JP2007516693A - 癌の治療および診断のための組成物および方法 - Google Patents

癌の治療および診断のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、癌の治療、特徴付け、および診断のための組成物ならびに方法に関する。具体的には、本発明は、充実性腫瘍幹細胞に関連する遺伝子発現プロファイル、ならびに充実性腫瘍幹細胞の診断、特徴付け、および治療に有用な新規の幹細胞癌マーカーを提供する。

Description

発明の分野
本発明は、癌の治療、特徴付け、ならびに診断のための組成物ならびに方法に関する。具体的には、本発明は、充実性腫瘍幹細胞に関連する遺伝子発現プロファイル、ならびに充実性腫瘍幹細胞の診断、特徴付け、および治療に有用な新規
本出願は、06/09/03に出願された米国仮出願第60/477,228号および06/09/03に出願された米国仮出願第60/477,235号に対して優先権を主張する。
本発明は国立衛生研究所により授与された助成番号5P01CA07513606の国庫補助を受けて為された。政府は本発明に一定の権利を有する。
の幹細胞癌マーカーを提供する。
発明の背景
乳癌は、生涯の間に女性人口の約10％を侵すと見積もられるため、ほとんどの先進工業国では最も一般的な女性の悪性腫瘍である。その死亡率は、早期診断および改良治療のおかげで、その発症率に伴って増加しないが、依然、中年女性の主要な死因の一つである。乳癌の早期診断にも関わらず、新たに乳癌と診断された女性の約1〜5％は診断時点で遠隔転移を有する。その上、最初に限局性疾患と診断された患者の約50％が転移を再発する。これらの再発の85％は、前記疾患の初期発現後、最初の5年以内に起きる。
発症時に、転移性乳癌を患う大半の患者はただ一つまたは二つの侵された器官系を有する。疾患が時間とともに進行するにつれ、複数の部位が通常侵されるようになる。実際に、転移は剖検の際にほぼ全ての身体の器官で見出され得る。観察される転移性障害の最も一般的な部位は、胸壁の皮膚および軟組織、ならびに腋窩および鎖骨上領域における局所領域での再発である。遠隔転移の最も一般的な部位は、骨（遠隔転移の30〜40％）、続いて肺および肝臓である。転移性乳癌は一般的に不治の病と考えられる。しかしながら、現在できる治療選択肢はしばしば無病状態および全生存率を延ばし、生活の質を高める。遠隔転移の発現からの平均生存期間は約3年である。
長足の進歩により、癌（例えば乳癌）につながる遺伝的変化が理解されてきたが、デノボのヒトの癌細胞についての信頼できる腫瘍検定の欠如が、これらの突然変異の影響を細胞レベルで理解する能力を妨げてきた。また、充実性腫瘍幹細胞について同定された癌マーカーの不足が癌患者（例えば乳癌患者）の診断および治療の開発を妨げてきた。このようなものとして、必要なものは、信頼できる腫瘍検定ならびに充実性腫瘍幹細胞の癌マーカーの同定である。
発明の概要
本発明は、癌の治療、特徴付け、ならびに診断のための組成物ならびに方法に関する。具体的には、本発明は、充実性腫瘍幹細胞に関連する遺伝子発現プロファイル、ならびに充実性腫瘍幹細胞の診断、特徴付け、および治療に有用な新規の幹細胞癌マーカーを提供する。
ある態様において、本発明は、a)被験体から組織試料を提供する工程、およびb)前記組織試料の充実性幹細胞の有無が決定されるような条件の下で前記組織試料において表4〜8の少なくとも一つの幹細胞癌マーカー（例えば、1、2、3、5、10、等）を検出する工程を含む、充実性腫瘍幹細胞を検出する方法を提供する。具体的な態様において、前記検出は少なくとも一つの幹細胞癌マーカーについての存在（もしくは欠如）または発現レベルを決定する工程を含む。他の態様において、前記検出は少なくとも一つの幹細胞癌マーカーのmRNA発現を検出する工程を含む。具体的な態様において、前記検出は幹細胞癌マーカーmRNAに相補的な核酸プローブに幹細胞癌マーカーmRNAを暴露する工程を含む。
ある態様において、前記検出は少なくとも一つの幹細胞癌マーカーのポリペプチド発現を検出する工程を含む。他の態様において、前記検出は、幹細胞癌マーカー・ポリペプチドに特異的な抗体に幹細胞癌マーカー・ポリペプチドを暴露する工程および幹細胞癌ポリペプチドへの前記抗体の結合を検出する工程を含む。さらなる態様において、被験体はヒトの被験体を含む。さらなる態様において、組織試料は腫瘍組織を含む。ある態様において、腫瘍組織試料は術後腫瘍組織試料（例えば腫瘍生検）である。
他の態様において、前記方法は、c)被験体に予後診断を提供する工程をさらに含む。ある態様において、少なくとも一つの幹細胞癌マーカーは表8から得られる。好ましい態様において、少なくとも一つの幹細胞癌マーカーは、Bmi-1、eed、easyh1、easyh2、rnf2、yy1、smarcA3、smarcA5、smarcD3、smarcE1、mllt3、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、WNT10B、WNT16、AXIN1、BCL9、MYC、および(TCF4)を含む。
具体的な態様において、本発明は、表4〜8に示される少なくとも一つの幹細胞癌マーカーに対する少なくとも一つの薬剤を含む生物学的に（例えば治療に）有効な量の組成物と充実性腫瘍の細胞とを接触させる工程を含む、充実性腫瘍の大きさを（例えば研究薬物スクリーニングまたは治療用途において）小さくする方法を提供する。ある態様において、生物学的に有効な量は充実性腫瘍の充実性腫瘍幹細胞の細胞死を惹起するのに十分な量または前記細胞の増殖を阻害するのに十分な量である。他の態様において、生物学的に有効な量は、充実性腫瘍幹細胞の生存経路（例えばnotch関連遺伝子）または自己再生経路（例えばWNT経路）を妨げる量である。
充実性腫瘍幹細胞が本発明に従って単離または濃縮され得る充実性腫瘍の例は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽腫など（これらに限定されない）の肉腫および癌腫を含むが、これらに限定されない。本発明は、卵巣癌および乳癌などの肉腫および上皮癌に適用できる。
さらなる態様において、少なくとも一つの薬剤は、抗体、ペプチドまたは小分子である。さらなる態様において、抗体、ペプチド、アンチセンス、siRNA、または小分子は、少なくとも一つの幹細胞癌マーカーの細胞外ドメインに対するものである。ある態様において、少なくとも一つの幹細胞癌マーカーは、Bmi-1、eed、easyh1、easyh2、rnf2、yy1、smarcA3、smarcA5、smarcD3、smarcE1、mllt3、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、WNT10B、WNT16、AXIN1、BCL9、MYC、および(TCF4)からなる群より選択される。
他の態様において、本発明は、表4〜8に示される少なくとも一つの幹細胞癌マーカーの活性を調節する少なくとも一つの剤を含む生物学的に（例えば治療的に）有効な量の組成物と充実性腫瘍の細胞とを接触させる工程を含む、充実性腫瘍の大きさを小さくする方法を提供する。ある態様において、本発明は、表4〜8に示される少なくとも一つの幹細胞癌マーカーを標的とする少なくとも一つの剤を含む生物学的に有効な量の組成物と充実性腫瘍幹細胞とを接触させる工程を含む、充実性腫瘍幹細胞の増殖を絶つ方法または阻害する方法を提供する。ある態様において、前記方法は、前記接触工程後に充実性腫瘍幹細胞の死または増殖防止を確認する工程をさらに含む。さらなる態様において、細胞死はアポトーシスにより惹起する。他の態様において、生物学的に有効な量は充実性腫瘍幹細胞の生存経路（例えばnotch関連遺伝子）または自己再生経路（例えばWNT経路）を妨げる量である。他の態様において、少なくとも一つの幹細胞癌マーカーは、Bmi-1、eed、easyh1、easyh2、rnf2、yy1、smarcA3、smarcA5、smarcD3、smarcE1、mllt3、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、WNT10B、WNT16、AXIN1、BCL9、MYC、および(TCF4)からなる群より選択される。
具体的な態様において、充実性腫瘍幹細胞は細胞表面マーカーのCD44、ESA、またはB38.1を発現する。他の態様において、充実性腫瘍幹細胞は、CD2、CD3、CDIO、CD14、CD16、CD31、CD45、CD64、およびCD140b（例えば米国特許公報第US20040037815A1号および第US20020119565号を参照のこと、両方とも参照により本明細書に組み入れられる）からなる群より選択される少なくとも一つのLINEAGEマーカーを発現できない。
他の態様において、本発明は、(a)充実性腫瘍幹細胞に存在する表4〜8の少なくとも一つの幹細胞癌マーカーを同定する工程；および(b)少なくとも一つの幹細胞癌マーカーに選択的に結合するまたは前記マーカーを調節する剤または一連の剤を得る工程を含む、選択的に充実性腫瘍幹細胞を標的にする方法を提供する。ある態様において、剤は充実性腫瘍幹細胞を遺伝子操作する。具体的な態様において、剤は二重特異性複合体を含む。更なる態様において、剤はアデノウイルス・ベクターを含む。
ある態様において、本発明は、精製された（例えば細胞線量の）充実性腫瘍幹細胞を動物に導入する工程を含む、動物で腫瘍を形成する方法を提供する。前記方法で、(a)充実性腫瘍幹細胞は充実性腫瘍に由来し、ならびに(b)充実性腫瘍幹細胞は表4〜8の少なくとも一つの幹細胞癌マーカーの存在に基づいて未分画腫瘍細胞と比べて少なくとも2倍濃縮される。他の態様において、動物は免疫不全動物である。ある態様において、動物は、マウス（例えばヌード・マウス、SCIDマウス、NOD/SCIDマウス、Beige/SCIDマウス；およびミクログロブリン欠損NOD/SCIDマウス）などの免疫不全哺乳動物である。具体的な態様において、細胞線量の細胞数は約100細胞から約5×105細胞である。
ある態様において、本発明は、a)被験体からの組織または細胞の試料において表4〜8の少なくとも一つの幹細胞癌マーカーを特異的に検出できる試薬、および、任意で、b)組織試料において充実性腫瘍幹細胞の有無を検出する試薬を使用するための取扱説明書を含む、被験体で充実性腫瘍幹細胞を検出するキットを提供する。更なる態様において、試薬は少なくとも一つの幹細胞癌マーカーからmRNAに相補的な核酸プローブを含む。他の態様において、試薬は抗体または抗体断片を含む。
ある態様において、本発明は、a)i)充実性腫瘍幹細胞、およびii)一つまたは複数の試験化合物を提供する工程；ならびにb)前記充実性腫瘍幹細胞を前記試験化合物と接触させる工程；ならびにc)試験化合物の非存在下と比べて試験化合物の存在下で表4〜8に示される少なくとも一つの幹細胞癌マーカーの発現の変化を検出する工程を含む、化合物をスクリーニングする方法を提供する。具体的な態様において、前記検出工程は少なくとも一つの幹細胞癌マーカーの発現レベルを決定する工程を含む。具体的な態様において、前記検出工程は少なくとも一つの幹細胞癌マーカーのmRNA発現を検出する工程を含む。ある態様において、前記検出工程は少なくとも一つの幹細胞癌マーカーのポリペプチド発現を検出する工程を含む。更なる態様において、充実性腫瘍幹細胞はインビトロである。他の態様において、充実性腫瘍幹細胞はインビボである。さらなる態様において、試験化合物は薬物（例えば小分子、抗体、抗体-毒素複合体、siRNAなど）を含む。
ある態様において、本発明は少なくとも二つの薬剤（例えば小分子、抗体、抗体-毒素複合体、siRNAなど）を含む組成物を提供する。ここで、剤のそれぞれは表4〜8に示される少なくとも一つの幹細胞癌マーカーの活性を調節する。さらなる態様において、前記組成物は少なくとも三つの薬剤を含む。
具体的な態様において、本発明は、癌細胞のβ-カテニンの存在を検出し、癌細胞のβ-カテニンの局在性が主に核または主に細胞質であると決定される工程を含む、腫瘍原性と非腫瘍原性の癌細胞を識別する方法を提供する。ある態様において、前記方法は、β-カテニンの局在性が主に核である場合、癌細胞を腫瘍原性と同定する工程、またはβ-カテニンの局在性が主に細胞質である場合、癌細胞を非腫瘍原性と同定する工程をさらに含む。
ある態様において、本発明は、a)i)癌細胞、およびii)β-カテニンに結合するよう形状設定された剤を含む組成物を提供する工程；ならびにb)癌細胞のβ-カテニンの局在性が主に核または主に細胞質であると決定されるような条件の下で前記癌細胞と前記組成物とを接触させる工程；ならびにc) β-カテニンの局在性が主に核である場合、癌細胞を腫瘍原性と同定する工程、またはβ-カテニンの局在性が主に細胞質である場合、癌細胞を非腫瘍原性と同定する工程を含む、腫瘍原性と非腫瘍原性の癌細胞を識別する方法を提供する。
全般的記載
本発明は、癌の治療、特徴付け、ならびに診断のための組成物ならびに方法に関する。具体的には、本発明は、充実性腫瘍幹細胞に関連する遺伝子発現プロファイル、ならびに充実性腫瘍幹細胞の診断、特徴付け、および治療に有用な新規マーカーを提供する。標的にされ得る（例えば診断または治療の目的で）適切なマーカーは、表4〜8に示されるような充実性腫瘍幹細胞で発現の異なる遺伝子および前記遺伝子によりコードされるペプチドである。発現の異なる遺伝子、およびそれによりコードされるペプチドは、充実性腫瘍幹細胞の存在を同定するために、ならびに存在する任意の充実性腫瘍幹細胞の増殖を減らす（もしくは絶つ）、自己再生経路を妨げる、または生存経路を妨げるのに適した分子を決定しスクリーニングするために（例えば定量的に）検出され得る。これらの表に示される発現の異なる遺伝子、およびそれによりコードされるペプチドも、一つまたは複数のこれらのマーカーを（例えばマーカーの活性を阻害または促進するために）標的とする治療剤を作製するために役立つ。
充実性腫瘍幹細胞マーカーを同定するために、5人の患者の細胞、6人の患者のAML幹細胞および非腫瘍原性癌細胞、正常な造血幹細胞（HSC5）、正常な造血細胞、正常な結腸上皮細胞、ならびに正常な乳房上皮細胞が異なる発現について分析された。
本発明は他の細胞と異なって発現する充実性腫瘍幹細胞も提供する。表4〜8で提供される一つまたは複数のマーカー。充実性腫瘍幹細胞はヒトまたは他の動物であり得る。発現は、多かれ少なかれ、いずれかの程度であり得る。他の細胞は、正常細胞、造血幹細胞、急性骨髄性白血病（AML）幹細胞、または任意の他の種類の細胞から選択され得る。
本発明は（患者にとって好ましい治療剤を選択または試験するために患者の）充実性腫瘍幹細胞の精製母集団をもたらす、一母集団の細胞を選別する方法を提供する。本発明は、非腫瘍原性（NTG）腫瘍細胞の母集団など、充実性腫瘍幹細胞以外の腫瘍細胞の精製母集団を選別する方法も提供する。本発明は前記選別細胞に対する抗体を産出する方法を提供する。本発明は前記選別細胞を用いた診断方法を提供する。本発明は治療方法も提供し、前記治療は充実性腫瘍幹細胞に対するものである（例えば直接的または間接的に本明細書で同定される幹細胞癌マーカーの一つに対するものである）。
従って、本発明は、細胞を選別し、疾患を診断し、調査研究を実施し、ならびに所与の経路にある特定の遺伝子に向けられた選択方法、診断方法および治療を用いて充実性腫瘍を治療する方法を提供する。一つまたは複数の下記の遺伝子および遺伝子産物：Bmi-1、eed、easyhi、easyh2、mf2、yy1、smarcA3、smarcA5、smarcD3、smarcE1、およびmllt3、ならびに表4〜8に示されるものが含まれる。これらの遺伝子の多数は、本明細書で示されるように、正常細胞および非腫瘍原性癌細胞と比べて充実性腫瘍幹細胞で異なって発現する。
本発明は充実性腫瘍幹細胞機能および充実性腫瘍から単離された多様な細胞集団による細胞機能のインビボおよびインビトロの検定を提供する。本発明は充実性腫瘍幹細胞の増殖に影響を及ぼす因子を同定するために充実性腫瘍から単離された多様な細胞集団（充実性腫瘍幹細胞を濃縮した細胞集団など）を用いる方法を提供する。本発明の方法により、充実性腫瘍内で表現型が異種の細胞集団を特徴付けられる。具体的には、広範な増殖の幹細胞性質および他のあらゆる腫瘍細胞型を生じる能力を有する腫瘍内で表現型が異なる細胞集団を同定し、単離し、ならびに特徴付けられる。充実性腫瘍幹細胞は治療後に腫瘍を再構築できる腫瘍原性細胞である。
従って、本発明は充実性腫瘍幹細胞に対する診断剤または治療剤を選択的に標的にする方法を提供する。本発明は充実性腫瘍幹細胞を選択的に標的とする（例えば本明細書で開示する充実性腫瘍幹細胞の癌マーカーの一つに向けられる）生体分子などの剤も提供する。好ましい態様において、この標的とされる幹細胞癌マーカーは自己再生または細胞生存の経路の一部である。このようなマーカーの一例はBmi-1であり、成熟自己再生造血幹細胞の維持に必要であることが示された（例えばPark et al., Nature, 2003 May 15;423(6937):302-5を参照のこと、参照により本明細書に組み入れられる）。
ある態様において、本発明は、抗癌剤をスクリーニングする方法；抗癌治療を試験する方法；新規経路を標的にする薬物を開発する方法；新しい抗癌治療標的を同定する方法；病理標本の悪性細胞を同定し診断する方法；充実性腫瘍幹細胞の薬物感受性を試験し検定する方法；薬物感受性を予測する特定因子を測定する方法；ならびに患者をスクリーニングする方法（例えばマンモグラフィーの補助として）を提供する。
本発明の他の特徴、対象および利点は下記の詳細な説明から明白であろう。更なる指針は、Regents of the University of Michiganによる公開されたPCT特許出願WO02/12447およびRegents of the University of MichiganによるPCT特許出願PCT/USO2/39191で提供され、両者は参照により本明細書に組み入れられる。
定義
本発明の理解を容易にするため、幾つかの用語および語句が以下に定義される。
本明細書で用いられるように、「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、具体的にはモノクローナル抗体（全長のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば二重特異性抗体）、ならびに所望の生体活性（例えば本明細書に記載するような幹細胞癌マーカーと結合できる）を示す限り、抗体断片を網羅する。抗体は他の分子（例えば毒素）と結合し得る。
本明細書で用いられるように、「抗体断片」という用語は原型抗体の一部を指す。抗体断片の例は、直鎖抗体；一本鎖抗体分子；FcまたはFc’ペプチド、FabおよびFab断片；ならびに抗体断片から形成される多特異的抗体を含むが、これらに限定されない。
本明細書で用いられるように、非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むまたは配列を含まないキメラ抗体である。大部分については、ヒト化抗体は、受容者の超可変領域の残基が、望ましい特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種の超可変領域の残基（供与抗体）と置換されるヒト免疫グロブリン（受容抗体）である。時には、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域（FR）残基は対応する非ヒト残基と置換される。さらに、ヒト化抗体は受容抗体または供与抗体で見出されない残基を含み得る。これらの修飾は一般に抗体の性能をさらに高めるために為される。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変領域の実質的に全てを含み、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域ループに対応するものの全てまたは実質的に全てならびにFR残基の全てまたは実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Fc）、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部も含み得る。ヒト化抗体を作製するために用いられる方法の例は、Winter et al.の米国特許第5,225,539号（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。
濃縮された細胞集団のように、「濃縮された」とは、未分画細胞群における（例えば表4〜8に示されるような）特定マーカーを有する細胞数と比べて、分画細胞群における前記マーカーを有する細胞数の増加に基づいて、表現型で定義され得る。しかしながら、「濃縮された」という用語は、試験マウスの限界希釈頻度で腫瘍を形成する細胞の最少数として腫瘍原性という機能により機能で定義できるのが好ましい。例えば、500個の腫瘍幹細胞が63％の試験動物で腫瘍を形成するが、63％の試験動物で腫瘍を形成するために5000個の未分画腫瘍細胞が必要な場合、充実性腫瘍幹細胞集団は腫瘍原活性について10倍濃縮される。本発明の幹細胞癌マーカーは濃縮された癌幹細胞集団を作製するために使用され得る。好ましい態様において、幹細胞集団は未分画腫瘍細胞と比べて少なくとも1.4倍（例えば1.4倍、1.5倍、2倍、5倍・・・20倍）濃縮される。
細胞に関して、「単離された」とは、その自然環境（充実性腫瘍など）から取り出される細胞を指し、天然に存在するが単離された細胞に基づくマーカーを欠く他の細胞から、少なくとも約30％、50％、75％遊離して、最も好ましくは約90％遊離して、単離または分離される細胞を指す。本発明の幹細胞癌マーカーは単離された癌幹細胞集団を作製するために使用できる。
本明細書で用いられるように、「受容体結合ドメイン」という用語は、細胞接着分子を含む受容体に対する任意の天然リガンド、または対応する天然リガンドの定性的受容体結合能を少なくとも保持する前記天然リガンドの任意の領域もしくは誘導体を指す。
本明細書で用いられるように、「抗体-イムノアドヘシンキメラ」という用語は、少なくとも一つのイムノアドヘシンを有する抗体の少なくとも一つの結合ドメインと結合する分子を含む。例として、Berg et al., PNAS(USA)88:4723-4727(1991)およびCharnow et al., J. Immunol., 153:4268(1994)に記載された二重特異性CD4-IgGキメラを含むが、これらに限定されない。両者は参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書で用いられるように、「癌」および「癌性」という用語は、通常、無秩序な細胞増殖により特徴付けられる哺乳動物の生理学的状態を指すまたは説明する。癌の例は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病を含むが、これらに限定されない。このような癌のより具体的な例は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、消化管癌、膵癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌（liver cancer）、膀胱癌、肝癌（hepatoma）、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮の癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌（hepatic carcinoma）、ならびに様々な種類の頭部および頸部の癌を含む。
本明細書で用いられる「エピトープ」という用語は、特定の抗体と接触する抗原の一部を指す。
タンパク質またはタンパク質の断片が宿主動物に免疫性を与えるために使用される場合、タンパク質の多数の領域は、タンパク質の所与領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘導し得る。これらの領域または構造は「抗原決定基」と呼ばれる。抗原決定基は抗体と結合するために原型抗原（即ち免疫応答を引き起こすために用いられる「免疫原」）と競合し得る。
抗体とタンパク質またはペプチドの相互作用に関して用いられる場合、「特異的な結合」または「特異的に結合する」という用語は、前記相互作用がタンパク質の特定構造（即ち抗原決定基すなわちエピトープ）の存在に依存することを意味し；換言すれば、抗体はタンパク質全般よりむしろ特異的なタンパク質構造を認識し結合する。例えば、抗体がエピトープ「A」に特異的である場合、被標識「A」および抗体を含む反応におけるエピトープA（または遊離の未標識A）を含むタンパク質の存在は抗体に結合した被標識Aの量を減少させるであろう。
本明細書で用いられるように、「非特異的な結合」および「バックグラウンド結合」という用語は、抗体とタンパク質またはペプチドの相互作用に関して用いられる場合、特定構造の存在に依存しない相互作用を指す（即ち抗体はエピトープなどの特定構造よりむしろタンパク質全般に結合する）。
本明細書で用いられるように、「被験体」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含むが、これらに限定されない、特定治療の受容者となるべき任意の動物（例えば哺乳動物）を指す。典型的には、「被験体」および「患者」という用語はヒトの被験体に関して本明細書で同義に用いられる。
本明細書で用いられるように、「癌の疑いがある被験体」という用語は、癌を示す一つまたは複数の症状（例えば顕著なしこりまたは塊）またはを提示する被験体または癌検査（例えば定期健康診断中）を受けている被験体を指す。癌の疑いがある被験体は一つまたは複数の危険因子も有し得る。癌の疑いがある被験体は一般に癌の検査を受けていなかった。しかしながら、「癌の疑いがある被験体」は初期診断を受けたが癌の病期を知らない個体を包含する。前記用語はさらに癌に一度罹った人々（例えば寛解の個体）を含む。
本明細書で用いられるように、「癌の危険性がある被験体」という用語は特定の癌を発症する一つまたは複数の危険因子を有する被験体を指す。危険因子は、性別、年齢、遺伝性素因、環境暴露、癌の前歴、癌以外の先在疾患、および生活様式を含むが、これらに限定されない。
本明細書で用いられるように、「被験体の癌を特徴付けする」という用語は、被験体の癌試料の一つまたは複数の性質を同定することを指し、良性、前癌または癌の組織の存在、癌の病期、および被験体の予後を含むが、これらに限定されない。癌は、本明細書で開示される癌マーカーを含むが、これらに限定されない一つまたは複数の癌マーカー遺伝子の発現の同定により特徴付けられ得る。
本明細書で用いられるように、「幹細胞癌マーカー」という用語は、発現レベルが腫瘍原性癌細胞の存在と相関する遺伝子、または前記遺伝子単独により、もしくは他の遺伝子と組み合わせて、発現するペプチドを指す。前記相関関係は前記遺伝子の発現の増加または減少（例えばmRNAまたは前記遺伝子によりコードされるペプチドの増減レベル）のいずれかに関係し得る。
本明細書で用いられるように、「発現レベルを特異的に検出する試薬」という用語は、一つまたは複数の遺伝子の発現を検出するために用いられる試薬を指す（例えば本発明の癌マーカーを含むが、これに限定されない）。適切な試薬の例は、対象となる遺伝子に特異的にハイブリダイズできる核酸プローブ、アプタマー、対象となる遺伝子を特異的に増幅できるPCRプライマー、および対象となる遺伝子により発現するタンパク質に特異的に結合できる抗体を含むが、これらに限定されない。他の非限定的な例は下記の記載および実施例で見出せる。
本明細書で用いられるように、「非癌性制御に関する発現の増減を検出する」という用語は、非癌性制御試料のレベルに関する遺伝子の発現レベル（例えばmRNA又はタンパク質のレベル）の測定を指す。遺伝子発現は、本明細書に記載されるものを含むが、これらに限定されない任意の適切な方法を用いて測定できる。
本明細書で用いられるように、「前記試験化合物の非存在下と比べて前記試験化合物の存在下で細胞試料の遺伝子発現の変化を検出する」という用語は、試験化合物の非存在下と比べて試験化合物の存在下で変化した（例えば増加したまたは減少した）発現レベルの測定を指す。遺伝子発現は任意の適切な方法を用いて測定できる。
本明細書で用いられるように、「前記被験体の癌を検出する前記キットを使用するための取扱説明書」という用語は、被験体からの試料における癌の検出および特徴決定のために前記キットに含まれる試薬を使用するための取扱説明書を含む。
本明細書で用いられるように、「予後を提供する」という用語は、被験体の将来の健康（例えば予想される罹患率または死亡率、癌に罹る可能性、および転移の危険性）に及ぼす癌の存在の影響に関する情報（例えば本発明の診断方法により測定されるように）を提供することを指す。
本明細書で用いられるように、「術後腫瘍組織」という用語は（例えば手術中）被験体から取り除かれた癌性組織（例えば生検組織）を指す。
本明細書で用いられるように、「癌と診断された被験体」という用語は、検査され癌性細胞を有することが見出された被験体を指す。癌は、生検、x線、血液検査、および本発明の診断方法を含むがこれらに限定されない任意の適切な方法を用いて診断され得る。
本明細書で用いられるように、「生検組織」という用語は、試料が癌性組織を含むか否かを解決するために被験体から採取される組織試料を指す。ある態様においては、被験体に癌の疑いがあるために生検組織が得られる。次いで生検組織は癌の有無について調べられる。
本明細書で用いられるように、「遺伝子導入系」という用語は核酸配列を含む組成物を細胞または組織に送達する任意の手段を指す。例えば、遺伝子導入系は、ベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および他の核酸に基づく輸送系）、裸の核酸のマイクロインジェクション、重合体に基づく輸送系（例えばリポソームに基づく系および金属粒子に基づく系）、微粒子銃による注入などを含むが、これらに限定されない。本明細書で用いられるように、「ウイルス遺伝子導入系」という用語は、所望の細胞または組織への試料の送達を促進するためのウイルス要素（例えば原型ウイルス、改変ウイルスおよび核酸またはタンパク質などのウイルス構成要素）を含む遺伝子導入系を指す。本明細書で用いられるように、「アデノウイルス遺伝子導入系」という用語は、アデノウイルス科に属する原型ウイルスまたは改変ウイルスを含む遺伝子導入系を指す。
本明細書で用いられるように、「部位特異的組換え標的配列」という用語は、組換え因子の認識配列および組換えが起こる位置を提供する核酸配列を指す。
本明細書で用いられるように、「核酸分子」という用語は、DNAまたはRNAを含むが、これらに限定されない分子を含む任意の核酸を指す。前記用語は、4-アセチルシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、5-（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルプソイドウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキュェオシン、5’-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、オキシブトキソシン（oxybutoxosine）、プソイドウラシル、キュェオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、プソイドウラシル、キュェオシン、2-チオシトシン、および2,6-ジアミノプリンを含むが、これらに限定されない、DNAおよびRNAの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列を包含する。
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド、前駆体、またはRNA（例えばrRNA、tRNA）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えばDNA）配列を指す。ポリペプチドは、全長または断片の所望する活性または機能性（例えば酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性など）が保持される限り、全長のコード配列によりまたはコード配列の任意の部分によりコードされ得る。前記用語は、構造遺伝子のコード領域、ならびに前記遺伝子が全長mRNAの長さに対応するように片末端に向かって約1kb以上の距離で5’および3’の両末端のコード領域に隣接して位置する配列も包含する。コード領域の5’に位置しmRNAに存在する配列は5’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の3’または下流に位置しmRNAに存在する配列は3’非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語は遺伝子のcDNAおよびゲノムの両形態を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列に中断されたコード領域を含む。イントロンは核RNA（hnRNA）に転写される遺伝子の分節であり；イントロンはエンハンサーなどの調節要素を含み得る。イントロンは核または一次転写産物から取り除かれる即ち「スプライシングされる」。従って、イントロンはメッセンジャーRNA（mRNA）転写産物に存在しない。mRNAは翻訳中に新生ポリペプチドのアミノ酸の配列または順序を指定するように機能する。
本明細書で用いられるように、「異種遺伝子」という用語は、その自然環境にない遺伝子を指す。例えば、異種遺伝子は他の種に導入される一つの種の遺伝子を含む。異種遺伝子は何らかの方法（例えば突然変異、多重コピーでの付加、非天然調節配列と連結など）で改変された生物原産の遺伝子も含む。異種遺伝子は、前記異種遺伝子配列が染色体の遺伝子配列と関連することが天然で見出されていないDNA配列または天然で見出されない染色体の部分と関連するDNA配列と通常連結するという点で、内在性遺伝子と識別される（例えば遺伝子が正常に発現しない遺伝子座で発現する遺伝子）。
本明細書で用いられるように、「遺伝子発現」という用語は、遺伝子の「転写」を通して（例えばRNAポリメラーゼの酵素作用によって）遺伝子にコードされる遺伝情報をRNA(例えばmRNA、rRNA、tRNA、またはsnRNA)に変換する過程、およびタンパク質をコードする遺伝子については、mRNAの「翻訳」を通してタンパク質に変換する過程を指す。遺伝子発現は前記過程の多数の段階で調節され得る。「上方制御」または「活性化」とは遺伝子発現産物（例えばRNAまたはタンパク質）の産生を増加する調節を指し、一方、「下方制御」または「抑制」とは産生を減少させる調節を指す。上方制御または下方制御に関与する分子（例えば転写因子）は、しばしば「活性剤」および「抑制剤」とそれぞれ呼ばれる。
イントロンを含むことに加えて、遺伝子のゲノム形態はRNA転写産物に存在する配列の5’および3’の両末端に位置する配列も含み得る。これらの配列は「隣接」配列または領域と呼ばれる（これらの隣接配列はmRNA転写産物に存在する非翻訳配列に対して5’または3’に位置する）。5’隣接領域は遺伝子の転写を制御するまたは影響するプロモーターおよびエンハンサーなどの調節配列を含み得る。3’隣接領域は転写の終止、転写後切断およびポリアデニル化を指図する配列を含み得る。
「siRNA」という用語は低分子干渉RNAを指す。ある態様において、siRNAは約18〜25ヌクレオチドの長さの二本鎖または二本鎖領域を含み；しばしばsiRNAは各鎖の3’末端で約2個から4個の不対合ヌクレオチドを含む。siRNAの二本鎖または二本鎖領域の少なくとも一鎖は標的RNA分子に実質的に相同であるまたは実質的に相補的である。標的RNA分子に相補的な鎖は「アンチセンス鎖」であり；標的RNA分子に相同な鎖は「センス鎖」であり、siRNAアンチセンス鎖にも相補的である。siRNAは付加配列も含み得る；このような配列の非制限的例は連結配列、またはループ、ならびに幹構造および他の折り畳み構造を含む。siRNAは、無脊椎動物および脊椎動物のRNA干渉を誘発する際に、および植物の転写後遺伝子サイレンシング中の配列特異的RNA分解を誘発する際に、重要な仲介物として機能すると考えられる。
「RNA干渉」または「RNAi」という用語は、siRNAによる遺伝子発現のサイレンシングまたは減少を指す。これは動物および植物の配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの過程であり、サイレンス遺伝子の配列にその二本鎖領域で相同なsiRNAにより開始される。前記遺伝子は、生物に内因性または外因性であり、染色体内に取り込まれて存在するまたはゲノム内に取り込まれていないトランスフェクション・ベクターに存在し得る。遺伝子の発現は完全にあるいは部分的に阻害される。RNAiは標的RNAの機能を阻害するとも考えられ得る。標的RNAの機能は完全または部分的であり得る。
本明細書で用いられるように、「コードする核酸分子」、「コードするDNA配列」、および「コードするDNA」という用語は、デオキシリボ核酸の一本鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序はポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。従って、前記DNA配列はアミノ酸配列をコードする。
本明細書で用いられるように、「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」および「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」という用語は、遺伝子のコード領域を含む核酸配列、または換言すれば遺伝子産物をコードする核酸配列を意味する。コード領域は、cDNA、ゲノムDNAまたはRNAの形態で存在し得る。DNAの形態で存在する場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖（即ちセンス鎖）または二本鎖であり得る。エンハンサー/プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化シグナルなどの適切な制御要素は、適切な転写開始および/または一次RNA転写産物の正確なプロセシングを可能にするために必要ならば、遺伝子のコード領域に密接して配置され得る。または、本発明の発現ベクターで利用されるコード領域は、内因性のエンハンサー/プロモーター、スプライス部位、介在配列、ポリアデニル化シグナルなど、または内因性および外因性の両制御要素の組み合わせを含み得る。
本明細書で用いられるように、「部分」という用語は、ヌクレオチド配列に関する場合（「所与のヌクレオチド配列の部分」のように）、前記配列の断片を指す。断片は、4ヌクレオチドから、全ヌクレオチド配列から1ヌクレオチドを差し引いた大きさにまで及び得る（10ヌクレオチド、20、30、40、50、100、200など）。
本明細書で用いられる「機能できる組み合わせ」、「機能できる順序」および「機能できるよう連結された」という用語は、所与遺伝子の転写および/または所望のタンパク質分子の合成を指図できる核酸分子が産生されるような様式の核酸配列の連結を指す。前記用語は、機能的なタンパク質が産生されるような様式のアミノ酸配列の連結も指す。
「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」のように、核酸に関して用いられる場合、「単離された」という用語は、同定され、ならびにその自然源で通常付随する少なくとも一つの構成要素または混入物質から分離された核酸配列を指す。単離された核酸は、自然で見出される形態または環境と異なって存在する。対照的に、単離されていない核酸は天然に存在する状態で見られるDNAおよびRNAなどの核酸として存在する。例えば、所与のDNA配列（例えば遺伝子）は隣接遺伝子に近接した宿主細胞の染色体に見出せ；特定タンパク質をコードする特定のmRNA配列などのRNA配列は、多数のタンパク質をコードする多くの他のmRNAとの混合物として細胞で見出せる。しかしながら、所与のタンパク質をコードする単離された核酸は、一例として、核酸が天然の細胞と異なる染色体位置である、所与タンパク質を通常発現する細胞の核酸などを含み、または自然で見出されるものと異なる核酸配列と別なやり方で隣接する。単離された核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖の形態で存在し得る。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがタンパク質を発現するために利用される場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはセンス鎖またはコード鎖を最小限に含むであろう（即ちオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖であり得る）が、センスおよびアンチセンスの両鎖を含み得る（即ちオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは二本鎖であり得る）。
「アミノ酸配列」および「ポリペプチド」または「タンパク質」などの用語は、列挙したタンパク質分子と関連する全長の天然アミノ酸配列に前記アミノ酸配列を限定することを意味しない。
本明細書で用いられるような「天然タンパク質」という用語は、タンパク質がベクター配列によりコードされるアミノ酸残基を含まないことを意味し、即ち天然タンパク質は天然で存在するようなタンパク質で見出されるアミノ酸のみを含む。天然タンパク質は組換え手段により産生され得るまたは天然に存在する起源から単離され得る。
本明細書で用いられるように、「部分」という用語は、タンパク質に関する場合（「所与タンパク質の部分」のように）、前記タンパク質の断片を指す。前記断片は、4アミノ酸残基から、全アミノ酸配列から1アミノ酸を差し引いた大きさにまで及び得る。
「サザン・ブロット」という用語は、アガロース・ゲルまたはアクリルアミドゲル上のDNA分析、大きさによるDNAの分画後、前記ゲルからニトロセルロースまたはナイロン膜などの固体支持体へのDNAの転移を指す。次いで、固定されたDNAは標識プローブで精査され、使用プローブに相補的なDNA種を検出する。DNAは電気泳動前に制限酵素で切断してもよい。電気泳動後、DNAは固体支持体への転移の前または最中に部分的に脱プリン化および変性してもよい。サザン・ブロットは分子生物学者の標準手段である（J.Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, pp 9.31-9.58[1989]）。
本明細書で用いられる「ノーザン・ブロット」という用語は、アガロースゲル上でのRNAの電気泳動によるRNAの分析、大きさによるRNAの分画後、前記ゲルからニトロセルロースまたはナイロン膜などの固体支持体へのRNAの転移を指す。次いで、固定されたRNAは標識プローブで精査され、使用プローブに相補的なRNA種を検出する。ノーザン・ブロットは分子生物学者の標準手段である（J.Sambrook et al.,前記, pp 7.39-7.52[1989]）。
「ウェスタン・ブロット」という用語は、ニトロセルロースまたは膜などの支持体上に固定されたタンパク質（またはポリペプチド）の分析を指す。タンパク質はタンパク質を分離するためにアクリルアミド・ゲルで泳動し、次いでゲルからニトロセルロースまたはナイロン膜などの固体支持体にタンパク質を転移する。次いで、固定されたタンパク質は対象となる抗原に対して反応性を有する抗体に曝される。抗体の結合は放射性標識抗体の使用を含む種々の方法により検出され得る。
本明細書で用いられる「導入遺伝子」という用語は、例えば新しく受精した卵または初期胚に外来遺伝子を導入することにより、生物に配置された外来遺伝子を指す。「外来遺伝子」という用語は、実験操作により動物のゲノムに導入される任意の核酸（例えば遺伝子配列）を指し、導入される遺伝子が天然に存在する遺伝子と同じ配置で存在しない限り、動物で見出される遺伝子配列を含み得る。
本明細書で用いられるように、「ベクター」という用語は、一つの細胞から他へDNA分節を転移する核酸分子に関して用いられる。「媒体」という用語は時々「ベクター」と同義で用いられる。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、または植物もしくは動物のウイルスにしばしば由来する。
本明細書で用いられる「発現ベクター」という用語は、所望のコード配列、および特定の宿主生物において機能できるよう連結されたコード配列の発現に必要な適切な核酸配列を含む組換えDNA分子を指す。原核生物の発現に必要な核酸配列は、通常、プロモーター、オペレーター（任意で）、およびリボソーム結合部位をしばしば他の配列とともに含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終止シグナルおよびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
「過剰発現」および「過剰発現する」という用語ならびに文法的等価物は、対照または非トランスジェニック動物の所与組織で観察されるより約1.5倍高い（または大きい）発現レベルを示すためのmRNAのレベルに関して用いられる。mRNAのレベルは、ノーザン・ブロット分析を含むが、これに限定されない、当業者に公知の幾つかの任意の技法を用いて測定される。適切な対照がノーザン・ブロットに含まれ、分析される各組織からローディングされたRNA量の差異を調整する（例えば本質的に同量で全組織に存在し、各試料に存在する豊富なRNA転写産物の28S rRNA量は、ノーザン・ブロットで観察されるmRNAに特異的なシグナルを正規化または標準化する手段として使用され得る）。正確にスプライシングされる導入遺伝子RNAに大きさが対応するバンドに存在するmRNA量が定量され；トランスジェニックmRNAの発現の定量において導入遺伝子プローブにハイブリダイズする他の微量種のRNAは検討されない。
本明細書で用いられるように、「インビトロ」という用語は人工環境ならびに人工環境で起きる過程または反応を指す。インビトロの環境は、試験管および細胞培養から成り得るが、これらに限定されない。「インビボ」という用語は自然環境（例えば動物または細胞）ならびに自然環境で起きる過程または反応を指す。
「試験化合物」および「候補化合物」という用語は、身体機能の疾患、疾病、病期、または障害（例えば癌）を治療または予防するための使用候補である任意の化学物質、医薬品、薬物などを指す。試験化合物は公知および潜在的な治療化合物を両方含む。試験化合物は本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングすることにより治療用であると決定できる。本発明のある態様において、試験化合物はアンチセンス化合物を含む。
本明細書で用いられるように、「試料」という用語はその最も広い意味で用いられる。一つの意味において、任意の起源から得られる標本または培養物、ならびに生体試料および環境試料を含むことを意味する。生体試料は、動物（ヒトを含む）から得てもよく、流体、固体、組織、および気体を包含する。生体試料は、血漿、血清などの血液製剤を含む。環境試料は、表面物質、土壌、水、結晶および産業試料などの環境物質を含む。このような試料は、しかしながら、本発明に適用できる試料の種類を限定するものとして解釈されるべきでない。
発明の詳細な説明
本発明は癌の治療、特徴付け、ならびに診断のための組成物および方法を提供する。具体的には、本発明は、充実性腫瘍幹細胞に関連する遺伝子発現プロファイル、ならびに充実性腫瘍幹細胞の診断、特徴付け、および治療に有用な新規マーカーを提供する。
I.幹細胞および充実性腫瘍幹細胞
一般的な癌は、短命な成熟細胞の補充を担う大亜集団の増殖細胞を含む組織で生じる。このような器官において、細胞の成熟は序列に並べられ、前記序列では、希少集団の幹細胞が成熟細胞を生じ、自己再生1-11と呼ばれる過程を通して永続させる。幹細胞は希少なため、前記細胞は生物学的性質、分子性質、および生化学的性質を研究するために単離されるべきである。幹細胞が大半の組織を生じそうだが、幹細胞はほんの少数の組織で厳密に同定され精製されてきた。リンパ造血系を生じる幹細胞は、造血幹細胞（HSC）と呼ばれ、マウスおよびヒトから単離されており、最もよく特徴付けられた幹細胞である。HSCを含む組織の有用性は、骨髄破壊的なプロトコル12後に血液リンパ系を再生するため、骨髄移植で大量に使用する癌治療で証明されている。患者からのHSCの見込み単離は自己移植のない癌である集団をもたらし得る13-17。
癌が生じる組織、および具体的には前記組織に存在する幹細胞の細胞生物学の理解は、癌生物学に新しい洞察を提供する。幹細胞生物学の幾つかの局面は癌に関連している。第一に、正常な幹細胞および癌幹細胞の両方が自己再生を経る。出現する証拠は、正常な幹細胞およびそれらの悪性対応物において、同様な分子機構が自己再生を調節することを示唆している。次に、癌をもたらす突然変異が正常な幹細胞に蓄積すると考えられる。最終的に、腫瘍は腫瘍の増殖および転移を推進する不明確な増殖能を有する「癌幹細胞」集団を含む可能性が高い18-26。
HSCは最も研究され最もよく理解されている体細胞幹細胞集団である1。造血は、造血幹細胞のプールが、形成される血液成分、例えば赤血球細胞、血小板、顆粒球、マクロファージ、ならびにBリンパ球およびTリンパ球からなるリンパ造血系を最終的に生じる、厳重に調節された過程である。これらの細胞は、酸化、出血予防、免疫、および感染にそれぞれ重要である。成体では、HSCは二つの基本的性質を有する。第一に、HSCは幹細胞プールを維持するために自己再生を必要とし；総HSC数が厳密な遺伝的調節下にある27。第二に、HSCは、正常な状態で恒常的な成熟細胞のプールを維持するために、ならびに出血または感染などのストレスに応答して特定の系列数を増やすために、分化を経なければならない。
造血系において、多能性細胞は、マウスの骨髄細胞の0.05％を構成し、自己再生能に関して異質である。多能性細胞には三つの異なる集団がある。長期自己再生HSC、短期自己再生HSC、および検出できる自己再生潜在能をもたない多能性前駆体7、28。これらの集団は階層を形成し、長期HSCは短期HSCを生じ、短期HSCは順に多能性前駆体を生じる[7の図1]。HSCは長期自己再生プールから多能性前駆体に成熟するにつれ、より有糸分裂活性になるが自己再生能を失う。長期HSCのみが動物の生存期間に成熟造血細胞を生じることができ、一方、短期HSCおよび多能性前駆体は8週未満で致死的な放射線を照射されたマウスを再構築する7。
マウスおよびヒトのHSCの表現型及び機能の特性が広範囲に特徴付けられてきたという事実にもかかわらず2、基本的な幹細胞の性質である自己再生の理解は僅かである25、29、30。ほとんどの場合、HSCは、長期培養で広範囲の増殖を誘導し得る増殖因子の組み合わせに暴露されると、分化する31。限られた期間培養物のHSC活性を維持する培養条件の同定が最近進歩してきた[例えばMillerおよびGraves32を参照]が、移植可能なHSC活性を有する前駆体の有意で且つ長期の増殖を促進する組織培養条件を同定するのは非常に困難であることが分かっている。
組織または腫瘍の維持は増殖および細胞死の平衡により測定される33。正常組織では、幹細胞数は厳重な遺伝調節下にあり、器官で一定の幹細胞数が維持される27、34、35。対照的に、癌細胞はこの恒常性制御を免れ、自己再生能を有する腫瘍の細胞数は絶えず増加し、必然的な腫瘍の成長をもたらす。予想されるように、腫瘍の拡大を促す突然変異の多くは細胞増殖または生存のいずれかを調節する。例えば、癌遺伝子Bcl-2の強制発現によるアポトーシスの予防は、リンパ腫の発達を促進し、インビボでのHSC数の増加ももたらす。これは細胞死がHSCの恒常性の調節に役割を果たすことを示唆している36、37。事実、マウスにおける実験上の急性骨髄性白血病への進行は、幾つかの内在的に誘発される脊髄細胞のプログラム細胞死経路を遮断し前記経路を外在的に誘起するために、少なくとも3つ、おそらく4つの独立事象を必要とする38。腫瘍細胞の増殖を推進するc-mybおよびc-mycなどの癌原遺伝子もHSCの発達に必須である39-42。
癌細胞および正常な幹細胞は自己再生能を共有するため、古くから癌に関連する幾つかの遺伝子が正常な幹細胞の発達も調節し得ることは驚くことではない[25、43で概説される]。ヒトの造血幹細胞（CD34+Lin-CD38-）を極めて濃縮した細胞がインビトロでShh刺激に応答して自己再生の増大を示したという発見により、他の増殖因子と組み合わせて、Shhシグナル伝達も自己再生の調節に関係している44。発癌に関する幾つかの他の遺伝子は幹細胞の機能に重要であることが示されてきた。例えば、ヒト急性白血病の幾つかの症例に関与するtal-1/SCLを欠損するマウスは胚の造血を欠如し45、造血を開始するのに必要な内因性または外因性の事象、最も初期の最終血液細胞の維持、または胚性HSCの下流で血液細胞を形成する決定に必要なことを示唆する45、46。Hoxファミリーの構成員もヒトの白血病に関係している。HoxB4の強制発現は幹細胞の機能に影響を及ぼし得る47、48。p53腫瘍抑制遺伝子の主要な標的の一つはp21cip1である。p21cip1欠損マウスの骨髄は致死的な放射線を照射された受容動物を逐次再構築する能力が低下している。連続移行の失敗は、幹細胞プールの枯渇、テロメアの消失、または移植可能性の喪失に起因し得る49。マウスにおいて、c-mycと協同してリンパ腫を誘起する遺伝子のbmi-150、51は成体HSCおよび白血病細胞の維持に必要である。従って、幹細胞の運命決定に関与する多数の遺伝子も悪性形質転換に関与する。
マウスおよびヒトの両方で発癌に関係する他の二つのシグナル伝達経路であるWnt/β-カテニン経路およびNotch経路は、正常および癌の両幹細胞の自己再生に中心的な役割を果たし得る。受容体のNotchファミリーはショウジョウバエ（Drosophila）で最初に同定され発達および分化に関係する52。線虫（C elegans）において、Notchは生殖細胞の自己再生に役割を果たす53。神経発生において、一過性のNotchの活性化は胚性神経堤幹細胞により神経発生から膠形成（gliogenesis）への不可逆スイッチを起動する10。NotchリガンドのJagged-1またはDeltaのいずれかを用いた培養におけるHSCのNotch活性化は、インビトロおよびインビボで観察され得る初期前駆体の活性を一過的に増大させた。これはNotchの活性化が前駆細胞の多能性の維持またはHSCの自己再生のいずれかを促進することを示唆する54、55。Notch経路は発達に中心的な役割を果たす一方で、マウスのint-3癌遺伝子は切断型Notch4であり56、新規のヒトの癌におけるNotchの役割は複雑であまり解明されていない。Notchシグナル伝達経路の多様な構成員は上皮性起源の癌に発現し、染色体転座によりNotchによる活性化は白血病の幾つかの症例に関与する57-61。マイクロアレイ分析はNotch経路の構成員がしばしば腫瘍細胞により過剰発現することを示した58、59。切断型Notch4のmRNAは幾つかの乳癌細胞系により発現する62。Notch1の過剰発現は小細胞肺癌細胞系の増殖停止に至る一方で、Notch1シグナルの阻害は白血病細胞系を誘導してアポトーシスに達し得る52、54、63。Mieleと同僚による研究は、Notch-1シグナル伝達の活性化がRasで形質転換されたヒトの細胞で新生物表現型を維持することを示した64。彼らは、デノボ癌において、活性化Ras突然変異の細胞もNotch-1およびNotch-4の発現増加を証明することも見出した。
Wnt/β-カテニンのシグナル伝達も正常幹細胞の自己再生および悪性形質転換に中枢的役割を果たす65-67。Wnt経路は最初にMMTVで誘起される乳癌に関係し、プロウイルス挿入によるWnt-1の無秩序な発現が乳腺腫瘍をもたらした68、69。続いて、Wntタンパク質はパターン形成に中心的な役割を果たすことが示された。Wnt-1は、frizzledおよび低比重リポタンパク質受容体に関連するタンパク質ファミリーの構成員である同種受容体への結合により機能する極めて疎水性の分泌タンパク質の大ファミリーに属し、β-カテニンの活性化をもたらす43、58、65、70、71。受容体活性化の欠如下でβ-カテニンは大腸腺腫様ポリポーシス（APC）、Axinおよびグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ-3βタンパク質からなる複合体による分解の印となる58、67、72-74、66、75。Wntタンパク質は骨髄で発現し、インビトロのWntタンパク質による、または恒常的に活性なβ-カテニンの発現による、Wnt/β-カテニン・シグナル伝達の活性化は、組織培養およびインビボで初期前駆細胞および濃縮された移植可能な正常造血幹細胞のプールを拡大する25、67、72。β-カテニン・シグナル伝達の阻害剤であるAxinの異所性発現によるWnt/β-カテニンの阻害は、インビトロおよびインビボの両方で幹細胞の増殖阻害をもたらす。他の研究は、Wnt/β-カテニン経路が他の組織で幹細胞または前駆細胞の自己再生を媒介することを示唆する73、74、76、77。高レベルのβ-カテニンは、低い増殖能を有するケラチン生成細胞で見られるものより高い増殖能を有するケラチン生成細胞で見られる73、74、77。正常な造血幹細胞の対応物と同様に、活性化されたβ-カテニンの強制発現は表皮幹細胞の自己再生能を増大させ分化能を低下させた。TCF-4、即ちβ-カテニンに結合する際に活性化される転写因子の一つを発現できないマウスは、未分化な腺窩上皮前駆細胞をまもなく使い果たす。これはWntシグナル伝達が上皮幹細胞の自己再生に関与することをさらに示唆する43、76。
タンパク質分解経路の不活性化による、最も頻繁にはAPCの突然変異による、結腸癌のβ-カテニンの活性化は一般的である43、58、66、75。あるWnt遺伝子の発現は他の幾つかの上皮癌で高く、β-カテニンの活性化がこのような癌のリガンド活性化に続発することを示唆する65、78-83。Wnt/β-カテニン経路の恒常的活性化が癌細胞に幹細胞/前駆細胞の表現型を付与し得る証拠が存在する。結腸癌細胞系のβ-カテニン/TCF-4の阻害は、細胞周期阻害剤のp21cip-1の発現を誘起し、前記細胞が増殖を停止し、より分化した表現型を獲得するよう誘起した83。β-カテニン/TCF-4により転写活性される癌原遺伝子c-mycの強制発現は、p21cip-1の発現を阻害し、β-カテニン/TCF-4のシグナル伝達が遮断された際に結腸癌細胞の増殖を可能にし、細胞の増殖および分化の調節においてWntシグナル伝達をc-mycに結び付けた。多数の研究がWnt/β-カテニン経路を乳癌に関係させてきたが、β-カテニンの活性化突然変異はこの疾患では希少であり、この経路をヒトの乳癌に決定的に結び付ける研究はない84-89。
HSCおよび恐らく複数組織から得る幹細胞の自己再生の調節におけるNotch、Wnt、c-myc、およびShhなどの遺伝子の役割の含意は、多数の種類の正常な体細胞幹細胞及び癌幹細胞に共通の自己再生経路が存在し得ることを示唆する。これらの経路が働く分子機構を同定し、前記経路が正常幹細胞および癌細胞の自己再生を調節するために相互作用するか否かを解決することは重要である。
Wnt経路は正常幹細胞の自己再生に関与し、Wntの活性化突然変異はマウスで乳癌を誘発する。この経路は数人の患者から単離されたヒト乳癌幹細胞による腫瘍の形成に役割を果たす。さらに、証拠は、腫瘍を形成する異なる乳癌細胞集団の能力が違うことを示唆する。興味深いことに、Wnt/frizzled/β-カテニン経路の構成員の発現は異なる癌細胞集団により多様に発現し、経路の特定構成員の発現は腫瘍を形成する能力と相関し得る。
癌細胞および腫瘍細胞の異なる集団は乳癌細胞の増殖を推進する。活性化されたβ-カテニンは有意な数の患者の癌細胞で見られる。恒常的に活性なこの経路を有する癌細胞を含む腫瘍は、恒常的に活性なβ-カテニンを含まないものと異なって振舞う。
II.ヒト乳癌の異種移植モデル
細胞系は癌細胞の分子変化および生化学的変化の本発明者らの理解に著しい利点をもたらしてきたが、効果的な癌治療の検証に使用することは幾分限られている90、91。細胞系はデノボ腫瘍における薬効の不完全な予測因子である90、91。幾つかの因子はこの欠陥の原因となる可能性がある。癌細胞系は組織培養で増殖するよう特異的に適応する癌細胞の亜集団から選択され、これらの細胞系の生物学的性質および機能的性質は劇的に変化し得る92-95。さらに、ごく少数の乳癌腫瘍から得る癌細胞は細胞系または異種移植腫瘍を確立する96、97。これらの細胞系の表現型特性および機能特性はインビボでのそれらの性質に比べて劇的に変化し得る94。例えば、正常造血細胞および白血病組織培養細胞の両方のマーカー発現は、組織培養で急速に変化でき、それらが由来する起源の幹細胞のものをしばしば反映しない92、94、95、98。培養で正常な幹細胞を増殖できる条件が発明されても、前記条件は、培養の幹細胞がインビボで存在する細胞集団の階層を再現しない方法で、しばしば自己再生または分化を促進する。総合すれば、これらの観察は、癌細胞系の生物学的性質が前記系が由来する癌細胞と著しく異なり得ることを示唆する。これはおそらく何故前記細胞系がしばしば病院で薬物効果の貧弱な予測因子であるかを少なくとも部分的に説明する。
従って、初期のヒト乳癌細胞をインビトロまたはインビボで長期間構成的に増殖させるのに効果的な方法が欠如することにより、この疾患の生物学を理解する能力が大幅に制限されてきた。最も効率的な異種移植モデルはSCIDマウスの乳房でなく卵巣、脂肪体において前記時間の約60〜75％での乳癌腫瘍片の移植を報告する99。解離細胞の移植はこのモデルで可能ではなく、胸水から単離される癌細胞は前記時間の約10％で免疫欠損マウスに腫瘍をただ形成するだけである90。本発明（下記の実施例1を参照）は、重症な免疫欠損マウスの乳腺において腫瘍注射により初期乳腫瘍から腫瘍を確立できる異種移植モデルを提供する。本発明のこれらの異種移植により、生物学的試験および分子学的試験を行い、クローン性乳癌細胞および他の細胞の種類を特徴付けできる。重要なことには、本発明に従って成長した異種移植腫瘍は、前記腫瘍が由来したヒトの腫瘍で見出される表現型が多様な癌細胞の種類を含み、異なる癌細胞集団は腫瘍を形成する能力において著しく異なる100。
本発明の効果的な異種移植モデルの開発（例えば実施例1を参照）により、患者から得られる解離した充実性腫瘍細胞は、初めて腫瘍を確実に形成できる。重要なことには、これにより、個々の患者の癌細胞における生化学的経路を常套的に分析でき、デノボのヒト充実性腫瘍癌細胞による腫瘍形成時の特定遺伝経路の細胞結末の理解を可能にする分子操作を実施できる。
III.充実性腫瘍幹細胞の癌マーカー
本発明は、その発現が充実性腫瘍幹細胞で特異的に変化する（例えば上方制御または下方制御される）マーカーを提供する。このようなマーカーは種々の癌（例えば乳癌）の診断および特徴付けおよび改変（例えば治療標的化）での使用を見出す。
下記に提供される実施例4は充実性腫瘍癌マーカーを同定するために用いられる方法を記載する。好ましい癌マーカーは表4〜8、およびNotch4で下記に提供される。これらの表は遺伝子名を提供し、本発明が、本発明の治療方法および診断方法および組成物における、核酸配列およびそれによりコードされるペプチド、ならびに核酸およびペプチドの断片の両方の使用を意図することに留意される。
（表４）UPTG対UPNTGにおいて上方制御される
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（表５）UPTG対HSCにおいて上方制御される
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（表６）UPTG対UPNTGにおいて下方制御される
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（表７Ａ）未継代（un-passaged）腫瘍原性対HSCにおいて上方制御される遺伝子
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（表７Ｂ）未継代腫瘍原性対HSCにおいて下方制御される遺伝子
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（表７Ｃ）継代腫瘍原性対HSCにおいて上方制御される遺伝子
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（表７Ｄ）継代腫瘍原性対HSCにおいて下方制御される遺伝子
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（表８）好ましい充実性腫瘍幹細胞の癌マーカー
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更なる充実性腫瘍幹細胞の癌マーカーは、例えば下記の実施例4に記載される方法を用いて同定され得る。
IV.充実性腫瘍幹細胞の癌マーカーの検出
ある態様において、本発明は幹細胞癌マーカー（例えば乳癌幹細胞癌マーカー）の発現の検出方法を提供する。好ましい態様において、発現は直接測定される（例えばRNAまたはタンパク質のレベルで）。ある態様において、発現は組織試料（例えば生検組織）で検出される。他の態様において、発現は体液（例えば血漿、血清、全血、粘液および尿を含むが、これらに限定されない）で検出される。本発明はさらにマーカーを検出するためのパネルおよびキットを提供する。好ましい態様において、幹細胞癌マーカーの存在は被験体に予後を提供するために用いられる。提供される情報は治療方針を指示するためにも用いられる。例えば、被験体が充実性腫瘍幹細胞（例えば表4〜8を参照）を示すマーカーを有することが見出される場合、さらなる治療（例えばホルモン療法または放射線療法）が、効果的な可能性が高い初期の時点（例えば転移前）で開始され得る。その上、被験体がホルモン療法に反応しない腫瘍を有することが見出される場合、前記治療の費用および不都合が回避できる。
本発明は上述するマーカーに限定されない。癌または癌の進行に相関する任意の適切なマーカーが利用されてもよい。追加のマーカーも本発明の範囲内に包含される。下記の事例的な実施例4で記載するものを含むが、これに限定されない、本発明の方法で使用するのに適した癌マーカーを同定し特徴づけするために、任意の適切な方法が利用されてもよい。例えば、ある態様において、本発明の遺伝子発現マイクロアレイ方法を用いて充実性腫瘍幹細胞で上方制御または下方制御されるものとして同定されるマーカーは、組織マイクロアレイ、免疫組織化学、ノーザン・ブロット分析、siRNAまたはアンチセンスRNAの阻害、突然変異分析、臨床転帰を用いた発現の調査、ならびに本明細書で開示される他の方法を用いて、さらに特徴付けされる。
ある態様において、本発明は複数のマーカーの分析用パネルを提供する。パネルは発癌および/または転移と相関する複数のマーカーの同時分析を可能にする。被験体に応じて、パネルは、最善の診断および予後を提供するために、単独でまたは組み合わせて分析され得る。パネルに含むマーカーは、下記の事例的な実施例に記載するものを含むが、これに限定されない任意の適切な方法を用いて、予測値についてスクリーニングすることにより、選択される。
1.RNAの検出
幾つかの好ましい態様において、充実性腫瘍幹細胞の癌マーカー（例えば、表4〜8に開示されるものを含むが、これに限定されない）の検出は、組織試料（例えば乳癌組織）における相当するmRNAの発現を測定することにより検出される。mRNAの発現は、下記に開示されるものを含むが、これに限定されない、任意の適切な方法により測定され得る。
ある態様において、RNAはノーザン・ブロット分析により検出される。ノーザン・ブロット分析はRNAの分離および相補的な標識プローブのハイブリダイゼーションを含む。
さらなる態様において、RNA（または対応するcDNA）はオリゴヌクレオチド・プローブへのハイブリダイゼーションにより検出される。ハイブリダイゼーションおよび検出の様々な技法を用いる種々のハイブリダイゼーション検定が利用できる。例えば、ある態様において、TaqMan検定（PE Biosystems, Foster City, CA; 例えば米国特許第5,962,233号および第5,538,848号を参照、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる）が利用される。前記検定はPCR反応中に実施される。TaqMan検定はAMPLITAQ GOLD DNAポリメラーゼの5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を活用する。5’-レポーター色素（例えば蛍光色素）および3’-消光剤色素を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブはPCR反応に含まれる。PCR中、プローブがその標的に結合する場合、AMPLITAQ GOLDポリメラーゼの5’-3’核酸分解活性がレポーターと消光剤色素の間でプローブを切断する。消光剤色素からのレポーター色素の分離は蛍光の増加をもたらす。シグナルは、PCRの各周期とともに蓄積し、蛍光光度計で観察できる。
更なる他の態様において、逆転写酵素PCR(RT-PCR)はRNAの発現を検出するために用いられる。RT-PCRにおいて、RNAは逆転写酵素を用いて相補的DNAすなわち「cDNA」に酵素的に変換される。次いで、cDNAはPCR反応中に鋳型として用いられる。PCR産物は、ゲル電気泳動およびDNA特異的染色を用いた染色または標識プローブへのハイブリダイゼーションを含むが、これらに限定されない、任意の適切な方法により検出できる。ある態様において、米国特許第5,639,606号、第5,643,765号、および第5,876,978号（それぞれが参照により本明細書に組み入れられる）に記載される競合鋳型方法の規格混合物を用いた定量的逆転写酵素PCRが利用される。
2.タンパク質の検出
他の態様において、幹細胞癌マーカーの遺伝子発現は対応するタンパク質またはポリペプチドの発現を測定することにより検出される。タンパク質の発現は任意の適切な方法により検出され得る。ある態様において、タンパク質は免疫組織化学により検出される。他の態様において、タンパク質は前記タンパク質に対して生じる抗体への結合により検出される。抗体の作製は下記に記載する。
抗体の結合は当技術分野において公知の技法（例えば、放射免疫検定、ELISA(酵素免疫吸着検定)、「サンドイッチ」免疫検定、免疫放射定量測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散検定、インサイチュー免疫検定（例えばコロイド金、酵素、または放射性同位体標識を用いて）、ウェスタン・ブロット、沈降反応、凝集検定（例えばゲル凝集検定、血球凝集検定など）、補体結合検定、免疫蛍光検定、プロテインA検定、および免疫電気泳動検定など）により検出される。
一つの態様において、抗体の結合は一次抗体の標識を検出することにより検出される。他の態様において、一次抗体は一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することにより検出される。さらなる態様において、二次抗体が標識される。免疫検定での結合を検出する多数の方法が当技術分野において知られており本発明の範囲内にある。
ある態様において、自動検出検定が利用される。免疫検定の自動化の方法は米国特許第5,885,530号、第4,981,785号、第6,159,750号、および5,358,691号に記載するものを含み、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる。ある態様において、結果の分析および提示も自動化される。例えば、ある態様において、癌マーカーに対応する一連のタンパク質の有無に基づいた予後を作成するソフトウェアが利用される。
他の態様において、米国特許第5,599,677号および第5,672,480号に記載される免疫検定；それぞれが参照により本明細書に組み入れられる。
3.データ分析
ある態様において、コンピュータに基づく分析プログラムは、検出検定（例えば単数または複数の所与マーカーの存在、不在、または量）により作成された生データを臨床医にとって予測価値のあるデータに翻訳するために用いられる。臨床医は任意の適切な手段を用いた予測データにアクセスできる。従って、幾つかの好ましい態様において、本発明は、遺伝学または分子生物学に長けていそうにない臨床医が生データを理解する必要がないという更なる利点を提供する。データはその最も役立つ形態で臨床医に直接提示される。その結果、臨床医は被験体の治療を最適にするための情報を迅速に利用できる。
本発明は、検定を実施する研究室、情報提供者、医療関係者、および被験体との間で情報を受け取り、処理し、ならびに送信できる任意の方法を意図する。例えば、本発明のある態様において、試料（例えば生検または血清または尿の試料）が被験体から採取され、プロファイリング・サービス（例えば医療施設の臨床検査室、ゲノム・プロファイリング・ビジネスなど）に提出される。前記サービスは世界の任意の地域（例えば被験体が居住する国または情報が最終的に使用される国と異なる国）に位置し、生データを作成する。試料が組織または他の生体試料を含む場合、被験体は医療センターを訪れ、試料を採取されプロファイリング・センターに送られ得る。または被験体は試料を自身で収集しプロファイリング・センターへ直接送付してもよい。試料が以前に測定された生体情報を含む場合、前記情報は被験体により直接プロファイリング・サービスに送付され得る（例えば、前記情報を含む情報カードはコンピュータに読み取られ、データは電子通信システムを用いてプロファイリング・センターのコンピュータに送信され得る）。プロファイリング・サービスにより一度受信されると、試料は処理され、被験体に望ましい診断または予後の情報に特異的なプロファイル（例えば発現データ）が作成される。
次いでプロファイル・データは治療医師による解釈に適した形式で作成される。例えば、生の発現データ（例えば表4〜8に記載される幾つかのマーカーを試験する）を提供するよりもむしろ、作成される形式は、具体的な治療選択肢の推薦とともに、被験体についての診断または危険性評価を示してもよい。前記データは任意の適切な方法により医師に表示され得る。例えば、ある態様において、プロファイリング・サービスは（例えば治療時に）臨床医に印刷できる報告書またはコンピュータ・モニターで臨床医に表示できる報告書を作成する。
ある態様において、前記情報はまず治療時にまたは局所施設で分析される。次いで、生データは、さらなる分析のため、ならびに/または生データを臨床医または患者に役立つ情報に変換するため、中央処理設備に送られる。中央処理設備は、プライバシー（全てのデータは画一なセキュリティー・プロトコルを備えた中央設備で保存される）、速度、およびデータ分析の一貫性という利点を提供する。次いで中央処理設備は、被験体の治療後に、データの運命を統制できる。例えば、電子通信システムを用いて、中央設備は臨床医、被験体、または研究者にデータを提供できる。
ある態様において、被験体は電子通信システムを用いてデータに直接アクセスできる。被験体は結果に基づいて更なる介入またはカウンセリングを選択してもよい。ある態様において、データは研究用途に用いられる。例えば、データは疾患の具体的な状態または段階の有用な指標としてマーカーの包含または排除をさらに最適にするために用いられ得る。
4.キット
更なる他の態様において、本発明は癌の検出および特徴づけのため（例えば表4〜8に示される一つまたは複数のマーカーを検出するため、または表4〜8に示される一つまたは複数のマーカーにより発現するペプチドの活性を調節するため）のキットを提供する。ある態様において、キットは検出試薬および緩衝液に加えて癌マーカーに特異的な抗体を含む。他の態様において、キットはmRNAまたはcDNAの検出に特異的な試薬を含む（例えばオリゴヌクレオチド・プローブまたはプライマー）。好ましい態様において、キットは、あらゆる対照、検定を実施するための取扱説明書、および結果の分析および提示に必要な任意のソフトウェアを含む、検出検定を実施するために必要な構成要素の全てを含む。
5.インビボ撮像
ある態様において、インビボ撮像技術は動物（例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物）での癌マーカーの発現を可視化するために用いられる。例えば、ある態様において、癌マーカーのmRNAまたはタンパク質は癌マーカーに特異的な標識抗体を用いて標識される。特異的に結合し標識された抗体は、放射性核種撮像、陽電子放出断層撮影、コンピュータ体軸断層撮影、X線または磁気共鳴の撮像法、蛍光検出、および化学発光検出を含むが、これらに限定されない、インビボ撮像法を用いて、個体で検出できる。本発明の癌マーカーに対する抗体を作製する方法は以下に記載する。
本発明のインビボ撮像法は、本発明の充実性腫瘍幹細胞癌マーカーを発現する癌（例えば乳癌）の診断に役立つ。インビボ撮像は癌を示すマーカーの存在を可視化するために用いられる。このような技術は不快な生検を用いない診断を可能にする。本発明のインビボ撮像法は癌患者に予後を提供するためにも役立つ。例えば、癌幹細胞を示すマーカーの存在が検出できる。本発明のインビボ撮像法は更に他の身体部分の転移癌を検出するために用いられ得る。
ある態様において、本発明の癌マーカーに特異的な試薬（例えば抗体）は蛍光標識される。標識抗体は被験体に（例えば経口または非経口で）導入される。蛍光標識された抗体は任意の適切な方法を用いて（米国特許第6,198,107号に記載される装置を用いて、参照により本明細書に組み入れられる）検出される。
他の態様において、抗体は放射性標識される。インビボ診断に抗体を使用することは当技術分野において周知である。Sumerdon et al.（Nucl. Med. Biol 17:247-254[1990]）は、標識としてインジウム-111を用いた腫瘍の放射免疫シンチグラフィ撮像用の抗体-キレート剤を記載し最適化した。Griffin et al.（J Clin Onc 9:631-640[1991]）は再発性結腸直腸癌の疑いがある患者に腫瘍を検出する際の前記剤の使用を記載している。磁気共鳴撮像に標識としての常磁性イオンとともに類似の剤を使用することは当技術分野において知られている（Lauffer, Magnetic Resonance in Medicine 22:339-342[1991]）。使用される標識は選択される画像診断法に応じて変わるだろう。インジウム-111、テクネチウム-99m、またはヨウ素-131などの放射性標識は平面走査または単光子放出コンピュータ断層撮影（SPECT）に使用できる。フッ素-19などの陽電子放射標識も陽電子放出断層撮影（PET）に使用できる。MRIについては、ガドリニウム（III）またはマンガン（II）などの常磁性イオンが使用できる。
スカンジウム-47（3.5日）、ガリウム-67（2.8日）、ガリウム-68（68分）、テクネチウム-99m（6時間）、およびインジウム-111（3.2日）など、1時間から3.5日に及ぶ半減期を有する放射性金属は、抗体への結合に利用される。そのうち、ガリウム-67、テクネチウム-99m、およびインジウム-111はガンマ・カメラ撮像に好ましく、ガリウム-68は陽電子放出断層撮影に好ましい。
このような放射性金属で抗体を標識する有用な方法は、例えば、In-111およびTc-99mについてKhaw et al.（Science 209:295[1980]）により、ならびにScheinberg et al.（Science 215:1511[1982]）により記載されるように、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）などの二官能性キレート剤を用いる。他のキレート剤も使用され得るが、1-（p-カルボキシメトキシベンジル）EDTAおよびDTPAの無水カルボキシ炭酸が好都合であり、なぜなら、それらの使用は実質的に抗体の免疫反応性に影響することなく結合できるからである。
タンパク質にDPTAを結合する他の方法は、In-111によるアルブミンの標識についてHnatowich et al.（Int. J. Appl. Radiat. Isot. 33:327[1982]）が記載するように、DTPAの環状無水物の使用によるが、これは抗体の標識に適応できない。DPTAによるキレート化を用いないでTc-99mで抗体を標識する適切な方法は、Crockford et al.（米国特許第4,323,546号、参照により本明細書に組み入れられる）の前もって錫めっきする方法である。
Tc-99mで免疫グロブリンを標識する好ましい方法は、血漿タンパク質についてWong et al.（Int. J. Appl. Radiat. Isot., 29:251[1978]）により記載される方法、および最近Wong et al.（J. Nucl. Med., 23:229[1981]）により首尾よく抗体標識に適応された方法である。
特異的抗体に結合した放射性金属の場合、その免疫特異性を破壊することなく、できるだけ高比率の放射標識を抗体分子に導入することがさらに望ましい。本発明の特異的な幹細胞癌マーカーの存在下で放射標識することにより、更なる改良が達成され、抗体の抗原結合部位が保護されることを保証し得る。
更なる態様において、インビボバイオフォトニック撮像（Xenogen, Almeda, CA）がインビボ撮像に利用される。このリアルタイム・インビボ撮像はルシフェラーゼを利用する。ルシフェラーゼ遺伝子は、細胞、微生物、および動物に（例えば、本発明の癌マーカーとの融合タンパク質として）組み込まれる。活性時に、発光する反応に至る。CCDカメラおよびソフトウェアは画像を記録し分析するために用いられる。
V.抗体および抗体断片
本発明は単離された抗体および抗体断片（例えばFab）を提供する。好ましい態様において、本発明は、本明細書に記載する（例えば表4〜8に示されるような）幹細胞癌マーカーの少なくとも5、または少なくとも15のアミノ酸残基からなる単離ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体または抗体断片を提供する。これらの抗体または抗体断片は本明細書に記載される診断方法、薬物スクリーニング方法、および治療方法での使用（例えば、幹細胞の癌マーカー・ペプチドの活性を検出または調節するため）を見出す。
本発明のタンパク質に対する抗体または抗体断片は、前記タンパク質を認識できる限り、任意のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。抗体は、従来の抗体または抗血清の調製過程に従って、抗原としての本発明のタンパク質を用いることにより作製できる。
本発明はモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方の使用を意図する。任意の適切な方法は、本明細書に開示されるものを含むが、これらに限定されない、本発明の方法および組成物で使用される抗体を作製するために用いられ得る。例えば、モノクローナル抗体の調製については、タンパク質、それ自体として、または適切な担体もしくは希釈剤とともに、抗体を産生できる条件下で、動物（例えば哺乳動物）に投与される。抗体産生能を強化するために、完全または不完全フロイント・アジュバントが投与され得る。通常、前記タンパク質は、2週から6週毎に1度、全部で約2回から約10回、投与される。このような方法での使用に適した動物は、霊長類、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどを含むが、これらに限定されない。
モノクローナル抗体を産生する細胞を調製するため、抗体力価が確認されている個々の動物（例えばマウス）が選択され、最終免疫の2日後から5日後に、その脾臓またはリンパ節が採取され、そこに含まれる抗体産生細胞は骨髄腫細胞と融合され、所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを調製する。抗血清の抗体力価の測定は、例えば、以下の本明細書に記載されるような標識タンパク質と抗血清を反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより、実施できる。細胞融合は、公知の方法、例えばKoehlerおよびMilstein（Nature 256:495[1975]）により記載される方法に従って実施できる。融合プロモーターとして、例えばポリエチレングリコール（PEG）またはセンダイ・ウイルス（HVJ）、好ましくはPEGが使用される。
骨髄腫細胞の例は、NS-1、P3U1、SP2/0、AP-1などを含む。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数の割合は約1：1から約20：1が好ましい。PEG（好ましくはPEG 1000-PEG 6000）は約10％から約80％の濃度で添加されることが好ましい。細胞融合は、約20℃から約40℃、好ましくは約30℃から約37℃で約1分間から10分間両細胞の混合物をインキュベートすることにより効率的に実施できる。
抗体（例えば腫瘍抗原または本発明の自己抗体に対する）を産生するハイブリドーマをスクリーニングするために種々の方法が用いられ得る。例えば、抗体が直接または担体とともに吸着する固相（例えばマイクロプレート）にハイブリドーマの上清が添加される場合、次いで、放射活性物質または酵素で標識された抗免疫グロブリン抗体（マウス細胞が細胞融合に使用される場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が使用される）またはプロテインAが添加され、固相に結合したタンパク質に対するモノクローナル抗体を検出する。または、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインAが吸着する固相にハイブリドーマの上清が添加されると、放射活性物質または酵素で標識されたタンパク質が添加され、固相に結合したタンパク質に対するモノクローナル抗体を検出する。
モノクローナル抗体の選択は任意の既知方法またはその変形版に従って実施できる。通常、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用の培地が用いられる。ハイブリドーマが増殖できる限り、任意の選択培地および増殖培地が使用できる。例えば、1％から20％、好ましくは10％から20％のウシ胎仔血清を含むRPMI 1640培地、1％から10％のウシ胎仔血清を含むGIT培地、ハイブリドーマ（SFM-101、日水製薬）培養用の無血清培地などが使用できる。通常、培養は20℃から40℃、好ましくは37℃で、約5日から3週間、好ましくは1週間から2週間、約5％CO2ガスの下で実施できる。ハイブリドーマ培養の上清の抗体力価は、抗血清における抗タンパク質の抗体力価に関して上述するものと同様な様式に従って測定できる。
モノクローナル抗体（例えば本発明の癌マーカーに対する）の分離および精製は、免疫グロブリンの分離および精製、例えば塩析、アルコール沈降、等電点沈降、電気泳動、イオン交換体（例えばDEAE）を用いた吸着および脱着、超遠心分離、ゲル濾過などの従来のポリクローナル抗体と同様な様式、または抗原結合固相などの活性吸着材、プロテインAもしくはプロテインGおよび前記結合の解離を用いて抗体のみが収集される特異的な精製方法に従って実施でき、抗体を得る。
ポリクローナル抗体は、患者から抗体を得る工程を含む任意の既知の方法、または前記方法の変形版により調製され得る。例えば、免疫原（タンパク質に対する抗原）と担体タンパク質の複合体が調製され、上記のモノクローナル抗体の調製に関して記載されるものと同様な様式に従って、動物は前記複合体を免疫される。前記抗体を含む物質は免疫動物から回収され、前記抗体は分離および精製される。
動物の免疫に使用される免疫原および担体タンパク質の複合体に関して、担体と架橋し免疫に使用されるハプテンに対する抗体が効率的に産生される限り、任意の担体タンパク質および任意の混合比率の担体とハプテンが使用できる。例えば、ウシ血清アルブミン、ウシ・シクログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニンなどは、ハプテン1部当たり約0.1部から約20部、好ましくは約1部から約5部の重量比でハプテンに結合し得る。
さらに、種々の縮合剤がハプテンおよび担体の結合に使用できる。例えば、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性化エステル、チオール基またはジチオピリジル基を含む活性化エステル試薬などは本発明との併用を見出す。縮合産物は、それ自体または適切な担体もしくは希釈剤とともに、抗体産生できる動物の部位に投与される。抗体産生能を強化するため、完全または不完全フロイント・アジュバントが投与されてもよい。通常、前記タンパク質は2週から6週に1回、合計で約3回から約10回投与される。
ポリクローナル抗体は上記方法により免疫された動物の血液、腹水などから回収される。抗血清の抗体力価はハイブリドーマ培養の上清に関して上述するものと同様な様式に従って測定できる。抗体の分離および精製は、上記のモノクローナル抗体に関して記載するものと同様な免疫グロブリンの分離方法および精製方法に従って実施できる。
免疫原として本明細書で用いられるタンパク質は、任意の特定の種類の免疫原に限定されない。例えば、本発明の幹細胞の癌マーカー（一部変更したヌクレオチド配列を有する遺伝子をさらに含む）は免疫原として使用できる。さらに、タンパク質の断片が使用されてもよい。断片は、遺伝子断片の発現、タンパク質の酵素処理、化学合成などを含むが、これらに限定されない任意の方法により得られ得る。抗体および抗体断片は治療（例えば癌細胞を死滅させる化合物）と結び付けてもよい。この点において、幹細胞癌マーカーの一つに向けられる抗体は充実性腫瘍癌細胞に治療剤を特異的に送達するために用いられる（例えば前記細胞の増殖を阻害するため、または前記細胞を死滅させるため）。
VI.薬物スクリーニング
ある態様において、本発明は薬物スクリーニングアッセイを提供する（例えば抗癌薬をスクリーニングするため）。本発明のスクリーニング方法は本発明の方法を用いて同定された幹細胞癌マーカーを使用する（例えば表4〜8に示される幹細胞癌マーカーを含むが、これらに限定されない）。例えば、ある態様において、本発明は幹細胞癌マーカー遺伝子の発現を変化させる（例えば増減させる）化合物をスクリーニングする方法を提供する。ある態様において、候補化合物は癌マーカーに向けられるアンチセンス剤またはsiRNA剤（例えばオリゴヌクレオチド）である。他の態様において、候補化合物は本発明の幹細胞癌マーカーに特異的に結合する抗体である。ある態様において、小分子の化合物のライブラリーは本明細書に記載する方法を用いてスクリーニングされる。
一つのスクリーニング方法において、候補化合物は、幹細胞癌マーカーを発現する細胞と化合物を接触させた後、発現に及ぼす候補化合物の影響を検定することにより、幹細胞癌マーカーの発現を変化させる能力について評価される。ある態様において、癌マーカー遺伝子の発現に及ぼす候補化合物の影響は、前記細胞により発現する癌マーカーmRNAのレベルを検出することにより検定される。mRNAの発現は任意の適切な方法により検出できる。他の態様において、癌マーカー遺伝子の発現に及ぼす候補化合物の影響は、癌マーカーによりコードされるポリペプチドのレベルを測定することにより検定される。発現するポリペプチドのレベルは、本明細書に開示される方法を含むが、これらに限定されない、任意の適切な方法を用いて測定できる。ある態様において、細胞生物学の他の変化（例えばアポトーシス）が検出される。
具体的には、本発明は、モジュレータ、即ち本発明の癌マーカーに結合する、または前記マーカーと関連するシグナル伝達もしくは機能を変化させる、例えば幹細胞癌マーカーの発現もしくは癌マーカーの活性に阻害（もしくは刺激）影響を及ぼす、または例えば癌マーカー基質の発現もしくは活性に刺激もしくは阻害の影響を及ぼす、候補または試験の化合物または剤（例えばタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド、小分子または他の薬物）を同定するためのスクリーニング方法を提供する。従って、同定される化合物は、治療プロトコルで直接的にあるいは間接的に標的遺伝子産物（例えば幹細胞癌マーカー遺伝子）の活性を調節するために、標的遺伝子産物の生物学的機能を詳述するために、または正常な標的遺伝子の相互作用を破壊する化合物を同定するために使用できる。癌マーカーの活性または発現を阻害する化合物は、増殖性障害、例えば癌、具体的には転移性癌の治療、または腫瘍幹細胞の除去もしくは制御に役立ち、癌の危険性を予防または低減する。
一つの態様において、本発明は癌マーカーのタンパク質またはポリペプチドまたはそれらの生体活性部分の基質である候補化合物または試験化合物をスクリーニングする検定を提供する。他の態様において、本発明は癌マーカーのタンパク質またはポリペプチドまたはその生体活性部分の活性に結合するまたは調節する候補化合物または試験化合物をスクリーニングする検定を提供する。
本発明の試験化合物は、生物ライブラリー；ペプトイド・ライブラリー（ペプチドの機能性を有する分子のライブラリーだが、酵素分解に耐性がある新規の非ペプチド骨格を備え、酵素分解にも関わらず依然生体活性がある；Zuckennann et al., J. Med. Chem. 37:2678-85[1994]を参照）；空間的にアドレス可能な並列固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを要する合成ライブラリー法；1ビーズ1化合物ライブラリー法；およびアフィニティー・クロマトグラフィー選別を用いる合成ライブラリー法を含む、当技術分野において知られる組み合わせライブラリー方法における多数の研究方法のいずれかを用いて得られる。生物ライブラリーおよびペプトイド・ライブラリーの研究方法はペプチド・ライブラリーとともに使用に好ましい一方、残りの4つの研究方法は化合物のペプチド・ライブラリー、非ペプチド・オリゴマー・ライブラリーまたは小分子ライブラリーに適応できる（Lam(1997)Anticancer Drug Des. 12:145）。
分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野において、例えばDeWitt et al., Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A.90:6909[1993]; Erb et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 91:11422[1994]; Zuckermann et al., J. Med. Chem.37:2678[1994]; Cho et al., Science 261:1303[1993]; Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33.2059[1994]; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061[1994]; およびGallop et al., J. Med. Chem. 37:1233[1994]に見出せる。
化合物のライブラリーは、溶液（例えばHoughten, Biotechniques 13:412-421[1992]）、またはビーズ（Lam, Nature 354:82-84[1991]）、チップ（Fodor, Nature 364:555-556[1993]）、細菌もしくは胞子（米国特許第5,223,409号；参照により本明細書に組み入れられる）、プラスミド（Cull et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:18651869[1992]）またはファージ（ScottおよびSmith, Science 249:386-390[1990]; Devlin Science 249:404-406[1990]; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382[1990]; Felici, J. Mol. Biol. 222:301[1991]）で提示され得る。
ある態様において、検定は細胞に基づく検定であり、前記検定において、幹細胞癌マーカータンパク質またはその生体活性部分を発現する細胞は試験化合物と接触し、試験化合物の癌マーカーの活性を調節する能力が測定される。試験化合物の幹細胞癌マーカーの活性を調節する能力を測定することは、例えば酵素活性の変化を観察することにより達成できる。細胞は、例えば、哺乳動物起源であり得る。
化合物、例えば幹細胞癌マーカー基質に結合する癌マーカーを調節する試験化合物の能力も評価できる。これは、化合物（例えば基質）の癌マーカーへの結合が複合体において標識化合物（例えば基質）を検出することにより測定できるように、例えば前記化合物（例えば基質）と放射性同位体標識または酵素標識とを結合することにより達成できる。
または、幹細胞癌マーカーは放射性同位体または酵素の標識と結合し、複合体の癌マーカー基質に結合する癌マーカーを調節する試験化合物の能力を観察する。例えば、化合物（例えば基質）は直接的または間接的に125I、35S、14C、または3Hで標識でき、放射性同位体は放射放出の直接計数によりまたはシンチレーション計数により検出される。または、化合物は、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素標識でき、酵素標識は適切な基質から産物への変換の測定により検出される。
反応体のいずれかを標識してまたは標識せずに、幹細胞癌マーカーと相互作用する化合物（例えば幹細胞癌マーカー基質）の能力が評価され得る。例えば、化合物または癌マーカーのいずれかを標識せずに癌マーカーと化合物の相互作用を検出するためにマイクロフィジオメーター（microphysiometer）が使用できる（McConnell et al., Science 257:1906-1912[1992]）。本明細書で用いられるように、「マイクロフィジオメーター（例えばサイトセンサー（Cytosensor））」は、細胞が光でアドレス可能な電位差センサー（LAPS）を用いてその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は化合物と癌マーカーの相互作用の指標として用いることができる。
更なる他の態様において、無細胞検定が提供される。前記検定では、癌マーカータンパク質またはその生体活性部分が試験化合物と接触し、幹細胞癌マーカータンパク質またはその生体活性部分に結合する試験化合物の能力が評価される。本発明の検定で用いられる癌マーカータンパク質の好ましい生体活性部分は、基質または他のタンパク質、例えば高い表面確率点（surface probability score）を有する断片との相互作用に加わる断片を含む。
無細胞検定は、二つの構成要素が相互作用ならびに結合でき、従って除去ならびに/または検出され得る複合体を形成するのに十分な条件下および時間で標的遺伝子タンパク質と試験化合物の反応混合物を調製する工程を含む。
二分子間の相互作用も、例えば蛍光エネルギー移動（FRET）（例えばLakowicz et al., 米国特許第5,631,169号；Stavrianopoulos et al., 米国特許第4,968,103号を参照；それぞれが参照により本明細書に組み入れられる）を用いて検出できる。蛍光標識は、第一供与分子の放出する蛍光エネルギーが第二「受容」分子の蛍光標識により吸収され、次に吸収エネルギーにより蛍光を発することができるように、選択される。
または、「供与」タンパク質分子は単にトリプトファン残基の自然蛍光エネルギーを利用してもよい。「受容」分子の標識が「供与体」の標識と識別され得るように、異なる光の波長を放出する標識が選択される。標識間のエネルギー移動の効率は分子を隔てる距離に関係するため、前記分子間の空間関係が見極められ得る。分子間の結合が起きる状況で、15の検定における「受容」分子の標識の蛍光発光が最大であるべきである。FRET結合事象は当技術分野において周知の標準的な蛍光検出手段を通して（例えば蛍光光度計を用いて）簡便に測定できる。
他の態様において、幹細胞癌マーカータンパク質の標的分子に結合する能力を測定することは、リアルタイムのBiomolecular Interaction Analysis（BIA）を用いて達成できる（例えば、SjolanderおよびUrbaniczky, Anal. Chem.63:2338-2345[1991]およびSzabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705[1995]を参照）。「表面プラズマ共鳴」または「BIA」は、いずれの反応体（例えばBIAcore）も標識せずに、リアルタイムで生体特異的相互作用を検出する。結合表面の質量（結合事象を示す）の変化は表面近くの光の屈折率の変動をもたらし（表面プラズマ共鳴（SPR）の光学現象）、生体分子間のリアルタイム反応の指標として用いられ得る検出シグナルに結実する。
一つの態様において、標的遺伝子産物または試験物質は固相に固定される。固相に固定された標的遺伝子産物/試験化合物の複合体は反応の終わりに検出できる。好ましくは、標的遺伝子産物は固相に固定でき、試験化合物（固定されていない）は本明細書で論じられる検出可能な標識で直接的または間接的に標識され得る。
前記タンパク質の一つまたは両方の非複合形態から複合形態の分離を促進するため、ならびに検定の自動化に適応するため、幹細胞癌マーカー、抗癌マーカー抗体またはその標的分子を固定することが望ましいかもしれない。幹細胞癌マーカータンパク質への試験化合物の結合、または候補化合物の存在下および不在下での標的分子と癌マーカータンパク質との相互作用は、反応体を含むのに適した任意の容器で達成できる。このような容器の例は、マイクロタイター・プレート、試験管、および超遠心分離管を含む。一つの態様において、タンパク質の一つまたは両方が基質に結合できるドメインを付加する融合タンパク質が提供され得る。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ-癌マーカー融合タンパク質またはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ/標的融合タンパク質は、グルタチオン・セファロース・ビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）またはグルタチオンで被覆されたマイクロタイター・プレートに吸着され得る。次いで、これらは、試験化合物、または試験化合物と非吸着標的タンパク質もしくは癌マーカータンパク質のいずれかと混合され、混合物は複合体形成に寄与する条件下で（例えば塩およびpHの生理条件で）インキュベートされる。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイター・プレート・ウェルは洗浄し、いずれの非結合構成要素、ビーズの場合は固定された基質も取り除き、複合体は、例えば上述するように、直接的または間接的に測定される。
または、複合体は基質から解離でき、癌マーカーの結合または活性のレベルは標準技法を用いて測定される。癌マーカータンパク質または標的分子のいずれかを基質に固定する他の技法はビオチンおよびストレプトアビジンの結合を用いる技法を含む。ビオチン化癌マーカータンパク質または標的分子は、当技術分野において知られる技法（例えばビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, EL）を用いてビオチン-NHS（N-ヒドロキシ-スクシンイミド）から調製され、ストレプトアビジンで被覆した96穴プレート（Pierce Chemical）のウェルに固定される。
前記検定を行うために、非固定構成要素は固定構成要素を含む被覆表面に添加される。反応が終了した後、形成されるいずれの複合体も依然固体表面に固定しているような条件下で、未反応構成要素が（例えば洗浄により）取り除かれる。固体表面に固定される複合体の検出は幾つかの方法で達成できる。予め固定されていない構成要素が予め標識される場合、表面に固定された標識の検出は複合体が形成されたことを示す。予め固定されていない構成要素が予め標識されない場合、表面に固定される複合体を検出するために、例えば固定構成要素に特異的な標識抗体を用いて（前記抗体は、次いで、直接的に標識され得るまたは例えば標識抗IgG抗体で間接的に標識され得る）、間接標識が用いられ得る。
この検定は、幹細胞癌マーカータンパク質または標的分子と反応するが、その標的分子への幹細胞癌マーカータンパク質の結合を妨げない抗体を用いて実施される。このような抗体はプレートのウェルに被覆され得る。結合していない標的または癌マーカータンパク質は抗体の結合によりウェルに捕捉される。GSTで固定される複合体について上述する方法に加えて、前記複合体を検出する方法は、癌マーカータンパク質または標的分子と反応する抗体を用いた複合体の免疫検出、ならびに癌マーカータンパク質または標的分子と関連する酵素活性の検出に依存する酵素結合検定を含む。
または、無細胞検定は液相で行える。このような検定において、反応産物は、分画遠心（例えば、RivasおよびMinton, Trends Biochem Sci 18:284-7[1993]を参照）；クロマトグラフィー（ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー）；電気泳動（例えばAusubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: New Yorkを参照）；および免役沈降（例えばAusubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: New Yorkを参照）を含むが、これらに限定されない幾つかの標準技法のいずれかにより、未反応の構成要素から分離される。このような樹脂およびクロマトグラフィー技法は当業者に知られている（例えばHeegaard J. Mol. Recognit 11:141-8[1998]; Hageand Tweed J. Chromatogr. Biomed. Sci. App1 699:499-525[1997]を参照）。その上、溶液から複合体をさらに精製することなく結合を検出するため、蛍光エネルギー移動も、本明細書に記載するように、簡便に利用できる。
前記検定は、幹細胞癌マーカータンパク質またはその生体活性部分と癌マーカーに結合する公知化合物とを接触させて検定混合物を形成する工程、検定混合物と試験化合物を接触させる工程、および癌マーカータンパク質と相互作用する試験化合物の能力を測定する工程を含む。ここで、癌マーカータンパク質と相互作用する試験化合物の能力を測定する工程は、公知化合物と比べて、癌マーカーもしくはその生体活性部分に優先的に結合する試験化合物の能力、または標的分子の活性を調節する前記化合物の能力を測定する工程を含む。
幹細胞癌マーカーがタンパク質などの一つまたは複数の細胞高分子または細胞外高分子とインビボで相互作用し得る範囲内で、このような相互作用の阻害剤が役立つ。阻害剤を同定するために、同種の検定が用いられ得る。
例えば、標的遺伝子産物と、相互作用する細胞または細胞外の結合相手産物との予め形成される複合体は、標的遺伝子産物またはそれらの結合相手のいずれかが標識されるように調製されるが、標識により生成するシグナルは複合体形成により消光する（例えば免疫検定にこの研究方法を利用する米国特許第4,109,496号を参照、参照により本明細書に組み入れられる）。予め形成する複合体から得る種の一つと競合し置換する試験物質の添加は、バックグラウンドを上回るシグナルの生成をもたらす。このような方法で、標的遺伝子産物と結合する相手の相互作用を破壊する試験物質が同定できる。または、癌マーカータンパク質は、癌マーカーと結合または相互作用し（「癌マーカー結合タンパク質」すなわち「癌マーカー-bp」）ならびに癌マーカーの活性に関与する他のタンパク質を同定するために、2-ハイブリッド検定または3-ハイブリッド検定で「おとりタンパク質」として使用できる（例えば、米国特許第5,283,317号；Zervos et al., Cell 72:223-232[1993]; Madura et al., J. Biol. Chem.268.12046-12054[1993]; Bartel et al., Biotechniques 14:920-924[1993]; Iwabuchi et al., Oncogene 8:1693-1696[1993]; およびBrent WO94/10300; それぞれ参照により本明細書に組み入れられるを参照）。このような癌マーカー-bpは、例えば癌マーカーが媒介するシグナル伝達経路の下方要素として、癌マーカータンパク質または標的によるシグナルの活性剤または阻害剤であり得る。
癌マーカー発現の調節剤も同定できる。例えば、細胞または無細胞混合物は候補化合物と接触し、癌マーカーのmRNAまたはタンパク質の発現は、候補化合物の不在下の幹細胞癌マーカーのmRNAまたはタンパク質の発現レベルと比べて、評価される。癌マーカーのmRNAまたはタンパク質の発現がその不在下より候補化合物の存在下で高い場合、候補化合物は癌マーカーのmRNAまたはタンパク質の発現の刺激剤として同定される。または、癌マーカーのmRNAまたはタンパク質の発現がその不在下より候補化合物の存在下で低い（即ち統計的に有意に低い）場合、候補化合物は癌マーカーのmRNAまたはタンパク質の発現の阻害剤として同定される。癌マーカーのmRNAまたはタンパク質の発現レベルは癌マーカーのmRNAまたはタンパク質を検出する本明細書に記載の方法により測定できる。
調節剤は細胞に基づく検定または無細胞検定を用いて同定でき、癌マーカータンパク質の活性を調節する前記剤の能力は、インビボで、例えば疾患の動物モデルなどの動物（例えば前立腺癌または転移性前立腺癌を患う動物；もしくは前立腺癌の（例えばリンパ節、骨、もしくは肝臓への）転移に起因する癌を患う動物（例えばヒト）もしくは細胞から前立腺細胞の異種移植を受けた動物）または前立腺癌細胞系から得る細胞で確認できる。
本発明はさらに上述するスクリーニングアッセイ（例えば癌治療の下記の記載を参照）により同定される新規剤に関する。従って、このような剤を用いた治療の有効性、毒性、副作用、または作用機構を決定するために、適切な動物モデル（本明細書に記載するものなど）で、本明細書に記載する同定された剤（例えば癌マーカー調節剤、アンチセンス癌マーカー核酸分子、siRNA分子、癌マーカーに特異的な抗体、または癌マーカーの結合相手）をさらに使用することは本発明の範囲内である。さらに、上述するスクリーニングアッセイにより同定された新規剤は、例えば本明細書に記載するような治療に（例えば癌を患うヒトの患者を治療するために）使用できる。
VII.癌治療
ある態様において、本発明は癌（例えば乳癌）の治療を提供する。ある態様において、治療は癌マーカー（例えば表4〜8に示すものを含むが、これらに限定されない）を標的にする。
A.アンチセンス治療
候補の治療剤は薬物スクリーニングおよび研究用途における使用も見出す。ある態様において、本発明は幹細胞癌マーカーの発現を標的にする。例えば、ある態様において、本発明は、本発明の幹細胞癌マーカーをコードする核酸分子の機能を調節し、最終的に発現する癌マーカーの量を調節する際に使用する、オリゴマーのアンチセンス化合物、具体的にはオリゴヌクレオチド（例えば上述する薬物スクリーニング法で同定されるもの）を含む組成物を使用する。これは本発明の癌マーカーをコードする一つまたは複数の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することにより達成される。オリゴマー化合物とその標的核酸との特異的なハイブリダイゼーションは正常な核酸の機能を妨げる。標的核酸に特異的にハイブリダイズする化合物による前記核酸のこの機能調節は一般に「アンチセンス」と呼ばれる。妨げられるDNAの機能は複製および転写を含む。妨げれるRNAの機能は、例えば、タンパク質翻訳部位へのRNAの転座、RNAからタンパク質への翻訳、一つまたは複数のmRNA種を生じるRNAのスプライシング、およびRNAにより関与または促進され得る触媒活性などのあらゆる生体機能を含む。標的核酸機能によるこのような妨害の全体的効果は本発明の癌マーカーの発現調節である。本発明の文脈において、「調節」は遺伝子発現の増加（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。例えば腫瘍の増殖を潜在的に抑制するために、発現が阻害され得る。
アンチセンスのため特異的核酸を標的にすることが好ましい。本発明の文脈において、特定の核酸に対するアンチセンス化合物を「標的化する」ことは多段階の過程である。前記過程は、通常、その機能が調節されるべきである核酸配列の同定で始まる。これは、例えば、その発現が特定の障害または疾患の状態に関連する細胞遺伝子（または前記遺伝子から転写されるmRNA）、または感染物質から得る核酸分子であり得る。本発明において、標的は本発明の幹細胞癌マーカーをコードする核酸分子である。標的過程は、所望する効果、例えばタンパク質発現の検出または調節が起こるように、アンチセンス相互作用が生じる前記遺伝子内の単数または複数の部位を決定する工程も含む。本発明の文脈内において、好ましい遺伝子内部位は遺伝子のオープン・リーディング・フレーム（ORF）の翻訳開始コドンまたは終止コドンを包含する領域である。翻訳開始コドンは典型的には5’-AUG（転写されたmRNA分子において；対応するDNA分子においては5’-ATG）であるため、翻訳開始コドンは、「AUGコドン」、「開始コドン」または「AUG開始コドン」とも呼ばれる。小数の遺伝子は5’-GUG、5’-UUGまたは5’-CUG、および5’-AUAのRNA配列を有する翻訳開始コドンを有し、5’-ACGおよび5’-CUGはインビボで機能することが示された。従って、「翻訳開始コドン」および「開始コドン」という用語は、たとえどの場合の開始アミノ酸が概してメチオニン（真核生物で）またはホルミルメチオニン（原核生物で）であっても、多数のコドン配列を包含し得る。真核生物および原核生物の遺伝子は二つ以上の代替開始コドンを有し得る。これらのいずれか一つは、特定の細胞型もしくは組織で、または特定の条件下で、翻訳開始に優先的に用いられ得る。本発明の文脈において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、そのようなコドンの配列に関わらず、本発明の腫瘍抗原をコードする遺伝子から転写されるmRNA分子の翻訳を開始するためにインビボで用いられる単数または複数のコドンを指す。
遺伝子の翻訳終止コドン（または「終止コドン」）は3つの配列（即ち、5’-UAA、5’-UAGおよび5’-UGA；対応するDNA配列はそれぞれ5’-TAA、5’-TAGおよび5’-TGAである）の1つを有し得る。「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンから片方向（即ち5’または3’） に約25から約50の連続するヌクレオチドを包含するmRNAまたは遺伝子の一部を指す。同様に、「終止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンから片方向（即ち5’または3’） に約25から約50の連続するヌクレオチドを包含するmRNAまたは遺伝子の一部を指す。
オープン・リーディング・フレーム（ORF）または「コード領域」は、翻訳開始コドンと翻訳終止コドンの間の領域を指し、効果的に標的にされ得る領域でもある。他の標的領域は、翻訳開始コドンから5’方向のmRNAの部分を指すため、5’キャップ部位とmRNAの翻訳開始コドンの間のヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含む5’-非翻訳領域（5’UTR）、ならびに翻訳終止コドンから3’方向のmRNAの部分を指すため、翻訳終止コドンとmRNAの3’末端の間のヌクレオチドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含む3’-非翻訳領域（3’UTR）を含む。mRNAの5’キャップは5’-5’三リン酸結合を介してmRNAの5’の大半の残基と結合したN7-メチル化グアノシン残基を含む。mRNAの5’キャップ領域は5’キャップ構造自体およびキャップに隣接した最初の50ヌクレオチドを含むと考えられる。キャップ領域は好ましい標的領域でもあり得る。
幾つかの真核生物のmRNA転写産物は直接翻訳されるが、多くは、「イントロン」として知られ、翻訳される前に転写産物から切り出される一つまたは複数の領域を含む。残り（故に翻訳される）の領域は、「エキソン」として知られ、ともに継ぎ合わされ、連続なmRNA配列を形成する。mRNAスプライシング部位（すなわちイントロン-エキソン分岐点）は好ましい標的領域でもあり得る。前記部位は、異常スプライシングが疾患に関係する場合、または特定のmRNAスプライシング産物の過剰産生が疾患に関係する場合の状況で特に有用である。再配列または欠失による異常な融合分岐点も好ましい標的である。イントロンは、例えばDNAまたはmRNA前駆体を標的とするアンチセンス化合物の効果的な、故に好ましい標的領域でもあり得ることも見出された。
ある態様において、アンチセンス阻害の標的部位は市販のソフトウェア・プログラム（例えば、Biognostik, Gottingen, Germany; SysArris Software, Bangalore, India; Antisense Research Group, University of Liverpool, Liverpool, England; GeneTrove, Carlsbad, CA）を用いて同定される。他の態様において、アンチセンス阻害の標的部位は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第WO0198537A2号に記載されるアクセス可能部位（accessible site）法を用いて同定される。
一つまたは複数の標的部位が一度同定されると、所望の効果を得るため、標的に十分相補的な（即ち、十分によくハイブリダイズし十分な特異性を有する）オリゴヌクレオチドが選択される。例えば、本発明の好ましい態様において、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは開始コドンまたは開始コドンの付近を標的にする。
本発明の文脈において、アンチセンス組成物およびアンチセンス方法に関する「ハイブリダイゼーション」とは、相補的なヌクレオシド塩基間またはヌクレオチド塩基間のWatson-Crick、Hoogsteenまたは逆Hoogsteenの水素結合であり得る水素結合を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは水素結合の形成を介して対合する相補的な核酸塩基である。アンチセンス化合物の配列は特異的にハイブリダイズできるその標的核酸の配列に対して100％相補的である必要がないと理解される。アンチセンス化合物は、標的のDNA分子またはRNA分子への化合物の結合が標的のDNAまたはRNAの正常な機能を妨げ効用の喪失を惹起する場合にアンチセンス化合物は特異的にハイブリダイズでき、特異的な結合が望ましい条件下（即ち、インビボ検定または治療処置の場合の生理的条件下、およびインビトロ検定の場合、検定が実施される条件下）で非標的配列へのアンチセンス化合物の非特異的結合を回避する十分な程度の相補性がある。
アンチセンス化合物は一般に研究試薬および診断として用いられる。例えば、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を特異的に阻害でき、特定遺伝子の機能を解明するために使用できる。アンチセンス化合物は、例えば生体経路の様々な構成員の機能間を識別するためにも用いられる。
アンチセンスの特異性および感受性は治療用途にも適応される。例えば、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは動物およびヒトの病態の治療における治療部分として使用されている。アンチセンス・オリゴヌクレオチドはヒトに安全且つ効果的に投与されており、多数の臨床試験が現在進行中である。従って、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織、及び動物、特にヒトの治療についての治療計画に役立つよう設定できる有用な治療法であることが確立される。
アンチセンス・オリゴヌクレオチドはアンチセンス化合物の好ましい形態である一方、本発明は、下記に記載されるようなオリゴヌクレオチド模倣剤を含むが、これらに限定されない、他のオリゴマー・アンチセンス化合物を包含する。本発明のアンチセンス化合物は約8から約30の核酸塩基（即ち約8から約30の結合塩基）を含むことが好ましいが、より長い配列およびより短い配列の両方が本発明で使用され得る。特に好ましいアンチセンス化合物はアンチセンス・オリゴヌクレオチドであり、更により好ましくは、約12から約25の核酸塩基を含むものである。
本発明で有用な好ましいアンチセンス化合物の具体例は、修飾骨格または非天然のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で定義されるように、修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドは、骨格のリン原子を保持するもの、および骨格にリン原子を有さないものを含む。本明細書の目的上、ヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドであると考えられる。
好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格は、例えばホスホロチオエート、キラル・ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3’-アルキレン・ホスホネートおよびキラル・ホスホネートを含むメチルおよび他のアルキル・ホスホネート、ホスフィネート、3’-アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに標準的な3’-5’結合を有するボラノリン酸塩、これらの2’-5’結合した類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣接対が3’-5’から5’-3’または2’-5’から5’-2’で結合する逆転極性を有するものを含む。様々な塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。
リン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖のアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、混合へテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、または一つまたは複数の短鎖へテロ原子もしくは複素環のヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレン・ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケンを含む骨格；スルファミン酸塩骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸塩およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合のN、O、SおよびCH2の構成部分を有するその他、を有するものを含む。
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣剤において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合（すなわち骨格）の両方は新規な基で置換される。塩基単位は適切な核酸標的化合物を用いるハイブリダイゼーション用に保持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されたオリゴヌクレオチド模倣剤である、一つのこのようなオリゴマー化合物はペプチド核酸（PNA）と呼ばれる。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格はアミドを含む骨格、特にアミノエチルグリシン骨格と置換される。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示する代表的な合衆国特許は、米国特許第5,539,082号；第5,714,331号；および第5,719,262号を含むが、これらに限定されない。それぞれが参照により本明細書に組み入れられる。PNA化合物の更なる教示はNielsen et al., Science 254:1497(1991)で見いだせ得る。
本発明のより好ましい態様は、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドであり、特に--CH2、--NH--O--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[メチレン（メチルイミノ）またはMMI骨格として公知]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--、および上記に参照した米国特許第5,489,677号の--O--N(CH3)--CH2--CH2--[式中、天然のホスホジエステル骨格は--O--P--O--CH2-として表される]、および上記に参照した米国特許第5,602,240号のアミド骨格である。上記で参照した米国特許第5,034,506号のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドである。
修飾されたオリゴヌクレオチドは一つまたは複数の置換糖部分も含み得る。好ましいオリゴヌクレオチドは2’位で下記の一つを含む：OH; F; O-、S-、もしくはN-アルキル；O-、S-、もしくはN-アルケニル；O-、S-、もしくはN-アルキニル；またはO-アルキル-O-アルキル。ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換または非置換のC1からC10のアルキルまたはC2からC10のアルケニルおよびアルキニルであり得る。O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3]2が特に好ましい。式中、nおよびmは1から約10である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは2’位に下記の一つを含む：C1からC10の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリルまたはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、介入物、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改良する基、および同様な特性を有する他の置換基。好ましい修飾は、2’-メトキシエトキシ（2’-O--CH2CH2OCH3、2’-O-（2-メトキシエチル）または2’-MOEとしても知られる）（Martin et al., Helv. Chim. Acta 78:486[1995]）、即ちアルコキシアルコキシ基を含む。さらに好ましい修飾は、2’-DMAOEとしても知られる2’-ジメチルアミノオキシエトキシ（即ち、O(CH2)2ON(CH3)2基）および2’-ジメチルアミノエトキシエトキシ（2’-O-ジメチルアミノエトキシエチルまたは2’-DMAEOEとしても当技術分野において知られる）、即ち2’-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2を含む。
他の好ましい修飾は、2’-メトキシ（2’-O--CH3）、2’-アミノプロポキシ（2’-OCH2CH2CH2NH2）および2’-フルオロ（2’-F）を含む。同様な修飾はオリゴヌクレオチドの他の位置、特に3’末端ヌクレオチドまたは2’-5’結合オリゴヌクレオチドおよび5’末端ヌクレオチドの5’位の糖の3’位でも為され得る。オリゴヌクレオチドはペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体も有し得る。
オリゴヌクレオチドは核酸塩基（しばしば当技術分野においては単に「塩基」と呼ばれる）の修飾または置換も含み得る。本明細書で用いられるように、「修飾されていない」または「天然の」核酸塩基は、プリン塩基のアデニン（A）およびグアニン（G）、ならびにピリミジン塩基のチミン（T）、シトシン（C）およびウラシル（U）を含む。修飾された核酸塩基は、5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（プソイドウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換されたアデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換されたウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンならびに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンなどの他の合成および天然の核酸塩基を含む。さらなる核酸塩基は米国特許第3,687,808号に開示されるものを含む。ある種のこれらの核酸塩基は本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらは、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含む、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、ならびにN-2、N-6、およびO-6置換されたプリンを含む。5-メチルシトシンの置換は、0.6-1.2℃ごとに核酸二本鎖の安定性を増すことが示されており、現在好ましい塩基置換であり、更により具体的には2’-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合に好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを増す一つまたは複数の部分または複合体をオリゴヌクレオチドに化学結合させる工程を含む。このような部分は、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエステル（例えばヘキシル-S-トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪族鎖（例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基）、リン脂質（例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分を含むが、これらに限定されない。
当業者は上述した修飾を含むオリゴヌクレオチドの作製方法を周知している。本発明は上述したアンチセンス・オリゴヌクレオチドに限定されない。任意の適切な修飾または置換が利用され得る。
所与化合物の全位置が均一に修飾される必要はなく、実際、前述した修飾の一つより多くが一つの化合物またはオリゴヌクレオチド内の一つのヌクレオシドでさえ組み込まれ得る。本発明はキメラ化合物であるアンチセンス化合物も含む。「キメラの」アンチセンス化合物または「キメラ」は、本発明の文脈において、アンチセンス化合物、具体的にはオリゴヌクレオチドである。これらは二つ以上の化学的に異なる領域を含み、それぞれが少なくとも一つの単量体単位、即ちオリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチドから構成される。これらのオリゴヌクレオチドは通常少なくとも一つの領域を含み、前記オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ分解に対する耐性の増強、細胞取り込みの増加、および/または標的核酸に対する結合親和性の増加をオリゴヌクレオチドに付与するように修飾される。オリゴヌクレオチドの付加的領域はRNA：DNAまたはRNA：RNAのハイブリッドを切断できる酵素に対する基質として役立ち得る。一例として、RNaseHはRNA：DNA二本鎖のRNA鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。RNaseHの活性は、従って、標的RNAの切断をもたらし、それにより、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を非常に高める。結果的に、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエート・デオキシオリゴヌクレオチドと比べて、キメラ・オリゴヌクレオチドが用いられる場合のより短いオリゴヌクレオチドで同様の結果がしばしば得られる。標的RNAの切断は、ゲル電気泳動、および、必要ならば、当技術分野において知られる関連する核酸ハイブリダイゼーション技法により常套的に検出できる。
本発明のキメラ・アンチセンス化合物は、上述する二つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび/またはオリゴヌクレオチド模倣剤の複合構造として形成され得る。
本発明は下記に記載するような本発明のアンチセンス化合物を含む薬学的組成物および製剤も含む。
B.遺伝子治療
本発明は本発明の幹細胞癌マーカーの発現を調節するのに用いる任意の遺伝子操作の使用を意図する。遺伝子操作の例は、遺伝子ノックアウト（例を挙げると、例えば組換えを用いて染色体から癌マーカー遺伝子を除去する）、誘導プロモーターを含むまたは含まないアンチセンス構築物の発現、異種遺伝子（例えば誘導プロモーターにより制御される）の付加などを含むが、これらに限定されない。インビトロまたはインビボにおける細胞への核酸構築物の送達は任意の適切な方法を用いて行われ得る。適切な方法は所望の事象が起きるような細胞に核酸構築物を導入する方法である（例えばアンチセンス構築物の発現）。
遺伝情報を携える分子を細胞に導入することは、裸DNA構築物の直接注入、前記構築物を充填した金粒子を用いた衝撃（bombardment）、および例えばリポソーム、生体高分子などを用いた高分子媒介遺伝子導入を含むが、これらに限定されない種々の方法のいずれかにより達成される。好ましい方法は、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを含むが、これらに限定されないウイルスに由来する遺伝子送達媒体を用いる。レトロウイルスと比較すると効率が高いため、アデノウイルスに由来するベクターはインビボで核酸分子を宿主細胞に導入するために好ましい遺伝子送達媒体である。アデノウイルスベクターは、動物モデルの様々な充実性腫瘍および免疫欠損マウスのヒト充実性腫瘍異種移植片への非常に効率的なインビボ遺伝子導入を提供することが示されている。アデノウイルスベクターおよび遺伝子導入方法の例はPCT公報のWO00/12738およびWO00/09675および米国特許出願第6,033,908号、第6,019,978号、第6,001,557号、第5,994,132号、第5,994,128号、第5,994,106号、第5,981,225号、第5,885,808号、第5,872,154号、第5,830,730号、および第5,824,544号に記載され、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み入れられる。
ベクターは種々の方法で被験体に投与され得る。例えば、本発明のある態様において、ベクターは直接注入を用いて腫瘍または腫瘍に関連する組織に投与される。他の態様において、投与は血液循環またはリンパ循環による（例えば、参照により本明細書にそのまま組み入れられるPCT公報99/02685を参照のこと）。アデノウイルスベクターの典型的な用量レベルはかん流液に添加される108から1011のベクター粒子が好ましい。
C.抗体治療
ある態様において、本発明は本発明の幹細胞癌マーカー（例えば表4〜8に示されるもの）を発現する腫瘍を標的にする抗体を提供する。任意の適切な抗体（例えばモノクローナル、ポリクローナル、または合成）が本明細書で開示される治療方法で利用され得る。好ましい態様において、癌治療に用いる抗体はヒト化抗体である。抗体をヒト化する方法は当技術分野において周知である（例えば米国特許第6,180,370号、第5,585,089号、第6,054,297号、および第5,565,332号；これらのそれぞれは参照により本明細書に組み入れられる）。
ある態様において、治療抗体は本発明の幹細胞癌マーカーに対して作製される抗体を含み、前記抗体は細胞毒性剤と結合する。このような態様において、正常細胞を標的にしない、腫瘍に特異的な治療剤が作製されるため、従来の化学療法の有害な副作用の多くを軽減する。ある種の適用では、治療剤は、抗体への結合に有用な剤として役立つ薬剤、具体的には内皮細胞を死滅するもしくは前記細胞の増殖または細胞分裂を抑制する能力を有する細胞毒性剤または他の抗細胞剤であることが想定される。本発明は、抗体に結合し、活性形態で送達され得る任意の薬剤の使用を意図する。典型的な抗細胞剤は化学療法剤、放射性同位体、および細胞毒素を含む。本発明の治療抗体は、放射活性同位体（例えば、ヨウ素-131、ヨウ素-123、テクネチウム-99m、インジウム-111、レニウム-188、レニウム-186、ガリウム-67、銅-67、イットリウム-90、ヨウ素-125またはアスタチン-211）、ステロイドなどのホルモン、シトシンなどの代謝拮抗剤（例えば、アラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサートまたはアミノプテリン；アントラサイクリン；マイトマイシンC）、ビンカ・アルカロイド（例えばデメコルシン；エトポシド；ミトラマイシン）、およびクロラムブシルまたはメルファランなどの抗腫瘍アルキル化剤を含むが、これらに限定されない種々の細胞毒性部分を含み得る。他の態様は、凝固剤、サイトカイン、増殖因子、細胞内毒素または細胞内毒素の脂質A部分などの剤を含み得る。例えば、ある態様において、治療剤は、植物、菌類または細菌に由来する毒素、ほんの数例を挙げると、A鎖毒素、リボソーム不活性化タンパク質、α-サルシン、アスペルギリン、リストリクトシン、リボヌクレアーゼ、ジフテリア毒素または緑膿菌（pseudomonas）外毒素を含む。ある好ましい態様において、脱グリコシル化リシンA鎖を使用する。
あらゆる事象において、これらのような剤は、所望ならば、公知の結合技法（例えばGhose et al., Methods Enzymol., 93:280[1983]を参照のこと）を用いて必要に応じて標的腫瘍細胞の部位の血液構成要素への標的化、内在化、放出または提示を可能にする様式で、抗体に首尾よく結合され得ることが提案される。
例えば、ある態様において、本発明は本発明の幹細胞癌マーカーを標的とする免疫毒素を提供する。免疫毒素は、毒素部分などの細胞毒性薬と、特異的な標的化剤、通常は腫瘍に対する抗体または断片との複合体である。標的化剤は標的抗原を携える細胞に毒素を導くことにより選択的に前記細胞を死滅させる。ある態様において、治療抗体は高いインビボ安定性を提供する架橋剤を用いる（Thorpe et al., Cancer Res., 48:6396[1988]）。
他の態様、特に充実性腫瘍の治療に関する態様において、抗体は、血管内皮細胞の増殖または細胞分裂を抑制することにより、腫瘍血管系に対して細胞毒性効果または他の抗細胞効果を有するように設計される。この攻撃は腫瘍が局在する血管の虚脱をもたらし、腫瘍細胞、特に血管系末端の腫瘍細胞から酸素および栄養を奪い、最終的に細胞死および腫瘍壊死に導くことを意図する。
好ましい態様において、抗体に基づく治療は下記に記載するような薬学的組成物として調製される。好ましい態様において、本発明の抗体組成物の投与は癌の測定可能な減少をもたらす（例えば腫瘍の減少または除去）。
D.RNAi療法
他の態様において、RNAiは本発明の幹細胞癌マーカー（例えば表4〜8に示されるもの）の発現を調節するために用いられる。RNAiはヒトを含む大半の真核生物において外来遺伝子の発現を制御するために進化的に保存された細胞防御を表す。RNAiは、二本鎖RNA（dsRNA）により誘発され、dsRNAに応答して相同な一本鎖標的RNAの配列特異的mRNA分解を惹起する。mRNA分解の媒介物質は低分子干渉RNA二本鎖（siRNA）であり、siRNAは通常細胞での酵素切断により長いdsRNAから産生される。siRNAは、一般に長さ約21ヌクレオチド（例えば長さ21〜23ヌクレオチド）であり、2つのヌクレオチド3’-突出部により特徴付けられる塩基対構造を有する。細胞への短いRNAの導入、すなわちRNAi後、配列はRISC（RNA誘導性サイレンシング複合体）と呼ばれる酵素複合体に送達されると考えられる。RISCは前記標的を認識しエンドヌクレアーゼで切断する。より長いRNA配列が細胞に送達される場合、RNaseIII酵素（Dicer）はより長いdsRNAを21〜23ヌクレオチドのds siRNA断片に変換することに留意される。
化学合成されたsiRNAは培養体細胞における哺乳動物遺伝子機能のゲノム規模での分析のための強力な試薬となっている。遺伝子機能の検証価値を超えて、siRNAは遺伝子に特異的な治療剤として高い潜在能力も抱える（TuschlおよびBorkhardt, Molecular Intervent. 2002; 2(3):158-67、参照により本明細書に組み入れられる）。
動物細胞へのsiRNAのトランスフェクションは特定遺伝子の強力で持続する転写後サイレンシングを引き起こす（Caplen et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2001; 98:9742-7; Elbashir et al., Nature. 2001; 411:494-8; Elbashir et al., Genes Dev. 2001; 15:188-200;およびElbashir et al., EMBO J. 2001; 20:6877-88、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み入れられる）。siRNAを用いてRNAiを実施する方法および組成物は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,506,559号に記載される。
siRNAは、伸長タンパク質により、しばしば検出できないレベルまで、標的RNA量を減少させるのに非常に効果的である。サイレンシング効果は数ヶ月続き得る。前記効果は、標的RNAとsiRNAの中心領域との間の1つのヌクレオチド不対合がしばしばサイレンシングを抑えるのに十分であるため、非常に特異的である（Brummelkamp et al., Science 2002; 296:550-3;およびHolen et al, Nucleic Acids Res. 2002; 30:1757-66、両方とも参照により本明細書に組み入れられる）。
E.薬学的組成物
本発明は薬学的組成物（例えば本発明の幹細胞癌マーカーを標的にする小分子、アンチセント、抗体、またはsiRNAを含む）をさらに提供する。本発明の薬学的組成物は、治療される部位に応じて局部治療または全身治療のいずれが望ましいかに依存して幾つかの方法で投与され得る。投与は局部的（眼、膣もしくは直腸の送達を含む粘膜を含む）、肺（例えば、粉末もしくはエアロゾルの吸入もしくは吹送により、噴霧器によるものを含む；気管内；鼻腔内；表皮および経皮）、経口または非経口であり得る。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋内の注射または注入；または頭蓋内、例えば鞘内もしくは脳室内の投与であり得る。
局部投与用の薬学的組成物および製剤は、経皮貼布、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、坐剤、スプレー、液体および粉末を含み得る。従来の薬学的な担体、水性、粉末または油性の基剤、増粘剤などが必要または望ましいかもしれない。
経口投与用の組成物および製剤は、粉末もしくは顆粒、水もしくは非水性媒体の懸濁液もしくは溶液、カプセル、小袋または錠剤を含む。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましいかもしれない。
非経口、鞘内または脳室内の投与用の組成物および製剤は、緩衝剤、希釈剤、ならびに浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容し得る担体もしくは賦形剤など（これらに限定されない）の他の適切な添加剤も含有し得る滅菌水溶液を含み得る。
本発明の薬学的組成物は、溶液、乳液、およびリポソームを含む製剤を含むが、これらに限定されない。これらの組成物は、予め作製された液体、自己乳化固体および自己乳化半固体を含むが、これらに限定されない種々の構成要素から作製され得る。
単位剤形で簡便に提示され得る本発明の薬学的製剤は、製薬産業で周知の従来の技法に従って調製され得る。このような技法は、薬学的な担体または賦形剤と活性成分とを結び付ける工程を含む。一般に、前記製剤は、液体担体もしくは微細に分割された固体担体もしくは両方と活性成分とを均一かつ密接に結び付けた後、必要ならば前記産物を成形することにより調製される。
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、液体シロップ、軟ゲル、坐剤、および浣腸剤など（これらに限定されない）の多数の可能な剤形のいずれかに製剤され得る。本発明の組成物は、水性、非水性または混合の媒体の懸濁液としても調製され得る。水性懸濁液は、例えばカルボキシメチルセルロース・ナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランを含む懸濁液の粘度を上げる物質をさらに含み得る。懸濁液は安定剤も含み得る。
本発明の一つの態様において、薬学的組成物は泡として調製され使用され得る。薬用泡は、乳液、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリーおよびリポソームなど（これらに限定されない）の製剤を含む。基本的には似ているが、これらの製剤は最終産物の構成要素および一貫性において変化する。
細胞レベルでオリゴヌクレオチドの取り込みを増強する剤も本発明の薬学的組成物および他の組成物に添加され得る。例えば、リポフェクチン（米国特許第5,705,188号）などの陽イオン性脂質、陽イオン性グリセロール誘導体、およびポリリシン（WO97/30731）などのポリカチオン性分子もオリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増強する。
本発明の組成物は薬学的組成物で従来見出される他のアジュバント構成要素をさらに含み得る。従って、例えば、前記組成物は、例えば、かゆみ止め薬、収れん剤、局所麻酔剤もしくは抗炎症剤などの付加的で適合できる薬学的活性物質を含み得る。または、前記組成物は、色素、香味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定剤など、本発明の組成物の様々な剤形を物理的に製剤するのに役立つ付加的物質を含み得る。しかしながら、このような物質は、添加される際、本発明の組成物の構成要素の生体活性を過度に妨げるべきではない。前記製剤は、安定化され、必要ならば、製剤の核酸と有害に相互作用しない助剤、例えば潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝剤、着色剤、香味剤および/または芳香剤などと混合し得る。
本発明のある態様は、（a）幹細胞癌マーカーの活性を調節する一つまたは複数の化合物（例えば、抗体、小分子、siRNA、アンチセンスなど）および（b）一つまたは複数の他の化学療法剤を含む薬学的組成物を提供する。このような化学療法剤の例は、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェン・マスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン（CA）、5-フルオロウラシル（5-FU）、フロクスウリジン（5-FUdR）、メトトレキセート（MTX）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（DES）などの抗癌剤を含むが、これらに限定されない。抗炎症薬は、非ステロイド抗炎症薬およびコルチコステロイドを含むが、これらに限定されず、抗ウイルス薬は、リビビリン（ribivirin）、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルを含むが、これらに限定されず、前記薬も本発明の組成物で混合され得る。他の化学療法剤も本発明の範囲内にある。二つ以上の混合される化合物はともにまたは順次使用され得る。
投薬は、数日から数ヶ月続く治療過程とともに、または治療が影響を及ぼすまで、もしくは病態の減退が達成される（例えば腫瘍の大きさが収縮する）まで、治療される病態の重症度および反応性に依存する。最適な投薬計画は患者の身体での薬物蓄積の測定から算出できる。投与する医師は最適用量、投与方法および反復速度を容易に決定できる。最適用量は個々のオリゴヌクレオチドの相対力に応じて変化し得る。前記用量は、一般に、インビトロおよびインビボの動物モデルで効果的であることが見出されたEC50に基づいて、または本明細書に記載する実施例に基づいて見積もることができる。一般に、用量は体重1kgあたり0.01μgから100gであり、毎日、毎週、毎月または毎年一回以上与えられ得る。治療医師は体液または組織で測定される薬物の滞留時間および濃度に基づいて投薬の反復速度を見積もることができる。治療の成功後、被験体は病状の再発を防止するために維持療法を受けることが望ましいかもしれない。オリゴヌクレオチドは、体重1kgあたり0.01μgから100gの範囲で、毎日1回以上から20年毎に1回、維持用量で投与される。
VIII.癌マーカー遺伝子を発現するトランスジェニック動物
本発明は、本発明の外因性癌マーカー遺伝子またはその突然変異体および変異体（例えば切断または一塩基変異多型）またはそのノックアウトを含むトランスジェニック動物の作製を意図する。好ましい態様において、トランスジェニック動物は野生型動物と比べて変化した表現型（例えばマーカーの増減する存在）を示す。このような表現型の有無を分析する方法は、本明細書に開示するものを含むが、これらに限定されない。幾つかの好ましい態様において、トランスジェニック動物はさらに増減する腫瘍の増殖または癌の証拠を示す。
本発明のトランスジェニック動物は薬物（例えば癌療法）スクリーニングで使用される。ある態様において、試験化合物（例えば、癌を治療するために役立つ可能性がある薬物）および対照化合物（例えばプラセボ）はトランスジェニック動物および対照動物に投与され、効果が評価される。
トランスジェニック動物は種々の方法により作製できる。ある態様において、種々の発達段階の胚細胞はトランスジェニック動物の作製用に導入遺伝子を導入するために用いられる。胚細胞の発達段階に応じて、異なる方法が用いられる。受精卵はマイクロインジェクションの最もよい標的である。マウスでは、雄性前核は直径約20マイクロメーターの大きさに達し、1〜2ピコリットル（pl）のDNA溶液を再現可能に注入できる。遺伝子導入の標的としての受精卵の使用は、大半の場合で注入されるDNAが最初の切断前に宿主ゲノムに取り込まれるという点において主要な利点を有する（Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442[1985]）。結果として、非ヒトトランスジェニック動物の全細胞は取り込まれた導入遺伝子を携える。これは、生殖細胞の50％が導入遺伝子を含むため、初代の子孫への導入遺伝子の効率的な伝達にも一般に反映されるであろう。米国特許第4,873,191号は受精卵のマイクロインジェクション方法を記載し、この特許の開示はそのまま本明細書に組み入れられる。
他の態様において、レトロウイルス感染は非ヒト動物への導入遺伝子を導入するために用いられる。ある態様において、レトロウイルス・ベクターは卵母細胞の囲卵腔にレトロウイルス・ベクターを注入することにより卵母細胞をトランスフェクトするために利用される（米国特許第6,080,912号、参照により本明細書に組み入れられる）。他の態様において、発生中の非ヒト胚は胚盤胞期までインビトロで培養できる。この間に、割球はレトロウイルス感染の標的とされ得る（Janenich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:1260[1976]）。割球の効率的な感染は透明帯を取り除く酵素処理により得られる（Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.[1986]のHogan et al.）。導入遺伝子を導入するために用いるウイルス・ベクター系は通常導入遺伝子を携える複製欠損レトロウイルスである（Jahner et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:6927[1985]）。トランスフェクションはウイルス産生細胞の単層上で割球を培養することにより容易に且つ効率的に得られる（Stewart et al., EMBO J., 6:383[1987]）。
または、感染は後期で実施できる。ウイルスまたはウイルス産生細胞は胞胚腔内に注入され得る（Jahner et al., Nature 298:623[1982]）。初代の大半は、取り込みがトランスジェニック動物を形成する細胞の一部のみで起きるため、導入遺伝子に関してモザイクであろう。さらに、初代はゲノムの異なる位置で導入遺伝子の様々なレトロウイルス挿入物を含み得る。前記ゲノムは一般に子孫に分離するであろう。その上、たとえ低い効率でも、妊娠中期胚の子宮内レトロウイルス感染により導入遺伝子を生殖系列に導入することも可能である（Jahner et al.,前記[1982]）。レトロウイルスまたはレトロウイルス・ベクターを用いて当技術分野において知られるトランスジェニック動物を創出するさらなる手段は、レトロウイルス粒子、またはレトロウイルスを産生し且つマイトマイシンCで処理された細胞を、受精卵または初期胚の囲卵腔にマイクロインジェクションすることを含む（PCT国際出願WO90/08832[1990]、ならびにHaskellおよびBowen, Mol. Reprod. Dev., 40:386[1995]）。
他の態様において、導入遺伝子は胚性幹細胞に導入され、トランスフェクトされた幹細胞は胚を形成するために用いられる。ES細胞は適切な条件下のインビトロで着床前胚を培養することにより得られる（Evans et al., Nature 292:154[1981]; Bradley et al., Nature 309:255[1984]; Gossler et al., Proc. Acad. Sci. USA 83:9065[1986];およびRobertson et al., Nature 322:445[1986]）。導入遺伝子は、リン酸カルシウム共沈降、プロトプラストまたはスフェロプラストの融合、リポフェクチンおよびDEAE-デキストランが媒介するトランスフェクションを含む当技術分野において知られる種々の方法によるDNAトランスフェクションにより効率的にES細胞に導入できる。導入遺伝子はレトロウイルスが媒介する形質導入によりまたはマイクロインジェクションによりES細胞にも導入され得る。このようなトランスフェクトされたES細胞はその後胚胞期の胞胚腔への導入後、胚に定着し、得られるキメラ動物の生殖系列に寄与し得る（概説については、Jaenisch, Science 240: 1468[1988]を参照）。トランスフェクトされたES細胞を胞胚腔に導入する前に、トランスフェクトされたES細胞は、導入遺伝子を組み込んだES細胞を濃縮するために種々の選別手順に供してもよく、これは導入遺伝子がこのような選別手段を提供することを想定する。または、導入遺伝子を組み込んだES細胞をスクリーニングするために、ポリメラーゼ連鎖反応が用いられてもよい。この技法は、胞胚腔への導入前に適切な選別条件下でトランスフェクトしたES細胞を増殖させる必要性を取り除く。
更なる他の態様において、相同的組換えは遺伝子機能をノックアウトするためまたは欠失変異体（例えば切断変異体）を創出するために利用される。相同的組換えの方法は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,614,396号に記載される。
実験
下記の実施例は、本発明の好ましいある種の態様および局面を証明しさらに説明するために提供され、その範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。
下記に示す実験の開示において、下記の略語を適用する。N（正常）；M（モル濃度）；mM（ミリモル濃度）；μM（マイクロモル濃度）；mol（モル）；mmol（ミリモル）；μmol（マイクロモル）；nmol（ナノモル）；pmol（ピコモル）；g（グラム）；mg（ミリグラム）；μg（マイクログラム）；ng（ナノグラム）；lまたはL（リットル）；ml（ミリリットル）；μl（マイクロリットル）；cm（センチメートル）；mm（ミリメートル）；μm（マイクロメートル）；nm（ナノメートル）；および℃（摂氏温度）。
実施例1
充実性腫瘍細胞異種移植モデルの確立および分析
この実施例はヒト由来のヒト充実性腫瘍細胞を用いたマウスでの腫瘍の生成およびこれらの腫瘍の分析を記載する。
材料および方法
マウスの準備。8週齢の雌NOD-SCIDマウスは0.2mlのケタミン/キシラジン（4mlの容積で20mgのキシラジンと混合した300mgのケタミン。マウス20gあたりに0.02mlの溶液が使用された）の腹腔内注射により麻酔された。HBSSを用いて200μlに希釈した。次いで、マウスは腹腔内注射によりVP-16（エトポシド）で処理した（マウス1kgあたり30mgのエトポシド用量、200μlの最終注射用量用に無血清HBSSで希釈した）。同時に、エストロゲンのペレットは套管針を用いてマウスの首の裏の皮下に置かれた。全ての腫瘍注射/移植はこの手法の5日後に為された。下記の手法において、マウスは上述するように麻酔された。
原発腫瘍試料の移植。新鮮な試料を移植するため、ヒト乳房腫瘍の試料は術後1時間以内に入手した。腫瘍はハサミで小片に切断し、次いで前記片は刃物で切り刻み、2×2mmの大きさの片を得た。切り刻みは氷上の滅菌条件下で20％ウシ胎児血清（FBS）を細くした滅菌RPMI1640培地中で行われた。腫瘍片は移植前に無血清HBSSで洗浄した。次に、中腹部の領域で2mmの切開が為され、套管針を用いて、1から2の腫瘍小片は右上および左上の乳房脂肪塊の領域（両側の第二乳首の真下）に移植された。6-0縫合はMFP-Nipple周辺で2回包まれ、移植片を定位置に留めておける。縫合は5日後除去された。Nexabanを用いて切開を密封し、マウスは腫瘍増殖について毎週観察された。
胸水注射。胸水の注射用に、細胞は胸腔穿刺直後に入手し、無血清HBSSで洗浄した。次に、細胞は無血清-RPMI/Matrigel混合物（1：1容積）に懸濁した後、必要な18Gを用いて右上および左上の乳房塊に注入した。100万〜200万の細胞を含む0.2mlは典型的に注入された。針注入の部位はNexabanで密閉し細胞の漏出を防いだ。
腫瘍細胞の単細胞懸濁液の調製。コラゲナーゼによる分解前に、異種移植腫瘍またはヒト原発腫瘍は小片に切断された後、適切な刃物を用いて完全に切り刻んだ。単細胞懸濁液を得るため、次に胸水細胞または得られる腫瘍片のいずれかを超純粋コラゲナーゼIIIを含むHBSS溶液と混合し（1mlあたり200〜250Uコラゲナーゼ）、37℃で3〜4時間インキュベートした。10mlのピペットを用いて15〜20分毎にピペッティングした。インキュベーションの終わりに、細胞は45μのナイロン網を通して濾過し、RPMI-20%FBSで洗浄した後、HBSSで二回洗浄した。次いで、注入される細胞はHBSS/Matrigel混合物（1：1容積）に懸濁し、上述するように乳房脂肪塊の領域に注入した。Nexabanは注入部位を密閉するために用いた。
フローサイトメトリー用の細胞染色。細胞は計数された後、5mlの管に移され、2％の熱不活性化ウシ血清（HICS）を含むHBSSで2回洗浄された（5分、1000rpm）後、2％のHICSを含む100μl（106細胞あたり）のHBSSに再懸濁した。次いで、5mlのSandoglobin溶液（1mg/ml）を添加し、氷上で10分間インキュベートした。その後、試料はHBSS 2％ HICSで2回洗浄し、100ml（106細胞あたり）のHBSS 2％ HICSに再懸濁した。次いで、抗体（抗体あたりに適切な希釈を用いて）を添加し、氷上で20分間インキュベートした後、HBSS 2％ HICSで2回洗浄した。必要ならば、100ul（106細胞あたり）のHBSS 2％ HICSに再懸濁することにより、二次抗体の添加を行った後、1〜4mlの二次抗体（二次抗体およびその濃度に応じて）を添加し、続いて20分間インキュベートした。ストレプトアビジン段階を用いる場合、細胞は100ul（106細胞あたり）のHBSS 2％ HICSに再懸濁した後、指示する蛍光色素と結合した1ulのストレプトアビジンを添加し、20分間インキュベートした。細胞はHBSS 2％熱不活性化ウシ胎児血清（HICS）で2回洗浄され、7AAD（1mg/mlの最終濃度）を含む0.5ml（100万個の細胞あたり）のHBSS 2％ HICSに再懸濁した。
フローサイトメトリー。用いた抗体は抗CD44（APC、PEまたはビオチン）、抗CD24（PEまたはFITC）、抗B38.1（APC）、抗ESA-FITC（Biomeda, CA）、抗H2Kd（Santa Cruz Products, Santa Cruz, CA）であった。系列マーカー抗体は抗-CD2、-CD3、-CD10、-CD16、-CD18、-CD31、-CD64および-CD140bであった。明記しない限り、抗体はPharmingen（San Diego, CA）から購入した。抗体は試験に応じて種々の蛍光色素と直接結合した。全試験で、マウス細胞および/またはLineage+細胞はフローサイトメトリー中にH2Kd（クラスI MHC）細胞またはLineage+細胞を廃棄することにより取り除いた。死細胞は生死判別色素の7-AADを用いて排除した。フローサイトメトリーはFACSVantage（Becton Dickinson, San Jose, CA）で実施した。側方散乱および前方散乱のプロファイルは細胞の重複（doublet）を除外するために用いた。細胞は常套的に二回選別され、前記細胞は純度について再分析された。純度は通常95％を上回った。
充実性腫瘍において、ほんの一部の腫瘍細胞がインビトロ・コロニー形成検定でコロニーを形成できることが証明されている21-24、101-103。さらに、多数の細胞は通常異種移植モデルで腫瘍を形成するために移植されなければならない。これらの観察についての一つの可能な説明は、腫瘍内のいずれの細胞も増殖し新規腫瘍を形成する能力を有するが、これらの検定で個々の細胞が必要な段階を終了する確率は低いということである。代わりの説明は、表現型の異なる稀な細胞集団のみが著しく増殖し新規な腫瘍を形成する能力を有するが、この集団内の細胞は非常に効率的に行うということである25。これらの可能性を見分けるため、他の非腫瘍原細胞とこれらの細胞を識別するマーカーを有するこれらの腫瘍内のコロニー形成細胞を同定する必要がある。これは急性骨髄性白血病（AML）で遂行された。特定の白血病細胞亜集団（正常な造血幹細胞に似たマーカーを発現する）はNOD/SCID免疫不全マウスにおいてコロニー形成活性が一貫して高かった一方で、他の癌細胞はコロニー形成活性が激減したことが証明された104-106。このような試験は充実性癌で報告されていなかった。
充実性腫瘍多様性の機構を調査するために、マウスのモデルが開発され、これは、ヒトの乳癌がマウスの乳房脂肪塊で効率的に増殖するNOD/SCID免疫不全マウスモデルの変形であった99。本出願において、充実性腫瘍は、マウスで腫瘍を形成する限定的能力を有する異なる細胞集団を含むことが示された。これらの細胞は、他の癌細胞集団が腫瘍形成できる細胞を激減した間、一貫して腫瘍を形成したため、腫瘍原性細胞または癌開始細胞と呼ばれる。これらの細胞集団を識別できる細胞表面マーカーが同定された。これらの発見は、既定の細胞集団が腫瘍原を推し進める乳房腫瘍生物学の新規なモデル、および作製する腫瘍細胞の多様性を提供する。この癌細胞の腫瘍原集団の予測同定は、これらの細胞で発現する分子の同定を可能にし、次いで前記細胞は癌細胞のこの重要な集団を除去するための標的として役立ち得る。
腫瘍試料および移植率。9人の異なる患者（腫瘍1-9と指名；T1〜T9）の原発部位または転移部位から得たヒト乳癌試料は全てNOD/SCIDマウスに移植した（表1）。一例において、癌細胞は原発乳房腫瘍から得た（T2）。一方、残りの例においては、前記細胞は転移性胸水から得た（T1、T3-T9）。幾つかの試験は、マウスで一回または二回継代した後の細胞で行った（継代1および2と指名）。他方で、残りの試験は患者から直接得られた未継代の新鮮なまたは凍結した腫瘍試料で行った。マウスで継代した腫瘍から得るヒト癌細胞を用いる場合、H2K＋細胞[マウス組織適合性クラスI（MHC）]を排除することにより、汚染マウス細胞は除去された。
（表１）
Figure 2007516693
表1はNOD/SCIDマウスへのヒト乳癌の移植結果を提示した。マウスは、選別していないT1細胞およびT3細胞、ならびに2mm片のT2を注射された。T4〜T9からの細胞は図1に記載するようにフローサイトメトリーにより単離した。試験される全部で9つの腫瘍はNOD/SCIDマウスモデルに移植した。原発乳房腫瘍であったT2を除いて、他の全ての腫瘍が転移であった。腫瘍の全てはT4を除くマウスで連続して継代した。
腫瘍原性マーカーの同定。乳癌細胞は、CD44、CD24、およびB38.1を含む種々の細胞表面マーカーの発現に関して不均一であった。CD24およびCD44は接着分子であり、一方、B38.1は乳/卵巣癌に特異的なマーカーとして記載されている9、107、108。これらのマーカーが非腫瘍原性細胞と腫瘍原性細胞を識別できるか否かを解決するために、フローサイトメトリーが用いられ、一代継代のT1細胞またはT2細胞からの各マーカーについて陽性または陰性である細胞を単離した。2×105〜8×105細胞の各集団が注入された場合、CD44+細胞（8/8）、B38.1+細胞（8/8）、またはCD24-/low細胞（12/12）の全注入物は注入の12週以内に可視の腫瘍を生じたが、CD44-細胞（0/8）、またはB38.1-細胞（0/8）の注入物のいずれも検出できる腫瘍を形成しなかった（表2）。CD24＋細胞を注射された位置で触診により腫瘍は検出できなかったが、CD24＋細胞を注入された12匹のマウスの内2匹は注入部位に検視時に検出された小さな腫瘍を含んでいた。これらの腫瘍は、選別されたCD24＋細胞を常に汚染する1〜3％のCD24-細胞から、または増殖能力が低下したCD24＋細胞から生じた可能性が高い（表2）。CD44＋細胞は専らB38.1+であったため、本発明者らはその後の試験でCD44およびCD24のマーカーに注目した。
正常な細胞型（Lineageマーカー；CD2、CD3、CD10、CD16、CD18、CD31、CD64およびCD140b）に関連する幾つかの抗原は、マウスで複数回継代してきた腫瘍の分析に基づいて癌細胞により発現しないことが見出された。未継代または初期継代の腫瘍細胞からのLineage＋細胞を排除することにより、正常なヒトの白血球、内皮細胞、中皮細胞および線維芽細胞が排除された。顕微鏡調査により、Lineage-腫瘍細胞は新生物細胞の外観を有した（図6）。
（表２）
Figure 2007516693
表2は、指示マーカーの発現に基づいて図1に記載されるようにフローサイトメトリーにより単離され、NOD/SCIDマウスの乳房脂肪塊への注入後の腫瘍形成能について検定された細胞の結果を示す。12週間、マウスは観察および触診により腫瘍について毎週調べられた後、全てのマウスは検視され、小さすぎて触診できない注入部位の腫瘍について観察された。形成される腫瘍の数/実施した注入の回数が各集団について示される。全ての腫瘍は、検視時にのみ検出されたCD24＋集団から得る腫瘍を除いて、外観検査および触診により容易に明らかであった。
腫瘍に応じて、腫瘍または胸水のLineage-癌細胞の11％から35％がCD44+CD24-/lowであった（図4a-1f）。9人の患者から単離されたCD44+CD24-/lowLineage-細胞またはLineage-癌細胞の他集団はマウスの乳房脂肪塊に注入された（表3）。無選別の継代T1またはT2細胞を注入した場合、5×104細胞は一貫して腫瘍を生成したが、104細胞はほんの少数の事例で腫瘍を生成した。対照的に、わずか103のT1またはT2のCD44+CD24-/lowLineage-細胞は全ての事例で腫瘍を生成した（表3）。T1およびT2において、CD44+Lineage-だがCD24＋の2×104以下の細胞は腫瘍を形成できなかった。これらのデータは、CD44+CD24-/lowLineage-集団は未分画腫瘍細胞に比べてNOD/SCIDマウスで腫瘍を形成する能力が10〜50倍高いことを示唆する。CD44+CD24-/lowLineage-細胞が継代腫瘍（T1、T2、T3）または患者から直接得られる未継代癌細胞（T1、T4-T6、T8、T9）のいずれから単離されようと、前記細胞は腫瘍原活性が高かった。T7は、研究された9つの癌のうち、この型に合わない唯一つのものであったことに留意されたい（図4f）。T7以外で、未継代および継代の両腫瘍のCD24+Lineage-癌細胞は新しい腫瘍を形成できなかった（表3）。従って、異種移植片および患者の未継代腫瘍は表現型の異なる癌細胞型の同様な集団から構成され、両事例において、CD44+CD24-/lowLineage-細胞のみが増殖して新しい腫瘍を形成する能力を有した（p＜0.001）。
（表３）
Figure 2007516693
表3で示されるように、腫瘍原性乳癌細胞はESA+CD44+CD24-/low集団で極めて多かった。細胞は、第一継代（マウス継代1と呼ぶ）の腫瘍1、腫瘍2および腫瘍3、第二継代腫瘍3（マウス継代2と呼ぶ）、6人の異なる患者から得られた未継代細胞のT1、T4、T5、T6、T8およびT9（患者の腫瘍細胞と呼ぶ）から単離された。CD44+CD24+Lineage-集団およびCD44+CD24-/lowLineage-細胞は図1に記載するようなフローサイトメトリーにより単離された。指定された数の各表現型の細胞はNOD/SCIDマウスの胸部に注入された。単一な腫瘍原性細胞が腫瘍を形成できたなら、変形最大尤度分析方法により計算される腫瘍原性細胞の頻度は〜5/105であり、どの移植腫瘍原性細胞も腫瘍を形成した109。従って、この計算は、細胞-細胞相互作用および移植に影響を及ぼし得る局所環境因子を考慮しないため、腫瘍原性細胞の頻度を低く見積もり得る。示されるマーカーに加えて、全試験で選別された全細胞はLineage-であった。T1、T2、およびT3から得る腫瘍原性細胞はさらにB38.1+として選別された。マウスは、マウスが腫瘍で発病するまで、4〜61/2ヶ月間毎週観察された。T5 ESA-CD44+CD24-/lowLINEAGE-細胞による＃腫瘍形成は2〜4週間遅れた。＊2,000細胞がこれらの試験で注入された。
図1は腫瘍原性細胞の単離を示す。フローサイトメトリーは、NOD/SCIDマウスの腫瘍原性について試験した腫瘍1（a、b）、腫瘍3（c）、腫瘍5（d）、腫瘍6（e）および腫瘍7細胞（f）の亜集団を単離するために用いた。T1(b)およびT3(c)はNOD/SCIDマウスで一度継代し（P）、一方、残りの細胞は患者から採取した直後に得られた凍結試料または非凍結試料であった（UP）。細胞はCD44、CD24、Lineageマーカー、およびマウス-H2K（マウスから得られた継代腫瘍）、および7AADに対する抗体を用いて染色した。死細胞（7AAD+）、マウス細胞（H2K+）およびLineage+正常細胞は全分析から除外した。図1のそれぞれのプロットは生きたヒトLineage-癌細胞のCD24およびCD44の染色パターンを示す。各試料における癌細胞/全細胞の割合としての枠で囲んだ腫瘍原性集団の頻度が示される。
3つの腫瘍において、CD44+/CD24-/low集団のESA+サブセットを単離することにより、腫瘍原性活性のさらなる向上が可能であった。ESA(上皮特異的抗原、Ep-CAM)は良性反応性中皮細胞から得る上皮癌細胞を識別するために従来使用されてきた110。ESA+CD44+CD24-/lowLineage-細胞が継代T1から単離された場合、僅か200細胞が注入後5〜6ヶ月間で約1cmの腫瘍を一貫して形成し、一方、2,000ESA-CD44+CD24-/lowLineage-細胞または20,000CD44+CD24＋細胞は常に腫瘍を形成できなかった（表3）。10,000個の無選別細胞は12匹のマウスのうち3匹で腫瘍を形成した。これはESA＋CD44+CD24-/lowLineage-集団が未分画腫瘍細胞に比べて腫瘍を形成する能力が50倍より高かったことを示唆している（表3）。ESA＋CD44+CD24-/lowLineage-集団は第一継代T1細胞の2〜4％を占めた（癌細胞の2.5〜5％）。未継代T5細胞から得たESA＋CD44+CD24-/lowLineage-集団（癌細胞の0.6％）もESA-CD44+CD24-/lowLineage-細胞と比べて腫瘍原性活性が高かったが、ESA+およびESA-の両画分はいくらかの腫瘍原性活性を有した（表3）。未継代T5細胞の中で、僅か1000個のESA＋CD44+CD24-/lowLineage-細胞が一貫して腫瘍を形成した。
細胞集団の腫瘍原性の差異が細胞周期の差異によるか否かを解決するために、集団はフローサイトメトリーにより分析された。T1から得た腫瘍原性および非腫瘍原性の癌細胞の細胞周期状態を比較することにより、両方が同様な細胞周期の分布を示すことが明らかになった（図2a、2b）。従って、特定の細胞周期の段階にある細胞が多い集団はなく、非腫瘍原性細胞は異種移植モデルで少なくとも限られた数の分裂を受けることができた。
図2は、腫瘍原性および非腫瘍原性の乳癌細胞のDNA含量を示す。T1から単離されたESA+CD44+CD24-/lowLineage-腫瘍原性細胞（a）および残りのLineage-非腫瘍原性癌細胞（b）の細胞周期の状態はDNA含量のヘキスト33342染色により決定した（20）。腫瘍原性および非腫瘍原性の細胞集団は同様な細胞周期の分布を示した。
接種の6ヵ月後、20,000個の腫瘍原性CD44+CD24-/lowLineage-細胞および20,000個のCD44+CD24＋Lineage-細胞の注入部位は組織学により調べた。CD44+CD24-/lowLineage-注入部位は直径約1cmの腫瘍を含んだが、CD44+CD24＋Lineage-注入部位は検出できる腫瘍を含まなかった（図6c）。正常なマウス乳房組織のみがCD44+CD24＋Lineage-注入の部位で組織学により見られた（図3a）が、CD44+CD24-/lowLineage-細胞を形成した腫瘍は、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した切片により判断すると、悪性細胞を含んでいた（図3b）。1,000〜50,000個の細胞をそれぞれ投与された58匹のマウスから得たCD44+CD24＋Lineage-注入部位が16〜29週後に調べられた場合でさえ、腫瘍は検出されなかった。さらに、腫瘍原性および非腫瘍原性の集団は形態上識別できなかった。継代および未継代の腫瘍から得た腫瘍原性および非腫瘍原性のLineage-細胞の両サブセットは、Wright染色またはパパニコロー染色および顕微鏡分析により判断されるように、＞95％の癌細胞を含んだ。組織学により、CD44+CD24-/lowLineage-細胞および残りのLineage-細胞は上皮癌細胞の外観を有した（図3d、3e）。
図3は、正常なマウスの組織のみを示したCD24＋注入部位(a)（20倍対物倍率）、一方、悪性細胞を含んだCD24-/low注入部位(b) （40倍対物倍率）からの組織学を示す。(c)CD44+CD24-/lowLineage-注入部位であって、CD44+CD24＋Lineage-注入部位ではないマウスの典型的な腫瘍。T3細胞はパパニコロー染色で染色し顕微鏡（100倍対物）で調べた。非腫瘍原性(c)および腫瘍原性(d)の両集団は新生物の外観で大核および大きな核小体を有する細胞を含んだ。
腫瘍原性集団は初発腫瘍で見出される表現型多様性を生成できる。少数のCD44+CD24-/lowLineage-腫瘍原性細胞の新腫瘍を生じる能力は正常な幹細胞の器官形成能に似ていた。正常な幹細胞は自己再生し、増殖能の低い多様な表現型の細胞を生じる。腫瘍原性乳癌細胞もこれらの性質を示すか否かを試験するために、200個のESA+CD44+CD24-/lowLineage-T1または1,000個のCD44+CD24-/lowLineage-T2細胞から生じる腫瘍は解離しフローサイトメトリーにより分析した。二次性腫瘍におけるESA、CD44またはCD24の不均一な発現パターンは、それらが由来する腫瘍の表現型の複雑性に似ていた（図7a、7b対7e、7f）。これらの二次性腫瘍の間で、CD44+CD24-/lowLineage-細胞は依然腫瘍原性であったが、Lineage-癌細胞の他の集団は依然非腫瘍原性であった（表3）。従って、腫瘍原性細胞は、付加的なCD44+CD24-/lowLineage-腫瘍原性細胞、および腫瘍原性細胞が由来する原発腫瘍の複雑性を再現する多様な表現型の非腫瘍原性細胞の両方を生じた。T1、T2およびT3からのこれらのCD44+CD24-/lowLineage-腫瘍原性細胞はマウスで回の腫瘍形成を連続的に経験し、それぞれの継代で腫瘍原低下の証拠がないという同様な結果を得た。これらの観察は、CD44+CD24-/lowLineage-腫瘍原性癌細胞が正常な幹細胞の自己再生および分化に類似する過程を経ることを示唆する。
図4はCD44+CD24-/lowLineage-細胞から生じる腫瘍の表現型多様性を示す。プロットは、腫瘍1（a、cおよびe）または腫瘍2（b、dおよびf）から得る生きたヒトLineage-癌細胞のCD24およびCD44またはESAの染色パターンを示す。T1 CD44+Lineage-細胞（a）またはT2 Lineage-細胞（b）はNOD/SCIDマウスで一度継代した腫瘍から得られた。T1からのESA+CD44+CD24-/lowLineage-腫瘍原性細胞（c）またはT2からのCD44+CD24-/lowLineage-腫瘍原性細胞（d）は単離されNOD/SCIDマウスの胸部に注入された。パネルの（e）および（f）はこれらの細胞から生じた腫瘍の分析を示す。両事例において、腫瘍原性細胞は、起源の腫瘍で観察される細胞に類似する多様な表現型の細胞を含む腫瘍を形成した。
乳癌腫瘍細胞の亜集団におけるWnt経路遺伝子の発現。frizzledタンパク質はWntファミリーの増殖/生存因子の受容体である。幾つかの正常幹細胞において、Wntは増殖、生存および分化に役割を果たすことが知られている。ある状況では、Wntの刺激が幹細胞の自己再生を促進し得る。活性すると、Wntはβ-カテニンの安定化を誘導する。β-カテニンに対する抗体を用いたフローサイトメトリーは、腫瘍1細胞がこのタンパク質を発現することを証明する（図5）。免疫組織化学は、β-カテニンが細胞質および核に局在することを示し、これは前記タンパク質が活性であることを示す（データは示していない）。異なるWntタンパク質は異なるfrizzled受容体を特異的に活性化する（44）。Wntシグナル伝達経路は正常細胞および乳癌細胞の両方の増殖に重要な役割を果たすと考えられるため（14、27）、腫瘍1の腫瘍原性細胞および非腫瘍原性細胞におけるWnt経路遺伝子の発現が調べられた（図5）。これを行うために、100個のESA+B38.1+CD24-/lowLINEAGE-（腫瘍原性）または非腫瘍原性腫瘍細胞が単離された。frizzledタンパク質のそれぞれに対するネステッドプライマーを用いたRT-PCRが実施された。これらの結果は、腫瘍原性細胞がfrizzled 2および6を発現したが、非腫瘍原性細胞はfrizzled 2および7を発現したことを証明する（図5）。これらの試験は同一の結果で2回反復した。次に、乳癌細胞により発現するWntファミリーの構成員が同定された。RNAは10,000個の幹細胞および非腫瘍原性細胞から単離された。Wntファミリーには20を超える公知構成員が存在し、乳癌腫瘍の特定のWntの発現を分析することを困難にする。従って、RT-PCRは全ての公知Wnt遺伝子を認識する縮重プライマーを用いて実施され、得られるcDNAをクローニングし配列決定した。驚くべきことに、本発明者らは非腫瘍原性細胞のみによるcDNAの発現を検出できた（図5）。これは10細胞のレベルでRT-PCRを行い確認された。frizzled 6の発現は、10腫瘍原試料のうち9つで、ならびに10非腫瘍原性細胞試料のうち唯1つで、検出された。cDNAはクローニングし、配列決定はこれらの細胞がWnt3A、4、7A、7B、10Bおよび11を発現したことを示した。Wntシグナルは乳癌細胞および正常内皮細胞の両方の増殖に関係していた。本発明を実施するために理解する必要はないが、これは、非腫瘍原性細胞がWnt経路を介した乳癌幹細胞および血管形成の両刺激により腫瘍形成を促進することを示唆する。このモデルは、個々の細胞と対照的に組織片を用いて乳癌を増殖することがはるかに容易であるという公知の観察と非常によく適合する（22）。
図5はWnt（左パネル）およびfrizzled(右パネル)の発現を示す。左パネルに関して、RT-PCRは示す型の10,000細胞から単離されたRNAとともに縮重Wntプライマーを用いて実施した。＋または-はRTが使用されたか否かを示す。右パネル。RNAは100個の乳癌細胞または図1に記載するようなフローサイトメトリーにより単離された乳癌幹細胞から単離された。RT-PCRはネステッドプライマーを用いて行い示されるmRNAを検出した。RTを省略する対照RT-PCR反応は陰性であった。
frizzledタンパク質の発現についてのRT-PCR結果を確認するために、Affimetrixマイクロアレイは腫瘍1、腫瘍2および腫瘍3の癌幹細胞から作製されたcDNAを用いて精査した。全部で3つの腫瘍がfrizzled 2および6を発現した。その上、腫瘍2および3はfrizzled4を発現するようであった。
腫瘍からの正常細胞の単離。次いで、これらの細胞を用いた分子研究を行うために十分な正常細胞が腫瘍から単離できるか否かを解決するための試みが為された。患者の腫瘍から得た正常な線維芽細胞および内皮細胞（約3cmの大きさ）がフローサイトメトリーにより単離された。腫瘍細胞の2％はCD31＋内皮細胞であり、8％はCD140b+線維芽細胞であった（図6）。腫瘍の1/45がフローサイトメトリーに使用された際に、9000個の線維芽細胞および2000個の内皮細胞が回収された。外挿により、腫瘍全体から約90,000個の内皮細胞および405,000個の線維芽細胞を単離することは可能であった。
図6は正常な腫瘍線維芽細胞及び内皮細胞の単離を示す。腫瘍は方法の項に記載するように解離し、腫瘍細胞は、CD2、CD3、CD16、CD18、CD45、CD64に対する抗体、および抗-B38.1-APC（それぞれ造血細胞および腫瘍細胞を排除するため）、抗-CD140b-PEおよび抗-CD31-FITCで標識されたシトクロムで染色した。A：枠は線維芽細胞の選別ゲートを示し、前記細胞はLineage-CD31-CD140b+細胞である。B：枠は内皮細胞の選別ゲートを示し、前記細胞はCD31＋Lineage-細胞である。
アデノウイルス・ベクターを用いた乳癌幹細胞の感染。異種移植腫瘍は組織培養でのみ簡単に増殖できるため、従来のトランスフェクション方法は一般に遺伝子発現研究に有用でなく、ウイルス・ベクターのみが乳癌幹細胞を効率的に形質導入する潜在能力を有する。従って、T1乳癌幹細胞を感染するアデノウイルス・ベクターの能力が試験された。これを行うために、10,000個の乳癌幹細胞または対照のMCF-7細胞の群は、0、50、500、または5,000個のLacZアデノウイルス粒子に感染した。図7は、本発明者らが幹細胞の90％以上を容易に形質導入でき、それらは対照のMCF-7細胞よりアデノウイルス・ベクターでさらに容易に感染したことを示す。これは、本発明者らが組換え遺伝子で幹細胞を形質導入するためにアデノウイルス・ベクターを使用できることを証明する。
図7はアデノウイルス・ベクターによる乳癌幹細胞の感染を示す。フローサイトメトリーはCD44+CD24-/lowLineage-細胞を単離するために用いた。腫瘍1幹細胞または対照MCF-7細胞は、0、または500、または5,000個のLacZアデノウイルス粒子/細胞を用いて感染した。2日後、細胞はX-galで染色した。腫瘍1幹細胞がアデノウイルス・ベクターにより容易に感染したことに留意されたい。
下記のデータは、造血幹細胞を研究した仕事の記載である。前記データは、基本的な幹細胞の特性を説明し、幹細胞の単離がどのようにしてまずこれらの細胞を特徴付けした後に分子研究および生化学研究を行い機能的に特徴付けできるかも証明する。
成人幹細胞数は厳密に調製される。造血幹細胞（HSC）恒常性の調節はあまり理解されていない。本発明者らは、骨髄の長期再構築HSCまたは限定前駆体の数におけるマウス株の差異に関連する遺伝的多型についてスクリーニングした。AKR/Jマウスは骨髄においてC57BL/Ka-Thy-1.1マウスより有意に高い頻度および数のHSCおよび限定前駆体両方を有した。C57BL/Ka-Thy-1.1対立遺伝子は部分的に優性であった。H-2複合体を含む17染色体の遺伝子座は長期自己再生HSCの頻度に関連したが、限定前駆体の頻度との関連の証拠を示さなかった。逆に、1染色体の遺伝子座は限定前駆体の頻度との示唆に富む関連を示したが、HSC頻度と関連しなかった。これは、インビボでHSCおよび限定前駆体の頻度の異なる遺伝的決定基が存在することを証明する。AKR/Jの17染色体遺伝子座は、C57BLバックグランド上で培養された（bred）場合、HSC頻度を増すのに十分でなかった。これは、HSC頻度に影響を及ぼすため、この遺伝子座の産物が非連鎖改変遺伝子座との相互作用に依存する可能性があることを示唆する。本発明は幹細胞の増殖が動物において厳重な遺伝調節下にあることを証明する。
造血幹細胞のゲノム分析。造血幹細胞（HSC）は自己再生能および多分化発生能を有する。HSCの自己再生を制御する分子機構は多分に依然知られていない。HSCの遺伝子発現プロファイルを分析するためにバイオインフォマティクスおよびアレイ・ハイブリダイゼーションの技法を用いた体系的手法が実施された。不確定（uncommitted）細胞系統で主に発現するmRNAを濃縮するために、極めて濃縮されたHSC集団から作製された54,000個のcDNAクローンならびに幹細胞および初期多能性前駆体（MPP）細胞の混合集団はナイロン膜上に配置され（マクロアレイまたは高密度アレイ）、脾臓、胸腺、および骨髄を含む成熟系列細胞に由来するcDNAプローブとサブトラクションした。非常に低いハイブリダイゼーション・シグナルを有する5,000個のcDNAクローンが配列決定およびガラス・スライド上のマイクロアレイを用いたさらなる分析のために選別された。細胞の2集団、即ちHSCおよびMPP細胞はマイクロアレイ分析を用いて異なる遺伝子発現について比較した。HSCは自己再生能を有し、一方、MPP細胞は自己再生能を喪失していた。HSCおよびMPP細胞の濃縮集団により異なって発現する多数の遺伝子が同定された。これらは、転写因子、シグナル伝達分子、およびこれまで知られていない遺伝子を含んだ。
Bmi-1はHSC自己再生に必要である。HSCの遺伝子発現分析により、本発明者らは自己再生に潜在的に重要な遺伝子を同定することができた。遺伝子発現データの分析後、本発明者らは重要な幹細胞調節遺伝子を同定するために機構研究を開始した。幹細胞生物学の中心的課題はHSCの自己再生を調節する機構を理解することであり、これは造血が動物の一生涯存続することを必要とする。本発明者らは、成体およびE14.5胎児のマウスならびに成人の造血幹細胞が癌原遺伝子bmi-1を発現することを見出した。フローサイトメトリーにより測定されるように、胎児の肝臓HSC数は機能喪失bmi-1マウスで正常であった。bmi-1-/-HSCはケモカイン勾配に正常に移動できた。出生後のbmi-1-/-マウスでは、HSCの数は著しく減少したが、初期前駆体細胞は著しく減少しなかった。bmi-1-/-マウスから得られる胎児の肝臓および骨髄細胞の両方は、致死的に照射された受容者に移植した場合に、一過的にのみ造血に寄与できた。成体造血幹細胞の検出できる自己再生はなかった。これはbmi-1-/-マウスでの細胞自律的障害を示している。この研究は、bmi-1の発現が自己再生する成体造血幹細胞の生成に必須であることを示す。Park et al., 「Bmi-1 is required for maintenance of adult self-renewing hematopoietic stem cells」 Nature (2003)による原稿を参照されたい。
要約：本実験室により開発された異種移植モデルは細胞レベルでのヒト乳癌細胞の分析を可能にした。癌細胞系は多くの研究に有用であると立証されてきたが、細胞系は組織培養により課される独自条件に適応し、それらの性質の多くは患者の腫瘍の癌細胞と明らかに異なる91、109。最近、切除前の原発性乳癌腫瘍の大きさが著しく縮小した。これは患者の試料を用いた生物学的および生化学的な研究を困難にした。予備実験で記載する異種移植モデルはこの問題を改善することが意図される。予備実験は、異種移植腫瘍が起源の患者の腫瘍に見られる表現型多様性および生物学的多様性を再現する可能性があることを示唆している。環境因子によりマウスおよびヒトの腫瘍に若干の差異が存在し得るが、本明細書に記載するNOD/SCIDモデルはヒトの乳癌の利用できる最善のモデルである。結果は、乳癌細胞がこの異種移植モデルおよび初期継代に確実に移植し起源のヒトの腫瘍で見られる細胞多様性および生物学的多様性を反映する。これらの試験も異なる癌細胞集団が腫瘍形成能において異なり得ることを示す。
実施例2
ヒト乳癌腫瘍のWnt/β-カテニン経路を特徴付ける
この実施例は、上述した異種移植モデルを用いてヒト乳癌腫瘍のWnt/β-カテニン経路をどのように特徴づけできるかを記載する。Wnt/β-カテニン経路は正常な幹細胞の増殖および自己再生に役割を果たす。結腸癌と違って、かなりの割合のヒト乳癌がこの重要な経路の恒常的活性化を有すると考えられるが、この経路がヒトの前記疾患の病理学にどんな役割を果たすかは明確に確率されていない84-89。上記の異種移植モデルはヒトの乳癌腫瘍における前記経路の生物学的影響を特徴付けるために用いられ得る。これらの試験は患者からの切除直後の癌細胞および初期継代異種移植腫瘍を用いて行われる。
複数の患者の腫瘍におけるWnt/frizzled/β-カテニン・シグナル伝達経路の機能。論拠：ほぼ90％の結腸癌がβ-カテニンの活性化をもたらす突然変異を含む。最も一般的な突然変異はAPC遺伝子におけるものであり、前記遺伝子はβ-カテニン・タンパク質自体の分解または突然変異についてのβ-カテニンの標的化に関与する43、111。これらの後者の突然変異は分解を妨げる。多くの乳房腫瘍の癌細胞は結腸癌と対照的にβ-カテニンの恒常的活性化を有すると考えられる84が、APC遺伝子またはβ-カテニン自体の突然変異は、これらの事例のわずか6〜10％を占めるに過ぎない84-89。乳癌細胞のWnt/β-カテニン・シグナル伝達経路の調査は前記疾患の病因に新しい洞察をもたらすはずである。異なるfrizzled受容体に異なって結合すると考えられる多数のWntタンパク質が存在する43、65、69、78、112。Wntサブセットのみ、推論によりfrizzled受容体がβ-カテニンを活性化できる。通常、β-カテニンは細胞膜でE-カドヘリンに結合する。細胞質β-カテニンはAPCおよびAxinタンパク質と複合体を形成し、GSK3βによるβ-カテニンのリン酸化を促進する87、88、111。次いで、リン酸化されたβ-カテニンはユビキチン分解経路を経て分解される。しかしながら、Wntによりfrizzled受容体が活性化されると、β-カテニンは安定化される。次に、前記タンパク質は核に移行し、核で転写を活性化するためLGLS/BCL9、PYGOおよびTCFタンパク質と複合体を形成する113、114。本発明者らは、本発明の異種移植モデルおよび細胞検定がこの重要な経路を理解するための独自の強力な手段であると信じている。本発明者らは恒常的なβ-カテニンのシグナル伝達を有する10の腫瘍および有さない10の腫瘍を分析する。これらの研究は、Wnt経路が活性化される機構およびヒトの乳癌における前記活性化の結果に新しい洞察を付与する。
マウスにおいて、種々のWntタンパク質の異所性発現は乳房腫瘍の形成をもたらし、一方、ヒトにおいて、乳癌細胞の活性化β-カテニンはサイクリンD1の発現および予後不良に関連する78、84、115、116。しかしながら、連続的なβ-カテニンのシグナル伝達が腫瘍を形成するために腫瘍原性乳癌細胞に必要であるか否かは知られていない。恒常的なβ-カテニンのシグナル伝達がヒトの乳癌に果たし得る幾つかの可能な役割が存在する。第一に、発癌性癌細胞の連続した増殖および/または存続に必要であり得る。次に、腫瘍の開始に必要であり得るが、続く突然変異がβ-カテニンのシグナル伝達の必要性を回避する。第三に、サイクリンD1などの下流標的の活性化によって、癌細胞は化学療法に対してより抵抗性を示す。第四に、恒常的β-カテニン・シグナル伝達は癌細胞の増殖を促進するが、腫瘍原性に必要ではない。最後に、腫瘍形成におけるβ-カテニン・シグナル伝達の役割は、β-カテニンの恒常的活性化の有無に関わらず、腫瘍で異なり得る。例えば、前者の腫瘍はβ-カテニン・シグナル伝達を必要とし得る一方で、後者の腫瘍は他の腫瘍細胞からのWntシグナルを必要とし得る、またはc-mycおよび/またはサイクリンD1などの下流標的の恒常的活性化を有するため、β-カテニンと無関係であり得る。本明細書に記載する試験はヒトの癌の新規な異種移植モデルを用いてこれらの可能性を見分けるよう企画されている。データは、異種移植モデルがヒトの乳房腫瘍を実質的に再現することを示す。従って、このモデルにより、できるだけ生理的な条件でヒトのデノボ腫瘍におけるWnt経路を研究できる。
β-カテニン・シグナル伝達は複数の患者から単離された癌細胞による腫瘍形成に必要であるか。この試験は、β-カテニン経路が乳癌細胞の増殖に義務があるか否か、または活性化が腫瘍の形成に必要ではないが癌細胞の増殖速度の増加に必要であるか否かを解決する。異種移植腫瘍はヒトの腫瘍に酷似すると考えられるが、やがて、淘汰圧がマウスの環境に適応する腫瘍をもたらす。このような腫瘍の癌細胞は起源のヒトの腫瘍を構成する癌細胞と幾つかの点で異なる。本発明者らは、5つの異なる異種移植腫瘍およびβ-カテニンを活性化した5つの未継代腫瘍からの癌細胞（免疫組織化学による細胞質および/または核の発現）ならびに5つの異種移植腫瘍およびβ-カテニンを活性化しない5つの未継代腫瘍からの癌細胞（免疫組織化学による膜に結合した発現）を同定する。本発明者らは、エストロゲン受容体/プロゲステロン受容体（ER/PgR）、原発腫瘍対転移腫瘍、野生型対突然変異のp53、およびHer2/neuの増幅を含む重要な予後像について不均質な腫瘍を選別する。
β-カテニンの恒常的活性化を有する細胞を同定するために、本発明者らは、前記活性化がβ-カテニンの安定化ならびに細胞質および核における前記タンパク質の蓄積をもたらすという観察を巧みに利用する。活性化されていない場合、β-カテニンは原形質膜と結合している。従って、本発明者らは、β-カテニンの細胞内局在性を決定するために免疫組織化学を用いて、ならびにそれぞれの細胞集団により発現するβ-カテニンの量を測定するためにフローサイトメトリーを用いて、前記腫瘍のそれぞれから乳癌細胞集団を分析する。これを実施するために、本発明者らはフローサイトメトリーを用いて複数の腫瘍からLineage-癌細胞を単離する。生存凍結した異種移植片または患者の腫瘍細胞がこの分析に用いられる。次いで、癌細胞は抗体の製造業者（Transduction Laboratories）のプロトコルを用いて免疫組織化学およびフローサイトメトリー分析のために抗β-カテニンFITC抗体で染色される。活性化されたβ-カテニンを含む細胞は細胞質/核に局在し前記タンパク質のレベルが増す。
腫瘍形成におけるβ-カテニン・シグナル伝達の役割を決定するために、20個の腫瘍のそれぞれから単離されたLineage-癌細胞はアデノウイルス・ベクターまたはドミナントネガティブ（dn）なTCF4-IRES-GFPミニ遺伝子を含むレンチウイルス・ベクターのいずれかまたは対照GFPウイルスに感染する（ウイルスの構築および使用の詳細については、117を参照）。アデノウイルス・ベクターはdnTCF4を1〜3週間一過的に発現し、一方、レンチウイルス・ベクターはdnTCF4を恒久的に発現する。dnTCF4アデノウイルスはすでにdnTCF4ミニ遺伝子（Eric Fearon氏から贈与）を用いて作製された。dnTCF4はβ-カテニンと複合体を形成することにより、活性化β-カテニンによる転写トランス活性化を阻害する。dnTCF4はβ-カテニン・シグナル伝達を媒介するTCFファミリーの全構成員からのシグナル伝達を遮断する（Eric Fearon、私信）ことに留意されたい。限界希釈試験はインビトロのコロニーおよびインビボの腫瘍を形成する形質導入細胞の能力を試験するために実施される。この試験はフローサイトメトリーにより患者またはヒトの腫瘍のいずれかから単離された癌細胞を用いて行われる。系統混合物を除去して正常細胞を排除することにより、癌細胞によるマウスの組織培養および腫瘍形成におけるコロニー形成が測定できる（腫瘍原性細胞の増殖への正常間質細胞の可能な貢献は目的2Bで後述するように分析される）。癌細胞の増殖および生存におけるβ-カテニン・シグナル伝達の役割を決定するために、dnTCF4ウイルス（アデノウイルス・ベクターまたはレンチウイルス・ベクターのいずれか）および対照ウイルスに感染した個々の腫瘍から得る5組の1,000、5,000、20,000、50,000および100,000個のLineage-癌細胞は、NotchリガンドDeltaを含む培地でインビトロ培養し、形成するコロニー数が測定される。対照組織培養プレートのコロニーはサイトケラチンで染色し、新生物細胞から生じたことを確認する96。感染の2日後、細胞は蛍光顕微鏡で試験し、前記細胞の90％以上がウイルスにより形質導入されたことを確認する。同様に、インビボ限界希釈試験はdnTCF4ウイルスが異なる患者から単離された癌細胞により腫瘍形成に影響を及ぼすか否かを解決するために行われる。感染後、10組の5,000、20,000、50,000および100,000個のLineage-癌細胞がフローサイトメトリーにより単離され、次いでdnTCF4アデノウイルスまたは対照アデノウイルスに感染する。感染細胞はNOD/SCIDマウスの胸部に注入する。次に、本発明者らは、各群で腫瘍を形成するために必要な癌細胞数、各群で腫瘍を形成するために必要な時間、各群の増殖速度、および各群で形成する腫瘍の大きさを決定する。これにより、恒常的に活性化β-カテニンを有するまたは有さない癌細胞による腫瘍形成にβ-カテニンが必要であるか否かを解決できる。
その後の試験はインビボおよびインビトロ限界希釈試験の結果に依存する。β-カテニンの転写トランス活性化の阻害が腫瘍の形成を遮断するまたは腫瘍の増殖を遅らせるならば、本発明者らはサイクリンD1またはc-mycなどの下流β-カテニン標的が腫瘍原性に必要か否かの試験を始める84、85、118。これを行うために、本発明者らは、フローサイトメトリーにより単離したLineage-癌細胞を感染させ、対照もしくはdnTCF4アデノウイルスのいずれか及び対照gfpベクター、c-myc-IRES-gfpレトロウイルス・ベクター、サイクリンD1-IRES-rfpレトロウイルス・ベクター、またはmyc-IRES-gfpおよびサイクリンD1-IRES-rfpレトロウイルス・ベクターの両方に感染した。感染細胞はフローサイトメトリーにより単離され、次いで、各試験群の10組の5,000、10,000、20,000、50,000または100,000個のLineage-癌細胞がマウスに注入される。前記マウスは各試験群の腫瘍形成および増殖速度について毎週分析される。これにより、c-mycおよび/またはサイクリンのいずれかの強制発現がβ-カテニン・シグナル伝達の阻害から前記細胞を救うか否かを解決できる。
β-カテニンの阻害が腫瘍形成に何ら明確な影響を及ぼさない場合、本発明者らはドミナントネガティブな両ウイルスがdnTCF4ミニ遺伝子の発現を阻害することをまず確認する。そうでない場合、本発明者らはβ-カテニン経路を阻害するために他の方法を用いる。RNA-iおよびアンチセンス手法に加えて119-122、Axin（分解のためβ-カテニンを標的にする）の過剰発現がβ-カテニンを阻害するために用いられ得る66、75。β-カテニン・シグナル伝達が阻害され、腫瘍形成に最小効果があった又は効果がなかったならば、本発明者らは癌幹細胞により微妙な変化があるか否かを測定する。サイクリンD1の発現はβ-カテニンにより誘発され、その発現は化学療法に対する抵抗性と関連している。従って、本発明者らは、β-カテニンの阻害が化学療法の効能を増強するか否かを解決するために、dnTCF4を形質導入された癌幹細胞または対照の癌幹細胞がマウスに注入された5日後にアドリアマイシン（8mg/kg）またはタキソール（60mg/kg）でマウスを処理する。腫瘍形成および腫瘍増殖速度に及ぼす影響は上述するように測定される。
予測される結果。有意な数の乳房腫瘍の癌細胞が恒常的に活性なβ-カテニン・シグナル伝達経路を有するが、この経路が悪性形質転換に必須であるか否かは知られていない。Wnt/β-カテニン経路が癌細胞の腫瘍形成に必要であるならば、ドミナントネガティブな阻害剤は癌細胞の腫瘍形成能を阻止する。恒常的β-カテニン・シグナル伝達は悪性形質転換後の腫瘍細胞増殖を増強するが腫瘍形成に必要でないならば、ドミナントネガティブな阻害剤は腫瘍細胞の増殖を遅らせるが腫瘍の形成を阻止しない。腫瘍発生後の発癌性の突然変異が細胞をWntシグナル伝達と無関係にさせるならば、ドミナントネガティブな阻害剤は腫瘍の形成または増殖に影響しない。最後に、Wnt経路の恒常的活性化はアポトーシスへの耐性に寄与するため、前記細胞は化学療法に抵抗性を示す。
マウスの癌モデルにおいて、これらの遺伝子により形質転換された癌細胞におけるc-rasまたはc-mycの短い阻害は恒久的な腫瘍原性の喪失をもたらした123、124。これがβ-カテニン・シグナル伝達にも当てはまるならば、アデノウイルスによる一過的なシグナル伝達の阻害は腫瘍形成を阻害する。β-カテニン・シグナル伝達の阻害は腫瘍原性を阻害するが、前記細胞が依然存命し、β-カテニン・シグナル伝達の修復により前記細胞が腫瘍を形成できるならば、アデノウイルス・ベクターは腫瘍形成を遅らせるのに対して、レンチウイルス・ベクターは腫瘍形成を阻害する。β-カテニン・シグナル伝達は増殖速度を増すが腫瘍原性に義務を負わないならば、両ウイルス・ベクターは腫瘍形成を延ばし腫瘍の増殖を遅らせる。幾つかの腫瘍はβ-カテニン・シグナル伝達に依存し、残りは他の経路に依存するまたはβ-カテニン・シグナル伝達の下流エフェクターの恒常的活性化を有するならば、幾つかの腫瘍は前記ウイルス・ベクターにより作用されるが、残りは作用されない。この標的に記載される試験により、ヒトの腫瘍を再現する独自のモデルを用いて、これらの重要な疑問に回答できる。これらの試験は初めてデノボのヒト乳癌におけるβ-カテニン・シグナル伝達の生物学的機能を描く。
レンチウイルスは、効率的に前記細胞に感染する包膜が見出されるまで、他の包膜を用いて作製できる125、126。
レンチウイルス・ベクターでは、感染効率が30〜70％の範囲のみであり得ることに留意されたい。これは、腫瘍を形成し得る有意な数の腫瘍細胞が残存することを意味する。しかしながら、β-カテニン・シグナル伝達の阻害が腫瘍形成を阻害するならば、得られる腫瘍はgfpを発現しないであろう。フローサイトメトリーはdnTCF4および対照ウイルスに感染した腫瘍においてgfpを発現する細胞を測定するために用いられる。dnTCF4群から生じる腫瘍は、β-カテニン・シグナル伝達が腫瘍形成に役割を果たす場合、このような細胞で著しく縮小する。
β-カテニン・シグナル伝達の阻害は腫瘍原性乳癌細胞の表現型を変えるか。腫瘍原性および非腫瘍原性の乳癌細胞の分離に役立つ有益なマーカーの一つはCD44である。興味深いことに、CD44はβ-カテニンにより転写が上方制御される標的遺伝子の一つであり、上皮幹細胞はこのマーカーを発現できないが、それらの分化した子孫は発現する83、127。本発明者らは、β-カテニン・シグナル伝達の阻害が腫瘍原性乳癌細胞の分化をもたらしCD44の発現を喪失させることを意図する。本発明者らはさらにCD44-非腫瘍原性癌細胞が活性β-カテニンを有さないことを意図する。これを試すために、本発明者らは、フローサイトメトリーを用いて腫瘍1、腫瘍2および腫瘍3からESA+CD44+CD24-/lowLineage-癌細胞を単離し、dnTCF4アデノウイルスまたは対照アデノウイルスに感染させる。細胞は可溶性Deltaを含む組織培養培地で培養する。本発明者らは、この培地により腫瘍原性細胞が1〜3週間組織培養で増殖できることを見出した。細胞は3週間にわたってインビトロの増殖について観察される。その上、感染の1、3、7日後、dnTCF4アデノウイルスまたは対照アデノウイルスに感染した細胞はESA、CD44およびCD24の発現についてフローサイトメトリーにより分析される。
次に、本発明者らは、腫瘍原性癌細胞、CD44＋癌細胞、またはCD44-癌細胞にβ-カテニン・シグナル伝達の差異が存在するか否かを測定する。これを行うために、本発明者らは、フローサイトメトリーを用いて、腫瘍1、腫瘍2および腫瘍3からESA+CD44+CD24-/lowLineage-腫瘍原性癌細胞、CD44+癌細胞、およびCD44-非腫瘍原性癌細胞を単離する。個々の細胞集団はAPCと結合させた抗β-カテニン抗体を用いて染色する。個々の細胞集団は、β-カテニンが膜結合するか否かを決定するために蛍光顕微鏡により（恒常的に活性でない）、ならびに細胞における前記タンパク質の量を測定するためにフローサイトメトリーにより分析される。β-カテニンのレベルは活性と関連する。その上、本発明者らは、リン酸化および非リン酸化のβ-カテニンを認識する市販の抗体を使用する。リン酸化形態は分解の印である一方、非リン酸化形態は活性である128、129。これらの試験により。本発明者らはCD44の発現およびβ-カテニン・シグナル伝達が患者の癌細胞に関与するか否かを解決できる。
CD44は腫瘍原性癌細胞と非腫瘍原性癌細胞とを識別できる最良のマーカーの一つである。CD44はβ-カテニンにより転写活性されるため、β-カテニン・シグナル伝達の阻害はCD44の下方制御をもたらす。
frizzledタンパク質の異なる発現は腫瘍1の乳癌幹細胞の運命に影響を及ぼすか。データは、腫瘍1において、腫瘍原性幹細胞がfrizzled 2および6を発現し、非腫瘍原性新生物細胞がWnt3、Wnt4、Wnt7A、Wnt7B、Wnt10B、およびWnt11を発現することを示唆する。これは、この特定腫瘍の傍分泌系を示唆し、前記系では非腫瘍原性細胞が癌幹細胞の増殖を推進し得る。予備データは、腫瘍1において、腫瘍原性幹細胞がfrizzled 2および6を発現する一方、非腫瘍原性新生物細胞がfrizzled 2および7を発現することも示唆する。frizzled遺伝子の異なる発現が癌細胞の運命決定に役割を果たすことが可能である。他の可能性は、これらの遺伝子の異なる発現が分化または不死の機能であるが、この腫瘍の細胞運命決定を直接調節しないことである。この下位目的（sub-aim）はこれらの可能性を識別する。
腫瘍1の腫瘍原性細胞はfrizzled 6を発現し、非腫瘍原性癌細胞はfrizzled 7を発現する。癌細胞の増殖または自己再生をfrizzled 6は増強しfrizzled 7は阻害することが可能である。この可能性を試すため、インビトロおよびインビボのコロニー形成検定が行われる。腫瘍1の腫瘍原性および非腫瘍原性の癌細胞はfrizzled 6-IRES-GFPまたはfrizzled 7-IRES-GFPのいずれかを発現するレンチウイルス・ベクターに感染する。レンチウイルスが高い割合の初代細胞に感染し安定に形質導入できるのに対して、アデノウイルスの形質導入がしばしば一過性であるため、アデノウイルスよりむしろレンチウイルスが用いられる。frizzled 6の発現は癌細胞に自己再生能を付与することが考えられる。そうならば、frizzled 6-IRES-GFPミニ遺伝子を含むレンチウイルス・ベクターによる幹細胞および/または非腫瘍原性細胞の感染により、幹細胞の腫瘍原性が増大し得る、又は本来非腫瘍原性である細胞が腫瘍を形成し得る。逆に、frizzled 7の強制発現は腫瘍原性を阻害し得る。frizzledまたは対照ウイルスのいずれかによる感染後、各遺伝子の強制発現が個々の癌細胞集団の腫瘍形成能を変化させるか否かを決定するために限定希釈試験が行われる。
これらの試験により、本発明者らは、frizzled 6の強制発現が幹細胞の増殖および/または自己再生を増大するか否か、またはfrizzled 7が腫瘍原性癌細胞の増殖および/または自己再生を阻害するか否かを解決できる。この可能性を試すため、本発明者らは、腫瘍原性ESA+CD44+CD24-/lowLineage-癌細胞および他のLineage-を単離し、非腫瘍原性癌細胞は個々の腫瘍からフローサイトメトリーにより単離される。最初に、抗β-カテニン抗体を用いて免疫組織化学を行い、腫瘍原性細胞および非腫瘍原性細胞において活性β-カテニン量に差異があるか否かを決定する。次に、本発明者らは腫瘍原性細胞および非腫瘍原性細胞においてリン酸化（不活性化）および非リン酸化（活性）のβ-カテニンの量を測定する128。
次に、組織培養の腫瘍原性細胞および非腫瘍原性細胞によるコロニー形成に及ぼすそれぞれの遺伝子の影響を測定するインビトロ検定が企画される。フローサイトメトリーによる単離後、それぞれの細胞集団は同一のMOIのfrizzled 6/GFP、frizzled 7/GRPまたは対照GFPウイルスのいずれかに感染する。100、500、1,000、および5,000個の細胞の3部培養は組織培養培地に置かれる。GFP+コロニーの総数ならびにコロニーの総数およびGFP+コロニーの数は、3、7、14、21、および28日目に計数する。21日目の終わりに、本発明者らは特定のfrizzled遺伝子の発現が自己再生に影響を及ぼすか否かを決定するために前記細胞を継代することを試みる。
NOD/SCIDマウスにおける新生物細胞の腫瘍形成能に及ぼす各frizzled遺伝子の強制発現の影響が測定される。通常、200個の腫瘍1細胞が腫瘍を形成するために必要である。従って、frizzled 6、frizzled 7または対照GFPのレンチウイルスは、50、100、500、1,000、5,000、および10,000個の腫瘍原性癌細胞または非腫瘍原性癌細胞を感染するために用いられる。前記細胞は免疫欠損マウスに注入される。腫瘍を形成するのに必要な細胞数および腫瘍増殖の速度が観察される。腫瘍は1センチメーターの大きさに到達した後、摘出され、GFPの発現についてフローサイトメトリーにより分析される。GFPウイルスおよびfrizzled/GFPウイルスにより感染した細胞の割合を比較することにより、本発明者らは、感染効率、および増殖に及ぼす後者ウイルスの影響を見積もることができる。これらの試験は三回反復する。
予測される結果：腫瘍1において、異なる細胞集団が異なるfrizzledタンパク質を発現し、非腫瘍原性細胞はWntタンパク質を選択的に発現すると考えられる。これは、ある種の非腫瘍原性細胞の集団がWntを通じて腫瘍形成を促進することを示唆している。β-カテニン・シグナル伝達が非腫瘍原性細胞で下方制御され腫瘍原性サブセットで活性である場合、これは非腫瘍原性および腫瘍原性の癌細胞においてリン酸化および非リン酸化のβ-カテニンの発現パターンをそれぞれ免疫組織化学分析することにより検出される。特定のfrizzled/GFPウイルスの影響がないならば、同様な割合の細胞がそれぞれの群でGFPを発現し、腫瘍を形成するのに必要な細胞数に差異はない。特定のfrizzledウイルスが腫瘍原性または増殖を増減するならば、frizzled/GFPウイルスに感染した腫瘍は、それぞれ、少数または多数のGFP+細胞を有するであろう、ならびに/または腫瘍を形成するために多数または少数の細胞を要するであろう。
必要ならば、ネコ白血病ウイルス、レンチウイルスに基づくベクター系が用いられる。この後者のベクターは非複製細胞を効率的に形質導入し、導入遺伝子の長期発現をもたらす。本発明者らは遺伝子インスレーターにより隣接するtet誘導性dnTCF-IRES-GFPレンチウイルスまたは対照GFPレンチウイルスを用いて細胞を感染できる。腫瘍を採取する1〜2日前に、導入遺伝子が活性化される。GFP+乳癌幹細胞は収集されNOD/SCIDマウスの胸部に移植される。本発明者らはマウスで導入遺伝子の発現を誘導し続け、本発明者らは前記細胞の腫瘍形成能について観察できる。
β-カテニン・シグナル伝達経路は、恒常的に活性化したβ-カテニンの有無に関わらず、癌から単離される癌細胞において異なる。論拠：結腸癌と違って、β-カテニン・シグナル伝達経路の突然変異は少数の乳癌細胞でのみ検出されている。しかしながら、これらの研究はAPCおよびβ-カテニンにのみ焦点を合わせている。この目的上、本発明者らは具体的な目的1Aの生体レベルで分析された個々の腫瘍のβ-カテニン経路を詳しく調べる。
Wnt経路は異なる腫瘍から単離される癌細胞で相違するか。これらの実験において、本発明者らは個々の腫瘍のWnt/β-カテニン経路を特徴付ける。これを行うために、本発明者らは、β-カテニンが恒常的に活性化する10個の腫瘍のそれぞれから得る癌細胞により発現するβ-カテニンのコード配列、それぞれのfrizzledタンパク質、低密度リポタンパク質に関連するWnt受容体、APC、TCFファミリーの構成員、Axin、およびBcl-9を増幅するためにRT-PCRを用いる。発現遺伝子のRT-PCR産物は配列決定され、いずれかの遺伝子に突然変異が存在するか否かを決定する。あらゆる可能な突然変異遺伝子が独立したRT-PCR試料の反復配列決定により確認される。突然変異が見出される場合、本発明者らは前記突然変異がWnt/β-カテニン経路の恒常的活性化をもたらすか否かを確定する。これを行うために、突然変異遺伝子-IRES-GFPはpCDNA3真核細胞発現ベクターにクローニングされる。例えば、本発明者らが変異体frizzled 2を見出すならば、HEK293細胞（活性化β-カテニンを有さない130）は変異体frizzled 2-IRES-GFP発現ベクターまたは対照IRES-GFPベクターでトランスフェクションされる。細胞は抗β-カテニンPE抗体で染色し、蛍光顕微鏡は変異体frizzled 6がβ-カテニンの細胞質/核の局在を惹起する（シグナル伝達の活性化を示す）か否かを判断するために行われる。この検定により、本発明者らはβ-カテニン経路の構成要素の突然変異がヒト乳癌幹細胞に異常なシグナル伝達を引き起こすか否かを確定できる。
予測される結果。恒常的に活性なβ-カテニンは有意な数の乳癌腫瘍の癌細胞において見られるが、その機構は知られていない。これらの研究により検出される異なる腫瘍細胞においてシグナル伝達経路に差異が存在する。Wnt受容体またはβ-カテニン修飾因子の突然変異が存在するならば、配列決定研究がこの差異を検出する。自己分泌刺激が存在するならば、本発明者らは癌細胞によるWntリガンドの一つの発現を見出す。
幾つかの腫瘍の異なる腫瘍細胞集団によるWnt発現は乳癌細胞の増殖を推進するか。おそらく、他のあらゆる種類の癌よりももっと、乳癌腫瘍は、間葉（間質）細胞、炎症細胞、および悪性細胞と相互作用し腫瘍の増殖および浸潤を調節する内皮細胞を含む、不均質な正常細胞集団を含む。本目的は、このような相互作用におけるWnt経路の役割を理解し始めることである。本発明者らは、間葉細胞および内皮細胞を含む正常な間質要素が、腫瘍細胞の増殖および浸潤に影響する異なるWntを産生することを意図する。異種移植腫瘍が正常なマウスの間質細胞に浸潤することが予想されるため、ならびにマウス細胞の分析があまりに複雑であるため、全く継代していない腫瘍が分析される。フローサイトメトリーによるこれらの細胞の精製は、最初に前記細胞を組織培養することなく、これらの細胞の分子分析および生物学的分析の両方を可能にする。これは、正常細胞がインビトロで培養されると遺伝子発現を変化させることが知られているため、特に重要である。
正常な間質細胞は乳癌細胞の増殖に役割を果たすと考えられる。癌細胞間の細胞-細胞相互作用は腫瘍増殖に寄与することもあり得る。Wntシグナル伝達は正常な組織細胞が互いに伝達し合うために用いる主要経路の一つである。従って、この経路がどのように腫瘍で調節されるかを理解することは重要である。特異的なWntタンパク質は特定のfrizzled受容体を活性化し得る。幾つかのfrizzled受容体はβ-カテニンを介して合図する一方で、他は異なる経路を通して合図する。腫瘍内の様々な腫瘍細胞集団がどのようにこの経路を通して腫瘍原性乳癌細胞と伝達し合うのかを理解するために、本発明者らは、どのfrizzled遺伝子およびWnt遺伝子が正常細胞および複数の患者の腫瘍から得る癌細胞により発現するかをまず確定しなければならない。従って、本発明者らは、正常細胞の各集団、および恒常的β-カテニン・シグナル伝達を有する5人の患者の腫瘍試料から単離される癌細胞、および前記タンパク質の恒常的活性化を有さない5人の患者の腫瘍からの癌細胞により発現するWnt経路の遺伝子を同定する。
本発明者らの証拠は、異なる癌細胞集団におけるWnt遺伝子およびfrizzled遺伝子の発現に相違があることを示唆するため、これらの試験を行うために癌の異なる表現型の細胞サブセットを単離することが重要である。これは明らかに腫瘍原性の細胞集団が少数派集団であるためであり、これらの細胞が発現する遺伝子は分析で見逃されかねない。従って、フローサイトメトリーが用いられ、腫瘍原性および非腫瘍原性の乳癌細胞、ならびに患者の起源腫瘍から得る正常な内皮細胞および線維芽細胞を単離する。これは予備結果および目的1に記載するように行われる。RNAは35,000個の各細胞集団のプールから単離され、次いで、線形増幅が行われ、マイクロアレイ分析に十分なプローブを作製する131-135。どのfrizzled遺伝子およびWnt遺伝子が個々の腫瘍で見出される各細胞集団により発現するかを確定するために、本発明者らはWnt遺伝子およびfrizzled遺伝子を含むAffimetrix・マイクロアレイ・チップ（各細胞型につき3チップ）を精査する（新しく発売されたU133チップはこれらの遺伝子の大半を有する）。
結果は、癌細胞における活性化β-カテニンの有無に関わらず、原発腫瘍から単離される異なる癌細胞集団の定量的RT-PCRにより確認される。リアルタイムRT-PCRは、正常細胞および新生物腫瘍細胞の異なる集団によるfrizzled遺伝子およびWnt遺伝子のそれぞれの発現レベルを測定するために行われる。これを行うために、本発明者らはこれらの遺伝子のそれぞれを検出するためのPCRプライマーを作製する。それぞれのプライマー・セットは、RT-PCRが腫瘍細胞の異なる集団におけるmRNAの発現を検出するために使用できるように、少なくとも一つのエキソンにわたっている。フローサイトメトリーが用いられて、それぞれの腫瘍で同定される腫瘍原性の細胞集団を単離する。次いで、リアルタイムPCRが用いられ、マイクロアレイ分析で同定される個々の細胞集団によるWnt経路に関連するRNAのそれぞれの発現を測定する（136で概説される）。リアルタイムPCR遺伝子発現分析を行うために、mRNAは3×104細胞から精製される（フローサイトメトリーにより単離される）。RNAの一部はRibogreen RNA定量方法（Molecular Probes, Eugene, OR）によりRNA量を直接測定するために使用され、一部はTaqmanリアルタイムRT-PCRアッセイによりrRNAおよびGAPDH（対照のハウスキーピング遺伝子）の発現を測定するために使用される。総合すれば、これらの対照測定により、本発明者らは異なる細胞集団間での対象となる遺伝子の発現を標準化できる136。より少数の細胞がこの検定で使用されるかもしれないが、3×104細胞から単離されるRNAの分析は遺伝子発現のより正確な測定をもたらすはずである。
個々の腫瘍から得られる異なる癌細胞集団により発現する個々のfrizzled受容体は、腫瘍内の異なる細胞集団により発現する異なるWnt遺伝子のそれぞれにより刺激される場合、β-カテニンを活性化し細胞を形質転換する能力について分析される。二つの生体系がこれらの研究に用いられる。第一に、本発明者らは、このスクリーニングで同定された個々のfrizzledをトランスフェクトしたHEK293細胞を用いて、腫瘍原性細胞により発現するfrizzledタンパク質を介してβ-カテニンを活性化する同定Wntの能力を試験する。次に、本発明者らは乳房上皮細胞系を用いて、特定のWnt遺伝子またはfrizzled遺伝子が前記細胞系を形質転換できるか否かを確定する。
乳癌細胞により発現する異なるWntおよびfrizzledタンパク質の生化学的機能を測定するために、本発明者らはGazit et al.130により記載されるような一過性トランスフェクション検定を用いる。この検定において、HEK293T細胞はfrizzledミニ遺伝子または対照ミニ遺伝子およびTCF-ルシフェラーゼ即ち対照レポーター・ミニ遺伝子を用いて一過的にトランスフェクションされる。特定のWntタンパク質がβ-カテニン・シグナル伝達を刺激する能力を試験するため、HEK293T細胞の第二群は腫瘍細胞の様々な集団により発現するそれぞれのWnt遺伝子を用いてトランスフェクションされる。frizzledをトランスフェクトされた細胞はWntをトランスフェクトされた細胞と混合し、腫瘍細胞の様々な集団の一つにより発現する特定のWntタンパク質により刺激された際にβ-カテニンを活性化する乳癌幹細胞により発現する特定のfrizzled受容体の傍分泌活性を測定する。
C57MG細胞系は、特定のWntによる特定のfrizzled受容体の活性化が形態変換を惹起するか否かを判断するために用いられる137。これらの細胞は、Wnt-1、Wnt-2、Wnt-3A、Wnt-6およびWnt-7Aに暴露された場合に形態変換を経るが、Wnt4、Wnt-5A、Wnt-5BおよびWnt-7Bに暴露された場合は経ない。これらのデータは、非変換Wntが変換Wntと異なって伝達すること、またはC57MG細胞により発現しない異なる受容体を介して伝達することを示唆する。従って、患者の腫瘍の癌細胞により発現する異なるfrizzledおよびWntタンパク質の機能を十分に特徴付けるため、本発明者らはどのfrizzled遺伝子がC57MG細胞により発現するのかをまず確定しなければならない。前記細胞は、腫瘍原性乳癌細胞により発現するがC57MG細胞により発現しない、いずれかのfrizzled遺伝子を発現するミニ遺伝子を用いてトランスフェクションされる。次に、細胞は、致死照射された線維芽細胞または腫瘍細胞の異なる集団により発現する個々のWnt遺伝子でトランスフェクトされたHEK293T細胞の存在下で培養される。前記細胞はShimizu138により記載されるような形態変換について分析される。
次に、本発明者らは腫瘍細胞により為される異なる患者の腫瘍から異なるWntへの癌細胞のインビボ応答を特徴付ける。Wntタンパク質はしばしば細胞外基質で見出され、可溶形態で調製することが困難である。従って、本発明者らは、2人の患者の腫瘍に存在する様々な種類の腫瘍細胞により産生される、それぞれのWntを発現する対照のHEK293細胞系を作製する。これを行うために、本発明者らはまずHEK293細胞を分析して前記細胞がWntタンパク質のいずれかを恒常的に産生するか否かを確定する。次に、本発明者らは患者の腫瘍細胞により産生するWntのそれぞれを用いてHEK293細胞を安定にトランスフェクトする。インビボにおけるWntのそれぞれのリガンドによる乳癌細胞のWnt刺激の影響を測定するために、0、10、50、100、200、500、および1,000個の腫瘍1幹細胞は、500,000個の致死照射された対照の293細胞または一つまたは複数の関連Wntミニ遺伝子をトランスフェクトされた293細胞と混合した後、免疫欠損マウスに注入される。各注入は5匹のマウスで行う。次に、前記マウスは腫瘍形成について毎週観察される。特定のWntが自己再生細胞の分裂を刺激するならば、いずれかの少数の細胞が一つまたは複数の腫瘍の形成をより迅速に開始するために必要である。逆に、前記リガンドが分化へのコミットメントを誘導するならば、より多くの細胞が形成するのに時間がかかる一つおよび/または複数の腫瘍を形成するために必要である。
予測される結果。腫瘍の正常な間質細胞と癌細胞との相互作用は腫瘍の形成および転移に重要であると考えられる33。Wnt経路は正常組織の細胞が伝達する中枢経路の一つである65。従って、このような伝達はある程度腫瘍で維持されると考えられる。この提言に記載するモデルは、このような研究が患者の腫瘍細胞を用いて実施されることを初めて可能にする。間質細胞が実際にWntシグナル伝達を通して腫瘍の増殖を促進するならば、腫瘍原性癌細胞に増殖シグナルを与える間質細胞の様々な集団が特異的なWntを産生する。
これらの問題を最小限にするため、全ての試験は異なる数の細胞を用いて三回行われる。公知量の対照RNAの発現はデータを分析するために標準曲線を構築するために用いられる（136で概説される）。必要ならば、新しいPCRプライマーが作製され、またはmRNAの異なる部分を認識する遺伝子特異的プライマーを用いてRTが行われる（オリゴdTプライマーは最初にRT反応に用いられる）。
要約：これらの試験は、複数の患者の腫瘍から直接得られる乳癌細胞の腫瘍原性集団においてβ-カテニン経路がインビボで活性化される分子機構、ならびにデノボの乳癌細胞における前記活性化の生物学的影響を初めて包括的で詳細に記載する。
実施例3
腫瘍原性細胞におけるβ-カテニンの局在性
正常な造血細胞において、核のβ-カテニンは幹細胞区画にのみ見出される。Reya et al.はさらにβ-カテニン・シグナル伝達が正常な幹細胞の自己再生に必要であることを証明する。最近完了した、腫瘍原性および非腫瘍原性の腫瘍1乳癌細胞におけるβ-カテニンの細胞内局在性の分析はこの考えをさらに支持する。通常、β-カテニンの細胞内分布は癌細胞で不均一である。幾つかの細胞では、前記タンパク質は主として外膜に局在する一方、他では、主として核に局在する。前記タンパク質の細胞内分布は腫瘍原性および非腫瘍原性の癌細胞で異なる。β-カテニンは非腫瘍原性癌細胞の細胞質に主として局在し、一方、腫瘍原性細胞の核に主として存在する（図8）。Wntシグナルにより活性化されると、β-カテニンは細胞膜から核に移行して下流の標的遺伝子を活性化するため、このデータは、Wntシグナル伝達が乳癌幹細胞の自己再生で役割を果たすという仮説を支持する。
図8はβ-カテニンの細胞内局在性を示す。FITCで標識された抗β-カテニン抗体は、（A）恒常的に活性化したβ-カテニンを含む結腸癌細胞、（B）非腫瘍原性T1乳癌細胞、および（C）腫瘍原性乳癌細胞を染色するために用いた。腫瘍原性および非腫瘍原性の癌細胞は、Al-Hajj et al.によりPNASの原稿に記載されるように、フローサイトメトリーにより単離された。β-カテニンは結腸癌細胞および乳癌幹細胞の核に主として局在するが、非腫瘍原性細胞の表面に主として局在することに留意されたい。
乳癌におけるβ-カテニン・シグナル伝達の生物学的影響を理解し始めるために、本発明者らは幾つかの細胞系でドミナントネガティブなTCF-4（dTCF4）アデノウイルス・ベクターを試験した。このアデノウイルスはβ-カテニン・シグナル伝達を阻害するように振舞う。二つの異なる乳癌細胞系であるSKBR3およびMCF7、ならびに胃腸管癌細胞系のRKOは、dTCF4アデノウイルスまたは対照アデノウイルス（空ベクター）に感染した。感染の4日後、各群の存命細胞の数が測定された。図9に示すように、dTCF4アデノウイルスに感染した乳癌細胞は死んだが、対照アデノウイルスに感染した前記細胞は死ななかった。これらのデータは、Wnt経路がヒトの乳癌において役割を担うことを示している。
図9は癌細胞におけるβ-カテニン・シグナル伝達の阻害を示す。SKBR3細胞（A）、MCF7細胞（B）およびRKO細胞（C）の3部培養は、対照のアデノウイルス（空ベクター）またはドミナントネガティブなTCF4ミニ遺伝子（dTCF4）を発現するアデノウイルス・ベクターに感染した。ウイルス濃度が上がるにつれ、SKBR3細胞およびMCF7細胞は生存能力を失ったが、RKO細胞は失わなかった。細胞死をもたらすウイルス力価は大半の標的細胞が対照GFPウイルスに効率的に感染するのに必要なものであったことに留意されたい（データは示していない）。この実験は同様な結果で反復した。
β-カテニンは、非腫瘍原性癌細胞でなく、腫瘍原性癌細胞で主として核に局在するという観察は、β-カテニン・シグナル伝達の阻害が幾つかの乳癌細胞系の生存能力に影響を及ぼすという観察とともに、Wntシグナルが正常な幹細胞と同様に癌幹細胞の自己再生に役割を果たし得ることを示す。
実施例4
幹細胞癌マーカーの同定
この実施例は、種々の幹細胞癌マーカーがどのようにマイクロアレイ・スクリーニングを用いて同定されたかを記載する。これらのスクリーニングの結果は処理され、異なって発現する遺伝子の名前は表4〜8に報告される（上記参照）。
遺伝子発現プロファイルを作成するために、ヒトの乳房の腫瘍原性細胞が最初に単離された。一連の試料はヒトの乳房腫瘍または正常組織から集めた。これらは下記の通りに作製された。3継代乳房腫瘍---患者1、2、3から得た乳房腫瘍細胞はマウスに移植し、腫瘍は3匹のマウスに移植し、3通りの腫瘍を生成した。次に、乳房腫瘍原性細胞はこれらの腫瘍から単離された。3人の患者、SUM、PE13、PE15から得た2未継代または3未継代の乳房腫瘍は標識され、腫瘍原性細胞（TG）または非腫瘍原性細胞（NTG）に選別された。PE15-TGおよびPE15-NTGはともに3部構成であった。2つまたは3つの正常な乳房試料は乳房縮小患者から得た。乳房上皮細胞（乳房）はフローサイトメトリーで単離されマイクロアレイに用いた。2つまたは3つの正常な結腸試料は結腸患者から新しく採取した。結腸上皮細胞（結腸）はフローサイトメトリーで単離されマイクロアレイに用いた。2つまたは3つの正常な幹細胞試料（正常骨髄）は骨髄提供者から採取した。造血幹細胞（HSC）はフローサイトメトリーで単離された。下記から作製されたプローブはマイクロアレイ分析で用いる種々の細胞型から作製された。
種々のマイクロアレイ・スクリーニングを実施するために、AffimetrixHG-U133遺伝子チップが使用された。正規化遺伝子発現強度は幾つかの大きな表で回収されるデータを作成するために用いた。これらの表の結果は処理され、表4、5、6、7a、7b、7c、7dおよび8を作成するために用いた。前記表は異なって発現することが見出された遺伝子名を提示する。表4〜6については、候補の癌マーカーは、その発現が非腫瘍原性細胞または正常幹細胞（HSC）と比べて未継代の乳房腫瘍原性細胞において1.5倍超過または未満である遺伝子を同定することにより、選別された。表6はUPTG対UPNTGで下方制御されることが見出された遺伝子のみを示す。表5はUPTG対HSCで上方制御されることが見出された遺伝子のみを示す。表4はUPTG対UPNTGで上方制御されることが見出された遺伝子のみを示す。表7a、7b、7cおよび7dについては、癌マーカーは標準的なT-検定により大きな表から作製された。これらの表は、t-点が<0.01であり比が2倍より多くであることに基づいて選別された。表7aはUPTG対HSCで上方制御されることが見出された遺伝子のみを示す。表7bはUPTG対HSCで下方制御されることが見出された遺伝子のみを示す。表7cはPTG対HSCで上方制御されることが見出された遺伝子のみを示す。表7dはPTG対HSCで下方制御されることが見出された遺伝子のみを示す。
参照文献
Figure 2007516693
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上記の明細書で言及した全ての刊行物および特許は参照により本明細書に組み入れられる。本発明の記載方法およびシステムの種々の改変および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかであろう。本発明は特に好ましい態様に関連して記載されてきたが、請求される本発明がこのような特定の態様を過度に限定するべきでないことが理解されるはずである。実際に、本発明を実施するための記載様態の種々の改変は、当業者に明白であり、下記の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
腫瘍原性細胞の単離を示す。 腫瘍原性および非腫瘍原性の乳癌細胞のDNA含量を示す。 正常なマウスの組織のみを示したCD24＋注入部位(a)（20倍対物倍率）、一方、悪性細胞を含んだCD24-/low注入部位(b)（40倍対物倍率）からの組織学を示す。(c)CD44+CD24-/lowLineage-注入部位であって、CD44+CD24＋Lineage-注入部位ではないマウスの典型的な腫瘍。T3細胞はパパニコロー染色で染色し顕微鏡（100倍対物）で調べた。非腫瘍原性(c)および腫瘍原性(d)の両群は新生物の外観で大核および大きな核小体を有する細胞を含んだ。 CD44+CD24-/lowLineage-細胞から生じる腫瘍の表現型多様性を示す。 Wnt（左パネル）およびfrizzled（右パネル）の発現を示す。 正常な腫瘍線維芽細胞及び内皮細胞の単離を示す。 アデノウイルス・ベクターを用いた乳癌幹細胞の感染を示す。 β-カテニンの細胞内局在性を示す。 癌細胞におけるβ-カテニンのシグナル伝達の阻害を示す。

Claims (21)

  1. a）被験体から組織試料を提供する工程、および
    b）該組織試料における充実性腫瘍幹細胞の有無が測定されるような条件下で表4〜8の少なくとも一つの幹細胞癌マーカーを該組織試料において検出する工程
    を含む、充実性腫瘍幹細胞を検出するための方法。
  2. 検出工程が、少なくとも一つの幹細胞癌マーカーの発現レベルを測定する工程を含む、請求項1記載の方法。
  3. 検出工程が、少なくとも一つの幹細胞癌マーカーのmRNA発現を検出する工程を含む、請求項1記載の方法。
  4. 検出工程が、少なくとも一つの幹細胞癌マーカーのポリペプチド発現を検出する工程を含む、請求項1記載の方法。
  5. 被験体がヒトの被験体を含む、請求項1記載の方法。
  6. 組織試料が腫瘍組織を含む、請求項1記載の方法。
  7. 被験体に予後を提供する工程C）をさらに含む、請求項1記載の方法。
  8. 少なくとも一つの幹細胞癌マーカーが表8に由来する、請求項1記載の方法。
  9. 少なくとも一つの幹細胞癌マーカーが、Bmi-1、eed、easyh1、easyh2、rnf2、yy1、smarcA3、smarcA5、smarcD3、smarcE1、mllt3、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、WNT10B、WNT16、AXIN1、BCL9、MYC、および(TCF4)からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
  10. 表4〜8に示される少なくとも一つの幹細胞癌マーカーに対する少なくとも一つの薬剤を含む、生物学的有効量の組成物と充実性腫瘍の細胞とを接触させる工程を含む、充実性腫瘍の大きさを縮小する方法。
  11. 生物学的有効量が、充実性腫瘍において充実性腫瘍幹細胞の細胞死を惹起するまたは増殖を阻害するのに十分な量である、請求項10記載の方法。
  12. 少なくとも一つの薬剤が抗体、ペプチド、または小分子である、請求項10記載の方法。
  13. 抗体、ペプチドまたは小分子が、少なくとも一つの幹細胞癌マーカーの細胞外ドメインに向けられたものである、請求項12記載の方法。
  14. 少なくとも一つの幹細胞癌マーカーが、Bmi-1、eed、easyh1、easyh2、rnf2、yy1、smarcA3、smarcA5、smarcD3、smarcE1、mllt3、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、WNT10B、WNT16、AXIN1、BCL9、MYC、および(TCF4)からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
  15. 表4〜8に示される少なくとも一つの幹細胞癌マーカーに対する少なくとも一つの薬剤を含む生物学的有効量の組成物と充実性腫瘍幹細胞とを接触させる工程を含む、充実性腫瘍幹細胞を死滅させる方法または該細胞の増殖を阻害する方法。
  16. 接触後に充実性腫瘍幹細胞の死または増殖予防を確認する工程をさらに含む、請求項15記載の方法。
  17. 細胞死がアポトーシスである、請求項16記載の方法。
  18. 少なくとも一つの幹細胞癌マーカーが、Bmi-1、eed、easyh1、easyh2、rnf2、yy1、smarcA3、smarcA5、smarcD3、smarcE1、mllt3、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、WNT10B、WNT16、AXIN1、BCL9、MYC、および(TCF4)からなる群より選択される、請求項15記載の方法。
  19. 充実性腫瘍幹細胞が細胞表面マーカーCD44、ESA、またはB38.1を発現する、請求項15記載の方法。
  20. 癌細胞におけるβ-カテニンの局在性が主に核または主に細胞質であると決定されるように、癌細胞におけるβ-カテニンの存在を検出する工程を含む、腫瘍原性と非腫瘍原性の癌細胞を識別する方法。
  21. β-カテニンの局在性が主に核である場合に癌細胞を腫瘍原性と同定する工程、またはβ-カテニンの局在性が主に細胞質である場合に癌細胞を非腫瘍原性と同定する工程をさらに含む、請求項20記載の方法。
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