ES2300257T3 - Terapia antisentido contra trpm-2. - Google Patents

Terapia antisentido contra trpm-2. Download PDF

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Abstract

Una composición que contiene un oligonucleótido antisentido que inhibe la expresión de TRPM-2 por células tumorales para retrasar la progresión de células tumorales prostáticas hacia un estado de independencia androgénica.

Description

Terapia antisentido contra TRPM-2.
Esta solicitud reclama prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. Nº 60/121.726, registrada el 26 de Febrero de 1999.
Antecedentes de la invención
Esta invención se refiere a tratamientos antisentido para el cáncer utilizando un oligonucleótido antisentido que se une al mensaje 2 prostático reprimido por testosterona (TRPM-2).
El cáncer de próstata es el cáncer más habitual que afecta a los hombres y la segunda causa principal de las muertes de hombres por cáncer en el mundo occidental. Como el cáncer de próstata es un tumor sensible a andrógenos, se utiliza en algunos regímenes terapéuticos la privación de andrógenos, por ejemplo mediante castración, en pacientes con cáncer de próstata avanzado. La privación de andrógenos da lugar a una extensa apoptosis en el tumor de próstata y por tanto a una regresión de la enfermedad. Sin embargo, la apoptosis inducida por la castración no es completa y finalmente tiene lugar una progresión de las células tumorales supervivientes hacia una independencia androgénica. Esta progresión es el obstáculo principal para mejorar la supervivencia y la calidad de vida, y por tanto se han hecho esfuerzos para convertir en dianas las células independientes de andrógenos. Estos esfuerzos se han centrado en terapias no hormonales dirigidas contra las células tumorales independientes de andrógenos (Yagoda y col., Cancer 71 (Suplemento 3): 1098-1109 (1993); Oh y col., J. Urol. 60: 1220-1229 (1998)), sin embargo, hasta ahora ningún agente no hormonal ha mejorado la supervivencia. Están por tanto indicados procedimientos alternativos.
Se ha observado que numerosas proteínas son expresadas en cantidades incrementadas por las células tumorales prostáticas después de la privación de andrógenos. Se asume que al menos algunas de estas proteínas están asociadas con la muerte celular apoptótica observada tras la privación de andrógenos. (Raffo y col., Cancer Res.: 4448-4445 (1995); Krajewska y col., Am. J. Pathol. 148: 1567-1576 (1996); McDonnnell y col., Cancer Res. 52: 6940-6944 (1992)). Sin embargo, las funciones de muchas de las proteínas no se conocen claramente. La TRPM-2 (conocida también como glicoproteína-2 sulfatada (SGP-2) o clusterina) está dentro de esta última categoría.
La TRPM-2 es una proteína ubicua, con un rango diverso de actividades propuestas. En las células epiteliales de la próstata, la expresión de TRPM-2 aumenta inmediatamente después de la castración, alcanzando niveles máximos en células de próstata de rata de 3 a 4 días después de la castración, coincidiendo con la aparición de una muerte celular masiva. Estos resultados han llevado a algunos investigadores a la conclusión de que la TRPM-2 es un marcador de muerte celular y un promotor de la apoptosis. Por otra parte, la observación de que las células de Sertoli y algunas células epiteliales expresan niveles elevados de TRPM-2 sin niveles incrementados de muerte celular, cuestiona si esta conclusión es correcta.
Sensibar y col., Cancer Research 55: 2431-2437 (1995) describieron experimentos in vitro llevados a cabo para elucidar más claramente la función de la TRPM-2 en la muerte de células prostáticas. Utilizaron células LNCaP transfectadas con un gen que codificaba TRPM-2 y observaron si la expresión de esta proteína alteraba los efectos del factor de necrosis tumoral \alpha (TNF-\alpha), al cual son muy sensibles las células LNCaP, teniendo lugar normalmente la muerte celular en 12 horas aproximadamente. Se demostró que el tratamiento con TNF-\alpha de las células LNCaP transfectadas tenía como resultado un incremento transitorio de los niveles de TRPM-2 durante un periodo de unas pocas horas, pero estos niveles se habían disipado en el momento en el que se observó la fragmentación del ADN que precede a la muerte celular. La utilización una molécula antisentido correspondiente a las bases 1-21 de la secuencia de TRPM-2, pero no otros oligonucleótidos antisentido de TRPM-2, tuvo como resultado una reducción sustancial de la expresión de TRPM-2 y un incremento de la muerte celular apoptótica en las células LNCaP expuestas a TNF-\alpha. Esto condujo a Sensibar y col. a la hipótesis de que la sobreexpresión de TRPM-2 podría proteger a las células del efecto citotóxico del TNF, y de que la disminución de TRPM-2 es responsable del inicio de la muerte celular, aunque el mecanismo de acción permanece incierto.
Aunque el artículo de Sensibar y col. proporciona información sobre la posible función de la TRPM-2, describe no obstante resultados de únicamente un sistema modelo en el cual la expresión de TRPM-2 está basada en un gen transfectado. Además, los niveles de expresión de TRPM-2 son muy bajos o están ausentes en células LNCaP cultivadas en otros laboratorios. La situación que resulta in vivo cuando células tumorales prostáticas son sometidas a una privación de andrógenos es mucho más compleja, teniendo como resultado el cambio de los niveles de expresión de numerosas proteínas. Por tanto, no es posible predecir a partir de los datos de Sensibar y col. si la TRPM-2 realizaría la misma función cuando estuviera presente en combinación con otras proteínas, o si cambios de los niveles de TRPM-2 después de la privación de andrógenos in vivo podrían proporcionar algún beneficio terapéutico. En efecto, el hecho de que la TRPM-2 sea expresada en cantidades sustanciales en las células tumorales prostáticas en varios estadios después de la privación de andrógenos, incluyendo estadios en los que está teniendo lugar una muerte celular apoptótica significativa, sugiere que la función de la TRPM-2 in vivo puede ser más complicada. Por tanto, aunque la técnica proporciona datos concernientes a ciertos aspectos de la muerte celular apoptótica en células tumorales prostáticas, no ofrece ni la descripción ni la sugerencia de una metodología para proporcionar un retraso en la aparición de la independencia androgénica.
Es un objeto de la presente invención proporcionar tal método.
Es un objeto más de la presente invención proporcionar moléculas antisentido terapéuticas para retrasar la aparición de la independencia androgénica en células tumorales prostáticas.
Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para incrementar la quimiosensibilidad o la sensibilidad a la radiación de células cancerosas procedentes de un cáncer que exprese TRPM-2.
Es un objeto más de la presente invención proporcionar moléculas antisentido terapéuticas para inhibir la expresión de TRPM-2.
Resumen de la invención
De acuerdo con la presente invención, se ha determinado ahora que la terapia antisentido que reduce la expresión de TRPM-2 proporciona beneficios terapéuticos en el tratamiento del cáncer. En particular, tal terapia antisentido puede ser aplicada en el tratamiento del cáncer de próstata y en cáncer de células renales.
La adición de un oligodesoxinucleótido (ODN) de TRPM-2 antisentido a células tumorales prostáticas in vivo es eficaz para retrasar el comienzo de la independencia androgénica. Por tanto, en un aspecto, la invención proporciona un método para tratar el cáncer de próstata en un individuo que padezca cáncer de próstata, que comprende las etapas de iniciar la privación androgénica para inducir la muerte celular apoptótica de las células tumorales prostáticas del individuo, y administrar al individuo un oligonucleótido antisentido eficaz para inhibir la expresión de TRPM-2 por las células tumorales, retrasando de este modo la progresión de las células tumorales prostáticas hacia un estado de independencia androgénica en un individuo. Además, la utilización combinada de TRPM-2 antisentido más una quimioterapia citotóxica (por ejemplo con taxanos) aumenta de manera sinérgica la quimiosensibilidad en cáncer de próstata refractario a hormonas. En otro aspecto de la invención, se administra un segundo ODN antisentido que inhibe la expresión de una proteína anti-apoptótica distinta de TRPM-2 junto con el ODN de TRPM-2 antisentido.
Se ha encontrado también que TRPM-2 antisentido tiene efectos beneficiosos en otros tipos de cáncer. Específicamente, el ODN de TRPM-2 antisentido incrementa la quimiosensibilidad en cáncer de células renales humano, una enfermedad normalmente quimiorresistente sin que haya ningún agente quimioterapéutico activo con una tasa de respuesta objetiva superior al 10%. La sensibilidad a la radiación es también incrementada cuando células que expresan TRPM-2 son tratadas con el ODN de TRPM-2 antisentido. Por tanto, los ODNs de TRPM-2 antisentido pueden ser utilizados para tratar una variedad de tipos de cáncer en los que se ha observado la expresión de TRPM-2.
Breve descripción de las figuras
La Fig. 1 muestra el retraso del comienzo de la independencia androgénica que se consigue mediante la utilización de un ODN de TRPM-2 antisentido.
La Fig. 2 muestras las posiciones de 10 oligonucleótidos antisentido evaluados para determinar su capacidad para inhibir la expresión de TRPM-2 y retrasar el comienzo de la independencia androgénica.
La Fig. 3 muestra los niveles de expresión de ARNm de TRPM-2 en presencia de varios ODNs antisentido.
La Fig. 4 muestra los niveles de ARNm de TRPM-2 en células de Shionogi tratadas in vitro con cantidades variables de ODN de TRPM-2 antisentido o con un control desapareado ("mismatch").
La Fig. 5 muestra la curva dosis-respuesta para combinaciones de taxol y ODN de TRPM-2 antisentido.
La Fig. 6 muestra la curva dosis-respuesta para combinaciones de taxol, ODN de TRPM-2 antisentido y ODN de Bcl-2 antisentido.
La Fig. 7A muestra la disminución de los niveles de ARNm de TRPM-2 en cáncer de células renales humano después del tratamiento con ODNs de TRPM-2 antisentido.
La Fig. 7B muestra el incremento de la quimiosensibilidad del cáncer de células renales humano al taxol después del tratamiento con ODNs de TRPM-2 antisentido.
La Fig. 8 muestra la expresión de TRPM-2 en células de cáncer de próstata PC-3 después de varias dosis de radiación.
Las Figs. 9A y 9B muestran la resistencia a la radiación comparativa de líneas celulares prostáticas humanas que sobreexpresan (LNCaP/T) y que expresan normalmente (LNCaP/P) TRPM-2.
La Fig. 10 muestra la susceptibilidad incrementada de células PC-3 a la radiación después del tratamiento con ODN de TRPM-2 antisentido.
Las Figs. 11A y 11B muestran la sensibilidad incrementada de células PC-3 a la radiación después del tratamiento con ODN de TRPM-2 antisentido.
Las Figs. 12A y 12B muestran la sensibilidad incrementada de células tumorales de Shionogi a los agentes quimioterapéuticos paclitaxel y mitoxantrona cuando son administrados con ODN de TRPM-2 antisentido.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a ODNs de TRPM-2 antisentido y a la utilización de estas composiciones en el tratamiento del cáncer. La invención puede ser aplicada en el tratamiento de cánceres en los que las células cancerosas expresan TRPM-2. Tres clases significativas de células cancerosas que expresan TRPM-2 son las células de cáncer prostático, las células de cáncer de células renales (RCC) humano y células de algunos cánceres de mama.
En una realización, la presente invención proporciona un método para incrementar la muerte de células tumorales inducida por la castración y parar retrasar la progresión de las células tumorales prostáticas hacia una independencia androgénica; un método terapéutico para el tratamiento de individuos, incluyendo humanos, que padezcan cáncer de próstata; y agentes terapéuticos eficaces para ser utilizados en tales métodos. El método terapéutico de la invención será utilizado más comúnmente en el tratamiento de individuos con cáncer de próstata avanzado.
El incremento de la muerte de células tumorales inducida por castración y el retraso de la progresión de las células de cáncer de próstata sensibles a andrógenos hacia una independencia androgénica se consiguen mediante la inhibición de la expresión de TRPM-2 por las células. Se realizaron experimentos en tres sistemas modelo, el modelo tumoral de Shionogi in vivo, el modelo de LNCaP transfectadas con TRPM-2 humano y el modelo de PC-3 humanas, que tomados en conjunto demostraron que tal inhibición que daba lugar a un retraso de la independencia androgénica podía ser conseguida mediante el tratamiento de las células tumorales prostáticas sensibles a andrógenos con oligodesoxinucleótidos (ODNs) antisentido.
En el primer experimento, se evaluó la capacidad de una molécula antisentido de TRPM-2 de ratón (Sec ID. Nº 1) para retrasar el comienzo de la independencia androgénica en el modelo tumoral de Shionogi. El modelo tumoral de Shionogi es un xenoinjerto de un carcinoma mamario de ratón dependiente de andrógenos que crece subcutáneamente en huéspedes singénicos macho. Las células tumorales de Shionogi son muy tumorigénicas y localmente invasivas. Se ha demostrado que las células responden a la privación de andrógenos de una manera que remeda el comportamiento observado en las células tumorales prostáticas, y han sido aceptadas como modelo válido del cáncer de próstata en humanos. (Bruchovsky y col., Cancer Res. 50: 2275-2282 (1990); Rennie y col., Cancer Res. 48: 6309-6312 (1988); Bruchovsky y col., Cell 13: 272-280 (1978); Gleave y col., en Genitourinary Oncology, pp. 367-378, Lange y col., eds., Lippencott (1997); Gleave y col., J. Urol. 157: 1727-1730 (1997); Bruchovsky y col., The Prostate 6: 13-21 (1996)). Por tanto, la privación de andrógenos precipita la apoptosis y la regresión del tumor de manera muy reproducible. Además, los cambios de la expresión de TRPM-2 y de Bcl-2 en cáncer de próstata humano después de la castración y durante la progresión hacia la independencia androgénica son similares a los observados en las células tumorales de Shionogi. Por tanto, el modelo tumoral de Shionogi remeda muchas de las características de las células de cáncer de próstata. Además, el modelo tumoral de Shionogi proporciona un modelo muy útil para la evaluación de la capacidad de compuestos para retrasar el comienzo de la independencia androgénica. A pesar de una regresión completa del tumor después de la castración, los tumores de Shionogi independientes de andrógenos de crecimiento rápido reaparecen invariablemente después de un mes, lo cual proporciona un punto final fiable para evaluar agentes que puedan retrasar la progresión hacia la independencia androgénica. En general, los acontecimientos que tienen lugar en el modelo tumoral de Shionogi en un mes se presentan en los pacientes humanos en dos años aproximadamente.
La capacidad de los ODNs antisentido que inhiben la expresión de TRPM-2 para retrasar el comienzo de la independencia androgénica fue evaluada midiendo el volumen tumoral después de la castración en el modelo tumoral de Shionogi. Los animales de ensayo (n=7) fueron tratados intraperitonealmente una vez al día con dosis repetidas de 12,5 mg/kg de ODNs de TRPM-2 antisentido (Sec. ID. Nº 1) en solución salina tamponada. Como control, los animales (n=7) fueron tratados con un ODN desapareado ("mismatch") (Sec. ID. Nº 2). Según se muestra en la Fig. 1, los grupos de ensayo y control mostraron la disminución esperada de volumen tumoral inmediatamente después de la castración, pero los tumores de los ratones tratados con ODN de TRPM-2 antisentido regresaron más rápidamente que los de los controles. El grupo control presentó también el incremento esperado del volumen tumoral que está asociado con el desarrollo de la independencia androgénica. En contraste, a los 49 días después de la castración, había tenido lugar una pequeña reactivación tumoral en los ratones tratados utilizando el ODN de TRPM-2 antisentido. Los tumores reaparecieron finalmente en los ratones tratados con ODN de TRPM-2 antisentido, pero el tiempo medio de recurrencia era aproximadamente el doble que el del grupo control. Por tanto, la inhibición de TRPM-2 es eficaz no sólo para incrementar la tasa de muerte celular que tiene lugar inmediatamente después de la privación de andrógenos, sino también para retrasar la aparición de la independencia androgénica. La disminución más rápida del volumen tumoral en los ratones tratados con los ODNs de TRPM-2 antisentido era debida a una aparición más temprana y más extensa de la apoptosis inducida por la castración. Esto fue confirmado mediante la detección de fragmentos de corte de la poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP) en especímenes de tumores de Shionogi (Miyake y col., Cancer Res. 60: 170-176 (2000)).
Con el fin de evaluar qué ODNs antisentido humanos complementarios a secuencias del ARNm de TRPM-2 son los más eficaces para este fin, se preparó una serie de diez ODNs fosforotioato antisentido que abarcaban varias regiones del ARNm según se muestra en la Fig. 2. Las secuencias de estos diez ODNs están mostradas en el Listado de Secuencias adjunto como Sec. ID. N^{os} 3-12. Los diez ODNs antisentido humanos fueron evaluados utilizando células LNCaP transfectadas con TRPM-2 y células PC-3 de cáncer de próstata humano para determinar su capacidad para inhibir la expresión del ARNm de TRPM-2. Según se muestra en la Fig. 3, los ODNs antisentido analizados producían niveles variables de inhibición de la expresión del ARNm de TRPM-2, alcanzándose los mejores resultados con las Sec. ID. N^{os} 4, 5 y 12. La secuencia ID. Nº 5 corresponde a la secuencia utilizada por Sensibar y col. que producía la inhibición de la expresión de TRPM-2 en células LNCaP, y es complementaria a las primeras 21 bases del ARNm de TRPM-2. La disminución regulada más eficaz tenía lugar con la Sec. ID. Nº 4. Común a todas las secuencias eficaces es un solapamiento con los sitios de inicio o terminación del ARNm de TRPM-2. Por tanto, en sentido general, el método de la invención puede ser puesto en práctica con oligonucleótidos antisentido que sean complementarios a una región del ARNm de TRPM-2 que abarque el sitio de inicio de la traducción o el sitio de terminación de la traducción.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se consigue el tratamiento terapéutico de individuos, incluyendo individuos humanos, que padezcan cáncer de próstata mediante el inicio de una privación de andrógenos para inducir la muerte celular apoptótica de las células tumorales prostáticas del individuo, y la administración al individuo de un oligonucleótido antisentido eficaz para inhibir la expresión de TRPM-2 por las células tumorales, retrasando de este modo la progresión de las células tumorales prostáticas hacia un estado independiente de andrógenos en el individuo.
El inicio de la privación de andrógenos puede ser realizado mediante castración quirúrgica (extracción de ambos testículos) o médica (supresión de la testosterona inducida por fármacos) la cual está indicada actualmente para el tratamiento del cáncer de próstata. La castración médica puede ser conseguida mediante varios regímenes, incluyendo agentes LHRH o antiandrógenos. (Gleave y col., CMAJ 160: 225-232 (1999)). Una terapia intermitente en la cual se efectúa una privación de andrógenos reversible está descrita en Gleave y col., Eur. Urol. 34 (Suplemento 3): 37-41 (1998).
La inhibición de la expresión de TRPM-2 puede ser transitoria, e idealmente debe tener lugar coincidiendo con la privación de andrógenos. En humanos, esto significa que la inhibición de la expresión debe ser eficaz comenzando un día o dos después de la privación de andrógenos y prolongándose durante 3 a 6 meses aproximadamente. Esto puede requerir la aplicación de múltiples dosis. Se comprenderá, sin embargo, que el periodo de tiempo puede ser más prolongando, comenzando antes de la castración y extendiéndose durante un tiempo sustancial después de la misma, sin alejarse del ámbito de la invención.
Se ha determinado también que los ODNs de TRPM-2 antisentido incrementan la quimiosensibilidad en cáncer de células renales (RCC) humano. El RCC es una enfermedad quimiorresistente sin ningún agente quimioterapéutico activo con tasas de respuesta objetivas superiores al 10%. Se ha observado la expresión incrementada de TRPM-2 en células contorneadas proximales renales que experimentan apoptosis después de varios estímulos, incluyendo la obstrucción del uréter y aminoglucósidos. Sin embargo, el significado funcional de la expresión de TRPM-2 en RCC no ha sido bien documentado. Los resultados del ensayo muestran, sin embargo, que el ODN de TRPM-2 antisentido aumenta la quimiosensibilidad en células CaKi-2 de RCC humano (Ver el Ejemplo 6, infra).
Se encontró también que los ODNs de TRPM-2 antisentido incrementaban la sensibilidad a la radiación (ver el Ejemplo 7 y la Fig. 8).
La inhibición de la expresión de TRPM-2 puede ser llevada a cabo mediante la administración de ODNs antisentido, particularmente ODNs antisentido que sean complementarios a una región del ARNm de TRPM-2 que abarque el sitio de inicio de la traducción o el sitio de terminación de la traducción. Para el tratamiento del cáncer de próstata en humanos, son secuencias útiles específicas las mostradas en las Sec. ID. N^{os} 4, 5 y 12.
Los ODNs empleados pueden ser modificados con el fin de incrementar la estabilidad del ODN in vivo. Por ejemplo, los ODNs pueden ser empleados como derivados fosforotioato (sustitución de un átomo de oxígeno que no una fosforilos por un átomo de azufre) que tienen una resistencia incrementada a la digestión por nucleasas. La modificación de MOE (esqueleto ISIS) es también eficaz.
La administración de ODNs antisentido puede ser llevada a cabo utilizando los diferentes mecanismos conocidos en la técnica, incluyendo la administración desnuda y la administración en vehículos lipídicos farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, vehículos lipídicos para la administración de moléculas antisentido están descritos en las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.855.911 y 5.417.978 que se incorporan a la presente por referencia. En general, el antisentido es administrado por vía intravenosa, intraperitoneal, subcutánea u oral, o mediante inyección directa local en el tumor. De los experimentos llevados a cabo utilizando el modelo de Shionogi en ratón, parece que el ODN antisentido es preferencialmente activo en las células tumorales. En efecto, la expresión de TRPM-2 en tejidos no tumorales no fue afectada sustancialmente, y no se observaron efectos colaterales derivadas de la administración del ODN antisentido.
La cantidad de ODN antisentido administrada es una que sea eficaz para inhibir la expresión de TRPM-2 en células prostáticas. Se comprenderá que esta cantidad variará con la eficacia del ODN antisentido empleado, y con la naturaleza del vehículo utilizado. La determinación de las cantidades apropiadas de cualquier composición dada está dentro de la experiencia en la técnica, a través de series estándar de ensayos diseñados para determinar los niveles terapéuticos apropiados.
El método de tratamiento del cáncer de próstata de acuerdo con la invención puede incluir además la administración de agentes quimioterapéuticos y/o de ODNs antisentido adicionales dirigidos hacia diferentes dianas. Por ejemplo, se ha encontrado utilizando el modelo tumoral de Shionogi que el ODN de TRPM-2 antisentido aumenta la sensibilidad a agentes quimioterapéuticos convencionales tales como los taxanos (paclitaxel o docetaxel) y la mitoxantrona (Figs. 12A y 12B). Según se muestra en las Figs. 12A y 12B, el tratamiento con ODN de TRPM-2 antisentido en presencia de taxol o de mitoxantrona tuvo como resultado un volumen tumoral reducido en comparación con la combinación de taxol o mitoxantrona con el ODN desapareado ("mismatch") (MM). Otros agentes que es probable que muestren actividad sinérgica incluyen otros agentes citotóxicos (por ejemplo ciclofosfamida, inhibidores de topoisomerasa), inhibidores de la angiogénesis, agentes de diferenciación e inhibidores de la transmisión de señales. De manera similar, combinaciones del antisentido de TRPM-2 con otras especies antisentido tal como el ODN de Bcl-2 antisentido funcionaban mejor destruyendo células de Shionogi in vitro que cualquiera de los ODNs solo. Por tanto, TRPM-2 puede funcionar conjuntamente con otras moléculas antisentido, tales como ODNs antisentido de Bcl-2, Bcl-x1 y c-myc para proporcionar una eficacia mayor.
La invención será descrita ahora adicionalmente con referencia a los ejemplos no limitantes siguientes.
Ejemplo 1
Los experimentos con el modelo tumoral de Shionogi fueron llevados a cabo utilizando células de la sublínea de Toronto del carcinoma mamario de ratón AD SC-115 transplantable. Para los estudios in vivo, 5 X 10^{6} células aproximadamente de carcinoma de Shionogi fueron inyectadas subcutáneamente a ratones macho adultos de la cepa DD/S. Cuando los tumores de Shionogi tuvieron de 1 a 2 cm de diámetro, normalmente 2 a 3 semanas después de la inyección, se realizó la castración mediante incisión abdominal bajo anestesia con metoxifluorano. Los detalles del mantenimiento de los ratones, del stock tumoral y de los procedimientos operativos han sido descritos previamente. (Bruchovsky y col., Cancer Res. 50: 2275-2282 (1990); Rennie y col., Cancer Res. 48: 6309-6312 (1988); Bruchovsky y col., Cell 13: 272-280 (1978); Gleave y col., en Genitourinary Oncology, pp. 367-378, Lange y col., eds., Lippencott (1997); Gleave y col., J. Urol. 157: 1727-1730 (1997); Bruchovsky y col., The Prostate 6: 13-21
(1996)).
Los ratones fueron seleccionados aleatoriamente para ser tratados con ODN de TRPM-2 antisentido fosforotioato murino (Sec. ID. Nº 1) o con un control desapareado ("mismatch") (Sec. ID. Nº 2) que tiene dos bases diferentes en la secuencia con respecto al ODN de TRPM-2 antisentido. Cada grupo experimental constaba de 7 ratones. Un día después de la castración, se inyectaron intraperitonealmente 12,5 mg/kg de ODN de TRPM-2 antisentido o del ODN control desapareado ("mismatch") disueltos en solución salina tamponada con fosfato, una vez al día a cada ratón durante 40 días. El volumen tumoral fue medido dos veces a la semana y calculado mediante la fórmula: longitud X anchura X profundidad X 0,5236. Gleave y col., Cancer Res. 52: 1598-1605 (1992). Los datos fueron presentados como volúmenes tumorales medios \pm desviación estándar.
Los resultados de este estudio están mostrados en la Fig. 1. Según se muestra, los tumores de Shionogi regresaron más rápidamente y la regresión completa tuvo lugar antes, en los ratones tratados con el ODN de TRPM-2 antisentido. Además, el tratamiento con ODN de TRPM-2 antisentido retrasó sustancialmente la aparición de la independencia androgénica, la cual está reflejada por el incremento del volumen tumoral después del día 21 en los animales control. No se observaron efectos colaterales asociados con el TRPM-2 antisentido o con el control desapareado ("mismatch").
Con el fin de examinar los efectos del tratamiento in vivo con ODN sobre los niveles de ARNm de TRPM-2, se llevó a cabo un análisis de transferencia Northern en tejido tumoral de Shionogi procedente de ratones. Los ratones fueron tratados diariamente con 12,5 mg/kg de ODN de TRPM-2 antisentido (n=6) o del control desapareado ("mismatch") (n=6) mediante inyección intraperitoneal, comenzando un día después de la castración. El cuarto día después de la castración, se recogieron tejidos tumorales y se analizaron mediante transferencia Northern para determinar el ARNm de TRPM-2. El ODN de TRPM-2 antisentido tuvo como resultado un 75% de reducción de los niveles de ARNm de TRPM-2 en los tumores de Shionogi en comparación con los tumores tratados con el ODN control desapareado ("mismatch") (Fig. 3).
Se realizaron análisis comparables en órganos de ratón normales. Se recogieron muestras de bazo, riñón, próstata y cerebro de ratones con tumores de Shionogi tratados con el ODN de TRPM-2 antisentido y con el control desapareado ("mismatch") bajo el mismo patrón de tratamiento, y se analizaron mediante transferencia Northern. Aunque los niveles de ARNm de TRPM-2 eran significativamente menores en los tejidos tumorales, el ODN de TRPM-2 antisentido no tuvo efecto sobre los niveles de ARNm de TRPM-2 en los órganos normales.
Ejemplo 2
La selectividad de la secuencia del ODN de TRPM-2 antisentido (Sec. ID. Nº 1) fue confirmada comparando los niveles de expresión de ARNm de TRPM-2 en células tumorales de Shionogi mantenidas in vitro, después del tratamiento con niveles variables del ODN de TRPM-2 antisentido o con el control desapareado ("mismatch") (Sec. ID. Nº 2). Con el fin de facilitar la captación de los ODNs por las células, los ODNs fueron formulados en un vehículo lipídico catiónico (Lipofectina^{TM}, (Life Technologies, Inc.)). Las células fueron tratadas dos veces a lo largo de un periodo de dos días utilizando el protocolo siguiente. Las células fueron preincubadas durante 20 minutos con 4 \mug/ml de lipofectina en OPTI-MEM^{TM} sin suero (Life Technologies, Inc.) e incubadas posteriormente con el medio que contenía la concentración seleccionada de ODN y lipofectina durante cuatro horas. El medio fue posteriormente sustituido por medio de cultivo estándar.
La cantidad de ARNm de TRPM-2 en las células fue evaluada utilizando análisis de transferencia Northern. Según se muestra en la Fig. 4, el tratamiento de las células de Shionogi con ODN de TRPM-2 antisentido redujo los niveles de ARNm de TRPM-2 de manera dependiente de la dosis. En contraste, los niveles de ARNm de TRPM-2 no se vieron afectados por el ODN desapareado ("mismatch") (Sec. ID. Nº 2) a ninguna de las concentraciones empleadas. Por tanto, el efecto del ODN de TRPM-2 antisentido es aparentemente específico de la secuencia.
Ejemplo 3
Células de Shionogi mantenidas in vitro fueron tratadas con cantidades variables de taxol solo o en combinación con 500 nM del ODN de TRPM-2 antisentido (Sec. ID. Nº 1) o del control desapareado ("mismatch") (Sec. ID. Nº 2). Las células fueron tratadas dos veces, según se describió en el Ejemplo 2, y se determinó el porcentaje de células viables restantes. Los resultados están resumidos en la Fig. 5. Según se muestra, la inclusión del ODN de TRPM-2 antisentido desplazó la curva dosis-respuesta hacia la izquierda, disminuyendo la CI_{50} en un factor de 5 a 10. Se consiguieron resultados similares utilizando mitoxantrona en lugar de paclitaxel (Figs. 12A y 12B).
Ejemplo 4
Se repitió el experimento del Ejemplo 3, con la adición de ODN de Bcl-2 antisentido (Sec. ID. Nº 13) o de un ODN de Bcl-2 desapareado ("mismatch") (Sec. ID. Nº 14) en varias combinaciones con ODN de TRPM-2 antisentido/desapareado ("mismatch") y taxol. Los resultados están mostrados en la Fig. 6. La combinación de ODN de TRPM-2 antisentido con ODN de Bcl-2 antisentido y taxol incrementó adicionalmente los efectos citotóxicos del taxol. Por tanto, la vectorización de agentes antiapoptóticos adicionales parece proporcionar beneficios terapéuticos.
Ejemplo 5
Con el fin de identificar secuencias de ODN de TRPM-2 antisentido apropiadas para ser utilizadas en terapia humana, se sintetizaron secuencias de ODN antisentido dirigidas contra 10 lugares diferentes del gen TRPM-2 humano (Fig. 2, Sec. ID. N^{os} 3-12) y se analizaron con el fin de determinar su capacidad para disminuir la expresión del gen TRPM-2 en células PC-3 de cáncer de próstata humano y en células LNCaP transfectadas que sobreexpresan TRPM-2, utilizando el mismo protocolo de tratamiento que el descrito en el Ejemplo 2. Los resultados están resumidos en la Fig. 3. Según se muestra, las secuencias 4, 5 y 12 son activas para reducir la expresión de TRPM-2. Estas tres secuencias solapan o están inmediatamente adyacentes a los sitios de inicio o de terminación de la traducción.
Ejemplo 6
Se utilizó tinción inmunohistoquímica para caracterizar la expresión de clusterina en 17 tejidos renales de RCC y normales obtenidos de especímenes procedentes de nefrectomía radical. La expresión de TRPM-2 en las líneas celulares de cáncer renal humano ACHN, CaKi-1 y CaKi-2 fue evaluada mediante análisis de transferencia Northern y Western. Se utilizó el análisis de transferencia Northern para determinar los cambios en la expresión del ARNm de TRPM-2 tras el tratamiento con ODN de TRPM-2 antisentido. Los efectos del tratamiento combinado con ODN de TRPM-2 antisentido y taxol sobre el crecimiento de células CaKi-2 fueron examinados utilizando un ensayo MTT.
La inmunotinción mostró una expresión incrementada de clusterina en 11 especímenes de RCC en comparación con el tejido renal normal adyacente. En los 6 casos restantes, no se observó diferencia entre el tejido maligno y el tejido normal. En las tres líneas celulares de RCC humano eran detectables ARNm de TRPM-2 y la expresión de la proteína, siendo los niveles más elevados en CaKi-2.
El ODN de TRPM-2 antisentido (Sec. ID. Nº 1), pero no el ODN desapareado ("mismatch") control (Sec. ID. Nº 2), inhibía la expresión de TRPM-2 en células CaKi-2 de manera dependiente de la dosis y específica de la secuencia (Fig. 7A). Además, el ODN de TRPM-2 antisentido incrementaba sustancialmente la quimiosensibilidad al taxol, reduciendo la CI_{50} del taxol en 1 log (de 500 nM a 50 nM) en comparación con el ODN desapareado ("mismatch") control (Fig. 7B). Estos datos demuestran que el TRPM-2 y su proteína, la clusterina, se expresan en niveles más elevados en RCC en comparación con el tejido renal normal, y que el ODN de TRPM-2 antisentido puede ser útil para incrementar los efectos citotóxicos de la quimioterapia convencional en RCC avanzado.
Ejemplo 7
Los ODNs de TRPM-2 antisentido incrementan la sensibilidad a la radiación de células cancerosas que expresan TRPM-2. Utilizando análisis Northern, encontramos que la terapia de radiación tiene como resultado incrementos dependientes de la dosis y del tiempo de la expresión del gen TRPM-2 en células PC-3 de cáncer de próstata humano (Fig. 8). La sobreexpresión de TRPM-2 tiene como resultado una resistencia incrementada a la muerte celular inducida por radiación. Las células LNCaP de próstata humana que sobreexpresan TRPM-2 (LNCaP/T1) son más resistentes a la terapia de radiación (Figs. 9A y 9B). El tratamiento de células PC-3 de cáncer de próstata humano con ODNs de TRPM-2 antisentido (Sec. ID. Nº 1) 100 y 500 nM reduce significativamente la supervivencia celular tras un único tratamiento con terapia de radiación de 4 Gy en comparación con el tratamiento con el ODN desapareado ("mismatch") (Sec. ID. Nº 2). (Fig. 10). Las Figuras 11A y B muestran la sensibilización a la radiación dependiente de la dosis de células PC-3 de cáncer de próstata humano después del tratamiento in vitro con el oligo de TRPM-2 antisentido a 10, 50 y 100 nM.
Ejemplo 8
Con el fin de determinar si el tratamiento con ODN de TRPM-2 antisentido humano aumenta la quimiosensibilidad en la línea celular de cáncer de próstata humano PC-3, ratones portadores de tumores PC-3 fueron tratados con ODN de TRPM-2 antisentido humano más paclitaxel micelar o mitoxantrona, y con ODN control desapareado ("mismatch") más paclitaxel micelar o mitoxantrona (Figs. 12A y 12B). El ODN fue administrado durante 28 días y se administraron 0,5 mg de taxol micelar o 0,3 mg de mitoxantrona en dos ocasiones: desde el día 10 al 14 y desde el día 24 al 28. Se observó una reducción significativa del tamaño de tumor en los animales tratados con el ODN antisentido en comparación con los tratados con el ODN control desapareado ("mismatch"). Este efecto fue incluso más pronunciado después de la segunda dosificación del paclitaxel micelar o de la mitoxantrona.
<110> Gleave, Martin
\hskip1cm
Rennie, Paul S. 
\hskip1cm
Miyake, Hideaki 
\hskip1cm
Nelson, Colleen 
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<120> TERAPIA ANTISENTIDO CONTRA TRPM-2
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<130> UBC.P-020-WO
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<140>
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<141>
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<150> 60/121.726
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<151> 26-02-1999
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<160> 14
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Murino
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<220>
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<223> ODN de TRPM-2 antisentido
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcacagcagg agaatcttca t 
\hfill
21 
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<210> 2
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Murino
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<220>
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<223> control desapareado ("mismatch")
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<400> 2
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gcacagcagc aggatcttca t 
\hfill
21 
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<210> 3
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Humano
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<220>
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<223> ODN de TRPM-2 antisentido
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<400> 3
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tggagtcttt gcacgcctcg g 
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21 
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<210> 4
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Humano
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<220>
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<223> ODN de TRPM-2 antisentido
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cagcagcaga gtcttcatca t 
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21 
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<210> 5
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<211> 21
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<223> ODN de TRPM-2 antisentido
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attgtctgag accgtctggt c 
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21 
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ccttcagctt tgtctctgat t 
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21 
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<210> 7
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Humano
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<220>
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<223> ODN de TRPM-2 antisentido
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskip
agcagggagt cgatgcggtc a 
\hfill
21 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Humano
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<220>
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<223> ODN de TRPM-2 antisentido
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskip
atcaagctgc ggacgatgcg g 
\hfill
21 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Humano
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<220>
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<223> ODN de TRPM-2 antisentido
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<400> 9
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gcaggcagcc cgtggagttg t 
\hfill
21 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Humano
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<220>
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<223> ODN de TRPM-2 antisentido
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<400> 10
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ttcagctgct ccagcaagga g 
\hfill
21 
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<210> 11
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Humano
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<220>
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<223> ODN de TRPM-2 antisentido
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskip
aatttagggt tcttcctgga g 
\hfill
21 
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<210> 12
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Humano
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ODN de TRPM-2 antisentido
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskip
gctgggcgga gttgggggcc t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Murino
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<220>
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<223> ODN de Bcl-2 antisentido
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<400> 13
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tctcccggct tgcgccat 
\hfill
18 
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<210> 14
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Murino
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<220>
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<223> ODN de Bcl-2 desapareado ("mismatch")
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<400> 14
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tctcccggca tggtgcat 
\hfill
18 
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Claims (15)

1. Una composición que contiene un oligonucleótido antisentido que inhibe la expresión de TRPM-2 por células tumorales para retrasar la progresión de células tumorales prostáticas hacia un estado de independencia androgénica.
2. Una composición para incrementar la quimiosensibilidad o la sensibilidad a la radiación de células cancerosas en un individuo que padezca un cáncer que exprese TRPM-2 en cantidades diferentes del tejido normal del mismo tipo, que contiene un oligonucleótido antisentido que inhibe la expresión de TRPM-2 en las células cancerosas.
3. La composición de la reivindicación 1 ó 2, en la que el oligonucleótido antisentido es complementario a una región del ARNm de TRPM-2 que incluye el sitio de inicio o de terminación de la traducción.
4. La composición de la reivindicación 3, en la que el oligonucleótido antisentido tiene la secuencia dada por la Sec. ID. Nº 4.
5. La composición de la reivindicación 3, en la que el oligonucleótido antisentido tiene la secuencia dada por la Sec. ID. Nº 5.
6. La composición de la reivindicación 3, en la que el oligonucleótido antisentido tiene la secuencia dada por la Sec. ID. Nº 12.
7. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, conteniendo además un segundo oligodesoxinucleótido antisentido que inhibe la expresión de una proteína antiapoptótica distinta de la TRPM-2.
8. La composición de la reivindicación 7, en la que el segundo oligodesoxinucleótido antisentido es un oligodesoxinucleótido de Bcl-2 antisentido.
9. Un oligonucleótido que consta de la secuencia mostrada en la Sec. ID. Nº 4.
10. Un oligonucleótido que consta de la secuencia mostrada en la Sec. ID. Nº 12.
11. Una composición que contiene un oligonucleótido antisentido que es complementario al ARNm de TRPM-2 y que contiene una secuencia como la mostrada en cualquiera de las Sec. ID. N^{os} 4, 5 y 12, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para proporcionar el oligonucleótido a un sujeto mamífero con el fin de reducir la expresión de TRPM-2, para ser utilizada como medicamento.
12. La composición de la reivindicación 11, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable es un vehículo lipídico.
13. La composición de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, que contiene además un oligonucleótido antisentido adicional que se une específicamente a una secuencia que no es el ARNm de TRPM-2.
14. La composición de acuerdo con la reivindicación 13, en la que el oligonucleótido antisentido adicional se une específicamente a una secuencia seleccionada entre Bcl-2, Bcl-1x y c-myc.
15. La composición de acuerdo con la reivindicación 14, en la que el oligonucleótido adicional consta de la secuencia mostrada en la Sec. ID. Nº 13.
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