JPWO2010023917A1 - 抗がん剤の作用増強剤及びその利用、並びにがん患者の予後推定用バイオマーカー及びその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]酸化ストレス誘導能を有する抗がん剤の作用増強剤であって、RFP(RET finger protein)遺伝子の発現又はRFPの作用を抑制する化合物を有効成分とする作用増強剤。
[2]前記化合物が以下の(a)〜(d)からなる群より選択される化合物である、[1]に記載の作用増強剤:
(a)RFP遺伝子を標的とするsiRNA;
(b)RFP遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する核酸コンストラクト;
(c)RFP遺伝子の転写産物を標的とするアンチセンス核酸;
(d)RFP遺伝子の転写産物を標的とするリボザイム。
[3]酸化ストレス誘導能を有する抗がん剤と併用される、[1]又は[2]に記載の作用増強剤。
[4]酸化ストレス誘導能を有する抗がん剤の作用を増強する方法であって、標的がん細胞内において、RFP遺伝子の発現又はRFPの作用を抑制するステップを含む方法。
[5][1]又は[2]に記載の作用増強剤を投与するステップと、酸化ストレス誘導能を有する抗がん剤を投与するステップと、を含むがん治療法。
[6]生体から分離されたがん細胞内のRFP発現量を調べるステップと、
前記ステップの結果に基づき、酸化ストレス誘導能を有する抗癌剤に対する前記がん細胞の耐性を判定するステップと、を含む抗がん剤耐性検査法。
[7]RFPからなる、がん患者の予後推定用バイオマーカー。
[8]がんが大腸癌又は子宮体がんである、[7]に記載の予後推定用バイオマーカー。
[9]がん患者から分離されたがん細胞内のRFP発現量を指標とした、がん患者の予後推定法。
[10]がん細胞内のRFP発現量が多いことが、予後が不良であることを示す、[9]に記載の予後推定法。
[11]がんが大腸癌又は子宮体がんである、[9]又は[10]に記載の予後推定法。
[12]抗RFP抗体からなる、がん患者の予後推定用試薬。
[13]がんが大腸癌又は子宮体がんである、[12]に記載の予後推定用試薬。
[14][12]又[13]に記載の試薬を含む、がん患者の予後推定用キット。
[15]がんが大腸癌又は子宮体がんである、[14]に記載の予後推定用キット。
本発明の第1の局面は抗がん剤の作用増強剤(以下、「本発明の薬剤」と称する)に関する。本発明の薬剤は、酸化ストレス誘導能を有する抗がん剤の作用を増強する。別の言い方をすれば、本発明の薬剤は、標的のがん細胞において酸化ストレス抵抗性が亢進すると効き目が弱くなる又は効かなくなる抗がん剤の作用を増強する。本発明において「抗がん剤の作用を増強する」又は「抗がん剤の作用増強」とは、抗がん剤の抗がん作用を高めることをいう。本発明の薬剤を抗がん剤と併用することによって、がんの治療成績が向上する。ここでの「治療成績の向上」には、(1)治療効果の増大、(2)奏功率ないし有効率の向上、(3)副作用の低減ないし回避が含まれる(本発明によれば、この中の少なくとも一つが達成される)。抗がん剤の例は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン等のプラチナ製剤、サイクロフォスファミド、フルオロウラシル(5-FU)、エトポシド、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンである。
(a)RFP遺伝子を標的とするsiRNA
(b)RFP遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する核酸コンストラクト
(c)RFP遺伝子の転写産物を標的とするアンチセンス核酸
(d)RFP遺伝子の転写産物を標的とするリボザイム
5'-GAGTTACTCGGGAGGGAAA-3'(配列番号4。後述の実施例で使用した配列)
5'-AACTCTTAGGCCTAACCCAGA-3'(配列番号5。Krutzfeldt M, Ellis M, Weekes DB, Bull JJ, Eilers M, Vivanco MD, Sellers WR, Mittnacht S. (2005). Selective ablation of retinoblastoma protein function by the RET finger protein. Mol Cell. 18(2):213-24.を参照)
5'-AAGAGAGGCUCAGUUAUACUC-3'(配列番号6。Krutzfeldt M, Ellis M, Weekes DB, Bull JJ, Eilers M, Vivanco MD, Sellers WR, Mittnacht S. (2005). Selective ablation of retinoblastoma protein function by the RET finger protein. Mol Cell. 18(2):213-24.を参照)
5'-CCCUAUGAGUGGGAUUGAU-3'(配列番号7。Fukushige S, Kondo E, Gu Z, Suzuki H, Horii A.(2006).RET finger protein enhances MBD2- and MBD4-dependent transcriptional repression. Biochem Biophys Res Commun. 351(1):85-92. Epub 2006 Oct 10.を参照)
5'-GACTCAGTGTGCAGAAAAG-3'(配列番号8。Zha J, Han KJ, Xu LG, He W, Zhou Q, Chen D, Zhai Z, Shu HB.(2006). The Ret finger protein inhibits signaling mediated by the noncanonical and canonical IkappaB kinase family members. J Immunol. Jan 15;176(2):1072-80.を参照)
5'-AGAACCAGCTCGACCATT-3'(配列番号9。Townson SM, Kang K, Lee AV, Oesterreich S.(2006). Novel role of the RET finger protein in estrogen receptor-mediated transcription in MCF-7 cells. Biochem Biophys Res Commun. Oct 20;349(2):540-8. Epub 2006 Aug 22.を参照)
アンチセンス核酸は例えば市販の自動DNA合成装置(例えばアプライド・バイオシステムズ社等)を使用するなど、常法で合成することができる。核酸修飾体や誘導体の作製には例えば、Stein et al.(1988), Nucl. Acids Res. 16:3209やSarin et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451等を参照することができる。
アンチセンス核酸の発現は、哺乳動物細胞(好ましくはヒト細胞)で機能することが知られている任意のプロモーター(誘導性プロモーター又は構成的プロモーター)によって行うことができる。例えば、SV40初期プロモーター領域 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウィルスの3'末端領域由来のプロモーター(Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797)、疱疹チミジン・キナーゼ・プロモーター(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)等のプロモーターを使用することができる。
アンチセンス法を利用する場合と同様に、例えば安定性やターゲット能を向上させることを目的として、修飾されたオリゴヌクレオチドを用いてリボザイムを構築してもよい。効果的な量のリボザイムを標的細胞内で生成させるために、例えば、強力なプロモーター(例えばpol IIやpol III)の制御下に、当該リボザイムをコードするDNAを配置した核酸コンストラクトを使用することが好ましい。
有効成分としての抗体は、HDAC1若しくはRFP又はこれらの一部(好ましくは相互作用に関与する部位)を抗原として利用した免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などによって調製することができる。
尚、抗体自体を有効成分とするのではなく、細胞内で所望の抗体を発現可能なベクターを有効成分としてもよい。抗体以外の化合物についても同様である。
本発明の薬剤には、期待される治療効果(又は予防効果)を得るために必要な量(即ち治療上有効量)の有効成分が含有される。本発明の薬剤中の有効成分量は一般に剤型によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約0.1重量%〜約95重量%の範囲内で設定する。
本発明の薬剤はその剤型に応じて経口投与又は非経口投与(静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内、又は腹腔内注射、経皮、経鼻、経粘膜など)によって対象に適用される。これらの投与経路は互いに排他的なものではなく、任意に選択される二つ以上を併用することもできる(例えば、経口投与と同時に又は所定時間経過後に静脈注射等を行う等)。
核酸コンストラクトを有効成分とした場合(例えばRNAiを利用する態様)、in vivo投与に限らず、ex vivo投与を採用することもできる。
投与量は患者の症状、年齢、性別、及び体重などによって異なるが、当業者であれば適宜適当な投与量を設定することが可能である。投与スケジュールの設定においては、患者の症状や薬剤の効果持続時間などを考慮することができる。
尚、本発明の薬剤と抗がん剤を混合した配合剤を用意し、これを対象に投与することにしてもよい。
本発明者らの検討の結果、RFPの高発現が、ヒトの大腸癌におけるTBP-2の発現低下や、大腸癌患者の予後不良と相関することが判明した(後述の実施例を参照)。この知見に基づき本発明の第2の局面は、RFP遺伝子の発現量を利用した抗がん剤耐性検査法(以下、「本発明の検査法」と称する)を提供する。本発明の検査法を行うと、がん細胞の抗がん剤耐性を判定することができる。判定結果は例えば治療方針の決定(効果的な治療法の選択など)に利用される。判定結果を利用することによって治療成績の向上、予後改善、患者の生活の質(QOL)の向上などがもたらされる。このように本発明の検査法は、がん治療に極めて有用な情報を提供する。
免疫組織化学ではRFPを特異的に認識する抗体(抗RFP抗体)を使用し、当該抗体の結合性(結合量)を指標としてRFPタンパク質量を調べる。抗RFP抗体を使用した免疫組織化学は例えばABC(Avidin-Biotin Complex)法、PAP(Peroxydase-anti-Peroxydase Complex)法、LAB(Linked Avidin-Biotin)法、LSAB(Linked Streptavidin-Biotin)法等で行うことができる。これらの各方法についての標準的なプロコールは周知である(例えば、「酵素抗体法、改訂第3版」、渡辺慶一、中根一穂編集、学際企画を参照)。
(1)固定・パラフィン包埋
生体(剖検症例の場合は死体)より採取した組織をホルマリンやパラフォルムアルデヒド等によって固定する。その後パラフィン包埋する。一般にアルコールで脱水した後キシレンで処理し、最後にパラフィンで包埋する。パラフィンで包埋された標本を所望の厚さ(例えば3〜5μm)に薄切し、スライドガラス上に伸展させる。尚、パラフィン包埋標本に代えて凍結標本を用いる場合もある。
(2)脱パラフィン
一般にキシレン、アルコール、及び精製水で順に処理する。
(3)前処理(抗原賦活)
必要に応じて抗原賦活のために酵素処理、加熱処理及び/又は加圧処理等を行う。
(4)内因性ペルオキシダーゼ除去
染色の際の標識物質としてペルオキシダーゼを使用する場合、過酸化水素水で処理して内因性ペルオキシダーゼ活性を除去しておく。
(5)非特異的反応阻害
切片をウシ血清アルブミン溶液(例えば1%溶液)で数分から数十分程度処理して非特異的反応を阻害する。尚、ウシ血清アルブミンを含有させた抗体溶液を使用して次の一次抗体反応を行うこととし、この工程を省略してもよい。
(6)一次抗体反応
適当な濃度に希釈した抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
(7)標識試薬の添加
標識物質としてペルオキシダーゼが頻用される。ペルオキシダーゼを結合させた2次抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
(8)発色反応
トリス緩衝液にDAB(3,3'-diaminobenzidine)を溶解する。続いて過酸化水素水を添加する。このようにして調製した発色用溶液を数分間(例えば5分間)切片に浸透させ、発色させる。発色後、切片を水道水で十分に洗浄し、DABを除去する。
(9)核染色
マイヤーのヘマトキシリンを数秒〜数十秒反応させて核染色を行う。流水で洗浄し色出しする(通常、数分間)。
(10)脱水、透徹、封入
アルコールで脱水した後、キシレンで透徹処理し、最後に合成樹脂やグリセリン、ゴムシロップなどで封入する。
当業者であればRFPの配列(NCBIのデータベース、Accession: RFPNM_006510、DEFINITION: Homo sapiens tripartite motif-containing 27 (TRIM27), mRNA.(配列番号2))を基に各方法に適した核酸プライマー又は核酸プローブを常法で設計することができる。
<例1>
区分1:RFP陽性である:抗がん剤耐性である
区分2:RFP陰性である:抗がん剤感受性である
<例2>
区分1:RFPの発現を認めず:抗がん剤感受性である
区分2:RFPの弱い発現を認める:抗がん剤に対する耐性は低い
区分3:RFPの中程度の発現を認める:抗がん剤に対する耐性は中程度である
区分4:RFPの強い発現を認める:抗がん剤に対する耐性は高い
本発明者らの検討の結果、RFPの高発現が大腸癌患者や子宮体がん患者の予後不良と相関することが判明した(後述の実施例を参照)。この知見に基づき本発明の第3の局面は、RFPからなる、がん患者の予後推定用マーカーを提供する。当該バイオマーカーはがん患者の予後を把握する上で有用である。また、術式を決定する際の指針にもなる。例えば、子宮体がんの患者から採取した検体(がん細胞)においてRFPの発現を認めた場合(例えば免疫染色で陽性と判断した場合)、より積極的な術式を採用することが好ましいと判定することが可能である。より積極的な術式としては広範子宮全摘術、リンパ説郭清を挙げることができる。
<例1>
区分1:RFP陽性である:予後が悪い
区分2:RFP陰性である:予後が良い
<例2>
区分1:RFPの発現を認めず:予後が良い
区分2:RFPの弱い発現を認める:予後が比較的良い
区分3:RFPの中程度の発現を認める:予後が比較的悪い
区分4:RFPの強い発現を認める:予後が悪い
1.材料及び方法
(1)プラスミド
pcDNA3-HDAC1-Flagは川口博士(愛知県心身障害者コロニー)より供与された。全長NF-YA、NF-YB、NF-YC、HDAC1、HDAC1欠失断片、及びTBP-2 cDNAをpcDNA3.1/V5-His-TOPOベクターにクローニングした。操作は取り扱い説明書に従った。pcDNA3.1/V5-His-HDAC1から切り出したHDAC1 cDNAをpcDNA3.1/myc-Hisベクターに挿入した。pFlag-RFPコンストラクトについては記述の通りである(参考文献20)。RFP cDNAをpEGFP-C1ベクターに挿入した。
HDAC1 siRNAはDhamacon社から、siRFP, siTBP-2, siNF-YCはQIAGEN社から購入した。siRNAはLipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いて細胞内に導入した。shRNAを利用したノックダウンのためにRFPを標的とするshRNAをコードする一本鎖オリゴヌクレオチドおよびその相補配列を合成した(以下にセンス鎖を示す)。
shRFP: 5’- GATCGAGTTACTCGGGAGGGAAATTCAAGAGATTTCCCTCCCGAGTAACTCTTTTTTGGAAA -3’(配列番号10)
この相補的なオリゴヌクレオチド対をpSilencer3.1-H1 neo vector (Ambion)に挿入し、shRNA発現ベクターとして用いた。
HeLa細胞に上記のshRNA発現ベクターをLipofectamine 2000を用いて導入し、ネオマイシンで2週間選択を行った。
8 x 103の細胞を96穴プレートにまき、24時間後にH2O2(10時間)またはシスプラチン(24時間)を記述した濃度で処理を行った。生存率の計測はWST-1法(Roche)を用いて行った。グラフは未処理の細胞の値を1とした相対値で示している。
siRNAでトランスフェクトしたHeLa細胞からRNeasy Mini Kit (キアゲン)を用いて全RNAを調製した。Superscript II (インビトロジェン)を用いてcDNA転写物を調製した。RT-PCRにはHDAC1特異的プライマー(センス:5’- CTCCTGTTTTTTTCAGGCTCC-3’(配列番号11)、アンチセンス:5’- AGGAGAAGACAGACAGAGGGC-3’(配列番号12))、RFP特異的プライマー(センス:5’-TGCTCGACTGCGGCCATAAC-3’(配列番号13)、アンチセンス:5’-TCGGTGCGCAGCTGCTTTAC-3’(配列番号14))、TBP-2特異的プライマー(センス:5’- TGAGATGGTGATCATGAGACC -3’(配列番号15)、アンチセンス:5’- GTATTGACATCCACCAGATCC -3’(配列番号16))GAPDH特異的プライマー(センス:5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3’(配列番号17)、アンチセンス:5’-GAGATGATGACCCTTTTGGCTC-3’(配列番号18))を用いた。
細胞を氷冷PBSで2回洗浄した後、プロテアーゼインヒビターを含有する溶解バッファー(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 120 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.8% Nonidet P-40, 10% glycerol, 1mM DTT and 1 mM PMSF)で溶解した。ライセートを超音波処理した後、各抗体で免疫沈降した。精製した正常ウサギ抗体又は抗HAタグ抗体をコントロールに用いた。電気泳動による分離及びウエスタンブロットは既述の方法(参考文献20)に従った。ウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットにはRelia Blot(Bethyl Laboratories)を使用した。
(7)クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイ
既述の方法に従ってクロマチン免疫沈降アッセイを行った(参考文献28)。簡単に説明すると、ホルムアルデヒドで架橋したクロマチンを超音波処理し、得られたクロマチン断片を抗HDAC1抗体、抗アセチル化H3抗体、抗アセチル化H4抗体、抗RFP抗体又は抗NFYB抗体で免疫沈降した。精製した正常ウサギ又はマウスIgGをコントロールに用いた。5M NaClを終濃度で0.2Mとなるように添加した後、65℃で8時間インキュベートして脱架橋した。精製DNA及び全細胞DNAをPCR(32〜37サイクル)で増幅した。
コントロールもしくはRFPのshRNAの安定発現株を、7週齢のメスのヌードマウスの背部に移植した。腫瘍の体積が50mm3に達した時点でマウスをシスプラチン治療群と無治療群に無作為に分けた。用量1mg/kgのシスプラチンもしくは溶媒(生理食塩水:コントロール)を4日毎にマウスの腹腔内に投与した。腫瘍の体積は、ノギスを用いて腫瘍径を測定し、以下の式で計算した。
体積=(長径 x 短径 x 短径)/2
今回の実験では、ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した大腸癌の組織切片を用いた。標本をキシレン中で脱パラフィン処理し、段階的に希釈したエタノールに順次浸けることで親水化させた。Protein Blocking Agent(UltraTech HRP Streptavidin-Biotin Detection System, Beckman Coulter)を用いて非特異的なシグナルの抑制処理を行った。さらに、3%過酸化水素水で内因性ペルオキシダーゼの不活性化処理を行った。0.5%NP-40を含むクエン酸緩衝液(pH7.0)中に浸け、121℃、10分間オートクレーブをかけて抗原の賦活化を行った。サンプルを抗RFPウサギポリクローナル抗体と反応させた後に、ビオチン化したヤギの二次抗体を反応させた。さらに、ペルオキシダーゼを付加したストレプトアビジンを反応させ、3, 3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB)を用いて発色させた。茶色の染色が10%以上の細胞で見られる標本をRFP陽性と判定した。
統計解析ソフトStat Viewを用いて、Kaplan-Meier法によってRFPの発現と大腸癌患者の予後との関連性を検討した。
上述の大腸癌組織標本をキシレン中で脱パラフィン処理をし、段階的に希釈したエタノールに順次浸けることで親水化させた。クエン酸緩衝液(pH6.0)中で10分間マイクロウェーブ処理をして抗原を賦活化させた。サンプルを1%BSAで処理することで非特異的なシグナルの検出を抑制した。サンプルに抗RFPウサギポリクローナル抗体および抗TBP-2マウスモノクローナル抗体を反応させた後、Alexa Fluor 594を付加した抗ウサギIgG抗体およびAlexa Fluor 488を付加した抗マウスIgG抗体を反応させた。細胞核を、DAPIを用いて染色した。スライドにマウント剤を乗せて標本とし、共焦点顕微鏡を用いて観察及び撮影を行った。
1992〜2007年の間に名古屋大学病院で治療を受けた子宮体がん患者から採取した試料(119検体)をインフォームドコンセントの下、実験に用いた。患者の年齢は28〜86歳である(平均年齢57歳)。ネオアジュバンド化学療法を受けた患者は含まれていない。全ての患者は、子宮全摘出術又は広範子宮全摘術と両側卵管卵巣摘出術のいずれかを経験している。また、72名の患者にはリンパ節郭清が行われている。ステージ1998年のFigO(International Federation of Gynecology and Obstetrics)基準に従って各患者のステージを決定した。ステージIが72名、ステージIIが16名は、ステージIIIが24名、ステージIVが7名であった。組織学的グレードについては世界保健機構の基準に従った。G1が50名、G2が51名、G3が18名であった。
初めに、HDACiがHeLa細胞の酸化ストレスに対する感受性に影響を与えるかどうかを検討した。代表的なHDACiであるTrichostatin A (TSA)によって処理したHeLa細胞では、酸化ストレスの誘導剤であるH2O2に対する感受性が亢進していることを見出した(図1a)。このHDACiによる感受性の亢進に関わる分子機構を解明するため、HDAC1に着目して研究を進めた。HDAC1をsiRNAでノックダウンすると、H2O2およびシスプラチンの細胞障害作用が著しく亢進した(図1b〜d)。このことから、HDACiが、HDAC1の機能阻害を介して酸化ストレス感受性を亢進させている可能性が示唆された。HDAC1によるストレス感受性の制御の分子機構に関しては、p53との相互作用を介したものが推測されるが(参考文献16〜19)、今回用いたHeLa細胞ではパピローマウイルスのE6タンパク質によってp53の発現が抑制されているため、他の機構を介して制御されている可能性が高い。
さらに、同様の結果が大腸癌および乳がんの細胞株を用いた際にも観察されることを確認した(図4)。
今回の発見は、HDACiと抗がん剤の相乗効果における分子機構に新たな知見をもたらすものである。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
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Claims (15)
- 酸化ストレス誘導能を有する抗がん剤の作用増強剤であって、RFP(RET finger protein)遺伝子の発現又はRFPの作用を抑制する化合物を有効成分とする作用増強剤。
- 前記化合物が以下の(a)〜(d)からなる群より選択される化合物である、請求項1に記載の作用増強剤:
(a)RFP遺伝子を標的とするsiRNA;
(b)RFP遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する核酸コンストラクト;
(c)RFP遺伝子の転写産物を標的とするアンチセンス核酸;
(d)RFP遺伝子の転写産物を標的とするリボザイム。 - 酸化ストレス誘導能を有する抗がん剤と併用される、請求項1又は2に記載の作用増強剤。
- 酸化ストレス誘導能を有する抗がん剤の作用を増強する方法であって、標的がん細胞内において、RFP遺伝子の発現又はRFPの作用を抑制するステップを含む方法。
- 請求項1又は2に記載の作用増強剤を投与するステップと、酸化ストレス誘導能を有する抗がん剤を投与するステップと、を含むがん治療法。
- 生体から分離されたがん細胞内のRFP発現量を調べるステップと、
前記ステップの結果に基づき、酸化ストレス誘導能を有する抗癌剤に対する前記がん細胞の耐性を判定するステップと、を含む抗がん剤耐性検査法。 - RFPからなる、がん患者の予後推定用バイオマーカー。
- がんが大腸癌又は子宮体がんである、請求項7に記載の予後推定用バイオマーカー。
- がん患者から分離されたがん細胞内のRFP発現量を指標とした、がん患者の予後推定法。
- がん細胞内のRFP発現量が多いことが、予後が不良であることを示す、請求項9に記載の予後推定法。
- がんが大腸癌又は子宮体がんである、請求項9又は10に記載の予後推定法。
- 抗RFP抗体からなる、がん患者の予後推定用試薬。
- がんが大腸癌又は子宮体がんである、請求項12に記載の予後推定用試薬。
- 請求項12又は13に記載の試薬を含む、がん患者の予後推定用キット。
- がんが大腸癌又は子宮体がんである、請求項14に記載の予後推定用キット。
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