CN101520457A - 一种pak3作为神经内分泌肿瘤的生物学标记物的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种PAK3作为神经内分泌肿瘤的生物学标记物的新用途。本发明通过对胸腺类癌、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺腺瘤、垂体瘤、肾上腺腺瘤、胰岛细胞瘤细胞株、小细胞肺癌细胞株等神经内分泌肿瘤组织及细胞进行PAK3的蛋白表达水平检测，均高度表达，涵盖了临床常见的神经内分泌肿瘤，涉及身体各个组织及腺体，这是首次发现PAK3与肿瘤相关，特别是与神经内分泌肿瘤相关；本发明揭示了PAK3可以明显增加细胞的迁移能力，显示PAK3在神经内分泌肿瘤的发展过程中发挥了重要作用，结果表明，PAK3可以作为神经内分泌肿瘤的生物学标记物。

Description

一种PAK3作为神经内分泌肿瘤的生物学标记物的新用途

技术领域

本发明涉及一种PAK3作为神经内分泌肿瘤的生物学标记物的新用途。

背景技术

人体存在两种形式分布的内分泌细胞，一种是内分泌细胞群集形成内分泌器官，如垂体等，另一种是内分泌细胞单个散在于其它组织细胞之间，形成弥散的内分泌系统(diffuse endocrine system)。通过免疫细胞化学方法及超微结构观察，人们对内分泌细胞的分布形态与功能等不断有新的发现。1968年，Pearse观察到体内一些分泌肽类物质的细胞具有共同的细胞化学特性，即具有摄取胺前体、脱去其羧基变为活性胺的能力(amine precursior uptake and decarboxylation)而命名为APUD细胞，把这些细胞归属为APUD系统。随着APUD细胞研究的不断深入，发现许多APUD细胞不仅产生胺，而且还产生肽，有的细胞则只产生肽；并且随着APUD细胞类型和分布的不断扩展，发现神经系统内的许多神经元也合成和分泌与APUD细胞相同的胺和(或)肽类物质。现在，这个概念已扩展为体内分泌肽类和/或胺类活性物质的内分泌细胞的总称，所分泌的活性物质作为激素、神经递质而发挥作用；已知APUD系统的细胞有40多种，已确定的肽类产物有30多种。近年的研究表明，APUD细胞与下丘脑的一些神经内分泌细胞很相似，因此，提出弥散内分泌细胞、APUD细胞、神经内分泌细胞实际上是同一类细胞，弥散分布、具有带膜的胞浆分泌颗粒以及分泌胺类和/或肽类激素是它们的共同特点。有人提出，一切摄取胺前体脱羧细胞都是神经外胚叶起源，但也有人对此持不同意见。事实上，若干肽类激素如生长激素抑制素既可在胃肠和胰腺内生成，也可在中枢神经系统内生成；而神经元的标志酶，即神经元特异性烯醇化酶(NSE)，也可在肽激素生成性APUD细胞浆内检出，这些共性使人们将APUD系统归入神经内分泌系统的概念内。

APUD细胞或神经内分泌细胞发生的肿瘤称为APUD肿瘤(apudoma)或神经内分泌肿瘤，此类肿瘤涵盖胃肠胰腺内分泌肿瘤，胸腺、支气管类癌及一部分肺小细胞未分化癌，甲状腺髓样癌、嗜铬细胞瘤以及垂体腺瘤几大类，最近还不断提出一些新的肿瘤，如食管、宫颈、前列腺等部位的“小细胞”嗜银癌、子宫内膜“小细胞未分化型APUD瘤”、喉部“神经内分泌癌”、皮肤“神经内分泌癌”(Meckel细胞癌)等。这一类肿瘤在功能和形态上，有以下共同特点：①具有内分泌功能，患者血中可出现肿瘤分泌产物，如胃泌素、嗜铬粒蛋白(chromogranin)等，临床上也可表现相关症状；②肿瘤组织可提取相应的激素类物质，免疫细胞化学染色呈特异性阳性反应；③肿瘤细胞在电镜下可见其有被膜的神经分泌颗粒。以上这些特点可作为诊断神经内分泌肿瘤(APUD肿瘤)的依据。

神经内分泌肿瘤种类繁多，临床表型各异，起病隐匿，早期症状不典型，常规影像学手段检出率低，定位较困难。目前对于此类疾病主要的诊断方法有：实验室相关的激素测定，影像学B超，CT，MRI，以及病理学检查，方法不够特异，早期诊断不灵敏，往往延误治疗时机。

P21蛋白激活激酶(p21-activated kinases，PAKs)家族是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，已发现有六个家族成员，据结构功能可分为两个亚组，其中PAK1、2、3属于I组，PAK4、5、6属于II组。目前对I组PAKs的研究比较多，它们在结构上都包含调节区，自身抑制区(AID)，以及小G蛋白(small GTPase)结合区(PBD)(后两者位置重叠)，PBD可与Rho-GTPases(Cdc42和Rac1)结合，解除自身抑制，从而发挥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，参与细胞骨架动力学、细胞迁移、增殖、生长、凋亡以及神经发育的调节。另外，PAKs家族的成员PAK1是目前该家族中功能研究最多的一个分子，研究报道，该分子与肿瘤的发生、转移及肿瘤恶性进展密切相关，尤其在乳腺癌和多发性神经纤维瘤2型(NF2)研究比较集中，PAK1参与乳腺癌的恶性进展，并且参与部分乳腺癌病人的他莫昔芬(Tamoxifen)抵抗；在NF2的研究中，PAKs参与细胞的生长，具有潜在的治疗价值。

PAK3属于PAKs I组，1995年Edward Manser首次克隆PAK3基因，Northern Blot分析PAK3的组织表达谱，发现PAK3只在脑组织存在表达，而在胸腺、脾、肺、睾丸、肾脏、肝脏以及心脏均无表达。Ve′ronique Rousseau在2003年重复PAK3的表达谱，聚合酶链式反应(PCR)结果显示PAK3在大脑半球、小脑、中脑以及脊索和睾丸均有表达，肾脏、心脏、脾脏和骨骼肌表达阴性。该基因编码一个65KD的蛋白，该分子与Rac1或Cdc42结合后，自身抑制解除而被激活，可以磷酸化下游分子的丝氨酸/苏氨酸位点，激活下游分子，参与神经细胞树突发育及突触可塑性过程中的细胞骨架调节。据报道，PAK3在胚胎发育过程中促进端脑中间神经节隆突产生的未成熟神经元向皮层迁移；PAK3可磷酸化神经调节转录因子cAMP反应元件结合蛋白(CREB)，调控其活性，改变突触可塑性；PAK3基因敲除鼠的神经系统形态学表型变化不大，但出现记忆障碍等类似于神经发育迟滞的功能性症状；PAK3基因突变导致神经元轴突发育障碍，引起X连锁的智力发育迟缓综合症，目前已经报道的突变位点有R67C、A365E、R419X、W446S，提示PAK3与神经系统分化发育关系密切。另外，研究证实，失活型PAK3可抑制raf-1激活，而激活型PAK3则可使raf-1338位丝氨酸磷酸化激活。由于raf-1可激活MEKK、MEK、ERK1/2MAPK，最终促进细胞生长、增殖等生物学过程，提示PAK3有可能参与肿瘤的发生发展。然而，目前尚未见PAK3与肿瘤发生及转移相关的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种PAK3作为神经内分泌肿瘤的生物学标记物的新用途。

本发明通过对胸腺类癌、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺腺瘤、垂体瘤、肾上腺腺瘤、胰岛细胞瘤细胞株、小细胞肺癌细胞株等神经内分泌肿瘤组织及细胞进行PAK3的蛋白表达水平检测，均高度表达，涵盖了临床常见的神经内分泌肿瘤，涉及身体各个组织及腺体，这是首次发现PAK3与肿瘤相关，特别是与神经内分泌肿瘤相关；本发明揭示了PAK3可以明显增加细胞的迁移能力，显示PAK3在神经内分泌肿瘤的发展过程中发挥了重要作用，结果表明，PAK3可以作为神经内分泌肿瘤的生物学标记物。

本发明对异位ACTH综合征患者的胸腺类癌组织和正常胸腺组织，进行cDNA微阵列(microarray)分析其差异表达基因，在检测的基因中发现p21激活激酶3(p21 activatedkinase 3，PAK3)基因在胸腺类癌组织中明显表达上调，并得到RT-PCR及蛋白质免疫印记技术的证实。以此为基础，扩大肿瘤样本及种类(包括嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胶质瘤、甲状旁腺瘤、胰岛细胞瘤、乳腺癌、胃癌组织等)后，发现PAK3只在嗜铬细胞瘤、肾上腺腺瘤、甲状旁腺瘤、胰岛细胞瘤等神经内分泌肿瘤组织中高度表达，而正常胸腺、胰岛、胃癌、乳腺癌均无表达。此外，在分泌异位ACTH的胸腺类癌组织以及小细胞肺癌细胞株DMS79中，PAK3的表达与人促黑素细胞皮质素原基因(POMC，)、羧肽酶E(CPE，参与神经递质与激素的合成)以及ASCL1的表达密切相关，具有很强的一致性，而这三个基因都对胸腺类癌的神经内分泌表型起一定作用，这也佐证了PAK3与神经内分泌肿瘤的相关性。

不同生物体的研究证明PAKs在Heregulin介导的细胞骨架的组织以及调节过程中发挥了非常重要的作用，绝大多数哺乳动物细胞形态以及极性的维持均依靠Rho家族及下游PAKs对细胞骨架的调节。细胞骨架平衡状态的破坏以及重建会造成细胞迁移增加、恶性转化、非锚定生长以及细胞侵袭等后果，最终导致肿瘤的发生。另外，研究证实PAK1的T423E突变体具有活化的激酶活性，鉴于PAK家族在结构上的保守性，PAK1的T423对应PAK3的T421。因而，本发明构建了小鼠PAK3野生型和T421E突变激活型表达载体，体外转染NIH3T3细胞，通过划痕试验以及细胞侵袭试验即Transwell实验，发现PAK3可以明显增加细胞的迁移能力，显示PAK3在神经内分泌肿瘤的发展过程中发挥了重要作用；同时发现c—Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-Terminal Kinase，JNK)和c-Jun在转染后的细胞中磷酸化水平是增高的，转染T421E PAK3的NIH3T3细胞中，磷酸化c-Jun水平更高，而野生型小鼠PAK3可能被细胞内在的激酶系统活化，p-JNK和c-Jun水平也有不同程度的升高，然而在使用了JNK信号通路抑制剂SP600125后，PAK3促进迁移的作用则被阻断，综上，结果表明，PAK3能够促进细胞迁移，并且促进迁移的机制是由于激活了JNK信号通路，同时在胸腺类癌组织及其他所检测的神经内分泌肿瘤中也看到了JNK信号通路的激活，更加验证了PAK3通过激活JNK信号通路促进细胞迁移参与肿瘤转移的作用。

综合PAK3的神经内分泌肿瘤表达谱以及对肿瘤转移的作用，PAK3可以作为神经内分泌肿瘤的生物学标记物。PAK3在神经内分泌肿瘤组织高表达，肿瘤早期阶段即可检测出，利用该特点，通过对瘤组织PAK3的表达检测可以早期诊断该类肿瘤。

临床标本检测PAK3表达水平的方法包括：免疫组织化学，蛋白质免疫印记，实时荧光定量PCR。

一、免疫组织化学：包括组织切片制备和染色，观察比较直观，形态表现较好，耗时约3—4天。

二、蛋白质免疫印记：技术平台成熟、流程规范、耗时短，1—2天可出结果。

1)组织蛋白裂解

a.取病人肿瘤组织标本冻于液氮中长期保存，或新鲜提取裂解；

b.取米粒大小组织置5ml离心管，加500μl组织蛋白裂解液，加5μl蛋白酶抑制剂和10μl磷酸酶抑制剂；

c.在冰上用匀浆器匀浆，置冰上30分钟；置于4℃10,000转离心10分钟；

d.转移上清至1.5ml离心管，获得蛋白裂解液，-80℃储存。

2)蛋白定量

a.稀释BSA标准品，用裂解液10倍稀释待测样品；

b.准备工作液，将试剂A和试剂B按50:1比例混合成工作液；

c.往96孔酶标板内加入标准品和稀释的待测样品25μl，每孔内加入200μl工作液，盖上薄膜，37℃水浴孵育30分钟；

d.待冷却至室温后，揭开薄膜，置酶标仪内用540nm波长检测吸光度；

e.绘制标准曲线，计算样品的浓度；

3)蛋白变性样本的制备

用裂解液调整各蛋白样本至等体积等浓度后，加入5X十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液，混合均匀后至99℃中变性10分钟，立即放入0℃的冰水浴中冷却备用；

4)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

a.乙醇擦洗干净玻璃板；

b.确定分离胶浓度(60-200kDa用5％的分离胶，16-70kDa，用10％，12-45kDa用15％)，配置分离胶，小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，为积层胶留有足够空间，加乙醇覆盖。室温放置30-60分钟，待分离胶凝聚；

c.倒掉覆盖物，蒸馏水冲洗凝胶上部数次，吸干残存液体；

d.配置积层胶，注入分离胶上端，插入梳子，避免气泡。室温放置30-45分钟，待积层胶凝聚；

e.将凝胶放入电泳槽上下槽加入1X电泳缓冲液，小心拔出梳子，用注射器冲孔；

f.取适量蛋白样品和5微升蛋白质分子量标记物上样；

g.100伏电泳2-4小时；

h.转膜：将滤纸剪成5 X 8cm大小，浸入转印缓冲液，剪与分离胶大小相同的PVDF膜，标记，甲醇浸15秒，蒸馏水浸1分钟X5次；

i.在含有转印缓冲液的托盘中，从下往上依次放置塑料支架黑色端、海绵、滤纸、分离胶(去除积层胶)、滤纸、海绵和塑料支架白色端，去除气泡，加紧支架，放入电转槽，注意胶靠负极，膜靠正极；

j.电压30伏，4℃电转过夜，或者100伏内外加冰电转1-2小时；

k.取出膜，加丽春红染色，用大量蒸馏水冲洗膜；

l.封闭液室温封闭1小时；

m.一抗(根据抗体说明书稀释)4℃杂交过夜，或者室温杂交2小时；

n.洗膜缓冲液室温冲洗5分钟X3次；

o.二抗(1：1000封闭液稀释)室温杂交1小时；

p.室温冲洗5分钟X3次；

q.将膜置于暗盒中，暗室显色，曝光，冲片；

三、实时荧光定量PCR：流程简单、规范、耗时短，送标本24小时可出结果。

1)组织RNA提取：

a.取1ml的Trizol放于5ml离心管中，取50—100mg组织(大米粒大小即可)，用剪刀剪碎，匀浆机进行匀浆。

b.室温静置5分钟，4℃12000转离心10分钟；

c.转移上清，加入200ul氯仿，充分混匀；室温静置2—3分钟，4℃12000转离心15分钟；

d.转移上清，加入等体积异丙醇，轻轻混匀，室温静置10分钟，4℃12000转离心10分钟；

e.弃上清，加入1ml75％乙醇，4℃7500转离心5分钟；

f.倒置晾干10-15分钟，可用小枪头吸出残余乙醇；

g.加入20—50ul的DECP水溶解RNA；

h.紫外分光光度计检测吸光度值及260nm/280nm的吸光度比值及电泳鉴定；

i.立即进行逆转录或保存于-80℃；

2)逆转录反应

3)对胸腺类癌等神经内分泌肿瘤组织PAK3基因进行定量PCR扩增，根据NCBI提供的基因序列，采用引物设计软件Primer5.0设计人的PAK3及骨架蛋白actin引物，采用标准反应体系，利用Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System。

本发明的一种PAK3作为神经内分泌肿瘤的生物学标记物的新用途，还揭示PAK3可作为神经内分泌肿瘤预后判断的指标和神经内分泌肿瘤药物研发的靶点。文献报道，PAK1可增强细胞的运动性，参与肿瘤转移，鉴于此，我们也研究了PAK3对细胞迁移行为的影响，通过划痕试验、transwell等一系列试验证实，稳定表达PAK3的细胞株细胞的迁移能力增强，结合PAK3在肿瘤组织高表达的结果，提示PAK3可参与肿瘤转移及恶性转化。故可将PAK3作为神经内分泌肿瘤预后判断的指标，通过免疫组化染色及蛋白质免疫印记的表达高低判断神经内分泌肿瘤预后的好坏。PAK3可作为神经内分泌肿瘤药物研发的靶点，PAK3参与促肾上腺皮质激素释放因子CRF诱导的垂体瘤细胞增殖，将PAK3抑制后，CRF的促增殖作用便消失，而本发明发现PAK3在包括嗜铬细胞瘤、分泌ACTH的胸腺类癌、甲状旁腺肿瘤、垂体瘤在内的神经内分泌肿瘤表达异常增高，由此，提示我们PAK3可作为神经内分泌肿瘤治疗的药物靶点，研发抑制PAK3表达的药物可以控制此类肿瘤的失控性生长，为此类疾病提供一个靶向治疗的手段。综合PAK3的神经内分泌肿瘤表达谱以及对肿瘤转移的作用，PAK3可以作为神经内分泌肿瘤的生物学标记物。

本发明的有益效果是：

本发明的一种PAK3作为神经内分泌肿瘤的生物学标记物的新用途，首次将PAK3与神经内分泌肿瘤的发展过程联系在一起，开拓了神经内分泌肿瘤分子机制研究的领域；神经内分泌肿瘤涉及多种内分泌腺体，诊治困难，缺乏特异的生物学标志物，本发明为神经内分泌肿瘤的诊断增加了一个方便，快速，特异性高的检测方法，有利于疾病的早期诊断和明确诊断，减少误诊率，有助早期治疗，改善病人的生活质量，降低致死率、致残率；为神经内分泌肿瘤恶性程度的判断以及预后评估增加了一个新的指标；靶点药物的研发为此类疾病的治疗提供了新的契机。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明的一种PAK3作为神经内分泌肿瘤的生物学标记物的新用途，通过对胸腺类癌、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺腺瘤、垂体瘤、肾上腺腺瘤、胰岛细胞瘤细胞株、小细胞肺癌细胞株等神经内分泌肿瘤组织及细胞进行PAK3的蛋白表达水平检测，均高度表达，涵盖了临床常见的神经内分泌肿瘤，这是首次发现PAK3与肿瘤相关，特别是与神经内分泌肿瘤相关；本发明揭示了PAK3可以明显增加细胞的迁移能力，显示PAK3在神经内分泌肿瘤的发展过程中发挥了重要作用，结果表明，PAK3可以作为神经内分泌肿瘤的生物学标记物。

本发明对5例异位ACTH综合征患者的胸腺类癌组织和6例正常胸腺组织，进行cDNA微阵列(micro-array)分析其差异表达基因，在12672个检测的基因中发现p21激活激酶3(p21activated kinase 3，PAK3)基因在胸腺类癌组织中明显表达上调，并得到RT-PCR及Western Blot的证实。以此为基础，扩大肿瘤样本及种类(包括嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胶质瘤、甲状旁腺瘤、胰岛细胞瘤、乳腺癌、胃癌组织等)后，发现PAK3只在嗜铬细胞瘤、肾上腺腺瘤、甲状旁腺瘤、胰岛细胞瘤等神经内分泌肿瘤组织中高度表达，而正常胸腺、胰岛、胃癌、乳腺癌均无表达。此外，在分泌异位ACTH的胸腺类癌组织以及小细胞肺癌细胞株DMS79中，PAK3的表达与人促黑素细胞皮质素原基因(POMC)、羧肽酶E(CPE，参与神经递质与激素的合成)以及ASCL1的表达密切相关，且具有很强的一致性，而这三个基因都对胸腺类癌的神经内分泌表型起一定作用，这也佐证了PAK3与神经内分泌肿瘤的相关性。

具体的讲，本发明采用蛋白质免疫印记方法验证了基因芯片的结果，PAK3在异位ACTH分泌的胸腺类癌组织明显高表达；在神经内分泌细胞来源的小细胞肺癌细胞株的表达显著增高；此外我们进一步对24例嗜铬细胞瘤组织进行PAK3表达分析，发现21例有PAK3的显著高表达；甲状旁腺腺瘤、垂体瘤、胰岛细胞瘤与胃癌、乳腺癌、正常胰岛PAK3比较，前三个表达水平显著升高，而后三个检未测到表达。由此，PAK3仅在神经内分泌肿瘤高表达，在非神经内分泌肿瘤不表达。

进一步，对PAK3分子进行了细胞水平的功能研究，发现该分子可以促进细胞迁移，划痕试验及细胞侵袭试验(Transwell试验)均证明了这一点；采用JNK通路抑制剂SP600125后，PAK3的这种促进细胞迁移的作用便减弱，该结果表明PAK3对细胞迁移的促进作用是通过激活了JNK信号通路而发挥的，同时在神经内分泌肿瘤组织中同样检测到JNK信号通路的激活，表现为磷酸化JNK和c—Jun表达水平的增加，与PAK3的高表达相一致。上述结果均表明PAK3促进细胞迁移，参与神经内分泌肿瘤的发展过程。

Claims (1)

1.一种PAK3作为神经内分泌肿瘤的生物学标记物的新用途。