CN110387423B - 前庭神经鞘瘤诊断用生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了前庭神经鞘瘤诊断用生物标志物，所述标志物选自LARP6、PAK3、FOXP2。本发明通过实验证明了LARP6、PAK3、FOXP2在前庭神经鞘瘤中表达下调，并通过生物信息统计学分析发现LARP6与PAK3或FOXP2组合具有很好的AUC值，提示LARP6、PAK3、FOXP2作为生物标志物具有较高的应用价值。本发明通过实验同时证明了LARP6、PAK3、FOXP2可以影响细胞的增殖，为前庭神经鞘瘤的治疗提供了新的分子手段。

Description

前庭神经鞘瘤诊断用生物标志物
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及前庭神经鞘瘤诊断用生物标志物，具体的涉及的生物标志物为LARP6、PAK3、FOXP2。
背景技术
前庭神经鞘膜瘤，又称为听神经瘤，是临床常见颅内肿瘤，原发于第八颅神经鞘膜，其发病率占桥小脑角区(cerebellopontine angle region,CPA)肿瘤的80％-90％(Wong BY,Capper R.Incidence of vestibular schwannoma and incidental findingson the magnetic resonance imaging and computed tomography scans of patientsfrom a direct referral audiology clinic.The Journal of laryngology andotology 2012；126:658-662.)，占总颅内肿瘤的6％-9％，为继脑膜瘤、垂体瘤及胶质瘤之后的第四大颅内肿瘤疾病，其发病率呈逐年升高的趋势。瘤体在增大的过程中逐渐压迫邻近重要结构，包括听神经、面神经、三叉神经、后组颅神经、动眼神经、小脑、脑干等，从而产生相应症状，主要表现为非对称性听力下降、耳鸣、眩晕、面瘫、面部麻木、疼痛及感觉减退、复视等，严重者可出现颅高压、偏瘫，甚至威胁生命(Gerganov VM,Pirayesh A,Nouri M,etal.Hydrocephalus associated with vestibular schwannomas:management optionsand factors predicting the outcome.Journal of neurosurgery 2011；114:1209-1215.)。
目前传统的治疗方法主要为手术切除及立体定向放射外科治疗，手术治疗往往会带来脑脊液漏、颅内感染、面瘫、脑神经损伤、脑水肿、及听力丧失等并发症，立体定向放射外科治疗后的并发症主要包括脑水肿、面神经损伤及三叉神经损伤，以及小脑水肿、迟发性肿瘤增大、脑干梗死以及肿瘤恶变等。因此，探究前庭神经鞘瘤的发生发展机制，寻找新的治疗方法，对于提高手术疗效、指导临床治疗具有重要的意义。
随着分子生物学的发展，遗传因素对疾病的影响受到广泛重视，寻找与疾病相关的基因成为当前研究的热点。越来越多的研究证实，基因在前庭神经鞘瘤中的发生发展过程中起着重要的调控作用，寻找前庭神经鞘瘤的生物标志物对于其早期诊断和治疗以及发病机制的探究具有重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，在于提供与前庭神经鞘瘤发生发展相关的分子标志物。
本发明的目的之二，在于提供一种诊断前庭神经鞘瘤的产品和手段，通过检测分子标志物的表达水平来判断患者是否患有前庭神经鞘瘤或者患前庭神经鞘瘤的风险，从而指导临床医生进行早期干预和治疗，提高患者的生存率和生存质量。
本发明的目的之三，在于提供一种治疗前庭神经鞘瘤的治疗方法和手段，通过改变生物标志物的表达水平，进而实现前庭神经鞘瘤的分子治疗。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测基因的试剂在制备诊断前庭神经鞘瘤的产品中的应用，所述基因包括LARP6、PAK3、FOXP2中的任意一种或几种。
进一步，所述基因为LARP6和PAK3。
进一步，所述基因为LARP6和FOXP2。
进一步，所述检测基因的试剂选自：
特异性识别所述基因的探针；
特异性扩增所述基因的引物；或
特异性结合所述基因编码的蛋白的抗体。
进一步，特异性扩增所述基因的引物包括：序列如SEQ ID NO.1～6所示的扩增LARP6、PAK3、FOXP2基因的引物。
本发明提供了一种诊断前庭神经鞘瘤的产品，所述产品包括检测LARP6、PAK3、FOXP2中的任意一种或两种的试剂。
进一步，所述产品包括检测LARP6和PAK3的试剂。
进一步，所述产品包括检测LARP6和FOXP2的试剂。
进一步，所述产品为芯片、试剂盒。
本发明提供给了PAK3、FOXP2和/或LARP6在构建预测前庭神经鞘瘤的计算模型中的应用。
本发明提供了基因在制备治疗前庭神经鞘瘤的药物中的应用，所述基因包括PAK3、FOXP2和/或LARP6。
进一步，所述药物包括PAK3、FOXP2和/或LARP6的促进剂。
进一步，所述促进剂为增加PAK3、FOXP2和/或LARP6表达水平的任何试剂，包括但不限于PAK3、FOXP2和/或LARP6的过表达载体，PAK3、FOXP2和/或LARP6蛋白，只要可以实现增加PAK3、FOXP2和/或LARP6表达水平即可。
本发明提供了一种治疗前庭神经鞘瘤的药物，所述药物包括PAK3、FOXP2和/或LARP6的促进剂。
附图说明
图1是QPCR检测基因在前庭神经鞘瘤中的表达差异图，其中图A、B、C、D的基因分别是LARP6、PAK3、FOXP2、ZMAT3。
图2是基因对前庭神经鞘瘤细胞增殖的影响图。
具体的实施方式
分子标志物
“生物标志物”是其在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因。“差异表达基因”或“基因差异表达”是指，与正常或对照用靶的表达相比，在患有前庭神经鞘瘤的患者体内得到更高或更低水平的活化的基因。此外，“差异表达基因”或“差异基因表达”包括相同疾病的不同分期内得到更高或更低水平的活化的基因。这种差异可通过如多肽的mRNA水平、表面显示、分泌或其他分配上的变化而得以证明。从本发明的目的出发，将“差异基因表达”视为从正常的或患有疾病的受试者中，或从患有疾病的受试者的各分期中的取得的基因的表达之间存在1.5倍或以上、约4倍或以上、约6倍或以上、约10倍或以上的差异时存在的现象。
LARP6、PAK3、FOXP2基因
LARP6，基因ID为55323，位于15号染色体长臂22区3带上，该基因目前存在3个转录本，一种代表性的转录本的序列如NM_001286679.2所示。
PAK3，基因ID为5063，位于X染色体长臂2区3带上，该基因目前存在16个转录本，一种代表性的转录本的序列如NM_001128166.2所示。
FOXP2，基因ID为93986，位于7号染色体长臂3区1带上，该基因目前存在6个转录本，一种代表性的转录本的序列如NM_001172766.3所示。
本领域技术人员知道，采用生物信息学进行基因比对的时候，会将测序的序列比对到已知的基因上，会将原始测序结果比对到人的参考基因组上，因此筛选结果中的基因可能包含该基因不同的突变型或其片段。
检测方法
本发明的基隐使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。
核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。
核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。
核酸杂交技术的示例性非限制性实例包括但不限于：原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。
蛋白免疫技术的示例性非限制性实例包括但不限于：夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。
生物学分析
样品与正常的比较
可将在个体提供的样品(测度样品)上进行的分子表达谱的结果与已知或怀疑为正常的生物样品相比较。正常样品是没有或预期没有任何癌症、疾病或状况的样品或在分子表达谱分析中对于任何癌症疾病或状况测试为阴性的样品。正常样品可来自与被测试个体不同的个体或来自相同个体。正常样品可与测试样品在同一时间或不同时间进行分析。
可将测试样品的分析结果与在正常样品上进行的相同分析的结果相比较。在某些情况下，在正常样品上的分析结果来自于数据库或基准。在某些情况下，在正常样品上的分析结果是已知的或通常被本领域普通技术人员所接受的值。在某些情况下，比较是定性的。在其他情况下，比较是定量的。在一些情况下，定性或定量比较可包括但不限于以下一种或多种：比较荧光值、点强度、吸光度值、化学发光信号、柱状图、关键阈值、统计学显著性值、基因产物表达水平、基因产物表达水平的改变、可选择外显子使用、可选择外显子使用的改变、蛋白质水平、DNA多态性、拷贝(copy)数变异、一种或多种DNA标志物或区域存在或不存在的指示或核酸序列。
结果评估
在某些实施方式中，使用本领域已知的方法评估分子表达谱结果以将基因产物表达水平或可选择外显子使用与特定表型如恶性、恶性类型、良性或正常性(如不具有疾病或状况)相关联。在某些情况下，可以确定指定的统计学置信度水平以提供诊断置信水平。例如，可以确定，大于90％的置信度水平可以是恶性、恶性类型或良性的可用预测值。在其他实施方式中，可以选择更高或更低严格性的置信度水平。例如，可以选择大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％或99.9％的置信度水平作为有用的表型预测值。在某些情况下，所提供的置信度水平可与样品的质量、数据的质量、分析的质量、所使用的特定方法和所分析的基因表达产物的数量相关。用于提供诊断的指定置信度水平可基于预期的假阳性或假阴性的数目和/或费用进行选择。选择用于实现指定的置信度水平或用于识别具有诊断能力的标志物的参数的方法包括但不限于：受试者工作特征曲线分析(Receiver Operator Curve analysis，ROC)、副法线ROC、主成分分析、部分最小平方分析、奇异值分解、最小绝对收缩和选择操作器(least absolute shrinkage and selectionoperator)分析、最小角回归和阈值梯度导向规则化(threshold gradient directedregularization)方法。
本发明提供了基因在构建预测前庭神经鞘瘤的计算模型中的应用。正如熟练技术人员会领会的，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合蛋白质和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。
在本发明的优选的实施方案中，标志物的组合为LARP6和PAK3，本发明通过使用生物信息学方法检测受试者工作特征曲线，发现LARP6和PAK3联合应用的AUC值为0.96，因此以LARP6和PAK3作为生物标志物进行联合诊断具有较高的准确率。
在本发明的另一优选的实施方案中，标志物的组合为LARP6和FOXP2，本发明通过使用生物信息学方法检测受试者工作特征曲线，发现LARP6和FOXP2联合应用的AUC值为0.97，因此以LARP6和FOXP2作为生物标志物进行联合诊断具有较高的准确率。
在本发明的具体实施例中，实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，基因在实验组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1高通量检测差异表达基因
1、实验材料
1)样本采集
分别收集42例前庭神经鞘瘤患者的肿瘤组织和癌旁组织，从中随机选取5例前庭神经鞘瘤患者的肿瘤组织和癌旁组织进行高通量测序，排除其他脑疾病的患者。
2)实验仪器
电动组织匀浆器DY89—11，宁波新芝生物科技股份有限公司，
离心机Centrifuge 5424R，Eppendorf，
NanoVue Plus 28956057，BIOCHROM LTD
2、RNA样品的制备
使用Trizol法提取组织RNA，步骤如下：
1)用剪刀组织剪碎，加入1ml Trizol,振荡器上震荡1min；常温放置10min，使核蛋白体完全分解。
2)加入200μl三氯甲烷(氯仿)，盖紧管盖，剧烈震荡15s，常温静置10min。
3)4℃，11000rpm离心15min。
4)将水样层转移到一个新的离心管中，加入500μl异丙醇；颠倒混匀后，常温静置10min。
5)4℃，11000rpm离心15min。
6)用枪小心吸走液体，留沉淀在管底，加入1ml 75％的乙醇，在振荡器上震荡5s，洗涤沉淀一次。
7)4℃，8000rpm离心5min。
8)将上清小心去掉，干燥沉淀10min，加入适量的水溶解沉淀10min。
9)检测RNA浓度，鉴定RNA的产量和纯度。
3、构建cDNA文库及测序
cDNA文库的构建及测序由华大基因完成，步骤如下：
使用用Epicentre的Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA；利用金属离子将完整的RNA随机打断成200bp左右的小片段。
利用Illumina的TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作详见说明书。
检测合格的文库，加入NaOH变性成单链，变性稀释后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交，在cBot上完成桥式PCR扩增，使用Illumina X-Ten测序平台进行测序。
4、高通量转录组测序数据分析
对测序结果进行生物信息学分析，使用metaMA包分析，meta分析中p值合并所用方法为inverse normal method。差异表达基因的筛选标准是FDR<0.05。
5、结果
RNA-seq结果显示，与癌旁组织相比，LARP6、PAK3、FOXP2和ZMAT3呈现差异表达，其中LARP6、PAK3、FOXP2表达下调，ZMAT3表达上调。
实施例2 QPCR检测相关基因的差异表达
1、实验材料
FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN，KR106)，
SuperReal荧光定量预混试剂增强版(TIANGEN，FP205)，
miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit(TIANGEN，KR211-02)，
miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit(SYBR Green)
(TIANGEN，FP411-02)
荧光定量PCR仪ABI7300，Applied Biosystems
2、RNA提取
步骤同实施例1。
3、逆转录：
采用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒进行mRNA反转录，步骤如下：
首先去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNA Buffer 2.0μl，TotalRNA1μg，加Rnase Free ddH2O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min。
将10×Fast RT Buffer 2.0μl，RT Enzyme Mix 1.0μl，FQ-RT Primer Mix 2.0μl，RNase Free ddH2O 5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min，合成的cDNA需要长期保存时，请于-20℃或更低温度保存。
4、荧光定量检测
用ABI 7300型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行基因的相对定量分析。
扩增体系的配置：2×SuperReal PreMix Plus 10μl，正反向引物(10μM)各0.6μl(引物序列如表1所示)，5×ROX Reference Dye△2μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。
扩增程序为：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃33s)×42个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s)。
表1引物序列
Figure BDA0002198214050000091
5、结果
结果如图1所示，与癌旁组织相比，LARP6、PAK3、FOXP2和ZMAT3呈现差异表达，其中LARP6、PAK3、FOXP2在前庭神经鞘瘤组织中表达下调，ZMAT3在前庭神经鞘瘤组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，其中，LARP6、PAK3、FOXP2分别在45例、47例、39例样本中表达下调，所述样本中分别包括39例、40例、37例为前庭神经鞘瘤组织，ZMAT3在44例样本中表达上调，所述样本包含36例前庭神经鞘组织。
实施例3分析基因在GEO数据库中的表达情况
1、数据收集
从GEO数据库中收集88例前庭神经鞘瘤组织和22例癌旁组织的基因表达谱数据，对LARP6、PAK3、FOXP2和ZMAT3基因进行表达差异的验证，使用R3.6.1软件中的pROC包中的主函数ROC计算基因的AUC值。
2、结果
结果显示，与癌旁组织相比，LARP6、PAK3、FOXP2在前庭神经鞘瘤组织中表达下调，ZMAT3在前庭神经鞘瘤组织中表达上调，AUC结果如表2所示，LARP6、PAK3、FOXP2、ZMAT3单独进行诊断具有较好的诊断效果(AUC值>0.8)，LARP6与PAK3、FOXP2则具有很好的诊断效果(AUC值>0.95)，而LARP6、PAK3、FOXP2与ZMAT3组合则诊断效果较差(AUC值<0.7)
表2基因诊断预测
基因 AUC值
LARP6 0.806828
PAK3 0.8967156
FOXP2 0.8081245
ZMAT3 0.8483146
LARP6+PAK3 0.9589455
LARP6+FOXP2 0.9706137
LARP6+ZMAT3 0.6758859
FOXP2+PAK3 0.865169
FOXP2+ZMAT3 0.5133967
PAK3+ZMAT3 0.5989628
实施例4 CCK-8法检测基因对前庭神经鞘瘤细胞的影响
1、原代细胞的培养
1)将前庭神经鞘瘤肿瘤组织置入4℃的培养基中，剪成1mm3的小块，用PBS页洗涤3遍，1000rpm离心1min，去上清；
2)转入含200mg/L链霉素、105U/L青霉素、200mmol/L HEPES、10％胎牛血清的培养基中，于37℃摇床培养2h，离心去上清；
3)将细胞接种于50ml培养瓶中，加入含10％胎牛血清的培养基；
4)37℃培养箱中培养，3天后更换培养基。
2、质粒转染
LARP6、PAK3、FOXP2过表达质粒购自上海生工，选择空载体作为对照，转染试剂为lipofectamine 3000，按照建议的浓度进行转染。
3、CCK-8检测细胞增殖
1)将细胞接种于96孔板中，100μl/孔，每孔数量为2000个细胞。将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱培养过夜，于1-5天连续进行CCK-8检测；
2)向每孔加入10μl CCK-8溶液，将96孔板在培养箱内避光孵育2.5h；
3)用酶标仪测定在450nm处的OD值。
4、结果
结果如图2所示，过表达LARP6、PAK3、FOXP2基因后，前庭神经鞘瘤细胞的增殖受到不同程度的抑制，说明LARP6、PAK3、FOXP2参与了前列神经鞘瘤细胞的增殖过程，为前列神经鞘瘤的治疗提供了新的靶点。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 河北医科大学第二医院
<120> 前庭神经鞘瘤诊断用生物标志物
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagcatccac ctgaacaa 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttggcagaag actcatcac 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agaggaagaa gaagaagaag 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caaccacaga acgagtat 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gactacctcc tccaacac 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcacttagaa ctgaagactg 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgctcaatg tgtaatgtt 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caccttgctc ttatgttg 18
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aatcccatca ccatcttcca g 21
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gagccccagc cttctccat 19

Claims (4)

1.检测基因的试剂在制备诊断前庭神经鞘瘤的产品中的应用，其特征在于，所述基因为LARP6与PAK3的组合或LARP6与FOXP2的组合。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测基因的试剂选自：
特异性识别所述基因的探针；或
特异性扩增所述基因的引物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，特异性扩增所述基因的引物包括：序列如SEQ ID NO.1~6所示的扩增LARP6、PAK3、FOXP2基因的引物。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为芯片或试剂盒。
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