früheren Beginn und der umfangreicheren Kastrations-induzierten Apoptose. Dies wurde durch Nachweis durch mit Poly(ADP-ribose)-Polymerase (PARP) gespaltenen Fragmenten in Shionogi-Tumorarten bestätigt (Miyake et al., Cancer Res. 60: 170-176 (2000)).
  • Um zu bewerten, welche humanen Antisense-ODNs, die komplementär zu TRPM-2-mRNA-Sequenzen sind, für diesen Zweck am wirksamsten sind, wurde eine Reihe von zehn Antisense-Phosphorothioat-ODNs hergestellt, welche verschiedene mRNA-Regionen überspannen, wie in 2 gezeigt. Die Sequenzen der zehn ODNs sind in dem beigefügten Sequenzprotokoll als SEQ. ID. Nos. 3–12 angegeben. Die zehn humanen Antisense-ODNs wurden unter Verwendung von mit TRPM-2 transfizierten LNCaP-Zellen und humanen Prostatakrebs-PC-3-Zellen bezüglich ihrer Fähigkeit bewertet, die Expression von TRPM-2-mRNA zu hemmen. Wie in 3 gezeigt, erzeugten die getesteten Antisense-ODNs variable Maße der Hemmung der TRPM-2-mRNA-Expression, wobei die besten Resultate mit SEQ. ID. Nos. 4, 5 und 12 erzielt wurden. Die Sequenz ID. No. 5 entspricht der Sequenz, die von Sensibar et al. verwendet wurde und eine Hemmung der TRPM-2-Expression in LNCaP-Zellen erzeugte und komplementär zu den ersten 21 Basen der TRPM-2-mRNA ist. Die wirksamste Hinunterregulierung fand mit SEQ. ID. No. 4 statt. Allen wirksamen Sequenzen gemeinsam ist eine Überlappung mit entweder der Initiations- oder Terminationsstelle der TRPM-2-mRNA. Demgemäß kann in einem allgemeinen Sinn das Verfahren der Erfindung mit Antisense-Oligonukleotiden durchgeführt werden, die zu einer Region der TRPM-2-mRNA komplementär sind, welche entweder die Translationsinitiationsstelle oder die -terminationsstelle überspannen.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die therapeutische Behandlung von Patienten, einschließlich menschlicher Patienten, die an Prostatakrebs leiden, durch Einleiten eines Androgen-Entzugs, um den apoptotischen Zelltod von Prostata-Tumorzellen in dem Patienten zu induzieren, und Verabreichen eines Antisense-Oligonukleotids an den Patienten zur Hemmung der Expression von TRPM-2 durch die Tumorzellen erzielt, wodurch das Fortschreiten von Prostata-Tumorzellen zu einem Androgen-unabhängigen Zustand in einem Patienten verzögert wird.
  • Die Einleitung des Androgen-Entzugs kann durch chirurgische (Entfernung beider Testikel) oder medizinische (Arzneistoff-induzierte Suppression von Testosteron) Kastration bewerkstelligt werden, welche derzeit für die Behandlung von Prostatakrebs indiziert ist. Die medizinische Kastration kann durch verschiedene Behandlungsschemata erzielt werden, einschließlich LHRH-Mitteln oder Antiandrogenen. (Gleave et al., CMAJ 160: 225-232 (1999)). Eine intermittierende Therapie, in der ein reversibler Androgen-Entzug bewirkt wird, wird von Gleave et al. Eur. Urol. 34 (Supp. 3): 37-41 (1998) beschrieben.
  • Die Hemmung der TRPM-2-Expression kann vorübergehend sein und sollte idealerweise gleichzeitig mit dem Androgen-Entzug stattfinden. Bei Menschen bedeutet dies, dass die Hemmung der Expression innerhalb von einem oder zwei Tagen des Androgen-Entzugs wirksam sein und sich über etwa 3 bis 6 Monate erstrecken sollte. Dies zu erzielen kann mehrere Dosen erfordern. Man wird jedoch erkennen, dass die Zeitspanne länger sein kann, beginnend vor der Kastration und sich über eine beträchtliche Zeit danach erstreckend, ohne vom Bereich der Erfindung abzuweichen.
  • Es wurde auch festgestellt, dass Antisense-TRPM-2-ODNs die Chemoempfindlichkeit bei humanem Nierenzellenkrebs (RCC) verstärken. RCC ist eine chemoresistente Krankheit, für die es kein aktives chemotherapeutisches Mittel mit objektiven Antwortraten von mehr als 10% gibt. Es wurde eine erhöhte TRPM-2-Expression in renalen proximalen knäueligen Zellen, die eine Apoptose eingehen, nach verschiedenen Stimuli, einschließlich Harnleiterobstruktion und Aminoglycosiden, beobachtet. Jedoch ist die funktionelle Bedeutung der TRPM-2-Expression bei RCC nicht gut dokumentiert. Testergebnisse zeigen jedoch, dass Antisense-TRPM-2-CDN die Chemoempfindlichkeit in humanen RCC-CaKi-2-Zellen erhöht (siehe Beispiel 6, unten).
  • Es wurde auch gefunden, dass Antisense-TRPM-2-ODNs die Empfindlichkeit gegenüber Strahlung erhöhen (siehe Beispiel 7 und 8).
  • Die Hemmung der Expression von TRPM-2 kann durch die Verabreichung von Antisense-ODNs, insbesondere Antisense-ODNs, die komplementär zu einem Bereich der TRPM-2-mRNA sind, welcher entweder die Translationsinitiationsstelle oder die -terminationsstelle überspannt, bewerkstelligt werden. Für die Behandlung von Prostatakrebs bei Menschen sind spezielle nützliche Sequenzen jene, die in SEQ. ID. Nos. 4, 5 und 12 gezeigt sind.
  • Die verwendeten ODNs können modifiziert werden, um die Stabilität des ODN in vivo zu erhöhen. Beispielsweise können die ODNs als Phosphorothioat-Derivate (Ersatz eines nicht-verbrückenden Phosphorylsauerstoffatoms durch ein Schwefelatom) verwendet werden, die eine erhöhte Beständigkeit gegen Nuklease-Verdau aufweisen. MOE-Modifikation (ISIS-Rückgrat) ist ebenfalls wirksam.
  • Die Verabreichung von Antisense-ODNs kann unter Verwendung der verschiedenen auf dem Gebiet bekannten Mechanismen durchgeführt werden, einschließlich einer nackten Verabreichung und einer Verabreichung in pharmazeutisch annehmbaren flüssigen Trägern. Flüssige Träger für eine Antisense-Zufuhr sind zum Beispiel in den U.S. Patenten Nr. 5,855,911 und 5,417,978 offenbart, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden. Im Allgemeinen wird das Antisense auf intravenösem, intraperitonealem, subkutanem oder oralem Weg oder durch direkte lokale Tumorinjektion verabreicht. Aus den Experimenten, die unter Verwendung des Shionogi-Mausmodells durchgeführt wurden, erscheint es, dass das Antisense-CDN bevorzugt in Tumorzellen aktiv ist. In der Tat war die TRPM-2-Expression in Nicht-Tumorgewebe im Wesentlichen unbeeinflusst und es wurden keine Nebenwirkungen der Antisense-ODN-Verabreichung beobachtet.
  • Die Menge an verabreichtem Antisense-ODN ist wirksam, um die Expression von TRPM-2 in Prostatazellen zu hemmen. Man erkennt, dass diese Menge sowohl mit der Wirksamkeit des verwendeten Antisense-ODN als auch mit der Natur jeglichen verwendeten Trägers variiert. Die Bestimmung von geeigneten Mengen bei jeder gegebenen Zusammensetzung durch Standardreihentests, die so ausgelegt sind, dass sie geeignete therapeutische Dosen abschätzen, liegt im Vermögen des Fachmanns.
  • Das Verfahren zur Behandlung von Prostatakrebs gemäß der Erfindung kann weiter die Verabreichung von chemotherapeutischen Mitteln und/oder zusätzlichen Antisense-ODNs direkt an verschiedene Ziele einschließen. Zum Beispiel wurde unter Verwendung des Shionogi-Tumormodells gefunden, dass Antisense-TRPM-2-ODN die Empfindlichkeit gegen herkömmliche Chemotherapiemittel, wie Taxane (Paclitaxel oder Docetaxel) und Mitoxantron erhöht (12A und 12B). Wie in den 12A und 12B gezeigt, hatte die Behandlung mit Antisense-TRPM-2-ODN in Anwesenheit von Taxol oder Mitoxantron ein verringertes Tumorvolumen im Vergleich zur Kombination von Taxol oder Mitoxantron mit der Fehlpaarungs(MM [mismatch])-ODN zur Folge. Andere Mittel, die wahrscheinlich eine synergistische Aktivität zeigen, umfassen andere zytotoxische Mittel (z. B. Cyclophosphamid, Topoisomerase-Inhibitoren), Angiogenese-Inhibitoren, Differenzierungsmittel und Signaltransduktions-Inhibitoren). Ähnlich funktionierten Kombinationen von TRPM-2-Antisense mit anderen Antisense-Spezies, wie Antisense-Bcl-2-ODN, besser bei der Abtötung von Shionogi-Zellen in vitro als jedes ODN allein. So kann TRPM-2 zusammen mit anderen Antisense-Molekülen, wie Antisense-Bcl-2, Bcl-xl und c-myc-ODN, zusammenarbeiten, um für eine größere Wirksamkeit zu sorgen.
  • Die Erfindung wird nun weiter mit Bezug auf die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele beschrieben.
  • BEISPIEL 1
  • Shionogi-Tumormodell-Experimente wurden unter Verwendung von Zellen aus der Toronto-Unterlinie des transplantierbaren SC-115 AD-Maus-Mammakarzinoms durchgeführt. Für in-vivo-Studien wurden erwachsenen männlichen Mäusen vom DD/S-Stamm etwa 5 × 106 Zellen des Shionogi-Karzinoms subkutan injiziert. Als die Shionogi-Tumoren einen Durchmesser von 1 bis 2 cm aufwiesen, gewöhnlich 2 bis 3 Wochen nach Injektion, wurde durch einen Unterleibseinschnitt unter Methoxyfluran-Anästhesie eine Kastration durchgeführt. Einzelheiten der Haltung von Mäusen, des Tumorvorrats und der Operationsverfahren wurden früher beschrieben. Bruchovsky et al., Cancer Res. 50: 2275-2282 (1990); Rennie et al., Cancer Res. 48: 6309-6312 (1988); Bruchovsky et al., Cell 13: 272-280 (1978); Gleave et al. in Genitourinary Oncology, S. 367-378, Lange et al., Hrsg., Lippencott (1997); Gleave et al., J. Urol. 157: 1727-1730 (1997); Bruchovsky et al., The Prostate 6: 13-21 (1996)).
  • Mäuse wurden statistisch für die Behandlung mit murinem Phosphorothioat-Antisense-TRPM-2-ODN (SEQ. ID. No. 1) oder einer Fehlpaarungskontrolle (SEQ. ID. No. 2) ausgewählt, welche sich in der Sequenz in zwei Basen vom Antisense-TRPM-2-ODN unterscheidet. Jede experimentelle Gruppe bestand aus 7 Mäusen. Einen Tag nach der Kastration wurden 12,5 mg/kg Antisense-TRPM-2- oder Fehlpaaungskontroll-ODN, gelöst in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, jeder Maus einmal täglich über 40 Tage intraperitoneal injiziert. Das Tumorvolumen wurden zweimal wöchentlich gemessen und durch die Formel Länge × Breite × Tiefe × 0,5236 berechnet. Gleave et al., Cancer Res. 52: 1598-1605 (1992). Die Datenpunkte wurden als durchschnittliche Tumorvolumina ± Standardabweichung mitgeteilt.
  • Die Ergebnisse dieser Studie sind in 1 gezeigt. Wie gezeigt, nahmen Shionogi-Tumoren schneller ab und fand eine vollständige Regression früher in Mäusen statt, die mit Antisense-TRPM-2-ODN behandelt wurden. Weiter verzögerte die Behandlung mit Antisense-TRPM-2-ODN wesentlich den Beginn von Androgen-Unabhängigkeit, was durch die Zunahme des Tumorvolumens nach 21 Tagen in den Kontrolltieren widergespiegelt wird. Es wurden keine Nebenwirkungen beobachtet, die mit dem Antisense-TRPM-2 oder der Fehlpaarungskontrolle verbunden waren.
  • Um die Wirkungen der in-vivo-ODN-Behandlung auf die Konzentrationen an TRPM-2-mRNA zu überprüfen, wurde eine Northern-Blot-Analyse an Shionogi-Tumorgewebe aus Mäusen durchgeführt. Die Mäuse wurden täglich mit 12,5 mg/kg Antisense-TRPM-2-ODN (n = 6) oder der Fehlpaarungskontrolle (n = 6) durch intraperitoneale Injektion beginnend am Tag nach der Kastration behandelt. Am vierten Tag nach der Kastration wurden die Tumorgewebe geerntet und durch Northern-Blot bezüglich TRPM-2-mRNA analysiert. Antisense-TRPM-2-ODN hatte eine 75%-ige Verringerung von TRPM-2-mRNA-Konzentrationen in Shionogi-Tumoren im Vergleich zu mit Fehlpaaungskontroll-ODN behandelten Tumoren zum Ergebnis (3).
  • Vergleichbare Analysen wurden bei normalen Mausorganen durchgeführt. Proben von Milz, Niere, Prostata und Gehirn wurden von Shionogi-Tumor-Mäusen geerntet, die mit Antisense-TRPM-2-ODN und der Fehlpaarungskontrolle unter dem gleichen Behandlungsschema behandelt worden waren, und durch Northern-Blot analysiert. Obwohl die TRPM-2-mRNA-Konzentrationen in Tumorgeweben signifikant erniedrigt waren, hatte Antisense-TRPM-2-ODN keine Auswirkung auf TRPM-2-mRNA-Konzentrationen in den normalen Organen.
  • BEISPIEL 2
  • Die Sequenzselektivität des Antisense-TRPM-2-ODN (SEQ. ID. No. 1) wurde durch Vergleich der Expressionsniveaus von TRPM-2-mRNA in Shionogi-Tumorzellen, die in vitro gehalten wurden, nach Behandlung mit den variierenden Konzentrationen an Antisense-TRPM-2-ODN oder einer Fehlpaarungskontrolle (SEQ. ID. No. 2) bestätigt. Um die Aufnahme der ODNs in die Zellen zu erleichtern, wurden die ODNs in einem kationischen Lipid-Träger (LipofectinTM (Life Technologies, Inc.)) formuliert. Die Zeilen wurden zweimal über eine Zeitspanne von zwei Tagen unter Verwendung des folgenden Protokolls behandelt. Die Zellen wurden 20 Minuten mit 4 μg/ml Lipofectin in serumfreiem OPTI-MEMTM (Life Technologies, Inc.) vorinkubiert und dann vier Stunden lang mit dem Medium inkubiert, das die gewählte Konzentration an ODN und Lipofectin enthielt. Das Medium wurde dann durch Standard-Kulturmedium ersetzt.
  • Die Menge an TRPM-2-mRNA in die Zellen wurde unter Verwendung von Northern-Blot-Analyse ausgewertet. Wie in 4 gezeigt, verringerte die Behandlung von Shionogi-Zellen mit Antisense-TRPM-2-ODN die TRPM-2-mRNA-Konzentrationen auf Dosis-abhängige Weise. Im Gegensatz dazu wurden die TRPM-2-mRNA-Konzentrationen durch das Fehlpaarungs-ODN (SEQ. ID. No. 2) bei allen verwendeten Konzentrationen nicht beeinflusst. So ist die Wirkung von Antisense-TRPM-2-ODN offensichtlich sequenzspezifisch.
  • BEISPIEL 3
  • Shionogi-Zellen, die in vitro gehalten wurden, wurden mit variierenden Mengen an Taxol allein oder in Kombination mit 500 nM Antisense-TRPM-2-ODN (SEQ. ID. No. 1) oder der Fehlpaarungskontrolle (SEQ. ID. No. 2) behandelt. Die Zellen wurden zweimal behandelt, wie in Beispiel 2 beschrieben, und der Prozentsatz an verbleibenden lebensfähigen Zellen wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in 5 zusammengefasst. Wie gezeigt, verschob der Einschluss von Antisense-TRPM-2-ODN die Dosis-Antwort-Kurve auf die linke Seite, wobei die IC50 um einen Faktor von 5 bis 10 verringert war. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung von Mitoxantron anstelle von Paclitaxel erzielt (12A und 12B).
  • BEISPIEL 4
  • Das Experiment von Beispiel 3 wurde unter Zugabe von Antisense-Bcl-2-ODN (SEQ. ID. No. 13) oder einem Fehlpaarungs-Bcl-2-ODN (SEQ. ID. No. 14) in verschiedenen Kombinationen mit Antisense/Fehlpaarungs-TRPM-2-ODN und Taxol wiederholt. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Die Kombination von Antisense-TRPM-2-ODN mit Antisense-Bcl-2-ODN und Taxol verstärkte weiter die zytotoxischen Wirkungen von Taxol. So scheint das Targeting von zusätzlichen antiapoptotischen Mitteln für therapeutische Vorteile zu sorgen.
  • BEISPIEL 5
  • Um geeignete Antisense-TRPM-2-ODN-Sequenzen zur Verwendung bei der humanen Therapie zu identifizieren, wurden Antisense-ODN-Sequenzen synthetisiert, die gegen zehn verschiedene Stellen des humanen TRPM-2-Gens gerichtet waren, (2, SEQ. ID. Nos. 3–12) und unter Verwendung desselben Behandlungsprotokolls, wie in Beispiel 2 beschrieben, bezüglich ihrer Fähigkeit getestet, die TRPM-2-Genexpression in humanen Prostatakrebs-PC-3- und transfizierten LNCaP-Zellen zu verringern, welche TRPM-2 überexprimieren. Die Ergebnisse sind in 3 zusammengefasst. Wie gezeigt, sind die Sequenzen 4, 5 und 12 für die Verringerung von TRPM-2-Expression wirksam. Diese drei Sequenzen überlappen mit der Translationsinitiations- oder -terminationsstelle oder grenzen unmittelbar daran an.
  • BEISPIEL 6
  • Immunhistochemische Färbung wurde verwendet, um die Clusterin-Expression in 17 RCC und normalen Nierengeweben, die von Proben radikaler Nephrektomie erhalten wurden, zu charakterisieren. Die TRPM-2-Expression in humanen Nierenkrebs-Zelllinien ACHN, CaKi-1 und CaKi-2 wurde durch Northern- und Western-Blot-Analyse bewertet. Die Northern-Blot-Analyse wurde verwendet, um Änderungen der TRPM-2-mRNA-Expression nach einer Antisense-TRPM-2-ODN-Behandlung abzuschätzen. Die Wirkungen einer kombinierten Antisense-TRPM-2-ODN- und Taxol-Behandlung auf das CaKi-2-Zellenwachstum wurde unter Verwendung eines MTT-Assays überprüft.
  • Immunfärbung zeigte eine erhöhte Clusterin-Expression in 11 RCC-Proben im Vergleich zu angrenzendem normalem Nierengewebe. In den verbleibenden 6 Fällen wurde kein Unterschied zwischen malignem und normalem Gewebe gesehen. Sowohl die TRPM-2-mRNA- als auch die Protein-Expression waren in allen drei humanen RCC-Zelllinien nachweisbar, mit den höchsten Niveaus bei CaKi-2. Antisense-TRPM-2-ODN (SEQ. ID. No. 1), aber nicht Fehlpaaungskontroll-ODN (SEQ. ID. No. 2), hemmte die TRPM-2-Expression in CaKi-2-Zellen auf Dosis-abhängige und sequenzspezifische Weise (7A). Weiter erhöhte Antisense-TRPM-2-ODN wesentlich die Taxol-Chemoempfindlichkeit, wobei die IC50 von Taxol um 1 log (500 nM gegenüber 50 nM) im Vergleich zu Fehlpaaungskontroll-ODN verringert wurde (7B). Diese Daten demonstrieren, dass TRPM-2 und dessen Protein, Clusterin, in RCC mit höheren Niveaus exprimiert werden als in normalem Nierengewebe und dass Antisense-TRPM-2-ODN bei der Verstärkung der zytotoxischen Wirkungen der herkömmlichen Chemotherapie bei fortgeschrittenem RCC nützlich sein kann.
  • BEISPIEL 7
  • Antisense-TRPM-2-ODNs erhöhen die Strahlungsempfindlichkeit von Krebszellen, die TRPM-2 exprimieren. Unter Verwendung von Northern-Analyse fanden wir, dass eine Strahlentherapie Dosis- und Zeit-abhängige Zunahmen der TRPM-2-Genexpression in humanen Prostatakrebs-PC-3-Zellen zur Folge hat (8). Die Überexpression von TRPM-2 hat eine erhöhte Beständigkeit gegen Strahlungs-induzierten Zelltod zur Folge. Humane Prostata-LNCaP-Zellen, die TRPM-2 überexprimieren (LNCaP/T1), sind gegenüber einer Strahlentherapie resistenter (9A und B). Die Behandlung von humanen Prostatakrebs-PC-3-Zellen mit 100 und 500 nM Antisense-TRPM-2-ODNs (SEQ. ID. No. 1) verringert signifikant das Überleben der Zellen nach einer einzigen Behandlung mit einer 4 Gy-Strahlentherapie im Vergleich zu Fehlpaarungs-ODN (SEQ. ID. No. 2)-Behandlung (10). Die 11A und B zeigen Dosis-abhängige Strahlungssensibilisierung von humanen Prostatakrebs-PC-3-Zellen nach Behandlung mit 10, 50 und 100 nM Antisense-TRPM-2-Oligo in vitro.
  • BEISPIEL 8
  • Um zu bestimmten, ob eine Behandlung mit humanem Antisense-TRPM-2-ODN die Chemoempfindlichkeit in der humanen PC-3-Prostatakrebs-Zelllinie erhöht, wurden Mäuse, die PC-3-Tumoren trugen, mit humanem Antisense-TRPM-2-ODN plus mizellarem Paclitaxel oder Mitoxantron und Fehlpaaungskontroll-ODN plus mizellarem Paclitaxel oder Mitoxantron behandelt (12A und 12B). ODN wurde 28 Tage verabreicht und entweder 0,5 mg mizellares Taxol oder 0,3 mg Mitoxantron wurden bei zwei Anlässen verabreicht: von Tag 10 bis 14 und Tag 24 bis 28. Eine signifikante Verringerung der Tumorgröße wurde bei mit Antisense-ODN behandelten Tieren im Vergleich zu jenen beobachtet, die mit Fehlpaaungskontroll-ODN behandelt wurden. Diese Wirkung war sogar nach der zweiten Verabreichung des mizellaren Paclitaxels oder Mitoxantrons noch ausgeprägter.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00190001
  • Figure 00200001
  • Figure 00210001
  • Figure 00220001

Claims (15)

  1. Eine Zusammensetzung mit einem Antisense-Oligonukleotid, das die Exprimierung von TRPM-2 in Tumorzellen inhibiert, für die Verzögerung der Entwicklung der Zellen eines Prostata-Tumors in einen Androgen-unabhängigen Zustand.
  2. Eine Zusammensetzung für die Verstärkung der Chemo- oder Strahlungs-Empfindlichkeit von Krebszellen in einem Individuum, das an einem Krebs leidet, der TRPM-2 in von normalem Gewebe desselben Typs verschiedenen Mengen exprimiert, mit einem Antisense-Oligonukleotid, das die Exprimierung von TRPM-2 in den Krebszellen inhibiert.
  3. Die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Antisense-Oligonukleotid komplementär ist zu einer Region von TRPM-2 mRNA, die die Translations-Initiationsstelle oder die Translations-Terminationsstelle beinhaltet.
  4. Die Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das Antisense-Oligonukleotid die Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 4 hat.
  5. Die Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das Antisense-Oligonukleotid die Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 hat.
  6. Die Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das Antisense-Oligonukleotid die Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 12 hat.
  7. Die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die zusätzlich ein zweites Antisense-Oligonukleotid aufweist, das die Exprimierung eines anti-apoptotischen Proteins, das nicht TRPM-2 ist, inhibiert.
  8. Die Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das zweite Antisense-Oligonukleotid ein Antisense-Bcl-2-Oligodeoxynukleotid ist.
  9. Ein Oligonukleotid mit der Sequenz gemäß SEQ. ID Nr. 4.
  10. Ein Oligonukleotid mit der Sequenz gemäß SEQ. ID Nr. 12.
  11. Eine Zusammensetzung mit einem Antisense-Oligonukleotid, das komplementär, ist zur TRPM-2 mRNA und das eine der Sequenzen gemäß SEQ. ID Nr. 4, 5 oder 12 aufweist, und mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger zur Verabreichung des Oligonukleotids an einen Säuger für die Reduktion der Exprimierung von TRPM-2, zur Verwendung als Arzneimittel.
  12. Die Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei der pharmazeutisch akzeptable Träger ein lipider Träger ist.
  13. Die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 oder 12, die ein zusätzliches Antisense-Oligonukleotid aufweist, das sich spezifisch an eine Sequenz bindet, die anders ist als die Sequenz von TRPM-2 mRNA.
  14. Die Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei sich das zusätzliche Antisense-Oligonukleotid spezifisch an eine Sequenz bindet, die ausgewählt ist aus der Gruppe von Bcl-2, Bcl-1x und c-myc.
  15. Die Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei das zusätzliche Antisense-Oligonukleotid die Sequenz gemäß SEQ. ID Nr. 13 hat.
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