ES2575429T3 - Receptor tirosina cinasa TYRO3 como una diana terapéutica en el tratamiento del cáncer - Google Patents

Receptor tirosina cinasa TYRO3 como una diana terapéutica en el tratamiento del cáncer Download PDF

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ES2575429T3 ES09783150.7T ES09783150T ES2575429T3 ES 2575429 T3 ES2575429 T3 ES 2575429T3 ES 09783150 T ES09783150 T ES 09783150T ES 2575429 T3 ES2575429 T3 ES 2575429T3
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Abstract

Inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3 para uso en el tratamiento de un cáncer en que se sobreexpresa TYRO3, seleccionado del grupo que consiste en tumor de vejiga, linfoma difuso de células B grandes, carcinoma adenoide quístico de glándula salival, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, adenocarcinoma ductal pancreático, leucemia de células pilosas, cáncer metastásico de próstata, melanoma y cáncer colorrectal, en donde el inhibidor es seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular de TYRO3, una molécula de ácido nucleico que interfiere específicamente en la expresión de TYRO3, un receptor negativo dominante TYRO3 que presenta un dominio cinasa muerto, y un señuelo soluble de TYRO3, siendo dicho señuelo soluble de TYRO3 un receptor TYRO3 recombinante constituido por, al menos, un dominio de tipo Ig o de fibronectina III del dominio extracelular del receptor.

Description

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DESCRIPCION
Receptor tirosina cinasa TYRO3 como una diana terapeutica en el tratamiento del cancer Campo de la invencion
La presente invencion esta relacionada con el campo de la medicina, en particular con el tratamiento del cancer. Se refiere a nuevos usos en el tratamiento del cancer y a metodos de exploracion de moleculas utiles en el tratamiento del cancer.
Antecedentes de la invencion
Se produce cancer cuando la division celular pasa a estar fuera de control y es el resultado del deterioro de una ruta de reparacion de DNA, la transformacion de genes normales en oncogenes o el mal funcionamiento de genes supresores de tumores. Existen muchas formas diferentes de cancer. La incidencia de estos canceres vana, pero representa la segunda mayor causa de mortalidad, despues de la enfermedad cardfaca, en la mayona de los pafses desarrollados.
El cancer de vejiga es el quinto cancer en terminos de incidencia. Puede aparecer como lesiones superficiales restringidas al urotelio [Ta y carcinoma in situ (CIS)] o a la lamina propia (T1) o como lesiones muscularmente invasivas (T2-T4). Hasta la fecha se han descrito dos rutas diferentes de progresion tumoral en el cancer de vejiga, la ruta Ta y la ruta CIS. Los tumores Ta, que constituyen el 50% de los tumores de vejiga en la primera presentacion, son tumores papilares superficiales, normalmente de bajo grado, que no invaden la membrana basal. El carcinoma in situ (CIS) es tambien un tumor superficial que no invade la membrana basal pero es siempre de alto grado. Los tumores Ta, a pesar de la reseccion quirurgica asociada o no con una terapia con BCG (bacilo de Calmette-Guerin), a menudo son recurrentes pero raramente progresan hasta una enfermedad muscularmente invasiva (T2-T4), mientras que el CIS a menudo progresa hasta tumores T2-T4. En lo relativo a carcinomas de vejiga muscularmente invasivos, el tratamiento estandar es la cistectoirna. A pesar de este tratamiento radical, el carcinoma de vejiga muscularmente invasivo sigue siendo una enfermedad mortal para la mayona de los pacientes.
Hasta ahora, aun cuando se han descrito muchas alteraciones cromosomicas recurrentes en el cancer de vejiga, se ha demostrado que solo unos pocos genes estan implicados en la progresion tumoral (p53, CDKN2A, RB1, E2F3, FGFR3).
En consecuencia, existe la significativa necesidad de un tratamiento apropiado para los tumores de vejiga, en particular de nuevos y mas eficaces agentes terapeuticos.
Sumario de la invencion
Sorprendentemente, los inventores demuestran en esta memoria que TYRO3 esta sobreexpresado en varios tipos de tumores, incluyendo los tumores de vejiga, y es responsable de la supervivencia de celulas tumorales. Ademas, muestran que se pueden emplear compuestos que inducen inhibicion o supresion de TYRO3 para tratar canceres en que se sobreexpresa TYRO3.
La presente invencion proporciona nuevos agentes terapeuticos para uso en el tratamiento del cancer, y en particular del tumor de vejiga.
En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a un inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3 para uso en el tratamiento de un cancer en que se sobreexpresa TYRO3. En una realizacion particular, el cancer en que se sobreexpresa TYRO3 es seleccionado del grupo que consiste en tumor de vejiga, linfoma difuso de celulas B grandes, carcinoma adenoide qrnstico de glandula salival, linfoma de Burkitt, mieloma multiple, adenocarcinoma ductal pancreatico, leucemia de celulas pilosas, cancer metastasico de prostata, melanoma y cancer colorrectal. En una realizacion preferida, el cancer en que se sobreexpresa TYRO3 es un tumor de vejiga.
La presente invencion tambien se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3 y un vehfculo/excipiente farmaceuticamente aceptable para uso en el tratamiento de un cancer en que se sobreexpresa TYRO3. En una realizacion particular, el cancer en que se sobreexpresa TYRO3 es seleccionado del grupo que consiste en tumor de vejiga, linfoma difuso de celulas B grandes, carcinoma adenoide qrnstico de glandula salival, linfoma de Burkitt, mieloma multiple, adenocarcinoma ductal pancreatico, leucemia de celulas pilosas, cancer metastasico de prostata, melanoma y cancer colorrectal. En una realizacion preferida, el cancer en que se sobreexpresa TYRO3 es un tumor de vejiga.
El inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3 es seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular de TYRO3, una molecula de acido nucleico que interfiere espedficamente en la expresion de TYRO3, un senuelo soluble de TYRO3, y un receptor negativo dominante que presenta un dominio cinasa muerto. En una realizacion preferida, el inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3 es seleccionado del
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grupo que consiste en un anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular de TYRO3, una molecula de acido nucleico que interfiere espedficamente en la expresion de TYRO3, un senuelo soluble de TYRO3 y un receptor negativo dominante que presenta un dominio cinasa muerto. En una realizacion particular, el inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3 es un RNAi, un acido nucleico antisentido o una ribozima que interfiere espedficamente en la expresion de TYRO3.
En una realizacion preferida, el inhibidor es un siRNA, en particular un siRNA que comprende una secuencia de ID. SEC. n° 1.
En otra realizacion, el inhibidor es un senuelo soluble de TYRO3 que es un receptor TYRO3 recombinante constituido por, al menos, el dominio extracelular del receptor o uno de los dominios (de tipo Ig o de fibronectina) del mismo. En otra realizacion particular, el senuelo soluble de TYRO3 es un anticuerpo dirigido contra Gas-6.
En una realizacion, el inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3 se emplea en combinacion con otro ingrediente activo, en particular un farmaco antitumoral. En una realizacion particular, el inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3 se emplea en combinacion con un tratamiento contra el tumor de vejiga.
La presente invencion tambien se refiere a un metodo in vitro para explorar o identificar una molecula adecuada para tratar un cancer en que se sobreexpresa TYRO3, en donde el metodo comprende las operaciones de (i) poner moleculas candidatas en contacto con celulas que expresan el receptor TYRO3, y (ii) seleccionar las moleculas que tienen la capacidad para unirse al receptor TYRO3 y/o competir con y/o por un ligando del receptor TYRO3 y/o disminuir la expresion del gen TYRO3 y/o disminuir la fosforilacion de los sustratos de TYRO3 o la autofosforilacion de TYRO3. En una realizacion particular, el cancer en que se sobreexpresa TYRO3 es un tumor de vejiga.
Opcionalmente, estos metodos para explorar o identificar una molecula adecuada para tratar un cancer en que se sobreexpresa TYRO3 pueden comprender ademas la operacion de administrar in vitro la molecula seleccionada a un modelo animal no humano con tumor que sobreexpresa TYRO3 y analizar el efecto sobre la progresion de la enfermedad. En una realizacion particular, el cancer en que se sobreexpresa TYRO3 es un tumor de vejiga y el modelo animal no humano con tumor que sobreexpresa TYRO3 es un modelo animal no humano con tumor de vejiga.
Finalmente, la presente invencion se refiere al uso de un inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3 para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de un cancer en que se sobreexpresa TYRO3. En una realizacion particular, el cancer en que se sobreexpresa TYRO3 es seleccionado del grupo que consiste en tumor de vejiga, linfoma difuso de celulas B grandes, carcinoma adenoide qrnstico de glandula salival, linfoma de Burkitt, mieloma multiple, adenocarcinoma ductal pancreatico, leucemia de celulas pilosas, cancer metastasico de prostata, melanoma y cancer colorrectal. En una realizacion preferida, el cancer en que se sobreexpresa TYRO3 es un tumor de vejiga.
Breve descripcion de los dibujos
En la Figura 1 se muestra la expresion de TYRO3 en tumores de vejiga y lmeas celulares de cancer de vejiga. Se evaluaron los niveles de expresion de mRNA en tumores de cancer de vejiga humano usando una micromatriz de DNA Affymetrix U95A (Figura 1A). Las diferencias de expresion entre los diferentes grupos se compararon utilizando una prueba de analisis de varianza (ANOVA) (Figura 1B).
En la Figura 2 se muestra la expresion de GAS6 en tumores de vejiga y lmeas celulares de cancer de vejiga. Se evaluaron los niveles de expresion de mRNA en tumores de cancer de vejiga humano usando una micromatriz de DNA Affymetrix U95A (Figura 2A) y se compararon las diferencias de expresion entre los diferentes grupos utilizando una prueba de ANOVA (Figura 2B).
En la Figura 3 se muestran los niveles de expresion de mRNA de TYRO3 y GAS6 en las lmeas celulares T24, MGH- U3, RT4, KK47, TCCSUP, EJ138, J82 y RT112 de cancer de vejiga humano y en una lmea celular procedente de urotelio normal humano (NHU), evaluados mediante Q-RT-PCR.
En la Figura 4 se muestra la eficacia del silenciamiento de TYRO3 en celulas MGH-U3. Se transfectaron las celulas con siRNA 50 nM [siRNA anti-TYRO3 (ID. SEC. n° 1) o siRNA testigo (revuelto, ID. SEC. n° 2)] y se evaluo la eficacia del silenciamiento de TYRO3 72 horas despues de la transfeccion mediante transferencia Western.
En la Figura 5 se muestra un grafico que representa el efecto de la reduccion de actividad de TYRO3 sobre la viabilidad de celulas de cancer de vejiga. Despues de la transfeccion, como se describe en la leyenda de la Figura 4, se trataron las celulas con tripsina 72 horas despues de la transfeccion y se tineron con azul de tripano y se contaron las celulas viables por triplicado utilizando un hematocitometro Malassez. Los resultados son los valores medios +/- la desviacion estandar de dos experimentos independientes llevados a cabo por triplicado.
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En la Figura 6 se muestra el efecto de un anticuerpo anti-TYRO3 sobre la viabilidad de celulas de cancer de vejiga. Se incubaron las celulas 72 horas en presencia de diferentes concentraciones de un anticuerpo policlonal dirigido contra el dominio extracelular de TYRO3 [anti-Rse (N-18), generado en cabra, Santa Cruz Biotechnology] y se midio la viabilidad celular mediante un ensayo con MTT.
En la Figura 7 se muestra el efecto de un receptor TYRO3 soluble recombinante sobre la viabilidad celular. Se produjo en bacterias y se purifico el dominio extracelular de TYRO3 (421 aa), compuesto por dos dominios de tipo Ig (aa 1-220) y dos dominios de fibronectina III (aa 220-421). Se incubaron las celulas 72 horas en presencia de diferentes cantidades de este receptor soluble y se midio la viabilidad celular por incorporacion de MTT.
En la Figura 8 se muestran los resultados de un ensayo TUNEL [marcacion de final de corte mediada por desoxinucleotidil transferasa terminal (tdt; del ingles, terminal deoxynucleotidyl transferase)] sobre celulas de cancer de vejiga transfectadas. Se sembraron 3x104 celulas por pocillo sobre un portaobjetos de vidrio en una placa de 24 pocillos y se transfectaron con siRNA 50 nM. Se evaluo la fragmentacion de DNA 72 horas despues de la transfeccion utilizando un kit de deteccion del ensayo TUNEL (Roche Diagnostics, Meylan, Francia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los inventores analizaron 600 celulas bajo un microscopio optico, determinando la razon de celulas marcadas.
En la Figura 9 se muestra un analisis del ciclo celular por citometna de flujo 72 horas despues de la transfeccion con siRNA. Los resultados se analizaron utilizando una prueba de Fisher; *** p < 0,001, * 0,01 < p < 0,05.
En la Figura 10 se muestra un grafico que representa el efecto de la reduccion de actividad de TYRO3 sobre la formacion de colonias independiente del anclaje. Se anadieron 2104 celulas transfectadas con siRNA 50 nM, en medio DMEM complementado con FCS al 10% y agar al 0,3%, a pocillos triplicados que conteman medio y agar al 0,8% en placas de 12 pocillos. Se incubaron las placas durante dos semanas y se calificaron como positivas las colonias con diametros superiores a 50 pm utilizando un microscopio de contraste de fases provisto de una reticula de medicion. Los resultados son los valores medios +/- la desviacion estandar de dos experimentos independientes llevados a cabo por triplicado.
En la Figura 11 se muestra el efecto de siRNA de TYRO3 sobre el crecimiento de tumores J82 xenoinjertados. Se trataron ratones que portaban tumores, tres veces a la semana, mediante una inyeccion intraperitoneal de 4 pg de siRNA (testigo o TYRO3) (6 ratones y 12 tumores por grupo) (la primera inyeccion corresponde al dfa 0). En el grafico de la Figura 11A se representan variaciones del volumen tumoral (prueba de la suma de rangos de Wilcoxon: *, 0,05 < p < 0,01; **, 0,01 < p < 0,001; ***, p < 0,001). Se han insertado fotograffas de tumores representativos observados al final del tratamiento. Los tumores de la lmea superior son los de ratones tratados con siRNA testigo. Los tumores de la lmea inferior son los de ratones tratados con siRNA de TYRO3. Los tumores se pesaron al final del experimento (Figura 11B).
En la Figura 12 se muestra el efecto de siRNA de TYRO3 sobre el crecimiento de tumores J82 xenoinjertados. Se trataron ratones que portaban tumores, tres veces a la semana, mediante una inyeccion intraperitoneal de 4 pg de siRNA (testigo o TYRO3) (6 ratones y 12 tumores por grupo) (la primera inyeccion corresponde al dfa 0). En el grafico de la Figura 12A se representan variaciones del volumen tumoral (prueba de la suma de rangos de Wilcoxon: *, 0,05 < p < 0,01; **, 0,01 < p < 0,001; ***, p < 0,001). Se han insertado fotograffas de tumores representativos observados al final del tratamiento. Los tumores de la lmea superior son los de ratones tratados con siRNA de TYRO3. Los tumores de la lmea central son los de ratones tratados con siRNA testigo. Los tumores de la lmea inferior son los de ratones tratados con PBS. Los tumores se pesaron al final del experimento (Figura 12B).
La Figura 13 es un grafico que muestra los niveles de mRNA de TYRO3 para xenoinjertos de MGH-U3, 3 dfas despues de la ultima inyeccion de siRNA, divididos por los niveles de mRNA de protema ligante de TATA (TBP; del ingles, TATA binding protein) +/- la desviacion estandar en tumores tratados y testigo, segun se evalua mediante Q- RT-PCR.
En la Figura 14 se muestra el efecto de un receptor TYRO3 soluble recombinante que consiste en el dominio extracelular recombinante de TYRO3, producido en bacterias, sobre el crecimiento de tumores MGH-U3 xenoinjertados. Se trataron ratones que portaban tumores, tres veces a la semana, mediante una inyeccion intratumoral de 80 pg de receptor TYRO3 soluble o PBS (7 ratones y 14 tumores por grupo) (la primera inyeccion corresponde al dfa 0). En el grafico de la Figura 14A se representan variaciones del volumen tumoral (prueba de la suma de rangos de Wilcoxon: *, 0,05 < p < 0,01; **, 0,01 < p < 0,001; ***, p < 0,001). En la Figura 14B se muestran fotograffas de tumores representativos observados al final del tratamiento.
En la Figura 15 se muestran los resultados de un ensayo TUNEL sobre tumores MGH-U3 xenoinjertados, tratados con receptor TYRO3 soluble o PBS. 18 dfas despues del comienzo del tratamiento, se sacrificaron los ratones y se embebieron los tumores en parafina. Luego se evaluo la fragmentacion de DNA utilizando un kit de deteccion del ensayo TUNEL [marcacion de final de corte mediada por desoxinucleotidil transferasa terminal (tdt)] (Roche Diagnostics, Meylan, Francia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se muestran fotograffas de campos
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En la Figura 16 se muestra la sobreexpresion de TYRO3 en diferentes canceres. Analisis de expresion diferencial de TYRO3 en tumores humanos usando la pagina web de Oncomine (Rhodes et al., 2004). Se representan estudios (Figura 16A) que muestran una significativa suprarregulacion (p < 0,01) de los niveles de expresion del gen TYRO3 en tejidos tumorales (gris, seccion derecha) en comparacion con tejidos normales (blanco, seccion izquierda). En la Figura 16B se proporcionan detalles de los datos empleados para este analisis.
En la Figura 17 se muestran graficos de la expresion del gen TYRO3 a traves de un gran espectro de tejidos normales (Figura 16B), extrafdos de la base de datos GeneSapiens (Kilpinen et al., 2008).
En la Figura 18 se muestran graficos de la expresion del gen TYRO3 a traves de un gran espectro de tejidos tumorales, extrafdos de la base de datos GeneSapiens (Kilpinen et al., 2008).
Descripcion detallada de la invencion
Al analizar el transcriptoma en una serie de 80 carcinomas de vejiga, 5 urotelios de vejiga normales y 10 lmeas celulares de tumor de vejiga, los inventores:
- han identificado un receptor tirosina cinasa TYRO3 sobreexpresado en casi el 70% de los carcinomas de vejiga en comparacion con las muestras de urotelio normal, siendo esta sobreexpresion independiente de la fase y el grado;
- se han dado cuenta de que uno de los ligandos de TYRO3, GAS6, esta tambien sobreexpresado en el carcinoma invasivo en comparacion con el urotelio normal y los tumores superficiales; y
- han demostrado funcionalmente la importancia de TYRO3 en la supervivencia de celulas de tumores de vejiga.
Un analisis por QPCR permitio validar los datos transcriptomicos de Affymetrix y, a partir de ellos, mostrar una sobreexpresion de TYRO3 en la mayona de las muestras de tumor de vejiga. Una hibridacion in situ permitio demostrar que TYRO3 es expresado por celulas epiteliales de tumor de vejiga mientras que GAS6 es principalmente expresado por celulas estromales. Estudios funcionales sobre TYRO3 en cuatro lmeas celulares de tumor de vejiga (dos que solo expresan TYRO3 y dos que expresan tanto TYRO3 como GAS6) utilizando siRNA para reducir la expresion genica o un receptor soluble TYRO3 recombinante (constituido por el dominio extracelular del receptor) mostraron que TYRO3 era necesario para la supervivencia in vitro de celulas de cancer de vejiga. Estos resultados se confirmaron in vivo utilizando una lmea celular xenoinjertada procedente de tumor de vejiga humano. En realidad, la inactivacion de TYRO3 1) inhibe la supervivencia celular al inducir apoptosis celular; 2) inhibe el crecimiento independiente del anclaje, lo que demuestra que TYRO3 regula la supervivencia celular de celulas clonogenicas; y 3) inhibe el crecimiento de celulas de tumor de vejiga xenoinjertadas en ratones desnudos y, aun mas, reduce el tamano del tumor. Resulta interesante que los inventores observaran el mismo efecto in vitro a traves de la inhibicion de la actividad de TYRO3 utilizando un anticuerpo policlonal anti-TYRO3 dirigido contra su dominio extracelular.
Ademas, los inventores de mostraron que TYRO3 no solo esta sobreexpresado en tumores de vejiga sino tambien en otros diferentes tipos de cancer, tales como linfoma difuso de celulas B grandes, carcinoma adenoide qrnstico de glandula salival, linfoma de Burkitt, mieloma multiple, adenocarcinoma ductal pancreatico, leucemia de celulas pilosas, cancer metastasico de prostata, melanoma y cancer colorrectal.
En consecuencia, los inventores han demostrado que TYRO3 es una tirosina cinasa sobreexpresada en la mayona de los tumores de vejiga y en otros diversos tipos de canceres y que induce la supervivencia de celulas tumorales. Por lo tanto, la presente invencion proporciona una nueva e interesante diana terapeutica para el cancer en que se sobreexpresa TYRO3 y, en particular, para el cancer de vejiga.
Hasta ahora se habfa descrito que TYRO3 estaba sobreexpresado o coexpresado con su ligando en unos pocos tipos tumorales humanos [leiomioma uterino (Sun et al., 2003a), canceres uterinos de endometrio y endometriosis ovarica (Sun et al., 2002; Sun et al., 2003b), y carcinoma pulmonar (Wimmel et al., 1999)], pero nunca se habfa sugerido ni demostrado su papel en la progresion de tumores ni, especialmente, en la supervivencia de celulas tumorales.
Se ha sugerido su funcion oncogenica ya que su expresion transformaba fibroblastos Rat-2 y fibroblastos RatB1 (Lai et al., 2004; Taylor et al., 1995). Ademas, se han sugerido tambien estas propiedades oncogenicas porque un receptor tnbrido constituido por la parte extracelular del receptor de EGF y la parte intracelular de TYRO3 puede transformar celulas NIH3T3 en presencia de EGF (Lan et al., 2000).
Sin embargo, la potencial funcion oncogenica de TYRO3 no permite describir ni sugerir la funcion de este receptor en la supervivencia de celulas tumorales.
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Recientemente, en una solicitud de patente retirada (WO/2005/000207) de Kiener et al. se sugiere que TYRO3 es el receptor del factor de crecimiento derivado de celulas de cancer de prostata (PCDGF; del ingles, prostate cancer cell derived growth factor). Puesto que el PCDGF esta sobreexpresado en diferentes canceres, este documento sugiere que la inhibicion de la union de PCDGF a TYRO3 podna ser una estrategia terapeutica en diversos canceres en que se sobreexpresa PCDGF. Sin embargo, este documento no contiene ningun dato que respalde su estrategia. En realidad, no hay ningun dato que demuestre que TYRO3 es el receptor de PCDGF y que una molecula que inhiba la potencial union de PCDGF con TYRO3 pueda ejercer un efecto sobre celulas cancerosas.
En consecuencia, se ha descrito y demostrado por vez primera el papel de TYRO3 en la supervivencia de celulas tumorales, y este papel proporciona un nuevo medio para tratar un cancer existente en que se sobreexpresa TYRO3, y en particular un tumor de vejiga.
Los receptores tirosina cinasa estan compuestos por un dominio extracelular, que es capaz de unirse a un ligando espedfico, un dominio transmembranal y un dominio catalttico intracelular que es capaz de unirse a, y fosforilar, sustratos intracelulares seleccionados. La union de un ligando a la region extracelular causa una serie de reordenamientos estructurales en el receptor tirosina cinasa que conducen a su activacion enzimatica, la cual desencadena una cascada de sucesos a traves de la fosforilacion de protemas intracelulares que finalmente transducen la senal extracelular al nucleo causando cambios en la expresion genica.
El receptor tirosina cinasa TYRO3 es un miembro de la familia AXL/Ufo/Mer de receptores tirosina cinasa. El TYRO3 es tambien conocido como BYK, Brt, Dtk, Rse, Sky y Tif. Se ha descrito que el gen 6 espedfico de la detencion del crecimiento (GAS6; del ingles, growth arrest specific gene-6) y la protema S activan la actividad tirosina cinasa de TYRO3.
Las secuencias polinucleotfdica y de aminoacidos son bien conocidas en la tecnica. Son secuencias de referencia los numeros de acceso MN_006293.2 y NP_006284.2, respectivamente, de Genbank. La entrada de referencia para el TYRO3 humano en la base de datos UniGene del transcriptoma es Hs.381282.
En la presente invencion, un "inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3" es una molecula que inhibe o reduce la actividad del receptor TYRO3. De este modo, el inhibidor induce la supresion o reduccion de la transmision de senales extracelulares a la celula a traves del receptor TYRO3.
La actividad del receptor tirosina cinasa TYRO3 puede ser facilmente examinada mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. Un primer ensayo puede ser la determinacion de la capacidad del inhibidor para unirse al receptor TYRO3. Un segundo ensayo puede ser la determinacion de la capacidad del inhibidor para competir con un ligando del receptor TYRO3 por la union de este receptor o de este ligando. Un tercer ensayo puede ser la determinacion de la capacidad del inhibidor para disminuir el nivel de expresion de TYRO3. Un cuarto ensayo puede ser la determinacion de la capacidad del inhibidor para disminuir la fosforilacion de los sustratos de TYRO3 o la autofosforilacion de TYRO3. Estos diferentes metodos se describen mas adelante en este documento y se pueden combinar.
La inhibicion puede ser debida a la union de una molecula al dominio extracelular del receptor. En este caso, el inhibidor puede ser un antagonista que se une al dominio de union a ligandos o a otro dominio del receptor, o una molecula que modifica la actividad del receptor mediante impedimento esterico o modificacion. Este inhibidor puede ser, por ejemplo, un aptamero o un anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular del receptor. Se puede determinar la actividad inhibitoria por medio de un ensayo de union, un ensayo de union competitiva o un ensayo de fosforilacion.
La inhibicion puede ser tambien debida a la reduccion o supresion de la expresion del gen que codifica el receptor usando, por ejemplo, un RNAi, acido nucleico antisentido o ribozima espedficos, lo que induce una disminucion del numero de receptores en la superficie celular y, por lo tanto, una reduccion de la transmision de senales extracelulares. Se puede examinar la actividad inhibitoria a traves de la medicion del nivel de expresion de TYRO3, a nivel de protema o a nivel de RNA. Tambien se puede examinar la actividad inhibitoria a traves de la fosforilacion de TYRO3 o de un sustrato de TYRO3.
El uso de senuelos que se unen a ligandos del receptor TYRO3 puede tambien inducir la reduccion o supresion de la actividad de este receptor mediante la competicion por estos ligandos. En realidad, estos senuelos atrapan ligandos de TYRO3 y, en consecuencia, disminuyen la concentracion de ligandos disponibles para la activacion de TYRO3. Estos senuelos se pueden desplegar en la membrana en forma de receptores negativos dominantes, o en el fluido extracelular en forma de receptores solubles. Estos senuelos pueden ser tambien anticuerpos dirigidos contra ligandos de TYRO3. Se puede determinar la actividad inhibitoria a traves de un ensayo de competicion para determinar la disminucion de union entre el receptor TYRO3 funcional y su ligando. Tambien se puede examinar la actividad inhibitoria a traves de la fosforilacion de TYRO3 o de un sustrato de TYRO3.
En realizaciones particulares de la presente invencion, el inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3 es
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preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular de TYRO3, una molecula de acido nucleico que interfiere espedficamente en la expresion de TYRO3, un receptor negativo dominante que presenta un dominio cinasa muerto, y un senuelo soluble de TYRO3.
En una realizacion preferida, el inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3 es preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en una molecula de acido nucleico que interfiere espedficamente en la expresion de TYRO3, un anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular de TYRO3, un receptor negativo dominante que presenta un dominio cinasa muerto, y un senuelo soluble de TYRO3.
Como se emplea en esta memoria, con el termino "anticuerpo" se pretende hacer referencia, en terminos generales, a cualquier agente ligante inmunologico tal como IgG, IgM, IgA, IgD o IgE y a un anticuerpo humanizado o quimerico. En ciertas realizaciones, se prefieren IgG y/o IgM porque son los anticuerpos mas comunes en el estado fisiologico y son los fabricados mas facilmente. El termino "anticuerpo" se emplea para referirse a cualquier molecula de tipo anticuerpo que tiene una region ligante de antfgenos, e incluye fragmentos de anticuerpo tales como Fab', Fab, F(ab')2, anticuerpos de un solo dominio (DABs), Fv, Fv de cadena unica (scFv; del ingles, single chain Fv), y similares. Las tecnicas para preparar y emplear diversas construcciones y fragmentos basados en anticuerpos son bien conocidas en este campo tecnico. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos son tambien bien conocidos en este campo tecnico (vease, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988).
Un anticuerpo "humanizado" es un anticuerpo en que las regiones constantes y variables de armazon de una o mas inmunoglobulinas humanas estan fusionadas con la region ligante, por ejemplo, la CDR, de una inmunoglobulina animal. Los anticuerpos "humanizados" contemplados en la presente invencion son anticuerpos quimericos de raton, rata u otra especie que portan dominios de regiones constantes y/o variables humanas, anticuerpos biespedficos, anticuerpos recombinantes y geneticamente modificados y fragmentos de los mismos. Dichos anticuerpos humanizados se disenan para mantener la especificidad ligante del anticuerpo no humano a partir del cual proceden las regiones ligantes, pero para evitar una reaccion inmune contra el anticuerpo no humano.
Un anticuerpo "quimerico" es una molecula de anticuerpo en que (a) la region constante, o una porcion de la misma, esta alterada, reemplazada o cambiada de modo que el sitio ligante de antfgenos (region variable) esta unido a una region constante de una clase, funcion efectora y/o especie diferente o alterada, o a una molecula totalmente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimerico, tal como, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, farmaco, etc.; o (b) la region variable, o una porcion de la misma, esta alterada, reemplazada o cambiada por una region variable que tiene una especificidad antigenica diferente o alterada.
Particularmente, con la expresion "anticuerpo contra el dominio extracelular de TYRO3" se designa un anticuerpo como el anteriormente descrito que es capaz de unirse al dominio extracelular del receptor tirosina cinasa TYRO3 y bloquear o reducir su actividad. Esta inhibicion puede ser debida a un impedimento esterico o modificacion que evita la union del ligando.
En una realizacion preferida, el anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular de TYRO3 es un anticuerpo anti- Rse (N-18) (Santa Cruz Biotechnology).
Como se emplea en esta memoria, un "receptor negativo dominante que presenta un dominio cinasa muerto" es un receptor que es capaz de unirse a un ligando pero es defectuoso para la transmision de la senal. En consecuencia, la sobreexpresion de un receptor negativo dominante afecta a la senalizacion del receptor al bloquear la transduccion de senales. La presencia de dicho receptor negativo dominante en la superficie celular induce una competicion por el ligando que disminuye la cantidad de ligando disponible para el receptor activo y, de este modo, evita la activacion de este receptor. En la presente invencion, el receptor negativo dominante TYRO3 presenta un dominio extracelular operativo que se une a un ligando de TYRO3, y un dominio cinasa no operativo que es incapaz de transmitir la senal dentro de la celula por medio de la fosforilacion de sustratos intracelulares.
Como se emplea en esta memoria, con la expresion "senuelo soluble de TYRO3" se designa una molecula extracelular que es capaz de unirse a un ligando de TYRO3 y, de este modo, inducir la reduccion o supresion de la actividad del receptor TYRO3 mediante competicion por sus ligandos o mediante heterodimerizacion con el receptor endogeno de tipo silvestre. Este senuelo soluble puede estar constituido por cualquier peptido que tenga la capacidad para unirse a un ligando del receptor TYRO3 o al dominio extracelular del receptor.
En una realizacion, el senuelo soluble de TYRO3 es un receptor TYRO3 recombinante constituido por el dominio extracelular del receptor, o un fragmento del mismo capaz de unirse a un ligando de TYRO3, o un dominio extracelular de TYRO3 (por ejemplo, un dominio de tipo Ig o de fibronectina). En una realizacion preferida, el senuelo soluble de TYRO3 es el dominio extracelular completo del receptor TYRO3. El dominio extracelular de TYRO3 (421 aa) esta compuesto por dos dominios de tipo Ig (aa 1-220) y dos dominios de fibronectina III (aa 220421). En otra realizacion, el senuelo soluble de TYRO3 es un receptor TYRO3 recombinante constituido por uno o dos dominios de tipo Ig o por uno o dos dominios de fibronectina III. Si es necesario, los dominios del receptor TYRO3 pueden ser copulados con un fragmento Fc para estabilizar el receptor.
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Los inhibidores del receptor tirosina cinasa TYRO3 de la invencion tambien pueden ser moleculas de acido nucleico. La expresion "molecula de acido nucleico" incluye, pero no se limita a, moleculas de RNAi, acido nucleico antisentido y ribozima.
En la presente invencion, una "molecula de acido nucleico que interfiere espedficamente en la expresion de TYRO3" es una molecula de acido nucleico que es capaz de reducir o suprimir de un modo espedfico la expresion del gen que codifica el receptor TYRO3.
La expresion "RNAi" o "RNA interferente" significa todo RNA que es capaz de infrarregular la expresion de la protema diana. Abarca moleculas de RNA interferente pequeno (siRNA; del ingles, small interfering RNA), RNA de doble cadena (dsRNA; del ingles, double-stranded RNA), RNA de cadena sencilla (ssRNA; del ingles, singlestranded RNA), microRNA (miRNA) y RNA corto en horquilla (shRNA; del ingles, short hairpin RNA). La interferencia de RNA designa un fenomeno mediante el cual dsRNA suprime espedficamente la expresion de un gen diana a nivel postraduccional. En condiciones normales, la interferencia de RNA es iniciada por moleculas de RNA de doble cadena (dsRNA) con una longitud de varios miles de pares de bases. In vivo, el dsRNA introducido en una celula es escindido en una mezcla de pequenas moleculas de dsRNA llamadas siRNA. La enzima que cataliza la escision, Dicer, es una endo-RNasa que contiene dominios de RNasa III (Bernstein, Caudy et al., 2001). En celulas de mairnfero, los siRNAs producidos por Dicer tienen una longitud de 21-23 pares de bases, con una secuencia duplex de 19 o 20 nucleotidos, salientes 3' de dos nucleotidos y extremos de 5'-trifosfato (Zamore, Tuschi et al., 2000; Elbashir, Lendeckel et al., 2001; Elbashir, Martinez et al., 2001).
En un numero de patentes y solicitudes de patente, por ejemplo, los documentos WO 99/32619, US 20040053876, US 20040102408 y WO 2004/007718, se ha descrito, en terminos generales, el uso de moleculas de siRNA para inhibir la expresion genica.
Se disenan normalmente siRNAs contra una region de 50-100 nucleotidos cadena abajo del codon iniciador de la traduccion, mientras que se evitan normalmente las regiones no traducidas 5'-UTR y 3'-UTR. La secuencia diana de siRNA escogida debena ser sometida a una busqueda BLAST frente a una base de datos de ESTs para asegurar que se apunta al unico gen deseado. Se dispone comercialmente de varios productos para facilitar la preparacion y el uso de siRNA.
En una realizacion preferida, la molecula de RNAi es un siRNA con una longitud de al menos aproximadamente 1550 nucleotidos, preferiblemente de aproximadamente 20-30 nucleotidos, preferiblemente de aproximadamente 20-25 nucleotidos.
En una realizacion particular, la molecula de siRNA comprende la secuencia de ID. SEC. n° 1.
El RNAi puede comprender RNA de origen natural, RNA sintetico o RNA recombinantemente producido, asf como RNA alterado que difiere del RNA de origen natural por la adicion, delecion, sustitucion y/o alteracion de uno o mas nucleotidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adicion de material no nucleotfdico, tal como al extremo de la molecula o a uno o mas nucleotidos internos del RNAi, incluyendo modificaciones que hagan al RNAi resistente a la digestion por nucleasas.
Los RNAi se pueden administrar en forma libre (desnuda) o mediante el uso de sistemas de suministro que potencien la estabilidad y/o el direccionamiento, tales como, por ejemplo, liposomas, o incorporados a otros vedculos, tales como hidrogeles, ciclodextrinas, nanocapsulas biodegradables, microesferas bioadhesivas o vectores proteicos (documento WO 00/53722), o en combinacion con un peptido cationico (documento US 2007275923). Tambien se pueden administrar en forma de sus precursores o de DNAs de codificacion.
En una realizacion particular, se encapsulan RNAi dentro de vesfculas, preferiblemente dentro de liposomas.
Tambien se puede utilizar acido nucleico antisentido para infrarregular la expresion del receptor TYRO3. El acido nucleico antisentido puede ser complementario de la totalidad o parte de un acido nucleico sentido que codifica un polipeptido de receptor TYRO3, por ejemplo, complementario de la cadena de codificacion de una molecula de cDNa de doble cadena o complementario de una secuencia de mRNA, y se cree que interfiere en la traduccion del mRNA diana.
En una realizacion preferida, el acido nucleico antisentido es una molecula de RNA complementaria de un mRNA diana que codifica un polipeptido de receptor TYRO3.
Un acido nucleico antisentido puede tener, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleotidos. Particularmente, las moleculas de RNA antisentido tienen normalmente una longitud de 1850 nucleotidos.
Se puede construir un acido nucleico antisentido para uso en el metodo de la invencion utilizando reacciones de
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smtesis qmmica y ligacion enzimatica, empleando procedimientos conocidos en la tecnica. Particularmente, el RNA antisentido puede ser qmmicamente sintetizado, producido por transcripcion in vitro de moldes lineales (por ejemplo, productos de PCR) o circulares (por ejemplo, vectores vmcos o no vmcos), o producido por transcripcion in vivo de vectores vmcos o no vmcos.
El acido nucleico antisentido puede ser modificado para que tenga una estabilidad potenciada, resistencia a nucleasas, especificidad por la diana y propiedades farmacologicas mejoradas. Por ejemplo, el acido nucleico antisentido puede incluir nucleotidos modificados, disenados para aumentar la estabilidad ffsica del duplex formado entre los acidos nucleicos antisentido y sentido, por ejemplo, derivados de fosforotioato y nucleotidos sustituidos por acridina.
Tambien se pueden emplear moleculas de ribozima para disminuir los niveles de receptor tirosina cinasa TYRO3 funcional. Las ribozimas son moleculas de RNA cataltticas con actividad ribonucleasa que son capaces de escindir un acido nucleico de cadena sencilla, tal como un mRNA, con el que tienen una region complementaria. De esta manera, se pueden emplear ribozimas para escindir catalfticamente transcritos de mRNA con objeto de inhibir asf la traduccion de la protema codificada por el mRNA. Se pueden disenar, producir y administrar moleculas de ribozima espedficas para receptor tirosina cinasa TYRO3 funcional mediante metodos comunmente conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Fanning y Symonds, 2006, en donde se revisa el uso terapeutico de ribozimas de cabeza de martillo y RNA pequeno en horquilla).
Los terminos "cancer" y "tumor", como se emplean en esta memoria, se refieren a la presencia de celulas que poseen caractensticas tipicas de celulas causantes de cancer, tales como proliferacion incontrolada, inmortalidad, potencial metastasico y ciertos rasgos morfologicos caractensticos. Estos terminos se refieren a cualquier tipo de malignidad (malignidad primaria o metastasis).
La expresion "cancer en que se sobreexpresa TYRO3", como se emplea en esta memoria, se refiere a cualquier tipo de cancer o tumor en que TYRO3 esta suprarregulado. El nivel de expresion de TYRO3 puede ser determinado en una muestra de cancer mediante una diversidad de tecnicas bien conocidas por la persona experta. El nivel de expresion de TYRO3 puede ser determinado midiendo la cantidad de protema TYRO3 o de mRNA TYRO3 o evaluando la actividad de TYRO3. La expresion de TYRO3 puede ser examinada mediante RT-PCR cuantitativa o utilizando cualquier metodo conocido por la persona experta en la tecnica. La expresion de TYRO3 en el tejido tumoral debena ser comparada con la expresion en lmeas celulares proliferativas normales, preferiblemente con la de celulas normales procedentes del mismo tejido que el del tumor. En una realizacion particular, el cancer en que se sobreexpresa TYRO3 es seleccionado del grupo que consiste en tumor de vejiga, linfoma difuso de celulas B grandes, carcinoma adenoide qrnstico de glandula salival, linfoma de Burkitt, mieloma multiple, adenocarcinoma ductal pancreatico, leucemia de celulas pilosas, cancer metastasico de prostata, melanoma y cancer colorrectal. En una realizacion preferida, el cancer en que se sobreexpresa TYRO3 es un tumor de vejiga.
Por "tumor de vejiga" se quiere significar en esta memoria tumor de vejiga urinaria, cancer de vejiga o cancer de vejiga urinaria, y neoplasia de vejiga o neoplasia de vejiga urinaria. Un tumor de vejiga puede ser un carcinoma de vejiga o un adenoma de vejiga. El sistema de desarrollo de fases mas comun para los tumores de vejiga es el sistema TNM (tumor, ganglio, metastasis; del ingles, tumor, node, metastasis). Este sistema de desarrollo de fases tiene en consideracion a que profundidad ha crecido el tumor en la vejiga, si hay cancer en los ganglios linfaticos y si el cancer se ha propagado a cualquier otra parte del cuerpo. En una realizacion preferida, el tumor de vejiga es un carcinoma de vejiga. En una realizacion preferida, el carcinoma de vejiga que se va a tratar esta en una fase T. Ademas, los carcinomas de vejiga de fase T pueden tener subfases:
CIS - solo se detectan celulas cancerosas muy precoces en la capa mas interna del epitelio de la vejiga;
Ta - el cancer esta justo en la capa mas interna del epitelio de la vejiga;
T1 - el cancer ha comenzado a desarrollarse en el tejido conjuntivo por debajo del epitelio de la vejiga;
T2 - el cancer se ha desarrollado a traves del tejido conjuntivo en el musculo;
T2a - el cancer se ha desarrollado en el musculo superficial;
T2b - el cancer se ha desarrollado en el musculo mas profundo;
T3 - el cancer se ha desarrollado a traves del musculo en la capa adiposa;
T3a - el cancer de la capa adiposa solo se puede ver bajo un microscopio;
T3b - el cancer de la capa adiposa se puede ver mediante ensayos o lo puede notar el medico;
T4 - el cancer se ha propagado fuera de la vejiga;
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T4a - el cancer se ha propagado a la prostata, el utero o la vagina;
T4b - el cancer se ha propagado a la pared de la pelvis y el abdomen.
En consecuencia, el tumor o carcinoma de vejiga que puede ser tratado mediante la presente invencion puede ser superficial (Ta, T1) o invasivo (de T2 a T4). En una realizacion particular, el carcinoma de vejiga que puede ser tratado mediante la presente invencion puede ser de cualquiera y todas las subfases T.
En una realizacion preferida, se examina una muestra del sujeto que se va a tratar, en particular una muestra de tumor de vejiga, en cuanto a la sobreexpresion de TYRO3. En consecuencia, el tratamiento con el inhibidor de TYRO3 es mas particularmente apropiado para un sujeto que tiene un tumor que sobreexpresa TYRO3, en particular un tumor de vejiga que sobreexpresa TYRO3.
Como se emplea en esta memoria, el termino "tratamiento" de una enfermedad se refiere a cualquier acto destinado a prolongar el tiempo de vida de los pacientes, tal como terapia y retraso de la enfermedad. El tratamiento puede ser disenado para erradicar el tumor, detener la progresion del tumor, evitar la aparicion de metastasis, promover la regresion del tumor y/o evitar una invasion muscular del cancer. El paciente que se va a tratar es cualquier animal mairnfero, preferiblemente un ser humano.
El tratamiento del cancer en que se sobreexpresa TYRO3 con una composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion se puede asociar con otra terapia, tal como cirugfa, terapia por radiacion u otra quimioterapia.
Mediante una "cantidad terapeuticamente eficaz" se quiere significar una cantidad de agente terapeutico, un inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3, administrada un paciente que es suficiente para constituir un tratamiento de un cancer en que se sobreexpresa TYRO3 como el anteriormente definido.
La composicion farmaceutica que comprende el inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3 se formula de acuerdo con la practica farmaceutica estandar [veanse, por ejemplo, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20a edicion), redactado por A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000, y "Encyclopedia of Pharmaceutical Technology", redactado por J. Swarbrick y J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York] conocida por una persona experta en la tecnica.
Las composiciones farmaceuticas posibles incluyen las adecuadas para administracion oral, rectal, intravesical, topica (incluyendo transdermica, bucal y sublingual) o parenteral (incluyendo subcutanea, intramuscular, intravenosa e intradermica). Para estas formulaciones se puede utilizar un excipiente convencional de acuerdo con tecnicas bien conocidas por los expertos en este campo tecnico.
Las composiciones para administracion parenteral son generalmente disoluciones o suspensiones esteriles y fisiologicamente compatibles que pueden ser opcionalmente preparadas inmediatamente antes de su uso a partir de una forma solida o liofilizada. Se pueden disolver agentes adyuvantes tales como agentes anestesicos locales, conservantes y tampones en el vehfculo y se puede incluir en la composicion un agente tensioactivo o humectante para facilitar la distribucion uniforme del ingrediente activo.
Para administracion oral, la composicion puede ser formulada en formas de dosificacion oral convencionales tales como tabletas, capsulas, polvos, granulos y preparaciones lfquidas tales como jarabes, elixires y gotas concentradas. Se pueden emplear vehfculos o diluyentes solidos atoxicos que incluyen, por ejemplo, manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio, y similares de calidad farmaceutica. Para las tabletas comprimidas tambien son necesarios agentes aglutinantes, que son agentes que imparten cualidades cohesivas a los materiales pulverulentos. Como agentes aglutinantes se pueden utilizar, por ejemplo, almidon, gelatina, azucares tales como lactosa y dextrosa, y gomas naturales o sinteticas. Tambien son necesarios agentes disgregantes en las tabletas para facilitar la descomposicion de la tableta. Los agentes disgregantes incluyen almidones, arcillas, celulosas, alginas, gomas y polfmeros reticulados. Ademas, tambien se incluyen lubricantes y agentes mejoradores de la fluencia en las tabletas para prevenir la adhesion del material de la tableta a superficies en el proceso de fabricacion y para mejorar las caractensticas de fluencia del material pulverulento durante la fabricacion. El dioxido de silicio coloidal es muy comunmente empleado como agente mejorador de la fluencia, y compuestos tales como el talco y acidos estearicos son muy comunmente empleados como lubricantes.
Para administracion transdermica, la composicion puede ser formulada en forma de unguento, crema o gel, y se podnan emplear agentes penetrantes o detergentes apropiados para facilitar la permeacion, tales como dimetilsulfoxido, dimetilacetamida y dimetilformamida.
Para administracion transmucosa se pueden emplear composiciones para pulverizacion nasal y supositorios rectales o vaginales. El compuesto activo se puede incorporar a cualquiera de las bases para supositorios conocidas mediante metodos conocidos en la tecnica. Los ejemplos de dichas bases incluyen manteca de cacao,
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polietilenglicoles (productos Carbowax), monoestearato de polietilensorbitan, y mezclas de estos con otros materiales compatibles para modificar el punto de fusion o la velocidad de disolucion.
Las composiciones farmaceuticas de acuerdo con la invencion se pueden formular para que sustancialmente liberen el farmaco activo inmediatamente despues de la administracion o en cualquier momento o periodo de tiempo predeterminados despues de la administracion.
Las composiciones farmaceuticas de acuerdo con la invencion pueden comprender uno o mas inhibidores del receptor tirosina cinasa TYRO3 asociados con excipientes y/o veldculos farmaceuticamente aceptables. Estos excipientes y/o vedculos se escogen de acuerdo con la forma de administracion, como se describio anteriormente. Tambien se pueden asociar otros compuestos activos con inhibidores del receptor tirosina cinasa TYRO3, en particular farmacos antitumorales tales como tamoxifeno, inhibidores de aromatasa, trastuzumab, compuestos analogos a GnRH, gemcitabina, docetaxel, paclitaxel, mitomicina, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, doxorrubicina, daunorrubicina, docetaxel, ciclofosfamida, epirrubicina, fluorouracilo, metotrexato, mitoxantrona, vinblastina, vincristina, vinorelbina, bleomicina, fosfato de estramustina y fosfato de etoposido. En una realizacion particular, se pueden asociar inhibidores del receptor tirosina cinasa TYRO3 con otras moleculas empleadas para el tratamiento del cancer de vejiga (por ejemplo, cisplatino, adriamicina, mitomicina C, gemcitabina, paclitaxel o docetaxel).
En una realizacion particular, la composicion farmaceutica comprende uno o mas inhibidores del receptor tirosina cinasa TYRO3 seleccionados del grupo que consiste en un anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular de TYRO3, una molecula de RNAi espedfica para TYRO3, particularmente un siRNA, un receptor negativo dominante que presenta un dominio cinasa muerto, y un receptor TYRO3 soluble.
En una realizacion preferida, la composicion farmaceutica comprende uno o mas inhibidores del receptor tirosina cinasa TYRO3 seleccionados del grupo que consiste en un anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular de TYRO3, una molecula de RNAi espedfica para TYRO3, particularmente un siRNA, un receptor negativo dominante que presenta un dominio cinasa muerto, un anticuerpo dirigido contra Gas6, y un receptor TYRO3 soluble.
La cantidad de inhibidor de receptor tirosina cinasa TYRO3 que se va a administrar ha de ser determinada mediante un procedimiento estandar bien conocido por quienes tienen una experiencia normal en la tecnica. Para determinar la dosificacion apropiada se han de tener en cuenta datos fisiologicos del paciente (por ejemplo, la edad, el tamano y el peso), las vfas de administracion y la enfermedad que se va a tratar.
El inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3 se puede administrar en una sola dosis o en multiples dosis. Si el inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3 es una molecula pequena que inhibe la actividad tirosina cinasa, cada dosis unitaria puede contener, por ejemplo, de 200 a 1000 mg/kg de peso corporal, particularmente de 500 a 800 mg/kg de peso corporal. Si el inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3 es un anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular de TYRO3, cada dosis unitaria puede contener, por ejemplo, de 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal, particularmente de 4 a 10 mg/kg de peso corporal. Si el inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3 es una molecula de RNAi espedfica para TYRO3, cada dosis unitaria puede contener, por ejemplo, de 2 a 50 mg/kg de peso corporal, particularmente de 5 a 20 mg/kg de peso corporal. Si el inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3 es un receptor negativo dominante que presenta un dominio cinasa muerto o es un receptor TYRO3 soluble, cada dosis unitaria puede contener, por ejemplo, de 5 a 100 mg/kg de peso corporal, particularmente de 15 a 70 mg/kg de peso corporal. Si el inhibidor es un anticuerpo dirigido contra Gas6 o la protema S, cada dosis unitaria puede contener, por ejemplo, de 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal, particularmente de 4 a 10 mg /kg de peso corporal.
El inhibidor de TYRO3 se puede utilizar en combinacion con otros ingredientes activos, en particular con otros inhibidores de TYRO3 o con otros tratamientos para el cancer, tales como tamoxifeno, inhibidores de aromatasa, trastuzumab, compuestos analogos a GnRH, gemcitabina, docetaxel, paclitaxel, mitomicina, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, doxorrubicina, daunorrubicina, docetaxel, ciclofosfamida, epirrubicina, fluorouracilo, metotrexato, mitoxantrona, vinblastina, vincristina, vinorelbina, bleomicina, fosfato de estramustina y fosfato de etoposido. En particular, el inhibidor de TYRO3 se puede emplear en combinacion con otros tratamientos para el cancer de vejiga, tales como el tratamiento con BCG (por ejemplo, documento WO 05/077411) y la administracion de farmacos anticancerosos, tales como, por ejemplo, cisplatino, adriamicina, mitomicina C, gemcitabina, paclitaxel y docetaxel. En este caso, los inhibidores de TYRO3 y las demas moleculas se pueden administrar simultanea o consecutivamente.
La presente invencion tambien se refiere al uso de un inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3 para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de un cancer en que se sobreexpresa TYRO3.
La presente invencion proporciona un metodo para explorar o identificar una molecula adecuada para tratar un cancer en que se sobreexpresa TYRO3. El metodo es un metodo in vitro.
En una realizacion particular, el cancer en que se sobreexpresa TYRO3 es seleccionado del grupo que consiste en tumor de vejiga, linfoma difuso de celulas B grandes, carcinoma adenoide qrnstico de glandula salival, linfoma de
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Este metodo se basa en el analisis de la capacidad de una molecula para unirse al receptor TYRO3, competir con o por un ligando del receptor TYRO3, disminuir la expresion del gen TYRO3 o disminuir la fosforilacion de los sustratos de TYRO3 o la autofosforilacion de TYRO3.
El metodo para explorar o identificar una molecula adecuada para tratar un cancer en que se sobreexpresa TYRO3 comprende las operaciones de (i) poner moleculas candidatas en contacto con celulas que expresan el receptor TYRO3, y (ii) seleccionar las moleculas que tienen la capacidad para unirse al receptor TYRO3 y/o competir con y/o por un ligando del receptor TYRO3 y/o disminuir la expresion del gen TYRO3 y/o disminuir la fosforilacion de los sustratos de TYRO3 o la autofosforilacion de TYRO3. Las celulas empleadas para esta exploracion pueden ser celulas que expresan un nivel elevado de TYRO3 endogeno, tales como la mayona de las lmeas celulares de vejiga, en particular las lmeas celulares J82 y RT112, o celulas geneticamente modificadas que sobreexpresan TYRO3 permitiendo una deteccion optimizada de la actividad tirosina cinasa. El metodo puede comprender una operacion (i') de determinacion de la capacidad de las moleculas candidatas para unirse al receptor TYRO3 y/o competir con y/o por un ligando del receptor TYRO3 y/o disminuir la fosforilacion de los sustratos de TYRO3 o la autofosforilacion de TYRO3.
La union de una molecula al receptor TYRO3 puede ser medida mediante tecnicas bien conocidas, tales como resonancia de plasmones superficiales, calorimetna y tecnologfa Biacore.
La capacidad de una molecula para competir con o por un ligando del receptor TYRO3 puede ser evaluada, por ejemplo, mediante experimentos de competicion con un ligando marcado, en particular un ligando radiomarcado, tecnologfa Biacore u observaciones espectroscopicas.
La expresion del gen TYRO3 puede ser evaluada con diferentes tecnicas bien conocidas, tales como RT-PCR cuantitativa, transferencia Northern, ensayo ELISA y transferencia Western.
El nivel de fosforilacion de TYRO3 puede ser evaluado por transferencia Western utilizando un anticuerpo anti- fosfotirosina o anti fosfo-TYRO3, un ensayo FlashPlate radiactivo, un ensayo de transferencia de energfa de resonancia con fluorescencia (FRET; del ingles, fluorescent resonance energy transfer) o un inmunoensayo de florescencia de lantanidos con disociacion potenciada (DELFIA; del ingles, dissociation-enhanced Janthanide fluorescence immunassay).
Este metodo, como se describio anteriormente, puede comprender ademas una operacion subsiguiente que consiste en administrar la molecula previamente seleccionada mediante el metodo in vitro de la invencion, como se describio anteriormente, a un modelo animal no humano con cancer en que se sobreexpresa TYRO3, en particular a un modelo animal no humano con tumor de vejiga, y analizar el efecto sobre la progresion del tumor. Se puede evaluar la eficacia de la molecula, por ejemplo, analizando el tiempo de vida de los animales, la aparicion de metastasis, la progresion del tumor, y la aparicion de invasion muscular del cancer. Todas estas caractensticas han de ser comparadas con las de testigos que consisten en modelos animales no humanos con cancer en que se sobreexpresa TYRO3, tal como un modelo animal no humano con tumor de vejiga, que no han recibido tratamiento. El modelo animal no humano puede ser ratones desnudos con tumor injertado. En una realizacion particular, el tumor injertado es un tumor de vejiga.
Los ejemplos siguientes se presentan con fines de ilustracion y no a modo de limitacion.
Ejemplos
Ejemplo 1: Sobreexpresion de TYRO3 y GAS6 en tumores de vejiga
Se analizaron los niveles de RNA en 80 carcinomas de vejiga y 5 urotelios de vejiga normales usando micromatrices de DNA Affymetrix U95A. Se empleo el software SAM (
http://www.stat.stanford.edu/~tibs/SAM) para identificar genes que presentaban expresion diferencial entre muestras tumorales y normales. El software SAM con los parametros "mdice de descubrimientos falsos de 10%" y "factor de cambio SAM de al menos 2" permitio identificar 823 conjuntos de sondas significativamente mas intensamente expresados en tumores en comparacion con el urotelio normal, y 477 conjuntos de sondas menos intensamente expresados en tumores.
Entre estos genes suprarregulados el enfoque se realizo sobre TYRO-3 cinasa, y los resultados obtenidos con SAM fueron confirmados utilizando una prueba de ANOVA (Figura 1B). Luego se comparo el nivel de RNA de TYRO3 (datos de chips de DNA Affymetrix MAS 5) en cada muestra tumoral con la distribucion de niveles de RNA de TYRO3 en muestras normales, y la diferencia fue considerada significativa si excedfa de tres desviaciones estandares (unidad tipificada z > 3, p < 0,0013). TYRO3 estaba significativamente sobreexpresado en 57/80 tumores
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(71%). Esta sobreexpresion era independiente de la fase y el grado tumorales (Figura 1A). Estos resultados obtenidos a partir de datos de Affymetrix se confirmaron mediante un analisis por Q-RT-PCR (datos no mostrados).
Resulta interesante que GAS6, el unico ligando conocido de TYRO3, tambien estaba significativamente sobreexpresado en tumores invasivos en comparacion con tumores normales o superficiales (analisis SAM de genes diferencialmente expresados entre muestras normales e invasivas o entre tumores superficiales e invasivos, confirmado mediante una prueba de ANOVA) (Figura 2A).
No se observo correlacion alguna entre nivel de expresion de mRNA y numero de copias de DNA en el locus TYRO3 ni el locus GAS6, lo que sugiere que las sobreexpresiones de TYRO3 y GAS6 no se debfan a una multiplicacion de DNA. Una hibridacion in situ mostro que TYRO3 era expresado por celulas epiteliales mientras que GAS6 es expresado por celulas tanto epiteliales como estromales, lo que sugiere una posible activacion autocrina o paracrina de TYRO3 por GAS6 en tumores invasivos y un refuerzo del papel de TYRO3 en esos carcinomas (datos no mostrados). No se hallo mutacion alguna de TYRO3 en un subconjunto de 15 muestras de tumor de vejiga que expresaban diversos niveles de mRNA de TYRO3.
Ejemplo 2: Efecto de la inhibicion de la actividad de TYRO3 en celulas de tumor de vejiga
Para explorar el papel de TYRO3 en el carcinoma de vejiga, el primer paso fue identificar lmeas celulares procedentes de cancer de vejiga que simularan tumores superficiales que solo expresan TYRO3 y tumores invasivos que expresan tanto TYRO3 como GAS6. Por lo tanto, se investigaron los niveles de expresion de mRNA de TYRO3 y GAS6 en 8 lmeas celulares procedentes de cancer de vejiga [lmeas celulares T24, RT4, KK47, TCCSUP, EJ138, J82 y RT112 (ATCC) y lmea celular MGH-U3 (Lin et al., 1985)] y en una lmea celular procedente de urotelio normal, NHU (ATCC), mediante Q-RT-PCR (Figura 3). Todas las lmeas celulares tumorales estudiadas expresaban TYRO3 mas intensamente que la lmea celular proliferativa normal, lo que sugiere que la expresion de TYRO3 dependfa del cancer y no estaba vinculada a la proliferacion celular.
Con objeto de investigar el papel de TYRO3 en el crecimiento celular y las propiedades tumorigenicas, se bloqueo la expresion de TYRO3 usando la tecnologfa de interferencia por RNA o se inhibio la actividad de TYRO3 utilizando un anticuerpo bloqueante dirigido contra el dominio extracelular de TYRO3 o un receptor soluble consistente en el dominio extracelular recombinante de TYRO3 producido en bacterias. Se emplearon dos lmeas celulares que expresaban TYRO3 (MGH-U3 y KK47), dos lmeas celulares que expresaban tanto TYRO3 como GAS6 (J82 y RT112) y una lmea celular testigo procedente de cancer de mama que presentaba un bajfsimo nivel de expresion de TYRO3 (MCF-7). Se mostro por transferencia Western, utilizando un anticuerpo anti-fosfotirosina despues de la inmunoprecipitacion de TYRO3, que en cada tipo de lmea celular (expresase GAS6 o no) estaba activado TYRO3 (datos no mostrados).
La transfeccion de celulas MGH-U3, KK47, J82 y RT112 con siRNAs de TYRO3 disminuyo acusadamente los niveles de mRNA y protema TYRO3 (inhibicion de 80-90%) (en la Figura 4 se presentan los resultados para las celulas MGH-U3). Esta reduccion de actividad de TYRO3 produjo menos celulas MGH-U3, KK47, J82 y RT112 viables que el siRNA testigo (Figura 5) mientras que no tuvo efecto alguno sobre las celulas MCF7, lo que sugiere que el efecto observado despues de la transfeccion con el siRNA espedfico se debfa mas bien a un silenciamiento genico espedfico que a un efecto secundario. Tambien se obtuvo el mismo efecto sobre el crecimiento celular al bloquear TYRO3 usando unos anticuerpos policlonales dirigidos contra su dominio extracelular (Figura 6) o un receptor soluble recombinante que consistfa en el dominio extracelular entero de TYRO3 (aa 1 a 421) (Figura 7).
Este numero disminuido de celulas viables podna ser atribuido a un mdice apoptotico aumentado (Figura 8) con un cambio significativo aunque pequeno en la progresion del ciclo celular (Figura 9). La reduccion de actividad de TYRO3 tambien produjo menos colonias MGH-U3, KK47, RT112 y J82 viables en ensayos en agar blando, lo que demostraba que TYRO3 regulaba la supervivencia celular de celulas cancerosas clonogenicas (Figura 10).
Ejemplo 3: Estudios in vivo sobre el papel de TYRO3 en el crecimiento de celulas de cancer de vejiga
De este modo, nuestros resultados demostraron claramente que TYRO3 regula la supervivencia/proliferacion de celulas de cancer de vejiga in vitro. Se estudio el papel de este gen en el crecimiento de celulas de cancer de vejiga in vivo. Se implantaron subcutaneamente celulas J82 y MGH-U3 en ratones desnudos atfmicos. Una vez que se hubieron establecido los tumores, se seleccionaron aleatoriamente ratones para tratamiento con siRNA testigo o espedfico de TYRO3. En cuanto a los xenoinjertos de J82, dos semanas despues del comienzo del tratamiento solo se observaron tres tumores de 12 (Figuras 11A y 11B). En cuanto a los xenoinjertos de MGH-U3, despues de 21 dfas de tratamiento el volumen tumoral era un 70% menor en los ratones tratados con siRNA de TYRO3 que en los ratones tratados con siRNA testigo (prueba de suma de rangos de Wilcoxon, p < 0,001) (Figuras 12A y 12B).
Esta inhibicion del crecimiento tumoral estaba asociada con una disminucion significativa de los niveles de mRNA de TYRO3 (prueba t de Student, p < 0,001), medidos en un momento (3 dfas despues de la ultima inyeccion de siRNA) en que esta disminucion debena ser la minima (Figura 13). No se observo diferencia histologica alguna entre los
tumores tratados y los testigo (datos no mostrados), pero un analisis TUNEL demostro que la inhibicion del crecimiento tumoral se debfa a una apoptosis aumentada en los tumores tratados (datos no mostrados).
Tambien se examino in vivo la capacidad de un receptor soluble consistente en el dominio extracelular recombinante de TYRO3, producido en bacterias, para inducir una inhibicion del crecimiento de celulas de cancer de vejiga. Se 5 implantaron subcutaneamente celulas MGH-U3 en ratones desnudos atimicos. Una vez que se hubieron establecido los tumores, se seleccionaron aleatoriamente ratones para tratamiento con PBS o receptor TYRO3 soluble. Despues de 18 dfas de tratamiento, el volumen tumoral era un 70% menor en los ratones tratados con receptor TYRO3 soluble que en los ratones tratados con PBS (prueba de suma de rangos de Wilcoxon, p < 0,001) (Figuras 14A y 14B). Esta inhibicion del crecimiento tumoral se debfa a una apoptosis aumentada en los tumores tratados (Figura 10 15).
Considerados en conjunto, nuestros resultados permitieron identificar a TYRO3 como un gen principal implicado en el carcinoma de vejiga, que esta suprarregulado en la mayona de los casos (70-75% de los tumores) independientemente de la fase y/o el grado de los tumores y que es responsable de la supervivencia de celulas tumorales. Ademas, estos experimentos demuestran que los compuestos que inducen inhibicion o supresion de 15 TYRO3 provocan una apoptosis potenciada de celulas de tumor de vejiga y, en consecuencia, pueden ser empleados para tratar el tumor de vejiga.
Ejemplo 4: Sobreexpresion de TYRO3 en varios tipos de tumores
Puesto que se identifico una sobreexpresion de TYRO3 en tumores de vejiga y se demostro el papel antiapoptotico de TYRO3 en este contexto, los inventores se preguntaron si TYRO3 podna estar implicado en otros canceres y, en 20 consecuencia, podna ser empleado como una diana terapeutica para tratar esos tumores. Utilizando datos publicamente disponibles compilados en la pagina web de Oncomine, se identificaron 7 tipos de canceres en que TYRO3 estaba suprarregulado en tumores en comparacion con muestras normales: carcinoma de vejiga, linfoma difuso de celulas B grandes, carcinoma adenoide qrnstico de glandula salival, linfoma de Burkitt, mieloma multiple, adenocarcinoma ductal pancreatico y leucemia de celulas pilosas (Figuras 16A y 16B). Los inventores tambien 25 identificaron otro cancer, de prostata, en que la expresion de TYRO3 aumentaba durante la progresion tumoral, es decir, en canceres de prostata metastasicos, en comparacion con el carcinoma de prostata (datos no mostrados). Utilizando la base de datos GeneSapiens para obtener graficos de la expresion de TYRO3 en un amplio espectro de tejidos normales (Figura 17) y tumorales (Figura 18), tambien se identifico la sobreexpresion de TYRO3 en otros dos tipos de cancer: melanoma y cancer colorrectal.
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Claims (12)

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    REIVINDICACIONES
    1. Inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3 para uso en el tratamiento de un cancer en que se sobreexpresa TYRO3, seleccionado del grupo que consiste en tumor de vejiga, linfoma difuso de celulas B grandes, carcinoma adenoide qmstico de glandula salival, linfoma de Burkitt, mieloma multiple, adenocarcinoma ductal pancreatico, leucemia de celulas pilosas, cancer metastasico de prostata, melanoma y cancer colorrectal, en donde el inhibidor es seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo dirigido contra el dominio extracelular de TYRO3, una molecula de acido nucleico que interfiere espedficamente en la expresion de TYRO3, un receptor negativo dominante TYRO3 que presenta un dominio cinasa muerto, y un senuelo soluble de TYRO3, siendo dicho senuelo soluble de TYRO3 un receptor TYRO3 recombinante constituido por, al menos, un dominio de tipo Ig o de fibronectina III del dominio extracelular del receptor.
  2. 2. El inhibidor para uso segun la Reivindicacion 1, en donde la molecula de acido nucleico que interfiere espedficamente en la expresion de TYRO3 es un RNAi, un acido nucleico antisentido o una ribozima.
  3. 3. El inhibidor para uso segun la Reivindicacion 2, en donde el RNAi es un siRNA, en particular un siRNA que comprende una secuencia de ID. SEC. n° 1.
  4. 4. El inhibidor para uso segun la Reivindicacion 1, en donde el inhibidor es un receptor TYRO3 recombinante constituido por, al menos, un dominio de tipo Ig o de fibronectina III del dominio extracelular del receptor.
  5. 5. El inhibidor para uso segun cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en donde el inhibidor del receptor tirosina cinasa TYRO3 se utiliza en combinacion con otro ingrediente activo, en particular un farmaco antitumoral.
  6. 6. El inhibidor para uso segun la Reivindicacion 5, en donde el farmaco antitumoral es seleccionado del grupo que consiste en tamoxifeno, inhibidores de aromatasa, trastuzumab, compuestos analogos a GnRH, gemcitabina, docetaxel, paclitaxel, mitomicina, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, doxorrubicina, daunorrubicina, docetaxel, ciclofosfamida, epirrubicina, fluorouracilo, metotrexato, mitoxantrona, vinblastina, vincristina, vinorelbina, bleomicina, fosfato de estramustina y fosfato de etoposido.
  7. 7. Metodo in vitro para explorar o identificar una molecula adecuada para tratar un cancer en que se sobreexpresa TYRO3, en donde el metodo comprende las operaciones de (i) poner moleculas candidatas en contacto con celulas que expresan el receptor TYRO3, y (ii) seleccionar las moleculas que tienen la capacidad para unirse al receptor TYRO3 y/o competir con y/o por un ligando del receptor TYRO3 y/o disminuir la expresion del gen TYRO3 y/o disminuir la fosforilacion de los sustratos de TYRO3 o la autofosforilacion de TYRO3.
  8. 8. El metodo segun la Reivindicacion 7, que comprende ademas la operacion de administrar la molecula seleccionada mediante el metodo de la Reivindicacion 7 a un modelo animal no humano con cancer en que se sobreexpresa TYRO3 y analizar el efecto sobre la progresion de la enfermedad.
  9. 9. El metodo segun la Reivindicacion 8, en donde el cancer en que se sobreexpresa TYRO3 es un tumor de vejiga y el modelo animal no humano con cancer en que se sobreexpresa TYRO3 es un modelo animal no humano con tumor de vejiga.
  10. 10. El metodo de cualquiera de las Reivindicaciones 7 a 9, en donde el cancer en que se sobreexpresa TYRO3 es seleccionado del grupo que consiste en tumor de vejiga, linfoma difuso de celulas B grandes, carcinoma adenoide qmstico de glandula salival, linfoma de Burkitt, mieloma multiple, adenocarcinoma ductal pancreatico, leucemia de celulas pilosas, cancer metastasico de prostata, melanoma y cancer colorrectal.
  11. 11. El inhibidor para uso de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6 o el metodo de la Reivindicacion 10, en donde el cancer en que se sobreexpresa TYRO3 es tumor de vejiga.
  12. 12. El inhibidor para uso de la Reivindicacion 11, para uso en combinacion con otro tratamiento para el tumor de vejiga.
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