ES2371000B1 - Metodo de diagnostico in vitro de pacientes con linfoma esplenico de la zona marginal - Google Patents

Abstract

Método de diagnóstico in vitro de pacientes con linfoma esplénico de la zona marginal. La presente invención describe un método de diagnóstico in vitro de LEZM basado en el análisis de la expresión de una serie de genes localizados en una región muy específica delecionada del cromosoma 7 humano. La región específica delecionada en pacientes con LEZM ha sido definida mediante la utilización CGH arrays de alta afinidad y se localiza en 7q22.1 entre las bases 99925039-101348479, donde se encuentran los genes: TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, SH2B2, MUC17 y CUX1. Además en la presente invención se describen kits de diagnóstico in vitro de LEZM, que comprenden al menos una sonda que reconozcan la región delecionada en 7q22.1 o que hibride con al menos una de las secuencias nucleotídicas de los genes mencionados anteriormente.

Description

Método de diagnóstico in vitro de pacientes con linfoma esplénico de la zona marginal.

Campo de la invención

La presente invención se encuadra en el ámbito de la biomedicina y en el campo farmacéutico, más específicamente, se refiere a un método de diagnosis in vitro, para el diagnóstico de pacientes que padecen la enfermedad neoplásica: linfoma esplénico de la zona marginal (LEZM). Además la presente invención también hace referencia a un kit de diagnóstico in vitro de pacientes con LEZM.

Antecedentes

El Linfoma Esplénicodela Zona Marginal (LEZM), es una enfermedad tumoral que puede afectara cualquier órgano, aunque los más comunes sonel bazoylosganglios linfáticos.Ha sido consideradocomo una entidad clínico-patológica distinta desde hace años (Schmid C et al. Am J Surg Pathol 1992, 16: 455-466). Más recientemente, la clasificaciónde enfermedadeshematológicasdelaOrganización Mundialdela Salud (OMS),ha designadoalos LEZM como un subtipo distinto de linfomas no-Hodgkin (Harris NL, et al. Histopathology 2000, 36: 69-86) (LNH), en basea su morfología, inmunofenotipoy características clínicas, junto con los linfomas asociadosa mucosas (MALT) ylos linfomas de la zona marginal nodal (LZMN). Estos tres subtipos de LNH: LEZM, linfomas MALTyLZMN, están incluidosenlos linfomasdela zona marginal porque tienensu origen comúnenel compartimentomarginalde las célulasBde los nódulos linfáticosydel bazo.

En el diagnóstico de los linfomas, es importante clasificar cada uno dentro del subtipo al que pertenece para poder dar al paciente el tratamiento adecuado, ya que cada tipo de linfoma tiene un tratamiento distinto. Así, por ejemplo, en el caso del LEZM no se debe aplicar quimioterapia en primera instancia, siendo el tratamiento más adecuado la extirpación del órgano afectado, generalmente el bazo, por lo que es muy importante diagnosticarlo correctamente. El diagnóstico de los LNHy la diferenciación entre cada uno de ellos se basa en las características morfológicas, inmunohistoquímicasymoleculares, siendo las alteraciones genéticas en general,ylas traslocaciones específicas en particular, unade las características que más está ayudando para distinguir unos linfomasde otros.La mayoríadelos LNH se caracterizan por la presencia de traslocaciones específicas, que sirven para su diagnóstico. Sin embargo,los LEZM carecendeun marcador molecular conocido pues,a diferenciade otros linfomas,noseha identificadoenellos una traslocación que les sea característica, lo que dificulta su diagnóstico. Si bien los análisis citogenéticos muestran queen estetipode tumores puedendetectarse pérdidasenlasqueestáninvolucradoslos cromosomas 1,3,7y 8 (Dierlamm J, et al., Blood 1996, 87: 299-307; SoléF, et al.,BrJHaematol1997; 98: 446-449),existen pocos estudios que demuestrenlaexistenciade una alteración que fuera específicay característicade los LEZMy que permitiera la identificación de una alta proporción de aquellos pacientes que la padecen. Estudios de citogenética convencional pusieron de manifiesto que una de las alteraciones más frecuentes en los LEZM eran las pérdidas en el brazo largo del cromosoma7(del(7q)),loquepodíasugerirqueladel(7q)está asociadaconlosLEZM(BrynesRK, et al., ModPathol 1996, 9: 995-1000; Hernández JM, et al., Leukemia 1995, 9: 2140-2146). En esos primeros estudios se estimaba que las deleciones en el brazo largo del cromosoma 7 no se presentaban en más de un 25% de los pacientes aquejados de LEZM (FrancoV, et al., Blood 2003; 101:2464-2472), por lo que no se consideraba que el desarrollo de métodos diagnósticos basados en su detección pudiera tener interés, al permitir identificar sólo una proporción muy bajadel total de pacientes aquejados de LEZM. Posteriormente, estudios de pérdida de heterocigosidad demostraron que la presencia de una pérdida alélica en los LEZM (40%) es mayor que la observada en otros síndromes linfoproliferativos de células-B.

La técnica utilizada más habitualmente para realizar los estudios de los cambios producidos en los cromosomas asociados con los LEZM ha sido la hibridación genómica comparada (CGH), metodología que permite la determinacióndegananciasypérdidasenelnúmerodecopiasentredos muestrasdeADN, medianteuna hibridacióncompetitiva de ADN normalydel ADN tumoral en estudio (cada unode ellos marcados con un fluorocromo diferente) sobremetafases de individuos normales, evaluando después si existen zonas en las que se produzca un aumento de la señal correspondienteal fluorocromoconelquesehaya marcadoelADN tumoral(loqueseconsideraindicativodeganancias) o disminuciones de dicha señal, aumentando la señal correspondiente al otro fluorocromo, eldel ADN normal (lo que se considera indicativo de pérdidas). Estudios de CGH confirmaron que hay distintas regiones del genoma implicadasen estos linfomas, tales como5q,7q,9q,12qy20q, encontrando, además,queexiste una correlaciónentre las pérdidasde material genómicoyel acortamiento del períodode supervivencia (Hernández J.M., et al AmJPathol. 2001 May; 158:1843-50).

Mediante la utilización de dichas técnicas se ha observado que la región 7q31-q36 en particular, parece estar estrechamente relacionada con los LEZMy en ella se encuentrana menudo deleciones en los pacientes aquejadosde esta enfermedad. Dicha región comprende una zona muy amplia del genoma, en la que no se han encontrado genes candidatos que sirviesen para el diagnóstico de la enfermedad (Algara P, et al., Blood 2002, 99:1299-1304; Ocio EM, et al., ClinicalLymphoma 2005, 4: 241-245).Apesar de haber sido de gran utilidad en el conocimiento de las alteraciones genómicas en los procesos tumoralesyen especial en los linfomas, (para cuyo conocimiento, clasificación ypronóstico ha sido de gran utilidad), la técnica de la CGH tiene una capacidad de resolución limitada: por una parte, los cambios que impliquen delecionesde segmentos inferiores a7Mb no son detectables (BentzM, et al., Genes Chromosomes Cancer 1998; 21:172-175)y por otra parte, la determinación de los puntos exactos del cromosoma entre los cuales se inserta la amplificación o que suponen los límites de la deleción es difícil, ya que la región mínima delecionada es demasiado extensa como para poder ser analizada con una sonda de hibridación in situ (Hernández J.M., et al.,AmJPathol. 2001 May; 158:1843-50).

Laspérdidasdelbrazolargodel cromosoma7,comoyaseha comentado,sonunadelas alteracionesquemássehan detectadohastaahoraenlos estudiosrealizadossobreLEZM,yasea mediantelas técnicasdeCGHomediante técnicas de hibridación fluorescente in situ (FISH). Sin embargo, las amplias regiones delecionadas encontradas mediante dichas técnicas, han mostrado problemas a la hora de definirlas, ya que las sondas utilizadas eran de gran tamaño, no mostrando la suficiente seguridad ni especificidad para su uso en el diagnóstico de la enfermedad.

En la patente española ES2284408 solucionan dicho problema mediante el uso de arrays genómicos, también llamadosCGH-arraysoarraysdeCGH.LosCGH-arrayssonunmétodopara identificar alteracionesenelgenoma,sin ser capaz de detectar translocaciones recíprocas. Se trata de una técnica que combina la tecnología de los micro-arrays con la tecnología de laCGH, en la que la hibridación se realiza reemplazando las metafases de los cromosomaspor segmentos de ADN mapeados, cuyo conjunto representa todos los cromosomas o brazos de cromosomas, divididos en fragmentos clonados en cromosomas artificiales de levadura (YAC), cromosomas artificiales de bacteria (BAC), cromosomas artificiales basados en el genoma del bacteriófago P1 (PAC), cósmidos u otros vectores de clonación. De esta manera, aumenta el nivel de resolución, que deja de ser cromosómico (distancias medidas en megabases) pasandoapodersermedidoen kilobases.Lasventajasdeesta metodologíasonlamayor resoluciónylaposibilidadde realizarunmapeodirectodelclonoclonesquese encuentraninvolucradosenelcambiogenómico.Lapatenteespañola ES2284408divulgaelusodeunBAC/PAC-array específicode3500clonesconuna resoluciónde1Mb.Los resultados mostrados en dicha patente, ponen de manifiesto que los pacientes con LEZM presentan una deleción en la región 7q22.1-q22.2, definidaporla sonda portadoradela secuencia correspondienteal fragmentodel cromosoma7humano contenidoenelBAC/PAC-array, denominada RP11-44M6.En dichapatentesedivulga también,el uso opcional,en el mismo ensayo,de otras sondas diferentes que reconocen otra región delecionada también enel cromosoma 7,la región 7q32-q33, aumentando así el porcentaje de pacientes con LEZM que pueden ser diagnosticados en la misma prueba.

En la presente invención se describe un método de diagnóstico in vitro de LEZM basado en la identificación de una deleción más específica, localizada de forma más concreta entre las bases 99925039-101348479 de la región 7q22.1 del cromosoma 7 humano. La deleción específica obtenida mediante el método de la invención, posee un tamaño aproximadode 1.4Mb.Medianteel método descrito enlainvención seha identificado en dicha región más específica la presencia de los genes: TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, SH2B2, MUC17 yCUX1.Para la obtención de los resultados mostrados en la presente invención se ha hecho uso de diferentes plataformas de CGH-array, las cuales tienen un alto poderde resolución, permitiendo definir una región específica del cromosoma7localizada entre las bases 99925039-101348479, en la región 7q22.1, que se encuentra delecionada en pacientes con LEZM. Por lo tanto, aunque enel estadodela técnicaexistía información sobre distintas regiones delecionadas del cromosoma 7 en pacientesconLEZM, medianteel método descritoenlainvención,seha definido,unaregiónmuy específica,que es características de dicho proceso tumoralyque además, se encuentra con suficiente frecuencia entre la población afectada de LEZM,garantizando el diagnóstico de una proporción significativade pacientes. La obtención, de una manera tanexactaydefinida,dela región específica delecionada, medianteelmétododelainvención, permite realizar un diagnóstico diferencial de pacientes con LEZM, frente a otros tipos de linfomas, preferentemente linfomas linfoproliferativos crónicos o linfomas no-Hodking, los cuales no se caracterizan por presentar la deleción definida en la presente invención. Por otro lado, cuanto más definidas sean las regiones delecionadas para el diagnóstico de los pacientes conLEZM,mejorse conoceránlos genes implicadosenel desarrollodedichas patologías,favoreciendoel diseño de tratamientos específicos para frenar estas nuevas vías de señalización tumoral. En este sentido, la presente invenciónevidenciala presenciade genesque pueden funcionar como represoresde proto-oncogenes, supresoresde tumores,reguladoresdel crecimiento,yquese encuentranenlaregión delecionadaenpacientes con LEZM.

Descripción de la invención

Breve descripción de la invención

En la presente invención se describe la asociación entre los LEZMy la presencia de deleciones en una región muy específicaydefinidadel cromosoma7humano.La presenteinvenciónse refiereaunmétodode diagnóstico in vitro de pacientes con LEZM basado en el análisis de la expresión de una serie de genes localizados en una región delecionada de dicho cromosoma7 humano. La región delecionada en pacientes LEZM ha sido definida mediante la utilizacióndeCGH-arraysde alta afinidady se localizaen 7q22.1 entrelas bases 99925039-101348479, dondese encuentran los genes: TSC22D4, HRBL,LRCH4, MUC3, MUC12, SH2B2, MUC17 yCUX1,pudiéndose utilizar como genes candidatos para el diagnóstico de la enfermedad. En este sentido, la presente invención pone de manifiesto que lospacientesconLEZM muestranun incrementoenlaexpresióndeal menosunodelosgenesseleccionadosdeentre: TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, SH2B2, MUC17 y CUX1, respecto a los controles sanos o respecto a pacientes que presentan otro tipo de linfoma. El tamaño aproximado de la región delecionada es de 1.4 Mb. Mediante la utilización de CGH-arrays de alta afinidad según se describe en la invención, un 49% de los pacientes LEZM incluidos en el estudio mostraron la deleción de la región 7q22.1.

En la presente invención se define el término de CGH-array de alta afinidad como un método de citogenética molecular para la detección degananciasy pérdidas cromosómicas que combina la tecnología de los CGH con la tecnología de los micro-arrays. El array genómico de alta afinidad es preferentemente un soporte sólido al que se lehan adherido de forma ordenadaymediante un biorobot clones y/o secuencias de ADN conocidas, en forma de matriz de miles de puntos equiespaciados. La afinidad o resolución de los arrays genómicos viene determinada por la distancia genómica que hay entre dos clones consecutivos. Esta técnica está basada en la co-hibridación sobre el array de dos ADNs, tumoralyde referencia, marcados con diferentes fluorocromos.

Los CGH-arraysdealta afinidad utilizadosenlapresenteinvenciónhansido:BAC/PAC-array,que contiene3.523 clones procedentes deBACsyPACs que cubren todo el genoma con una resolución de1 Mb.Para corroborarlos resultados obtenidos mediante dicha plataforma se han utilizado ensayos de FISH. Posteriormente, para asegurar aún más dichos resultados se hizo usode otras2plataformas comercialesde arraysgenómicos: CGH-array Agilentde44 KyCGH-array NimbleGende72K. Mediantedichas técnicasse corroboróquelos pacientesconLEZM presentaban una deleción enla región 7q22.1 del cromosoma7humano.Para redefinirla zona específica delecionada enla región 7q22.1delcromosoma7humanoenpacientesconLEZM,seutilizóelarray comercialdealta resolución,Tiling-array de NimbleGen, específico del cromosoma 7. Dicho array utiliza aproximadamente 385.110 oligonucleótidos o dianas quecubrentodoel cromosoma7yquedejanuna distanciamediaentrecadaoligonucleótidodeaproximadamente355 pb.

Otroaspectodela presenteinvenciónse refiereakitsde diagnósticodeLEZMque comprendenal menosunasonda que reconozcanlaregión delecionadaen7q22.1oque hibrideconal menosunadelas secuencias nucleotídicasdelos genes mencionados anteriormente, estando acopladas dichas sondas a un compuesto, preferentemente un fluoróforo, que permite su detección.

Mediante el método de diagnóstico in vitro,descrito en la presente invención, se delimita con una gran precisión la región delecionada en 7q22.1, permitiendo un mejor diagnóstico diferencial de los pacientes con LEZM frente a los pacientes con otros síndromes linfoproliferativos crónicos o los linfomas no-Hodgkinianos, ya que está deleción específica enla región7q es muy característicade losLEZMy no del restode síndromes linfoproliferativos crónicos

o linfomas no-Hodgkin.

Descripción de las figuras

Figura 1. Regionesgenómicas comunesdepérdidaso ganancias enel cromosoma7de57 pacientes con LEZM. La figura muestra las regiones genómicas que presentanganancias(G) expresado como porcentaje o pérdidas(L) expresado como porcentaje, enel cromosoma7de pacientes con LEZM.Para cada región, se muestrala localización citogenéticayel porcentajedeganancias (%G)o pérdidas (%L).

Figura 2. Regionesgenómicas implicadasen pacientes LEZMque mostrarononoalteracionesenelcromosoma 7q.La figura muestralasganancias(G)expresadas como porcentaje,ylas pérdidas(L)expresadas como porcentaje, delos pacientes con pérdidasenel cromosoma7q (barrasnegras)ydelos pacientesquenomostraron pérdidasenel cromosoma 7q (barras blancas).

Figura 3. Análisis del cromosoma7medianteel arrayde alta afinidad “tiling array” específicodel cromosoma7 de NimbleGen(385K) enpacientes con LEZM. La figura muestra la deleción de la región de 7q22.1 en tres de los cuatro casos analizados, mostrado como líneas negras gruesas.C: Controles; LEZM1, LEZM2yLEZM3: pacientes con LEZM.

Figura 4: Análisisdela zona comúnmente delecionadadelcromosoma7,7q22.1entres pacientesLEZM, mediante los diferentes CGH-arrays utilizados en la invención. (A) La figura muestra los tres clones que cubren la región 7q22.1del cromosoma7analizado medianteelBAC/PACCGH-array.Lostres pacientesconLEZM(LEZM1,LEZM 2y LEZM 3) muestran una pérdida (en negro) en la región 7q22.1y en el control (C) no se observa cambio. La región7q22.1enestearrayestámapeadaportres clonesconuna resoluciónde1Mb.(B)Lafiguramuestralos53 oligonucleótidos presentes en la región 7q22.1 que contiene el CGH-array NimbleGen 72 K. Los tres pacientes con LEZM(LEZM1,LEZM2yLEZM3)presentaron pérdidasenlaregión7q22.1(negro), mientrasqueel control(C) no mostró cambiosen dicharegión.(C)La figura muestralos 3.553oligonucleótidosque recubrenlaregión 7q22.1en el “tiling-array” específico del cromosoma 7. Se observa que la región comúnmente delecionada en los tres pacientes con LEZM(LEZM1, LEZM2yLEZM3) analizadosse encuentra delimitada entrelos locis D7S2120EyD7S740.

C: control.

Figura 5. Expresión génica de CUX1 en pacientes con LEZM. Análisis de la expresión génica de CUX1 mediante RT-PCRenmuestrasde pacientes con LEZM,de pacientes conleucemia linfocítica crónicade célulasB(LLCB)yen individuos controles sanos(C). Mediantela técnicadeRT-PCR.EnelejeYseexpresan los resultadosdelaexpresión génica de CUX1 en términos relativos en función de la expresión del gen control ABL.

Descripción detallada de la invención

El primer objeto de la presente invención se refiere a un método de diagnóstico in vitro de LEZM que comprende unpasode deteccióndela delecióncomprendida entrelas bases 99925039-101348479 localizadasenlaregión7q22.1, en la que se localizan los genes TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3,MUC12, SH2B2, MUC17 yCUX1, mediante la utilización de arrays genómicos de alta afinidad.

En una realización preferida, el método de la invención se caracteriza porque además comprende la detección de la deleción comprendida entre las bases 102949624-145959694 localizadas en la región 7q22.2-q35 mediante la utilizacióndearraysgenómicosdealta afinidad.Estaregióntieneuntamañoaproximadode43,15Mbyse localizada entre los clonesde losBACs RP4-672O11yRP4-558L10. Además, en dicha región se localizanvarios genes, tales como por ejemplo: RELN, LHFPL3, PBEF1, THAP5, IMMP2L, FOXP2, TES, MET, ST7, PTPRZ1, GRM8, UBE2H, MLKN1, BPGM, CALD1, PTN,SVOPL,AGK, KEL, TPK1 yCNTNAP2.

En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza porque se realiza sobre una muestra de ADN seleccionadadeentre: una muestraprocedentedeun tejido infiltrado con célulasde linfoma,deun aspiradode médula ósea o de una muestra de sangre total.

En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza porque los arrays genómicos de alta afinidad utilizadosse seleccionan preferentementede entre:BAC/PACCGH-array,CGH-array Agilent, CGH-array NimbleGen yTiling-array de NimbleGen específico del cromosoma 7.

Otro objeto de la presente invención se refiere también a un método de diagnóstico in vitro de LEZM que mide el nivel de expresión de al menos uno de los genes seleccionados del grupo TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, SH2B2, MUC17 y CUX1, localizados en la deleción de la región 7q22.1 comprendida entre las bases 99925039101348479, preferentemente mide el nivel de expresión del gen CUX1 (Entrez Gene ID: 1523). En una realización preferida dicho método se caracteriza porque se realiza sobre una muestra de ARN seleccionada de entre una muestra procedente de un tejido infiltrado con células de linfoma, de un aspirado de médula ósea o de una muestra de sangre total.

Otro de los objetos de la presente invención se refiere a otro método de diagnóstico in vitro de LEZM que comprende una combinación en cualquier orden, de los dos métodos de diagnóstico in vitro de LEZM, mencionados anteriormente, esdecir, comprende, en cualquier orden, un paso de detección de la deleción comprendida entre las bases 99925039-101348479 localizadas en la región 7q22.1, mediante la utilización de arrays genómicos de alta afinidadyotropasoquemideelniveldeexpresiónde,al menos unodelos genes seleccionados entre: TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, SH2B2, MUC17 yCUX1.

En una realización preferida, dicho método comprende además, la detección de la deleción comprendida entre las bases 102949624-145959694 localizadas en la región 7q22.2-q35, dónde se localizan entre otros los genes: RELN, LHFPL3, PBEF1, THAP5, IMMP2L, FOXP2, TES, MET, ST7, PTPRZ1, GRM8, UBE2H, MLKN1, BPGM, CALD1, PTN,SVOPL,AGK, KEL, TPK1 yCNTNAP2;mediante la utilización de arrays genómicos de alta afinidad.

Otro objeto de la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico in vitro de LEZM que comprende al menos una sonda o un conjunto de sondas que hibriden total o parcialmente sobre la deleción comprendida entre las bases 99925039-101348479 localizadas en la región 7q22.1.

En unarealización preferida,elkitdelainvención,se caracteriza porquelas sondasse seleccionan preferentemente entre las comprendidas en el grupo: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 y/o SEQ ID NO:3.

En otra realización preferida, el kit de la invención, además comprende, al menos una sonda que hibride total o parcialmente sobre la deleción comprendida entre las bases 102949624-145959694 localizadas en la región 7q22.2q35, siendo preferentementedicha sondala definida comoSEQIDNO:4,que hibridaenlaregión7q33.

Otro objeto de la presente invención se refiere a otro kit de diagnóstico in vitro de LEZMque detecta la expresión de al menos uno de los genes seleccionados entre TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, SH2B2, MUC17 y CUX1, localizados en la deleción de la región 7q22.1 comprendida entre las bases 99925039-101348479, mediante RT-PCR utilizando cebadores específicos para las secuenciasde dichos genes.En una realización preferida, dichokit se caracteriza porque detecta la expresión del gen CUX1, preferentemente mediante los cebadores definidos como SEQID NO:5ySEQID NO:6.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar la invencióny no pretenden limitar el alcance de la misma.

Ejemplo1

Obtención de muestras de ADN de pacientes LEZM

Para la obtención de los resultados mostrados en la presente invención se estudiaron un total de 68 pacientes diagnosticados de LEZM de acuerdo conlos criterios propuestos por la Organización Mundial de la Salud. Del total de68 pacientes había treintay seis pacientes(53%) que eranmujeres. Las edadesde los pacientes incluidos enel estudiovariabande44-86 años (mediana69 años).El estudio fue aprobadoporel comité éticodeinvestigación.Se obtuvo consentimiento informado de cada paciente antes de entrar a formar parte del estudio.

TodoelADN genómicopuede obtenersede muestrasdebazo,ganglios linfáticos, aspiradode médulaóseaomuestrasdesangretotalsiempreycuandohaya infiltraciónpor célulasdeLEZMen cualquieradelostejidos descritos.En la presente invención se ha utilizado ADN genómico extraído de muestras frescas congeladas de bazo de 44 pacientes utilizando el método estándar de fenol-cloroformoyde muestras de sangre periférica de los restantes 24 pacientes. Las muestrasde ADN control fueron aisladasa partirde muestrasde placentade donantes sanos.Todas las muestras deADN se cuantificaron con el espectrofotómetro NanoDrop (ND-1000,Tecnologías NanoDrop,Wilmington,DE, EE.UU.).LacalidaddelADNfueevaluadaporla relación 260:280y suintegridadporla visualización engelde agarosa con bromuro de etidio.

Ejemplo2

Análisisdelas alteracionesgenómicasen pacientes LEZM medianteel microarraygenómicosde alta afinidadBAC/ PACCGH-array

Unavez obtenidoel ADN tantode pacientes LEZM, comode los controles sanos, se procedióal análisisde las alteraciones genómicas que presentan los pacientes LEZM frente a los controles sanos, haciendo uso de la técnica de los microarrays genómicos de altaafinidad (CGH-array). Como metodología de confirmación de los resultados obtenidos mediante los microarrays genómicos de alta afinidad, se ha utilizado la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH).

Los microarrays genómicosde alta afinidad utilizados en la presente invención han sido:BAC/PACCGH-array, Agilent CGH-array, NimbleGen CGH-arrayyTiling path CGH-array específico del cromosoma7.

El primer análisis realizado en las muestrasde pacientes LEZM se llevóa cabo mediantela plataformaBAC/PAC CGH-array, enlaque se analizaron los cambios enel númerode copiasde ADNde los pacientes LEZM frentea los controles sanos. ElBAC/PAC CGH-array utilizado comprende 3523 clones procedentes deBACs (cromosoma artificial bacteriano) y PACs (cromosoma artificial derivado del bacteriófago P1), cubriendo todo el genoma con una resolución de 1 Mb. Dicho microarray de alta afinidad fue obtenido en el Centro de Investigación del Cáncer (Salamanca, España) como se describe (Robledo et al., 2009). Brevemente, en primer lugar se procedió a la preparación de los ADN genómicos de pacientes LEZM y controles sanos, para hibridar con el array. Para ello se sometieron 2 µg ADN tumoral y control a una fragmentación mediante la digestión con la endonucleasa de restricción DpnII (New England Biolabs, Beverly, MA), para posteriormente proceder a su purificación mediante centrifugaciones en gradiente decreciente de etanol. Las muestras de ADN genómico (pacientesy controles) digerido y purificado se marcaron mediante la técnica de Ramdom-Prime con el Kit de Mareaje Bioprimer Labelling kit(Invitrogen).Parael mareaje se utilizaron dos fluorocromos diferentes,Cy3-dCTP (Amersham Biosciences)para los controlesy Cy5-dCTP (Amersham Biosciences) para las muestras a testar. La incorporación de nucleótidos marcados se cuantificó con el espectrofotómetro NanoDrop (ND-1000, Tecnologías NanoDrop, Wilmington, DE, EE.UU.).

Parala hibridaciónsobreelarray,se mezclaronlas muestrasdeADN marcadojuntoconADNcompetidorhumano Cot-1(LifeTechnologies), se mezclaron con solución de hibridación (50% formamida, 10% de sulfato de dextrano, 2X solución estándar salinade citrato,10mMTrispH7.6,2,7%de DodecilSulfato Sódico(SDS)y10 µg/µlde tARN de levadura) en el aparato para el procesamiento automatizado de arrays GeneTAC (Mícrogen) durante 48 horas a 42ºC segúnel protocolo recomendado porelfabricante.

Unavez concluidoel procesode hibridación,el arrayfue escaneadoenel escáner láserdualGenePix 4000B(Axon Instruments)ylas imágenes fueron analizadas con el software Pro4.0 GenePix (Axon Instruments). La intensidad de las señales de fluorescencia obtenidas para cada punto fue calculada después de la sustracción del ruido de fondo. Los ratios de fluorescencia se normalizaron usando la mediana de los ratios de fluorescencia de cada punto computado como el valor log2.

Para validar el array se realizaron una serie de hibridaciones hombre vs mujer controlesy además marcando el ADN empleado como control en las hibridaciones con las muestras a testar con los distintos fluorocromos, para eliminar los clones que en estas hibridaciones se encuentran alterados porque se considerarán que no se ven afectados porla enfermedad a analizar. Lasgananciasy pérdidas enel númerode copiasde las regiones del ADNgenómico obtenidas mediante la plataformaBAC/PAC CGH-array, se identificaron mediante la creación de umbrales de muestreo específicos, determinándose un valor de corte de 0,4 (Robledo C et al, Cancer. 2009;115(16):372837).

Para determinarqueunclonestá alteradose calculael promediodelosvaloresdeloslogaritmosdelos ratiosdela señal correspondientealCy5(ADNtumoral) frenteala correspondientealCy3(ADN control)decada triplicadodel clon. Los clones con valores de logaritmo por encima o debajo del valor de corte obtenido en el ADN de los controles (0,4)se consideró comogananciaso pérdidas respectivamente.Al menos,dos clonesBAC/PACcontiguosconunratio delog2de-0.4o menosse definió comounaregión “perdida”yaquellosconunratiodelog2de+0.4omásse definió como unaregión“ganada”.Del análisisde array genómicoseexcluyenlos puntosque tienen una intensidadbajade fluorescenciadelos fluorocromosCy3oCy5(por debajodeR2<0.2)y una desviación estándar mayoro iguala 0.3. Aproximadamente, un 10% de los clones fueron excluidos del análisis.

Cada clon del BAC/PAC CGH-array se comparó con las bases de datos “Database of Genomic Variants” (www.project.tcag.ca; Noviembre de 2009) y con la base de datos de desequilibrios cromosómicos y fenotipo de humanos “Ensembl Resources” (http://www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher/; noviembre de 2009).

Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que en 57 (84%) de los 68 pacientes con LEZM se identificaron alteraciones cromosómicas medíante el arraygenómico de alta afinidadBAC/PACCGH-array. La mediana de cambios por paciente fue de 4 (con un rango de 0-12). Las alteraciones genómicas más frecuentes mostradas en los pacientes analizados fueronganancias en los cromosomas 4q22.1 (14/57;25%), 1q21.3-q22 (12/57; 21%), 6q25.3, 20q13.33(11/57;19%),3q28,22q(10/57;18%),6p21.1,11q12.2(8/57;14%)ypérdidasaniveldelos cromosomas 7q22.1 (28/57; 49%), 2q23.3-q24.1 (20/57; 35%), 17p13.3-p13.1 (18/57; 32%), 4q31.3-q32.1 (17/57; 30%), 7q22.2q35 (16/57; 30%), 3p26.1 (14/57; 25%), 3q13.11 (13/57; 23%)y 18q12.1 (9/57; 16%) (Figura 1). Sólo tres casos mostraron pérdidas en el cromosoma 14qysolamente un caso tenía trisomía del cromosoma 12. Además, se delimitó un segmento crítico delecionado en 18 pacientes (32%) en el cromosoma 17p13.1, donde está localizado el gen TP53, que es un gen supresor tumoral, implicado en procesos de inducción de respuesta celular ante daños en el ADN, deteniendo incluso el ciclo celular en caso de mutaciones.

Enlos19 pacientesqueno mostraron alteracionesenel cromosoma7qla medianade cambiosfuede4(rango18)ylasgananciasmás frecuentesse localizaronanivelde 1q21.3-q22, 20q13.33 (42%), 6q25.3,22q (37%),6p21.1, 11q12.2 (26%)y10q22.3 (21%) mientras que las pérdidas en 2q23.3-q24.1 (37%), 4q31.3-q32.1 (26%), 3p26.1 (21%), 6q, 14q31.1-q32.11 (16%)y8p23.2-p12 (10%) (Figura 2).

Ejemplo3

Validaciónde lasregiones perdidas identificadas medianteBAC/PACCGH-array mediantela técnica FISH

Como metodologíade confirmaciónde los resultadosobtenidos medianteel microarrayde alta afinidadBAC/PAC CGH-array, se llevaron a cabo experimentos de FISH en un total de 20 pacientes diagnosticados de LEZM. Mediante la técnica de FISH se puede observar, mediante microscopía de fluorescencia, si una región está o no delecionada, ya que la región cromosómica con la que híbrida cada una de las sondas utilizadas, está duplicada en cada una de las células, si dicha zona no está delecionada, debe observarse en la célula dos señales con el color correspondiente al fluoróforoconelquesehaya marcadodichasonda.Encambio,siestádelecionada, únicamenteseobservaráunaúnica señal del color correspondiente al fluoróforo con el que se haya marcado dicha sonda.

En todos los casos el análisis mediante FISH confirmó los resultados obtenidos por CGH-array: deleción en la región 7q.Para corroborar más específicamente dichos resultados, se eligieron8pacientes LEZM, tres de ellos que mostraron pérdidasenlaregión7q medianteelBAC/PACCGH-arrayyotros cincoquenomostraron cambiosgenéticosen dicharegión.El único criteriode seleccióndelos pacientes estaba basadoenla disponibilidaddela muestra (seccionesde bazo embebidos en bloquesde parafina). Las sondas empleadas parala hibridación fueron los clonesde losBACs: RP11-44M6situado enla banda del cromosoma 7q22.1 (99873610-100038722 pb), RP11-333G13 situado en7q22.1 (101175494-101390682pb), RP11-36B6 localizadoanivelde7q31.31 (130078078-130270796pb)yRP11371N6 localizado en 7q33 (134684519-134842787 pb) como se describe previamente (González MB et al,. Cancer Genet Cytogenet. 2004;150(2):136-43). Estos clones fueron seleccionadosdela colecciónde clonesBAC/PACCGH-array(WellcomeTrust Sanger Institute,de Cambridge, Reino Unido),y semarcaron medianteel procedimientode “traslado de la muesca” (nick translation), utilizando los fluoroforos: Spectrum Green o Spectrum Orange, siguiendo las instrucciones delfabricante (Abbot Laboratories).

En siete de los ocho pacientesse analizó la región 7q22.1 mediante FISH. Cuatro de dichos pacientes mostraron una pérdida en dicha región, cuando se les analizó mediante la técnicaBAC/PACCGH-array, resultado que se corroboró mediante la técnica FISH, mientras que los restantes tres pacientes no presentaron pérdida ni mediante la técnica BAC/PACCGH-array ni mediante FISH.

Por otro lado, en otros cuatro pacientes se analizó la región 7q33.1 mediante FISH. Dos de los pacientes con LEZM, mostraron delecionesmediante ambas técnicas:BAC/PACCGH-arrayyFISH. Los dospacientes restantesno mostraron alteraciones en la región de 7q33.1 por ninguna de las dos técnicas empleadas,BAC/PAC CGH-array ni FISH.

Ejemplo4

Análisis de los LEZM mediante plataformas comerciales de CGH-array

Para definirdeuna maneramásprecisalas zonas delecionadasenlaregión7qde pacientesLEZM,se utilizarondos plataformas de CGH-arrays comerciales que presentaban una mayor afinidadyresolución que la técnicaBAC/PAC CGH-array. Estas plataformas son Agilent Human Genome CGH Microarray 44KyNimbleGen human CGH 4x72 KWhole Genome v2.0 array.

Se hibridaron muestras de ocho pacientes con LEZM en el microarray Agilent de 44 K. La plataforma de Agilent contiene 44.255 sondas sintetizadas in situ yespaciadas a intervalos de 43.000pb en todo el genoma humano, incluyendoademás,3.877sondascomo control.Elmicroarraysediseñópara estudiarlos cambiosenelnúmerodecopiasy representa la mayor parte de los genes humanos conocidos. Las sondas, además, son enriquecidas con genes relevantes en las patologías oncológicas, representando tanto a las secuencias codificantes como a las no codificantes de los cromosomas.Seha usadoADN genómico humanode placenta como controly sehaseguidoel protocolo recomendado por Agilent. Los arrays fueron escaneados medianteel escánerde Agilent.Laextracción, filtradoy normalización de los datos obtenidos, se llevó a cabo utilizando el software Feature Extraction software (Agilent Technologies). Posteriormentese utilizóel software Agilent CGH Analytics Software 3.4 (AgilentTechnologies) paraexportarlos datosdel arrayypoderlos analizarmedianteel softwareNexusCopyNumber Professional trial software(versión4, BioDiscovery Inc) (BaumbuschLO et al,. BMC Genomics. 2008;8;9:379).

Para llevar a cabo la técnica del microarray NimbleGen human de 72 K, se seleccionaron once pacientes con LEZM. Como ADN genómicocontrol, se utilizó ADNde placenta humano.Para llevara cabola obtencióndelos resultados se siguieron las instrucciones delfabricante. Brevemente, 500 ngde ADN tumoralde pacientes LEZMy de controles sanos, se marcó con los fluorocromos Cy3yCy5, respectivamente. El ADN marcado fluorescentemente se hibridó al microarray NimbleGen que posee 71.341 sondas de oligonucleótidos espaciadas aproximadamente a intervalos de 40.000 bp a lo largo de todo el genoma humano. Producida la hibridación, se procedió al lavado y escaneado del array a una resolución de 10 µm usando el escáner dual GenePix 4000B (Axon Instruments). Los datos fueron obtenidos mediante el software NimbleScan v2.5 (NimbleGen System, Inc), que permite la alineación automáticadelos resultados,suextracciónyla generaciónde archivosde datos útiles parasu análisis (SelzerRR et al,. Genes Chromosomes Cancer. 2005 Nov;44(3):305-19).

LasmetodologíasdeCGH-arraysempleadas hasta ahoraenla presenteinvención,BAC-CGH array,AgilentHuman Genome CGH Microarray 44KyNimbleGen human CGH 4x72KWhole Genome v2.0 array, confirmaron la existenciade alteracionesenel genomade pacientes con LEZM. Estas alteracionesfueron principalmente,gananciasa niveldelos cromosomas3, 6p22.1-p21.1,8q,17q,18ypérdidasaniveldelos cromosomas 4q28.3-q31.23, 10q24.33q25.3y17p13.3-p13.1. Además, estos CGH-arrays pusierondemanifiestolaexistenciade un paciente con trisomía enlos cromosomas3,12y18.Tantolos arrays genómicos conADNdeBACs comolosque tienen oligonucleótidos como sondas diana de hibridación, Agilent 44Ky NimbleGen 72 K, mostraron alteraciones en el brazo largo del cromosoma 7, quedando demostrado por tanto, mediante tres técnicas diferentes, la existencia de deleciones en el brazo largodel cromosoma7. Posteriormente se procedióal análisis pormenorizadode dicho cromosoma7mediante un array de alta afinidad específico del mismo.

Ejemplo5

Análisis detallado del cromosoma7

El análisis detallado del cromosoma 7medianteel“Tiling-array”deNimbleGen 385K, se realizó para redefinir la región específica delecionada en los pacientes con LEZM. El “Tiling-array” del cromosoma 7 se realizó con 4 muestras procedentesde pacientes con LEZM (tresde ellos conpérdidas confirmadasporlos métodos anterioresen la región 7q22.1,yel otro paciente LEZM sin anomalías en la región 7q22.1). Este “tiling-array” del cromosoma 7 se diseñó específicamentea una alta resolucióny con un fino análisis resolutivo que comprendía las bases 117.711

158.805.222pbde todoel cromosoma7. Este “tiling-array” del cromosoma7fue diseñado mediantela tecnologíade síntesis de array sin máscara (NimbleGen Systems, Inc.), con un máximo de 385.110 oligonucleótidos o sondas, con una mediana de separación entre sondas de 311 pb, lo que permite un profundo mapeo de toda la región. El diseño de alta resolución permite diseñar oligonucleótidos que estén colocados a menudo solapándose unos con otros para así obtener una elevada resolución de la zona a analizar, en la presente invención, de todo el cromosoma 7.

Llevadoa caboel procedimientode hibridación,el arrayse escaneóa una resoluciónde5 µm utilizando el escáner NimbleGen MS 200 Microarray (Roche NimbleGen Instruments). Los datos fueron extraídos de las imágenes escaneadas utilizandoel software NimbleScan v2.5 (NimbleGen system, Inc),que permitela automática alineacióndelos datosy suextracción, generando un archivosde datos útiles para su análisis.

Mediante el análisis de los pacientes LEZM con el “tiling-array” específico del cromosoma 7de NimbleGen, se detectaron que3de los4pacientes incluidos en este estudio mostraron pérdidasanivelde 7q22.1 (Figura3).

Analizandolos resultados obtenidosde todoslos ensayosCGH-arrayrealizadosenlas muestrasdelos pacientes con LEZM,y específicamente teniendo en cuenta los datos obtenidos medianteelTiling array específico delcromosoma7,seponedemanifiestoquela deleción mayoritariaenlos pacientesconLEZM-un49%delospacientes analizadosla presentan(27de57 casos)-se localizaenla banda 7q22.1y se encuentra mapeadosporlos cloneso sondasde losBAC/PACCGH-array:BACRP11-44M6 (SEQIDNO:1),PACRP5-1059M17 (SEQID NO:2)yBAC RP11-333G13 (SEQ ID NO:3), más específicamente entre las bases 99925039-101348479, dónde se localizan los genes TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, SH2B2,MUC17 yCUX1. Esta región tiene un tamaño aproximado de 1.4 Mb.

La precisadeteccióndela regióndelecionada enla banda 7q22.1, que implica las bases 99925039-101348479,ha sido posible gracias a la diferencia existente entre los límites de resolución de las diferentes metodologías utilizadas: BAC/PACCGH-array, Agilent44K, NimbleGen72Ky“tiling-array” específicodel cromosoma7de385K.Como se puede apreciar en la Figura 3, mediante el “tiling-array” específico del cromosoma 7, la región queda mucho mejor cartografiada debido a que el número de oligonucleótidos que detectamos para dicha región, es mucho mayor que con los otros arrays, 3.553 oligonucleótidos (Figura4C) frentealos53del NimbleGen72K(Figura4B)olostres clones delBAC/PACCGH-array (Figura 4A). Por lo tanto con el análisis del “tiling-array” específico del cromosoma7 se puede detectar con mayor precisión la localización exacta de la deleción que se produce en la banda del cromosoma 7q22.1.

La Figura 4A muestra el resultado delBAC/PACCGH-array en muestras de tres pacientes, observándose que en dichos pacientes había una pérdida mostrada en negro en la región7q22.1, mientras que en el control no se observa cambio.Laregión 7q22.1en este array estaba mapeadapor3clonescon una resoluciónde1Mb.Enla Figura4Bse muestrael resultadodel array NimbleGen72Kquetiene una resoluciónde42kb,ylaregión 7q22.1 estaba cubierta por53 oligos, en muestrasde3pacientes con LEZM. Los resultados obtenidosmuestran que los pacientes mostraban pérdidasa estenivel, mientrasqueel controlno mostró cambios.Enla Figura4Cse muestranlos resultados obtenidos medianteel array NimbleGen 385K, mostrando un zoom del áreade supresión (7q22.1). Como puede observarse,la región7q22.1 estaba mapeadapormásde 3.500oligosypudo delimitarselaregión comúnmente delecionadaaeste nivel entre los locis D7S2120EyD7S740. Porlo tanto,el “tiling-array” específico del cromosoma7permite detectar con mayor precisión la localización exacta de la deleción que se produce en la banda del cromosoma 7q22.1.

Mediante el método de la invención, también se ha puesto de manifiesto la deleción en una región más distal del cromosoma 7, la región 7q22-q35, entre las bases 102949624-145959694. En esta región de 43,15 Mb de tamaño localizada entre losBACs RP4-672O11y RP4-558L10 se localizan varios genes como por ejemplo: RELN, LHFPL3, PBEF1, THAP5, IMMP2L, FOXP2, TES, MET, ST7, PTPRZ1, GRM8, UBE2H, MLKN1, BPGM, CALD1, PTN, SVOPL,AGK, KEL, TPK1 yCNTNAP2. Dicha región se detecta mediante, entre otros,el clono sonda delBAC/PAC CGH-array:BACRP11-371N6(SEQIDNO:4) localizadaen7q33 (135034979-135191247).Así, medianteelempleo conjunto de las sondas que reconocen la deleción específica de la región 7q22.1, definidas como SEQ ID NO:1, SEQ IDNO:2ySEQIDNO:3,juntoconelempleodelasondaque reconocela delecióndelaregión7q33, definidacomo SEQ ID NO:4, se podría conseguir el aumento en el número de pacientes con LEZM diagnosticados.

Los resultados obtenidos mediante el empleo de plataformas comerciales, Nimblegen, Agilent,y losBAC/PAC CGH-array confirmanla pérdida parcial del cromosoma7comoel cambio más frecuente en los pacientes con LEZM. Además, ponen de manifiesto la existencia de una nueva región comúnmente delecionada en pacientes con LEZM, lo que le permite ser útil para su uso en clínica, situada a nivel de la banda 7q22.1, en un 49% de los pacientes analizados. En esta región específica delecionada en pacientes LEZM, localizada entre las bases 99925039-101348479 de la región 7q22.1, se localizan los genes: TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, SH2B2, MUC17 yCUX1. El análisisdeexpresiónde dichos genesen pacientes LEZM frentea controles sanoso pacientes aquejadosde otrostipos de linfomas, permitirá detectar si alguno de los mismos puede ser utilizado como marcador diagnóstico para dicha enfermedad.

Ejemplo6

Análisis de la expresión génica de CUX1 en pacientes LEZM

Como se ha mencionado anteriormente, en la región 7q22.1 se localizan los genes TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3,MUC12, SH2B2,MUC17 yCUX1. La proteína que codifica el gen CUX1 esun miembrodelafamiliadelas proteínasde unióna ADN. Puede regularlaexpresión genética,la morfogénesisyla diferenciaciónypuede tenerun papelenla progresióndel ciclo celular.En pacientescon enfermedad mieloide comolos síndromes mielodisplásicoso la leucemia mielomonocíticajuvenilse observóque era frecuentela monosomíadel cromosoma7, con una pérdidade los genes de la región de 7q22 entre los que se encuentra CUX1,ysin embargo, los análisis mutacionales no revelaron mutaciones patológicas en ninguno de los casos analizados, por lo que se concluyó que era improbable que este gen tuviese un papel importante en este tipo de neoplasias. (Hindersin,S et al, Leuk. Res.2007; 31:1323-1324). Hasta la fecha los estudios realizados en los LEZM no han podido relacionar la expresión del gen CUX1 con este tipo de neoplasia.

En la presente invención se procedió al análisis de la expresión génica de CUX1 medianteRT-PCR enmuestras de pacientes LEZM, de pacientes con leucemia linfocítica crónica de célulasB (LLCB)y en individuos controles sanos. Mediantela técnicadeRT-PCR, también conocida como “Reacciónen cadenadela polimerasa”,porsussiglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), se pretende obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. El material procedente de estos enfermos fue congelado en trizol (Invitrogen LifeTechnologies, Gaithersburg, MD) a -80ºC para extraer el ARN total. Posteriormente se procedió a su purificación del ARN mediante las columnas RNeasy® Mini, (Qiagen,Valencia,CA) para eliminarlos restosdeADNode proteínasquehubieran podido quedar yque pudieran interferirenel pasode este ARNa ADNc. Unavez purificado es convenienteevaluarla integridad del ARN obtenido midiendo su cantidadycalidad utilizando el sistema de Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent,Palo Alto, CA) con el kit ARN 6000 Nano LabChip.Para la síntesis del ADNc se empleó el kit comercial SuperscriptIII (SuperScript® III Fírst-Strand Synthesis SuperMix paraqRT-PCR,Invitrogen).En todos los casos se partióde1 µg de ARN total. Una vez obtenido el ADNc se purificó mediante el kit ADNc Cleanup (Affymetrix sample Cleanup Module Kit).

Los cebadores utilizados para obtener el ADNc se diseñaron mediante el programa “Primer Express 3.0” (Applied Biosystems). Además, con el programa “Oligoanalyzer” se observó que no formasen dímerosyfinalmente, se comprobó su especificidad con el programa NCBI BLAST. Los cebadores seleccionados para la realización del análisis de la expresión de CUX1 fueron la SEQ ID NO:5 (Cebador sentido del gen CUX1)y la SEQ ID NO:6 (Cebador antisentido del gen CUX1), como gen control se utilizó el gen ABL representado por las secuencias SEQ IDNO:7 (Cebador sentidodelgenABL)ySEQIDNO:8 (Cebador antisentidodelgenABL).

Para optimizar la temperatura de anillamíento de los cebadores diseñados, se realizó una prueba de gradiente de los mismos en el iCycler (Biorad) con un ADNc control procedente de la línea celular de Mieloma Múltiple (RPMI). Además, se utilizó el gen control ABL que mediante la detección de fluorescencia con el SYBR Green (Applied Biosystem)yelmétodode análisisPfaffl(PfafflMW,NucleicAcidsRes.2001May1:e45) determinaronla cuantificación relativadela sonda dianaen comparaciónconelgende referencia.Brevemente,enel métodode análisisdePfaffl las muestras se analizan por triplicado; se emplearon 10 ng/pocillo de cada muestra; se utilizó para cada gen un control positivo (ADNc control)y un control negativo(H2O).La reacción se realizóala temperatura óptimade cada cebador determinada por la prueba de gradiente. La reacción de PCR se preparó añadiendo los cebadores correspondientes (sentidoyantisentido), el ADNc, el 2xFast SYBR Green (Applied Biosystem)y elH2Ohasta completar unvolumen final de 25 µl. Unavez preparadala placa se introdujo enel termociclador para seguirel protocolodela PCRy su posterior análisis.

Los resultados obtenidos se expresaron en términos relativos (Ct, Threshold cycle) en función de la expresión del gen control ABL.

Los resultados obtenidos muestran que se producen un aumento en la expresión génica de CUX1 en los pacientes diagnosticadosdeLEZMcon respectoalossujetos control sanosyrespectoalospacientes diagnosticadosconLLCB (Figura 5).

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Método de diagnóstico in vitro de LEZM que comprende un paso de detección de la deleción comprendida entre las bases 99925039-101348479 localizadas en la región 7q22.1, en la que se localiza al menos el gen CUX1, mediante la utilización de arrays genómicos de alta afinidad.

2. 2.

   Método según la reivindicación1 caracterizado porque además en dicha región se localizan entre otros, los genes TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3,MUC12, SH2B2 yMUC17.

3. 3.

   Métodosegúnla reivindicación1 o2 que comprende ademásla deteccióndela deleción comprendida entre las bases 102949624-145959694 en la región 7q22.2-q35 en la que se localizan, entre otros, los genes: RELN, LHFPL3, PBEF1, THAP5, IMMP2L, FOXP2, TES, MET, ST7, PTPRZ1, GRM8, UBE2H, MLKN1, BPGM, CALD1, PTN, SVOPL,AGK, KEL, TPK1 yCNTNAP2 mediantela utilizaciónde arrays genómicosde alta afinidad.

4. 4.

   Métodosegún cualquieradelasreivindicaciones1,2o3 caracterizado porque se realiza sobre una muestra de ADN seleccionadade:una muestra procedentedeuntejido infiltradocon célulasde linfoma,deunaspiradodemédula ósea o de una muestra de sangre total.

5. 5.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque los arrays genómicos de alta afinidad utilizados se seleccionan entre:BAC/PACCGH-array, CGH-array Agilent, CGH-array NimbleGenyTilingarray de NimbleGen específico del cromosoma 7.

6. 6.

   Método de diagnóstico in vitro de LEZM que mide el nivel de expresión de al menos el gen CUX1, localizado en la deleción de la región 7q22.1 comprendida entre las bases 99925039-101348479.

7. 7.Métodosegúnlareivindicación6que comprendeademásla medicióndelniveldeexpresióndeal menos unode los genes seleccionados del grupo TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, SH2B2, MUC17 y/o cualquiera de sus combinaciones, localizados en la deleción de la región 7q22.1 comprendida entre las bases 99925039-101348479.

8. 8.

   Método según las reivindicaciones6 o7 caracterizado porque se realiza sobre una muestra de ARN seleccionada de: una muestra procedente de un tejido infiltrado con células de linfoma, de un aspirado de médula ósea o de una muestra de sangre total.

9. 9.

   Método de diagnóstico in vitro de LEZM que comprende una combinación en cualquier orden, de un paso de detección de la deleción comprendida entre las bases 99925039-101348479 localizada en la región 7q22,1, mediante la utilizaciónde arrays genómicosdealta afinidadyotropasoquemideelniveldeexpresióndeal menoselgenCUX

   1.

10. 10.

    Métodosegúnlareivindicación9 caracterizado porque además comprendela medicióndelniveldeexpresión de al menos uno de los genes seleccionados entre: TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, SH2B2 yMUC17 y/o cualquiera de sus combinaciones.

11. 11.

    Método según las reivindicaciones9 o10 que además comprendela deteccióndela deleción comprendida entre las bases 102949624-145959694 en la región 7q22.2-q35 donde se localizan, entre otros, los genes: RELN, LHFPL3, PBEF1, THAP5, IMMP2L, FOXP2, TES, MET, ST7, PTPRZ1, GRM8, UBE2H, MLKN1, BPGM, CALD1, PTN,SVOPL,AGK, KEL, TPK1 yCNTNAP2, mediante la utilización de arrays genómicos de alta afinidad.

12. 12.

    Kit de diagnóstico in vitro de LEZM que comprende un conjunto de sondas seleccionadas entre las comprendidasenel grupoSEQID NO:1,SEQID NO:2ySEQID NO:3,que hibriden totalo parcialmente sobrela deleción comprendida entre las bases 99925039-101348479 localizadas en la región 7q22.1, mediante arrays genómicos de alta afinidad.

13. 13.

    Kit según la reivindicación 12 que además comprende al menos una sonda que hibride total o parcialmente sobre la deleción comprendida entre las bases 102949624-145959694 en la región 7q22.2-q35, mediante arrays genómicos de alta afinidad, siendo preferentemente dicha sonda la definida como SEQ ID NO:4.

14. 14. Kit según la reivindicación 13 caracterizado porque la sonda hibrida en la región 7q33.

15. 15.

    Kit de diagnóstico in vitro de LEZM que detecta la expresión de al menos el gen CUX-1, localizado en la deleción de la región 7q22.1 comprendida entre las bases 99925039-101348479, localizadas en la región 7q22.1, medianteRT-PCR utilizandolos cebadores definidos comoSEQIDNO:5ySEQIDNO:6.

16. 16.

    Kit según la reivindicación 15 caracterizado porqueademás detectalaexpresióndeal menosunodelosgenes seleccionados entre TSC22D4, HRBL, LRCH4, MUC3, MUC12, SH2B2 yMUC17 y/o cualquiera de sus combinaciones mediante cebadores específicos para las secuencias de dichos genes.