ES2432537T3 - Pronóstico de cánceres de colon - Google Patents

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Takuya Kato
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Abstract

Un procedimiento para estimar el pronóstico en un paciente con carcinoma de colon, en el que se usa el nivel de expresión de RFP (RET finger protein) en una célula cancerosa aislada de un paciente con cáncer como indicador y en el que además, un nivel de expresión de RFP alto indica un pronóstico desfavorable.

Description

�
Pronostico de canceres de colon.
CAMPO TECNICO
[0001] La presente invencion se refiere a un procedimiento para estimar el pronostico de pacientes con cancer y el uso del mismo.
ANTECEDENTES DE LA TECNICA
[0002] Las histona desacetilasas (HDAC) participan en la carcinogenesis regulando la proliferacion, diferenciacion y supervivencia celular (bibliografia no patente 1 y 2). Los inhibidores de las HDAC (HDACi) han mostrado un profundo efecto sinergico en el tratamiento del cancer cuando se combinan con otros farmacos antineoplasicos (bibliografia no patente 2 y 3). No obstante, los mecanismos moleculares por los que se induce este sinergismo tras la adicion de un HDACi no se conocen por completo.
[0003] Estudios sistematicos in vitro han revelado que los HDACi pueden inducir la parada del crecimiento celular, la diferenciacion terminal y/o la inhibicion de la angiogenesis en celulas transformadas sin que se vean afectadas las celulas normales (bibliografia no patente 2, 3 y 5). Atendiendo a estos resultados in vitro, actualmente se estan probado varios HDACi en ensayos clinicos y uno de estos inhibidores, el acido hidroxamico suberoilanilida (SAHA) ha sido aprobado por la FDA para el tratamiento del linfoma cutaneo de celulas T (bibliografia no patente 4 y 5). Los HDACi tambien han mostrado efectos sinergicos o aditivos con una amplia variedad de reactivos antineoplasicos (bibliografia no patente 2 y 4). Asimismo, se sabe que la citotoxicidad de los farmacos quimioterapeuticos, como cisplatino, etoposido, 5-FU y doxorrubicina, se consigue en parte generando especies de oxigeno reactivas (ROS, por sus siglas en ingles) (bibliografia no patente 6 a 9). En consonancia con estos resultados, la alteracion de antioxidantes y su expresion genica relacionada modulan la resistencia a los farmacos quimioterapeuticos, probablemente a traves de su capacidad de eliminacion de ROS (bibliografia no patente 10 a 13). Este hecho respalda que la induccion de ROS por los farmacos quimioterapeuticos es importante para la citotoxicidad.
[Lista de citas]
[Bibliografia no patentes]
[0004]
[Bibliografia no patente 1] Yang, XJ. y Seto, E. The Rpd3/Hdal family of lysine deacetylases: from bacteria and yeast to mice and men. Nat Rev Mol Cell Biol. 9(3):206-18 (2008)
[Bibliografia no patente 2] Bolder, JE., Peart, MJ. y Johnstone, RW. Anticancer activities of histone deacetylase inhibitors. Nat Rev Drug Discov. 5(9):769-84 (2006).
[Bibliografia no patente 3] Minucci, S. y Pelicci, PG. Histone deacetylase inhibitors and the promise of epigenetic (and more) treatments for cancer. Nature Reviews Cancer. 6(1):38-51 (2006).
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[Bibliografia no patente 7] Kurosu, T., Fukuda, T., Miki, T. y Miura, O. BCL6 overexpression prevents increase in reactive oxygen species and inhibits apoptosis induced by chemotherapeutic reagents in B-cell lymphoma cells. Oncogene. 22(29):4459-68 (2003).
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[Bibliografia no patente 20] Shimono, Y., Murakami, H., Kawai, K., Wade, P.A., Shimokata, K. y Takahashi, M.: Mi-2 associates with BRG1 and RET finger protein at the distinct regions with transcriptional activating and repressing abilities. J. Biol. Chem. 278: 51638-51645 (2003)
[Bibliografia no patente 21] Shimono, K., Shimono, Y., Shimokata, K., Ishiguro, N., y Takahashi, M.: Microspherule protein 1, Mi-2�, and RET finger protein associate in the nucleolus and up-regulate ribosomal gene transcription. J. Biol. Chem. 280: 39436-39447 (2005)
[Descripcion de la invencion]
[Problema tecnico]
[0005] A menudo se usan diversos farmacos antineoplasicos en combinacion para el tratamiento del cancer. Aunque el uso combinado de farmacos antineoplasicos se lleva a cabo con la intencion de mejorar el efecto terapeutico, en ocasiones puede conllevar efectos adversos graves. Esto es debido a que muchos de los farmacos antineoplasicos usados actualmente van dirigidos a celulas que proliferan rapidamente y, por tanto, ejercen su toxicidad sobre celulas normales distintas de las celulas cancerosas.
[0006] Considerando los antecedentes mencionados mas arriba, un objeto es proporcionar medios para potenciar la accion de un farmaco antineoplasico o proporcionar un biomarcador util para conocer el pronostico de pacientes con cancer y el uso de los mismos, asi como contribuir a mejorar el resultado clinico del tratamiento del cancer.
[Solucion al problema]
[0007] Hasta la fecha, se ha mostrado que los HDACi alteran la expresion de la tiorredoxina y de TBP-2 regulando el estado de oxidacion de las celulas. Desde el punto de vista de este hecho, los presentes inventores han generado la hipotesis de que el HDACi regula el mecanismo antioxidante en las celulas, lo que hace a las celulas cancerosas sensibles a un farmaco antineoplasico. Para verificar la hipotesis, los presentes inventores se han centrado y estudiado exhaustivamente HDAC1 y RFP (RET finger protein). Las caracteristicas de HDAC1 son: 1) tiene una alta expresion en tumores humanos y 2) regula la proliferacion, diferenciacion y supervivencia de las celulas (Halkidou K, Gaughan L, Cook S, Leung HY, Neal DE, Robson CN. (2004). Upregulation and nuclear recruitment of HDAC1 in hormone refractory prostate cancer. Prostate 59: 177-189 (documento no patente 14); Glozak MA, Seto E. (2007). Histone deacetylases and cancer. Oncogene 26: 5420-5432 (documento no patente 15)). En la solicitud de patente de EE. UU. n.D 2004/146921 A1 se describe RFP como uno de los genes encontrado en experimentos con micromatrices como posible biomarcador del cancer de colon. Es concebible usar los ensayos de diagnostico tambien como ensayos de pronostico, aunque, en relacion general con los datos completos generados en el ensayo de micromatrices, con los ejemplos dirigidos solo al aspecto diagnostico y sin consideracion especifica hacia RFP, no hay especificaciones en particular relativas a la regulacion por incremento de RFP a este respecto. Las caracteristicas de RFP son: 1) tiene una alta expresion en una linea de celulas cancerosas; 2) su expresion en organismos vivos es localizada (Takahashi M, Inaguma Y, Hiai H, Hirose F. (1988). Developmentally regulated expression of a human quot;fingerquot;-containing gene encoded by the 5' half of the ret transforming gene. Mol Cell Biol. 4:1853-6 (documento no patente 16); Tezel, G. y col. M. (1999). Different nuclear/cytoplasmic distributions of RET finger protein in different cell types. Pathol. Int. 49: 881-886 (documento no patente 17)) y 3) los ratones que no expresan este gen (ratones knockout) no presentan un fenotipo de afecciones graves (datos no publicados). Como consecuencia, se ha descubierto que HDAC1 reduce la expresion de la proteina de union a tiorredoxina-2 (TBP-2), acelerando asi la resistencia de las celulas cancerosas al estres oxidativo. Asimismo, se ha observado que HDAC1 es reclutado al promotor del gen TBP-2 por un complejo proteico compuesto por RFP y un factor de transcripcion NF-Y. Ademas, la supresion de la expresion de RFP usando ARNi provoca la disgregacion del complejo proteico, dando lugar a un aumento considerable de la sensibilidad de las celulas cancerosas al cisplatino (que tambien es un farmaco antineoplasico inductor del estres oxidativo). Estos hechos revelan que RFP es un importante factor de regulacion que permite a las celulas cancerosas aumentar su resistencia a un farmaco antineoplasico y sugiere que la supresion de la expresion o la funcion de RFP potencia la accion de un farmaco antineoplasico, mejorando asi el resultado clinico del tratamiento del cancer.
[0008] Por otro lado, se ha observado que la alta expresion de RFP se correlaciona con la disminucion de la expresion de TBP-2 en el carcinoma de colon humano o con el pronostico desfavorable en pacientes con carcinoma de colon. Esto respalda la eficacia de la estrategia terapeutica de la supresion de la expresion o la funcion de RFP cuando se usan farmacos antineoplasicos y significa que se puede determinar la resistencia a los farmacos antineoplasicos examinando el nivel de expresion de RFP en las celulas cancerosas y la determinacion de los resultados constituye una informacion util que contribuye a determinar la politica de tratamiento (seleccion del metodo terapeutico eficaz y similares), mejorando el pronostico y la calidad de vida (CdV) de los pacientes. Como resultado de una investigacion mas profunda, se ha descubierto que la expresion de RFP se correlaciona con un pronostico desfavorable en pacientes con cancer de endometrio. Curiosamente, se han obtenido los siguientes resultados: cuando se observa una elevada expresion de RFP, el empleo de operaciones quirurgicas mas agresivas conllevan la mejora del pronostico. Como se menciono anteriormente, se ha demostrado que RFP es util como biomarcador (indicador) para estimar el pronostico de los pacientes con cancer. En particular, en el caso de cancer de endometrio, se sugiere que la expresion de RFP es un indicador util en la determinacion del procedimiento quirurgico.
[0009] La presente invencion se basa principalmente en los hallazgos y resultados mencionados anteriormente y que incluyen los siguientes:
[1] Un procedimiento para estimar el pronostico en un paciente con carcinoma de colon, en el que se usa el nivel de expresion de RFP en una celula cancerosa aislada de un paciente con cancer como indicador y en el que ademas, un nivel de expresion de RFP alto indica un pronostico desfavorable.
[2] Uso de un anticuerpo anti-RFP en el procedimiento segun [1].
La solicitud tambien describe:
[12] Un reactivo para estimar el pronostico en un paciente con cancer, que incluye un anticuerpo anti-RFP.
[13] El reactivo para estimar el pronostico segun [12], en el que el cancer es carcinoma de colon o cancer de endometrio.
[14] Un kit para estimar el pronostico en un paciente con cancer, que incluye un reactivo segun [12] o [13].
[15] El kit para estimar el pronostico segun [14], en el que el cancer es carcinoma de colon o cancer de endometrio.
[Efectos ventajosos]
[0010] El uso combinado de un agente potenciador de la accion mejora la accion de farmacos antineoplasicos, como el cisplatino, que tienen capacidad para inducir el estres oxidativo. Esto puede reducir la cantidad de farmaco antineoplasico que se tiene que usar o de los tipos de farmacos antineoplasicos (en los casos en los que se usan dos o mas tipos de farmacos antineoplasicos en combinacion). Ademas, los resultados clinicos del tratamiento pueden mejorar.
[Breve descripcion de los dibujos]
[0011]
[Fig. 1] Asociacion funcional entre HDAC1 y RFP. (a) Efecto del tratamiento con HDAC1 sobre la sensibilidad celular al estres oxidativo. Se trataron celulas HeLa durante 10 h con las dosis indicadas de H2O2 con o sin pretratamiento con TSA (500 nM) durante 3 h. Se determino la viabilidad de las celulas mediante un ensayo WST-1 y se definio el indice de supervivencia celular del grupo no tratado como 1. (b) Reduccion de la expresion endogena de HDAC1 mediada por ARN interferente pequeno (ARNip) en celulas HeLa. Se analizo el lisado celular total de celulas HeLa transfectadas con ARNip de HDCA1 o control mediante inmunotransferencia con anticuerpos anti-HDAC1. Se uso anti-�-actina como control de la carga. Se observo supresion de la expresion de HDAC1 en las celulas en la que se habia introducido HDAC1ip. (c), (d) Celulas HeLa transfectadas con ARNip de HDAC1 o control y tratadas con las dosis indicadas de H2O2 (10 h) en c y cisplatino (24 h) en d. Se determino la viabilidad celular y se calculo como se describe en a. En las celulas con expresion reducida de HDAC1, el grado de disminucion del indice de supervivencia celular es mayor en las celulas tratadas que en las control. (e) Disminucion de la expresion de RFP endogena mediada por ARNip en celulas HeLa. Se analizaron los lisados celulares totales de celulas HeLa transfectadas con ARNip de RFP o control mediante inmunotransferencia con anticuerpos anti-RFP y anti-�-actina. Se observo supresion de la expresion de RFP en las celulas en las que se habia introducido RFPip. (f), (g) Celulas HeLa transfectadas con ARNip de RFP o control y tratadas con las dosis indicadas de H2O2 (10 h) en f y cisplatino (24 h) en g. Se determino la viabilidad celular y se calculo como se describe en a. En las celulas con expresion reducida de RFP, el grado de disminucion del indice de supervivencia celular es mayor en las celulas tratadas que en las control.
[Fig. 2] Identificacion de los dominios de union entre HDAC1 y RFP. (a) HDAC1 interacciona con RFP. Las celulas HEK293 se cotransfectaron de forma transitoria con HDAC1-V5 y Flag-RFP. Los lisados celulares se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-V5 (panel superior) o anti-Flag (panel inferior) y los inmunoprecipitados se analizaron mediante inmunotransferencia con los anticuerpos indicados. Como control se usaron anticuerpos anti-HA. (b) Se inmunoprecipitaron HDAC1 y RFP endogenas con anticuerpos anti-HDAC1 (panel superior) y anti-RFP (panel inferior), respectivamente. Los inmunoprecipitados se analizaron mediante inmunotransferencia con anticuerpos anti-HDAC1 y anti-RFP. (c) Dominio de RFP necesario para la asociacion entre HDAC1 y RFP. Panel izquierdo: representacion esquematica de las construcciones de RFP. Se indican el dominio dedo de cinc tipo anillo caja B, superhelice y Rfp. Los fragmentos de ADNc correspondientes a los dominios indicados de RFP estan etiquetados con Flag. Panel derecho; las celulas HEK293 se cotransfectaron transitoriamente con las construcciones con delecion HDAC1-V15 y RFP etiquetado con Flag y se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-V5 seguido por inmunotransferencia con anticuerpos anti-Flag o anti-V5. El vector pFlag se uso como control. (d) Region de HDCA1 necesaria para la asociacion entre HDAC1 y RFP. Panel izquierdo: representacion esquematica de las construcciones de HDAC1. Los fragmentos de ADNc correspondientes a las regiones indicadas de HDAC1 se etiquetaron con V5. Las celulas HEK293 se cotransfectaron transitoriamente con las construcciones con delecion de Flag-RFP y HDAC1 etiquetado con V15 y se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-Flag seguido por inmunotransferencia con anticuerpos anti-V5 o anti-Flag. Las puntas de flecha indican los fragmentos coinmunoprecipitados. El vector pcDNA se uso como control.
[Fig. 3] TBP-2 es una diana comun de HDAC1 y RFP y es responsable de la sensibilizacion de las celulas cancerosas al H2O2 y al cisplatino. (a), (b) La disminucion de la expresion de HDCA1 o RFP causa el aumento de la expresion de TBP-2. Las celulas HeLa se transfectaron con ARNip de HDAC1, RFP o control. Los niveles de expresion de HDAC1, RFP o TBP-2 en estas celulas se analizaron mediante RT-PCR en a y mediante inmunotransferencia en b. Tanto en la RT-PCR como en la inmunotransferencia se observo un aumento de la expresion de TBP-2 mediante la reduccion de la expresion de HDAC1 o RFP. (c) Sobreexpresion de TBP-2 en celulas HeLa. Las celulas HeLa fueron transfectadas con TBP-2-V5 y la expresion de TBP-2-V5 se detecto mediante inmunotransferencia. (d), (e) Efecto de la sobreexpresion de TBP-2 sobre la sensibilidad de las celulas a H2O2 y cisplatino. Las celulas HeLa transfectadas con TBP-2-V5 y tratadas durante 10 h con H2O2 en d o durante 24 h con cisplatino en e. La viabilidad celular se determino mediante un ensayo WST-1 y el indice de supervivencia celular del grupo sin tratamiento se definio como 1. Se muestran los valores relativos con respecto a 1, el indice de supervivencia celular cuando no se llevo a cabo el tratamiento con H2O2 o cisplatino En celulas con sobreexpresion de TBP-2, el grado de disminucion del indice de supervivencia celular es mayor en las celulas tratadas que en las celulas control. (f) Las celulas HeLa se transfectaron con ARNip de HDAC1, RFP, TBP-2 o control. Los lisados celulares totales se analizaron mediante inmunotransferencia. Se muestra que la expresion de TBP-2 que se ha aumentado mediante la disminucion de la expresion de HDAC1 o RFP se suprimia mediante TBP-2ip. (g), (h) Las celulas HeLa se transfectaron como se describe en f. Las celulas se trataron durante 10 h con H2O2 (g) o durante 24 h con cisplatino (h). La viabilidad celular se midio y calculo como se describe en d, e. El indice de supervivencia celular en el momento en que se administran los farmacos, el cual se ha reducido mediante la disminucion de la expresion de HDAC1 o RFP, se disuelve parcialmente por la disminucion de la expresion de TBP-2.
[Fig. 4] HDAC1 y RFP regulan la expresion de TBP-2 y afectan a la sensibilidad celular al H2O2 y al cisplatino en lineas celulares de cancer de colon y de mama. (a) Se transfectaron celulas de cancer de colon (SW480, HT-29) y de mama (MDA-MB-231) con ARNip de HDCA1, RFP o control. Los lisados celulares totales se sometieron a inmunotransferencia. Se observo que cuando se reducia la expresion de HDAC1 y RFP en cada una de las lineas celulares, la expresion de TBP-2 aumentaba. (b), (c) Las celulas se transfectaron con ARNip de HDAC1, RFP o control y se trataron durante 10 h con H2O2 en b o durante 24 h con cisplatino en c. La viabilidad celular se determino mediante un ensayo WST-1 y el indice de supervivencia celular del grupo sin tratamiento se definio como
1. En las celulas con expresion reducida de HDAC1 o RFP, el grado de disminucion del indice de supervivencia celular es mayor en las celulas tratadas que en las celulas control.
[Fig. 5] RFP recluta HDAC1 al promotor de TBP-2 a traves de la interaccion con NF-YC. (a) El panel superior muestra una representacion esquematica del promotor de TBP-2. Se indican dos regiones usadas para el analisis ChIP (proximal y distal). El panel inferior muestra que HDAC1 y RFP son reclutados al promotor de TBP-2. La cromatina entrecruzada se inmunoprecipito usando los anticuerpos indicados. Se uso la PCR para detectar dos regiones del promotor de TBP-2 con cebadores correspondientes a las secuencias proximal y distal. «Entrada» representa la amplificacion por PCR del ADN de entrada total. (b) RFP recluta HDAC1 al promotor de TBP-2, que desacetila las histonas H3 y H4. La cromatina entrecruzada de las celulas NC1hc y RFP30hc se inmunoprecipito usando los anticuerpos indicados. La PCR se llevo a cabo como se describe en a. (c) RFP interacciona con NF-YC. Las celulas HEK293 se cotransfectaron de forma transitoria con Flag-RFP y NF-YC-V5. Los lisados celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-V5 (panel superior) o anti-Flag (panel inferior) y se analizaron mediante inmunotransferencia. Las flechas indican NF-YC-V5. Las puntas de flecha indican Flag-RFP. Como control se usaron anticuerpos anti-HA. (d) El RFP endogeno interacciona con NF-YC. Los inmunoprecipitados de las celulas con anti-RFP o IgG control se analizaron mediante inmunotransferencia con anticuerpos anti-RFP y anti-NF-YC. (e) Coinmunoprecipitacion de HDAC1 y RFP con NF-YC. Las celulas HEK293 se cotransfectaron con Flag-HDAC1, Flag-RFP y NF-YC-V5 y se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-V5; los inmunoprecipitados se analizaron mediante inmunotransferencia. Como control se usaron anticuerpos anti-HA. (f) NF-Y se une a la region proximal del promotor de TBP-2. El analisis ChIP se realizo con anticuerpos anti-NF-YB. La PCR se llevo a cabo como se describe en a. (g) Disminucion de la expresion de NF-YC endogeno mediada por ARNip en celulas HeLa. Los lisados celulares totales de celulas HeLa transfectadas con ARNip de NF-YC se analizaron mediante inmunotransferencia con anticuerpos anti-NF-YC. (h) NF-YC recluta HDAC1 y RFP al promotor de TBP-2. La cromatina entrecruzada de las celulas transfectadas con ARNip de NF-YC y control se inmunoprecipito con anticuerpos anti-HDAC1 y anti-RFP. La PCR se realizo como se describe en a. (i) Representacion esquematica del modelo de formacion del complejo HDAC1/RFP/NF-YC sobre el promotor de TBP-2.
[Fig. 6] RFP media en la formacion del complejo HDAC1/RFP/NF-YC. (a) HDAC1, RFP y NF-YC eluyen en la misma fraccion en columnas de filtracion en gel. Los extractos de celulas HeLa se separaron mediante cromatografia de filtracion en gel Superose 6 y se aplico un volumen identico de cada una de las fracciones a geles PAGE-SDS. Las fracciones se analizaron a continuacion mediante inmunotransferencia con anticuerpos anti-HDAC1, anti-RFP y anti-NF-YC. El perfil de elucion de los patrones de peso molecular se muestra en la parte superior (nulo, azul dextrano; 660 kDa, tiroglobulina; 440 kDa, ferritina; 230 kDa, catalasa). (b) La expresion de RFP potencia la formacion del complejo. Las celulas HEK293 se cotransfectaron con NF-YC-V5, HDAC1-myc y Flag-RFP y se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-V5. Las muestras inmunoprecipitadas se analizaron mediante inmunotransferencia con los anticuerpos indicados. (c) La eliminacion de RFP mediante ARNi altera la formacion del complejo. Se cotransfecto NF-YC-V5 con ARNip de RFP o control en celulas HeLa. Los lisados celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-V5, seguido de inmunotransferencia con los anticuerpos indicados. Como control se usaron anticuerpos anti-HA.
[Fig. 7] Oligomerizacion de RFP. (a) RFP forma un homooligomero. Las celulas HEK293 se cotransfectaron con GFP-RFP y Flag-RFP y se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-Flag seguido de inmunotransferencia con anticuerpos anti-Flag y anti-GFP. Como control se usaron anticuerpos anti-HA. LCT: lisados celulares totales. (b) Los dominios anillo-caja B y superhelice, pero no el dominio Rfp, de RFP eran necesarios para su oligomerizacion. Las celulas HEK293 se cotransfectaron con GFP-RFP y construcciones de delecion de RFP etiquetadas con Flag y se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-Flag. El vector pFlag se uso como control. Las puntas de flecha indican las construcciones de RFP etiquetadas con Flag.
[Fig. 8] RFP es una nueva diana para el tratamiento del cancer. (a), (b), (c) La disminucion de la expresion de RFP potencia la sensibilidad de los tumores al cisplatino in vivo. Se inyecto a los ratones por via subcutanea con las lineas celulares NC1hc, RFP23hc o RFP26hc. Cuando el volumen tumoral medio alcanzo al menos 50 mm3, los animales fueron asignados aleatoriamente al grupo control y a los grupos de tratamiento antes del primer tratamiento con cisplatino. Se administro por via intraperitoneal 1 mg/kg de cisplatino o vehiculo (solucion salina) cada 4 dias. En a se muestran fotografias de tumores representativos. Se muestra por medio de la observacion visual que el volumen tumoral en el grupo de tratamiento de la linea celular con expresion reducida de RFP es considerablemente mas pequeno que el del grupo sin tratamiento. En b se muestra la curva de crecimiento tumoral. El crecimiento tumoral es considerablemente mas lento en el grupo con tratamiento de la linea celular con expresion reducida de RFP en comparacion con el grupo sin tratamiento. El volumen tumoral medio del grupo sin tratamiento (vehiculo) se definio como el 100% y se comparo con el del grupo con tratamiento el dia 1 y el dia 21 en c. En NC1hc, el volumen tumoral era de aproximadamente el 92% con respecto al grupo sin tratamiento el dia 1 y disminuyo al 77% el dia 21. Mientras que en RFP23hc y RFP26hc los volumenes disminuian del 95% al 38% y del 112% al 42%, respectivamente. El efecto terapeutico del cisplatino aumentaba significativamente en el grupo en el que se uso la linea celular con expresion reducida de RFP. (d) La expresion de RFP es representativa de los tejidos tumorales de pacientes con carcinoma de colon. El color marron es indicativo de tincion con un anticuerpo policlonal anti-RFP. Cuando las celulas tenidas representan lt; 10%, se determina que son RFP-negativas y cuando las celulas tenidas representan � 10% se determina que son RFP-positivas. (e) RFP reprime la expresion de TBP-2 en pacientes con carcinoma de colon. Los tejidos tumorales se tineron con anticuerpo policlonal anti-RFP (rojo) y con anticuerpo monoclonal anti-TBP-2 (verde). Los nucleos celulares se tineron con DAPI (4',6-diamino-2-fenilindol). En las celulas que muestran expresion de RFP se observa que la expresion de TBP-2 es baja. (f) La expresion de RFP se correlaciona con un pronostico desfavorable en los pacientes con cancer de colon. La supervivencia global de 115 pacientes con carcinoma de colon se estratifico segun la expresion de RFP y se analizo mediante la representacion de Kaplan-Meier. Un analisis de rango logaritmico mostro diferencias significativas entre los grupos RFP+ y RFP-.
[Fig. 9] Graficas que muestran la correlacion entre la expresion de RFP y el pronostico desfavorable en el cancer de endometrio. Se compararon los grupos RFP-negativo y RFP-positivo entre si en cuanto a la supervivencia global. (a) Comparacion en todos los grupos de pacientes. (b) Comparacion en el grupo de pacientes en estadio I. (c) Comparacion en el grupo de pacientes en los estadios II a IV.
[Fig. 10] Las graficas muestran la expresion de RFP y la diferencia de los pronosticos del cancer de endometrio dependiendo de los metodos quirurgicos. Se compararon entre si un grupo de pacientes que se sometio a histerectomia radical y otro grupo que se sometio a histerectomia total en cuanto a la supervivencia global. (a) Comparacion en todos los grupos de pacientes. (b) Comparacion en el grupo RFP-negativo. (c) Comparacion en el grupo RFP-positivo.
[Fig. 11] Las graficas muestran la expresion de RFP y la diferencia de los pronosticos del cancer de endometrio dependiendo de los metodos quirurgicos. Se compararon entre si un grupo de pacientes que se sometio a linfadenectomia y otro grupo que no se sometio a linfadenectomia en cuanto a la supervivencia global. (a) Comparacion en todos los grupos de pacientes. (b) Comparacion en el grupo RFP-negativo. (c) Comparacion en el grupo RFP-positivo.
[Descripcion de las realizaciones]
[0012] Como resultado de la investigacion por los presentes inventores, se ha revelado que HDAC1 acelera la resistencia de las celulas cancerosas al estres oxidativo reduciendo la expresion de la proteina de union a tiorredoxina-2 (TBP-2).
[0013] RFP es una proteina nuclear que tiene una estructura de dedo de cinc tipo anillo que forma una proteina de fusion con RET y posteriormente es activada como proteina cancerosa (Takahashi, M y Cooper, GM: ret transforming gene encodes a fusion protein homologous to tyrosine kinases. Mol. Cell. Biol. 7, 1378-1385 (1987) (documento no patente 18; documento no patente 16). RFP tiene una potente actividad represora de la transcripcion e interacciona con diversas proteinas nucleares (Shimono y, Murakami, H, Hasegawa Y y Takahashi M: RFP is a transcriptional repressor and interacts with enhancer of polycomb that has dual transcriptional functions. J. Biol Chem. 275: 39411-39419. (200) (documento no patente 19); Shimono, Y, Murakami, H, Kawai, K, Wade, PA, Shimokata, K y Takahashi, M: Mi-2 associates with BRG1 and RET finger protein at the distinct regions with transcriptional activating and repressing abilities. J. Biol. Chem. 278: 51638-51645 (2003) (documento no patente 20); Shimono, K, Shimono, Y, Shimokata, K, Ishiguro, N, y Takahashi, M: Microspherule protein 1, Mi-2�, and RET finger protein associate in the nucleolus and up-regulate ribosomal gene transcription. J. Biol. Chem. 280: 3943639447 (2005) (documento no patente 21)). Se ha descrito que RFP se expresa a altos niveles en una linea celular de cancer. Sin embargo, no se ha dilucidado el estado de expresion de RFP en tejido canceroso. La secuencia de un gen de RFP (SEC ID N.D: 1), la secuencia de ARNm de RFP (SEC ID N.D: 2) y la secuencia de aminoacidos de RFP (SEC ID N.D: 3) se muestran en el listado de secuencias. Como se menciono anteriormente, puesto que los ratones knockout para RFP no muestran fenotipo de afecciones graves, es preferible RFP como diana desde el punto de vista de la seguridad. Ademas, ya que se observa una elevada expresion en diversos tipos de tumores humanos o lineas celulares en cultivo derivadas de la mayoria de los tumores examinados (datos no publicados y documento no patente 16), se espera que la accion se ejerza sobre una amplia variedad de tumores.
[0014] Como resultado de la investigacion de los presentes inventores (veanse los ejemplos mencionados a continuacion), se ha descubierto que RFP esta implicado en la regulacion de la sensibilidad al estres oxidativo por HDAC1 a traves de la interaccion fisica y funcional entre RFP y HDAC1. Como resultado de la investigacion de los presentes inventores, se ha revelado que el extremo N-terminal de HDAC1 se une a un dominio superhelice y a un dominio Rfp de RFP.
(Procedimiento para el analisis de la resistencia a farmacos antineoplasicos)
[0015] Como resultado de la investigacion de los presentes inventores, se ha descubierto que la alta expresion de RFP esta correlacionada con la reduccion de la expresion de TBP-2 en un carcinoma de colon humano y con un pronostico desfavorable en pacientes con carcinoma de colon (veanse los ejemplos mencionados a continuacion). El metodo de analisis permite determinar la resistencia de las celulas cancerosas a un farmaco antineoplasico. La determinacion de los resultados se pueden usar para determinar, por ejemplo, la politica de tratamiento (seleccion del metodo de tratamiento y similares). El uso de la determinacion conlleva mejoras en los resultados clinicos del tratamiento, mejora el pronostico y la calidad de vida (CdV) de los pacientes, y similares. Por tanto, el procedimiento de analisis proporciona informacion extremadamente util para el tratamiento del cancer.
[0016] El procedimiento de analisis incluye las siguientes etapas: una etapa de examen del nivel de expresion de RFP en celulas cancerosas aisladas de un organismo vivo (etapa de deteccion) y una etapa de determinacion de la resistencia de las celulas cancerosas a un farmaco antineoplasico que tiene capacidad para inducir el estres oxidativo basado en los resultados de la etapa mencionada anteriormente (etapa de determinacion).
[0017] En la etapa de deteccion, en primer lugar se preparan las celulas cancerosas aisladas de un organismo vivo. El termino «aislado de un organismo vivo» se refiere a un estado en el que se extrae una parte del tejido vivo que incluye las celulas cancerosas que se desea analizar y, por tanto, las celulas cancerosas que se desea analizar estan completamente aisladas del organismo vivo origen de las celulas cancerosas. Tan pronto como se cumpla esta condicion, las celulas cancerosas pueden estar en un estado en el que formen tejido junto con las celulas circundantes (esto es, en un estado de fragmento de tejido) o pueden estar en un estado en el que esten aisladas de las celulas circundantes. En el primer caso, las celulas se pueden preparar de modo que, por ejemplo, se realice el diagnostico histologico mediante biopsia (biopsia) y en el segundo caso, las celulas se pueden preparar de modo que, por ejemplo, se realice el diagnostico citologico.
[0018] Posteriormente se examina el nivel de expresion de RFP en las celulas cancerosas preparadas. El nivel de expresion de RFP normalmente se calcula en funcion de la comparacion con el control (comparacion con control). Como control es posible usar diversas celulas cancerosas cuyo nivel de expresion de RFP se haya determinado previamente y celulas normales recogidas junto con las celulas cancerosas que se desea analizar cuando las celulas cancerosas que se desea analizar se obtienen de un organismo vivo. No es necesario cuantificar estrictamente el nivel de expresion de RFP, aunque se puede detectar el nivel de expresion de RFP en tal grado que la resistencia a un farmaco antineoplasico de las celulas cancerosas que se desea analizar se puede evaluar a traves de la comparacion con el control. Tengase en cuenta aqui que, como es habitual, el caso en el que se observa expresion de RFP en las celulas cancerosas que se desea analizar se define tambien como RFP-positivo (o positivo para RFP), y el caso en el que no se observa expresion de RFP en las celulas cancerosas que se desea analizar se define tambien como RFP-negativo (o negativo para RFP). Cuando el nivel de expresion de RFP de las celulas cancerosas que se desea analizar se detecta mediante inmunohistoquimica (descrito con detalle mas adelante), por ejemplo, cuando se reconoce la tincion de no menos del 10% de las celulas cancerosas que se desea analizar (es decir, la tasa de celulas tenidas no es inferior al 10%), se determina que las celulas son RFP-positivas (o positivas para RFP). Se puede establecer adecuadamente un valor limite para distinguir positivo de negativo (lo que viene representado por la tasa de celulas tenidas) de acuerdo con el procedimiento de deteccion o las condiciones de deteccion. Por ejemplo, puede establecerse un valor limite del 5 al 30%.
[0019] El nivel de expresion de RFP se detecta mediante la concentracion de proteina o de ARNm. Cuando se requiera una alta precision, el nivel de proteina es mejor. Cuando el nivel de expresion de RFP se detecta mediante la concentracion de proteina, es decir, cuando se examina la cantidad de proteina RFP como el nivel de expresion de RFP, se puede usar un procedimiento de inmunotransferencia o inmunohistoquimica (inmunotincion), aunque el procedimiento no se limita a estos. Mediante inmunohistoquimica se puede examinar al mismo tiempo la forma o estado de distribucion de las celulas cancerosas que se desea analizar, se puede obtener informacion adicional al mismo tiempo.
En la inmunohistoquimica se usa un anticuerpo que reconoce especificamente RFP (anticuerpo anti-RFP) y se examina la cantidad de proteina RFP usando como indicador la propiedad de union (cantidad de union) del anticuerpo. Se puede realizar la inmunohistoquimica usando un anticuerpo anti-RFP por ejemplo mediante un metodo ABC (complejo avidina-biotina), un metodo PAP (complejo peroxidasa-antiperoxidasa), un metodo LAB (biotina ligada a avidina), un metodo LSAB (biotina ligada a estreptavidina) y similares. El protocolo convencional de cada uno de los procedimientos es bien conocido (vease por ejemplo, «Enzyme-labeled Antibody Method» 3a edicion revisada, K. Watanabe and K. Nakane (ed), Gakusai Kikaku).
[0020] El tipo y origen de los anticuerpos anti-RFP que se usen en la inmunohistoquimica no estan especialmente limitados. Preferiblemente se usa un anticuerpo monoclonal, aunque se pueden usar anticuerpos oligoclonales (una mezcla de varios tipos de anticuerpos) o un anticuerpo policlonal, siempre que se pueda detectar RFP con suficiente especificidad. Se pueden usar fragmentos de anticuerpos como Fab, Fab', F(ab')2, scFv y dsFv. El anticuerpo anti-RFP se puede preparar mediante procedimientos inmunologicos, una tecnica de despliegue de fagos, un procedimientos de despliegue de ribosomas y similares. Tengase en cuenta aqui que en el documento «Shimono, Y y col. RET finger protein is a transcriptional repressor and interacts with enhancer of polycomb that has dual transcriptional functions. J Biol Chem. 275(50): 39411-9 (2000)» se describe un procedimiento de preparacion de un anticuerpo anti-RFP (anticuerpo policlonal de conejo) y el uso del mismo, que puede servir como referencia.
[0021] A continuacion en este documento se muestra un ejemplo de los metodos y procedimientos de inmunohistoquimica.
(1)
Inmovilizacion. Metodo de inclusion en parafina
[0022] El tejido extraido de un ser vivo (en necropsia, cadaver) se inmoviliza en formalina, paraformaldehido y similares y posteriormente se incluye en parafina. En general, se deshidrata con alcohol, se trata con xileno y finalmente se incluye en parafina. Las muestras incluidas en parafina se cortan con el grosor deseado (por ejemplo, 3 a 5 !m) y se extiende sobre un portaobjetos de vidrio. En lugar de la muestra incluida en parafina, se puede usar una muestra congelada.
(2)
Desparafinacion
[0023] En general, el tratamiento se realiza secuencialmente, por este orden, con xileno, alcohol y agua purificada.
(3)
Pretratamiento (activacion del antigeno)
[0024] Si es necesario, para la activacion del antigeno se puede realizar, por ejemplo, un tratamiento enzimatico, tratamiento termico y/o tratamiento de presurizacion.
(4)
Eliminacion de la peroxidasa endogena.
[0025] Cuando se usa peroxidasa como material de marcaje para la tincion, se elimina la activacion de la peroxidasa endogena realizando un tratamiento con una solucion de peroxido de hidrogeno.
(5)
Inhibicion de la reaccion inespecifica
[0026] La reaccion inespecifica se inhibe tratando el corte de tejido con una solucion de albumina serica bovina (por ejemplo, solucion al 1%) de varios minutos a varias decenas de minutos. Tengase en cuenta aqui que este proceso se puede omitir cuando la reaccion con el anticuerpo primario que sigue se realiza usando una solucion de anticuerpo que contenga albumina serica bovina.
(6)
Reaccion con el anticuerpo primario
[0027] Se pone sobre el corte del portaobjetos de vidrio un anticuerpo diluido a la concentracion apropiada y se deja reaccionar de diez minutos a varias horas. Tras la reaccion, el producto reaccionado se lava con una solucion de tampon apropiada, como tampon fosfato.
(7)
Adicion del reactivo de marcaje
[0028] Como material de marcaje se usa frecuentemente peroxidasa. Se pone sobre el corte del portaobjetos de vidrio un anticuerpo secundario al que se ha unido la peroxidasa y se deja reaccionar de diez minutos a varias horas. Tras la reaccion, el producto formado se lava con una solucion de tampon apropiada, como tampon fosfato.
(8)
Reaccion de color
[0029] Se disuelve DAB (3,3'-diaminobencidina) en solucion de tampon Tris. A continuacion de anade la solucion de peroxido de hidrogeno. Se deja que la solucion de color asi preparada penetre en el corte de tejido durante varios minutos (por ejemplo, cinco minutos) de manera que se desarrolle color en el corte. Tras la reaccion de color, el corte se lava lo suficiente con agua corriente para eliminar el DAB.
(9)
Tincion nuclear
[0030] El corte se somete a una tincion nuclear haciendolo reaccionar con hematoxilina de Mayer de varios segundos a varias decenas de segundos. Se lava con agua corriente para eliminar el exceso de colorante (en general durante varios minutos).
(10)
Deshidratacion, aclaramiento y encapsulacion
[0031] El corte de tejido se deshidrata con alcohol, se somete a un tratamiento de aclaramiento con xileno y, finalmente, se encapsula con resina sintetica, glicerina, jarabe de goma y similares.
[0032] Para la deteccion y determinacion del ARNm cuando se examina el nivel de expresion de RFP en funcion de la concentracion de ARNm se puede usar RT-PCR (Molecular Cloning, tercera edicion, 8.46, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York), un procedimiento de transferencia de ARN (Molecular Cloning, tercera edicion,7.42, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York), un procedimiento de transferencia en puntos (Molecular Cloning, tercera edicion, 7.46, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York), un procedimiento que use un chip de ADN (matriz de ADN) y similares.
Una persona experta en la materia puede disenar un cebador de acidos nucleicos o una sonda de acidos nucleicos adecuados para cada uno de los procedimientos mediante un procedimiento convencional basado en la secuenciade RFP (base de datos del NCBI, acceso: RFPNM 006510, DEFINICION: Homo sapiens tripartite motif-containing 27 (TRIM27), ARNm. (SEC ID N.D 2)).
[0033] En la etapa de determinacion, la resistencia de las celulas cancerosas a un farmaco antineoplasico que tiene la capacidad de inducir el estres oxidativo se determina en funcion del resultado de la etapa de deteccion, es decir, del nivel de expresion de RFP. A continuacion en este documento se muestran ejemplos especificos de evaluacion basados en el nivel de expresion de RFP.
[0034] Previamente se establecen diversas divisiones de evaluacion para relacionar entre el nivel de expresion de RFP y la resistencia a farmacos antineoplasicos. A continuacion, en la etapa de decision se obtiene la division de evaluacion que corresponde con las celulas cancerosas que se desea analizar en funcion del nivel de expresion de RFP. Como ejemplos especificos del establecimiento de divisiones de evaluacion, se muestra a continuacion un ejemplo centrado en la presencia o ausencia de expresion de RFP (ejemplo 1) y un ejemplo centrado en el grado de expresion de RFP (ejemplo 2). Tengase en cuenta aqui que se describe por este orden el nombre de division: nivel de expresion de RFP relacionado con la division: resultados de la evaluacion relacionados con la division.
lt;ejemplo 1gt;
[0035]
Division 1: RFP-positivo: resistencia a un farmaco antineoplasico
Division 2: RFP-negativo: sensible a un farmaco antineoplasico
5 lt;ejemplo 2gt;
[0036]
Division 1: no se observa expresion de RFP: sensible a un farmaco antineoplasico
Division 2: se observa expresion debil de RFP: baja resistencia a un farmaco antineoplasico
Division 3: se observa expresion moderada de RFP: resistencia moderada a un farmaco antineoplasico
10 Division 4: se observa expresion fuerte de RFP: alta resistencia a un farmaco antineoplasico
[0037] El numero de divisiones de evaluacion, y el nivel de expresion de RFP y los resultados de la evaluacion relacionados con cada division de evaluacion no se limitan necesariamente a los ejemplos mencionados mas arriba, pudiendo establecerse arbitrariamente por medio de un experimento preliminar y similares. Tengase en cuenta que la determinacion y evaluacion en la presente invencion se puede realizar automatica y mecanicamente sin depender
15 de la determinacion por expertos en la materia, por ejemplo, doctores y tecnicos de laboratorio.
[0038] Como se menciono anteriormente, la politica de tratamiento se puede determinar usando los resultados de la determinacion del procedimiento de analisis. Por ejemplo, cuando el resultado de la determinacion es: «con resistencia a un farmaco antineoplasico» o «con alta resistencia a un farmaco antineoplasico», es posible predecir que el uso de un unico farmaco antineoplasico puede no mostrar el efecto terapeutico deseado. En tal caso, una 20 politica de tratamiento eficaz es usar el agente de la presente invencion en combinacion con un farmaco antineoplasico, ya que potencia la accion del farmaco antineoplasico. Por otro lado, si el resultado de la determinacion es: «sensibilidad a un farmaco antineoplasico» o «baja resistencia a un farmaco antineoplasico», es posible predecir que un unico farmaco antineoplasico puede mostrar el efecto terapeutico esperado. En tal caso, una de las opciones de politica de tratamiento eficaz es usar un farmaco antineoplasico en monoterapia. No obstante,
25 tambien en tal caso, para mejorar el efecto terapeutico potenciando la accion del farmaco antineoplasico, se puede administrar en combinacion el agente potenciador de la accion de la presente invencion.
(Biomarcador para estimar el pronostico y uso del mismo)
[0039] Como resultado de la investigacion de los presentes inventores se ha revelado que la alta expresion de RFP se correlaciona con el pronostico desfavorable en pacientes con carcinoma de colon o pacientes con cancer de 30 endometrio (vease el ejemplo mencionado a continuacion). Segun los resultados, un tercer aspecto de la presente invencion es proporcionar un marcador compuesto de RFP para estimar el pronostico en pacientes con cancer. El biomarcador es util para entender el pronostico en pacientes con cancer. Asimismo, puede servir de guia para determinar el procedimiento quirurgico. Por ejemplo, cuando se observa la expresion de RFP en una muestra (celulas cancerosas) aislada de una paciente con cancer de endometrio (por ejemplo, inmunotincion positiva), es
35 posible determinar si es preferible emplear una intervencion mas agresiva. Una intervencion mas agresiva puede ser una histerectomia radical con linfadenectomia.
[0040] Este aspecto proporciona el procedimiento para estimar el pronostico en pacientes con cancer como uso del biomarcador mencionado anteriormente. De acuerdo con el procedimiento de estimacion del pronostico segun la presente invencion, se obtiene informacion sobre la estimacion del pronostico en pacientes con cancer. Por ejemplo,
40 la informacion se usa para determinar la politica de tratamiento (seleccion del procedimiento eficaz de tratamiento y similares). El uso de la determinacion conlleva mejoras en los resultados clinicos del tratamiento, mejora el pronostico y la calidad de vida (CdV) de los pacientes, y similares.
[0041] A continuacion se ofrece una descripcion detallada de este aspecto de la presente invencion. Los temas comunes en el primer o en el segundo aspecto emplean la descripcion en el primer o segundo aspecto. En la
45 memoria descriptiva, el «biomarcador para estimar el pronostico en pacientes con cancer» se refiere a una biomolecula que es un indicador para estimar el pronostico en pacientes con cancer. El biomarcador de la presente invencion es particularmente util en la estimacion del pronostico de pacientes con carcinoma de colon.
[0042] En el procedimiento de estimacion del pronostico en la presente invencion, el biomarcador de la presente invencion se usa como indicador para la determinacion. Especificamente, el pronostico en un paciente con cancer se 50 estima usando como indicador el nivel de expresion de RFP en celulas cancerosas aisladas del paciente con cancer. Mas especificamente, se lleva a cabo una etapa de deteccion del nivel de expresion de RFP en celulas cancerosas aisladas del paciente con cancer (etapa de deteccion) y una etapa de estimacion del pronostico basada en el
resultado de la estimacion (etapa de estimacion del pronostico). La etapa de deteccion aqui se puede realizar de forma similar a la etapa de deteccion del segundo aspecto mencionado anteriormente. Entre los ejemplos de pacientes con cancer se incluyen pacientes con carcinoma de colon.
[0043] En la etapa de estimacion del pronostico, el pronostico en un paciente con cancer se estima usando el nivel de expresion de RFP en las celulas cancerosas como indicador. Basicamente, se emplea el criterio de determinacion en el que se determina que el pronostico es desfavorable si el nivel de expresion de RFP es grande. A continuacion se describen ejemplos especificos de evaluacion basados en el nivel de expresion de RFP.
[0044] Previamente se establecen diversas divisiones de evaluacion para relacionar entre el nivel de expresion de RFP y el pronostico. A continuacion, se determina la division de evaluacion correspondiente a las celulas cancerosas que se desea analizar en funcion del nivel de expresion de RFP obtenido en la etapa de decision. Como ejemplos especificos del establecimiento de divisiones de evaluacion, se muestra a continuacion un ejemplo centrado en la presencia o ausencia de expresion de RFP (ejemplo 1) y un ejemplo centrado en el grado de expresion de RFP (ejemplo 2). Tengase en cuenta aqui que se describe por este orden el nombre de division: nivel de expresion de RFP relacionado con la division: resultados de la evaluacion relacionados con la division.
lt;ejemplo 1gt;
[0045]
Division 1: RFP-positivo: el pronostico es desfavorable
Division 2: RFP-negativo: el pronostico es bueno
lt;ejemplo 2gt;
[0046]
Division 1: no se observa expresion de RFP: el pronostico es bueno
Division 2: se observa expresion debil de RFP: el pronostico es relativamente bueno
Division 3: se observa expresion moderada de RFP: el pronostico es relativamente desfavorable
Division 4: se observa expresion fuerte de RFP: el pronostico es desfavorable
[0047] El numero de divisiones de evaluacion, y el nivel de expresion de RFP y los resultados de la evaluacion relacionados con cada division de evaluacion no se limitan necesariamente a los ejemplos mencionados mas arriba, pudiendo establecerse arbitrariamente mediante de un experimento preliminar y similares. Tengase en cuenta que la determinacion y evaluacion en la presente invencion se puede realizar automatica y mecanicamente sin depender de la determinacion por expertos en la materia, por ejemplo, doctores y tecnicos de laboratorio.
[0048] El reactivo esta compuesto por un anticuerpo anti-RFP. Los tipos y origen de los anticuerpos anti-RFP emplean la correspondiente descripcion en el segundo aspecto. Cuando se usa un anticuerpo marcado como anticuerpo anti-RFP, la cantidad de anticuerpo unido se puede detectar directamente usando una cantidad de marcaje como indicador. Por tanto, se puede construir un procedimiento de analisis mas sencillo. Por el contrario, este procedimiento presenta los problemas de un anticuerpo anti-RFP al que se une un agente de marcaje y, ademas, la sensibilidad de deteccion es generalmente menor. Luego, es preferible usar procedimientos de deteccion indirectos como un procedimiento que use un anticuerpo secundario al cual se une un agente de marcaje, y un procedimiento que use un polimero al cual se une un anticuerpo secundario y un agente de marcaje. El anticuerpo secundario en el presente documento denota un anticuerpo con conectividad especifica con respecto al anticuerpo anti-RFP. Por ejemplo, cuando se prepara un anticuerpo anti-RFP como un anticuerpo de conejo, se puede usar un anticuerpo anti-IgG de conejo. Hay disponibles en el mercado anticuerpos secundarios marcados que se pueden usar para diversos anticuerpos como conejo, cabra y raton (por ejemplo, Funakoshi Co., Ltd., Cosmo Bio Co., Ltd. o similares) y los anticuerpos se pueden seleccionar adecuadamente segun los reactivos de la presente invencion.
[0049] Entre los ejemplos de agentes de marcaje se incluyen enzimas como peroxidasa, microperoxidasa, peroxidasa de rabano picante (HRP), fosfatasa alcalina, -D-galactosidasa, glucosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; una sustancia fluorescente como isotiocianato de fluoresceina (FITC), isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) y euripio; sustancias quimioluminiscentes como luminar, isoluminol y derivados de acridinio; coenzimas como NAD y biotina; asi como sustancias radioactivas como 131I y 125I.
[0050] El reactivo se puede formar en una fase solida de acuerdo con su uso. Los medios de soporte insoluble utilizado para hacer la fase solida no estan especialmente limitados. Por ejemplo, medios de soporte insoluble hechos de materiales insolubles en agua, por ejemplo, resina como una resina de poliestireno, una resina policarbonatada, una resina de silicona y una resina de nailon y vidrio. Los anticuerpos pueden fijarse en medios de soporte insolubles mediante adsorcion fisica o quimica.
[EJEMPLOS]
[0051] Segun la hipotesis de que el HDACi regula el mecanismo de antioxidacion en las celulas haciendo que estas sean sensibles a un farmaco antineoplasico, se realizan los experimentos mencionados a continuacion.
1. Materiales y procedimientos
5 (1) Plasmidos
[0052] El plasmido pcDNA3-HDAC1-Flag fue proporcionado generosamente por el Dr. Kawaguchi (Prefectura de Aichi, Japon). Los fragmentos de delecion de NF-YA, NF-YB, NF-YC, HDAC1 Y HDAC1 de longitud completa y el ADNc de TBP-2 se clonaron en el vector pcDNA3.1/V5-His-TOPO segun las instrucciones del fabricante. El ADNc de HDAC1 procedente de pcDNA3.1/V5-His-HDAC1 se inserto en el vector pcDNA3.1/myc-His. La construccion pFlag
10 RFP se ha descrito previamente (referencia 20). El ADNc de RFP se inserto en el vector pEGFP-C1.
(2) ARNi
[0053] El ARNip de HDAC1 se adquirio en Dhamacon. Los ARNip de RFP, TBP-2, NF-YC y control se adquirieron en QIAGEN. Los ARNip se transfectaron usando Lipofectoamine 2000 (Invitrogen) segun las instrucciones del fabricante. Para la expresion reducida de RFP mediada por ARNhc se sintetizo como sigue un conjunto de
15 oligonucleotidos de cadena sencilla que codificaban el ARNhc de la diana NFP o del control negativo y sus complementarios (solo se muestran las secuencias sentido) ARNi.
El par de oligonucleotidos complementarios se inserto en un vector pSilencer3.1-H1 neo (Ambion) que se uso como vector de expresion de ARNhc.
20 (3) Generacion de lineas celulares que expresan de forma estable ARNhc
[0054] Las celulas HeLa se transfectaron con el vector de expresion de ARNhc con Lipofectoamine 2000 y se seleccionaron con neomicina durante 2 semanas.
(4) Ensayo de viabilidad celular
[0055] Utilizando placas de 96 pocillos, se sembraron 8 x 103 celulas por pocillo y 24 horas despues se trataron
25 con H2O2 (10 h) o cisplatino (24 h) a la concentracion descrita. La viabilidad celular se midio mediante el ensayo WST-1 (Roche). En la grafica, el indice del grupo sin tratamiento se define como 1.
(5) RT-PCR
[0056] El ARN total de las celulas HeLa transfectadas con ARNip se aislo usando el kit RNeasy Mini (Qiagen). A continuacion, los transcritos del ADNc se generaron usando Superscript II (Invitrogen). Se realizo una RT-PCR con 30 cebadores especificos de HDAC1 (sentido, 5'-CTCCTGTTTTTTTCAGGCTCC-3' (SEC ID N.D: 11); complementario, 5'-ACGAGAAGACAGACAGAGGGC-3' (SEC ID N.D: 12)), RFP (sentido, 5'-TGCTCGACTGCGGCCATAAC-3' (SEC ID N.D: 13); complementario, 5'-TCGGTGCGCAGCTGCTTTAC-3' (SEC ID N.D: 14)), TBP-2 (sentido, 5'-TGAGATGGTGATCATGAGACC -3' (SEC ID N.D: 15); complementario, 5'-GTATTGACATCCACCAGATCC -3' (SEC ID N.D: 16)), GAPDH (sentido, 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3' (SEC ID N.D: 17); complementario, 5'
35 GAGATGATGACCCTTTTGGCTC-3' (SEC ID N.D: 18)).
(6) Inmunoprecipitacion e inmunotransferencia
[0057] Se lavaron las celulas dos veces con PBS enfriado en hielo y se lisaron con tampon de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 120 mM, MgCl2 5 mM, Nonidet P-40 al 0,8%, glicerol al 10%, DTT 1 mM y PMSF 1 mM) que contenia una mezcla de inhibidores de proteasas completa. Los lisados se sonicaron brevemente y se
40 inmunoprecipitaron con los anticuerpos indicados. Como control se uso un anticuerpo normal de conejo purificado un anticuerpo anti-etiqueta HA. La separacion electroforetica y la inmunotransferencia se realizaron segun lo descrito previamente (referencia 20). Para la inmunotransferencia con los inmunoprecipitados usando el anticuerpo policlonal de conejo se uso Relia Blot (Bethyl Laboratories) segun las instrucciones del fabricante.
(7) Ensayo de inmunoprecipitacion de la cromatina (ChIP)
45 [0058] Los experimentos de ChIP se realizaron segun lo descrito previamente (referencias 28). Brevemente, se sonico la cromatina entrecruzada con formaldehido procedente de las celulas indicadas y los fragmentos de cromatina resultantes se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-HDAC1, anti-H3 acetilada, anti-H4 acetilada, anti-RFP o anti-NFYB. Como control se uso IgG normal de conejo o de raton purificada. Los entrecruzados con formaldehido se invirtieron anadiendo NaCl 5 M a una concentracion final de 0,2 M y se incubaron durante 8 h a 65DC. El ADN purificado y el ADN de entrada se amplifico mediante PCR en 32-37 ciclos.
(8) Modelo de tratamiento in vivo
[0059] Se inyectaron por via subcutanea celulas control o HeLa que expresaban de forma estable ARNhc en el lomo de ratones hembra desnudos (7 semanas). Cuando el volumen tumoral medio alcanzo al menos 50 mm3, los animales fueron asignados aleatoriamente al grupo control y a los grupos de tratamiento antes del primer tratamiento con cisplatino. Se administro por via intraperitoneal 1 mg/kg de cisplatino o vehiculo (solucion salina: control) cada 4 dias. El volumen del tumor se calculo a partir de la siguiente ecuacion despues de medir el diametro tumoral con un calibrador.
Volumen � (Eje mayor � Eje menor � Eje menor) / 2
(9) Inmunohistoquimica
[0060] Se desparafinaron y rehidrataron cortes de tejido fijados en formalina e incluidos en parafina procedentes de pacientes con carcinoma de colon. Las preparaciones se lavaron bien con agente bloqueante de proteinas (UltraTech HRP Streptavidin-Biotin Detection System, Beckman Coulter) y se bloqueo la peroxidasa endogena con peroxido de hidrogeno al 3%. La recuperacion del antigeno se realizo autoclavando a 121DC durante 10 min en tampon citrato (pH 7,0) 0,1 moles/l con NP-40 al 0,5% (Sigma-Aldrich). Los cortes se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo anti-RFP y luego se aplico un anticuerpo secundario polivalente biotinilado de cabra (Beckman Coulter). Las muestras se incubaron con estreptavidina conjugada con peroxidasa y los productos de la reaccion se visualizaron con tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (DAB). Cuando se tenian mas del 10% de las celulas tumorales con el anticuerpo, se clasificaba como positivo para la expresion del antigeno.
Se usaron representaciones de Kaplan-Meier para estimar la importancia pronostica de RFP en analisis univariable usando Stat view.
(10)
Inmunofluorescencia
[0061] Se desparafinaron y rehidrataron cortes de tejido fijados en formalina e incluidos en parafina procedentes de pacientes con carcinoma de colon. La recuperacion del antigeno se realizo calentando con microondas durante 10 min en tampon citrato (pH 6). Las muestras se bloquearon con BSA al 1% en PBS y se incubaron con un anticuerpo policlonal anti-RFP y un anticuerpo monoclonal anti-TBP-2. A continuacion, las muestras se tineron con un anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado con Alexa Fluor 594, un anticuerpo anti-IgG de raton conjugado con Alexa Fluor 488 y con DAPI. Se montaron las preparaciones y se examinaron con un microscopio confocal.
(11)
Pacientes con cancer de endometrio
[0062] Se usaron para los experimentos, previo consentimiento informado, muestras problema (119 muestras) procedentes de pacientes con adenocarcinoma endometrioide de endometrio que se habian sometido a tratamiento quirurgico en el Hospital Universitario de Nagoya entre 1992 y 2007. Las edades de las pacientes oscilaban entre 28 a 86 anos (mediana de edad: 57). Ninguna de las pacientes se habia sometido a quimioterapia neoadyuvante. Todas las pacientes se sometieron a histerectomia radical o abdominal total mas salpingo-ovariectomia bilateral. Ademas, 72 pacientes se sometieron a linfadenectomia. Todas las pacientes se estadificaron de acuerdo con los criterios FigO (Federacion Internacional de Ginecologia y Obstetricia) de 1998. Setenta y dos (72) pacientes tenian un estadio 1, 16 pacientes estadio II, 24 pacientes estadio III y 7 pacientes estadio IV. El grado histologico se asigno segun la clasificacion de la Organizacion Mundial de la Salud. Cincuenta (50) pacientes eran G1, 51 pacientes eran G2 y 18 pacientes eran G3.
2. Resultados y discusion
[0063] En primer lugar se analizo si los HDACi afectan a la sensibilidad celular al estres oxidativo usando la linea celular de cancer de cuello uterino HeLa. El tratamiento con tricostatina A (TSA), un HDACi convencional, sensibilizo a las celulas HeLa al H2O2, un potente inductor del estres oxidativo (Fig. 1a). Para investigar el mecanismo molecular que subyace a esta sensibilizacion de las celulas cancerosas al estres oxidativo, los presentes inventores se centraron en el papel de la HDAC1, que es un miembro bien estudiado de las HDAC. La reduccion de la expresion de HDAC1 incrementaba considerablemente la citotoxicidad del H2O2 y del cisplatino en las celulas HeLa (Fig. 1b-d). Aunque se propuso que p53 se asocia con HDAC1 para regular la sensibilidad celular al estres oxidativo (referencias 16-19), pueden existir otros mecanismos en las celulas HeLa en las que la proteina E6 del virus del papiloma ha inactivado p53.
[0064] Puesto que los presentes inventores previamente encontraron que RFP (RET finger protein), que tiene una elevada expresion en la mayoria de lineas celulares de cancer, se asocia y colocaliza con HDAC1 (referencia 20), se intento elucidar si RFP esta implicada en la funcion biologica de HDAC1 en lo referente a la sensibilidad al estres oxidativo. Primero se determino el dominio de union de RFP y HDAC1. La region amino-terminal de HDAC1 se une tanto al dominio superhelice como al dominio Rfp de RFP (Fig. 2). Ademas, la reduccion de la expresion de RFP o de HDAC1 potencia la sensibilidad de las celulas cancerosas al H2O2 y al cisplatino (Fig. 1b-g), sugiriendo la posibilidad de que HDAC1 este funcionalmente asociado a RFP.
[0065] Puesto que tanto HDAC1 como RFP tienen actividad represora de la transcripcion1,20,21, se genero la hipotesis de que HDAC1 y RFP puede reprimir en cooperacion los genes diana comunes que son responsables de la sensibilizacion de las celulas a farmacos citotoxicos. Para identificar dichos genes diana, se generaron celulas HeLa estables que expresaban ARN horquillado corto (ARNhc) control o de RFP y se compararon los perfiles de expresion genica mediante micromatrices de ADN. Entre los genes cuya expresion aumentaba en las celulas con expresion reducida de RFP, los presentes inventores se centraron en el gen TBP-2 porque se ha descrito que su expresion tambien es aumentada significativamente por un inhibidor de HDAC, SAHA (referencia 15). Es bien conocido que TBP-2 inhibe la tiorredoxina (referencias 22 y 23), un eliminador de ROS, y sensibiliza a las celulas al estres oxidativo y al cisplatino (referencias 4 y 24). A partir de los resultados obtenidos mediante la reaccion en cadena de la polimerasa con transcripcion inversa (RT-PCR) y el analisis mediante inmunotransferencia, los presentes inventores confirmaron que la expresion de TBP-2 esta regulada a nivel transcripcional por HDAC1 y RFP (Fig. 3a y b). Para analizar si TBP-2 sensibiliza de hecho a las celulas al H2O2 y al cisplatino, se sobreexpreso TBP-2 en celulas HeLa. La sobreexpresion de TBP-2 aumentaba considerablemente la sensibilidad a estos agentes (Fig. 3d y e), sugiriendo que la expresion inducida de TBP-2 en celulas HeLa es responsable de la mayor sensibilidad al H2O2 y al cisplatino en celulas con expresion reducida de HDAC1 o RFP. Se examino mas en profundidad si la expresion inducida de TBP-2 por HDAC1ip o RFPip era responsable del aumento de la sensibilidad. La reduccion de la expresion de TBP-2 recuperaba significativamente la resistencia celular al H2O2 y al cisplatino, que disminuia por la reduccion de la expresion de HDAC1 o RFP (Fig. 3f-h). Estos resultados demuestran que HDAC1 y RFP aumentan la resistencia celular a estos agentes en parte por la represion de la expresion de TBP-2.
Asimismo, se confirmo que se observaron los mismos resultados cuando se usaron lineas celulares de carcinoma de colon y de canceres de mama (Fig. 4).
[0066] Se realizo una inmunoprecipitacion de cromatina (ChIP) para examinar si HDAC1 y RFP eran reclutados a la region del promotor del gen TBP-2 y regulaban directamente su expresion. Tanto HDAC1 como RFP eran reclutados a la region proximal, pero no a la distal, del promotor de TBP-2. El ensayo con el indicador luciferasa mostro que HDAC1 y RFP pueden reprimir de forma coordinada la actividad del promotor de TBP-2 y la actividad represora de la transcripcion de RFP era inhibida por HDAC1 (datos no mostrados). Puesto que la expresion de TBP-2 aumenta con la reduccion de la expresion de RFP, se penso que la acetilacion de histonas en la region del promotor de TBP-2 esta acelerada. La ChIP usando celulas con expresion reducida de RFP mostro un aumento de los niveles de acetilacion de las histonas H3 y H4 en el promotor (Fig. 5b). Ademas, puesto que el reclutamiento de HDAC1 en una region del promotor de TBP-2 esta debilitado por la supresion de la expresion de RFP, se penso que la acetilacion de histonas por la reduccion de la expresion de RFP es debida a que no se recluta HDAC1. Estos resultados sugieren en gran medida que RFP recluta HDAC1 a la region del promotor de TBP-2 y reprime su transcripcion a traves de la actividad de HDAC1.
[0067] Puesto que no se ha descrito que HDAC1 o RFP se unan directamente al ADN, el complejo HDAC1-RFP debe ser reclutado al promotor a traves de proteinas de union a ADN. Estudios previos indicaron que la region proximal del promotor de TBP-2 incluye la secuencia de union a NF-Y y que la induccion de la expresion de TBP-2 por HDACi estaba regulada por NF-Y (referencia 15). Por tanto, se especula que NF-Y puede ser un candidato que reclute el complejo HDAC1-RFP al promotor de TBP-2. NF-Y es un factor de transcripcion trimerico que consta de NF-YA, B y C. Los estudios de coinmunoprecipitacion revelaron que RFP puede interaccionar especificamente con NF-YC (Fig. 5c y d). Esto sugiere que HDAC1, RFP y NF-Y pueden formar un complejo proteico. Para investigar este complejo proteico se cotransfectaron transitoriamente las construcciones NF-YC-V5, Flag-HDAC1 y Flag-RFP en celulas HEK293 y se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-V5. HDAC1 y RFP coinmunoprecipitaban con NF-YC (fig. 5e).
[0068] El ensayo ChIP revelo que NF-Y se asociaba con la region proximal del promotor de TBP-2 (Fig. 5f) como se observaba para HDAC1 y RFP, y que la expresion reducida de NF-YC atenuaba considerablemente el reclutamiento tanto de HDAC1 como de RFP al promotor de TBP-2 (Fig. 5g y h). De estos resultados se deduce que HDAC1, RFP y NF-Y forman un complejo proteico sobre el promotor de TBP-2. Ademas, a partir de los resultados de cromatografia de filtracion en gel, los presentes inventores encontraron que HDAC1, RFP y NF-YC se detectaban en las mismas fracciones (alrededor de las fracciones de 400 kDa). Esto respalda el hecho de que estas proteinas forman un complejo.
[0069] Los resultados que se muestran en la Fig. 5 sugieren que RFP media en la interaccion entre HDAC1 y NF-YC. De acuerdo con esto, la asociacion entre HDAC1 y NF-YC se potenciaba en las celulas que expresaban RFP de forma exogena, mientras que se atenuaba en consecuencia en las celulas con expresion reducida de RFP (Fig. 6b y c). Estos resultados indican que RFP media en la formacion del complejo proteico. Puesto que se ha descrito que RFP forma un oligomero (referencias 25 y 26), se determino el dominio necesario para su oligomerizacion. Como se muestra en la Fig. 7b, para la oligomerizacion RFP-RFP son necesarios los dominios anillo-caja B (RB) y superhelice (CC), pero no el dominio Rfp (RD).
Puesto que los experimentos hasta la fecha mostraban que era necesario un dominio Rfp para que RFP se uniera a HDAC1 y NF-YC, se penso que RFP se polimerizaba en RB y CC en el extremo N-terminal y se unia a HDAC1 y NF-YC respectivamente en un dominio Rfp en el extremo C-terminal para formar un complejo proteico HDAC1-RFP-NF-Y (Fig. 5i).
[0070] Asimismo, se estudio el efecto de la expresion de RFP en modelos in vivo de tratamiento con farmacos antineoplasicos. Se trasplanto por via subcutanea en un raton desnudo una linea celular en la que se habia expresado ARNhc de RFP (RFP23hc y RFP26hc) y control (NC1hc). Cuando los tumores crecieron por encima de un volumen de 50 mm3, se inyecto cisplatino por via intraperitoneal cada cuatro dias. El tratamiento con cisplatino suprimia mas considerablemente el crecimiento tumoral de las celulas con expresion reducida de RFP que el de las celulas control (Fig. 8a-c).
[0071] Por ultimo, se analizo el efecto de la expresion de RFP sobre el pronostico de pacientes con cancer. Se obtuvieron muestras de 115 pacientes con carcinoma de colon. El cancer de colon RFP positivo se definio como mas del 10% de celulas tumorales claramente tenidas con anticuerpo anti-RFP. Como resultado, 68 de las 115 muestras de carcinoma de colon eran RFP positivas (Fig. 8d). La expresion de RFP y TBP-2 era exclusiva y la expresion de TBP-2 estaba claramente reducida en las celulas que expresaban RFP en muestras de cancer de colon (Fig. 8e). El analisis de supervivencia de Kaplan-Meier de estos casos revelo una correlacion significativa entre la expresion de RFP y una supervivencia global mas corta (Fig. 8f). Estos resultados sugieren que los niveles de expresion de RFP en el cancer de colon afectan a la eficacia de los farmacos antineoplasicos, asi como al desenlace clinico de los pacientes.
[0072] Los efectos antitumorales sinergicos de HDACi y los farmacos quimioterapeuticos han recibido considerable atencion en la investigacion para el tratamiento del cancer; sin embargo, no se ha esclarecido completamente la base mecanicista de dicha sinergia. Varios estudios han sugerido como posible mecanismo que HDAC1 regula la sensibilidad celular a la apoptosis inducida por diversos mecanismos de estres a traves de la asociacion con p53 (referencias 16-19). En este documento se presenta evidencia directa de que HDAC1 forma un complejo con RFP y NF-YC y regula la sensibilidad de las celulas cancerosas al estres oxidativo a traves de la represion de la expresion de TBP-2. Segun publicaciones previas, el aumento de la expresion de TBP-2 puede reducir la capacidad de eliminacion de ROS de la tiorredoxina y sensibilizar a las celulas cancerosas al estres oxidativo inducido por farmacos antineoplasicos. A la vista de estos datos, HDAC1 confiere a las celulas cancerosas resistencia a los farmacos antineoplasicos mediante la regulacion del estado del sistema antioxidante.
[0073] Ademas, los presentes inventores demostraron que la reduccion de la expresion de RFP sensibiliza significativamente a las celulas cancerosas frente a los farmacos antineoplasicos. De este modo, RFP podria convertirse en una nueva diana del tratamiento antineoplasico en combinacion con otros farmacos antineoplasicos. Aunque los HDACi tienen potentes actividades antineoplasicas a concentraciones que son minimamente toxicas para el huesped, tambien se observaron toxicidades limitantes de dosis (referencia 28). Considerando la expresion restringida a tejido de RFP en celulas normales (referencia 29) y la ausencia aparente de defectos fenotipicos en los ratones knockout para RFP, el desarrollo de un tratamiento para el cancer dirigido a RFP podria ser beneficioso y tener menos toxicidad.
Los resultados de los presentes inventores podrian proporcionar nuevos conocimientos sobre el mecanismo molecular que subyace al sinergismo entre HDACi y los farmacos antineoplasicos.
[0074] Para profundizar mas en la investigacion, se examino la relacion entre la expresion de RFP en el cancer de endometrio y el pronostico. Como resultado, en la investigacion de todos los grupos de pacientes (Fig. 9a), se demostro que el pronostico era significativamente desfavorable en un grupo de pacientes en las que se observo la expresion de RFP. Ademas, cuando se realizo la misma investigacion dividiendo los grupos de pacientes en estadio I y estadios II a IV, la expresion de RFP se correlaciona con un pronostico desfavorable independientemente del estadio (Fig. 9b y c). Posteriormente, la relacion entre la expresion de RFP y el pronostico se comparo entre los grupos de pacientes en los que se emplearon diferentes intervenciones quirurgicas respectivamente. En el presente documento se investigo la diferencia entre histerectomia radical e histerectomia total. Como resultado, en el grupo RFP-negativo no se observaron diferencias significativas en el pronostico en funcion de la diferencia del procedimiento quirurgico (Fig. 10b), aunque en el grupo RFP-positivo, el pronostico mejoraba significativamente en el grupo de histerectomia radical en comparacion con el grupo de histerectomia total (Fig. 10c). Por otro lado, se investigo la diferencia basada en la presencia o ausencia de linfadenectomia. En el grupo RFP-negativo no se observaron diferencias significativas entre ambos grupos (un grupo de pacientes (+) que se sometio a linfadenectomia y un grupo de pacientes (-) que no se sometio a linfadenectomia) (Fig. 11b). No obstante, en el grupo RFP-positivo, se demostro que el pronostico mejoraba en un grupo que se sometio a linfadenectomia en comparacion con un grupo de pacientes que no se sometio a linfadenectomia (Fig. 11c). Considerando en conjunto los resultados de ambas figuras (Figs. 10 y 11), se podria pensar que en el caso de las pacientes con expresion de RFP el empleo de procedimientos quirurgicos mas agresivos conduce a una mejora del pronostico. Se puede decir que puede obtenerse informacion para seleccionar un procedimiento quirurgico mediante la confirmacion del estado de expresion de RFP (por ejemplo, realizando una inmunotincion) en la biopsia para el diagnostico del cancer de
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[0076]
lt;110� NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION NAGOYA UNIVERSITY TAKAHASHI, Masahide KATO, Takuya KIKKAWA, Fumitaka lt;120� AGENTES PARA POTENCIAR EL FECTO DE F�RMACOS ANTINEOPL�SICOS Y USOS DE LOS MISMOS lt;130� P08079P lt;150� JP P2008-223461 lt;151� 01/09/2008 lt;160� 18 lt;170� PatentIn version 3.5 lt;210� 1 lt;211� 2.969 lt;212� ADN lt;213� Ho�o ��pien� lt;400� 1
lt;210� 2 lt;211� 1.542 lt;212� ADN
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lt;210� 10 lt;211� 62 lt;212� ADN lt;213� Secuencia artificial lt;220� lt;223� ADN que codifica RFPhc disenado para inhibir la expresion del gen de RFP lt;400� 10
lt;210� 11 lt;211� 21 lt;212� ADN lt;213� Secuencia artificial lt;220� lt;223� cebador especifico para HDAC1 lt;400� 11
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Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para estimar el pronostico en un paciente con carcinoma de colon, en el que se usa el nivel de expresion de RFP (RET finger protein) en una celula cancerosa aislada de un paciente con cancer como indicador y en el que ademas, un nivel de expresion de RFP alto indica un pronostico desfavorable.
    5 2. Uso de un anticuerpo anti-RFP en el procedimiento de la reivindicacion 1.
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