ES2710109T3 - Acidos nucleicos que se dirigen a TCTP para su uso en el tratamiento de cánceres quimiorresistentes u hormonorresistentes - Google Patents

Abstract

Un antagonista de la proteína tumoral controlada traduccionalmente (TCTP) para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer, en el que dicho antagonista es un ácido nucleico que se dirige a un ARNm que codifica TCTP, en el que dicho ácido nucleico es capaz de reducir la cantidad de TCTP en las células, en el que dicho ácido nucleico tiene una longitud de 18 a 22 nucleótidos y en el que dicho ácido nucleico es un oligonucleótido antisentido (i) que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 40 o (ii) que consiste en un fragmento de al menos 18 nucleótidos consecutivos de una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 40.

Description

DESCRIPCION

Acidos nucleicos que se dirigen a TCTP para su uso en el tratamiento de canceres quimiorresistentes u hormonorresistentes

[0001] La presente invencion definida en las reivindicaciones se refiere a un antagonista de TCTP, en particular, a un acido nucleico que se dirige a un ARNm que codifica una protelna tumoral controlada traduccionalmente (TCTP), en el que dicho acido nucleico es capaz de reducir la cantidad de TCTP en las celulas, para su uso en el tratamiento o la prevention de un cancer independiente de hormonas o un cancer quimiorresistente, tal como un cancer de prostata independiente de androgenos.

[0002] El cancer de prostata (CP) es la neoplasia no cutanea mas comun entre los hombres en el mundo occidental. Despues del cancer de pulmon, el CP es la segunda causa mas comun de mortalidad relacionada con el cancer en los hombres, ya que es responsable de aproximadamente el 13 % de todas las muertes por cancer. Aunque los pacientes con enfermedad localizada pueden tratarse con cirugla o radiation, la ablation de androgenos suele ser la terapia inicial en pacientes con enfermedad avanzada o metastasica. Desafortunadamente, la enfermedad progresa gradualmente a un estado metastasico resistente a castration (RC), que sigue siendo incurable. Durante este estado, el crecimiento del tumor avanza en ausencia de androgenos, provocando la muerte en un plazo de 2 a 3 anos despues del diagnostico.

[0003] Dado que la mayorla de los pacientes finalmente no responden y recaen en 2-3 anos con un cancer de prostata resistente a castracion (CPRC), los esfuerzos se han centrado en el desarrollo de terapias no hormonales dirigidas a celulas resistentes a la castracion (RC).

[0004] Hasta hace poco, la quimioterapia no mostraba un beneficio de supervivencia y solo tenia una funcion paliativa para los hombres con CPRC. Se ha demostrado la eficacia de docetaxel en CPRC metastasico. Sin embargo, la supervivencia global media se prolongo durante unos pocos meses, lo que resalto la necesidad de nuevas terapias.

[0005] El documento WO02/36624 describe un metodo para inhibir una celula hiperproliferativa proporcionando a la celula una cantidad eficaz de un inhibidor de fortilina, en el que el inhibidor reduce la actividad de fortilina en la celula.

[0006] Munirathinam Gnanasekar y col. (International Journal of Oncology, Vol. 34, 2009, 1241-1246) describe que el silenciamiento genico de TCTP por ARNip permite inhibir el crecimiento celular e inducir la apoptosis in vitro en celulas de cancer de prostata humano.

[0007] El documento WO 03/097835 describe un metodo para suprimir el crecimiento de una celula cancerosa usando un compuesto que modula la slntesis o expresion del gen tpt1. Por ejemplo, la slntesis o expresion del gen tpt1 se inhibe dirigiendose especlficamente al ADN o ARNm de tpt1.

[0008] Wu-Ling Zhu y col. (Anticancer Research, Vol. 28, 2008, 1575-1580) estudian la expresion del ARNm de TCTP en un modelo de regeneration hepatica en rata y tejidos de cancer hepatico en humanos, as! como el posible papel de TCTP en la supresion del cancer hepatico.

[0009] Por lo tanto, existe una necesidad en la tecnica de tratamientos eficaces del cancer de prostata, en particular de CPRC.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

[0010] Los inventores han identificado que la protelna tumoral controlada traduccionalmente (TCTP) se une a la protelna de choque termico 27 (Hsp27) y que, por lo tanto, la TCTP esta protegida a partir de su via ubiquitinaproteasoma. La inhibition de la interaction TCTP-Hsp27 conduce a la degradation de la proteina TCTP.

[0011] Se notifico anteriormente que la Hsp27 estaba muy sobreexpresada en el cancer de prostata resistente a la castracion (CPRC). Los inventores han demostrado ahora que la Hsp27 tiene un efecto citoprotector en las celulas cancerosas, que esta mediada por su interaccion con TCTP.

[0012] Se sabe que la TCTP tiene una funcion en la patogenesis tumoral. Sin embargo, los inventores han hallado de manera sorprendente que la sobreexpresion de TCTP en la sensibilidad a la castracion confiere resistencia a la castracion y a la quimioterapia a las celulas.

[0013] Ademas, los inventores han identificado oligonucleotidos antisentido (OAS) y ARNs de interferencia pequenos (ARNips) que disminuyen significativamente los niveles de ARNm y proteinas de TCTP. Ademas, se demostro que los ^oA^s potenciaban los efectos antineoplasicos de la terapia hormonal y de quimioterapia con docetaxel tanto in vitro como in vivo.

[0014] Los inventores han hallado por ende que los OAS y los ARNip dirigidos a TCTP restauran la sensibilidad a las hormonas y a la quimioterapia en CPRC. Mas especlficamente, la actividad antineoplasica de los ARNip y OAS de TCTP en celulas de cancer de prostata es de gran interes para el uso de estos compuestos como agentes terapeuticos, ya que se espera que no muestren toxicidad como efecto secundario. De hecho, la TCTP esta fuertemente sobreexpresada en el 75 % del cancer de prostata en estadio avanzado, en particular en los tumores primarios y metastasis de CPRC. Por otra parte, no se ha observado expresion alguna de TCTP en tejidos de prostata normales. Incluso las glandulas de cancer de prostata normales que se encuentran entre las glandulas tumorales de cancer de prostata no tienen expresion de TCTP.

[0015] Una estrategia para mejorar las terapias en el cancer de prostata avanzado consiste en dirigir genes que se activan por la supresion de androgenos, ya sea para retrasar o prevenir la emergencia del fenotipo de RC. Se cree que los oAs y los ARNip dirigidos a TCTP tienen esta capacidad. En particular, se cree que la inhibicion de la TCTP es capaz de restaurar la sensibilidad de las celulas cancerosas que se han vuelto resistentes a terapias como la quimioterapia y/o la castracion.

Por lo tanto, la presente solicitud describe varios antagonistas de la protelna tumoral controlada traduccionalmente (TCTP), en particular varios acidos nucleicos que se dirigen al ARNm que codifica TCTP y que es capaz de reducir la cantidad de TCTP en celulas cancerosas, para su uso en el tratamiento o la prevencion de canceres, preferentemente cancer resistente a la castracion o a la quimioterapia, como por ejemplo CPRC o para sensibilizar a un paciente con cancer resistente a la castracion o a la quimioterapia a la terapia.

[0016] La presente invencion se define en las reivindicaciones.

Antagonistas para su uso descrito en esta invencion

[0017] Como se usa en esta invencion, el termino "antagonista de TCTP" se refiere a compuestos que inhiben o reducen la actividad biologica de TCTP. La actividad biologica de TCTP depende de la cantidad de la protelna (es decir, su nivel de expresion), as! como de la actividad de la protelna. Por lo tanto, el antagonista de TCTP puede reducir o inhibir la expresion de TCTP o la actividad de la protelna TCTP.

[0018] Como se usa en esta invencion, los terminos "protelna tumoral controlada traduccionalmente" y "TCTP" abarcan cualquier isoforma de origen natural de la protelna TCTP, incluida la protelna de la SEQ ID NO: 1, variantes alelicas de la misma, variantes de corte y empalme de la misma y protelnas homologas en otras especies. Preferentemente, la TCTP es de origen humano. Lo mas preferentemente, la TCTP tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1.

[0019] Los metodos para determinar si un compuesto es un antagonista de TCTP son bien conocidos por los expertos en la materia.

[0020] Por ejemplo, los expertos en la materia pueden evaluar si un compuesto reduce o elimina la expresion de TCTP por inmunoelectrotransferencia o por RT-PCR, Elisa (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) o inmunohistoqulmica.

[0021] La actividad biologica de la protelna TCTP tambien se puede evaluar midiendo uno de los fenomenos en los que se sabe que TCTP desempena un papel. Por ejemplo, se sabe que la TCTP desempena un papel en la liberacion de histamina, en el ciclo celular, en el crecimiento celular, en la apoptosis, en la estabilizacion de microtubulos, en el metabolismo del calcio, etc. Un compuesto que reduce o elimina la capacidad de TCTP para desempenar un papel en uno de estos fenomenos se define como un antagonista de TCTP.

[0022] Por ejemplo, determinar si un compuesto es un antagonista de TCTP se puede efectuar midiendo la capacidad de TCTP para causar la liberacion de histamina de los basofilos, por ejemplo, usando el metodo descrito en MacDonald y col. (1995, Science. 269:688-90), en presencia y en ausencia de un compuesto candidato. Un compuesto que reduce o elimina la liberacion de histamina se define como un antagonista de TCTP.

[0023] Los inventores han descubierto que TCTP es un ligando de Hsp27. La union de Hsp27 con TCTP protege a la TCTP de su via ubiquitina-proteasoma, y la inhibicion de esa interaccion conduce a la degradacion de la protelna TCTP (datos no publicados). Por ende, la actividad biologica de TCTP tambien puede medirse evaluando la capacidad de TCTP para unirse a sus ligandos naturales, como por ejemplo, Hsp27. La union de TCTP a Hsp27 se puede evaluar, por ejemplo, usando un ensayo de co-inmunoprecipitacion, un ensayo pull-down, un sistema de transferencia de energla por resonancia de bioluminiscencia (BRET) o el sistema de dos hlbridos de levadura (Y2H). Un compuesto que reduce o anula la union de TCTP a Hsp27 se define como un antagonista de TCTP.

[0024] Como se usa en esta invencion, los terminos "protelna de choque termico 27" y "Hsp27" abarcan cualquier isoforma de origen natural de la protelna Hsp27, incluida la protelna de la SEQ ID NO: 16, variantes alelicas de la misma, variantes de corte y empalme de la misma y protelnas homologas en otras especies. Preferentemente, Hsp27 es de origen humano. Lo mas preferentemente, Hsp27 es la protelna-1 de choque termico humana de 27 kDa (numero de acceso AAH12292) y tiene la secuencia de SEQ ID NO: 16.

[0025] "Anticuerpo" pretende incluir no solo moleculas de inmunoglobulina completas sino tambien fragmentos de las mismas como Fab, F(ab')2, Fv y otros fragmentos de las mismas que retienen el sitio de union al antlgeno. El termino "anticuerpo" tambien incluye derivados genotecnologicos de anticuerpos tales como moleculas Fv de cadena sencilla (scFv) y anticuerpos de dominio unico (dAbs). El termino incluye ademas moleculas similares a anticuerpos, que pueden producirse usando tecnicas de expresion en fagos u otras tecnicas de seleccion aleatoria para moleculas. El termino incluye todas las clases de anticuerpos y mas especlficamente IgGs, IgAs, IgMs, IgDs e IgEs.

[0026] Aunque el anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, resulta preferente si es un anticuerpo monoclonal. Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que reconoce solo un tipo de antlgeno. El termino "anticuerpo monoclonal" abarca tanto los anticuerpos producidos por hibridomas (Kohler y Milstein 1975 Nature 256:495-7) como los anticuerpos recombinantes obtenidos a traves de la ingenierla genetica. Mas especlficamente, los anticuerpos monoclonales abarcan anticuerpos quimericos (Boulianne y col. 1984 Nature 312:643-6), anticuerpos humanizados (Jones y col. 1986 Nature 321:522-5) y anticuerpos completamente humanos que pueden producirse, por ejemplo, por expresion en fagos (Vaughan y col. 1998 Nat. Biotecnol. 16:535-9) o tecnologla transgenica (Lonberg 2005 Nat Biotecnol. 23:1117-25).

[0027] Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porcion de un anticuerpo intacto, preferentemente la region de union a antlgeno o variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, diacuerpos y anticuerpos multiespeclficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. El termino "Fab" denota un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y una actividad de union a antlgeno, en la cual aproximadamente la mitad del lado N-terminal de la cadena H y la cadena L completa, entre los fragmentos obtenidos al tratar IgG con una proteasa, papalna, se unen entre si mediante un enlace disulfuro.

[0028] El termino "F(ab')2" se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 100.000 y una actividad de union a antlgeno, que es ligeramente mas grande que el Fab unido a traves de un enlace disulfuro de la region bisagra, entre los fragmentos obtenidos al tratar IgG con una proteasa, pepsina.

[0029] El termino "Fab" se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y una actividad de union a antlgeno, que se obtiene al cortar un enlace disulfuro de la region bisagra de F(ab')2.

[0030] Un polipeptido Fv de cadena sencilla ("scFv") es un heterodlmero VH::VL enlazado covalentemente que generalmente se expresa a partir de una fusion de genes que incluye genes que codifican VH y VL enlazados por un enlazador codificante de peptidos. El fragmento scFv humano descrito en esta invencion incluye CDRs que se mantienen en una conformacion apropiada, preferentemente usando tecnicas de recombinacion genica.

[0031] "dsFv" es un heterodlmero VH::VL estabilizado por un enlace disulfuro. Los fragmentos de anticuerpos divalentes y multivalentes pueden formarse espontaneamente por asociacion de scFvs monovalentes, o pueden generarse por acoplamiento de scFv monovalentes por un enlazador peptldico, tal como sc(Fv)2 divalente.

[0032] El termino "diacuerpos" se refiere a pequenos fragmentos de anticuerpos con dos sitios de union a antlgeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptldica (VH-VL). Al utilizar un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se obliga a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y as! crear dos sitios de union a antlgeno.

[0033] El antagonista de TCTP es un acido nucleico que se dirige a un ARNm que codifica una protelna tumoral controlada traduccionalmente (TCTP), y que es capaz de reducir la cantidad de TCTP en las celulas.

[0034] La presente solicitud describe tales acidos nucleicos que se dirigen a un ARNm que codifica una protelna tumoral controlada traduccionalmente (TCTP), y que son capaces de reducir la cantidad de TCTP en las celulas.

[0035] Como se usa en esta invencion, un acido nucleico que "se dirige" a un ARNm se refiere a un acido nucleico que es capaz de unirse especlficamente a dicho ARNm. Es decir, el acido nucleico comprende una secuencia que es al menos parcialmente complementaria, con especial preferencia perfectamente complementaria, a una region de la secuencia de dicho ARNm, siendo dicha complementariedad suficiente para producir una union especlfica en condiciones intracelulares.

[0036] Como un experto en la materia apreciara inmediatamente, una secuencia que es "perfectamente complementaria a" una segunda secuencia significa el homologo del complemento inverso de la segunda secuencia, ya sea bajo la forma de una molecula de ADN o bajo la forma de una molecula de ARN. Una secuencia es "parcialmente complementaria a" una segunda secuencia si hay uno o mas emparejamientos incorrectos.

[0037] Los acidos nucleicos que se dirigen a un ARNm que codifica TCTP pueden ser especlficos de TCTP y disenarse usando la secuencia de dicho ARNm como base, por ejemplo, usando herramientas bioinformaticas. Por ejemplo, la secuencia de SEQ ID NO: 5 se puede usar como base para disenar acidos nucleicos que se dirigen a un ARNm que codifica TCTP.

[0038] Los acidos nucleicos descritos en esta invencion son capaces de reducir la cantidad de TCTP en las celulas, por ejemplo, en celulas cancerosas tales como las celulas LNCaP, C4-2 o PC3. Los expertos en la materia conocen los metodos para determinar si un acido nucleico es capaz de reducir la cantidad de TCTP en las celulas. Esto se puede hacer, por ejemplo, analizando la expresion de la protelna TCTP mediante membrana de Western, y comparando la expresion de la protelna TCTP en presencia y en ausencia del acido nucleico a analizar (vease la Figura 4 y el Ejemplo 5).

[0039] Los acidos nucleicos descritos en esta invencion pueden corresponder, por ejemplo, a oligonucleotidos antisentido o a ARN de interferencia (incluidos ARNip, ARNhcs, miARNs, ARNdcs y otras especies de ARN que pueden escindirse in vivo para formar ARNips).

[0040] Los acidos nucleicos descritos en esta invencion tienen normalmente una longitud de 12 a 50 nucleotidos, por ejemplo, 12 a 35 nucleotidos, 12 a 30, 12 a 25, 12 a 22, 15 a 35, 15 a 30, 15 a 25, 15 a 22, 18 a 22, o aproximadamente 19, 20 o 21 nucleotidos.

[0041] Los acidos nucleicos descritos en esta invencion pueden, por ejemplo, comprender o consistir en 12 a 50 nucleotidos consecutivos, por ejemplo 12 a 35, 12 a 30, 12 a 25, 12 a 22, 15 a 35, 15 a 30, 15 a 25, 15 a 22, 18 a 22, o aproximadamente 19, 20 o 21 nucleotidos consecutivos de una secuencia complementaria al ARNm que se une especlficamente con la SEQ ID NO: 5.

[0042] En particular, los inventores han identificado trece acidos nucleicos dirigidos a un ARNm que codifica TCTP que son muy eficaces para reducir la cantidad de TCTP en las celulas (vease la Figura 4 y el Ejemplo 5). Estos acidos nucleicos se dirigen a las regiones que consisten en los nucleotidos 153 a 173 de la ^s E^q ID NO: 5, los nucleotidos 220 a 240 de la SEQ ID NO: 5, los nucleotidos 300 a 320 de la SEQ ID NO: 5 y los nucleotidos 320 a 340 de la SEQ ID NO: 5, respectivamente. Todos estos acidos nucleicos se dirigen a la region traducida del ARNm de TCTP (que se extiende desde el nucleotido 94 al 612 de la SEQ ID NO: 5).

[0043] Por lo tanto, los acidos nucleicos descritos en esta invencion se dirigen preferentemente a una secuencia que se superpone con los nucleotidos 153 a 173, o con los nucleotidos 221 a 240 o con los nucleotidos 300 a 340 de la SEQ ID NO: 5, dicho acido nucleico es un ADN o un ARN. Dicho acido nucleico puede, por ejemplo, dirigirse a:

- una secuencia que consiste en los nucleotidos 153 a 173 o en los nucleotidos 221 a 240 o en los nucleotidos 300 a 320, o en los nucleotidos 320 a 340 de la SEQ ID NO: 5, o

- una secuencia comprendida en los nucleotidos 153 a 173 o en los nucleotidos 221 a 240, o en los nucleotidos 300 a 320, o en los nucleotidos 320 a 340 de la SEQ ID NO: 5, o

- una secuencia parcialmente comprendida en los nucleotidos 153 a 173 o en los nucleotidos 221 a 240, o en los nucleotidos 300 a 320, o en los nucleotidos 320 a 340 de la SEQ ID NO: 5.

[0044] Los acidos nucleicos descritos en esta invencion pueden comprender, por ejemplo, un fragmento de al menos 10 nucleotidos consecutivos de una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 (5'-ACCAATGAGCGAGTCATCAA-3'), SEQ ID NO: 3 (5-AACCCGUCCGCGAUCUCCCGG-3'), SEQ ID NO: 14 (5'-AACTTGTTTCCTGCAGGTGA-3'), SEQ ID NO: 15 (5'-TGGTTCATGACAATATCGAC-3'), SEQ ID NO: 17 (5'­ T AAT CATGATGGCGACT GA A -3'), SEQ ID NO: 25 (5'-ACCAGT GATT ACT GTGCTTT-3'), SEQ ID NO: 26 (5'-CTTGTAGGCTTCTTTTGTGA-3'), SEQ ID NO: 27 (5'-ATGTAATCTTTGATGTACTT-3'), SEQ ID NO: 28 (5'-GTTTCCCTTTGATTGATTTC-3'), SEQ ID NO: 29 (5'-TTCTGGTCTCTGTTCTTCAA-3'), SEQ ID NO: 34 (5'-AGAAAATCATATATGGGGTC-3'), SEQ ID NO: 36 (5'-TTAACATTTCTCCATTTCTA-3'), SEQ ID NO: 38 (5'-GTCATAAAAGGTTTTACTCT-3') y SEQ ID NO: 40 (5'-GAAATTAGCAAGGATGTGCT-3'). Mas preferentemente, los acidos nucleicos descritos en esta invencion comprenden una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 40. Los acidos nucleicos descritos en esta invencion pueden comprender, por ejemplo, un fragmento de al menos 10 nucleotidos consecutivos de una secuencia de ^s E^q ID NO: 2 o de una secuencia de SEQ ID NO: 14, o de una secuencia de SEQ ID NO: 15, o de una secuencia de SEQ ID NO: 3. Lo mas preferentemente, comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 2, o una secuencia de SEQ ID NO: 14, o una secuencia de SEQ ID NO: 15 o una secuencia de SEQ ID NO: 3.

[0045] En una realizacion preferida descrita en esta invencion, el acido nucleico es un oligonucleotido antisentido. La molecula antisentido puede ser una molecula de ADN o de ARN.

[0046] Dicho oligonucleotido antisentido puede, por ejemplo, comprender o consistir en un fragmento de al menos 10, 12, 15, 18 o 20 nucleotidos consecutivos de una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 (5'-ACCAATGAGCGAGT- CATCAA-3'), SEQ ID NO: 14 (5'-AACTTGTTTCCTGCAGGTGA-3'), SEQ ID NO: 15 (5'-TGGTTCATGACAATATCGAC-3'), SEQ ID NO: 17 (5'-TAATCATGATGGCGACTGAA -3'), SEQ ID NO: 25 (5'-ACCAGT GATT ACT GT GCTTT-3'), SEQ ID NO: 26 (5'-CTTGTAGGCTTCTTTTGTGA-3'), SEQ ID NO: 27 (5'-ATGTAATCTTTGATGTACTT-3'), SEQ ID NO: 28 (5'-GTTTCCCTTTGATTGATTTC-3'), SEQ ID NO: 29 (5'-TTCTGGTCTCTGTTCTTCAA-3'), SEQ ID NO: 34 (5'- AGAAAATCATATATGGGGTC-3'), SEQ ID NO: 36 (5'-TTAACATTTCTCCATTTCTA -3'), SEQ ID NO: 38 (5'-GTCATAAAAGGTTTTACTCT-3') y SEQ ID NO: 40 (5'­ GAAATTAGCAAGGATGTGCT-3'), preferentemente de una secuencia SEQ ID NO: 2 (5'-ACCAATGAGCGAGTCATCAA-3'), o de una secuencia de SEQ ID NO: 14 (5'-AACTTGTTTCCTGCAGGTGA-3'), o de una secuencia de SEQ ID NO: 15 (5'-TGGTTCATGACAATATCGAC-3'). Preferentemente, comprende o consiste en una secuencia que comprende en el grupo seleccionado entre SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 40, mas preferentemente, en el grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15.

[0047] En otro aspecto de la descripcion, el acido nucleico es un ARN de interferencia (ARNi).

[0048] La interferencia de ARN de es un termino inicialmente acunado por Fire y sus colaboradores para describir la observacion de que el ARN bicatenario (ARNbc) puede bloquear la expresion genica cuando se introduce en gusanos (Fire y col., 1998, Nature 391:806-811). ARNbc dirige el silenciamiento postranscripcional especlfico de un gen en muchos organismos, incluidos los vertebrados, y ha proporcionado una nueva herramienta para estudiar la funcion de los genes. La interferencia de ARN de participa en la degradacion del ARNm, pero muchos de los mecanismos bioqulmicos que subyacen en esta interferencia son desconocidos. El uso de la interferencia de ARN se ha descrito mas detalladamente por Carthew y col. (2001, Current Opinions in Cell Biology, 13:244-248) y por Elbashir y col. (2001, Nature, 411:494-498). Las moleculas de ARNi descritas en esta invencion son ARN bicatenario o monocatenario, preferentemente de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleotidos, que median la inhibition del ARN. Es decir, el ARNi descrito en esta invencion media la degradacion del ARNm que codifica TCTP.

[0049] El termino "ARNi" incluye ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado (ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintetico, ARN producido de forma recombinante), as! como ARN alterado que difiere del ARN de origen natural por la adicion, deletion, sustitucion y/o alteration de uno o mas nucleotidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adicion de material no nucleotldico, tal como el(los) extremo(s) del ARN o internamente (en uno o mas nucleotidos del ARN). Los nucleotidos en las moleculas de ARNi descrito en esta invencion tambien pueden comprender nucleotidos no estandar, incluyendo nucleotidos o desoxirribonucleotidos de origen no natural. En conjunto, todos estos compuestos de ARNi alterado se refieren como analogos o analogos de ARN de origen natural. El ARNi descrito en esta invencion solo necesita ser lo suficientemente similar al ARN natural para que tenga la capacidad de mediar en la interferencia del ARN. Como se usa en esta invencion, la frase "mediar en la interferencia de ARN" se refiere a, e indica la capacidad de distinguir que ARNm se va a ver afectado por la maquinaria o el proceso de interferencia de ARN.

El ARN que media la interferencia del ARN interactua con la maquinaria de interferencia del ARN, de manera que dirige la maquinaria para degradar los ARNm particulares o para reducir de otro modo la expresion de la protelna diana. En un aspecto de la descripcion, la presente solicitud describe moleculas de ARNi que dirigen la escision del ARNm especlfico al que corresponde su secuencia. No es necesario que haya una correspondencia perfecta de las secuencias, pero la correspondencia ha de ser suficiente para permitir que el ARNi dirija la inhibicion de la interferencia del ARN por escision o falta de expresion del ARNm diana.

[0050] Las moleculas de ARNi descrito en esta invencion pueden comprender una portion de ARN y alguna porcion adicional, por ejemplo, una porcion de desoxirribonucleotido. El numero total de nucleotidos en la molecula de ARN es adecuadamente inferior a 49 a fin de ser mediadores eficaces de la interferencia de ARN. En las moleculas de ARN preferidas, el numero de nucleotidos es de 16 a 29, mas preferentemente de 18 a 23, y lo mas preferentemente de 21-23.

[0051] Como se indico anteriormente, el termino "ARNi" incluye, entre otros, ARNips, ARNhcs, miARNs, ARNbcs y otras especies de ARN que se pueden escindir in vivo para formar ARNips.

[0052] Un "ARN de interferencia corta" o "ARNip" comprende un hlbrido de ARN (region bicatenaria) y puede comprender ademas uno o dos salientes de cadena sencilla, salientes en 3' o 5'.

[0053] Un "ARN de horquilla corta (ARNhc)" se refiere a un segmento de ARN que es complementario a una porcion de un gen diana (complementario a uno o mas transcritos de un gen diana), y tiene una estructura en horquilla (horquilla).

[0054] "MicroARNs" o "miARNs" son ARN codificados de manera endogena que tienen una longitud de aproximadamente 22 nucleotidos, que regulan post-transcripcionalmente los genes diana y generalmente se expresan en una forma altamente especlfica de tejido o etapa de desarrollo especlfica. Se puede disenar y expresar miARNs artificiales segun las caracterlsticas de los genes de miARN existentes. La arquitectura miR-30 (microARN 30) se puede usar para expresar miARNs (o ARNips) a partir de plasmidos de expresion basados en el promotor de la ARN polimerasa II (Zeng y col., 2005, Methods enzymol. 392:371-380). En algunos casos, las moleculas precursoras de miARN pueden incluir mas de una estructura en horquilla. Las multiples estructuras en horquilla se pueden enlazar entre si a traves de un enlazador, como, por ejemplo, un enlazador de acido nucleico, una secuencia flanqueante de miARN, otras moleculas o alguna combinacion de las mismas.

[0055] En un aspecto preferido de la descripcion, el ARNi comprende o consiste en un fragmento de al menos 10, 12, 15, 18 o 20 nucleotidos consecutivos de una secuencia de SEQ ID NO: 3 (5-AACCCGUCCGCGAUCUCCCGG-3'). Preferentemente, dicho acido nucleico es un ARNi que comprende o consiste en una secuencia de SEQ ID NO: 3. Lo mas preferentemente, dicho acido nucleico es un ARNip o un ARNhc. La secuencia de SEQ ID NO: 3 puede modificarse, y por ejemplo corresponder a una secuencia modificada de SEQ ID NO: 3 tal como una secuencia 5'-AACCCGUCCGCGAUCUCCCdGdG-3'.

[0056] Los acidos nucleicos empleados como moleculas antisentido o ARNi pueden modificarse, preferentemente modificarse qulmicamente, para aumentar la estabilidad y/o la eficacia terapeutica de los acidos nucleicos in vivo.

[0057] Por ejemplo, los oligonucleotidos pueden emplearse como derivados de fosforotioato (reemplazo de un atomo de oxlgeno que no una fosforilos con un atomo de azufre) que tienen una resistencia incrementada a la digestion por nucleasas. La modificacion de MOE (esqueleto ISIS) o modificacion con llpidos (esqueleto de Philippe Barthelemy) es tambien eficaz.

[0058] Adicional o alternativamente, algunas nucleobases de una molecula de ARNi pueden estar presentes como desoxirribosas. Esa modificacion solo debe afectar al esqueleto de la nucleobase, en el que el grupo hidroxilo esta ausente, pero no a la cadena lateral de la nucleobase, que permanece sin cambios. Dicha modificacion suele favorecer el reconocimiento del ARNi por el complejo DICER.

Usos terapeuticos de los antagonistas descritos en esta invencion

[0059] Los inventores han hallado que los ARNips y los oligonucleotidos antisentido que se dirigen a la TCTP inhiben la progresion resistente a la castracion de las celulas PC3, LNCaP y C4-2 y los xenoinjertos y potencian la sensibilidad a docetaxel y a la castracion. Por lo tanto, la presente solicitud describe un antagonista de TCTP, por ejemplo, un acido nucleico como se ha definido anteriormente, para su uso en el tratamiento o la prevencion del cancer, preferentemente un cancer hormonorresistente y/o quimiorresistente. La presente solicitud tambien describe un antagonista de TCTP para su uso en la restauracion de la sensibilidad a la terapia con hormonas y/o quimioterapia en un paciente que padece cancer.

[0060] La solicitud tambien describe un metodo para tratar o prevenir un cancer y/o para restaurar la sensibilidad a la terapia hormonal y quimioterapia que comprende la etapa que consiste en administrar una cantidad eficaz de un antagonista como se describe en esta invencion a un individuo en necesidad del mismo.

[0061] Como se usa en esta invencion, el termino "cancer" se refiere a cualquier tipo de tumor maligno (es decir, no benigno). El tumor puede corresponder a un tumor maligno solido, que incluye, por ejemplo, carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas, melanomas malignos, mesoteliomas, blastomas o cancer de sangre como leucemias, linfomas y mielomas. El cancer puede corresponder, por ejemplo, a un cancer de prostata avanzado, un cancer de pancreas, un cancer de vejiga, un cancer de ovario, un cancer de testlculo, un adenoma cortical, un cancer de colon, un cancer colorrectal, un cancer de mama o un cancer de hlgado.

[0062] Los canceres que se tratan preferentemente como se describe en esta invencion son aquellos en los que la TCTP se expresa a niveles mas altos en celulas cancerosas que en celulas no cancerosas del mismo tipo de tejido. Ejemplos de estos canceres incluyen, sin limitacion, cancer de prostata, cancer de colon, cancer colorrectal, cancer de mama, cancer de hlgado, eritroleucemia, gliomas, melanomas, hepatoblastomas y linfomas.

[0063] Se cree que los antagonistas descritos en esta invencion son capaces de retrasar o prevenir la emergencia de un fenotipo resistente independiente de hormonas, y de ser capaces de revertir un fenotipo resistente independiente de hormonas. Por lo tanto, son particularmente adecuados para su uso en el tratamiento de un cancer independiente de hormonas o de un cancer dependiente de hormonas en el que se espera que ocurra la independencia hormonal. El termino "castracion" en la expresion "resistente a la castracion" o "independencia a la castracion" segun la invencion se refiere a "hormona" y corresponde a "resistente a hormonas" o "independencia hormonal". Independencia androgenica se refiere a una independencia hormonal. De hecho, un cancer de prostata independiente de androgenos (CPIA) es un cancer de prostata resistente a la castracion (CPRC).

[0064] Por lo tanto, una realizacion preferida descrita en esta invencion esta dirigida a un antagonista descrito en esta invencion para su uso en el tratamiento o la prevencion de un cancer independiente de hormonas o resistente a la quimioterapia.

[0065] Dado que los antagonistas descritos en esta invencion son capaces de restaurar la sensibilidad a los farmacos, son particularmente adecuados para su uso en el tratamiento de canceres avanzados o canceres resistentes a la quimioterapia. Los antagonistas descritos en esta invencion se pueden usar notablemente como una terapia de segunda ifnea.

[0066] El experto en la materia es capaz de determinar si un cancer es un cancer "avanzado" usando metodos de clasificacion bien conocidos, como por ejemplo el grado o la clasificacion TNM. Por ejemplo, se puede usar el grado (G1-4) de las celulas cancerosas. Mas especlficamente, las celulas cancerosas son de "bajo grado" si parecen similares a las celulas normales, y de "alto grado" si parecen poco diferenciadas. Por ejemplo, los canceres G3 o G4 se clasificarlan como canceres avanzados. Adicional o alternativamente, se puede usar la clasificacion TNM. En esta clasificacion, T(a, es, (0), 1-4) indica el tamano o extension directa del tumor primario, N(0-3) indica el grado de propagation a los ganglios linfaticos regionales, y M(0/1) indica la presencia de metastasis. Por ejemplo, un cancer T4/N3/M1 se clasificarla como un cancer avanzado.

[0067] Lo mas preferentemente, el cancer es un cancer de prostata, por ejemplo, un cancer de prostata avanzado y/o un cancer de prostata independiente de androgenos. En una realizacion especlfica, los canceres de prostata dependientes de androgenos pueden excluirse del alcance de los canceres a tratar descritos en esta invencion.

[0068] Los inventores han descubierto ademas que los oligonucleotidos antisentido descritos en esta invencion potenciaron los efectos antineoplasicos de la quimioterapia con docetaxel tanto in vitro como in vivo. En particular, se cree que los antagonistas descritos en esta invencion son capaces de revertir un fenotipo resistente a ia castracion y de restaurar ia sensibilidad a ios farmacos. Por lo tanto, el antagonista descrito en esta invencion puede usarse ventajosamente (simultanea o secuencialmente) en combination con al menos un segundo agente antineoplasico (por ejemplo, en el marco de una quimioterapia).

[0069] En particular, el antagonista descrito en esta invencion se puede usar en el marco de una quimioterapia de combinacion. El antagonista descrito en esta invencion puede usarse, por ejemplo, (simultanea o secuencialmente) en combinacion con al menos uno de los siguientes agentes antineoplasicos:

- un agente antimitotico tal como docetaxel, vincristina, paclitaxel (taxol), vinorelbina y abraxane;

- un farmaco de terapia hormonal, tales farmacos se usan comunmente en el marco del tratamiento de los canceres sensibles a las hormonas. Los farmacos de terapia hormonal incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, agonistas y antagonistas de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), antagonista del receptor de androgenos (RA) y antagonistas del receptor de estrogenos (RE);

- un agente alquilante tal como ciclofosfamida, clorambucil y melfalan;

- un antimetabolito tal como metotrexato, citarabina, fludarabina, 6-mercaptopurina y 5-fluorouracilo;

- un inhibidor de la topoisomerasa tal como doxorrubicina, irinotecan, derivados de platino, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino;

- un inhibidor de la aromatasa tal como bicalutamida, anastrozol, examestano y letrozol;

- un inhibidor de la serialization tal como imatinib (Gleevec), gefitinib y erlotinib;

- un anticuerpo monoclonal tal como rituximab, trastuzumab (herceptina) y gemtuzumab ozogamicina;

- un modificador de respuesta biologica tal como interferon-alfa;

- un agente diferenciador tal como tretinolna y trioxido de arsenico; y/o

- un agente que bloquea la formation de vasos sangulneos (agentes antiangiogenicos) como bevicizumab, serafinib y sunitinib.

[0070] Ademas, el metodo para tratar o prevenir un cancer descrito en esta invencion puede estar asociado con una radioterapia, cirugla y/o supresion de androgenos.

[0071] La administration de antagonistas descritos en esta invencion, y en particular de oligonucleotidos antisentido y de ARNis, puede llevarse a cabo usando diversos mecanismos conocidos en la tecnica, incluyendo administracion pura y administracion en vehlculos lipldicos farmaceuticamente aceptables o nanopartlculas. Por ejemplo, los vehlculos lipldicos para administracion antisentido se describen en las patentes de EE.UU. n.° 5.855.911 y 5.417.978.

[0072] Pueden administrarse, por ejemplo, por via intravenosa, intraperitoneal, subcutanea u oral, o inyeccion tumoral local directa.

[0073] El antagonista se administra en una "cantidad eficaz", es decir, en una cantidad suficiente para tratar o prevenir el cancer. Se apreciara que esta cantidad variara tanto con la efectividad de los oligonucleotidos antisentido u otro agente terapeutico empleado, como con la naturaleza de cualquier vehlculo usado. La determination de las cantidades apropiadas para cualquier composition dada esta dentro de la experiencia en la tecnica, a traves de series estandar de pruebas disenadas para evaluar los niveles terapeuticos apropiados.

[0074] Como se describe en esta invention, el individuo es preferentemente un individuo humano. Sin embargo, tambien se contempla el uso veterinario del antagonista descrito en esta invencion. Por ende, el individuo tambien puede corresponder a un individuo no humano, preferentemente un mamlfero no humano.

[0075] El termino "tratamiento" se refiere a un metodo terapeutico, es decir, un metodo destinado a curar, mejorar la afeccion y/o prolongar el periodo de la vida de un individuo que padece cancer.

[0076] Por "prevention" se entiende un metodo profilactico, por ejemplo, con el objetivo de reducir el riesgo de recalda y/o reducir el riesgo de aparicion de una independencia de hormonas.

[0077] El cancer de prostata es un cancer que sobreexpresa TCTP en canceres avanzados, y en particular en canceres que se han vuelto resistentes a la castration. Para el tratamiento del cancer de prostata, los antagonistas descritos en esta invencion se administran adecuadamente despues de la supresion inicial de androgenos. El inicio de la supresion de androgenos se puede realizar mediante la castracion quirurgica (extirpation de ambos testlculos) o medica (supresion de testosterona inducida por farmacos), que actualmente esta indicada para el tratamiento del cancer de prostata. La castracion medica puede lograrse mediante diversos reglmenes, incluidos los agentes de LHRH o antiandrogenos (vease por ejemplo Cleave y col., 1999, CMAJ 160:225-232). La terapia intermitente en la que se puede realizar la supresion reversible de androgenos se describe en Cleave y col. (1998, Eur. Urol. 34:37-41).

[0078] La inhibicion de TCTP, en particular de la expresion de TCTP por los acidos nucleicos descritos en esta la invencion, puede ser transitoria. Para el tratamiento del cancer de prostata, la inhibition de la TCTP deberla ocurrir idealmente junto con la supresion de androgenos. En los seres humanos, esto significa que la inhibicion de la TCTP debe ser eficaz a partir de uno o dos dlas de la supresion de androgenos (antes o despues) y extenderse durante aproximadamente 3 a 6 meses. Esto puede requerir multiples dosis para llevarlo a cabo. Se apreciara, sin embargo, que el periodo de tiempo puede ser mas prolongado, comenzando antes de la castracion y ampliandose durante un tiempo sustancial despues sin apartarse del alcance descrito en la invencion.

Composiciones farmaceuticas descritas en esta invencion

[0079] La presente solicitud tambien describe una composicion farmaceutica que comprende un antagonista descrito en esta invencion, en particular un acido nucleico descrito en esta invencion como se define en el parrafo anterior, y un vehlculo farmaceuticamente aceptable, as! como un antagonista descrito en esta invencion para su uso como un medicamento.

[0080] Las composiciones farmaceuticas formuladas de una manera adecuada para la administration de acidos nucleicos son conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, los vehlculos lipldicos (en particular liposomas) son vehlculos farmaceuticamente aceptables particularmente adecuados cuando se administra un acido nucleico descrito en esta invencion.

[0081] Los ejemplos no limitantes de vehlculos farmaceuticamente aceptables adecuados para la formulation con el acido nucleico descrita en esta invencion incluyen: acidos nucleicos conjugados con PEG, acidos nucleicos conjugados con fosfollpidos, acidos nucleicos que contienen restos lipofilos, fosforotioatos, inhibidores de la glicoprotelna P (tales como Pluronic P85) que pueden mejorar la entrada de farmacos en diversos tejidos, pollmeros biodegradables (como microesferas de poli(DL-lactida-coglicolido)) para la administracion de liberation sostenida despues del implante, y nanopartlculas cargadas (como las hechas de polibutilcianoacrilato).

[0082] La solicitud tambien describe una composicion farmaceutica que comprende liposomas modificados en la superficie que contienen llpidos de poli(etilenglicol) (modificados con PEG, ramificados y no ramificados o combinaciones de los mismos, o liposomas de circulation larga o liposomas sigilosos). Los acidos nucleicos descritos en esta invencion tambien pueden comprender moleculas de PEG unidas covalentemente de diversos pesos moleculares. Estas formulaciones ofrecen un metodo para aumentar la acumulacion de farmacos en los tejidos diana. Esta clase de vehlculos farmacologicos resiste la opsonization y la elimination por el sistema fagocltico mononuclear (MPS o RES), lo que permite tiempos de circulacion sangulnea mas largos y una mayor exposition al tejido para el farmaco encapsulado (Lasic y col., 1995, Chem. Rev., 95:2601-2627; Ishiwata y col., 1995, Chem. Pharm. Bull., 43:1005-1011). Se ha demostrado que tales liposomas se acumulan selectivamente en tumores, presumiblemente por extravasation y captura en los tejidos diana neovascularizados (Lasic y col., 1995, Science, 267:1275-1276; Oku y col., 1995, Biochim. Biophys Acta, 1238:86-90). Los liposomas de circulacion prolongada mejoran la farmacocinetica y la farmacodinamica del ADN y el ARN. Tambien es probable que los liposomas de circulacion prolongada protejan a los farmacos de la degradacion de las nucleasas en mayor medida que los liposomas cationicos.

[0083] La composicion farmaceutica descrita en esta invencion puede comprender estabilizadores, tampones y similares. Cuando se desea usar un mecanismo de administracion de liposomas, pueden seguirse protocolos estandar para la formacion de liposomas. Las composiciones descritas en esta invencion pueden formularse y usarse como comprimidos, capsulas o elixires para administracion oral, supositorios para administracion rectal, soluciones esteriles o suspensiones para administracion inyectable.

[0084] La eleccion de la formulacion depende en ultima instancia de la forma de administracion prevista, tal como por ejemplo una forma de administracion intravenosa, intraperitoneal, subcutanea u oral, o una administracion local mediante inyeccion tumoral. Preferentemente, la composicion farmaceutica descrita en esta invencion es una solucion o suspension, por ejemplo, una solucion o suspension inyectable. Puede, por ejemplo, envasarse en forma de dosificacion unitaria.

[0085] Aunque tienen significados distintos, los terminos "que comprende", "que tiene", "que contiene" y "que consiste en" pueden reemplazarse entre si a lo largo de la descripcion anterior.

[0086] Como se describe en esta invencion, todos los compuestos, polipeptidos y peptidos se pueden aislar y/o purificar opcionalmente.

[0087] La invencion se evaluara mas a fondo en vista de los siguientes ejemplos y figuras.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

[0088]

La Figura 1 ilustra el nivel de expresion de TCTP despues de la supresion de androgenos.

La Figura 2 ilustra el nivel de expresion de TCTP en la regulacion positiva o negativa de Hsp27.

La Figura 3 ilustra el efecto de la expresion de TCTP en la viabilidad celular de control de LNCaP y Hsp27. La Figura 4 muestra la expresion de la protelna TCTP en celulas PC3 transfectadas con ARNip o OAS de TCTP. La Figura 5 ilustra el efecto de la inhibicion de TCTP sobre la viabilidad de las celulas PC-3.

Las Figuras 6 y 7 ilustran la tasa de celulas PC-3, LNCaP y C4-2 apoptoticas despues de la inhibicion de TCTP. La Figura 8 ilustra la actividad antineoplasica de OAS de TCTP en el volumen de tumor xenoinjertado con PC3 (panel superior) y su actividad aditiva con docetaxel (panel inferior).

La Figura 9 ilustra el efecto del tratamiento con OAS de TCTP sobre el crecimiento del tumor PC-3 y la quimiosensibilidad a docetaxel in vivo.

Las Figuras 10 y H ilustran el efecto del tratamiento con OAS de TCTP sobre el crecimiento del tumor LNCaP in vivo despues de la castracion.

La Figura 12 ilustra el impacto de un ARNip de TCTP en la proliferacion y apoptosis de las celulas PC3.

La Figura 13 ilustra el impacto de un OAS de TCTP en la proliferacion y apoptosis de las celulas PC3.

La Figura 14 ilustra la semivida de TCTP despues del tratamiento con cicloheximida (A) y el porcentaje de celulas PC-3 que van a apoptosis despues del tratamiento con OAS de TCTP.

La Figura 15 ilustra el efecto de la inhibicion de TCTP en la viabilidad de las celulas LNCaP y C4-2.

La Figura 16 ilustra la capacidad de los mutantes N-terminal o C-terminal de Hsp27 para interactuar con TCTP. La Figura 17 ilustra la capacidad de los mutantes de fosforilacion de Hsp27 para interactuar con TCTP.

BREVE DESCRIPCION DE LAS SECUENCIAS

[0089]

La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de la protelna TCTP humana.

La SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 17 a la SEQ ID NO: 40 muestran secuencias de OAS; las secuencias SEQ ID NO: 2, SEQ ID nO: 14 y SEQ ID NO: 15 son secuencias de OAS de TCTP descritas en esta invencion.

La SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de un ARNip de TCTP descrita en esta invencion.

La SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de un oligonucleotido aleatorio que se ha usado como control.

La SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de un ARNm de TCTP humano. Se indican las regiones a las que se dirige por OAS de TCTP de la SEQ ID NO: 2 y por ARNip de TCTP de la SEQ ID NO: 3.

Las sEq ID Nos. 6 a 13 muestran las secuencias de cebadores usados en los Ejemplos.

La SEQ ID NO: 16 secuencia de protelna Hsp27

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Materiales y metodos

Acidos nucleicos

[0090] La secuencia conocida de ARNm de TCTP humana (numero de acceso en la base de datos de NCBI: NM-003295) sirvio como base para el diseno de oligonucleotidos antisentido (OAS) e inhibidores de nucleotidos de ARN de interferencia pequena (ARNip). El OAS de fosforotioato fue obtenido por Eurofins MWG Operon (Alemania). Los OAS preferidos tienen las secuencias 5'-ACCAATGAGCGAGTCATCAA-3' (SEQ ID nO: 2), 5'-AACTTGTTTCCTGCAGGTGA-3' (SEQ ID NO: 14) y 5-TGGTTCATGACAATATCGAC-3' (SEQ ID NO: 15). Se uso un oligonucleotido aleatorio 5'-c Gt GTAGGTACGGCAGATC-3' (SEQ ID NO: 4) como control. La secuencia del ARNip de TCTP fue 5'-AACCCGUCCGCGAUCUCCCdGdG-3' (es decir, una secuencia de SEQ ID NO: 3 en la que las dos guanosinas C-terminales son desoxirribosas. Esta modificacion solo afecta al esqueleto de la nucleobase, en el que el grupo hidroxilo esta ausente, pero la cadena lateral permanece inalterada). Este ARNip y sus respectivos ARNip aleatorios validados, usados como control para los experimentos del ARNip, se obtuvieron en Qiagen (Francia).

Estirpes celulares y condiciones de cultivo celular.

[0091] La estirpe celular de cancer de prostata RC PC-3 se adquirio en la American Type Culture Collection (Rockville, MD, EE. UU.). Las celulas se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia), suplementado con un 10 % de suero fetal bovino (FCS). Las celulas LNCaP de la estirpe celular del cancer de prostata sensible a la castracion humana (SC) fueron proporcionadas amablemente por la Universidad de Virginia (Charlottesville, VA, EE. UU.), la estirpe celular del cancer de prostata humano RC C4-2 fue realizada por el Dr. Martin Gleave (The Prostate Center, Vancouver, Canada) y la estirpe celular de prostata normal PNT2C2 fue proporcionada amablemente por el York Cancer Research (Universidad de York, York, Reino Unido). Esas celulas se mantuvieron en RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con FCS al 10 %. Las celulas REG del cancer colorrectal fueron proporcionadas amablemente por la Dra. Carmen Gamido (INSERM U-517, Facultad de Medicina y Farmacia, Dijon, Francia) y se mantuvieron en medio F10 (Invitrogen) suplementado con FCS al 10 %.

Infeccion lentiviral de Hsg27 en celulas LNCaP.

[0092] El ADNc de longitud completa para Hsp27 humana se subclono en el vector lentiviral pHR'-CMV-EGFP en los sitios BamHI y XhoI como se describio anteriormente (Rocchi y col., 2005, Cancer Res, 65:11083­ 11093).

Medio de levadura con sistema de reclutamiento Sos (SRS)

[0093] Las celulas de levadura se cultivaron para la transformacion en medio YPAD (levadura peptona adenina) (1 % de extracto de levadura, 2 % de bactopeptona, 2 % de dextrosa, 40 mg de sulfato de adenina, 40 % de glucosa por litro). El medio de selection (perdida) consistio en 1,7 g/l de base de nitrogeno de levadura sin aminoacidos, 5 g/l de sulfato de amonio, 20 g/l de dextrosa, aminoacidos y suplementos adicionales segun lo sugerido por el fabricante (Stratagene, Palo Alto, Estados Unidos). El medio de galactosa se preparo sustituyendo glucosa con 20 g/l de galactosa y 10 g/l de rafinosa. El medio solido se preparo anadiendo agar al 1,7 % antes de la autoclave.

Detection del sistema de reclutamiento Sos de dos hibridos de levadura (SRS).

[0094] Se uso el sistema de doble hlbrido de levadura SRS de Stratagene (CytoTrap) para identificar los interactores de la protelna Hsp27. Para esto, la Hsp27 humana se fusiono con los residuos 1070 N-terminales de Sos humanos y se uso como cebo. Se identifico selectivamente una biblioteca de ADNc de plasmidos de testlculo y una biblioteca de ADNc de HeLa de cancer de cuello uterino, cada una de ellas construida en el vector pMyr (Stratagene) con 4,5 x 106 colonias primarias y un tamano de insertion promedio de 1,7 kb segun las instrucciones del fabricante. Todas las transformaciones de levadura se realizaron usando el metodo estandar de acetato de litio. Para la deteccion de CytoTrap, la cepa de levadura cdc25H se cotransformo con 20 mg del plasmido de biblioteca pMyr-ADNc y 20 mg del plasmido recombinante pSos-cebo. Los transformantes (5 x 106) se identificaron selectivamente para cada protelna de cebo. Los transformantes resultantes se cultivaron durante 3 dlas a una temperatura permisiva (24 °C) en un medio de seleccion que contenla glucosa y suplementos adicionales, excluyendo leucina y uracilo (SC-Leu-Ura). Despues del sembrado en placas de la replica de galactosa mlnimas selectivas, las colonias que mostraron un crecimiento bajo temperatura restrictiva (37 °C) se consideraron clones positivos. Las colonias se parchearon en medio que contenla glucosa y se cultivaron a 24 °C durante 2 dlas. Luego se sembraron en placas de glucosa y galactosa y se cultivaron a 37 °C. Se seleccionaron colonias que muestran crecimiento solo en galactosa y no en medio de glucosa y se confirmaron como verdaderos positivos mediante una segunda ronda de deteccion. Estos clones se cultivaron en medio llquido, la pared celular de la levadura se rompio mediante agitation en vortex con perlas de vidrio (Sigma) y los plasmidos se aislaron con el kit Miniprep de Wizard Plus SV (Promega). Se usaron 5 pl de la preparation del plasmido para cada reaction de PCR usando GoTaq (Promega) y los cebadores especlficos del vector pMyr (5'-AACCCCGGATCGGACTACTA-3', SEQ ID NO: 6; 5’-AATAAGCTCTAGAGGGCCGC-3’ inversa, SEQ ID N^o : 7). La presencia de un solo amplicon se confirmo mediante electroforesis en gel de agarosa y la secuenciacion se llevo a cabo mediante el servicio de secuenciacion Genome Express (http://www.cogenics.com/). La identificacion de las secuencias del inserto se realizo mediante busquedas en la base de datos usando el Servicio BLAST de NCBI (Altschul y col., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-402).

Analisis de membrana Western.

[0095] El analisis de membrana Western se realizo como se describio anteriormente (Rocchi y col., 2004, Cancer Res. 64:6595-602) con anticuerpo policlonal anti-Hsp27 de conejo 1:5000 (Assay Designs, Villeurbanne, Francia), anticuerpo policlonal de TCTP de conejo 1:2000 (Abcam Inc., Cambridge, Reino Unido), anticuerpo policlonal anti-MSL1v1 de conejo 1:250 (Abcam Inc.), anticuerpo monoclonal anti-ubiquitina de raton 1:500 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Heidelberg, Alemania) o anticuerpo policlonal anti-caspasa-3 de conejo 1:1000 (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, EE. UU.). Los niveles de carga se normalizaron usando anti-gliceraldehldo-3-fosfato deshidrogenasa policlonal de conejo 1:5000 (Abcam Inc.) o anticuerpos monoclonales anti-vinculina de raton 1:2500 (Sigma Chemical Co., St. Louis, ^m O, EE. UU.).

Construccion de TMA.

[0096] La expresion de TCTP se evaluo en 2 micromatrices de tejidos diferentes (TMA) de muestras antes y despues de la terapia de castracion (TC) (o terapia de homonas, TH). La primera TMA se realizo en Marsella por S. Giusano con diferentes muestras de prostata no tratadas (n = 131) que incluyeron 20, 56, 10 y 5 adenocarcinomas de prostata (ADK) con una puntuacion de Gleason de 6, 7, 8 y 9 respectivamente, 16 de tejidos normales de prostata, 6 lesiones por neoplasia intraepitelial prostatica (PIN), 12 hiperplasias benignas de prostata (BPH) y 6 controles negativos (placenta). Se perforaron dos nucleos por grado de Gleason (es decir, 2, 4 o 6 nucleos por paciente) con un total de 330 nucleos. Se tomaron muestras de los nucleos usando un matrizador de tejidos (Alphelys, Plaisir, Francia). Los cilindros centrales de 0,6 mm de diametro perforados desde el bloque donador se depositaron en el bloque de parafina del receptor. Las secciones de TMA (4 pm de espesor) se cortaron 24 horas antes del procesamiento inmunohistoqulmico. La segunda TMA fue realizada por L. Fazli en Vancouver e incluyo tejidos de prostata tratados con castracion (TC) o tratados con hormonas (TH) (n = 232) obtenidos del banco de tejidos en el Departamento de Patologla y Laboratorio de Investigacion de Prostata en el Jack Bell Research Centre en el Hospital General de Vancouver. La mayorla de los tejidos procedlan de especlmenes de prostatectomla radical, mientras que los tejidos RC se obtuvieron de resecciones transuretrales. Los especlmenes se eligieron para representar varias duraciones del tratamiento de la terapia de supresion de androgenos antes de la prostatectomla radical que va de la ausencia de tratamiento (n = 35), de 0 a 3 meses (n = 58), de 3 a 6 meses (n = 52) y de 6 meses (n = 57). Tambien se identificaron tumores RC (n = 30). Este TMA se construyo usando un micromatrizador de Beecher de prostatectomla radical y muestras transuretrales (Beecher Instruments, Silver Spring, MD). Cada muestra de paciente se represento con 3 nucleos en la TMA.

Analisis de micromatrices de tejidos.

[0097] La primera TMA se analizo como se describio anteriormente (Charpin y col., 2009, Int J Oncol 34:983­ 93; Charpin y col., 2009 Int J Cancer 124:2124-34; Garcia y col., 2007, Hum Pathol 38:830-41) con anticuerpo anti-TCTP 1:100 (Abcam). Y el segundo analisis de TMA se realizo como se describio anteriormente (Rocchi y col., 2004, Cancer Res. 64:6595-602) con un anticuerpo anti-TCTP 1:50 (Abcam).

Procedimiento de analisis de imagen.

[0098] El analisis de imagenes se uso para la cuantificacion de la inmunohistoqulmica. El primer analisis de TMA con el dispositivo automatizado SAM^bA 2050 (SAMBA Technologie/TRIBVN, Chatillon 92320, Francia) se realizo como se describio anteriormente (Charpin y col., 1998, J Pathol 184:401-7; Altman y col., 1994, J Natl Cancer Inst 86:829-35; Charpin y col., 2009, Int J Oncol 34:983-93; Charpin y col., 2009 Int J Cancer 124:2124-34; Garcia y col., 2007, Hum Pathol 38:830-41). Para la segunda TMA, se tomaron fotomicrograflas a traves de un microscopio Leica DMLS acoplado a una camara digital (Photometrics CoolSNAP, Roper Scientific, Inc., Glenwood, IL) como se describio anteriormente (Rocchi y col., 2004, Cancer Res. 64:6595-602).

Inmunofluorescencia.

[0099] Las celulas de control LNCaP y Hsp27 se cultivaron en cubreobjetos de vidrio en medios RPMI y suero fetal bovino al 10 % durante 24 h. Posteriormente, las celulas se fijaron con paraformaldehldo al 4 % frlo durante 10 minutos a 25 °C y se permeabilizaron en Triton X-100 al 0,05 % en PBS. Los portaobjetos se incubaron en solucion de bloqueo de albumina de suero bovino al 1 % en PBS durante 30 minutos y se trataron con anticuerpos primarios Hsp27 monoclonal de raton (StressGen) y policlonal TCTP de conejo (Abcam) simultaneamente durante la noche. Los anticuerpos fluorescentes secundarios de cabra anti-raton Alexa Fluor 546 (Invitrogen) y cabra anti-conejo Alexa Fluor 488 (Invitrogen) se agregaron durante 1 hora a temperatura ambiente con 35 minutos de lavado en PBS. Las preparaciones se montaron con medios de montaje vectashield 4,6-diamidino-2-fenilindol fluorescentes (Vector Laboratories, Clinisciences, Montrouge, Francia). Las imagenes se capturaron usando un plano de microscopio confocal de fluorescencia Zeiss 510 META 63X/1.4 (Le Pecq, Francia), seguido de un analisis de colocalizacion focal realizada con el software Image Proplus 6 (MediaCybernetics, Wokingham, Reino Unido) con una asignacion de amarillo para focos colocalizados y verde o rojo como no colocalizacion.

Inmunoprecipitacion

[0100] Se usaron lisados aclarados (250 pg) con concentration de protelna ajustada (ensayo de protelnas, Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, Francia) para la inmunoprecipitacion (IP) con anticuerpos de conejo anti-TCTP 1:50 (Abcam) O/N a 4 °C. Los complejos inmunitarios se precipitaron despues de 1 h de incubation con 30 ml de perlas de inmunoglobulina anti-conejo TrueBlot (eBiosciences, Paris, Francia). Despues de lavar tres veces en tampon de lisis frlo, los complejos se volvieron a suspender en tampon de muestra de protelna (Bio-Rad) y se hirvieron durante 5 minutos antes de realizar la membrana Western como se describio anteriormente. Se uso el anticuerpo secundario IgG anti-conejo de True Blot (Biosciences) para revelar la membrana Western.

Analisis de la expresion de ARNm de TCTP.

[0101] El analisis de la reaction en cadena de la polimerasa con transcription inversa cuantitativa (qRT-PCR) se realizo en un sistema de detection LightCycler (Roche Applied Science, Meylan, Francia). Los niveles de expresion de la subunidad 18S del gen ribosoma se usaron como control interno. El ADNc de primera hebra se sintetizo a partir de 1 pg de ARN total usando hexameros aleatorios y se expandio por transcriptasa inversa segun las instrucciones del fabricante (Sistema de transcripcion inversa ImProm-II, Promega, Charbonnieres-les-Bains, Francia), posteriormente se diluyo 1:10 con agua, y se almaceno a -20 °C hasta su uso. TCTP y los productos de la reaccion en cadena de la polimerasa 18S (PCR) se detectaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) usando la premezcla SYBR Ex Taq (Takara Bio Inc., St Germain en Laye, Francia) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se mezclaron cinco microlitros de plantilla de ADNc diluido con 10 pl de premezcla SYBR Ex Taq (incluida la polimerasa Taq, tampon de reaccion, MgCl2, colorante SYBR verde I y mezcla de trifosfato de desoxinucleotido) y cebadores directos e inversos 0,4 pM, en un volumen final de 20 pl. Se usaron los siguientes cebadores: 5-GAAAGCACAGT AAT CACT GGTGT-3' directo de TCTP (SEQ ID NO: 8) y 5'-GCAGCCCCTGTCATAAAAGGT-3' inverso de TCTP; (SEQ ID NO: 9); 5'-CTACCACATCCAAGGAAGGC-3' directo de 18S (SEQ ID NO: 10) y 5'-TTTTCGTCACTACCTCCCCG-3' inverso de 18S (SEQ ID NO: 11). Despues de una activation inicial de Taq durante 10 segundos a 95 °C, se realizo PCR Light Cycler usando 55 ciclos con las siguientes condiciones de ciclado: 95 °C durante 5 segundos, 58 °C durante 7 segundos y 72 °C durante 14 segundos. Cada muestra se analizo por duplicado y el experimento se repitio tres veces. Los resultados se analizaron usando el software de analisis de datos RealQuant (Roche, Neuilly-sur-seine, Francia). El analisis de los resultados se realizo con el metodo 2(-Delta Delta C(T)) (Livak K J. y col., 2001; Methods. 25:402-8).

Oligonucleotidos antisentido (OAS) y secuencias de ARN de interferencia corta (ARNip).

[0102] OAS 2'-0-(2-metoxietil), OGX-427, se obtuvo de OncoGenex. La secuencia de OGX-427 corresponde al sitio de inicio de la traduction de Hsp27 humana (5'-GGGACGCGG-CGCTCGGTCAT-3') (SEQ ID NO: 12). Se uso un OAS apareado (OAS; 5'-CAGCAGCAGAGTATTTATCAT-3') (SEQ ID NO: 13) como control. El AOS fosforitioato de TCTP que se dirige a la TCTP humana (5'-ACCAATGAGCGAGTCATCAA-3') (SEQ ID NO: 2) y el oligonucleotido de control (5'-CGTGTAGGTACGGCAGa Tc -3') (SEQ ID NO: 4) se adquirieron en Operon (Eurofin MWG, Courtaboeuf, Francia) y TCTP de OAS disenado u OAS aleatorio. El ARNip de TCTP (5'-AACCCGUCCGCGAuCuCcCdGdG-3') (es decir, una secuencia de SEQ ID NO: 3 en la que las dos guanosinas C-terminales son desoxirribosas. Esta modification solo afecta al esqueleto de la nucleobase, en la que el grupo hidroxilo esta ausente, pero la cadena lateral permanece inalterada) se valido y se compro en Qiagen (Courtaboeuf, Francia). El ARNip de control tambien fue de Qiagen.

Tratamiento de las celulas con OAS y ARNip.

[0103] Las celulas se sembraron en placas a una densidad de 25.000 (PC-3) y 75.000 (LNCaP y C4-2) en 1,9 cm2 y se trataron el dla despues con el ARNip u OAS indicado durante 1 o 2 dlas respectivamente. La oligofectamina, un llpido cationico (Invitrogen), se uso para aumentar la captation de ARNip u ^oA^s en las celulas. Las celulas se trataron con las concentraciones indicadas de ARNip u OAS despues de una preincubacion durante 20 minutos con 3 mg/ml de oligofectamina en OPTI-MEM sin suero (Invitrogen). Cuatro horas mas tarde, se anadio 1 ml de FCS en el medio. Para estudiar los efectos sobre las tasas de degradation del proteasoma de TCTP, se agregaron cicloheximida (10 pg/ml) y MG132 (10 pmol/l) al final de la segunda transfection con OAS en medio reemplazado durante 24, 48 y 72 h.

Transfeccion transitoria de TCTP en celulas C4-2 y LNCaP.

[0104] Las celulas se transfectaron el dla despues de la siembra con el vector pcDNA 3.2/V5-DEST (Invitrogen) que contenla TCTP ts (pDEST-TCTP) o un vector de control vaclo (pDEST-control). El reactivo de transfeccion FuGENE HD (Promega) se uso para transfectar el ADN en las celulas C4-2 y LNCaP. El ADN se diluyo en OPTI-MEM libre de suero (Invitrogen) a 0,02 pg/pl y se anadio el reactivo FuGENE HD usando la relacion 7:2. Despues de 30 minutos de incubacion a temperatura ambiente, el complejo de transfeccion se anadio a las celulas gota a gota.

Ensayo mitogenico in vitro.

[0105] Se evaluaron los efectos in vitro de la regulation negativa de Hsp27 y TCTP, especialmente usando regulation positiva de ARNip u OAS o TCTP en la apoptosis inducida por docetaxel y supresion de androgenos, usando el ensayo de cristal violeta para LNCaP o C4-2 y el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol de 2-il)-2,5-difenil tetrazolio (MTT) para PC-3 como se describio anteriormente (Rocchi y col., 2004, Cancer Res. 64:6595-602; Gleave y col., 1999, Clin Cancer Res 5:2891-8). En resumen, las celulas se sembraron en cada pocillo de placas de microtitulacion de 12 pocillos (30.000 a 50.000 celulas por pocillo) y se dejaron unir durante la noche. Para estudiar el efecto de la regulacion negativa de la TCTP sobre la apoptosis inducida por docetaxel, las celulas PC-3 se transfectaron transitoriamente el dla despues de la siembra con 5 nM de ARNip de TCTP durante 48 horas o 100 nM de OAS de TCTP durante 72 horas. Luego se trataron las celulas con 50 nM de docetaxel y se realizaron ensayos de MTT despues de 24 h. Para evaluar el efecto de la regulacion negativa de TCTP en la citoproteccion de Hsp27, las celulas de control LNCaP y -Hsp27 se transfectaron transitoriamente el dla despues de la siembra con 5 nM de ARNip de TCTP durante 48 h. La regulacion negativa o positiva del efecto de TCTP en la viabilidad de las celulas LNCaP y C4-2 se realizo despues de las transfecciones transitorias con 100 nM de OAS de TCTP o 0,02 pg/pl de pDEST-TCTP durante 72 h y 48 h, respectivamente. Las celulas se trataron luego con 1 nM de docetaxel en medios sin suero (imita la supresion de androgenos in vitro) y los ensayos de cristal violeta se realizaron al dla siguiente. Cada ensayo se realizo por triplicado.

Analisis citometrico de flujo.

[0106] La citometrla de flujo de los nucleos tenidos con yoduro de propidio se realizo como se describio anteriormente (Rocchi y col., 2004, Cancer Res. 64:6595-602). En resumen, las celulas PC-3 se sembraron en placas a la densidad de 106 celulas en placas de 10 cm en DMEM suplementado con 10 % de FCS. Para evaluar el efecto de la inhibition de la TCTP sobre la apoptosis y el ciclo celular, las celulas se trataron el dla despues de la siembra con 5 nM de TCTP de ARNip o control y 100 nM de TCTP de OAS o control aleatorio durante 48 h. Las celulas se trataron luego con 50 nM de docetaxel. Despues de 24 h, las celulas se analizaron para determinar el contenido relativo de ADN en un citometro de flujo de laser dual (FACSCalibur, Becton Dickinson Biosciences, Le Pont de Claix, Francia). Cada ensayo se realizo por triplicado.

Ensayo de viabilidad por Cell Countess.

[0107] Las celulas PC-3 se trataron con 70, 100 o 200 nM de OAS de TCTP o control. 3 dlas despues, las celulas se recolectaron, se combinaron con 10 pl de azul de tripano y se contaron con Countess de Invitrogen. La viabilidad, la concentration celular y el tamano se registraron para cada muestra siguiendo las instrucciones del fabricante.

Evaluation del crecimiento de tumores in vivo.

[0108] Aproximadamente 3,106 celulas PC-3 y 10,106 celulas LNCaP se inocularon por via subcutanea con 0,1 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (Invitrogen) suplementado con FCS al 10 % para PC-3 o con 0,1 ml de Matrigel (BD Biosciences Discovery Labware) para LNCaP en la region del flanco de ratones desnudos atlmicos macho de 4 semanas de edad (Charles River, L'Arbresle, Francia) a traves de una aguja de calibre 23. Cuando los tumores de PC-3 alcanzaron 50 mm3, generalmente 3 a 4 semanas despues de la inyeccion, los ratones se seleccionaron al azar para el tratamiento con OAS de TCTP solo, OAS aleatorio solo, OAS de TCTP mas docetaxel u OAS aleatorio mas docetaxel. Los ratones que tenlan tumores LNCaP de entre 200 y 300 mm3 de volumen se castraron mediante abordaje escrotal y se asignaron al azar a un brazo de tratamiento. Los ratones se trataron comenzando 1 semana despues de la castration con OAS de TCTP u OAS de control solo y las mediciones de PSA en suero se realizaron semanalmente. Para ambos experimentos, cada grupo experimental consistio en 10 ratones y las mediciones del volumen tumoral se realizaron una vez a la semana y se calcularon por la formula longitud x ancho x profundidad x 0,5236 (Gleave y col., 1999, Clin Cancer Res 5: 2891-8). Despues de la asignacion al azar, se inyectaron 10 mg/kg de TCTP u OAS aleatorio por via intraperitoneal (i.p) una vez al dla durante 60 dlas para los grupos de monoterapia con OAS y 90 dlas para los grupos de OAS mas docetaxel. Se administro un total de 35 mg/kg de docetaxel i.p. Tres veces por semana desde los dlas 7 a 14. Las mediciones del volumen tumoral se realizaron una vez a la semana y se calcularon por la formula longitud x ancho x profundidad x 0,5236 (20). Los puntos de datos se expresaron como niveles de volumen tumoral promedio /- error estandar (EE). Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por las leyes francesas y las directivas europeas y con la certification institucional adecuada.

Agentes quimioterapeuticos y quimicos.

[0109] El docetaxel se obtuvo de Sanofi-aventis (Paris, Francia) y la solucidn madre de docetaxel se prepare con DMSO a las concentraciones requeridas antes de cada experimento. La cicloheximida y MG132 se adquirieron en Calbiochem (Merck Chemicals Ltd, Nottingham, Reino Unido).

Analisis estadistico.

[0110] Todos los resultados se expresaron como media /- error estandar (EE). El analisis estadistico se realizo usando un analisis de varianza unidireccional seguido de la prueba de la minima diferencia significativa protegida de Fisher (Statview 512, Brain Power Inc., Calabases, CA, EE. UU.). * P < 0,05 fue considerado significativo, con ** P < 0,01 y *** P < 0,001.

Ejemplo 2: TCTP es un nuevo socio de Hsp27 que esta sobreexpresado en el cancer de prostata resistente a la castracion (CPRC).

[0111] Para encontrar una explication mecanica para el papel protector de Hsp27 e identificar nuevos socios de Hsp27 especificos para CPRC, se uso el enfoque CytoTrap para buscar proteinas asociadas a Hsp27. Despues del analisis de PubMed de las proteinas asociadas identificadas, se presto atencion especificamente en 4 asociados: homologo letal-1 especifico para el hombre (MSL-1), proteina tumoral controlada traduccionalmente (TCTP), ribonucleoproteina nuclear heterogenea A2/B1 (hnRNPA2B1) y proteina de union al calcio S100 A4 (S100A4). El nivel de expresion de estos cuatro socios se realizo luego en lineas celulares LNCaP normales (PNT2C2), sensibles a la castracion (C) y en lineas celulares PC-3 y C4-2 resistentes a la castracion (RC) y en tejidos humanos. Se extrajeron las proteinas de las celulas normales (PNT2C2), LNCaP SC y PC-3 y C4-2 RC. Los niveles de proteina TCTP y gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se analizaron mediante inmunoelectrotransferencia. Los resultados muestran que, si bien la TCTP se expreso solo ligeramente en las celulas normales PNT2C2, su expresion aumento fuertemente en las celulas LNCaP SC e incluso mas en las celulas PC-3 y C4-2 RC. Se descubrio que ni hnRNPA2B1 ni S100A4 se expresaron en exceso en la estirpe de celulas PC-3 RC.

[0112] Tambien se descubrio que Msl-1 se expresa ligeramente en las celulas normales PNT2C2, aumenta en las celulas LNCaP y se vuelve mas alta en las celulas PC-3 RC. Sin embargo, en muestras humanas, Msl-1 se expreso uniformemente en muestras normales y de PC.

[0113] Para investigar las variaciones de los niveles de TCTP despues de la castracion en el xenoinjerto de PC, se inocularon 10.106 celulas LNCaP SC en ratones desnudos atimicos y cuando los tumores tenian un volumen de entre 200 y 300 mm3, los ratones se castraron mediante un abordaje escrotal. Los tumores fueron recogidos 0 y 40 dias despues de la castracion. En paralelo, se inocularon 10.106 celulas C4-2 RC en ratones desnudos atimicos y los tumores se recogieron 60 dias despues de la inoculation. Se extrajeron proteinas de los tumores LNCaP y C4-2. Los niveles de proteina TCTP, Hsp27 y vinculina se analizaron mediante analisis de membrana Western. La intensidad de las bandas para TCTP y Hsp27 se normalizaron con vinculina y se puntuaron con el software Image J.

[0114] Los niveles de proteina TCTP aumentan significativamente en el xenoinjerto C4-2 RC (70 %, ** P < 0,01) en comparacion con el xenoinjerto LNCaP SC (Fig. 1A). Ademas, la Fig. 1B muestra un aumento del 100 % (***, ^p < 0,001) de la expresion de TCTP en el xenoinjerto LNCaP RC recogido 40 dias despues de la castracion en comparacion con los tumores SC.

[0115] Acto seguido se examino la expresion de TCTP en muestras humanas usando micromatrices de tejido (TMA) de 131 especimenes no tratados (vease materiales y metodos). Se descubrio que la TCTP estaba sobreexpresada en el 10 % del adenocarcinoma de prostata (ADK). No se encontro expresion alguna en la hiperplasia benigna de prostata (BPH). Se descubrio que incluso en las glandulas normales diseminadas dentro de los tumores, no se observo expresion de TCTP. Con el fin de ver la expresion de TCTP durante la progresion de RC, se observo la expresion de TCTP en TMA de 232 especimenes tratados con castracion (TC) (vease materiales y metodos). Se descubrio que la expresion de TCTP estaba regulada negativamente despues de que la supresion de androgenos se volviera de manera uniforme altamente expresada en metastasis RC. Los especimenes se clasificaron de 0 a 3 de intensidad, lo que representa el intervalo de la ausencia de tincion a la tincion intensa mediante puntuacion visual y el analisis de imagen cuantitativo automatizado mediante el software de imagenes Proplus. Los datos de 232 muestras se usaron para calcular (promedio) la media /- EE. Todas las comparaciones de las intensidades de tincion se realizaron a 200X aumentos. La intensidad media de las celulas positivas en los no tratados, <3 meses, 3 a 6 meses, >6 meses de TC, y RC fue de 1,8, 1,02, 0,8, 1,25 y 2,5, respectivamente (Fig. 1C).

Ejemplo 3: Hsp27 protege la TCTP de la degradacion de ubiquitina-proteasoma.

[0116] Usando microscopia confocal, se descubrio que la TCTP se localiza conjuntamente con Hsp27 en el citoplasma de las celulas de control LNCaP y Hsp27 y que la intensidad de la tincion de la TCTP y la co-localization con Hsp27 fue mayor en las celulas LNCaP-Hsp27 en comparacion con las celulas transfectadas con control. Usando la co-inmunoprecipitacion (co-IP), se confirmo la interaccion entre la proteina Hsp27 y TCTP mediante el uso de lisados celulares de control LNCaP y Hsp27 y anticuerpos anti-TCTP de conejo o anti-inmunoglobulina (IgG) de conejo.

[0117] Con el fin de comprender el papel funcional de la interaccion entre Hsp27 y TCTP, se regulo positiva y negativamente Hsp27 y se verifico el nivel de TCTP por membrana Western. Se descubrio que cuando Hsp27 se sobreexpresa, el nivel de proteina de TCTP es 30 % mas alto, mientras que las celulas LNCaP tratadas con OGX-427 muestran un nivel de proteina de TCTP 70 % mas bajo que la LNCaP tratada con el control OGX-427 (fig. 2, panel superior) sin ningun cambio en su nivel de expresion de ARNm (fig. 2, panel inferior).

[0118] Los resultados indican que el nivel de TCTP se correlaciona con el de Hsp27 y los hallazgos recientes sugieren que la Hsp27 podria afectar los niveles de sus proteinas asociadas al protegerlas de su degradation por la via de la ubiquitina-proteasoma (Andrieu y col., 2010, Oncogene. 29:1883-96).

[0119] Para esclarecer como Hsp27 regula los niveles de la proteina TCTP, se probo el efecto de Hsp27 en las tasas de ubiquitinacion de TCTP. Por ende, los niveles ubiquitinados de TCTP se determinaron usando coinmunoprecipitacion en celulas de control LNCaP y LNCaP-Hsp27. Se descubrio que la sobreexpresion de Hsp27 disminuia los niveles de TCTP ubiquitinados, como lo demuestra la escala de especies de alto peso molecular, que es una caracteristica de la proteina poliubiquitinada, lo que sugiere que Hsp27 protege a la TCTP de su degradacion por la via de la ubiquitina-proteasoma.

[0120] Para determinar si la ubiquitinacion de TCTP resulta en su degradacion proteasomal, se determino la semivida de TCTP despues del tratamiento con OGX-427, en presencia o ausencia del inhibidor de proteasoma MG132 y el inhibidor de la sintesis de proteina cicloheximida despues de 2 dias. Los lisados de celulas PC-3, con o sin MG132 (10 pmol/l) o cicloheximida (10 pg/ml), se analizaron mediante membrana de western, lo que demuestra que el tratamiento con MG132 prolongo la semivida de la TCTP e invirtio el efecto de OGX 427 Este resultado demuestra que la regulation negativa de Hsp27 induce una disminucion en el nivel de proteina TCTP a traves de su degradacion proteasomal.

[0121] Estos resultados estan respaldados por el hecho de que despues del tratamiento con cicloheximida solo (20 pg/ml), los niveles de proteina TCTP disminuyen el tiempo de forma dependiente en un 40 % y 60 % a las 24 horas y 48 horas respectivamente. De hecho, estos resultados se observan en la Figura 14A que muestra la senal de TCTP (normalizada con vinculina y puntuacion con el software Image J) de un analisis de inmunoelectrotransferencia de lisados celulares de celulas PC-3 despues de 24 horas y 48 horas de tratamiento con 20 pg/ml de cicloheximida.

Ejemplo 4: El ARNip de TCTP disminuye los efectos citoprotectores de la Hsp27.

[0122] Para estudiar el papel funcional de TCTP en CPRC, se uso la inhibition inducida por ARNip de la expresion de TCTP para determinar si la reduction de la expresion de TCTP afecta el crecimiento de celulas de control LNCaP y Hsp27 despues de la supresion de androgenos y el tratamiento con docetaxel-quimioterapia in vitro combinado. La citoproteccion inducida por la sobreexpresion de Hsp27 en celulas LNCaP parece implicar actividad de TCTP, ya que la disminucion de la expresion de TCTP usando ARNip 5 nM revirtio la citoproteccion a la supresion de androgenos y el tratamiento con docetaxel normalmente conferido por la sobreexpresion de Hsp27.

[0123] Con el fin de estudiar las consecuencias de la inhibicion de la TCTP en la supervivencia celular despues de la supresion de androgenos y el tratamiento con docetaxel-quimioterapia combinada, se determino la viabilidad celular de control LNCaP y Hsp27 usando un cristal violeta despues del tratamiento de 24 h con 1 nM de docetaxel en medio sin suero (imita la supresion de androgenos in vitro). Este analisis demuestra que la inhibicion de la TCTP disminuye la supervivencia de las celulas de control LNCaP y Hsp27 despues de la supresion de androgenos y el tratamiento con docetaxel-quimioterapia combinado. De hecho, la Fig. 3 muestra una reduccion del 50 % (***, P < 0,001) en la tasa de crecimiento de celulas LNCaP-Hsp27 versus 40 % (***, P < 0,001) en control LNCaP despues de la regulacion negativa de TCTP (ARNip 5 nM) en comparacion con el control. Despues del ARNip de TCTP mas docetaxel en un tratamiento con medio sin suero (imita la supresion de androgenos in vitro), se descubrio una reduccion del 80 % (**, P < 0,01) en la tasa de crecimiento de celulas LNCaP-Hsp27 versus una reduccion del 50 % (**, P < 0,01) en control LNCaP en comparacion con el control.

Ejemplo 5: Deteccion de secuencias de OAS

[0124] Con el fin de encontrar una secuencia OAS que tenga un efecto inhibidor sobre la expresion de TCTP, se han disenado 30 secuencias de OAS, 26 de las cuales se muestran en la tabla 1. Dichas 30 secuencias cubren el ARNm de TCTP (numero de acceso NM 003295). Usando el programa BLAST, se ha estudiado la especificidad de dichas secuencias. Entre dichas 30 secuencias, solo se han identificado 15 secuencias como especificas para la secuencia de ARNm de TCPT (vease la tabla 1). El efecto de dichas secuencias de OAS en la expresion de TCTP se probo mediante analisis de membrana Western (WB) y/o mediante reaccion en cadena de la polimerasa de transcripcion inversa cuantitativa (qRT-PCR) en celulas PC-3 que expresan en exceso TCTP. WB y qRT-PCR se realizaron como se expone en el ejemplo 1.

Tabla 1:

[0125] Las secuencias OAS ASO4 de la secuencia SEQ ID NO: 17, Aso10 de la secuencia SEQ ID NO: 2, ASO13 de la secuencia SEQ ID NO: 25, ASO14 de la secuencia SEQ ID NO:15, ASO15 de la secuencia SEQ ID NO: 14, ASO 16 de la secuencia SEQ ID NO: 26, ASO17 de la secuencia SEQ ID NO: 27, ASO18 de la SEQ ID NO: 28, ASO 19 de la secuencia SEQ ID NO: 29, ASO24 de la secuencia SEQ ID NO: 34, ASO26 de la secuencia SEQ ID NO: 36, ASO28 de la secuencia SEQ ID NO: 38 y ASO30 de la secuencia SEQ ID NO: 40 muestran una gran capacidad para inhibir la expresion de TCTP. Y la secuencia de ASO10 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2 (5'-ACCAATGAGCGAGTCATCAA-3'), la secuencia de ASO15 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 14 (5-AACTTGTTTCCTGCAGGTGA-3'), y la secuencia de ASO14 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 15 (5'­ TGGTTCATGACAATATCGAC-3') manifiestan la mejor capacidad para inhibir especlficamente la expresion de TCTP (vease la tabla 1).

Ejemplo 6: El tratamiento con OAS y ARNip de TCTP inhibe el crecimiento celular de PC-3 RC y mejora la quimioterapia in vitro.

[0126] Los estudios han demostrado que la TCTP esta altamente expresada en varios canceres como el colon (Chung y col., 2000, Cancer Lett. 156:185-190), mama (Deng y col., Genomics Proteomics Bioinformatics.

2006, 4:165-72) o tumores de prostata (Tuynder y col., 2002, Proc Natl Acad Sci USA 99:14976-14981; Arcuri y col., 2004, Prostate 60:130-140). En los modelos biologicos de reversion tumoral establecidos a partir de estirpes celulares de leucemia y cancer de mama humanos, se descubrio que la TCTP es la regula notablemente de forma negativa la reversion tumoral (Tuynder y col., 2002, Proc Natl Acad Sci USA 99:14976-14981). Ademas, Tuynder y col. demostraron que la inhibicion de la expresion de TCTP podrla inducir cambios en el fenotipo maligno, cuando las celulas NIH3T3 transformadas con sarcoma viral (v-src) se transfectaron con TCTP antisentido (Tuynder y col., 2004, Proc. Natl Acad Sci. U.S.A. 101: 15364-15369).

[0127] Para determinar si la inhibicion de la expresion de TCTP afecta la progresion de RC in vitro, la inhibicion de la expresion de TCTP inducida por OAS o ARNip se determino mediante analisis de membrana Western. Las protelnas se extrajeron de celulas PC-3 tratadas con 5 a 50 nM de TCTP de ARNip o 50 a 100 nM de TCTP OAS u OAS aleatorio, lo que demuestra que se observo una inhibicion significativa de la protelna TCTP despues del tratamiento con ARNip u OAS a 5 y 100 nM respectivamente. Se observaron resultados similares para los niveles de ARNm de TCTP (Fig. 4). El ARNm de TCTP se obtuvo a partir de celulas PC-3 tratadas durante 1 dla con 5 nM de TCTP o ARNip de control, y durante 2 dlas con 100 nM de TCTP de OAS o un control de OAS. El ARN total se extrajo y los niveles de TCTP se analizaron mediante qRT-PCR. Despues de la normalizacion del ARNm de TCTP con niveles de ARNr 18S, los resultados se analizaron con el metodo 2(-Delta Delta C(T)) (Fig. 5A). Cada muestra fue analizada por triplicado. ** difiere de la PC-3 transfectada con ARNip de control (P < 0,01) y *** con control de OAS (P < 0,001) usando el software Statview.

[0128] Para evaluar el efecto de la regulacion negativa de TCTP en el crecimiento de celulas RC, las celulas PC-3 se trataron durante 1 dla con ARNip de TCTP 5 nM o durante 2 dlas con OAS de TCTP 100 nM. Al final del tratamiento, las celulas PC-3 se incubaron con 50 nM de docetaxel. Las tasas de crecimiento de las celulas PC-3 se examinaron usando el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio. La Fig. 5B, muestra una reduccion del 55 % (***, P < 0,001) en el crecimiento de celulas PC-34 dlas despues del tratamiento con ARNio de TCTP 5 nM solo en comparacion con el control aleatorio. Se observo una inhibition de crecimiento similar con OAS de TCTP 100 nM (Fig. 5C). El efecto de la inhibicion de TCTP sobre la supervivencia celular se analizo en PC-3 despues de un tratamiento combinado con OAS y docetaxel-quimioterapia. Despues de 24 h de tratamiento con 50 nM de docetaxel, se determino la viabilidad celular usando un ensayo MTT. El experimento se repitio por triplicado. *** difiere de la PC-3 transfectada con ARNip de control (P < 0,001) usando el software Statview. Ademas, la Fig. 5C, tambien muestra que la regulacion negativa de TCTP mediante el tratamiento con OAS puede mejorar la sensibilidad del docetaxel hasta en un 25 %. Se ha observado el mismo efecto con el ARNip de TCTP (SEQ ID NO: 3) y OAS 5'-AACTTGTTTCCTGCAGGTGA-3' (SEQ ID NO: 14) y 5 -TGGTTCATGACAATATATACGAC-3' (SEQ ID NO: 15).

[0129] Finalmente, para evaluar si OAS de TCTP tiene el mismo efecto en las estirpes celulares de cancer de prostata que expresan el receptor de androgenos (RA), se uso un colorante de cristal violeta para examinar el crecimiento de celulas LNCaP y C4-2. LNCaP y C4-2 se trataron con TCTP 100 nM u OAS de control (Fig. 15A y B) durante 2 dlas. Luego, las celulas LNCaP y C4-2 se incubaron con 1 nM de docetaxel en medios sin suero. Este resultado muestra claramente que la regulacion negativa de TCTP disminuye considerablemente el crecimiento de las celulas LNCaP y C4-2 y mejora la sensibilidad a los tratamientos (docetaxel y supresion de androgenos).

Ejemplo 7: El tratamiento con OAS de TCTP y ARNip induce apoptosis en celulas PC-3 in vitro.

[0130] La induction de la apoptosis y el bloqueo del ciclo celular por OAS o ARNip de TCTP se demostraron mediante citometrla de flujo. La citometrla de flujo se uso para cuantificar el porcentaje de celulas en cada fase del ciclo celular tres dlas despues del tratamiento con ARNip. Despues del tratamiento de celulas PC-3 con ARNip de TCTP 5 nM durante 1 dla, la fraction de celulas sometidas a apoptosis (fraction sub-G1/G0) fue un 25 % mayor despues del tratamiento con ARNip de TCTP 5 nM en comparacion con el ARNip de control aleatorio (**, P < 0,01; Fig. 6, panel superior). Usando el tratamiento con OAS de TCTP solo, se encontro un aumento del 75 % en la fraccion sub-G0G1 (***, P < 0,001; Fig. 6, panel central e inferior), mejorado por el tratamiento con docetaxel 50 nM (90 % en la fraccion subgrupo G0-G1, ***, P < 0,001). Tambien se encontro que la inhibicion de TCTP disminuyo el numero de celulas en la fase S. La fraccion de PC-3 en la fase S fue un 20 a 40 % menor despues de los tratamientos con ARNip u OAS de TCTP, respectivamente, en comparacion con los controles aleatorios (Fig. 6). Estos resultados demuestran claramente un aumento de la tasa de apoptosis y una detention del ciclo celular asociada con el silenciamiento de TCTP. Se observo que el tratamiento con docetaxel aumento la fraccion de celulas que experimentaban apoptosis sin cambiar la fraccion de celulas en la fase S. La tasa de celulas PC-3 apoptoticas despues del silenciamiento de TCTP con diferentes concentraciones de OAS se exploro con countess de Invitrogen (Fig. 6 y Fig. 7A). Las celulas PC-3 se trataron con 70, 100 o 200 nM de OAS de TCTP o control. Las celulas se recogieron 3 dlas despues del tratamiento y se agregaron 10 ml de azul de tripano antes del analisis con Countess de Invitrogen. Los resultados mostraron que tres dlas despues de la transfection de PC-3 con 70, 100 y 200 nM de TCTP u OAS de control aleatorio, la tasa de celulas apoptoticas fue de 100, 200 y 300 %, respectivamente. Se observaron los mismos efectos con ARNip de TCTP. Ademas, se ha notificado que TCTP interactua con la caspasa-3, inhibiendo as! la activation de la caspasa-3 (Gnanasekar y col., 2009, Int J. Oncol.

34:1241-6). Con el fin de investigar el efecto del silenciamiento de TCTP en la escision y la actividad de la caspasa-3, las celulas PC-3 se trataron diariamente con TCTP 100 nM u OAS aleatorios durante 2 dlas. Las celulas se recogieron 2 dlas despues y las protelnas se extrajeron para la inmunoelectrotransferencia con un anticuerpo de caspasa-3 que reconoce tanto la caspasa-3 escindida como la de longitud completa. La membrana Western revela la presencia de fragmentos de caspasa-3 escindidos activos (17-20 kDa) solo en celulas PC-3 tratadas con OAS de TCTP o ARNip de TCTP, pero no en las celulas tratadas de control.

Ejemplo 8: La sobreexpresion de TCTP confiere quimiorresistencia en celulas LNCaP y C4-2.

[0131] Para abordar mejor el papel de TCTP en la quimiosensibilidad, las celulas C4-2 y LNCaP se transfectaron transitoriamente con vectores de control pDEST-TCTP o pDEST. Despues de 48 h de tratamiento con 1 nM de docetaxel en medio sin suero (que simula la supresion de androgenos in vitro), se determino la viabilidad celular usando el ensayo de cristal violeta. Los resultados obtenidos indican claramente que las celulas LNCaP y C42 que sobreexpresan TCTP aumentaron la supervivencia celular despues de la supresion de androgenos y el tratamiento con docetaxel-quimioterapia combinado. De hecho, la TCTP claramente parece tener un papel en la quimiosensibilidad celular ya que su sobreexpresion conduce a un aumento del 40 % (**, P < 0,01) y del 60 % (***, P < 0.001) en la viabilidad de LNCaP y C4-2 respectivamente (Fig. 7B y Fig. 7C) despues de docetaxel 1 nM en un tratamiento con medio sin suero.

Ejemplo 9: El tratamiento con OAS de TCTP inhibe la progresion del tumor PC-3 y mejora la quimioterapia in vivo.

[0132] A continuation, se evaluo los efectos del tratamiento con OAS de TCTP sobre el crecimiento de tumores PC-3 in vivo (Fig. 8). Se seleccionaron aleatoriamente ratones macho desnudos que tenlan tumores PC-3 (50 mm3) para OAS de TCTP versus OAS aleatorio y se administraron 10 mg/kg de OAS una vez al dla por inyeccion i.p. durante 70 dlas. Desde los dlas 7 a 14, se administraron i.p. 30 mg/kg de docetaxel 3 dlas en la semana. El volumen medio del tumor fue similar en todos los grupos antes de la terapia.

[0133] La Figura 8, panel superior (Puntos, volumen medio tumoral en cada grupo experimental que contiene 10 ratones; barras, EE. *; ** y *** difieren del control aleatorio (p < 0,05; p < 0,01 y p < 0,001, respectivamente) por el software Statview muestra que la monoterapia con OAS de TCTP redujo significativamente el volumen del tumor PC-3 en un 50 % desde los dlas 56 a 70 (**, P < 0,01). Las mediciones de tumores recogidos de animales que recibieron TCTP de OAS o control por i.p. durante dos semanas muestra claramente que los tumores recogidos de animales tratados con OAS de TCTP tambien tienden a ser un 50 % mas pequenos en apariencia despues de dos semanas de tratamiento (Fig. 9A). Ademas, el tratamiento con OAS de TCTP, en comparacion con el control aleatorio, mejoro significativamente los efectos apoptoticos de docetaxel in vivo, reduciendo el volumen promedio del tumor PC-3 en <70 % en porcentaje, 13 semanas despues del inicio del tratamiento (*, P < 0,05; FIG. 8, panel inferior).

[0134] Con el fin de ver si se observo apoptosis en tumores tratados con TCTP de OAS, las protelnas se extrajeron de tumores PC-3 recogidos tratados con OAS de TCTP o control solo. La presencia de fragmentos de caspasa-3 escindidos observada por el analisis de inmunoelectrotransferencia solo en tumores tratados con OAS de TCTP demuestra claramente que la administration i.p. de OAS de TCTP aumento la apoptosis.

[0135] La ausencia de toxicidad del tratamiento en animales se estudio midiendo su peso corporal antes de la primera inyeccion (t0) y el dla del sacrificio (tf) (Fig. 9B). Bajo las condiciones experimentales descritas anteriormente, no se observaron efectos adversos. De hecho, la Fig. 9B muestra que OAS de TCTP no causo una toxicidad general en los animales indicada por ningun cambio en el comportamiento o el peso corporal del animal.

Ejemplo 10: OAS de TCTP de SEQ ID NO: 2 retrasa la progresion del tumor LNCaP despues de la castracion in vivo.

[0136] Veinte ratones machos portadores de tumores LNCaP se castraron 6 a 8 semanas despues del implante del tumor y se seleccionaron al azar para el tratamiento con OAS de TCTP de SEQ ID NO: 2 versus OAS de control. La castracion se realizo cuando los tumores alcanzaron una media de 200 mm3. El volumen medio del tumor y el PSA fueron similares en ambos grupos al inicio del tratamiento. Comenzando 1 semana despues de la castracion, se administraron 10 mg/kg de OAS una vez al dla por inyeccion i.p. durante 9 semanas. Como se muestra en la Figura 10, el volumen del tumor LNCaP aumento mas lentamente en ratones tratados con OAS de TCTP, en comparacion con los tratados con OAS de control. Todos los ratones (n = 10) tratados con castracion mas OAS de TCTP tuvieron una inhibition significativa del crecimiento del tumor Al durante las 9 semanas de analisis. En el momento del sacrificio, el volumen del tumor fue 4 veces mayor en el control (1650, 15 ± 281, 76 mm3) en comparacion con el grupo tratado con OAS de TCTP (397, 79 ± 132, 61 mm3; *, P < 0,05). Las fotograflas de los tumores recogidos de animales que recibieron TCTP de OAS o control durante 9 semanas (Fig. 11A) muestran que los tumores recogidos fueron 3/4 veces mas pequenos en apariencia despues de 9 semanas de monoterapia con OAS de TCTP. No se observaron efectos secundarios con OAS de TCTP o el tratamiento de control, como lo indica ningun cambio en el comportamiento o el peso corporal del animal (peso corporal antes de la primera inyeccion (t0) y peso corporal el dla del sacrificio (tf)) (Fig. 11B).

Ejemplo 11: Resumen de los resultados

Efecto de los compuestos sobre el ARNm de TCTP y la expresion de protelnas en celulas de cancer de prostata

[0137] La tincion de TCTP se realizo en micromatrices de tejido (TMA) de 335 pacientes que sufrlan una de las siguientes enfermedades:

- Hiperplasia prostatica benigna (BPH);

- Cancer de prostata con una puntuacion de Gleason de 3/4, en la que los pacientes no han sido tratados; o - Metastasis de cancer hepatico, oseo, ganglio linfatico y de prostata (CP), resistente a la castracion (RC).

[0138] No se encontro expresion de TCTP en la BPH y en las glandulas normales de la prostata y solo el 10 % de Gleason % CP expreso TCTP antes de la castracion. Sin embargo, se descubrio que TCTP estaba sobreexpresada de manera alta y homogenea en CP metastasico RC. La expresion de TCTP tambien se encontro ligeramente expresada en la estirpe celular de prostata normal inmortalizada con el virus simio SV40 (PNT2C2). La sobreexpresion de TCTP se descubrio en celulas CPRC (PC3) en comparacion con las celulas LNCaP sensibles a la castracion (SC).

[0139] Las pruebas de expresion de ARNm y protelnas TCTP se llevaron a cabo en celulas LNCaP y PC3 expuestas a un OAS de TCTP de SEQ ID NO: 2 o un ARNip de TCTP de SEQ ID NO: 3. El uso de estos compuestos disminuye de manera significativa la expresion en TCTP en estas celulas CP (Fig. 4).

Efectos antiproliferativos y proapoptoticos del ARNip de TCTP desarrollado en la estirpe celular CPRC

[0140] Las celulas PC3 se transfectaron con un ARNip de TCTP de SEQ ID NO: 3. La proliferation celular y la apoptosis se estudiaron usando, respectivamente, el ensayo bromuro (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio) MTT y citometrla de flujo. El uso de este ARNip disminuyo significativamente (48,1 %) la proliferacion de celulas PC3 y, por el contrario, aumento el porcentaje (25,8) de celulas apoptoticas (Fig. 12).

Efectos antiproliferativos y proapoptoticos de la TCTP de OAS desarrollada en la estirpe celular CPRC PC3

[0141] Las celulas PC3 se transfectaron con un OAS de TCTP de SEQ ID NO: 2. La proliferacion celular y la apoptosis se estudiaron usando respectivamente el ensayo MTT y la citometrla de flujo. El uso de este OAS disminuyo significativamente (58 %) la proliferacion de celulas PC3 y, por el contrario, aumento el porcentaje (70) de celulas apoptoticas (Fig. 13) a traves de la activation de caspasa-3.

Experimentos in vivo de la actividad antineoplasica aditiva de la inhibition de TCTP y el tratamiento con docetaxel en ratones desnudos xenoinjertados con PC3

[0142] La inhibicion de TCTP se evaluo en ratones desnudos xenoinjertados con la estirpe celular CPRC PC3. Los animales se trataron todos los dlas y durante un perlodo de dos meses mediante inyeccion peritoneal de OAS o TCTP de control una vez que su volumen tumoral fue de 200-300 mm3. Con el fin de evaluar la actividad antineoplasica aditiva de TCTP de OAS, los ratones se trataron con docetaxel (33 mg/kg) mediante inyeccion peritoneal tres veces por semana durante una semana antes de OAS o inyecciones de TCTP de control. Para todos los experimentos, el volumen promedio del tumor se midio una vez a la semana.

[0143] El tratamiento de ratones con TCTP de OAS indujo el mantenimiento del volumen tumoral a 500 mm3 en comparacion con el TCTP de control (OAS aleatorio) que midio mas de 1.500 mm3 en la decima semana de tratamiento (Fig. 8). Se observo que el tratamiento con docetaxel seguido de TCTP de OAS indujo en primer lugar una disminucion del volumen del tumor y luego el mantenimiento del volumen del tumor a 100 mm3. Por el contrario, los volumenes tumorales siguieron aumentando despues de la novena semana de tratamiento con TCTP de control.

[0144] Estos resultados demuestran el significativo efecto antineoplasico aditivo de TCTP de OAS cuando se combina con un agente quimioterapeutico tal como el agente antimitotico docetaxel.

Ejemplo 12: La asociacion de Hsp27 con TCTP implica su region C-terminal y depende del estado no fosforilado de la chaperona.

Materiales y metodos

Deletion de Hsp27 y transfection del mutante por fosforilacion.

[0145] Hsp27 TS etiquetada con histidina (His-tag) y tres mutantes de delecion (N1, N2 y C1) en pcDNA4 que contienen epltopo His-tag en el extremo N-terminal del fragmento insertado (Al-Madhoun AS. Y col., 2007, Mol Cell Endocrinol; 270) fueron proporcionados amablemente por Pr O'Brien (Ottawa University, Ontario, Canada). Los mutantes de fosforilacion (3D y 3A) en pcDNA3 que contiene una etiqueta de hemaglutinina (HA-tag) en el extremo N-terminal del fragmento insertado fueron proporcionados amablemente por Dr. Carmen Garrido (INSERM U866, Facultad de Medicina y Farmacia, Dijon, Francia). Las celulas LNCaP se transfectaron con 10 mg de TS, delecion o mutantes de fosforilacion usando el reactivo de Fugene (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los lisados limpios se obtuvieron 48 h despues de la transfeccion de acuerdo con nuestros experimentos anteriores (Rocchi P, y col., 2004, Cancer Res; 64: 6595-6602).

Inmunoprecipitacion.

[0146] Se usaron lisados limpios con concentration de protelna ajustada (ensayo de protelnas, BioRad, Marnes-la-Coquette, Francia) para la inmunoprecipitacion con anticuerpo de conejo anti-TCTP (Abcam Inc.,

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un antagonista de la protelna tumoral controlada traduccionalmente (TCTP) para su uso en el tratamiento o la prevencion del cancer, en el que dicho antagonista es un acido nucleico que se dirige a un ARNm que codifica TCTP, en el que dicho acido nucleico es capaz de reducir la cantidad de TCTP en las celulas, en el que dicho acido nucleico tiene una longitud de 18 a 22 nucleotidos y en el que dicho acido nucleico es un oligonucleotido antisentido (i) que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID

NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID

NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 40 o (ii) que consiste en un fragmento de al menos 18 nucleotidos consecutivos de una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:

14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:

34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 40.

2. El antagonista de TCTP para su uso segun la reivindicacion 1, en el que dicho cancer en un cancer hormonoindependiente o un cancer quimiorresistente.

3. El antagonista de TCPT para su uso segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho cancer es un cancer hormonoindependiente o un cancer de prostata quimiorresistente.

4. El antagonista de TCPT para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho acido nucleico tiene una longitud de 19, 20 o 21 nucleotidos.

5. El antagonista de TCPT para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho acido nucleico consiste en una secuencia seleccionada entre un grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID

NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 40.

6. El antagonista de TCTP para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho antagonista esta destinado a un uso simultaneo o secuencial en combinacion con un segundo agente antineoplasico.

7. El antagonista de TCPT para su uso segun la reivindicacion 6, en el que dicho segundo agente antineoplasico se selecciona entre el grupo que consiste en un agente antimitotico, un agente alquilante, un antimetabolito, un inhibidor de la topoisomerasa, un inhibidor de la aromatasa, un inhibidor de la senalizacion, un anticuerpo monoclonal, un modificador de la respuesta biologica, un agente diferenciador y un agente que bloquea la formacion de vasos sangulneos.

8. El antagonista de TCPT para su uso segun las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho antagonista esta destinado a uso simultaneo o posterior en combinacion con una supresion androgenica.

9. Un acido nucleico que se dirige a un ARNm que codifica una protelna tumoral controlada traduccionalmente (TCTP), en el que dicho acido nucleico:

- es capaz de reducir la cantidad de TCTP en las celulas,

- tiene una longitud de 18 a 22 nucleotidos, y

- es un oligonucleotido antisentido (i) que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO:

28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 40 o (ii) que consiste en un fragmento de al menos 18 nucleotidos consecutivos de una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO:

2, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID

NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 40.

10. Un acido nucleico segun la reivindicacion 9, en el que dicho acido nucleico consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 25, SEQ

ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 40.