TWI468519B - Methods of detecting squamous cell carcinoma in vitro - Google Patents
Methods of detecting squamous cell carcinoma in vitroInfo
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Description
本發明係有關一種檢測癌症的方法，尤指一種以基因融合作為檢測鱗狀細胞癌之標的的檢測方法。
鱗狀細胞癌(Squamous-cell carcinoma)是一種可能發生在許多不同的器官，包括皮膚，唇，口，食道，膀胱，前列腺，肺，陰道和子宮頸等不同類型的癌症。不同鱗狀細胞癌的發病率依據年齡，性別，種族，地理和遺傳學而異，其發病率隨著年齡的增加，發病高峰期通常是66歲左右。其中膀胱與前列腺的鱗狀細胞癌男性發病的比例較女性發病比例高，而皮膚的鱗狀細胞癌又以白種人較容易發病。如果長期暴露於紫外線輻射下，或具有皮膚的退化性病變，如疤痕、潰瘍，也較有機會罹病。此外，接觸砷或來自工業的污染也可能會顯著增加罹患鱗狀細胞癌的風險。
目前作為檢測鱗狀細胞癌的方法是以基因的過量表現作為指標，搭配病理切片(Elective neck dissection(END))的免疫染色(IHC)而有輔助診斷的效果，對於無明顯外觀差異的癌症早期檢測，多先使用黏膜篩檢(sentinel node biopsy(SNB))，再進一步用病理切片的免疫染色確認，並以VEGF-A,VEGF-C,EGFR,COX-2,c-myc,Cyclin D1,Cyclin A,Rb,p16,p21,p27,p34等基因的過量表現作為診斷的輔助(Seki,et al.,2011,
Oral Oncol.,47(7)：588-93；Massano,et al.,2006,Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,pp.67-76；Alkureishi,et al.,2009,Ann Surg Oncol.,16(11)：3190-210)。而上述技術在進行黏膜篩檢時，上述基因指標在癌症早期表現量並不高，等到癌症越晚期表現量越高，故對於癌症早期樣本的檢測常常無法與正常細胞區別，造成偽陰性的判斷，而有待改良。
癌症研究的主要目的是要找出和腫瘤發生改變具有因果關係的基因，其中幾種類型的體細胞突變已被發現，包括鹼基替換，插入，刪除，易位，基因套數的增減等，導致癌基因或抑癌基因的活性發生改變。此外，近來有越來越多的研究顯示，染色體易位和癌症具有因果關係(Rowley,Nat Rev Cancer 1：245(2001))。然而，在人類癌症的發病率和死亡率佔有相當比例的上皮腫瘤(Epithelial tumors(carcinomas))當中，相關的染色體易位被發現的數量，不到所有已知染色體易位總數的1%，(Mitelman,Mutat Res 462：247(2000))。
若能發現和鱗狀細胞癌具有因果關係之基因融合，不但對於鱗狀細胞癌檢測提供全新的標的，也將對鱗狀細胞癌的研究和治療提供更周全的思路。
本發明之主要目的，在於因以習用上述基因作為檢測鱗狀細胞癌指標的方法，會有偽陰性的判斷，為此本發明提供一種新發現的角質蛋白基因融和作為指標，提升檢測鱗狀細胞癌的準確性。
為達上述目的，本發明提供一種活體外檢測鱗狀細胞癌的方法，該方法包含步驟(a)取得一鱗狀細胞樣本檢體，步驟(b)檢測該鱗狀細胞樣本檢體中是否存在一基因融合，該基因融合包含有一具有一第一型角質蛋白基因的5'端，以及一具有一第二型角質蛋白基因的3'端，該第一型角質蛋白基因為KRT14基因，該第二型角質蛋白基因係選自由KRT6A基因、KRT6B基因及KRT6C基因所組成的群組，其中，該基因融合若存在於該鱗狀細胞樣本檢體中，定義該鱗狀細胞樣本檢體的具有鱗狀細胞癌。
進一步地，該步驟(b)包含偵測該鱗狀細胞樣本檢體中是否有基因體DNA的染色體易位的步驟，該基因體DNA包含有一具有該第一型角質蛋白基因的5'端，以及一具有該第二型角質蛋白基因的3'端，其中該KRT14基因包含有SEQ ID No：15之核苷酸序列，該KRT6A基因包含有SEQ ID No：11之核苷酸序列，該KRT6B基因包含有SEQ ID No：12之核苷酸序列，該KRT6C基因包含有SEQ ID No：13之核苷酸序列。
進一步地，該步驟(b)包含偵測該鱗狀細胞樣本檢體中是否有基因融合的mRNA的步驟，該基因融合mRNA具有一自該第一型角質蛋白基因轉錄的3'端，以及一具有該自第二型角質蛋白基因轉錄的5'端，其中該KRT14基因包含有SEQ ID No：15之核苷酸序列，該KRT6A基因包含有SEQ ID No：11之核苷酸序列，該KRT6B基因包含有SEQ ID No：12之核苷酸序列，該KRT6C基因包含有SEQ ID No：13之核苷酸序列。
進一步地，該步驟(b)包含偵測該鱗狀細胞樣本檢體中是否有一基因融合蛋白，該基因融合蛋白包含有一具有一第一型角質蛋白
之胺基酸序列的N端，以及一具有一第二型角質蛋白之胺基酸序列的C端，其中該第一型角質蛋白胺基酸序列為KRT14蛋白之胺基酸序列，該KRT14蛋白之胺基酸序列包含有SEQ ID No：22之胺基酸序列，該第二型角質蛋白胺基酸序列為選自由KRT6A蛋白之胺基酸序列、KRT6B蛋白之胺基酸序列以及KRT6C蛋白之胺基酸序列所組成的群組，該KRT6A蛋白之胺基酸序列包含有SEQ ID No：18之胺基酸序列，該KRT6B蛋白之胺基酸序列包含有SEQ ID No：19之胺基酸序列，該KRT6C蛋白之胺基酸序列包含有SEQ ID No：20之胺基酸序列。
進一步地，該鱗狀細胞樣本檢體係選自由口腔上皮細胞、子宮頸上皮細胞、鼻咽腔上皮細胞以及食道上皮細胞所組成的群組。
另外，本發明提供一種活體外檢測鱗狀細胞癌的方法，該方法包含步驟(a)取得一鱗狀細胞樣本檢體，步驟(b)檢測該鱗狀細胞樣本檢體中是否存在一基因融合，該基因融合包含有一具有一第二型角質蛋白基因的5'端，以及一具有一第一型角質蛋白基因的3'端，該第一型角質蛋白基因為KRT14基因，該第二型角質蛋白基因係選自由KRT6A基因、KRT6B基因及KRT6C基因所組成的群組，其中，該基因融合若存在於該鱗狀細胞樣本檢體中，定義該鱗狀細胞樣本檢體具有鱗狀細胞癌。
進一步地，該步驟(b)包含偵測該鱗狀細胞樣本檢體中是否有基因體DNA的染色體易位的步驟，該基因體DNA包含有一具有該第二型角質蛋白基因的5'端，以及一具有該第一型角質蛋白基因的3'端，其中該KRT14基因包含有SEQ ID No：15之核苷酸序列，該KRT6A基因包含有SEQ ID No：11之核苷酸序列，該KRT6B基因包
含有SEQ ID No：12之核苷酸序列，該KRT6C基因包含有SEQ ID No：13之核苷酸序列。
進一步地，該步驟(b)包含偵測該鱗狀細胞樣本檢體中是否有基因融合的mRNA的步驟，該基因融合mRNA具有一自該第二型角質蛋白基因轉錄的3'端，以及一具有該自第一型角質蛋白基因轉錄的5'端，其中該KRT14基因包含有SEQ ID No：15之核苷酸序列，該KRT6A基因包含有SEQ ID No：11之核苷酸序列，該KRT6B基因包含有SEQ ID No：12之核苷酸序列，該KRT6C基因包含有SEQ ID No：13之核苷酸序列。
進一步地，該步驟(b)包含偵測該鱗狀細胞樣本檢體中是否有一基因融合蛋白，該基因融合蛋白包含有一具有一第二型角質蛋白之胺基酸序列的N端，以及一具有一第一型角質蛋白之胺基酸序列的C端，其中該第一型角質蛋白胺基酸序列為KRT14蛋白之胺基酸序列，該KRT14蛋白之胺基酸序列包含有SEQ ID No：22之胺基酸序列，該第二型角質蛋白胺基酸序列為選自由KRT6A蛋白之胺基酸序列、KRT6B蛋白之胺基酸序列以及KRT6C蛋白之胺基酸序列所組成的群組，該KRT6A蛋白之胺基酸序列包含有SEQ ID No：18之胺基酸序列，該KRT6B蛋白之胺基酸序列包含有SEQ ID No：19之胺基酸序列，該KRT6C蛋白之胺基酸序列包含有SEQ ID No：20之胺基酸序列。
進一步地，該鱗狀細胞樣本檢體係選自由口腔上皮細胞、子宮頸上皮細胞、鼻咽腔上皮細胞以及食道上皮細胞所組成的群組。
本發明的有益效果在於：
本發明利用鱗狀細胞癌細胞中特有且健康組織不會表現的基因融合作為檢測標的，檢測受試者的檢體是否具有該基因融合的mRNA序列、蛋白質產物、或DNA染色體易位，因此可以專一檢測出受試者的檢體中是否具有鱗狀細胞癌細胞，即使樣本包含周圍的健康組織，亦不影響其檢測效力，而提升了檢測的準確性。
圖1，係本發明之口腔鱗狀細胞癌樣本巢狀聚合酶連鎖反應凝膠電泳結果圖。
圖2至圖5，係本發明之KRT6：KRT14基因融合桑格定序結果圖。
圖6A，係本發明之口腔頸鱗狀細胞癌之探針製備之PCR結果圖。
圖6B，係本發明之口腔頸鱗狀細胞癌之探針製備之DNA濃度與純度結果圖。
圖6C，係本發明之口腔頸鱗狀細胞癌之探針製備之缺口轉譯結果圖。
圖6D，係本發明之探針在未發生染色體易位的細胞進行螢光原位雜合結果圖。
圖6E，係本發明之探針在口腔頸鱗狀細胞癌SAT細胞株中基因融合的螢光原位雜合結果圖。
圖7，係本發明之子宮頸鱗狀細胞癌樣本巢狀聚合酶連鎖反應凝膠電泳結果圖。
圖8，係本發明之鼻咽鱗狀細胞癌樣本巢狀聚合酶連鎖反應凝膠電泳結果圖。
圖9，係本發明之食道鱗狀細胞癌樣本巢狀聚合酶連鎖反應凝膠電泳結果圖。
本發明提供一種活體外檢測鱗狀細胞癌的方法，該方法包含步驟(a)取得一鱗狀細胞樣本檢體，步驟(b)檢測該鱗狀細胞樣本檢體中是否存在一基因融合，該基因融合包含有一具有一第一型角質蛋白基因的5'端，以及一具有一第二型角質蛋白基因或一DSP基因或一MYH9基因或一SFN基因的3'端；或者，該基因融合包含有一具有一第二型角質蛋白基因的5'端，以及一具有一第一型角質蛋白基因或一DSP基因或一MYH9基因或一SFN基因的3'端；或者，該基因融合包含有一具有一DSP基因或一MYH9基因或一SFN基因的5'端，以及一具有一第一型角質蛋白基因或一第二型角質蛋白基因的3'端，其中，該基因融合若存在於該鱗狀細胞樣本檢體中，定義該鱗狀細胞樣本檢體具有鱗狀細胞癌。
本發明透過DNA染色體易位、mRNA、蛋白質表現等三個層面檢測該鱗狀細胞樣本檢體中是否存在有角質蛋白的基因融合：
一、染色體易位
於本發明的具體實施態樣中，該步驟(b)包含偵測該鱗狀細胞樣本檢體中是否有基因體DNA的染色體易位的步驟，該基因體DNA包含有一具有一第一型角質蛋白基因的5'端，以及一具有一第二型角質蛋白基因或一DSP基因或一MYH9基因或一SFN基因的3'端；或者該基因體DNA包含有一具有一第二型角質蛋白基因的5'端，以及一具有一第一型角質蛋白基因或一DSP基因或一MYH9基因或一
SFN基因的3'端；或者該基因體DNA包含有一具有一DSP基因或一MYH9基因或一SFN基因的5'端，以及一具有一第一型角質蛋白基因或一第二型角質蛋白基因的3'端。本發明主要技術特徵在於檢測受試者的鱗狀細胞樣本檢體是否具有鱗狀細胞癌中常見的基因融合，並不限定於任何檢測技術，其中可透過多種用於檢測基因體DNA的染色體易位的技術來檢測該鱗狀細胞樣本檢體中是否有基因體DNA的染色體易位，包括核酸定序，核酸雜合和核酸放大。核酸定序技術包含但不限於次世代定序(Next Generation Sequencing(NGS))，桑格定序(Sanger sequencing)；核酸雜合技術包含但不限於原位雜合(In Situ Hybridization(ISH))，微陣列(Microarray)，螢光原位雜交(Fluorescent In Situ Hybridization，FISH)，以及南方點墨法(Southern blot)：核酸放大技術包含但不限於聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction(PCR))，聚反轉錄合酶連鎖反應(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR))，轉錄介導的擴增法(Transcription-mediated Amplification(TMA))，連結酶鏈反應(Ligase Chain Reaction(LCR))，鏈置換擴增法(Strand Displacement Amplification(SDA))，依賴核酸序列擴增法(Nucleic Acid Sequence Based Amplification(NASBA))，以及顯色原位雜交法(Chromogenic In Situ Hybridization(CISH))。
二、基因融合之mRNA
本發明另一實施態樣中，該步驟(b)包含偵測該鱗狀細胞樣本檢體中是否有基因融合的mRNA的步驟，該基因融合mRNA具有一自一
第一型角質蛋白基因轉錄的3'端，以及一具有一自第二型角質蛋白基因轉錄或一自DSP基因轉錄或一自MYH9基因轉錄或一自SFN基因轉錄的5'端；或者該基因融合mRNA具有一自一第二型角質蛋白基因轉錄的3'端，以及一具有一自第一型角質蛋白基因轉錄或一自DSP基因轉錄或一自MYH9基因轉錄或一自SFN基因轉錄的5'端；或者該基因融合mRNA包含一具有一自DSP基因轉錄或一自MYH9基因轉錄或一自SFN基因轉錄的3'端，以及一具有一自第一型角質蛋白基因轉錄或一自第二型角質蛋白基因轉錄的5'端。本發明主要技術特徵在於檢測受試者的鱗狀細胞樣本檢體是否具有鱗狀細胞癌中常見的基因融合，並不限定於任何檢測技術，其中可透過多種檢測基因融合之mRNA的技術來檢測該鱗狀細胞樣本檢體中是否有基因融合的mRNA，包括核酸定序，核酸雜合和核酸放大。核酸定序技術包含但不限於次世代定序(Next Generation Sequencing(NGS))，桑格定序(Sanger sequencing)；核酸雜合技術包含但不限於原位雜合(In Situ Hybridization(ISH))，微陣列(Microarray)，以及南方點墨法(Southern blot)；核酸放大技術包含但不限於聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction(PCR))，聚反轉錄合酶連鎖反應(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR))，轉錄介導的擴增法(Transcription-mediated Amplification(TMA))，連結酶鏈反應(Ligase Chain Reaction(LCR))，鏈置換擴增法(Strand Displacement Amplification(SDA))，以及依賴核酸序列擴增法(Nucleic Acid Sequence Based Amplification(NASBA))。
三、基因融合之蛋白質產物
該步驟(b)包含偵測該鱗狀細胞樣本檢體中是否有一基因融合蛋白，該基因融合蛋白包含有一具有一第一型角質蛋白之胺基酸序列的N端，以及一具有一第二型角質蛋白之胺基酸序列或一DSP蛋白之胺基酸序列或一MYH9蛋白之胺基酸序列或一SFN蛋白之胺基酸序列的C端；或者該基因融合蛋白包含有一具有一第二型角質蛋白之胺基酸序列的N端，以及一具有一第一型角質蛋白之胺基酸序列或一DSP蛋白之胺基酸序列或一MYH9蛋白之胺基酸序列或一SFN蛋白之胺基酸序列的C端；或者該基因融合蛋白包含有一具有一DSP蛋白之胺基酸序列或一MYH9蛋白之胺基酸序列或一SFN蛋白之胺基酸序列的N端，以及一具有一第一型角質蛋白之胺基酸序列或一第二型角質蛋白之胺基酸序列的C端。本發明主要技術特徵在於檢測受試者的鱗狀細胞樣本檢體是否具有鱗狀細胞癌中常見的基因融合，並不限定於任何檢測技術，其中可透過多種技術檢測基因融合之蛋白質產物，包括但不限於蛋白質定序(Protein Sequencing)，免疫沉澱(Immunoprecipitation)，西方墨點法(Western blot)，酵素免疫分析法(ELISA)，免疫組織染色(Immunohistochemistry)，免疫細胞染色(Immunocytochemistry)，流式細胞分析(Flow Cytometry)，以及免疫聚合酶連鎖反應(Immuno-PCR)。
本發明以不同樣本與檢測為例，但並不以此為限，說明如下：
例(1)口腔鱗狀細胞癌樣本中基因融合的定序與普及率
A.試驗材料與方法
試驗材料包含口腔鱗狀細胞癌樣本(n=48)、正常樣本(n=4)；所有的口腔鱗狀細胞癌樣本均取自中國醫藥大學附設醫院的組織庫，各樣本的RNA以RNeasy mini kit(Qiagen)套組抽取，並以NanoDrop螢光吸收法定量RNA，且以凝膠電泳檢測RNA的品質。各樣本的RNA各取1μg以High Capacity cDNA RT kit(Applied Bioscience)套組反轉錄成cDNA，再以0.1X TE緩衝液稀釋至50~80ng/nl之濃度。各取1μL的cDNA當作模版，以Amyloid Petapredursor Protein(APP)基因序列引子(SEQ ID No：1；SEQ ID No：2)，進行聚合酶連鎖反應(PCR)，產物以凝膠電泳檢測，APP陰性的樣本與以剔除。APP陽性的樣本各取1μL的cDNA當作模版，以KRT6：KRT14基因融合序列外圍引子(SEQ ID No：5；SEQ ID No：6)，進行聚合酶連鎖反應(PCR)，產物以分生等級水稀釋十倍後，取1μL當作模版，再以KRT6：KRT14基因融合序列內圍引子(primer 132,SEQ ID No：7；primer 216,SEQ ID No：8)，進行巢狀聚合酶連鎖反應(nested-PCR)，產物以凝膠電泳檢測後，挖下欲知的凝膠位置，以膠回收套件(Qiagen)回收產物，再以pGEM-T easy(Promega)套件將產物克隆至載體，再進行桑格定序。
B.試驗結果
以32個口腔鱗狀細胞癌樣本(OSCC tissues)、4個正常樣本(normal)、和1個純水樣本(BC)為模版；以KRT6：KRT14基因融合序列進行巢狀聚合酶連鎖反應，結果如圖1之箭號所示，有20個口腔鱗狀細胞癌樣本(n=20)呈現陽性、4個正常樣本(normal)、和1個純水樣本(BC)呈現陰性；該凝膠電泳共有四種大小的PCR
產物(標號K6-K14v1、K6-K14v2、K6-K14v3、K6-K14v4)，進行桑格定序的結果分別如圖2、圖3、圖4、圖5所示，雖然大小相異，但均為KRT6：KRT14基因融合序列。由此可知，口腔鱗狀細胞癌樣本中KRT6：KRT14基因融合的普及率為62.5%(20/32)。
例(2)口腔頸鱗狀細胞癌SAT細胞株中基因融合的螢光原位雜合
A.試驗材料與方法
a.試驗樣本玻片的製備。
試驗材料包含口腔鱗狀細胞癌SAT細胞株。在T75培養盒中培養SAT細胞株至八分滿，加入0.2ml EtBr(1mg/ml)在37℃環境下靜置90分鐘，加入0.1ml colcemid(Gibco)在37℃環境下靜置25分鐘，收下細胞後離心去除上清液，加入10ml 0.56% KCl並37℃水浴15分鐘，離心去除上清液，再以0℃ 3：1甲醇-冰醋酸混合液清洗三次後固定。將固定好的細胞噴灑在清潔的載玻片上(silane coating slides(Muto pure chemicals))。以100%乙醇處理2分鐘，以100ug/ml RNAseA處理60分鐘，於37°C潮濕盒中以含有0.02% pepsin之0.01N HCl處理3分鐘，以1% Formaldehyde固定，再依序以70%、90%、100%乙醇脫水，置於乙醇中待用。
b.試驗螢光探針的製備。
BAC clone RP11-29C11(對應染色體17q21.2)和CTD-32094(對應染色體12q13.13)購買自(Invitrogen)。將菌液分別劃盤後，隔天各挑選五個單一菌落，於30ul LB Borth(MDBio)含有12.5ug/ml chloramphenicol(Amresco)於37℃ shaker中放大3小
時，各取1μL的菌液當作模版，RP11-29C11以引子(SEQ ID No：41；SEQ ID No：42)；CTD-32094以引子(SEQ ID No：43；SEQ ID No：44)，進行聚合酶連鎖反應(PCR)，並各以1個純水樣本作為對照組(BC)，產物以凝膠電泳檢測(如圖6A)，其中RP11-29C112的PCR產物以約140bp為合格；CTD-32094的PCR產物以約102bp為合格，各取一合格的單一菌落於400ml LB Borth(MDBio)含有12.5ug/ml chloramphenicol(Amresco)於37℃ shaker中放大一個晚上。以NucleoBond BAC 100kit(Macherey-Nagel)套件抽取BAC clone RP11-29C11的DNA與BAC clone CTD-32094的DNA，並以NanoDrop螢光吸收法定測定濃度和純度(如圖6B)，結果吸收光譜呈現單一波峰表示不含有機化合物及蛋白質的雜質。以缺口轉譯(Nick translation)將BAC clone RP11-29C11的DNA與BAC clone CTD-32094的DNA分別切成500bp左右的片段(如圖6C)，並將RP11-29C11以Biotin-11-2'-deoxyuridine-5'-triphosphate(Roche)標記；CTD-32094以digoxigenin-11-2'-deoxyuridine-5'-triphosphate(Roche)標記。如此便完成螢光探針的製備。
c.樣本玻片和螢光探針的雜合。
在雜合的過程中，以human cot DNA(Invitrogen)和salmon sperm DNA(Sigma)阻隔非專一性的重複片段。於37℃潮濕盒中雜合一個晚上後，T75培養盒中培養SAT細胞株至八分滿，加入0.2ml EtBr(1mg/ml)在37℃環境下靜置90分鐘，以Biotin-11-2'-deoxyuridine-5'-triphosphate標記的片段依序
以Biotinlated anti-avidin(Vector)和avidin-FITC(Vector)免疫染色，以digoxigenin-11-2'-deoxyuridine-5'-triphosphate標記的片段以sheep anti-digoxigenin和TRITC-conjugated F(ab’)2fragment of rabbit anti-sheep免疫染色，再以DAPI作對比染色後即可在螢光顯微鏡下觀查。
B.試驗結果
如(圖6D、圖6E)所示，分別為未發生與發生染色體易位的細胞。由圖6E可知口腔頸鱗狀細胞癌SAT細胞株中，可觀查到染色體17q21.2和染色體12q13.13發生易位。
例(3)子宮頸鱗狀細胞癌樣本中基因融合的普及率
A.試驗材料與方法
試驗材料包含子宮頸鱗狀細胞癌樣本(n=30)；所有的子宮頸鱗狀細胞癌樣本均取自中國醫藥大學附設醫院的組織庫，各樣本的RNA以RNeasy mini kit(Qiagen)套組抽取，並以NanoDrop螢光吸收法定量RNA，且以凝膠電泳檢測RNA的品質。各樣本的RNA各取1μg以High Capacity cDNA RT kit(Applied Bioscience)套組反轉錄成cDNA，再以0.1X TE緩衝液稀釋至50~80ng/nl之濃度。各取1μL的cDNA當作模版，以GAPDH基因序列引子(SEQ ID No：3；SEQ ID No：4)，進行聚合酶連鎖反應(PCR)，經PCR所得的產物以凝膠電泳檢測，GAPDH陰性的樣本與以剔除。GAPDH陽性的樣本各取1μL的cDNA當作模版，以KRT6：KRT14基因融合序列外圍引子(SEQ ID No：5；SEQ ID No：6)，進行聚合酶連
鎖反應(PCR)，經PCR所得的產物以分生等級水稀釋十倍後，取1μL當作模版，再以KRT6：KRT14基因融合序列內圍引子(SEQ ID No：7；SEQ ID No：8)，進行巢狀聚合酶連鎖反應(nested-PCR)，經nested-PCR所得的產物以凝膠電泳檢測。
B.試驗結果
以26個子宮頸鱗狀細胞癌樣本(CSCC tissues)、和1個純水樣本(BC)為模版；以KRT6：KRT14基因融合序列進行巢狀聚合酶連鎖反應，結果如圖7之箭號所示，有7個子宮頸鱗狀細胞癌樣本呈現陽性、純水樣本(BC)呈現陰性；由例(1)的結果可知，凝膠電泳共有四種大小的PCR產物均為KRT6：KRT14基因融合序列。由此可知，子宮頸鱗狀細胞癌樣本中KRT6：KRT14基因融合的普及率為26.9%(7/26)。
例(4)鼻咽鱗狀細胞癌樣本中基因融合的普及率
A.試驗材料與方法
試驗材料包含鼻咽鱗狀細胞癌樣本(n=30)；所有的鼻咽鱗狀細胞癌樣本均取自中國醫藥大學附設醫院的組織庫，各樣本的RNA以RNeasy mini kit(Qiagen)套組抽取，並以NanoDrop螢光吸收法定量RNA，且以凝膠電泳檢測RNA的品質。各樣本的RNA各取1μg以High Capacity cDNA RT kit(Applied Bioscience)套組反轉錄成cDNA，再以0.1X TE緩衝液稀釋至50~80ng/nl之濃度。各取1μL的cDNA當作模版，以APP基因序列引子(SEQ ID No：1；SEQ ID No：2)，進行聚合酶連鎖反應(PCR)，經PCR所得的產物以凝膠電泳檢測，APP陰性的樣本與以剔除。APP陽性的
樣本各取1μL的cDNA當作模版，以KRT6：KRT14基因融合序列外圍引子(SEQ ID No：5；SEQ ID No：6)，進行聚合酶連鎖反應(PCR)，經PCR所得的產物以分生等級水稀釋十倍後，取1μL當作模版，再以KRT6：KRT14基因融合序列內圍引子(SEQ ID No：7；SEQ ID No：8)，進行巢狀聚合酶連鎖反應(nested-PCR)，經nested-PCR所得的產物以凝膠電泳檢測。
B.試驗結果
以27個鼻咽鱗狀細胞癌樣本(NSCC tissues)、和1個純水樣本(BC)為模版；以KRT6：KRT14基因融合序列進行巢狀聚合酶連鎖反應，結果如圖8之箭號所示，有9個鼻咽鱗狀細胞癌樣本呈現陽性、純水樣本(BC)呈現陰性；由例(1)的結果可知，凝膠電泳共有四種大小的PCR產物均為KRT6：KRT14基因融合序列。由此可知，鼻咽鱗狀細胞癌樣本中KRT6：KRT14基因融合的普及率為33.3%(9/27)。
例(5)食道鱗狀細胞癌樣本中基因融合的普及率
A.試驗材料與方法
試驗材料包含食道鱗狀細胞癌樣本(n=30)；所有的食道鱗狀細胞癌樣本均取自中國醫藥大學附設醫院的組織庫，各樣本的RNA以RNeasy mini kit(Qiagen)套組抽取，並以NanoDrop螢光吸收法定量RNA，且以凝膠電泳檢測RNA的品質。各樣本的RNA各取1μg以High Capacity cDNA RT kit(Applied Bioscience)套組反轉錄成cDNA，再以0.1X TE緩衝液稀釋至50~80ng/nl之濃度。各取1μL的cDNA當作模版，以APP基因序列引子(SEQ ID
No：1；SEQ ID No：2)，進行聚合酶連鎖反應(PCR)，經PCR所得的產物以凝膠電泳檢測，APP陰性的樣本與以剔除。APP陽性的樣本各取1μL的cDNA當作模版，以KRT6：KRT14基因融合序列外圍引子(SEQ ID No：5；SEQ ID No：6)，進行聚合酶連鎖反應(PCR)，經PCR所得的產物以分生等級水稀釋十倍後，取1μL當作模版，再以KRT6：KRT14基因融合序列內圍引子(SEQ ID No：7；SEQ ID No：8)，進行巢狀聚合酶連鎖反應(nested-PCR)，經nested-PCR所得的產物以凝膠電泳檢測。
B.試驗結果
以23個食道鱗狀細胞癌樣本(ESCC tissues)、和1個純水樣本(BC)為模版；以KRT6：KRT14基因融合序列進行巢狀聚合酶連鎖反應，結果如圖9之箭號所示，有10個食道鱗狀細胞癌樣本呈現陽性、純水樣本(BC)呈現陰性；由例(1)的結果可知，凝膠電泳共有四種大小的PCR產物均為KRT6：KRT14基因融合序列。由此可知，食道鱗狀細胞癌樣本中KRT6：KRT14基因融合的普及率為43.5%(10/23)。
綜上所述，本發明利用鱗狀細胞癌細胞中特有且健康組織不會表現的基因融合作為檢測標的，檢測受試者的鱗狀細胞樣本檢體是否具有該基因融合的mRNA序列、蛋白質產物、或DNA染色體易位，因此可以專一的檢測出受試者鱗狀細胞樣本檢體中是否具有鱗狀細胞癌細胞，即使樣本包含周圍的健康組織，亦不影響其檢測效力。
因此本發明極具進步性及符合申請發明專利之要件，爰依法提出
申請，祈 鈞局早日賜准專利，實感德便。
以上已將本發明做一詳細說明，惟以上所述者，僅為本發明之一較佳實施例而已，當不能限定本發明實施之範圍。即凡依本發明申請範圍所作之均等變化與修飾等，皆應仍屬本發明之專利涵蓋範圍內。
<110> 許晉銓
<120> 用於篩檢病人鱗狀細胞癌的方法
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Claims (10)
- 一種活體外檢測鱗狀細胞癌的方法，該方法包含下列步驟：(a)取得一鱗狀細胞樣本檢體；(b)檢測該鱗狀細胞樣本檢體中是否存在一基因融合，該基因融合包含有一具有一第一型角質蛋白基因的5'端，以及一具有一第二型角質蛋白基因的3'端，該第一型角質蛋白基因為KRT14基因，該第二型角質蛋白基因係選自由KRT6A基因、KRT6B基因及KRT6C基因所組成的群組；其中，該基因融合若存在於該檢體中，定義該鱗狀細胞樣本檢體具有鱗狀細胞癌。
- 如申請專利範圍第1項所述活體外檢測鱗狀細胞癌的方法，其中，該步驟(b)包含偵測該鱗狀細胞樣本檢體中是否有基因體DNA的染色體易位的步驟，該基因體DNA包含有一具有該第一型角質蛋白基因的5'端，以及一具有該第二型角質蛋白基因的3'端，其中該KRT14基因包含有SEQ ID No：15之核苷酸序列，該KRT6A基因包含有SEQ ID No：11之核苷酸序列，該KRT6B基因包含有SEQ ID No：12之核苷酸序列，該KRT6C基因包含有SEQ ID No：13之核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述活體外檢測鱗狀細胞癌的方法，其中，該步驟(b)包含偵測該鱗狀細胞樣本檢體中是否有基因融合的mRNA的步驟，該基因融合mRNA具有一自該第一型角質蛋白基因轉錄的3'端，以及一具有自該第二型角質蛋白基因轉錄的5'端，其中該 KRT14基因包含有SEQ ID No：15之核苷酸序列，該KRT6A基因包含有SEQ ID No：11之核苷酸序列，該KRT6B基因包含有SEQ ID No：12之核苷酸序列，該KRT6C基因包含有SEQ ID No：13之核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述活體外檢測鱗狀細胞癌的方法，其中，該步驟(b)包含偵測該鱗狀細胞樣本檢體中是否有一基因融合蛋白，該基因融合蛋白包含有一具有一第一型角質蛋白之胺基酸序列的N端，以及一具有一第二型角質蛋白之胺基酸序列的C端，其中該第一型角質蛋白胺基酸序列為KRT14蛋白之胺基酸序列，該KRT14蛋白之胺基酸序列包含有SEQ ID No：22之胺基酸序列，該第二型角質蛋白胺基酸序列為選自由KRT6A蛋白之胺基酸序列、KRT6B蛋白之胺基酸序列以及KRT6C蛋白之胺基酸序列所組成的群組，該KRT6A蛋白之胺基酸序列包含有SEQ ID No：18之胺基酸序列，該KRT6B蛋白之胺基酸序列包含有SEQ ID No：19之胺基酸序列，該KRT6C蛋白之胺基酸序列包含有SEQ ID No：20之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述活體外檢測鱗狀細胞癌的方法，其中，該鱗狀細胞樣本檢體係選自由口腔上皮細胞、子宮頸上皮細胞、鼻咽腔上皮細胞以及食道上皮細胞所組成的群組。
- 一種活體外檢測鱗狀細胞癌的方法，該方法包含下列步驟：(a)取得一鱗狀細胞樣本檢體；(b)檢測該鱗狀細胞樣本檢體中是否存在一基因融合，該基因融合包含有一具有一第二型角質蛋白基因的5'端，以及一具有一第一型角質蛋白基因的3'端，該第一型角質蛋白基因為KRT14基因，該第二型角質蛋白基因係選自由KRT6A基因、KRT6B基因及KRT6C基因 所組成的群組；其中，該基因融合若存在於該檢體中，定義該鱗狀細胞樣本檢體具有鱗狀細胞癌。
- 如申請專利範圍第6項所述活體外檢測鱗狀細胞癌的方法，其中，該步驟(b)包含偵測該鱗狀細胞樣本檢體中是否有基因體DNA的染色體易位的步驟，該基因體DNA包含有一具有該第二型角質蛋白基因的5'端，以及一具有該第一型角質蛋白基因的3'端，其中該KRT14基因包含有SEQ ID No：15之核苷酸序列，該KRT6A基因包含有SEQ ID No：11之核苷酸序列，該KRT6B基因包含有SEQ ID No：12之核苷酸序列，該KRT6C基因包含有SEQ ID No：13之核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第6項所述活體外檢測鱗狀細胞癌的方法，其中，該步驟(b)包含偵測該鱗狀細胞樣本檢體中是否有一基因融合的mRNA的步驟，該基因融合mRNA具有一自該第二型角質蛋白基因轉錄的3'端，以及一具有自該第一型角質蛋白基因轉錄的5'端，其中該KRT14基因包含有SEQ ID No：15之核苷酸序列，該KRT6A基因包含有SEQ ID No：11之核苷酸序列，該KRT6B基因包含有SEQ ID No：12之核苷酸序列，該KRT6C基因包含有SEQ ID No：13之核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第6項所述活體外檢測鱗狀細胞癌的方法，其中，該步驟(b)包含偵測該鱗狀細胞樣本檢體中是否有一基因融合蛋白，該基因融合蛋白包含有一具有一第二型角質蛋白之胺基酸序列的N端，以及一具有一第一型角質蛋白之胺基酸序列的C端，其中該第一型角質蛋白胺基酸序列為KRT14蛋白之胺基酸序列，該KRT14蛋白之胺基酸序列包含有SEQ ID No：22之胺基酸序列，該 第二型角質蛋白胺基酸序列為選自由KRT6A蛋白之胺基酸序列、KRT6B蛋白之胺基酸序列以及KRT6C蛋白之胺基酸序列所組成的群組，該KRT6A蛋白之胺基酸序列包含有SEQ ID No：18之胺基酸序列，該KRT6B蛋白之胺基酸序列包含有SEQ ID No：19之胺基酸序列，該KRT6C蛋白之胺基酸序列包含有SEQ ID No：20之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第6項所述活體外檢測鱗狀細胞癌的方法，其中，該鱗狀細胞樣本檢體係選自由口腔上皮細胞、子宮頸上皮細胞、鼻咽腔上皮細胞以及食道上皮細胞所組成的群組。
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