TWI501770B - 小干擾ＲＮＡｓ及預防、抑制及／或治療乳癌惡性病程之方法 - Google Patents

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Tzu Chun Cheng
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Li Ching Chen
Chih Hsiung Wu
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小干擾RNAs及預防、抑制及/或治療乳癌惡性病程之方法
本發明係關於小干擾RNA(siRNA)用於抑制α9-nAChR之表現從而抑制乳癌及預防/抑制/治療尼古丁衍生化合物誘發之乳癌(乳癌係因尼古丁衍生化合物所誘發)之惡性病程，以及確定此類乳癌惡性程度之方法。
乳癌為最普遍之惡性腫瘤且係女性癌症相關死亡之第二大主因。在過去五十年來，乳癌的發病率一直逐步地上升。據估計，在全球每年約有一百萬個婦女被診斷出乳癌，且超過41萬人死於這個疾病。各種風險因子可增加女性患乳癌的機率，例如年齡、個人及家族乳癌病史、暴露於輻射、社會及經濟階層、懷孕、月經初潮、停經期及初次懷孕的年齡。菸草，是受到最為廣泛研究的環境因子，其包含導致女性患乳癌風險之人類致癌物質。在美國及日本流行病學大規模的組群研究顯示，患有乳癌之風險與主動及被動吸煙相關。
先前研究利用在軟瓊脂轉形試驗及小鼠異體移植模型，顯示非癌性MCF-10A人類乳腺上皮細胞無論是暴露於香菸煙霧冷凝物或菸草特異致癌物質4-(甲基硝基胺}-1-(3-砒啶)-1-丁酮(NNK)中，皆會進行癌化轉型(Mei J ,Hu H ,McEntee M ,et al .Breast Cancer Res Treat 2003;79(1):95-105;Siriwardhana N ,Choudhary S,Wang HC .Breast Cancer Res Treat 2008;109(3)；427-41) 。體內試驗已顯示尼古丁可促進固體腫瘤生長，這建議尼古丁可能有助於腫瘤中細胞增生、侵襲及血管新生之病程。
人類神經組織已被報導具有最多的菸鹼乙醯膽鹼受體(nAChR)次單元之表現，這些nAChRs以α次單元(α1-α6)及β次單元(β2-β4)所組成之異種五聚物(heteropentamers)，或以α7-α10次單元所組成之同種五聚物(homopentamers)對稱分布於一個中心離子孔道存在。然而，反轉錄聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)、免疫墨點法及流式細胞儀分析提供了相當多的證據顯示在神經系統外之非神經細胞中(包含支氣管上皮細胞膜及內皮細胞)也有nAChR之表現(West KA,Brognard J,Clark AS,et al. J Clin Invest 2003;111(1):81-90;Egleton RD,Brown KC,Dasgupta P. Trends Pharmacol Sci 2008;29(3):151-8 .)。生理上，nAChR的配位體是乙醯膽鹼，然而，菸草成分，例如尼古丁和NNK亦已知為對nAChR具高親和力之激動劑(Schuller HM.. Life Sci 2007;80(24-25):2274-80;Schuller HM,Orloff M. Biochem Pharmacol 1998;55(9):1377-84 .)。吸菸已知是肺癌、大腸癌、膀胱炎及乳癌的顯著的危險因子，該等癌症皆表現α9-nAChR，意味著尼古丁和NNK可能以受體-依賴性方式作用(Wong HP,Yu L,Lam EK,et al. Toxicol Sci 2007;97(2):279-87;West KA,Brognard J,Clark AS,et al. J Clin Invest 2003;111(1):81-90;Wong HP,Yu L,Lam EK,et al. Toxicol Appl Pharmacol 2007;221(3):261-7;Chen RJ,Ho YS,Guo HR,et al. Toxicol Sci 2008;104(2):283-93 .)，Yung-Leun Shih等人表明，尼古丁可顯著地增加α9-nAChR mRNA及蛋白質於人類乳癌細胞之表現量(Yung-Leun Shih et al .,J .Agric .Food .Chem .2010,58,235-241 )。然而，該篇參考論文並未提及α9-nAChR之表現與乳癌腫瘤形成之關聯。陳清祥等人則研究Nic/尼古丁乙醯膽鹼受體(nAChR)結合是否會影響人類乳癌細胞中細胞週期蛋白D3之表現以及細胞週期蛋白D3在致癌作用中的角色。該細胞週期蛋白D3表現並沒有建議α9-nAChR本身的過度表現及活化。
與表達在正常神經細胞中之nAChR不同，大多數在癌症細胞株中存在nAChR的尚未被功能上特徵化(Egleton RD,Brown KC,Dasgupta P .Trends Pharmacol Sci 2008;29(3):151-8 .)。在癌症細胞中，可能扮演具化療藥物抗性的角色。尼古丁已被證實可保護細胞對抗細胞凋亡，因此nAChR拮抗劑具潛在之與已存在之化療藥物併用而增進化療反應之用途。
具較侵襲性疾病的乳癌病患之鑑定對於準確的預測及規劃適當療法極為重要，辨別與惡性腫瘤相關之基因表現(包括那些參與腫瘤惡性病程)的改變，顯然不僅僅是可用於全面性了解癌症，亦為發展新且合理的對抗癌症療法之先決條件。不幸的是，目前並沒有足夠精確的方法可檢測乳癌之惡性病程及轉移之潛能。
本發明提供一種siRNA分子，其係用於透過RNA干擾(RNAi)而抑制α9-nAChR基因之過度表現，其包含：正義股，其係具有至少SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或與其互補序列，該等序列可充分互補至該α9-nAChR基因之RNA，而使該siRNA分子透過RNA干擾直接切割所述RNA。
本發明亦提供一種預防及/或抑制及/或治療尼古丁衍生化合物誘發之乳癌之惡性病程之方法，其包含投予有效量之α9-nAChR抑制劑至個體以減少α9-nAChR表現，因而預防及/或抑制及/或治療尼古丁衍生化合物誘發之該乳癌之惡性病程。
本發明另提供一種診斷尼古丁衍生化合物誘發之乳癌之惡性程度之方法，其包含測試個體乳腺細胞或組織樣品中α9-nAChR之表現量；其中該升高大於兩倍之量表示該個體可能患有分化超過第一期之乳癌。
本發明出人意料的發現α9-nAChR的過度表現及活化與乳癌腫瘤形成相關，並發展出一些小干擾RNAs以抑制乳癌。此外，本發明驚人的發現α9-nAChR之表現與乳癌惡性病程及乳癌細胞轉形相關，特別是，α9-nAChR表現量增加與分化程度呈依賴關係。基於這些發現，α9-nAChR的表現可作為決定乳癌(特別是尼古丁衍生化合物誘發之乳癌)之惡性程度。
定義
術語「一種(a)」或「一種(an)」當與「包含」連用於申請專利範圍或說明書中，可能代表有一個，但也符合「一或多個」「至少一個」「一過多於一個」。
術語「過度表現」意指在細胞或生物體中的表現量高於正常細胞或生物體之表現量。
術語「標靶(target)」以各種不同形式出現於本文，且需由上下文之定義其意義。「標靶RNA」指信使RNA，其可被特定之siRNA直接對抗。「標靶序列」及「標靶位點」意指一序列其中mRNA與siRNA之正義股展現了不同程度之同源性，且與該反義股顯現了不同程度的互補性。術語「siRNA標靶」意指siRNA可直接對抗之基因、mRNA或蛋白質。同樣地，「標靶靜默」係指基因或其對應之mRNA或蛋白質之狀態。
術語「基因靜默」表示表現特異基因產物之過程係減少或減緩。基因靜默可採用許多途徑產生。用於本文中，若未特別指定，則基因靜默代表因RNA干擾(RNAi)所造成的基因產物表現降低(一已定義、透過部分特徵化的途徑使小干擾RNA(siRNA)與宿主蛋白質(如RNA誘發靜默複合物，RISC)一致作用使信使RNA(mRNA)以序列依賴方式降解)。基因靜默的量可以各種方式測量，包含但不限於北方墨點分析法、B-DNA技術、轉錄-敏感受體構築體、表現分析(如DNA晶片)或相關方式來測量轉錄物之量。另外，靜默之量(the level of silencing)可經由測量特異基因所編碼之蛋白質之量來決定，其可透過一些研究，包括西方墨點法分析、量測如具有螢光性質(如GFP)或酵素活性(如鹼性磷酸酶)之報導體蛋白之表現量，或其他方式量測。
術語「抑制標靶基因表現」表示本發明之siRNA分子使標靶基因(如α9-nAChR基因)靜默、減少或抑制表現之能力。為了檢驗基因靜默的程度，一測試樣品(如一個令人感興趣可表現標靶基因之生物體中獲得的生物樣本或表現標靶基因之培養中細胞樣品)係與可使標靶基因靜默、減少或抑制表現之siRNA接觸。測試樣品中標靶基因之表現量與未與siRNA接觸或與為凌亂序列(scrambled sequences)之siRNA接觸之控制組樣品中標靶基因之表現量相比，控制組樣品定其數值為100%，標靶基因表現量之靜默、抑制或減少之達成係測試樣品與控制組樣品數值相比為約95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%或10%。合適的分析包括，例如使用技藝人士熟知之方式(如點墨點法、北方墨點法、原位雜交法、ELISA、免疫沉澱法、酶功能法)以檢驗蛋白質或mRNA表現量，或技藝人士熟知的表型檢測方式。
術語「小干擾核酸」、「siNA」、「小干擾RNA」、「siRNA」、「小干擾核酸分子」、「小干擾寡核酸分子」或「化學修飾之小干擾核酸分子」表示任何可抑制或向下調節標靶基因表現之核酸分子。這些分子長度可有所不同(基本上介於18-80鹼基對)，且在反義股中對於其標靶之mRNA具不同程度之互補性。有些(但非所有)的siRNA在其正義股及/或反義股之5'或3'端具有未配對之懸伸(overhang)鹼基。術語「siRNA」包含雙重之兩條分離股，及單股可形成具有雙重域之髮夾結構。
術語「互補」表示多核苷酸彼此形成鹼基對的能力。鹼基對典型地係透過反平行之多核苷酸鏈中核苷酸單元之間的氫鍵而形成。互補的多核酸鏈可以華生-克力克(Watson-Crick)方式(A配T、A配U、C配G)或以其他可形成雙重體(duplexes)之方式構成鹼基對，技藝人士應知，當使用RNA來對抗DNA時，與腺嘌呤(A)互補的鹼基係尿嘧啶(U)而不是胸腺嘧啶(T)，然而，當本發明文中使用U時，除非另有說明，否則隱含有以T替代之意義。完全或100%互補表示一條多核苷酸股之每一核苷酸單元可和另一條多核苷酸股之每一核苷酸單元以氫鍵結合之狀態。小於完全互補則意指兩股中，有些但非全部的核苷酸單元可以氫鍵結合另一者。例如，以兩條20-mers之多核苷酸股而言，若一股僅有2個鹼基可以氫鍵結合另外一股，則該多核苷酸股展現了10%的互補性；以相同的例子而言，若一股有18個鹼基可以氫鍵結合另外一股，則該多核苷酸股展現了90%的互補性。
術語「雙重區域(duplex region)」意謂兩相互補或實質上互補之多核苷酸，利用無論是華生-克力克鹼基對或其他使多核苷酸序列互補或實質上互補以形成穩定雙重體之方式，相互形成鹼基對之區域。
本文中術語「抑制劑」係指可抑制生物活性之化合物、分子或藥劑。術語「α9-尼古丁乙醯膽鹼受體抑制劑」係指實質上可抑制α9-尼古丁乙醯膽鹼受體(α9-nAChR)表現及活性且具有藥理上活性之抑制劑。該「α9-nAChR抑制劑」涵蓋天然化合物、內源性配位體及合成化合物，以及上述之醫藥上可接受之鹽類。抑制劑分子的實例包含但不限於胜肽、小分子、抗體、反義核酸、siRNA核酸及其他結合藥劑。
本文中術語「有效量」在這裡所指的是抑制劑可引起預期之效果之量或劑量，在一些實例中，有效劑量指足以抑制α9-nAChR表現的量。
本文中術語「樣品」意指一種生物樣品，例如由個體中所分離出之組織或液體(包含但不限於血漿、血清、腦脊液、淋巴液、眼淚、唾液或組織切片)或在體外細胞培養組成物。
術語「惡性」指癌症之嚴重形態，期可能僅影響癌細胞或可能透過血液或淋巴系統，擴散(轉移)至器官及骨骼。
術語「治療(treat)」、「治療(treatment)」或「治療(treating)」意指降低病人經歷乳癌症狀之頻率、程度、嚴重性及/或持續時間。
術語「防止(prevent)」、「預防(prevention)」或「防止(preventing)」意指抑制或避免乳癌相關之症狀。
本發明之小干擾RNA(siRNA)
本發明提供一種siRNA分子，其係用於透過RNA干擾(RNAi)而抑制α9-nAChR基因之過度表現，其包含：正義股，其係具有至少SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或與其互補序列，該等序列可充分互補至該α9-nAChR基因之RNA，而使該siRNA分子透過RNA干擾直接切割所述RNA。在本發明一實例中，該siRNA分子，其係進一步包含髮夾環形區域以及與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3互補序列之序列，或其互補序列，可充分互補至該α9-nAChR基因之RNA，而使該siRNA分子透過RNA干擾直接切割所述RNA。較佳地，該siRNA分子為包含如顯示於SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:7之序列。根據本發明，當siRNA分子具有為髮夾環形區，其可呈線形或髮夾彎形態，且線形及髮夾形兩者皆可用於透過RNA干擾而使基因表現靜默。此外，該髮夾環形區並非本發明siRNA分子必要之要件。即便siRNA分子不具有髮夾環，其仍可透過RNA干擾而使基因表現靜默。任何技術領域中已知之髮夾環皆可用於本發明，且其長度可有所變化。在一些實施例中，該環之長度係7、8、9、10、11、12或13個核苷酸。較佳地，該髮夾環形區域係TTCAAGAGA(SEQ ID NO:9)或TCTCTTGAA(SEQ ID NO:10)之序列。
在本發明之另一實施例，該siRNA分子係互補於上述之具髮夾環形區之序列；較佳地，這些序列係示於之SEQ ID NO:6及8之序列。
根據本發明，序列之互補性係具70%、80%、90%或100%互補於其對應序列。在一較佳之實施例中，該序列係分別完全互補於之SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:3之SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:4序列。在另一實施例中，該序列係分別完全互補於SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:7之SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:8之序列。
根據本發明，該siRNA分子長度係約19至80個核苷酸；較佳地，該siRNA分子長度係約19至約70、約19至約60、約19至約40、約19至約30個核苷酸。
根據本發明，SEQ ID NOs:1至8之序列如下所示：
SEQ ID NO:1
TGTGATCTCCTATGGCTGC
SEQ ID NO: 2
ACACTAGAGGATACCGACG
SEQ ID NO: 3
AAAGCAGCCAGGAACAAAG
SEQ ID NO: 4
HTCGTCGGTCCTTGTTTC
SEQ ID NO: 5
TGTGATCTCCTATGGCTGCTTCAAGAGAGCAGCCATAGGAGATCACA
SEQ ID NO: 6
ACACTAGAGGATACCGACGAAGTTCTCTCGTCGGTATCCTCTAGTGT
SEQ ID NO: 7
AAAGCAGCCAGGAACAAAGTTCAAGAGACTTTGTTCCTGGCTGCTTT
SEQ ID NO: 8
TTTCGTCGGTCCTTGTTTCAAGHCTCTGAAACAAGGACCGACGAAA
在本發明之一實施例中，該siRNA分子可進一步具有至少一個懸伸區(overhang region)；較佳地，每個懸伸區含6個或更少的核苷酸。懸伸區並非本發明siRNA分子必要之要件。根據本發明，懸伸區係在正義股或反義股中之非互補區域。懸伸區係在siRNA分子末端中一條非配對之核苷酸。這些非配對核苷酸可位於任何一股，而形成任一3'或5'之懸伸。較佳地，該具有懸伸區之siRNA分子序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示。
SEQ ID NOs:11、12、13及14之序列如下所示：
GATCCCCTGTGATCTCCTATGGCTGCTTCAAGAGAGCAGCCATAGGAGATCACATTTTTA(SEQ ID NO: 11)
AGCTTAAAAATGTGATCTCCTATGGCTGCTCTCTTGAAGCAGCCATAGGAGATCACAGGG(SEQ ID NO:12)
GATCCCCAAAGCAGCCAGGAACAAAGTTCAAGAGACTTTGTTCCTGGCTGCTTTTTTTTA(SEQ ID NO: 13)
AGCTTAAAAAAAAGCAGCCAGGAACAAAGTCTCTTGAACTTTGTTCCTGGCTGCTTTGGG(SEQ ID NO: 14)
本發明之siRNA分子可未經修飾或經化學修飾。本發明之siRNA可化學合成、載體表現或酵素合成。本發明以各種於細胞中透過RNA干擾而抑制之α9-nAChR基因表現或活性之化學合成之小干擾核酸分子(siRNA)為特徵。透過增加體內核酸酶分解抗性及/或增加細胞吸收，使用化學合成之siRNA可增進天然siRNA分子之效能，且與先前之研究報導相反，具多重化學修飾之siRNA保留了其RNAi活性。本發明之siRNA分子提供了用於各種療法、診斷、標靶確認、基因體發現、基因工程及藥物基因體學有用之試劑及方法。
在一實施例中，本文所述之siRNA分子可進一步包含載體系統，例如，將siRNA分子傳送至哺乳動物之細胞中。非限制性之適用於本發明載體系統之實例包含有核酸-脂質微粒、微脂體、膠微粒、仿病毒顆粒(virosome)、核酸複合物及其混合物。在某些情況下，siRNA分子與脂質(如陽離子脂質)複合而形成微脂粒複合物(lipoplex)。在某些情況下，siRNA分子與聚合物(如陽離子聚合物，如聚乙烯亞胺(PEI))複合而形成聚複合體(polyplex)。siRNA分子也可能與環糊精或其聚合物複合，較佳地，該siRNA分子係封裝於核酸脂質微粒中。
本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含如本文所述之siRNA分子及醫藥上可接受之載劑。
預防及/或抑制及/或治療尼古丁衍生化合物誘發之乳癌之惡性病程之方法
在另一方面，本發明提供一種預防及/或抑制及/或治療尼古丁衍生化合物誘發之乳癌之惡性病程之方法，其包含投予有效量之α9-nAChR抑制劑至個體以減少α9-nAChR表現，因而預防及/或抑制及/或治療尼古丁衍生化合物誘發之該乳癌之惡性病程。
技術領域中已知尼古丁並不是一個致癌物質，但尼古丁之亞硝化作用切割了N-CH3 鍵結並失去甲醛後得到NNN(N'-亞硝基尼古丁)，或分別經由無論是切斷2'-N或5'-N鍵結而得到NNK(4-(甲基硝基胺}-t-(3-砒啶)-1-丁酮，NNK一詞的由來係「尼古丁衍生之亞硝基胺酮」)或NNA(4-甲基硝基胺)-4-{3-砒啶)-丁醇)(Cancer Research 45,935-944,March 1985 ，其全部內容納入作為參考)。
根據本發明，在本發明中之方法所用之α9-nAChR抑制劑係可降低α9-nAChR表現或活性之藥劑。任何各式各樣的α9-nAChR抑制劑皆可用於本發明之方法中。實例包含但不限於siRNA、反義RNA尼古丁、阿托平(atropine)、毒蕈鹼(muscarine)、士的寧(strychnine)、比枯枯靈鹼(bicuculline)、ICS-205.930、托烷司瓊(tropisetron)、d -筒箭毒鹼(d -tubocurarine)、甲基牛扁亭鹼(methylycaconitine)、α-雨傘節蛇毒(α-bungarotoxin)、PelA、Vc1.1(ACV1)、vcla、α-ImI、α-RgIA、α-ImII及RgtA(Biochemical Pharmacology 78(2009) pp. 693-702;Mol. Pharmacol 72:1406-1410,2007；及PNAS 2006,Vol. 103,No. 47,pp. 17880-17884，其全部內容納入作為參考)。
該α9-nAChR抑制劑在投藥時可與一或多種可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑調配。醫藥上可接受之載劑已為醫藥領域所已知，且描述於如Remington's Pharmaceutical Sciences,Gennaro,A R,ed.,20th edition,2000: Williams and Wilkins Pa.,USA，其全部內容納入作為參考)。雖然任何已知的合適載劑皆可併入本發明之醫藥調配物中，然而載劑的類型會依照不同的投藥模式以及使否用需要緩慢釋放而相異。投藥的途徑包含經口、經吸入、經頰、經注射、經皮下投藥之路徑，或以新穎之傳遞系統如保護型微脂體經口傳遞胜肽。
經口投藥時，較佳之載劑包含碳水化合物或多肽填充物，如糖類，包含乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；來自玉米、小麥、水稻、馬鈴薯或其他植物之澱粉；纖維素，如甲基纖維素，羥丙基甲基-纖維素或羧甲基纖維素鈉；膠體，包括阿拉伯膠及黃著膠；以及多肽，如明膠及膠原蛋白。若有需要，可以加入崩散劑或溶解劑，如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、藻酸或其鹽，如海藻酸鈉。若有需要，藥物可以奈米膠囊傳遞以保護其不受蛋白酶之蛋白酶解。該等載劑可使本文之組合物調配為可使病人食用之錠劑、藥丸、糖衣錠、膠囊、液體、凝膠劑、糖漿、泥漿、懸浮液等等。用於口服的藥物製劑可透過活性化合物與固體賦形劑的組合，若有需要則可加入適量的輔助劑，並將顆粒混合物加工後獲得錠劑或糖衣錠的核心。由於組合物可能為胜肽或核酸，該等胜肽及核酸較佳係置於脂質體調配物以避免降解。
本文中較佳之醫藥調配物係以靜脈注射或局部使用(如外用或皮下)給藥。
外用投藥之調配物可使用溶液、乳劑、及軟膏或凝膠之基底作為載體，該基底，舉例而言，可包含一或多個之下列物質：凡士林、羊毛脂聚乙二醇、蜂蠟、礦物油、稀釋劑(如水及酒精)、乳化劑和穩定劑。一要組合物之外用劑型亦可於添加增稠劑。若係用於經皮給藥，則該組合物可包括經皮貼片或離子導入裝置。
任何用於本發明方法之α9-nAChR抑制劑可與第二抗癌藥劑共同調配或共同投藥，該第二抗癌藥劑可為技藝中任何已知的抗癌藥劑。
用於本發明方法之正常α9-nAChR抑制劑之劑量依照不同的投藥路徑可由至10毫克/公斤/天至500毫克/公斤/天而變化。較佳地，該劑量係10-450、10-400、10-300、10-200、10-100、50-400、50-350、50-300、50-200、100-400、100-300或100-200毫克/公斤/天。特定劑量及傳遞方式之指示已提供於文獻中，且一般可為技術領域之醫生所獲得。那些技藝人士可因核苷酸、多肽或其抑制劑而採用不同的調配物。同樣地，傳遞核酸或多肽係因特定的細胞、細胞類型、接受治療之生物體、狀態及位置而相異。
本發明亦提供一種篩選可用於預防及/或抑制及/或治療尼古丁衍生化合物誘發之乳癌之惡性病程之化合物之方法，其包含將該化合物與過度表現α9-nAChR之細胞接觸，其中若該化合物可降低α9-nAChR之表現則該化合物可預防及/或抑制及/或治療惡性病程。
診斷尼古丁衍生化合物誘發之乳癌之惡性程度之方法及套組
在另一方面，本發明提供一種診斷尼古丁衍生化合物誘發之乳癌之惡性程度之方法，其包含測試個體乳腺細胞或組織樣品中α9-nAChR之表現量；其中該升高大於兩倍之量表示該個體可能患有分化超過第一期之乳癌。較佳地，若該升高大於十倍之量表示該個體可能患有分化超過第二期之乳癌，且該升高大於三十倍之量表示該個體可能患有分化超過第三期之乳癌。
本發明亦提供一種診斷套組，其包含可測量樣品中α9-nAChR表現量之探針或引子。根據本發明，α9-nAChR mRNA之表現量之升高與分化的期數呈依附關係。根據本發明，樣品可為個體中所分離出之組織或液體，其包含但不限於血漿、血清、腦脊液、淋巴液、眼淚、唾液及組織切片。例如，循環之癌細胞或轉移細胞會存在體液中。
在本發明診斷方法之一個實施例中，RNA樣品係先由個體中得到。接著，測量包含於該RNA樣品中編碼本發明蛋白質之RNA之量。該測量出得RNA量與控制組相比。在本發明之診斷方法之另一個實施例中，先由個體之細胞或組織得到蛋白質樣品，測量包含於該蛋白質樣品中本發明蛋白質的量，接著將量測出之蛋白質量與控制組相比。舉例來說，測量之方式包含SDS聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS polyacrylamide electrophoresis)，利用本發明抗體之方法，如西方墨點法、點墨點法、免疫沉澱法、酵素連結免疫吸附分析(ELISA)及免疫螢光法。
α9-nAChR對於尼古丁衍生化合物(如尼古丁)誘發之正常人類乳腺上皮細胞之轉化係重要的。本發明發現透過RNA干擾而減少人類乳腺上皮細胞中α9-nAChR次單元的表現可實質上抑制體內和體外之腫瘤生長。如過度表現α9-nAChR之乳腺細胞特質所顯示，α9-nAChR次單元可能為正常人類乳腺上皮細胞體內或體外之潛在致癌物。相較於正常細胞，α9-nAChR的表現一般而言在腫瘤細胞較高。α9-nAChR在腫瘤細胞的表現量大體上在較後期的乳癌中會增加。
以下實施例不應視為過度地限制本發明。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可在不背離本發明之精神或範疇的情況下對本文所討論之實施例進行修改及變化，而仍屬於本發明之範圍。
藥理試驗
細胞培養及病人樣品
所有人類乳癌腫瘤樣本(n=276)係根據機構審查委員會(P50012)核准之規約，由台北醫學大學附設醫院及國泰綜合醫院之匿名捐贈者所獲得之樣本。在組織學檢察，所有的病人樣本皆由超過80%的腫瘤組織所構成。所有的樣本(每一對腫瘤vs正常組織)皆根據臨床資料(如分期狀態)收集及分類。人類乳腺表皮腺癌細胞(MCF-7、MDA-MB-231、AU-565、MDA-MB-453及BT-483)及正常人類乳腺表皮纖維囊細胞株(MCF-10A及HBL-100)皆購自ATCC(美國菌種保存中心，Manassas，VA，USA)。MCF-10A細胞培養於完全的MCF-10A培養基中，即杜伯之改良老鷹之培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)與添加有100毫微克/毫升霍亂腸毒素、10微克/毫升胰島素、0.5微克/毫升皮質醇及20毫微克/毫升表皮生長因子(Life Technologies,Rockville,MD)之哈姆氏F12培養基以1:1混合。MCF-7、MDA-MB-231、HBL-100及MDA-MB-453皆培養於DMEM中，而AU565及BT-483則培養於RPMI-1640中。
細胞增生及存活率試驗
細胞生長、增生及存活皆以3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑(MTT)法測定(Chou YH,Ho YS,Wu CC,et al. Food Chem Toxicol 2007;45(8):1356-67. )。10 mM之尼古丁及NNK(Chemsyn,Lenexa,KS)之貯存液係以二甲基亞碸(DMSO)配製。該試驗以二重複樣品重複四次測試。
RNA分離及即時定量PCR
根據製造商的說明書，利用Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA)由人類細胞株及直接由病人(n=276)獲得之乳癌組織細胞樣品中抽取全部RNA。由原族群中隨機選擇一部分樣品(n=276中的50個)以RT-PCR檢測其中之nAChR表現量。經隨機選擇，與這些樣品相關的臨床資料經仔細的檢察以確定所選之樣品與原族群沒有實質上的差異。該nAChR-次單元特異引子以先前研究所述之方式合成(West KA,Brognard J, Clark AS,et al. J Clin Invest 2003;111(1):81-90. )(見下方之表1)。
及時定量PCR係使用LightCycler迴圈變溫器(thermocycler)(Roche Molecular Biochemicals,Mannheim,Germany)。使用內建軟體(Roche LightCycler Version 4)測量α9-nAChR mRNA螢光強度測量以β-葡萄糖醛酸酶的表現標準化。
RNA干擾
在MDA-MB-231乳癌細胞中，α5-及α9-nAChR分別以至少兩個獨立的siRNA消除其表現。每個siRNA皆使用凌亂序列(scrambled sequences)作為控制組(見表1)。經BLAST分析確認序列與其他人類基因無顯著的同源性後，該篩選出之序列插入經Bgl II及Hind III切割之pSUPER載體以得到pSUPER-Si α5-nAChR、pSUPER-Si α9-nAChR及pSUPER-凌亂載體。所有構築體以DNA序列分析確認之。轉染之方式業已為先前所報導(John M,Geick A,Hadwiger P,et al. Curr Protoc Mol Biol 2003;Chapter 26:Unit 26 2 )。簡言之，1.5×105 個細胞以磷酸鹽緩衝液沖洗兩次後，與0.5 μg的質體混合，利用使用吸管型之MP-100微孔電穿儀(Digital Bio,Seoul,Korea)，以固定之電壓1.2 kV給予一個持續20 ms之脈衝。
產生穩定表現nAChR-siRNA之細胞株
建構至少三株可穩定表現對抗α5-nAChR及α9-nAChR之siRNA或凌亂控制組siRNA之MDA-MB-231細胞株。所有實驗均使用每種細胞株的多個亞轉殖株，且具可再現性之結果。每個pSUPER-Si α5-nAChR、pSUPER-Si α9-nAChR及pSUPER-凌亂載體皆轉染至細胞中，並於72小時後，以G418(4 mg/mL)篩選穩定插入者。在30天的篩選培養基中，分離出兩株G418抗性轉殖株，Si α5-nAChR(Si α5)及Si α9-nAChR(Si α9)。這些轉殖株與對照組轉殖株相比(凌亂控制，Sc)，其mRNA及蛋白質量顯示大於80%的減少。
小鼠體內以表現α9-nAChR siRNA之乳癌細胞異體移植
透過G418篩選而建構具有穩定插入pSUPER-Si α9及pSUPER-Si α9凌亂序列之MDA-MB-231細胞。該細胞(5×106 )以皮下植入至6週大之NOD.CB17-PRKDC(SCID)/J(NOD-SCID)小鼠(n=5)(購自國科會動物中心，台北)。經腫瘤移植後，透過飲水投與尼古丁(10 mg/mL)六週後，將小鼠以乙醚麻醉至死。在實驗的過程中，腫瘤的大小以游標卡尺測量且腫瘤體積以下式估算：腫瘤大小=1/2xLxW2 ，其中L為腫瘤之長度，W為腫瘤之寬(Lee WS,Chen RJ,Wang YJ,et al. Int J Cancer 2003;106(1):125-37 )。實驗結束後，取出小鼠之皮下腫瘤腫塊並秤重。所有小鼠實驗步驟皆依據國際實驗動物管理評估及認證協會(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care,AALAC)所認可之方式進行。
生產尼古丁-及NNK-轉型之MCF-10A細胞
MCF-10A細胞以低劑量之尼古丁(10 μM)或NNK(1 μM)處理，以模仿長期暴露於這些致癌物質的細胞(Mei J,Hu H,McEntee M, et al. Breast Cancer Res Treat 2003;79(1):95-105;Narayan S,Jaiswal AS,Kang D,et al. Oncogene 2004;23(35):5880-9 )。細胞每4天繼代培養，且每次繼代之細胞皆使用尼古丁及NNK處理48小時。兩個月後，該尼古丁-及NNK-轉型之細胞(MCF-10A-Nic及MCF-10A-NNK)以帶有可條件性控制(Tet-off)之α9-nAChR轉基因之腺病毒感染。
構築α9-nAChR腺病毒Tet-off表現載體
含有編碼α9-nAChR基因的PCR片段以編寫有EcoRI位點之前置引子5'-GTTGAATTCATGAACTGGTCCCATTCCTGC-3'(SEQ ID NO: 57)及編寫有BamHI位點之反置引子5'-GATGGATCCCTAATCCGCTCTTGCTATGAT-3'(SEQ ID NO: 58)產生(見表1)。以有EcoRI及BamHI切割後，該片斷接合至pTRE-Shuttle載體。該構築載體之完整性以限制切割及DNA序列分析確認。該Tet-反應性表現卡匣(cassette)以I-CeuI及I-SceI核酸內切酶由重組p-TRE-Shuttle質體切除後接合至已預切割之腺病毒-X病毒DNA。重組的腺病毒-X病毒DNA在大腸桿菌中增殖並以PacI切割成線型狀，並轉染至低代HEK293細胞。HEK293細胞以重組病毒感染後，在80%細胞脫離培養平盤後，收集生長培養基以產生高力價之病毒儲存液。
產生腺病毒-X Tet-off α9-nAChR-過度表現細胞
該以尼古丁-及NNK-轉型之細胞(MCF-10A-Nic及 MCF-10A-NNK)以每個培養皿中106 個細胞之密度，培養於60-mm培養皿中。兩天後，該細胞使用Tet-反應性重組病毒及四環黴素-控制轉活化因子病毒(BD Adeno-X Tet-off system,Clontech,Palo Alto,CA)，每個細胞以每種病毒株約五個溶菌斑之多重感染共感染。在37℃下於CO2 培養箱培育12小時後，移除該含病毒之培養基，並在存有或不存有1 μg/mL之四環黴素類似物多西黴素(Dox)(Dox+或Dox-)，加入含10%血清之新鮮培養基。此結果為建立了MCF-10A-Nic(DOX)及MCF-10A-NNK(DOX)細胞，其中移除DOX可誘發α9-nAChR之基因表現。
分離轉型之腺病毒-X Tet-off α9-nAChR-過度表現細胞
該MCF-10A-Nic(DOX)及MCF-10A-NNK(DOX)細胞培育於軟瓊脂上(見下方)。21天後，細胞群落自軟瓊脂上分離出並培育於5%之胰蛋白酶10分鐘，如先前研究所詳述(Mei J,Hu H,McEntee M,et al. Breast Cancer Res Treat 2003;79(1):95-105;Narayan S,Jaiswal AS,Kang D,et al.Oncogene 2004;23(35):5880-9 )。細胞分散於完全MCF-10A培養基中，培養於37℃下如同細胞株般培育。
軟瓊脂生長試驗
非附著性生長之α9-nAChR過度表現細胞(MCF-10A-Nic(DOX)及MCF-10A-NNK(DOX))及siRNA-表現MDA-MB-231 Si α5、Si α9及Sc細胞以軟瓊脂試驗觀察之。基礎層之培養基係含有0.9%低凝點SeaPlaque瓊脂膠(Sigma,St.Louis,MO,USA)之完全MCF-10A培養基。軟瓊脂之培養基為含有0.4%之SeaPlaque瓊脂膠之完全DMEM及F12培養基，與1×104 之細胞混合後倒入含基礎層之直徑60 mm之培養皿。細胞在倒入軟瓊脂前先與NNK(1 μM)或尼古丁(10 μM)處理。軟瓊脂培養於37℃下培養鵝外21天，並以Leica DMI 4000B顯微鏡成像系統(Leica Microsystems,Wetzlar,Germany)觀察群落出現，該試驗以雙重樣本四重複。
尼古丁-及NNK-轉型之MCF-10A細胞以及以α9-nAChR過度表現之受尼古丁轉型細胞異體移植之小鼠
BALB/c-nu/nu小鼠(雌性、4週大，每族群n=5)購自台北國科會動物中心，皮下注射MCF-10A-Nic(Dox)及載體控制(5×106 )細胞。經移植後，具腫瘤之小鼠透過飲水方式處理DOX(0.5 mg/mL)14天。之後，所有具腫瘤(200 mm3 )之小鼠分為表達α9-nAChR mRNA(DOX-)或非誘發之(DOX+)群組，後者可表現α9-nAChR mRNA基礎表現量。小鼠同時透過飲水以或不以尼古丁(10 mg/mL)處理額外六週。該移植瘤秤重並以瞬間以乾冰冷凍後保存於-80℃以用於RNA及蛋白質分析，或以福馬林固定及石蠟包埋以用於免疫組織觀察。
蛋白質萃取、西方墨點法及抗體
為了測試α9-nAChR蛋白質表現，Si α5、Si α9、Sc及MCF-10A-Nic(DOX+/-)細胞以冰冷的磷酸鹽緩衝食鹽水清洗並在冰上以含有蛋白酶抑制劑之細胞溶解液(50 mM Tris-HCl,pH 8.0，120 mM NaCl2 ，0.5%之乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40)，100 mM氟化鈉及200 mM之釩酸鈉)溶解細胞，詳述於(Shih,Y. L.,Liu,H. C.,Chen,C. S.,Hsu,C. H. et al.,J. Agric .Food Chem .2010,58,235-241 )。移植瘤組織以含有蛋白酶抑制劑之750 μL細胞溶解液解凍以檢察蛋白質表現。樣品在冰上以PRO 200均質機(PRO Scientific Inc.,Monroe,CT)設定為3(18,000 rpm)進行三次均勻化，每個樣品取蛋白質(50 μg)溶解於12%之十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳，轉移至硝酸纖維素膜後，以西方墨點法分析。老鼠抗甘油醛-3-磷酸去氫酶(GADPH)單株抗體及兔子抗-α9-nAChR單株抗體購自Abcam公司(Cambridge,MA)。鹼性磷酸酶偶合的抗鼠及抗兔IgG二抗係購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)。抗GAPDH及抗α9-nAChR初級抗體分別以1:2,000及1:8,000稀釋後培育兩小時，二級抗體以1:4,000稀釋後培育一小時。該試驗以雙重樣品進行二重複。
[ 3 H]-Nic平衡結合
L-(-)-[N-甲基-3 H]-Nic([3 H]-Nic)(71-75 Ci/mmol)購自Dupont/NEN Research Products(Boston,MA,USA)，游離鹼Nic(純度99%)購自The Eastman Kodak(Rochester,NY,USA)。為了研究單層MDA-MB-231細胞(2×106 cells/well)之[3 H]-Nic吸收，細胞先以含有140 mM NaCl、5.4 mM KCl、1.8 mM CaCl2 、0.8 mM MgSO4 、5 mM葡萄糖及25 mM Hepes/(pH 7.4)之緩衝液濕潤三次。飽和結合試驗則在6孔盤中，利用至少八種介於1至15 nM範圍之不同濃度中之[3 H]-Nic，於37℃下處理2 h。研究與時間相關之動力學則係以單一濃度之處理MDA-MB-231、Si α9、Sc細胞5、10、15、30、60及90分鐘。測定非特異性結合，則將10 nM未標記之Nic測定預加入培養基中，其後將細胞以冰冷緩衝液沖洗三次後暴露於[3 H]-Nic。[3 H]-Nic的吸收藉由抽走該吸收培養液及以冰冷緩衝液清洗每個孔洞3次而中斷。細胞以1 mL之0.5% Triton X-100溶解，而等分之細胞溶解物則轉移至塑膠閃爍計數瓶中，藉由閃爍計數以決定所結合之放射活性，該試驗以雙重樣品進行四重複。
雷射顯微細胞擷取(Laser capture microdissection)
準備乳癌樣品之冷凍切片以進行雷射顯微細胞擷取實驗。在此研究中，收集診斷為不同分期之腫瘤組織(第1至4期，n=11)。切片以HistGene(Arcturus Engineering,Mountain View,CA)染色後使用PixCell IIe系統(Arcturus Engineering,Mountain View,California)進行雷射顯微細胞擷取(Huang C,Yang L,Li Z,et al. Cancer Genet Cytogenet 2007;175(1):19-25 )。雷射顯微細胞擷取之參數設定為雷射直徑8 μm且激光功率為48-65 mW。對於每個樣品，以15,000之激光脈衝放電以捕捉~10,000形態上正常表皮細胞或惡性癌細胞。每個群組以顯微鏡觀察以確認所捕捉的細胞為均質的。該捕獲的細胞裝至含42 μL溶解緩衝液中之離心管並以標準方式(PicoPure RNA Isolation Kit,Arcturus Bioscience,Mountain View,CA)分離RNA。該分離出的RNA以反轉錄及即時定量PCR分析之。
免疫組織化學染色法及共軛焦顯微鏡
為測試是否可於人類乳癌細胞株中檢測到α9-nAChR，將人類乳癌細胞(MCF-7)接種於聚-L-離胺酸塗覆之玻片以共軛焦顯微鏡觀察。該玻片以FITC-標記之抗α9-nAChR抗體及玫紅(rhodamine)-標記之抗窖蛋白(caveolin)抗體在室溫下培育一小時，以磷酸緩衝之食鹽水清洗兩次，並以二級抗體在室溫下於濕室中培育額外30分鐘。該玻片以Leica TCS SP5共軛光譜顯微成像系統(Leica Microsystems,Wetzlar,Germany)觀測之。
乳癌腫瘤組織進一步以組織細胞化學染色定位α9-nAChR蛋白質。無論是由病人或由異體移植之腫瘤所切除之乳癌腫瘤細胞以石蠟包埋後，切為8 μM的薄片。在以微波使抗原恢復前，切片先預培育於3% H2 O2 及0.3% Triton X-100。對於α9-nAChR之免疫染色，切片先於Tris緩衝液(pH6)中微波10分鐘，接下來將切片以5%馬血清(Chemicon,Temecula,CA)阻滯30分鐘，並接著以1:400稀釋之α9-nAChR抗體於室溫中培育兩小時。接著以初級抗體培育後，使用購自DAKO(Carpinteria,CA,USA) LSAB 2套組，根據鏈抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶(streptavidin-biotin-peroxidase)之方式進行染色。簡言之，切片先以磷酸鹽緩衝液清洗後，以生物素標記之抗兔二級抗體培育，之後再以相同緩衝液沖洗後，培育於生物素蛋白-生物素-過氧化物酶複合物。在以基質-色素原溶液培育後，染色即結束。培育在含DAB溶液中的長度以低倍顯微鏡觀察而決定。玻片接著洗淨脫水及使用DPX(Sigma-Aldrich,St. Louis,MO)蓋上蓋玻片。相鄰區域及相同切片之一般組織方向皆以蘇木紫作對比染色。
統計方法
除非特別規定，否則所有數據之表示皆以至少三次試驗的95%信賴區間(CI)表示之。乳癌病人之正常組織及腫瘤組織以配對t -試驗檢定以比較α9-nAChR mRNA的表現量。以曼-惠特尼檢定法(Mann-Whitney test)以檢測細胞株中α9-nAChR mRNA的表現量及小鼠異種移植腫瘤中增加(Tet-off)或減低(siRNA)的α9-nAChR mRNA表現量之影響。以雪費檢定(Scheffe test)比較腫瘤與正常樣本(依照不同臨床分期標準由外科手術或雷射顯微激光擷取之所得之樣品)中α9-nAChR mRNA表現量的倍率。腫瘤細胞增生、體外Tet-調節α9-nAChR基因誘導、[3 H]-Nic受體結合活性及軟瓊脂試驗之統計差異以克魯克-衛理斯(Kruskal-Wallis)(無母數)檢定分析，而每個成對比較則是利用曼-惠特尼(Mann-Whitney)檢定。所有的統計比較均利用SigmaPlot圖表軟體及社會科學v.11.0.0(SPSS,Chicago,IL)統計軟體分析，所有統計試驗均採雙邊統計，p 值0.05或0.05以下則為統計上有意義。
實施例1、人類乳癌組織及乳癌細胞株中nAChR之表現
檢測正常(非惡性)人類乳腺細胞株(MCF-10A及HBL-100)以及人類乳癌細胞株(MDA-MB-231、MDA-MB-453、AU-565、BT-483及MCF-7)中nAChR次單元的表現。為了檢測在台灣乳癌病人中nAChR次單元的表現，切片人類乳癌腫瘤(n=50)及周圍正常組織並分別以RT-PCR檢測，所有的乳腺細胞株皆有相似的nAChR次單元(α5、α9及α10)表現量(圖1A)，主要存在於正常及惡性乳腺組織為三個相同的nAChR次單元(α5、α9及α10)(圖1B)。與正常組織相比，幾乎所有的癌症組織中α9-nAChR mRNA有上升的表現量(圖1G)。相反的，在癌症及正常配對樣本中，α5及α10-nAChR次單元mRNA的表現量沒有實質上的不同。
實施例2、在人類乳癌細胞生長中α9-nAChR所扮演的角色
為了探究α9-nAChR次單元可能在吸菸所誘發之人類乳腺組織致癌化所扮演的角色，建立一株受RNA干擾而減低其α9-nAChR表現的穩定MDA-MB-231細胞株，並建立一株α5-nAChR次單元表現量降低的MDA-MB-231細胞株作為控制組(圖1C)。由於α5-及α9-nAChR次單元對於細胞存活具重要作用，因此α5-及α9-nAChR次單元表現量皆靜默之細胞株無法建立。在親代MDA-MB-231(231)細胞以及穩定轉染凌亂載體(Sc)或α5-nAChR(Si α5) siRNA的細胞株，在經過1 μM NNK或10 μM尼古丁處理後，其細胞增生率皆有統計上意義的增加(Sc細胞在第11天，以DMSO處理者其平均OD540 nm =0.77、以尼古丁處理=1.35及以NNK處理=1.77；差異，尼古丁vs控制組=0.58、95% CI=0.48至0.68、P =.009；差異，NNK vs控制組=1.00,95% CI=0.9至1.1、P =.009;Si α5細胞在第5天，以DMSO處理者其平均OD540 nm =0.77、以尼古丁處理=1.35及以NNK處理=1.78；差異，尼古丁vs控制組=0.58、95% CI=0.48至0.68、P =.009；差異，NNK vs控制組=0.99、95% CI=0.89至1.09、P =.009)(圖1D)。與Sc細胞相比，經10 μM尼古丁、1 μM NNK及空白對照處理之Si α5，其細胞增生率係統計學上有意義的減少(以DMSO處理第11天時，Sc細胞平均OD540 nm =0.77且Si α9細胞=0.63；差異為1.34，95% CI=0.027至0.241、P =.009；以尼古丁處理第11天時，Sc細胞平均OD540 nm =1.35且Si α9細胞=0.63；差異為0.72，95% CI=0.65至0.79、P =.009；以NNK處理第11天時，Sc細胞平均OD540 nm =1.77且Si α9細胞=0.62；差異為1.15，95% CI=1.11至1.19、P =.009)。
以免疫染色接著以共軛焦顯微鏡觀察MCF-7乳癌細胞中與膜相關之α9-nAChR蛋白質(圖1E，如箭頭所示)。這些結果顯示菸草特異致癌成分(如NNK或尼古丁)所誘發之乳癌細胞增生可能是透果內源性α9-nAChR受體所介導。為了證實此假設，MDA-MB-231細胞以[3 H]-尼古丁處理來測試其配位體-受體結合能力。結果顯示MDA-MB-231細胞對結合之解離常數(Kd )為3 nM(圖1F，左欄)且在60分鐘達最大結合活性(圖1F，左欄)。與親代細胞或以凌亂(Sc)控制siRNA轉染的MDA-MB-231相比，以α9-nAChR siRNA轉染的(Si α9)MDA-MB-231細胞其平均[3 H]-尼古丁結合活性統計學上地顯著受到抑制(Si α9 cells與[3 H]-尼古丁結合=201.7 DPM，親代細胞=489.7 DPM，Sc細胞=450.6 DPM；差異，Si α9 vs親代細胞=288 DPM、95% CI=275至301 DPM、P =.009；差異，Si α9 vs Sc=248.3 DPM、95% CI=231至265.6 DPM、P =.009)。
實施例3、人類乳腺腫瘤組織中α9-nAChR之表現
如上所述，α9-nAChR次單位對於尼古丁誘發乳癌細胞之增生具重要性。以即時PCR分析276個腫瘤與腫瘤樣品配對之正常組織中α9-nAChR次單位的表現量(圖2A及2B)。相對於正常組織(綠線)，在腫瘤組織中PCR擴增曲線「左移」(圖2A，紅線)，其表明在所有的腫瘤樣品中具有較高的α9-nAChR表現量。該即時PCR結果經計算後，依據α9-nAChR mRNA表現量態樣將腫瘤分為兩組。於此，276個中的186個(67.3%)正常vs腫瘤組織配對落在α9-nAChR表現量於腫瘤組織中高於正常組織之群組(T>N)，且90個(32.7%)配對樣品落於正常組織中的表現量較腫瘤組織略高(N>T)之群組(圖2C)。在腫瘤表現量高於正常者之群組(T>N)總體而言，α9-nAChR於腫瘤細胞之表現量係正常細胞的7.8倍(正常細胞之套數=73,638 vs腫瘤細胞=497,655，差異=424,017，95% CI=285,647至709,664，p =.002)。此外，在186個腫瘤組織中有57個(30.6%)其α9-nAChR的表現量高達五倍增加(圖2C，柱狀3及4)。然而，在正常高於腫瘤(N>T)之群組中，幾乎所有的正常組織比上配對的腫瘤組織有小於五倍的α9-nAChR表現量圖(2C，柱狀5及6)。
實施例4、在晚期乳癌腫瘤組織中α9-nAChR之表現
將每個腫瘤vs正常組織配對根據腫瘤的臨床分期分類(圖2D)，晚期腫瘤與實質上α9-nAChR mRNA高表現量相關。數據以配對的腫瘤與正常組織平均倍數比率呈現，且比較零期(乳房腺管原位癌[DCIS])腫瘤vs正常配對組織與每個時期α9-nAChR mRNA表現量的倍數改變，如下所示：0期=1.0倍、1期=1.14倍、2期=3.51倍、3期=6.66倍、4期=18.88倍；差異，0期vs 1期=0.14倍，95% CI=0.09至0.19倍，P =.66；差異，0期vs 2期=2.51倍，95% CI=1.39至3.63倍，P =.047；差異，0期vs 3期=5.66倍，95% CI=3.67至7.65倍，P <.001；差異，0期vs 4期=17.88倍，95% CI=9.22至26.54倍，P <.001)。為了證實這些觀察，分別由11個腫瘤樣品中，以雷射顯微細胞擷取腫瘤及正常細胞，該雷射顯微細胞擷取細胞之α9-nAChR mRNA表現量以即時PCR分析測定之。α9-nAChR mRNA表現量之升高與分化之分期成呈現依賴性(1期=2.55倍，2期=11.66倍，3期=35.66倍；差異，1期vs 2期=9.08倍，95% CI=1.85至16.3-倍，P =.05；差異，1期vs 3期=33.1倍，95% CI=8.24至57.97-fold，P =.05)(圖2D及圖2D1)。接著，以免疫組織化學染色測定冷凍腫瘤切片中α9-nAChR蛋白質的分佈，發現在診斷為晚期的侵襲性導管及小葉癌中有升高的α9-nAChR蛋白質表現(圖2E，棕色染色之紅色方框中的黃色箭頭)。相反的，正常組織不表現大量的α9-nAChR(圖2E，綠色方框中的綠色箭頭)。在本研究，癌變前期乳房腺管原位癌腫瘤(DCIS，診斷為0期)vs正常配對組織中(n=10)，α9-nAChR mRNA及蛋白質的表現量沒有實質上的變化(圖2D，柱狀1與2，及圖2D2)。
實施例5、α9-nAChR之表現對MDA-MB-231細胞於轉型試驗中生長之影響
在軟瓊脂試驗中，帶有α9-nAChR siRNA(si α9)的MDA-MB-231細胞轉型之群落有統計上的減少(圖3A，柱狀1、4及7；群落數目：si α9細胞=140，Sc細胞=222，親代MDA-MB-231細胞=272；si α9 vs親代=132個群落，95% CI=93至170個群落，P =.009)；Si α9 vs Sc=82個群落，95% CI=33至130個群落，P =.009)。以尼古丁及NNK處理後，與那些帶有α9-nAChR siRNA(si α9)之細胞相比，親代MDA-MB-231細胞及帶有凌亂控制siRNA(Sc)之細胞轉型數量有統計上顯著的增加(圖3A)。在尼古丁處理後，尤以α9-nAChR表現細胞之群落顯著的增加(柱狀2、5及8；群落數目：si α9細胞=157，Sc細胞=357，親代細胞=341；si α9 vs親代=184個群落，95% CI=137至230個群落，P =.009；Si α9 vs Sc=200個群落，95% CI=164至235個群落，P =.009)。在NNK處理後，大多數α9-nAChR表現細胞群落有增加(柱狀3、6及9；群落數目：si α9細胞=164，Sc細胞=398，親代細胞=406；si α9 vs親代=242個群落，95% CI=218至266個群落，P =.009；Si α9 vs Sc=234個群落，95% CI=202至266個群落，P =.009)。以MDA-MB-231、Sc及si α9細胞腫瘤異體移植至SCID小鼠並餵以含尼古丁(10 mg/mL)之飲用水以觀察α9-nAChR siRNA在體內對細胞生長的影響。六週後，以尼古丁處理的帶有MDA-MB-231 si α9-腫瘤之小鼠其腫瘤體積及腫瘤重量係統計學上顯著的小於那些以尼古丁處理的帶有親代MDA-MB-231-腫瘤之小鼠(n=每個群組5隻小鼠；處理六週後之腫瘤體積，帶有si α9-腫瘤之小鼠vs帶有親代MDA-MB-231-腫瘤之小鼠係995.6 mm3 vs 2993.2 mm3 ；差異=1997.6 mm3 ，95% CI=1705至2290.2 mm3 ，P =.009；處理六週後之腫瘤重量，帶有si α9-腫瘤之小鼠vs帶有親代MDA-MB-231-腫瘤之小鼠係1.23 g vs 4.38 g；差異==3.14 g，95% CI=2.31 g至3.97 g,P =.009)(圖3C)。在腫瘤細胞移植六週後，將小鼠之腫瘤組織切除並以RT-RCR及西方墨點法分析，顯示具有α9-nAChR siRNA之腫瘤中α9-nAChR mRNA及蛋白質表現量有實質上的抑制(圖3E)。在同一腫瘤中，則α9-nAChR mRNA表現量沒有改變(圖3E)。
實施例6、過度表現α9-nAChR於正常人類乳腺表皮細胞之轉型及MCF-10A異體移植小鼠腫瘤生長之影響
為了探討α9-nAChR是否參與吸菸誘發之正常人類乳腺表皮(MCF-10A)細胞轉型，建立一種移除DOX後誘發α9-nAChR基因表現之MCF-10A(DOX)細胞。即時PCR分析顯示在移除DOX後，MCF-10A(DOX-)細胞在9-12小時α9-nAChR mRNA表現量到達最大(>200倍)(圖4A，右上方及圖4B，P =.009)。在移除DOX 24小時後，與控制組MCF-10A(DOX+)細胞相比，MCF-10A(DOX-)之細胞α9-nAChR蛋白質仍顯著的提升(圖4C，條帶1-4)。與控制組MCF-10A(DOX+)細胞相比，α9-nAChR過度表現之MCF-10A(DOX-)細胞有較高的細胞增生(圖5A，空白vs實心三角型，第7天，DOX+細胞平均OD540 =1.53、DOX-細胞平均OD540 =2.65，差異=1.12，95% CI=1.01至1.23，P =.009)。然而，尼古丁或NNK處理誘發之細胞增生僅在表現正常量之α9-nAChR之MCF-10A(DOX+)細胞株中可觀察到。
先前的動物模型中顯示，正常的人類乳現上皮(MCF-10A)細胞在體內可受NNK而轉型(Mei J,Hu H,McEntee M, et al. Breast Cancer Res Treat 2003;79(1):95-105 )。為模擬尼古丁受體結合之長期致癌作用於正常人類係乳腺上皮細胞轉型，根據Mei J,Hu H,McEntee M,et al. Breast Cancer Res Treat 2003;79(1):95-105 所述之方法，將MCF-10A(DOX+或DOX-)細胞以NNK(1 μM)或尼古丁(10 μM)長期(60天)處理。該以NNK或尼古丁處理的MCF-10A(DOX+或DOX-)細胞另以軟瓊脂培養21天，並以顯微鏡觀察群落形成(圖5B)。與NNK-處理之MCF-10A(DOX+)細胞相比，NNK-處理之MCF-10A(DOX-)細胞有較多的群落(圖5B，柱狀6 vs 3)。有趣的是，以尼古丁-處理的MCF-10A(DOX-)細胞形成6個群落(圖5B，柱狀3)，此為先前完全沒有被報導過的結果(Mei J,Hu H,McEntee M,et al. Breast Cancer Res Treat 2003;79(1):95-105 )，該結果顯示了長期暴露於低濃度的尼古丁，可誘發正常乳腺上皮細胞轉型，且α9-nAChR扮演了重要的角色。
由軟瓊脂群落曝露於尼古丁及NNK長期處理得到兩個轉型細胞株：MCF-10A-Nic(DOX)及MCF-10A-NNK(DOX)(圖5B，條帶5及6)。進行試驗以檢察是否在體內有或沒有尼古丁刺激下，α9-nAChR誘發可有效的促進腫瘤生長(圖6)。BALB/c-nu/nu小鼠皮下注射轉型MCF-10A-Nic(DOX)細胞(5×106 )。之後，將帶有腫瘤(200 mm3 )的小鼠分為表現α9-nAChR(DOX-)mRNA或不表現α9-nAChR(DOX+)mRNA之群組，且於飲用水中存有或不存有尼古丁(10 mg/mL)(每組n=5)。每週測量異體移植MCF-10A-Nic(DOX-)裸鼠之腫瘤體積，在尼古丁處理的第七週後有統計學上顯著的增加((+DOX，無尼古丁處理之腫瘤體積=266.2 mm3 vs尼古丁處理之腫瘤體積=501.6 mm3 ，差異=235.4 mm3 ，95% CI=112.7至358 mm3 ，P =.009)(圖5C，空心圓符號vs空心三角形符號)。尼古丁處理的小鼠在去除DOX後增強其腫瘤生長誘發(-DOX，無尼古丁處理之腫瘤體積=621.2 mm3 vs尼古丁處理之腫瘤體積=898.6 mm3 ，差異=277.4 mm3 ，95% CI=98.1至456.7 mm3 ，P =.016；尼古丁處理之腫瘤體積，DOX+vs DOX-=501.6 mm3 vs 898.6 mm3 ，差異=397 mm3 ，95% CI=241.3至552.6 mm3 ，P =.009)(圖5C，空心三角形符號vs實心三角形符號，及圖6)。無論有無DOX處理，空白對照載體小鼠皆未有腫瘤產生。這些結果再現了組織培養數據並顯示正常人類乳腺表皮細胞中α9-nAChR過度表達使其在暴露於尼古丁的反應變的敏感(圖5B，條帶5及6)。在腫瘤組織切除後，以RT-PCR及西方墨點法分析，發現體內MCF-10A-Nic(DOX)-異體移植之腫瘤α9-nAChR mRNA及蛋白質之表現實質上受誘發(圖5D)，組織化學染色亦顯示在MCF-10A-Nic(DOX-)腫瘤中α9-nAChR之表現實質上受誘發。
在人類乳癌中，很難有直接證據證實吸菸相關之α9-nAChR介導的致癌作用。因而執行流行病學群組研究來評估在不同分期的乳癌中，α9-nAChR表現的臨床意義及與台灣女性吸菸史的關連。在此研究中，共募有174個乳癌病患以評估吸菸史、臨床分期標準以及腫瘤vs正常配對樣本中α9-nAChR mRNA之表現分析(表2)。該結果顯示在吸菸組中，有7/18(38%)個乳癌組織診斷為晚期(3-4)。相反的，類似的發生率卻出現在被動(19/52，36.5%)及非吸菸(40/104，38%)之群組中早期(0-1)之腫瘤。此外，與那些非吸菸者相比，吸菸者的腫瘤組織中α9-nAChR mRNA表現量較高(6.62倍vs1.51倍，差異=5.11倍，95% CI=2.67至7.55倍，P =.003)。相反的，與非吸菸者相比，被動吸菸者腫瘤組織中α9-nAChR mRNA表現量有較低的倍率(2.81倍vs1.51倍，差異=1.3倍，95% CI=0.79至1.81倍，P =.256)。在本研究中，[3 H]-尼古丁結合試驗提供了人類乳癌中α9-nAChR與尼古丁結合活性之直接證據(圖1F)，這些結果皆歸結於尼古丁結合至nAChR對於人類乳癌有促進及發展的作用。
圖1顯示尼古丁-α9-尼古丁乙醯膽鹼受體(nAChR)結合在人類乳癌細胞增生中之角色。A)以反轉錄-聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)檢測正常及癌變之人類乳腺細胞株中nAChR次單元，MCF-7、MDA-MB-231、AU-565、MDA-MB-453及BT-483為轉型之人類乳癌細胞；MCF-10A及HBL-100則視為正常人類乳腺細胞株。人類SAEC(small airway epithelial，小呼吸道上皮)、NHBE(normal human bronchial epithelial，正常人類支氣管上皮)中nAChR次單元表現量亦以先前報導(West KA,Brognard J,Clark AS,et al. J Clin Invest 2003;111(1):81-90 )之方式檢測之。B)分離自50位乳癌患者之正常及腫瘤人類乳房組織不同nAChR次單元之相對mRNA表現量。cDNA用於RT-PCR檢測且實驗重複兩次，以發生百分比表示。C)表現α9-nAChR(Si α9)、α5-nAChR(Si α5)或凌亂(Sc)小干擾RNAs(siRNAs)之穩定MDA-MB-231細胞株中α5及α9 nAChR次單元之表現。α5-或α9-nAChRs表現特異性受抑制之細胞株係透過轉染及G418(4 mg/mL)篩選建立。α5及α9 mRNA表現量以RT-PCR檢測之，且α5及α9蛋白質表現量以西方墨點法(WB)檢測之。在每一種情況皆以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)的表現作為對照組。D)以二甲基亞碸DMSO vs尼古丁處理之細胞在Si α9、Sc及親代MDA-MB-231細胞，以及以DMSO vs尼古丁代謝物4-(甲基硝基胺)-1-(3-砒啶)-1-丁酮)(NNK)處理之細胞之細胞增生。親代MDA-MB-231細胞(231)及穩定轉染Si α5-、Sc或Si α9-siRNA之231細胞皆以尼古丁(10 μM)、NNK(1 μM)或單獨空白對照在G418篩選後繼續處理。每個群組之細胞以G418處理以確認成功表達pSUPER siRNA質體。以3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑(MTT)法測定細胞增生，其中在指定的時間點中有較高的OD540 nm反映了數量較多的細胞。實驗以雙樣本作四重複。數據點代表平均值，誤差長條(error bar)代表95%信賴區間，數據皆以無母數雙邊試驗(克魯克-衛理斯及曼-惠特尼檢定)分析。在第11天，以DMSO處理的MDA-MB-231、SC或Si α5細胞與尼古丁和NNK處理的細胞相比有有統計學上顯著的差異(所有比較之P=.009)。E)人類乳癌(MCF-7)細胞之共焦顯微鏡觀察α9-nAChR表現。使用螢光劑共軛之二級抗體偵測α9-nAChR，而玫紅(rhodamine)-共軛之螢光抗體則用以標記抗窖蛋白-1(caveolin-1)，顯示了α9-nAChR(左方，綠色)及細胞膜蛋白窖蛋白-1(中間，紅色)及合併後之影像(右方，黃色，比例尺=25米。F)[3 H]-尼古丁劑量依賴結合至人類乳癌MDA-MB-231細胞內源性α9-nAChR受體(左方)及[3 H]-尼古丁時間依賴結合至親代MDA-MB-231細胞(231)或穩定以α9-nAChR siRNA(Si α9)、凌亂控制(Sc) siRNAs轉型之231細胞(右方)。實驗以雙樣品重複四次，數據點代表平均值，誤差長條(error bar)代表95%信賴區間，數據皆以無母數雙邊試驗(克魯克-衛理斯及曼-惠特尼檢定)分析：表現Si α9之細胞與親代(231)或控制組細胞(Sc)相比，其結合至[3 H]-尼古丁有統計學上顯著的減少(兩者比較之P=.009)。G)人類乳癌組織中α9-尼古丁乙醯膽鹼受體(α9-nAChR)表現之分析。以反轉錄-聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)測定α9-nAChR mRNA表現量。在腫瘤或相鄰之正常組織中皆檢測到單一條帶之α9-nAChR及β-葡萄糖醛酸酶(GUS)轉錄體(分別為403及165個鹼基對)。PCR執行了30個循環，該瓊脂凝膠圖顯示50個隨機選擇及代表性病患。
圖2顯示在正常及惡性人類乳房組織中α9-尼古丁乙醯膽鹼受體(α9-nAChR)的表現量。A)以即時-聚合酶鏈鎖反應(PCR)偵測成對之人類乳房組織(紅線)及正常組織(綠線)中(n=276) α9-nAChR mRNA表現量。B) α9-nAChR mRNA表現量，186位病患檢體係腫瘤組織表現量高於正常組織(T>N) vs 90位病患檢體係正常組織表現量高於腫瘤組織(N>T)。拷貝數(每克mRNA有×105 )以平均即時PCR數據計算；誤差長條(error bar)代表95%信賴區間。群組1(T>N)之正常vs腫瘤組織，P=.002；群組2(N>T)之正常vs腫瘤組織，P=.16；數據以雙邊t試驗分析；P-值呈現雙邊。C)配對之腫瘤及正常組織樣品以α9-nAChR mRNA表現量差異之種類及程度分類。α9-nAChR mRNA表現量計算於圖2B係依據腫瘤及正常組織表現量之不同程度次分類為四組(<2，2-5，5-10及>10倍)，每組皆顯示發生百分率及腫瘤-正常配對之總數。D)依據臨床乳癌分類之腫瘤及正常組織配對群組中相對α9-nAChR mRNA表現量。依據相對α9-nAChR mRNA表現量所建立於圖2B之腫瘤-正常組織配對依據美國症照護期刊(American Journal of Critical Care)建議之臨床分期標準次分類為五組，數據係顯示於配對的腫瘤及正常組織中平均表現倍率，誤差長條(error bar)代表95%信賴區間，在各個分期之配對樣品數目係顯示於長條之上，數據利用全面性無母數試驗(克魯克-衛理斯檢定)分析，且以曼-惠特尼檢定分析多重比較，進行了下列之比較：0期vs 1期，P =.66；0期vs 2期，P =.047；0期vs 3期，P <.001；0期vs 4期，P <.001。所有P 值皆為雙邊。D1)以即時聚合酶鏈鎖反應偵測雷射顯微細胞擷取腫瘤及正常配對樣品中α9-nAChR mRNA表現量倍率差異。數據代表由不同階段之臨床分期1-4期中雷射顯微細胞擷取樣品之平均倍率；誤差長條(error bar)代表95%信賴區間，並執行1期vs 2期(P <0.01)及1期vs 3期(P <.001)之比較。數據分析採全面性無母數試驗(克魯克-衛理斯檢定)，且多重比較採雪費檢定(Scheffe test)分析，所有P 值皆為雙邊。D2)分析人類乳癌組織中α9-尼古丁乙醯膽鹼受體(α9-nAChR)的表現量。以免疫定位乳房腺管原位癌(DCIS)中之α9-nAChR蛋白。該腫瘤組織切為8μm的連續切片，接著以特異結合至人類α9-nAChR之抗體染色。N，正常；T，腫瘤；I.H.C，組織免疫化學染色；H.E.，蘇木紫及伊紅染色。在早期診斷為DCIS之腫瘤組織中α9-nAChR蛋白表現(棕色染色)沒有統計學上顯著的增加(圖2，D2，紅色方框，以黃色箭頭指示)。如預期般，正常組織不表現大量α9-nAChR(圖2，D2，綠色方框，以綠色箭頭指示)，比例尺=200微米。E)免疫定位人類侵襲性腺管及小葉乳癌組織中之α9-nAChR蛋白。該腫瘤組織切為8μm的連續切片，接著以特異結合至人類α9-nAChR之抗體染色。N，正常；T，腫瘤；I.H.C，組織免疫化學染色；H.E.，蘇木紫及伊紅染色。正常乳腺細胞以綠色框中之綠色箭頭指示，而惡性乳腺細胞則在紅色框中以黃色箭頭指示，比例尺=200微米。
圖3顯示了在軟瓊脂試驗及小鼠腫瘤生長中試驗表達α9-尼古丁乙醯膽鹼受體之短干擾RNA(α9-nAChR siRNA)之MDA-MB-231細胞致癌性。A)α9-nAChR活化對MDA-MB-231非依賴附著生長之影響。親代MDA-MB-231(231)細胞及表現α9-nAChR siRNA(Si α9)或凌亂控制Si RNA(Sc)之細胞在培養至軟瓊脂前以尼古丁代謝物4-(甲基硝基胺)-1-(3-砒啶)-1-丁酮)(NNK;1 μM)或尼古丁(Nic;10 μM))處理。每3 mm平盤的軟瓊脂中培養10,000個細胞，在21天後以結晶紫染色並在顯微鏡下記數群落的數目。實驗以雙樣本作四重複。數據顯示每個群組9個樣品之平均值，誤差長條(error bar)代表95%信賴區間。野生型MDA-MB-231(231)細胞暴露於二甲基亞碸(DMSO) vs尼古丁(P=.027)或DMSO vs NNK(P=.009)或凌亂載體控制(Sc)細胞暴露於DMSO vs尼古丁(P=.03)或DMSO vs NNK(P=.009)有統計學上顯著的差異。無論以DMSO、尼古丁或NNK處理，MDA-MB-231(231)細胞及凌亂載體控制(Sc)細胞之群落數目皆為統計學上顯著高於與帶有α9-nAChR siRNA細胞(P =.009)。數據分析採無母數試驗(克魯克-衛理斯及曼-惠特尼檢定檢定)，所有P 值皆為雙邊。B) MDA-MB-231細胞在裸鼠中α9-nAChR活化對致癌化之影響。野生型231細胞、Si α9細胞或凌亂siRNA控制組細胞(Sc)(1×107 )以皮下注射至每隻NOD.CB17-PRKDC(SCID)/J(NOD-SCID)小鼠的背上(N=5)，在腫瘤移植後，透過飲水施予尼古丁(10 mg/mL)六周直到犧牲小鼠。在藥物處理六周後，發現有腫瘤的出現。C,D)(B)之小鼠腫瘤體積及重量。分析每個群組的腫瘤樣品，數據顯示每組10隻小鼠平均腫瘤體積(C)及腫瘤重量(D)。誤差長條(error bar)代表95%信賴區間。由(C)所示，不管在有沒有尼古丁的處理下，源於帶有α9-nAChR siRNA之MDA-MB-231細胞腫瘤係統計學上顯著的小於那些源於親代(231)或控制組(Sc)細胞之腫瘤(P =.009)。由(D)所示，若小鼠以尼古丁餵食，則注射MDA-MB-231(231)細胞(P =.027)或凌亂載體控制組細胞(P =.009)之尼古丁處理小鼠之腫瘤重量較重。相較之下，無論是否以尼古丁處理之群組，注射含α9-nAChR siRNA之MDA-MB-231細胞之小鼠腫瘤均係統計學上顯著的小於其他的群組(P =.009)。數據分析採無母數試驗(克魯克-衛理斯及曼-惠特尼檢定檢定)，所有P 值皆為雙邊。E)腫瘤具沉默RNAs，nAChR次單元之表現。在實驗的最後，從小鼠中將腫瘤解剖取出，由腫瘤組織中分離總RNA及蛋白質裂解物，且分別以逆轉錄聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)及西方墨點法(WB)偵測α9及α5-nAChR mRNA和蛋白質表現量。以β-葡萄糖醛酸酶(GUS)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)作為對照。Si α9群組與Sc及231群組相比皆有統計學上顯著的差異(P =.009)。
圖4顯示透過以四環黴素為基礎(Tet-off)之控制系統建立過度表現α9-尼古丁乙醯膽鹼受體(α9-nAChR)之轉型人類乳腺上皮MCF-10A(DOX)細胞。A,B)可誘發之α9-nAChR表現。人類MCF-10A(DOX)細胞培養在含有10%血清及1 μg/mL四環黴素類似物，多西黴素(Dox)之新鮮培養基中。在移除DOX後，MCF-10A(DOC)細胞(指定為1440)之α9-nAChR mRNA表現呈現時間依賴反應。細胞僅感染腺病毒載體者(指定為neo)作為控制組。數據點代表平均值，誤差長條(error bar)代表95%信賴區間，在MCF-10A(DOX-)細胞中誘發之α9-nAChR表現量在第0 vs 9及小時做比較(P =.009)。每個樣品中分析β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因表現量作為內部控制，數據分析採無母數試驗(克魯克-衛理斯及曼-惠特尼檢定檢定)，所有P 值皆為雙邊。C)在移除DOX 24小時後，與控制組MCF-10A(DOX+)細胞相比(條帶5-8)，MCF-10A(DOX-)細胞中α9-nAChR蛋白質表現量大幅增加(條帶1-4)。
圖5顯示增進α9-菸鹼乙醯膽鹼受體(α9-nAChR)的表現對異體移植MCF-10A細胞小鼠致癌性的影響。A)透過移除多西黴素(DOX)誘發α9-nAChR表現之MCF-10A人類乳癌細胞增生。在存有或不存有DOX(1 μg/mL)下，細胞在指定的時間以尼古丁(Nic;10 μM)或尼古丁代謝物4-(甲基硝基胺)-1-(3-砒啶)-1-丁酮)(NNK;1 μM)處理，之後以3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑(MTT)法偵測細胞增生。在存有或不存有DOX(1 μg/mL)下，細胞以二甲基亞碸(DMSO)處理做為控制組。數據點代表平均值，誤差長條(error bar)代表95%信賴區間，分別進行DMSO+DOX+vsDMSO+DOX-(P =.009)，Nic+DOX+vs Nic+DOX-(P =.009)及NNK+DOX+vs NNK+DOX-(P =.009)之比較(P =.009)。實驗以重複樣品做四重複，數據分析採無母數試驗(克魯克-衛理斯及曼-惠特尼檢定檢定)，所有P 值皆為雙邊。C) MCF-10A(DOX)細胞體內致癌性。每隻BALB/c-nu/nu小鼠(雌性，4周大，n=20)皮下注射5×106 MCF-10A-Nic(DOX)細胞。在移植後，帶有腫瘤的小鼠透過飲水施予DOX(0.5 mg/mL)14天。之後，帶有腫瘤的小鼠分為表現α9-nAChR mRNA(DOX-)群組及不表現(DOX+)之群組，並在其飲水中給予或不給予尼古丁(10 mg/mL)(每個群組n=5)。紅色箭頭表示在第15天開始撤出DOX。數據代表每組10隻小鼠之平均腫瘤體積。誤差長條(error bar)代表95%信賴區間。分別進行DOX+Nic-vs DOX+Nic+(P =.009)及DOX+Nic+vs DOX-Nic+(P =.016)之比較。數據分析採無母數試驗(克魯克-衛理斯及曼-惠特尼檢定檢定)，所有P 值皆為雙邊。D)在MCF-10A(DOX+或-)腫瘤中α9-nAChR次單元之表現。在(C)之實驗最後，犧牲小鼠並且解剖其腫瘤，分別以逆轉錄聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)及西方墨點法(WB)偵測α9-nAChR mRNA和蛋白質表現量。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)之表現量作為對照。E)在MCF-10A-Nic(DOX)-異體移植乳癌腫瘤組織中α9-nAChR蛋白質免疫定位。在DOX-中可測得強α9-nAChR免疫反應性，但DOX+小鼠組織中卻無(箭頭)。比例尺=100微米；C，空白對照；Tet-off，移除四環黴素(DOX)。
圖6顯示體內處理異體移植尼古丁轉型MCF-10A細胞之小鼠及在多西黴素(DOX)移除後α9-尼古丁乙醯膽鹼受體(α9-nAChR)過度表現。在該研究，MCF-10A-Nic(DOX)轉型細胞株係以尼古丁長期處理軟瓊脂群落而得。移除DOX(DOX-)後α9-nAChR基因表現受誘發。A)由每組中選出四隻代表性雌鼠BALB/C-NU/nu小鼠(綠色方框)皮下注射MCF-10A-Nic(DOX)(5×106 )細胞。腺病毒載體轉染之MCF-10A(neo)細胞亦注射入小鼠作為陰性對照(數據未顯示)。帶有腫瘤之小鼠在其飲水中含有或不含尼古丁(10 mg/mL)下以DOX(0.5 mg/mL)處理，直到其腫瘤平均大小達20 mm3 。B)上述小鼠根據控制α9-nAChR mRNA之表現分成兩組，名為DOX+及DOX-(分別以紅及綠方框表示)，小鼠連續以其飲水中具有或不具有尼古丁(尼古丁+，10 mg/mL，vs尼古丁-)額外處理5週。
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<210>　47
<211>　60
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　nAchR α5 SC siRNA1-F引子
<220>
<221>　misc_feature
<222>　(1)..(60)
<223>　shRNA
<400>　47
<210>　48
<211>　60
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　nAchR α5 SC siRNA1-R引子
<220>
<221>　misc_feature
<222>　(1)..(60)
<223>　shRNA
<400>　48
<210>　49
<211>　60
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　nAchR α5 SC siRNA2-F引子
<220>
<221>　misc_feature
<222>　(1)..(60)
<223>　shRNA
<400>　49
<210>　50
<211>　60
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　nAchR α5 SC siRNA2-R引子
<220>
<221>　misc_feature
<222>　(1)..(60)
<223>　shRNA
<400>　50
<210>　51
<211>　18
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人類nAchR α9-F引子
<220>
<221>　misc_feature
<222>　(1)..(18)
<223>　用於即時PCR之合成寡核苷酸
<400>　51
<210>　52
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人類nAchR α9-R引子
<220>
<221>　misc_feature
<222>　(1)..(20)
<223>　用於即時PCR之合成寡核苷酸
<400>　52
<210>　53
<211>　23
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人類GUS-F引子
<220>
<221>　misc_feature
<222>　(1)..(23)
<223>　用於即時PCR之合成寡核苷酸
<400>　53
<210>　54
<211>　20
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人類GUS-R引子
<220>
<221>　misc_feature
<222>　(1)..(20)
<223>　用於即時PCR之合成寡核苷酸
<400>　54
<210>　55
<211>　31
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　nAchR α9 Tet-off-F引子
<220>
<221>　misc_feature
<222>　(1)..(31)
<223>　用於選殖之合成寡核苷酸
<400>　55
<210>　56
<211>　30
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　nAchR α9 Tet-off-R引子
<220>
<221>　misc_feature
<222>　(1)..(30)
<223>　用於選殖之合成寡核苷酸
<400>　56
<210>　57
<211>　30
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　前置引子
<220>
<221>　misc_feature
<222>　(1)..()
<223>　前置引子
<400>　57
<210>　58
<211>　30
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　反置引子
<220>
<221>　misc_feature
<222>　(1)..(30)
<223>　反置引子
<400>　58
(無元件符號說明)

Claims (12)

  1. 一種siRNA分子，其係用於透過RNA干擾(RNAi)而抑制α9-nAChR基因之過度表現，其包含：正義股，其係具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或與其互補序列，該等序列可充分互補至該α9-nAChR基因之RNA，而使該siRNA分子透過RNA干擾直接切割所述RNA。
  2. 如請求項1之siRNA分子，其中該互補序列係可完全與SEQ ID NO：1互補之SEQ ID NO：2序列，及可完全與SEQ ID NO：3互補之SEQ ID NO：4序列。
  3. 如請求項1之siRNA分子，其係進一步包含髮夾環形區域以及與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3互補序列之序列，或其互補序列，可充分互補至該α9-nAChR基因之RNA，而使該siRNA分子透過RNA干擾直接切割所述RNA。
  4. 如請求項3之siRNA分子，係可為線形或髮夾形態。
  5. 如請求項3之siRNA分子，其中該髮夾環形區域具有5、6、7、8、9、10、11、12或13個核苷酸之長度。
  6. 如請求項3之siRNA分子，其中該髮夾環形區域係TTCAAGAGA(SEQ ID NO：9)或TCTCTTGAA(SEQ ID NO：10)之序列。
  7. 如請求項3之siRNA分子，其包含如顯示於SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：7之序列。
  8. 如請求項3之siRNA分子，其中該互補序列係可完全與SEQ ID NO：5互補之SEQ ID NO：6序列，及可完全與SEQ ID NO：7互補之SEQ ID NO：8序列。
  9. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1之siRNA及醫藥上可接受之載劑。
  10. 一種α9-nAChR抑制劑之用途，其係用於製備預防及/或抑制及/或治療尼古丁衍生化合物誘發之乳癌之惡性病程之製劑，其中該α9-nAChR抑制劑為如請求項1至8項中任一項之siRNA分子。
  11. 如請求項10之用途，其中該α9-nAChR抑制劑係經口、經吸入、經頰、經注射、經皮下投藥之路徑或透過微脂體投藥。
  12. 如請求項10之用途，其中該α9-nAChR抑制劑之劑量範圍由10mg/kg/天至500mg/kg/天。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chen CS et al., Nicotine-induced human breast cancer cell proliferation attenuated by garcinol through down-regulation of the nicotinic receptor and cyclin D3 proteins. Breast Cancer Res Treat. 2011 Jan;125(1):73-87.Epub 2010 Mar 13. *
Shih YL et al., Combination treatment with luteolin and quercetin enhances antiproliferative effects in nicotine-treated MDA-MB-231 cells by down-regulating nicotinic acetylcholine receptors. J Agric Food Chem. 2010 Jan 13;58(1):235-41. *

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