CN102131525A

CN102131525A - 抗癌剂作用增强剂及其应用、以及癌患者预后推定用生物标记物及其应用

Info

Publication number: CN102131525A
Application number: CN2009801334384A
Authority: CN
Inventors: 高桥雅英; 加藤琢哉; 吉川史隆
Original assignee: Nagoya University NUC
Current assignee: Nagoya University NUC
Priority date: 2008-09-01
Filing date: 2009-08-27
Publication date: 2011-07-20
Also published as: EP2322224A1; JP5515071B2; EP2322224B1; JP2014112096A; JP5590693B2; US20130177660A1; US8936906B2; US20110160287A1; US8372583B2; EP2322224A4; ES2432537T3; WO2010023917A1; CN104698168A; JPWO2010023917A1

Abstract

本发明以提供能够提高癌的治疗效果的手段为课题。提供一种作用增强剂，其以抑制RFP(RET finger protein)基因的表达或RFP的作用的化合物为有效成分。并用该作用增强剂，则能增强具有氧化应激诱导效力的抗癌剂的作用。另一方面，提供对把握癌患者的预后有用的生物标记物及其用途。

Description

抗癌剂作用增强剂及其应用、以及癌患者预后推定用生物标记物及其应用

技术领域

本发明涉及增强抗癌剂的作用的药剂及其用途、以及癌患者预后推定用生物标记物及其用途等。

背景技术

组蛋白去乙酰化酶(HDACs)通过抑制细胞的增殖、分化、生存而抑制癌的发生(非专利文献1、2)。从过去的研究已知HDACs的抑制剂(HDACi)在与其他的抗癌剂并用时发挥显著的协同效果(非专利文献2、3)。然而，还未完全理解HDACi发挥协同效果时的分子机理。

经过系统的活体外(in vitro)研究慢慢发现HDACi对肿瘤细胞特异性诱导细胞增殖的停止、分化、细胞凋亡以及肿瘤血管新生的抑制等(非专利文献2、3、4)。基于这种活体外研究，几种HDACi在接受临床实验，其中之一的伏立诺他(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)已通过美国食品和药物管理局(FDA)的许可被应用于皮肤T细胞性淋巴瘤的治疗(非专利文献4、5)。另外，还报道有HDACi除了单独的作用之外还通过与多种作用的抗癌剂并用而发挥协同效果(非专利文献2、4)。而且，已知包括顺铂、5-FU、依托泊苷(etoposide)、阿霉素(Doxorubicin)等的化学疗法剂中，细胞毒性作用的机理之一是诱导活性氧(ROS)的产生(非专利文献6～9)。还报道有抗氧化酶或其关联基因的表达的改变将调节对癌细胞化学疗法剂的抵抗性(非专利文献10～13)，而这将支持上述的利用化学疗法剂的ROS产生的诱导对细胞毒活性重要这一见解。

非专利文献

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非专利文献15：Glozak MA，Seto E.(2007).Histone deacetylasesand cancer.Oncogene 26：5420-5432

非专利文献16：Takahashi M，Inaguma Y，Hiai H，Hirose F.(1988).Developmentally regulated expression of a human″finger″-containinggene encoded by the 5′half of the ret transforming gene.Mol Cell Biol.4：1853-6

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非专利文献18：Takahashi，M.and Cooper，G.M.：ret transforminggene encodes a fusion protein homologous to tyrosine kinases.Mol.Cell.Biol.7，1378-1385(1987)

非专利文献19：Shimono，Y.，Murakami，H.，Hasegawa，Y.andTakahashi，M.：RFP is a transcriptional repressor and interacts withenhancer of polycomb that has dual transcriptional functions.J.BiolChem.275：39411-39419.(2000)

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发明内容

在癌治疗中并用多个抗癌剂的情况较多。抗癌剂的并用是以提高治疗效果为目的进行的，但有时带来严重的副作用。其原因在于现在使用的抗癌剂的大部分以增殖迅速的细胞作为靶，对癌细胞以外的正常的细胞也起到细胞损伤作用。

本发明在如上的背景下，以提供增强抗癌剂的作用的手段，或提供对把握癌患者的预后有用的生物标记物及其用途，从而达成提高癌的治疗效果为课题。

到目前为止已知HDACi将改变控制细胞内氧化状态的硫氧还蛋白(Thioredoxin)、TBP-2的表达。鉴于该事实，本发明人建立如下假说：HDACi通过控制细胞内的抗氧化机理而使癌细胞变为抗癌剂敏感性。为了证实该假说，着眼于具有(1)在人的肿瘤中呈高表达，(2)控制细胞的增殖、分化、生存这样特征(Halkidou K，Gaughan L，Cook S，LeungHY，Neal DE，Robson CN.(2004).Upregulation and nuclearrecruitment of HDAC1 in hormone refractory prostate cancer.Prostate59：177-189(非专利文献14)；Glozak MA，Seto E.(2007).Histonedeacetylases and cancer.Oncogene 26：5420-5432(非专利文献15))的HDAC1，和具有(1)在癌细胞株中有高表达，(2)活体内的表达有局限性这样的特征(Takahashi M，Inaguma Y，Hiai H，Hirose F.(1988).Developmentally regulated expression of a human″finger″-containinggene encoded by the 5′half of the ret transforming gene.Mol Cell Biol.4：1853-6(非专利文献16)；Tezel，G.et al.M.(1999).Differentnuclear/cytoplasmic distributions of RET finger protein in different celltypes.Pathol.Int.49：881-886(非专利文献17))之上还具有(3)其敲除(knockout)鼠不显示严重的表型这样的特征(未发表数据)的(RETfinger protein)，进行了深入的研究。其结果发现HDAC1对ThioredoxinBinding Protein-2(TBP-2)的表达进行负控制，从而增进对癌细胞氧化应激的抵抗性。另外，还发现HDAC1通过由RFP以及转录因子NF-Y构成的蛋白复合体而被配置于TBP-2基因的启动子上。另外，还发现使用RNAi的RFP的表达抑制将招致该蛋白复合体的降解，结果显著增大癌细胞的顺铂(抗癌剂，也是氧化应激的诱导剂)敏感性。这些事实表明RFP是癌细胞获得抗癌剂耐性的重要的控制因子，还表明抑制RFP的表达或作用，则介由抗癌剂的作用的增强，可提高癌治疗结果。

另一方面，还发现RFP的高表达，与人的大肠癌的TBP-2的表达下降、大肠癌患者的预后不良相关。这表示使用抗癌剂时抑制RFP的表达或作用这一治疗对策的有效性，还表明检查癌细胞的RFP的表达水平则能判定对抗癌剂的耐性，而该判定结果将成为对确定治疗方针(有效的治疗法的选择等)、改善预后、提高患者生存质量(QOL)等有贡献的有益信息。进一步研究的结果还发现RFP的表达与子宫体癌的预后不良相关。引人注意的是得到了如下的见解：在发现RFP的高表达时，采用通过更积极的手术方式的举措将改善预后。如上所述，表明RFP作为癌患者的预后推定用生物标记物(指标)有用。尤其是表明在子宫体癌中，RFP的表达将成为决定手术方式时的有益的指标。

本发明主要是以上述的见解以及成果为基础，内容如下。

[1]一种作用增强剂，是具有氧化应激诱导效力的抗癌剂的作用增强剂，其中，以抑制RFP(RET finger protein)基因的表达或RFP的作用的化合物为有效成分。

[2]如[1]所述的作用增强剂，其中，所述化合物是选自以下的(a)～(d)中的化合物：

(a)以RFP基因作为靶的siRNA；

(b)在细胞内生成以RFP基因作为靶的siRNA的核酸构建物；

(c)以RFP基因的转录产物作为靶的反义核酸；

(d)以RFP基因的转录产物作为靶的核酶。

[3]如[1]或[2]所述的作用增强剂，其中，与具有氧化应激诱导效力的抗癌剂并用。

[4]一种增强具有氧化应激诱导效力的抗癌剂的作用的方法，包括：在靶癌细胞内，抑制RFP基因的表达或RFP的作用的步骤。

[5]一种癌治疗法，包括：将[1]或[2]所述的作用增强剂给药的步骤和将具有氧化应激诱导效力的抗癌剂给药的步骤。

[6]一种抗癌剂耐性检测法，包括：检查从活体分离的癌细胞内的RFP表达量的步骤，和

基于所述步骤的结果，判定对具有氧化应激诱导效力的抗癌剂的所述癌细胞的耐性的步骤。

[7]一种癌患者的预后推定用生物标记物，包含RFP。

[8]如[7]所述的预后推定用生物标记物，其中，癌为大肠癌或子宫体癌。

[9]一种癌患者的预后推定法，其中，以从癌患者分离的癌细胞内的RFP表达量为指标。

[10]如[9]所述的预后推定法，其中，癌细胞内的RFP表达量多是表示预后不良。

[11]如[9]或[10]所述的预后推定法，其中，癌为大肠癌或子宫体癌。

[12]一种癌患者的预后推定用试剂，含有抗RFP抗体。

[13]如[12]所述的预后推定用试剂，其中，癌为大肠癌或子宫体癌。

[14]一种癌患者的预后推定用试剂盒，包括[12]或[13]所述的试剂。

[15]如[14]所述的预后推定用试剂盒，其中，癌为大肠癌或子宫体癌。

并用本发明的作用增强剂，则提高以顺铂为代表的具有氧化应激诱导效力的抗癌剂的作用。由此，能够降低抗癌剂的使用量、抗癌剂的种类(并用2种类以上的抗癌剂的情况下)。另外，实现治疗效果的提高。

附图说明

图1：HDAC1和RFP的功能上的相互作用。

(a)HDACi处理对细胞的氧化应激的影响。将HeLa细胞分为用TSA(500nM)进行3小时的前处理的组和未进行处理的组，对各组以所述浓度的H₂O₂进行了10小时的处理。细胞的生死判定是以WST-1法进行的。以H₂O₂未处理时的生存指数为1，示出相对值。

(b)利用siRNA的内源性HDAC1的敲除。将从导入了对照或HDAC1的siRNA的HeLa细胞得到的蛋白的样品，以使用了抗HDAC1抗体的免疫印迹进行了解析。作为蛋白量的对照使用抗β肌动蛋白抗体。导入了siHDAC1的细胞中观察到了HDAC1的表达抑制。(c)、(d)将导入了对照或HDAC1的siRNA的HeLa细胞，以所述的浓度用c：H₂O₂(10小时)d：顺铂(24小时)进行了处理。细胞的生死判定和计算是以与a同样的方法进行的。HDAC1的敲除细胞中，与对照相比经处理的细胞的生存指数的减少度大。

(e)利用siRNA的内源性RFP的敲除。将从导入了对照或RFP的siRNA的HeLa细胞得到的蛋白的样品，以使用了抗RFP抗体的免疫印迹进行了解析。使用抗β肌动蛋白抗体作为蛋白量的对照。导入了siRFP的细胞中观察到了RFP的表达抑制。

(f)、(g)将导入了对照或RFP的siRNA的HeLa细胞，以所述的浓度的f：H₂O₂(10小时)、g：顺铂(24小时)进行了处理。细胞的生死判定和计算是以与a同样的方法进行的。RFP的敲除细胞中，与对照相比，经处理的细胞的生存指数的减少度大。

图2：HDAC1和RFP之间的结合域的鉴定。

(a)HDAC1与RFP相互作用。对HEK293细胞以HDAC1-V5以及Flag-RFP进行一过性共转染(co-transfect)。将细胞溶解产物以抗V5抗体(上侧的板块)或抗Flag抗体进行免疫沉淀，将免疫沉淀物用免疫印迹进行了解析。将抗HA抗体作为空转对照(mock)。

(b)将内源性HDAC1以及RFP用抗HDAC1(上侧的板块)以及抗RFP抗体(下侧的板块)分别进行免疫沉淀。将免疫沉淀物，以使用了抗HDAC1抗体以及抗RFP抗体的免疫印迹进行了解析。

(c)HDAC1和RFP的相互作用所需的RFP的结构域。左侧的板块：RFP的模式图。表示了Ring-B-box结构域、Coild-coil结构域以及Rfp结构域。在各结构域对应的cDNA上附加了Flag标签序列。右侧的板块：将HEK293细胞用HDAC1-V5以及Flag标签RFP缺失构建物一过性共转染之后，以抗V5抗体进行免疫沉淀，用抗Flag抗体或抗V5抗体进行了免疫印迹。使用pFlag载体作为对照。

(d)HDAC1和RFP之间的相互作用所需的HDAC1的区域。左侧板块：HDAC1的模式图。将HDAC1的各区域的对应的cDNA片段以V5标签进行了标记化。将HEK293细胞用Flag-RFP以及V5标签HDAC1缺失构建物一过性共转染之后，用抗Flag抗体进行免疫沉淀，以抗V5抗体或抗Flag抗体进行了免疫印迹。箭头表示共沉淀片段。使用pcDNA载体作为对照。

图3：TBP-2是HDAC1和RFP的共通的靶基因，成为增进癌细胞对H₂O₂和顺铂的敏感性的原因。

(a)、(b)通过HDAC1以及RFP的敲除而提高TBP-2的表达。将从对照、导入了HDAC1或RFP的siRNA的HeLa细胞得到的RNA或蛋白的样品，用RT-PCR(a)或免疫蛋白印迹(Western Blotting)(b)进行了解析。观察到了RT-PCR、免疫印迹均通过HDAC1或RFP的敲除而提高TBP-2的表达。

(c)TBP-2的过度表达。向HeLa细胞导入附加了V5标签的TBP-2的表达载体，用免疫蛋白印迹确认了表达。

(d)、(e)TBP-2的过度表达对于癌细胞对H₂O₂和顺铂的敏感性带来的影响。向HeLa细胞导入附加了V5标签的TBP-2的表达载体，以所述浓度的H₂O₂(10小时)(d)、顺铂(24小时)(e)进行了处理。细胞的生死判定是通过WST-1法进行的。以H₂O₂或顺铂未处理时的生存指数为1，示出相对值。过度表达TBP-2的细胞中，与对照相比经处理的细胞的生存指数的减少度大。

(f)将从对照、以所述的组合导入了HDAC1、RFP或TBP-2的siRNA的HeLa细胞得到的蛋白的样品，用免疫蛋白印迹进行了解析。显示了通过HDAC1或RFP的敲除而提高的TBP-2的表达因siTBP-2而被抑制。

(g)、(h)将以f所示的组合导入了siRNA的HeLa细胞，用所述浓度的H₂O₂(10小时)(g)、顺铂(24小时)(h)进行了处理。细胞的生死判定和计算是通过与d、e同样的方法进行的。通过HDAC1或RFP的敲除而减少的药剂给药时的生存指数由于TBP-2的敲除而部分被消除。

图4：HDAC1以及RFP将控制大肠癌以及乳癌细胞株中的TBP-2的表达，影响细胞对H₂O₂或顺铂的敏感性。

(a)向大肠癌细胞株(SW480，HT-29)和乳癌细胞株(MDA-MB-231)导入对照、HDAC1、RFP的siRNA，对从其细胞得到的蛋白以免疫蛋白印迹进行了解析。发现各细胞株中，敲除HDAC1或RFP则提高TBP-2的表达。

(b)、(c)向大肠癌细胞株(SW480，HT-29)和乳癌细胞株(MDA-MB-231)导入对照、HDAC1、RFP的siRNA，以所述的浓度的H₂O₂(10小时)(c)、顺铂(24小时)(d)进行了处理。细胞的生死判定是通过WST-1法进行的。以H₂O₂或顺铂未处理时的生存指数为1，示出相对值。HDAC1或RFP的敲除细胞中，与对照相比经处理的细胞的生存指数的减少度大。

图5：RFP介由与NF-YC的相互作用，将HDC1配置于TBP-2启动子。

(a)上侧的图模式性地表示TBP-2启动子。表示了用于染色质免疫沉淀法的二个区域。下侧的图是表示HDAC1和RFP配置于TBP-2启动子的情况。免疫沉淀中使用了所述的各抗体。TBP-2启动子区域的检测利用了PCR。图中的“投入”是表示总投入的DNA的PCR扩增产物。

(b)由于RFP将去乙酰基化组蛋白H3以及H4的HDAC1配置于TBP-2启动子。将从shNC1细胞以及shRFP30细胞调制的交联染色质进行了免疫沉淀。以a所述的方法进行了PCR。

(c)RFP与NF-YC相互作用。将HEK293细胞以Flag-RFP以及NF-YC-V5进行了一过性共转染。将细胞溶解产物用抗V5抗体(上)或抗Flag抗体(下)进行免疫沉淀，将免疫沉淀物用免疫蛋白印迹进行了解析。箭头标记表示V5-NF-YC。箭头表示Flag-RFP。将抗HA抗体作为空转对照(mock)。

(d)内源性RFP与NF-YC相互作用。将与抗RFP抗体或对照IgG的免疫沉淀物使用抗RFP抗体以及抗NF-YC抗体以免疫蛋白印迹进行了解析。

(e)利用NF-YC的HDAC1和RFP的免疫共沉淀。将HEK293细胞以Flag-HDAC1、Flag-RFP以及NF-YC-V5共转染之后，用抗V5抗体进行了免疫沉淀。将免疫沉淀物提供于免疫蛋白印迹解析。将抗HA抗体作为空转对照(mock)。

(f)NF-Y与TBP-2启动子的基因附近区域结合。使用抗NF-YB抗体进行了免疫沉淀分析。以与a所述的方法进行了PCR。

(g)HeLa细胞中的利用siRNA的内源性NF-YC的敲除。将以NF-YCsiRNA进行了转染的HeLa细胞的全细胞溶解产物，提供于使用了NF-YC抗体的免疫蛋白印迹解析。

(h)NF-YC是将HDAC1以及RFP配置于TBP-2启动子。将从以对照或NF-YC siRNA转染的细胞调制的交联染色质，用抗HDAC1抗体或抗RFP抗体进行了免疫沉淀。以与a所述的方法进行了PCR。

(i)模式性表示TBP-2启动子上形成的HDAC1/RFP/NF-YC复合体。

图6：RFP导致HDAC1/RFP/NF-YC复合体的形成。

(a)将HDAC1、RFP以及NF-YC，以凝胶过滤柱进行了共分离。将HeLa细胞提取液以Superose 6凝胶过滤色谱法进行分离，将各分组提供于SDS-PAGE。接着，使用抗HDAC1抗体、抗RFP抗体以及抗NF-YC抗体进行了免疫印迹。在上面标示了分子量标准(marker)的溶出位置。

(b)RFP的表达增进复合体的形成。将HEK293细胞以NF-YC-V5、HDAC1-myc以及Flag-RFP进行共转染之后，用抗V5抗体进行了免疫沉淀。将免疫沉淀物用免疫蛋白印迹进行了解析。

(c)以RNAi抑制RFP则抑制复合体的形成。将NF-YC-V5，与对照或RFP siRNA一同共转染于HeLa细胞。将细胞溶解产物用抗V5抗体进行免疫沉淀之后，用免疫蛋白印迹进行了解析。将抗HA抗体作为空转对照(mock)。

图7：RFP的多聚化。

(a)RFP将形成同源寡聚体。将HEK293细胞用GFP-RFP以及Flag-RFP进行共转染之后，以抗Flag抗体进行了免疫沉淀。接着使用抗Flag抗体以及抗GFP抗体进行了免疫印迹。将抗HA抗体作为空转对照(mock)。WCL表示全细胞溶解产物。

(b)Ring-B-box以及Coiled-coil是多聚化所必要的。将HEK293细胞用GFP-RFP以及具有Flag标签的RFP缺失构建物进行共转染之后，用抗Flag抗体进行了免疫沉淀。使用pFag载体作为对照。箭头表示具有Flag标签的RFP构建物。

图8：RFP是新型的癌治疗的靶。(a)、(b)、(c)RFP的敲除增强活体内的肿瘤的抗癌剂敏感性。裸小鼠的皮下移植shNC1(对照)、shRFP23、shRFP26三个细胞株。肿瘤的体积达到50mm³时，将小鼠随机分为顺铂治疗组和未治疗组。每4天将用量1mg/kg的顺铂(治疗组)或溶剂(生理食盐水：未治疗组)向小鼠的腹腔内给药。

(a)代表性肿瘤的照片。与未治疗组相比，观察到RFP敲除细胞株的治疗组中的肿瘤的体积明显小。

(b)肿瘤的成长曲线。每4天测定肿瘤直径，计算体积作成了图形。与未治疗组相比，RFP敲除细胞株的治疗组中肿瘤的成长明显慢。

(c)将b的第1天和第21天的未治疗组的体积设为100％时的治疗组的体积的比例制成了图形。shNC1中第1天相对于未治疗组约为92％，第21天减少为77％，而在shRFP23、shRFP26中分别为95％减少到38％、112％减少到42％。使用RFP敲除细胞株的组中顺铂的治疗效果大幅增强。

(d)表示大肠癌试样中的RFP的表达的代表性照片。染有茶色的部分表示RFP阳性部分。将被染色的细胞为＜10％判定为RFP阴性、≥10％判定为RFP阳性。

(e)RFP在大肠癌中抑制TBP-2的表达。将肿瘤组织以抗RFP抗体(红)以及抗TBP-2抗体(绿)进行了染色。将细胞核用DAPI(4’，6-diamino-2-phenylindole：青)进行了标签。可知表现RFP的表达的细胞中TBP-2的表达低。

(f)RFP的表达与大肠癌患者的预后不良相关联。115例的大肠癌患者的全生存期以有无RFP的表达进行分段化，以Kaplan-Meier法进行了解析。通过时序检验(log-rank test)发现RFP的表达与预后不良有显著的关联。

图9：表示RFP的表达和子宫体癌的预后不良之间的关联的座标图。对RFP阴性组和RFP阳性组的全生存期进行了比较。(a)患者组全体的比较。(b)分期I的患者组的比较。(c)分期II～IV的患者组的比较。

图10：表示因RFP的表达和子宫体癌的手术方式而预后不同的座标图。对经历广泛式子宫切除术(Radical hysterectomy)的患者组和经历全子宫切除术(Total hysterectomy)的患者组的全生存期进行了比较。(a)患者组全体的比较。(b)RFP阴性组的比较。(c)RFP阳性组的比较。

图11：表示因RFP的表达和子宫体癌的手术方式而预后不同的座标图。对经历淋巴结切除术(Lymphadenectomy)的患者组和未经历的患者组的全生存期进行了比较。(a)患者组全体的比较。(b)RFP阴性组的比较。(c)RFP阳性组的比较。

具体实施方式

(抗癌剂的作用增强剂及其用途)

本发明的第1方面是有关抗癌剂的作用增强剂(以下，称为“本发明的药剂”)。本发明的药剂增强具有氧化应激诱导效力的抗癌剂的作用。换言之，本发明的药剂是对在靶癌细胞中氧化应激抵抗性增进时效力变弱或失效的抗癌剂的作用进行增强。本发明中“对抗癌剂的作用进行增强”或“增强抗癌剂的作用”是指提高抗癌剂的抗癌作用。通过将本发明的药剂与抗癌剂并用而提高癌的治疗效果。在此的“提高治疗效果”包括：(1)治疗效果的增大，(2)起效率乃至有效率的提高，(3)副作用的降低乃至规避(根据本发明，达成其中的至少一个)。抗癌剂的例子有顺铂、卡铂、奥沙利铂等的铂制剂、环磷酰胺、氟尿嘧啶(5-FU)、依托泊苷、阿霉素、博来霉素、丝裂霉素。

本发明人研究的结果，发现通过将硫氧还蛋白结合蛋白2(TBP-2)的表达进行负控制而HDAC1增进癌细胞对氧化应激的抵抗性。为了阻止HDAC1的该作用，提高癌细胞的抗癌剂敏感性，本发明的药剂以判明了必须向TBP-2基因启动子上配置HDAC1的RFP作为靶。详细为，本发明的药剂是以抑制RFP基因的表达或RFP的作用的化合物为有效成分。其中，两个用语“抑制”和“阻止”的所指意义重叠，可以替换使用。在此，本说明书中，除了可从前后叙述必须特别区分的情况之外，统一使用用语“抑制”。

RFP是具有环指(ring finger)结构的核蛋白，通过与RET形成融合蛋白而作为癌蛋白被活化(Takahashi，M.and Cooper，G.M.：rettransforming gene encodes a fusion protein homologous to tyrosinekinases.Mol.Cell.Biol.7，1378-1385(1987)(非专利文献18)；非专利文献16)。RFP具有强转录抑制活性，与各种核蛋白相互作用(Shimono，Y.，Murakami，H.，Hasegawa，Y.and Takahashi，M.：RFP is atranscriptional repressor and interacts with enhancer of polycomb thathas dual transcriptional functions.J.Biol Chem.275：39411-39419.(2000)(非专利文献19)；Shimono，Y.，Murakami，H.，Kawai，K.，Wade，P.A.，Shimokata，K.and Takahashi，M.：Mi-2 associates with BRG1 andRET finger protein at the distinct regions with transcriptionalactivating and repressing abilities.J.Biol.Chem.278：51638-51645(2003)(非专利文献20)；Shimono，K.，Shimono，Y.，Shimokata，K.，Ishiguro，N.，and Takahashi，M.：Microspherule protein 1，Mi-2β，andRET finger protein associate in the nucleolus and up-regulate ribosomalgene transcription.J.Biol.Chem.280：39436-39447(2005)(非专利文献21))。报道有在癌细胞株中RFP呈高表达。但是，癌组织中的RFP的表达状态还未被了解。将RFP基因的序列(序列号1)、RFP的mRNA的序列(序列号2)以及RFP的氨基酸序列(序列号3)示于序列表。如上所述，从以RFP作为靶的敲除鼠不显示严重的表型可知以RFP作为靶在安全性的方面也优选。另外，从来源于多个种类的人的肿瘤或所检查的大多的肿瘤的培养细胞株中确认到了高表达(未发表数据以及非专利文献16)出发，可期待对广泛的肿瘤发挥作用。

成为本发明的有效成分的抑制RFP基因的表达的化合物是抑制RFP基因的表达过程(包括转录、转录后调控、翻译、翻译后调控)的化合物。该化合物的例子如下。其中，本发明的“表达的抑制”可以是一过性抑制和长期抑制的任一个。

(a)以RFP基因作为靶的siRNA

(b)在细胞内生成以RFP基因作为靶的siRNA的核酸构建物

(c)以RFP基因的转录产物作为靶的反义核酸

(d)以RFP基因的转录产物作为靶的核酶

上述(a)以及(b)是利用通过所谓的RNAi(RNA interference；RNA干扰)的表达抑制的化合物。换言之，根据以上述(a)或(b)的化合物为有效成分的本发明的药剂，通过RNAi可抑制RFP的表达。RNAi是能在真核细胞内引起的、序列特异性转录后基因抑制的过程。对于哺乳动物细胞的RNAi中，使用与靶mRNA的序列对应的短序列双链RNA(siRNA)。通常，siRNA是21～23碱基对。已知哺乳动物细胞具有受双链RNA(dsRNA)的影响的2个路径(序列特异性路径以及序列非特异性路径)。序列特异性路径中，比较长的dsRNA被短的干扰性RNA(即siRNA)分割。另一方面，序列非特异性路径被认为是只要为规定长度以上则与序列无关地被任意的dsRNA所发动。该路径中dsRNA活化两个酶，即成为活性型、通过磷酸化翻译起始因子eIF2而使蛋白合成全部停止的PKR，和与RNAase L活化分子的合成相关的2′，5′-寡腺苷酸合成酶。为了将该非特异性路径的进行停留在最小限度，优选使用短于约30碱基对的双链RNA(siRNA)(参照Hunter et al.(1975)J Biol Chem 250：409-17；Manche et al.(1992)Mol Cell Biol 12：5239-48；Minks et al.(1979)J Biol Chem 254：10180-3；以及Elbashir et al.(2001)Nature411：494-8)。

为了生成靶特异性RNAi，将由与靶基因的mRNA序列的一部分相同的正义RNA以及与其互补的反义RNA构成的siRNA导入细胞内，或者在细胞内表达即可。上述(a)是与前者的方法对应的化合物，同样地上述(b)是与后者的方法对应的化合物。

以靶基因(本发明中为RFP基因)作为靶的siRNA，通常是将由与该基因的mRNA的序列中连续的区域相同的序列形成的正义RNA和由与其互补的序列形成的反义RNA杂交的双链RNA。在此的“连续的区域”的长度通常为15～30碱基，优选为18～23碱基，更优选为19～21碱基。

已知末端具有数个碱基的突出端的双链RNA发挥高RNAi效果。因此，本发明中也优选采用这种结构的siRNA。形成突出端的碱基的长度没有特别限定，优选为2碱基(例如TT、UU)。

也可以使用由修饰的RNA形成的siRNA。在此的修饰的例子可举出磷硫酰化、修饰碱基(例如荧光标记碱基)的使用。

siRNA的设计以及调制可用一般法进行。siRNA的设计中通常利用靶序列中固有的序列(连续序列)。其中，已开发有用于选择适合的靶序列的程序以及算法。

以下，举出以RFP基因作为靶的siRNAの序列的例子。

5′-GAGTTACTCGGGAGGGAAA-3′(序列号4。在后述的实施例中使用的序列)

5′-AACTCTTAGGCCTAACCCAGA-3′(序列号5。参照KrutzfeldtM，Ellis M，Weekes DB，Bull JJ，Eilers M，Vivanco MD，Sellers WR，Mittnacht S.(2005).Selective ablation of retinoblastoma proteinfunction by the RET finger protein.Mol Cell.18(2)：213-24.)

5′-AAGAGAGGCUCAGUUAUACUC-3′(序列号6。参照KrutzfeldtM，Ellis M，Weekes DB，Bull JJ，Eilers M，Vivanco MD，Sellers WR，Mittnacht S.(2005).Selective ablation of retinoblastoma proteinfunction by the RET finger protein.Mol Cell.18(2)：213-24.)

5′-CCCUAUGAGUGGGAUUGAU-3′(序列号7。参照Fukushige S，Kondo E，Gu Z，Suzuki H，Horii A.(2006).RET finger protein enhancesMBD2-and MBD4-dependent transcriptional repression.BiochemBiophys Res Commun.351(1)：85-92.Epub 2006 Oct 10.)

5′-GACTCAGTGTGCAGAAAAG-3′(序列号8。参照Zha J，Han KJ，Xu LG，He W，Zhou Q，Chen D，Zhai Z，Shu HB.(2006).The Ret fingerprotein inhibits signaling mediated by the noncanonical and canonicalIkappaB kinase family members.J Immunol.Jan 15；176(2)：1072-80.)

5′-AGAACCAGCTCGACCATT-3′(序列号9。参照Townson SM，Kang K，Lee AV，Oesterreich S.(2006).Novel role of the RET fingerprotein in estrogen receptor-mediated transcription in MCF-7 cells.Biochem Biophys Res Commun.Oct 20；349(2)：540-8.Epub 2006 Aug22.)

上述(b)的“在细胞内生成siRNA的核酸构建物”是指将其导入细胞则由于细胞内的过程生成所希望的siRNA(引起对于靶基因的RNAi的siRNA)的核酸性分子。该核酸构建物的一个例子为shRNA(shorthairpin RNA)。shRNA是具有将正义RNA和反义RNA介由环结构部连接的结构(发夹结构)，在细胞内环结构部被切断成为双链siRNA，从而具有RNAi效果。环结构部的长度没有特别限定，通常为3～23碱基。

核酸构建物的其他例子为可表达所希望的siRNA的载体。作为这种载体可举出由于后面的过程而变换为siRNA的表达shRNA的(插入有编码shRNA的序列)载体(被称为茎环(stem loop)型或短发夹型)、分别表达正义RNA和反义RNA的载体(被称为串联型)。本领域技术人员可用一般法制作这些载体(可参考Brummelkamp TR et al.(2002)Science296：550-553；Lee NS et al.(2001)Nature Biotechnology 19：500-505；Miyagishi M & Taira K(2002)Nature Biotechnology 19：497-500；Paddison PJ et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：1443-1448；PaulCP et al.(2002)Nature Biotechnology 19：505-508；Sui G et al.(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99(8)：5515-5520；Paddison PJ et al.(2002)Genes Dev.16：948-958等)。现在，可利用各种各样的RNAi用载体。也可以利用这种公知的载体构建本发明的载体。这时，准备编码所希望的RNA(例如shRNA)的插入DNA之后，插入于载体的克隆位点，作为RNAi表达载体。shRNA的具体例示于序列表的序列号110。序列号10是编码以RFP作为靶的shRNA的单链寡聚核苷酸(正义链)的序列。

并且，只要具有在细胞内生成对靶基因发挥RNAi作用的siRNA这样的作用，对载体的来源、结构没有限定。因此，可使用各种病毒载体(腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体、仙台病毒载体等)、非病毒载体(脂质体、正电荷脂质体等)等。示出可在载体利用的启动子的例子，则有U6启动子、H1启动子、tRNA启动子。这些启动子是RNA聚合酶III类的启动子，可期待高表达效率。

上述(c)是利用于通过反义法的表达抑制的化合物。换言之，根据以上述(c)的化合物为有效成分的本发明的药剂，通过反义法可抑制RFP的表达。通过反义法进行表达阻止时，例如在靶细胞内进行了转录时，使用生成与编码RFP的mRNA的固有部分互补的RNA的反义构建物。这种反义构建物例如以表达质粒的形态导入于靶细胞。另一方面，作为反义·构建物可采用在导入靶细胞内时，与编码RFP的mRNA/或基因组DNA序列进行杂交而阻止其表达的寡核苷酸探针。作为这种寡核苷酸探针优选为对外切核酸酶和/或内切核酸酶等的内源性核酸酶具有抵抗性的探针。

作为反义核酸使用DNA分子时，优选来源于包括编码RFP的mRNA的翻译起始部位(例如-10～+10的区域)的区域的脱氧寡核苷酸。

虽然优选反义核酸与靶核酸之间的互补性严密，但多少可以存在错配。对靶核酸的反义核酸的杂交能力一般依赖于两个核酸的互补性的程度以及长度两方面。通常，所使用的反义核酸越长，即使错配的数多也能在靶核酸之间形成稳定的双链(或三链)。本领域技术人员能够使用标准的方法确认可容许的错配程度。

反义核酸可以是DNA、RNA或者它们的嵌合体混合物或它们的衍生物、变异型。另外，单链和双链均可以。通过修饰碱基部分、糖部分、或磷酸骨架部分而能提高反义核酸的稳定性、杂交能力等。另外，还可以向反义核酸附加促进细胞膜输送的物质(例如可参照Letsinger et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：6553-6556；Lemaitre et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.84：648-652；PCT Publication No.W088/09810，published December 15，1988)、提高对特定的细胞的亲和性的物质等。

反义核酸例如可通过使用市售的自动DNA合成装置(例如AppliedBiosystems公司等)等一般法进行合成。核酸修饰体、衍生物的制作例如可以参照Stein et al.(1988)，Nucl.Acids Res.16：3209；Sarin et al.，(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：7448-7451等。

为了提高靶细胞内的反义核酸的作用，可以利用pol II、pol III这样的强力启动子。即，将包含这样的启动子的控制下被配置的反义核酸的构建物导入靶细胞，则因该启动子的作用而能够确保充分量的反义核酸的转录。

反义核酸的表达可通过已知作用于哺乳动物细胞(优选为人细胞)的任意启动子(诱导性启动子或结构性启动子)而进行。例如，可使用SV40初期启动子区域(Bernoist and Chambon，1981，Nature 290：304-310)、来源于Rous肉瘤病毒的3′末端区域的启动子(Yamamoto et al.，1980，Cell 22：787-797)、疱疹病毒胸腺嘧啶激酶启动子(Wagner et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1441-1445)等的启动子。

本发明的一个方式中，使用利用核酶的表达抑制(上述(d)的化合物的情况)。使用以部位特异性识别序列使mRNA裂解的核酶，能使靶mRNA降解，优选使用锤头状核酶。锤头状核酶的构建方法例如可参考Haseloff and Gerlach，1988，Nature，334：585-591。

与利用反义法的情况同样地，例如以提高稳定性、靶能力为目的，可使用经修饰的寡核苷酸构建核酶。为了在靶细胞内生成有效量的核酶，例如优选使用在强力启动子(例如pol II、pol III)的控制下配置了编码该核酶的DNA的核酸构建物。

本发明的一个方式中，以抑制RFP的作用的化合物为有效成分。本发明人研究的结果(参照后述的实施例)，发现RFP介由与HDAC1之间的物理性且功能上相互作用，与由HDAC1导致的氧化应激敏感性的控制相关联。基于该见解，该方式的药剂抑制RFP与HDAC1的相互作用，实现增强抗癌剂的作用。只要是能够抑制RFP与HDAC1的相互作用，则对化合物的种类没有限制。本发明人研究的结果，发现HFAC1的N末端侧，与RFP的Coild-coil结构域以及Rfp结构域结合。因此，以能够阻止该结合的化合物作为有效成分使用即可。例如，可采用与RFP的Coild-coil结构域或Rfp结构域特异性结合的抗体。对抗体的种类、形态没有特别的限定。可以是多克隆抗体、寡克隆抗体以及单克隆抗体的任一个。另外，可以使用嵌合体抗体(例如人和小鼠的嵌合体)、人源化抗体、人抗体等。进而还可以使用Fab、Fab′、F(ab′)₂、scFv、dsFv等的抗体片段。

作为有效成分的抗体可通过使用将HDAC1或RFP或它们的一部分(优选为与相互作用相关的部位)作为抗原利用的免疫学的方法，噬菌体展示法、核糖体展示法等而调制。

也可以将与RFP竞争性地对HDAC1的N末端侧进行结合的化合物作为有效成分。这种化合物的例子可举出RFP的Coild-coil结构域样聚肽、Rfp结构域样聚肽。

并且，也可以不是以抗体自身作为有效成分，而是以细胞内能表达所希望的抗体的载体作为有效成分。抗体以外的化合物也同样。

本发明的药剂的制剂化可基于一般法进行。进行制剂化时，可含有制剂上容许的其它成分(例如，载体、赋形剂、降解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、麻醉剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理食盐水等)。作为赋形剂可以使用乳糖、淀粉、山梨糖醇、D-甘露糖醇、白糖等。作为降解剂可使用淀粉、羧甲基纤维素、碳酸钙等。作为缓冲剂可使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为乳化剂可以使用阿拉伯树胶、海藻酸钠、黄芪胶等。作为悬浮剂可使用单硬脂酸甘油酯、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、十二醇硫酸钠等。作为麻醉剂可使用苯甲醇、氯代丁醇、山梨糖醇等。作为稳定剂可使用丙二醇、二乙基亚硫酸盐、抗坏血酸等。作为保存剂可使用苯酚、苯扎氯铵、苯甲醇、氯代丁醇、羟苯甲酯等。作为防腐剂可使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯代丁醇等。

对制剂化时的剂型也没有特别限定。剂型例子有锭剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、注射剂、外用药以及栓剂。

本发明的药剂中，为了得到所期待的治疗效果(或预防效果)含有必要量(即治疗上有效的量)的有效成分。本发明的药剂中的有效成分量一般因剂型而不同，以能够实现所希望的给药量的方式，例如将有效成分量设定在约0.1重量％～约95重量％的范围内。

本发明的药剂根据其剂型通过经口给药或非经口给药(静脉内、动脉内、皮下、皮内、肌肉内或腹腔内注射、经皮、经鼻、经粘膜等)而应用于对象。这些给药路径并不相互排斥的，也可以并用任意选择的两种以上(例如，经口给药的同时或经过规定时间后进行静脉注射等)。

以核酸构建物作为有效成分时(例如利用RNAi的方式)，并不局限于活体内给药，也可以采用离体给药。

对于本发明的药剂的给药“对象”没有特别限定，包括人以及人以外的哺乳动物(包括宠物动物、家畜、试验动物。具体例如有小鼠、大鼠、土拨鼠、仓鼠、猴子、牛、猪、山羊、绵羊、狗、猫、鸡、鹌鹑等)。优选的一个方式中本发明的药物适用于人。

给药量根据患者的症状、年龄、性别以及体重等而不同，本领域技术人员可设定适宜适当的给药量。给药计划表的设定中可以考虑患者的症状、药剂的效果持续时间等。

本发明的药剂与抗癌剂并用。即，将本发明的药剂与抗癌剂一并给药。典型的是准备本发明的药剂和规定的抗癌剂，将两者向对象给药。此时，对于对象，同时或隔规定时间的间隔将两个药剂给药(应用)。在此，“同时”并不要求严格的同时性。因此，该“同时”自然包括混合两个药剂后向对象给药等的在两者的给药没有时间差的条件下实施的情况，也包括单方给药后，迅速将另一方给药等的在两个药剂的给药基本没有时间差的条件下实施的情况。优选为考虑本发明的药剂发挥作用为止所需的时间，将本发明的药剂给药之后，过规定的时间再将抗癌剂给药。在此的规定的时间例如为1小时～72小时(具体例为48小时)。如此地将本发明的药剂先行给药，则容易发挥基于本发明的作用，具有良好的治疗效果。

并且，也可以准备混合了本发明的药剂和抗癌剂的配合剂，将其向对象给药。

将本发明的药剂与抗癌剂并用给药，则在靶癌细胞内抑制RFP基因的表达或RFP的作用。由此，对由HDAC1导致的TBP-2的表达抑制进行抑制甚至消除，其结果，提高靶癌细胞的氧化应激敏感性。如此地形成抗癌剂容易起效的状态，即形成降低了对抗癌剂的耐性的状态，所以，提高抗癌剂的治疗效果。

本发明的药剂可期待对各种各样的癌的应用。成为本发明的药剂的靶的癌可以例示食道癌、口腔癌、上颚癌、喉头癌、咽头癌、胃癌、十二指肠癌、大肠癌、肝细胞癌、胆管细胞癌、肺癌、前列腺癌、肾癌、膀胱乳头状癌、前列腺癌、尿道扁平上皮癌、骨原性肉瘤、软骨肉瘤、滑膜肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、扁平上皮癌、恶性黑色素瘤(melanoma)、神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、乳癌、乳房肉瘤、子宫上皮内癌、子宫颈部扁平上皮癌、子宫腺癌、子宫肉瘤、卵巢癌、恶性黑色素瘤(melanoma)、甲状腺乳头状腺癌、甲状腺滤泡状腺瘤、急性髓细胞白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性未分化型白血病、慢性骨髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病。

并用的抗癌剂只要是具有氧化应激诱导效力，就没有特别的限定。例示抗癌剂则有顺铂、卡铂、奥沙利铂等的铂制剂、环磷酰胺、氟尿嘧啶(5-FU)、依托泊苷、阿霉素、博来霉素、丝裂霉素。也可以将2种以上的抗癌剂并用。抗癌剂的给药量是以将其单独使用时的使用量(即，通常的使用量)为准。但是，由于通过与本发明的药剂并用而能够期待增强抗癌剂的作用，所以可以将给药量设定成低于通常的给药量。其中，本领域技术人员可以考虑患者的病状、年龄、性别、体重等而设定“通常的使用量”。

(抗癌剂耐性检测法)

本发明人研究的结果，发现RFP的高表达与人的大肠癌中的TBP-2的表达的下降、大肠癌患者的预后不良相关联(参照后述的实施例)。基于该见解，本发明的第2方面是提供利用RFP基因的表达量的抗癌剂耐性检测法(以下称为“本发明的检测法”)。进行本发明的检测法则能够判定癌细胞的抗癌剂耐性。判定结果例如被利用于治疗方针的确定(有效的治疗法的选择等)。通过利用判定结果而能实现治疗效果的提高、预后改善、患者的生存质量(QOL)的提高等。如此地，本发明的检测法对癌治疗提供极为有用的信息。

本发明的检测法中进行如下的步骤。即，检查从活体分离的癌细胞内的RFP表达量的步骤(检测步骤)，以及基于所述步骤的结果判定对具有氧化应激诱导效力的抗癌剂的所述癌细胞的耐性的步骤(判定步骤)。

检测步骤中，首先准备从活体分离的癌细胞。“从活体分离的”是指通过摘取被检测癌细胞所存在的活体组织的一部分而使被检测癌细胞与其来源活体完全隔离的状态。只要满足该条件，可以是与周围的细胞一起形成组织的状态的癌细胞(即，组织片的状态)，也可以是从周围的细胞分离的状态的癌细胞。关于前者，例如以进行活组织检查(biopsy)时的要领调制细胞即可，关于后者，例如以细胞检查时的要领调制细胞即可。

接着检查所准备的癌细胞内的RFP表达量。RFP表达量通常是通过与对照(比较对照)的比较而计算。对照可以使用以预先知道了RFP表达量的各种癌细胞、将被检测癌细胞从活体采取时混于被检测癌细胞中被采取的正常细胞。对于RFP表达量无需进行严格的定量，只要能够检测到通过与对照比较而能够评价被检测癌细胞对抗癌剂的耐性的程度的RFP表达量即可。并且，根据通例，将被检测癌细胞中确认到RFP的表达的情况还表示为RFP阳性或RFP+(positive)，将被检测癌细胞中未确认到RFP的表达的情况表示为RFP阴性或RFP-(negative)。在以免疫组织化学测定被检测癌细胞的RFP表达量时(详细如后述)，例如，在10％以上的被检测癌细胞中确认到染色性时(即，被染色的细胞的比例为10％以上时)作为RFP阳性(或RFP+)。将区分阳性和阴性的临界值(以被染色的细胞的比例表示)可根据检测法、检测条件等而适当设定即可。例如，可以在5％～30％之间设定临界值。

RFP的表达量是以蛋白质水平或mRNA水平进行检测。若要求高精度则优选前者。将RFP表达量以蛋白水平进行检测时，即作为RFP表达量检测RFP蛋白量时，虽然不受此限制但优选利用免疫蛋白印迹法、免疫组织化学测定(免疫染色)。根据免疫组织化学测定，则能够同时检查出被检测癌细胞的形态、分布状态等，可同时得到附加的信息。

免疫组织化学测定中是使用将RFP特异性识别的抗体(抗RFP抗体)，将该抗体的结合性(结合量)作为指标检查RFP蛋白量。使用了抗RFP抗体的免疫组织化学测定例如可通过ABC(Avidin-Biotin Complex)法、PAP(Peroxydase-anti-Peroxydase Complex)法、LAB(Linked Avidin-Biotin)法、LSAB(Linked Streptavidin-Biotin)法等进行。所述各方法的标准的实验方案属于公知技术(例如参照“酶抗体法、改订第3版”、渡边庆一、中根一穗编、学际企画)。

对于免疫组织化学测定所使用的抗RFP抗体的种类、来源等没有特别的限定。优选使用单克隆抗体，但只要是具有充分的特异性且能检测RFP，则也可以使用寡克隆抗体(数种～数十种的抗体的混合物)或多克隆抗体。也可以使用Fab、Fab′、F(ab′)₂、scFv、dsFv抗体等的抗体片段。抗RFP抗体可通过利用免疫学的方法、噬菌体展示法、核糖体展示法等而调制。另外，在文献“Shimono，Y.et al.RET finger protein is atranscriptional repressor and interacts with enhancer of polycomb thathas dual transcriptional functions.J Biol Chem.275(50)：39411-9(2000)”中记载有抗RFP抗体(兔多克隆)的调制法及其使用例，可供参考。

下面，表示免疫组织化学测定的方法、步骤的一例。

(1)固定、石蜡包埋

将从活体(剖检病例的情况时为尸体)采取的组织用福尔马林、仲甲醛等进行固定。其后进行石蜡包埋。一般用乙醇进行脱水后以二甲苯处理，最后用石蜡进行包埋。将以石蜡包埋的标本切片成所希望的厚度(例如3～5μm)，玻片上展开。并且，有时也有代替石蜡包埋标本使用冻结标本的情况。

(2)脱石蜡

一般以二甲苯、乙醇以及净化水的顺序进行处理。

(3)前处理(抗原的活化)

根据需要，为了活化抗原进行酶处理、加热处理和/或加压处理等。

(4)内源性过氧化物酶的除去

作为染色时的标记物质使用过氧化物酶时，预先通过过氧化氢水进行处理除去内源性过氧化物酶活性。

(5)非特异性反应的阻止

将切片用牛血清白蛋白溶液(例如1％溶液)处理数分钟到数十分钟左右，阻止非特异性反应。并且，也可以使用含牛血清白蛋白的抗体溶液进行下面的一级抗体反应，从而省略该工序。

(6)一级抗体反应

将稀释为适当浓度的抗体在玻片上的切片上滴下，其后进行数十分钟～数小时的反应。反应结束后，以磷酸缓冲液等适当的缓冲液进行清洗。

(7)标记试剂的添加

作为标记物质频繁使用过氧化物酶。将结合了过氧化物酶的二级抗体在玻片上的切片上滴下，其后进行数十分钟～数小时的反应。反应结束后，以磷酸缓冲液等适当的缓冲液进行清洗。

(8)显色反应

Tris缓冲液中溶解DAB(3，3′-二氨基联苯胺)。接着添加过氧化氢水。用如此调制的显色用溶液将切片浸透数分钟(例如5分钟)，进行显色。显色后，将切片用自来水充分清洗，去除DAB。

(9)核染色

将Mayer苏木精液反应数秒～数十秒进行核染色。用自来水清洗染固(通常为数分钟)。

(10)脱水、渗透、密封

用乙醇进行脱水之后，用二甲苯进行渗透处理，最后用合成树脂、甘油、橡胶浆等进行密封。

以mRNA水平检查RFP表达量时的mRNA的检测/测定中可利用RT-PCR(Molecular Cloning，Third Edition，8.46，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York)、RNA印迹(Northern blot)法(MolecularCloning，Third Edition，7.42，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork)、斑点印迹法(Molecular Cloning，Third Edition，7.46，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York)、使用DNA芯片(DNA Array)的方法、原位杂交等。

本领域技术人员可基于RFP的序列(NCBI的数据库、Accession：RFPNM_006510、DEFINITION：Homo sapiens tripartitemotif-containing 27(TRIM27)，mRNA.(序列号2))，通过一般法设计适于各方法的核酸引物或核酸探针。

在判定步骤中，基于检测步骤的结果，即基于RFP表达量判定对具有氧化应激诱导效力的抗癌剂的癌细胞的耐性。以下表示基于RFP表达量的评价的具体例。

预先设定使RFP表达量与抗癌剂耐性相关联的多个评价区。然后基于在检测步骤中得到的RFP表达量，确定被检测癌细胞所属的评价区。作为关于评价区的设定的具体例下面表示了着眼于有无RFP的表达的例子(例1)和着眼于RFP的表达量的程度的例子(例2)。其中，以区名：与该区相关联的RFP表达量：与该区相关联的评价结果的顺序进行记载。

<例1>

区1：RFP阳性：抗癌剂耐性

区2：RFP阴性：抗癌剂敏感性

<例2>

区1：未确认到RFP的表达：抗癌剂敏感性

区2：确认到弱RFP的表达：对抗癌剂的耐性低

区3：确认到中度的RFP的表达：对抗癌剂的耐性为中度

区4：确认到强RFP的表达：对抗癌剂的耐性高

评价区的数、与各评价区相关联的RFP表达量以及评价结果均不受上述例的任何限制，可通过预备实验等而任意设定。并且，本发明的判定·评价并不依赖医生、检测人员等具有专业知识的人员的判断，能够全部自动、机械性地进行。

如上所述，可以利用根据本发明的检测法的判定结果的结果确定治疗方针。表示一例，则若得到“具有抗癌剂耐性”的判定结果、“对抗癌剂的耐性高”的判定结果时，能够预测单独的抗癌剂无法发挥所希望的治疗效果。这时将本发明的药剂与抗癌剂并用给药，增强抗癌剂的作用将成为有效的治疗方针。另一方面，得到“具有抗癌剂敏感性”的判定结果、“对抗癌剂的耐性低”的判定结果时，能够预测仅通过抗癌剂也能发挥所期待的治疗效果。这种情况下，将抗癌剂单独给药成为治疗方针选择之一。但是，这种情况下为了通过增强抗癌剂的作用而进一步提高治疗效果，也可以将本发明的作用增强剂并用给药。

(预后推定用生物标记物及其用途)

本发明人研究的结果，发现RFP的高表达与大肠癌患者、子宫体癌患者的预后不良相关联(参照后述的实施例)。基于该见解，本发明的第3方面是提供含有RFP的癌患者的预后推定用标记物。该生物标记物在把握癌患者的预后上有用。另外，也成为确定手术方式时的指针。例如，在从子宫体癌的患者采取的试样(癌细胞)中确认到RFP的表达时(例如免疫染色中判断为阳性时)，可以判定为优选采用更积极的手术方式。作为更积极的手术方式可以举出广泛式子宫切除术、淋巴结廓清术。

该方面中，作为上述生物标记物的用途还提供癌患者的预后推定法。根据本发明的预后推定法，能够得到对癌患者的预后推定有益的信息。该信息例如被利用于治疗方针的确定(有效的治疗法的选择等)。通过利用判定结果而能够实现治疗效果的提高、预后改善、患者的生存质量(QOL)的提高等。

下面，对该方面的发明进行详细说明，其中对于与第1方面或第2方面共同的事项将援用第1方面或第2方面中的说明。本说明书中，“癌患者的预后推定用生物标记物”是指成为癌患者的预后推定的指标的活体分子。对于“癌”的种类没有特别限定。并且，在患有大肠癌或子宫体癌的患者的预后推定中本发明的生物标记物尤其有用。

本发明的预后推定法中，将本发明的生物标记物用作判定指标。具体的是将从癌患者分离的癌细胞内的RFP表达量作为指标，预测癌患者的预后。更具体的是实施检测从癌患者分离的癌细胞内的RFP表达量的步骤(检测步骤)以及基于检测结果预测预后的步骤(预后推定步骤)。在此的检测步骤以与上述第2方面的检测步骤同样地实施即可。其中，癌患者的例是患有大肠癌或子宫体癌的患者。

预后推定步骤中，将癌细胞内的RFP表达量作为指标推定预后。基本上采用RFP表达量多则预后不良这样的判断基准。以下，表示根据RFP表达量的评价的具体例。

预先设定使RFP表达量和预后相关联的多个评价区。然后基于检测步骤中得到的RFP表达量，确定被检测癌细胞所属的评价区。作为有关评价区的设定的具体例，下面表示了着眼于有无RFP的表达的例子(例1)和着眼于RFP的表达量的程度的例子(例2)。其中，以区名：与该区相关联的RFP表达量：与该区相关连的评价结果的顺序进行记载。

<例1>

区1：RFP阳性：预后差

区2：RFP阴性：预后良好

<例2>

区1：未确认到RFP的表达：预后良好

区2：确认到弱RFP的表达：预后比较良好

区3：确认到中度的RFP的表达：预后比较差

区4：确认到强RFP的表达：预后差

本发明进一步还提供癌患者的预后推定用试剂以及癌患者的预后推定用试剂盒。本发明的试剂含有抗RFP抗体。关于抗RFP抗体的种类、来源将援用第2方面中所对应的说明。作为抗RFP抗体使用标记化抗体，则将标记量作为指标能够直接检测结合抗体量。因此，能够构建更为简便的检测法。反之还具有需要准备结合了标记物质的抗RFP抗体且检测敏感度通常变低这样的问题。因此，优选使用利用结合了标记物质的二次抗体的方法、利用结合了二次抗体与标记物质的聚合物的方法等的间接检测的方法。在此的二次抗体是对抗RFP抗体具有特异结合性的抗体，例如将抗RFP抗体作为兔抗体调制时可使用抗兔IgG抗体。市场上销售有作为可对兔、山羊、小鼠等各种的抗体使用的标记二次抗体(例如Funakoshi公司、COSMO BIO公司等)，可根据本发明的试剂适宜选择适当的抗体。

标记物质的例有过氧化物酶、微过氧化物酶、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶以及葡萄醣6-磷酸脱氢酶等的酶，异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基若丹明异硫氰酸酯(TRITC)以及铕等的荧光物质、鲁米诺(luminol)、异鲁米诺(isoluminol)以及吖啶脂(Acridinium)衍生物等的化学发光物质，NAD等的辅酶，生物素、¹³¹I以及¹²⁵I等的放射性物质。

一个方式中，本发明的试剂与其他的用途结合被固相化。固相化所用的不溶性支撑体没有特别限定。例如可以使用聚苯乙烯树脂、聚碳酸酯树脂、硅树脂、尼龙树脂等的树脂，由玻璃等的对水不溶性物质形成的不溶性支撑体。抗体向不溶性支撑体的搭载可通过物理吸附或化学吸附而进行。

本发明的试剂盒作为主要构成要素含有本发明的试剂。可以在试剂盒中包含实施检测法时所使用的其他的试剂(缓冲液、阻断用试剂、酶的底物、显色试剂等)和/或装置乃至器具(容器、反应装置、荧光仪等)。另外，优选作为标准样品在试剂盒中含有RFP。并且，本发明的试剂盒中通常还附加有操作说明书。

实施例

在HDACi通过控制细胞内的抗氧化机理而使癌细胞变成抗癌剂敏感性这一设想下，实施了以下的实验。

1.材料以及方法

(1)质粒

pcDNA3-HDAC1-Flag是由川口博士(爱知县身心障碍者克隆)提供的。将全长NF-YA、NF-YB、NF-YC、HDAC1、HDAC1缺失片段以及TBP-2cDNA向pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体进行了克隆。按照操作说明书进行了操作。将从pcDNA3.1/V5-His-HDAC1切取的HDAC1cDNA插入于pcDNA3.1/myc-His载体。pFlag-RFP构建物如下所述(参考文献20)。将RFP cDNA插入pEGFP-C1载体。

(2)RNAi

HDAC1 siRNA是从Dhamacon公司，siRFP、siTBP-2、siNF-YC是从QIAGEN公司购得的。siRNA是用Lipofectamine 2000(Invitrogen)导入于细胞内的。合成了编码为进行利用shRNA的敲除而以RFP作为靶的shRNA的单链寡核苷酸及其互补序列(下面表示正义链)。

shRFP：5’-GATCGAGTTACTCGGGAGGGAAATTCAAGAGATTTCCCTCCCGAGTAACTCTTTTTTGGAAA-3’(序列号10)

将该互补的寡核苷酸对插入于pSilencer3.1-H1 neo vector(Ambion)，作为shRNA表达载体使用。

(3)shRNA稳定表达株的制作

将上述的shRNA表达载体使用Lipofectamine 2000向HeLa细胞导入，以新霉素进行了2周的选择。

(4)细胞生存率的计测

将8×10³的细胞播于96孔板，24小时后用H₂O₂(10小时)或顺铂(24小时)以所述浓度进行了处理。生存率的计测是通过使用WST-1法(Roche)进行的。座标图是以未处理的细胞的值作为1而显示相对值。

(5)RT-PCR

使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司)，从用siRNA转染的HeLa细胞调制了全RNA。使用Superscript II(Invitrogen公司)调制了cDNA转录物。RT-PCR中使用了HDAC1特异性引物(正义：5’-CTCCTGTTTTTTTCAGGCTCC-3’(序列号11)、反义：5’-AGGAGAAGACAGACAGAGGGC-3’(序列号12))、RFP特异性引物(正义：5’-TGCTCGACTGCGGCCATAAC-3’(序列号13)、反义：5’-TCGGTGCGCAGCTGCTTTAC-3’(序列号14))、TBP-2特异性引物(正义：5’-TGAGATGGTGATCATGAGACC-3’(序列号15)、反义：5’-GTATTGACATCCACCAGATCC-3’(序列号16))GAPDH特异性引物(正义：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3’(序列号17)、反义：5’-GAGATGATGACCCTTTTGGCTC-3’(序列号18))。

(6)免疫沉淀以及免疫蛋白印迹

将细胞用冰冷的PBS清洗2次之后，用含蛋白酶抑制剂的溶解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4，120mM NaCl，5mM MgCl₂，0.8％Nonidet P-40，10％甘油，1mM DTT和1mM PMSF)溶解。将溶解产物超声波处理后，用各抗体进行了免疫沉淀。将提纯的正常兔抗体或抗HA标签抗体作为对照使用。利用电泳的分离以及免疫蛋白印迹是按照所述的方法(参考文献20)进行的。在使用兔多克隆抗体的免疫蛋白印迹中使用了Relia Blot(Bethyl Laboratories)。

(7)染色质免疫沉淀(ChIp)试验

按照所述的方法进行了染色质免疫沉淀试验(参考文献28)。若简单说明则将以甲醛进行了交联的染色质进行超声波处理，将所得的染色质片段用抗HDAC1抗体、抗乙酰化H3抗体、抗乙酰化H4抗体、抗RFP抗体或抗NFYB抗体进行了免疫沉淀。将提纯的正常兔或小鼠IgG作为对照使用。将5M NaCl以最终浓度成为0.2M的方式添加后，在65℃下8小时培养进行了脱交联。将提纯DNA以及全细胞DNA用PCR(32～37循环)进行了扩增。

(8)活体内的抗癌剂治疗的模型

将对照或RFP的shRNA的稳定表达株移植到7周龄的雌裸鼠的背部。在肿瘤的体积到达50mm³的时间点上将小鼠随机分为顺铂治疗组和未治疗组。将用量1mg/kg的顺铂或溶剂(生理食盐水：对照)每4天对小鼠的腹腔内给药。肿瘤的体积是使用游标尺测定肿瘤直径，通过下式进行了计算。

体积＝(长径×短径×短径)/2

(9)免疫组织化学测定

本次实验中使用了以福尔马林进行固定并石蜡包埋的大肠癌的组织切片。将标本在二甲苯中进行脱石蜡处理，通过在阶梯性稀释的乙醇中依次浸泡而亲水化。使用Protein Blocking Agent(UltraTech HRPStreptavidin-Biotin Detection System，Beckman Coulter)进行非特异性信号的抑制处理。进而，以3％过氧化氢水进行了内源性过氧化物酶的非活化处理。在含0.5％NP-40的柠檬酸缓冲液(pH7.0)中浸泡，进行121℃、10分钟的高压釜处理进行了抗原的活化。将样品与抗RFP兔多克隆抗体进行反应后，与生物素化的山羊的二次抗体进行了反应。进而，使附加了过氧化物酶的链霉亲和素反应，使用3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)显色。在10％以上的细胞中确认到茶色的染色的标本判定为RFP阳性。

使用统计解析软件Stat View，通过Kaplan-Meier法研究了RFP的表达与大肠癌患者的预后之间的关联性。

(10)免疫荧光染色

将上述的大肠癌组织标本在二甲苯中进行脱石蜡处理，通过在阶梯性稀释的乙醇中依次浸泡而亲水化。柠檬酸缓冲液(pH6.0)中进行10分钟的微波处理使抗原活化。通过将样品以1％BSA处理而抑制了非特异性信号的检出。将样品与抗RFP兔多克隆抗体和抗TBP-2小鼠单克隆抗体反应后，使附加了Alexa Fluor 594的抗兔IgG抗体以及附加了Alexa Fluor 488的抗小鼠IgG抗体反应。将细胞核用DAPI进行了染色。在玻片上放上封片剂作为标本，使用聚焦显微镜进行了观察和撮影。

(11)子宫体癌的患者

将从1992～2007年间在名古屋大学医院接受治疗的子宫体癌患者中采取的样品(119试样)，在知情同意下用于实验。患者的年龄为28～86岁(平均年龄57岁)。不包括接受了新辅助化疗的患者。所有患者经历过全子宫切除术、广泛式子宫切除术和双侧输卵管卵巢切除术中的任一个。另外，72名的患者进行过淋巴结廓清。按照1998年的FigO(International Federation of Gynecology and Obstetrics)分期标准，确定了各患者的分期。分期I为72名，分期II为16名，分期III为24名，分期IV为7名。组织学的分级是按照世界保健机构的基准进行的。G1为50名、G2为51名、G3为18名。

2.结果·考察

首先研究了HDACi是否影响HeLa细胞对氧化应激的敏感性。在经属于代表性的HDACi的Trichostatin A(TSA)的处理的HeLa细胞中，发现对作为氧化应激的诱导剂的H₂O₂的敏感性得到增进(图1a)。为了探明有关该HDACi导致的敏感性的增进的分子机理，着眼于HDAC1进行了研究。将HDAC1用siRNA敲除，则H₂O₂和顺铂的细胞毒性作用显著增进(图1b～d)。由此可知，HDACi可能是介由抑制HDAC1的作用而增进氧化应激敏感性。关于由HDAC1导致的应激敏感性的控制的分子机理，推测为是介由与p53之间的相互作用而导致的(参考文献16～19)，而在这次使用的HeLa细胞中由于乳头瘤病毒的E6蛋白而抑制p53的表达，因此介由其他的机理被控制的可能性高。

以前本发明人的研究组已发现在肿瘤细胞株中呈高表达的RFP与HDAC1相互作用，在细胞内显示共定位(参考文献20)。由此，考虑RFP是否与由HDAC1导致的氧化应激敏感性的控制相关联。最初研究RFP与HDAC1的相互作用结构域的结果，发现HDAC1的N末端侧，与RFP的Coild-coil(coiled-coil)结构域和Rfp结构域结合(图2)。进而，发现RFP的敲除也如同HDAC1，提高了HeLa细胞对H₂O₂和顺铂的敏感性(图1b～g)。由此可知，RFP和HDAC1物理且功能性地相互作用。

根据HDAC1和RFP均具有转录抑制活性的报道(参考文献1、20、21)，假设为两者可能是协同抑制与应激敏感性相关的共通靶基因的表达。为了鉴定这种靶基因，制作了恒定表达对照和RFP的short hairpinRNA(shRNA：质粒载体为基础在细胞内生产目的siRNA)的HeLa细胞株，将该两者的基因表达谱用DNA微阵列进行了比较。并注意到了与表达对照shRNA的细胞相比在敲除RFP的细胞中表达得到了提高的基因中的TBP-2。TBP-2是HDACi的一种，已报道用SAHA处理细胞而能提高表达(参考文献15)。另外，TBP-2通过与具有除去ROS的作用的硫氧还蛋白结合而抑制其作用(参考文献22、23)，并且通过过度表达而提高对氧化应激、顺铂的敏感性(参考文献4、24)。从RT-PCR、免疫蛋白印迹的结果确认到了TBP-2的表达由于HDAC1和RFP而在转录水平上受到控制(图3a，b)。在此，研究了TBP-2的表达在实际中是否在HeLa细胞中对H₂O₂和顺铂的敏感性有影响。在HeLa细胞中过度表达TBP-2的结果，出现了显著的敏感性的提高(图3d，e)。由此可知，由于HDAC1、RFP的敲除而引起的敏感性的增进有可能与TBP-2的表达的提高相关。进而，研究了由siHDAC1或siRFP诱导的TBP-2的表达是否与敏感性的增进相关。对敲除了HDAC1或RFP的细胞，进一步敲除TBP-2时，增进的敏感性发生了显著的下降(图3f～h)。从该结果可知，由HDAC1、RFP的敲除引起的敏感性的增进的一部分是由于TBP-2的表达的提高而导致的。

进而，还确认了在使用大肠癌和乳癌的细胞株时也能观察到同样的结果(图4)。

利用染色质免疫沉淀法研究了HDAC1和RFP是否直接控制TBP-2的表达。其结果，发现HDAC1和RFP被配置于TBP-2启动子的基因附近结构域。另外，荧光素酶报告基因检测中发现HDAC1和RFP协同抑制TBP-2启动子的活性，并且由于RFP导致的转录抑制被HDACi阻止(结果未图示)。从因RFP的敲除而TBP-2的表达提高可认为TBP-2启动子结构域的组蛋白的乙酰化在增进。使用RFP敲除细胞进行染色质免疫沉淀的结果，确认到了TBP-2启动子结构域的组蛋白H3和H4的乙酰化的增进(图5b)。另外，从HDAC1向TBP-2启动子结构域的配置由于RFP的表达抑制而减弱，可认为因RFP敲除而导致的组蛋白的乙酰化是因HDAC1未被配置所导致的。这些结果强烈表示了RFP将HDAC1配置于TBP-2启动子上，介由其去乙酰基化酶活性抑制TBP-2的表达。

到目前为止没有有关HDAC1和RFP直接与DNA结合的报道，所以推测HDAC1和RFP是介由与转录因子等的DNA结合蛋白的相互作用而被配置于TBP-2启动子。还报道有TBP-2启动子在其序列中包含作为转录因子的NF-Y(Nuclear Factor Y)的结合序列，因HDACi诱导TBP-2的表达时需要NF-Y(参考文献15)。由此推测为当HDAC1和RFP被配置于TBP-2启动子时，可能也需要NF-Y。已知NF-Y是由NF-YA、NF-YB、NF-YC这三个蛋白构成的三聚体转录因子。本次实验中，表明RFP与NF-YC特异性结合(图5c、d)。其表明HDAC1、RFP，NF-Y有可能形成了蛋白复合体。为了研究有关该蛋白复合体的形成，将附加了V5标签的NF-YC、附加了Flag标签的HDAC1以及RFP，一同向HEK293细胞转染，用对V5标签的抗体进行了免疫沉淀。结果HDAC1和RFP两者与NF-YC发生了共沉淀(图5e)。

染色质免疫沉淀法中确认了NF-Y实际上与HDAC1、RFP同样地与TBP-2启动子结合(图5f)。进而，在使用敲除了NF-YC的细胞的染色质免疫沉淀中确认HDAC1和RFP未被配置在TBP-2启动子上(图5g～h)。该结果表明HDAC1、RFP、NF-Y在TBP-2启动子上形成了蛋白复合体。进而，从凝胶过滤色谱法的结果确认到HDAC1、RFP、NF-YC被包含在相同部分(400kDa前后)中。其支持了这些蛋白形成为复合体这一观点。

从图5所示的结果认为RFP有可能通过借助HDAC1-NF-YC间的相互作用而形成复合体。图6b、c中得到了在外源表达RFP的细胞中HDAC1-NF-YC间的相互作用增强，反之在敲除了RFP的细胞中减弱这样的与上述的认识一致的结果。进而，对该复合体内的RFP的状态进行了研究。已报道有RFP进行多聚体化(参考文献25、26)，从这次的实验结果可知，该多聚化需要Ring-B-box结构域(RB)和Coild-coil结构域(CC)(图7b)。到此为止的实验中已知RFP为了与HDAC1和NF-YC结合而需要Rfp结构域，所以认为RFP在N末端侧的RB和CC上多聚体化，C末端侧的Rfp结构域上分别与HDAC1和NF-YC结合，从而形成HDAC1-RFP-NF-Y蛋白复合体(图5i)。

进而，对活体内的抗癌剂治疗模型中的RFP的表达的影响进行了研究。向裸鼠的皮下移植表达了对照(shNC1)和RFP(shRFP23、shRFP26)的shRNA的细胞株，对体积成为50mm³以上的模型，每4天给药顺铂观察了经过。利用顺铂的治疗，与对照组相比在RFP敲除组中发挥了强抗肿瘤效果(图8a～c)。

最后对癌患者试样中的RFP的表达与预后之间的关系进行了研究。使用115例的大肠癌试样，以RFP的抗体进行免疫染色，检查了RFP的阳性试样的比例(10％以上的细胞被染色时作为RFP阳性)。其结果，115例中68例(59％)观察到了RFP阳性像(图8d)。进一步将RFP和TBP-2的表达用免疫荧光染色进行确认的结果，相互排他性地进行表达，在大肠癌的试样的表达RFP的细胞中TBP-2的表达明显减少(图8e)。将大肠癌症例分为RFP阳性组和阴性组，以Kaplan-Meier法对各组的预后进行研究的结果，在RFP的表达和低生存率之间确认到了显著的关联(图8f)。从该结果，认为大肠癌的RFP的表达水平对抗癌剂的效果有影响，进一步对预后也有影响。

通过并用HDACi和抗癌剂而得到的协同抗肿瘤效果，虽然在癌治疗研究领域中备受瞩目，但其分子机理仍未完全被了解。在多个研究中表明了HDAC1介由与p53的相互作用而控制因各种应激而诱导的细胞凋亡的可能性(参考文献16～19)。这次直接表明了HDAC1与RFP和NF-Y形成蛋白复合体，抑制TBP-2的表达，从而控制癌细胞的氧化应激敏感性。考虑以前的报道可推测为TBP-2的表达的提高减弱了硫氧还蛋白的ROS除去作用，能使癌细胞对因抗癌剂而诱导的氧化应激变得敏感。从该结果可认为HDAC1通过控制抗氧化机理而对癌细胞赋予抗癌剂耐性。

进而，明确了RFP的敲除在活体外以及活体内使癌细胞对抗癌剂变得敏感。这表明RFP在与其他抗癌剂的并用治疗中将成为新的治疗靶。已知HDACi以毒性低的用量发挥抗肿瘤效果，但还报道有其呈剂量限制性毒性(参考文献28)。从RFP表达于局限的组织(参考文献29)，以及RFP敲除鼠不表现明显的损伤的点出发，可以说以RFP作为靶的治疗策略在副作用方面也优异。

这次的发现将对HDACi与抗癌剂的协同效果的分子机理赋予新的认识。

作为进一步研究，调查了子宫体癌的RFP的表达与预后之间的关系。其结果，在对所有患者组的调查中(图9(a))，确认到RFP的表达的患者组的预后明显差。另外，将患者组分为分期I和分期II～IV进行同样的调查的结果发现RFP的表达与分期无关地与预后不良相关联(图9(b)(c))。接着，将RFP的表达与预后之间的关系，在采用不同手术方式的患者组间进行了比较。在此调查了因广泛式子宫切除术(Radicalhysterectomy)和全子宫切除术(Total hysterectomy)而导致的不同。其结果，RFP阴性组中未确认到因手术方式的不同而导致的显著的预后差别(图10(b))，而在RFP阳性组中发现广泛式子宫切除术的组，与全子宫切除术的组相比预后得到了显著的改善(图10(c))。另一方面，进行了有无淋巴结廓清(Lymphadenectomy)而导致的不同。在RFP阴性组中两组(接受淋巴结廓清的患者组(+)和未接受的患者组(-))之间未发现显著的预后差别(图11(b))，而在RFP阳性组中发现接受淋巴结廓清的组，与未接受廓清的组相比，预后得到了显著的改善(图11(c))。综合考虑图10和11的结果，可认为对于表达了RFP的患者采用更积极的手术方式可改善预后。因此可以说为了诊断子宫体癌进行活检时通过确认RFP的表达状态(例如进行免疫染色)而能得到对手术方式的选择有用的信息。

产业上的利用可能性

本发明的作用增强剂将实现副作用少的癌治疗法。本发明的作用增强剂在利用具有氧化应激诱导效力的抗癌剂进行治疗时并用。在并用2种以上的抗癌剂时也能应用本发明的作用增强剂。

本发明并不受到上述发明的实施方式以及实施例的说明的任何限定。在不脱离权利要求书所记载的内容的情况下进行的本领域技术人员能够容易地想到的范围内的各种改变形态也属于本发明。

本说明书中指出的论文，专利公开文本以及专利公报等的内容通过援用其所有的内容而引用。

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