ES2284408B1 - Uso de sondas para el diagnostico del linfoma esplenico de la zona marginal. - Google Patents
Uso de sondas para el diagnostico del linfoma esplenico de la zona marginal. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de sondas para el diagnóstico del linfoma
esplénico de la zona marginal. La invención se refiere al uso de la
secuencia correspondiente al fragmento del cromosoma 7 humano
contenido en el BAC denominado RP11-44M6,
perteneciente a la región 7q22.1-7q22.2, para el
diagnóstico del LEZM mediante la detección de la existencia de
deleciones en dicha zona, así como al uso opcional de sondas
pertenecientes a la región 7q32-7q33 en el mismo
ensayo para aumentar el porcentaje de pacientes de LEZM que pueden
diagnosticarse en la misma prueba, prefiriéndose que la sonda
opcional se elija entre las correspondientes a los insertos de los
BACs RP11-36B6, RP11-329I5 y
RP11-193I17. La invención se refiere igualmente a
métodos de diagnóstico de LEZM en seres humanos en los que se
utiliza como sonda el inserto de RP11-44M6, sola o
en combinación con otra u otras, así como a los kits que incluyen
dicha sonda.
Description
Uso de sondas para el diagnóstico del linfoma
esplénico de la zona marginal.
La invención se refiere al uso de sondas para el
diagnóstico de la enfermedad neoplásica conocida como linfoma
esplénico de la zona marginal (LEZM) en seres humanos.
Concretamente, la invención se refiere al uso de la secuencia
correspondiente al fragmento del cromosoma 7 humano contenido en el
BAC denominado RP11-44M6, perteneciente a la región
7q22.1-7q22.2, para el diagnóstico del LEZM mediante
la detección de la existencia de deleciones en dicha zona, así como
al uso opcional de sondas pertenecientes a la región
7q32-7q33 en el mismo ensayo para complementar el
estudio y aumentar el porcentaje de pacientes de LEZM que pueden ser
diagnosticados en la misma prueba. La invención se refiere
igualmente a métodos de diagnóstico de LEZM en los que se utiliza
dicha sonda, sola o en combinación con otra, así como a los kits
que incluyen dicha sonda.
El Linfoma Esplénico de la Zona Marginal (LEZM),
es una enfermedad tumoral que puede afectar a cualquier órgano
(aunque los más comunes son el bazo y los ganglios linfáticos), que
ha sido considerado como una entidad
clínico-patológica distinta desde 1991 (Hollema H,
Visser 1, Poppema S: "Small lymphocytic lymphomas with
predominant splenomegaly: a comparision of inmunophenotypes with
cases of predominant lymphadenopathy", Modern Pathol
1991, 4: 712-717; Schmid C, Kirkham N, Diss T,
Isaacson PG: "Splenic marginal zone cell lymphoma", Am J
Surg Pathol 1992, 16: 455-466). En la
clasificación Europea-Americana de neoplasias
linfoides, el LEZM era categorizado como una entidad separada, pero
de manera provisional (Harris NL, Jaffe ES, Stain H y col: "A
revised European-American classification of lymphoid
neoplasms: a proposal from the International Lymphoma Study
Group", Blood 1994, 84: 1361-92). Más
recientemente, la clasificación de enfermedades hematológicas de la
Organización Mundial de la Salud (OMS) (Jaffe ES, Harris NL, Stein
H, Vardiman JW: "World Health Organization classification of
tumours: pathology and genetics of tumours of haematopoietic and
lymphoid tisúes", Lyon: IARC Press 2001), ha designado a los LEZM
como un subtipo distinto de linfomas no-Hodgkin
(Harris NL, Jaffe ES, Diebold J, Flandrin G,
Muller-Hermelink HK, Varriman J, Lister TA,
Bloomfield CD: "The World Health Organization classification of
neoplastic diseases of the haematopoietic and lymphoid tissues:
report of the clinical advisory committee meeting", airlie
house, Virginia, November, 1957, Histopathology 2000, 36:
69-86) (LNH), en base a su morfología,
inmunofenotipo y características clínicas (Mollejo M, Meránguez J,
Lloret E, Sánchez A, Campo E, Algara P, Cristóbal E, Piris MA:
"Splenic Marginal Zone Lymphoma: A distintive type of
low-grade B-cell lymphoma. A
clinicopathological study of 13 cases", Am J Surg Pathol,
1995, 19: 1146-1157) junto con los linfomas
asociados a mucosas (MALT) y los linfomas de la zona marginal nodal
(LZMN). Estos tres subtipos de linfomas están incluidos en los
linfomas de la zona marginal porque tienen su origen común en el
compartimento marginal de las células B de los nódulos linfáticos y
del bazo (Maes B, De Wolf-Peeters C.: "Marginal
zone cell lynphoma: an update on recent advances",
Histopathology 2002, 40: 117-126; Catherine
Thieblemont, Pascale Felman, Evelyne Callet-Bauchu,
Alexandra Traverse-Glehen, Gilles Salles, Françoise
Berger, Bertrand Coiffier: "Splenic marginal-zone
lymphoma: a distintc clinical and pathology entity",
Oncology, 2003, Vol. 4).
El diagnóstico de la existencia de un linfoma no
es difícil para los expertos. Sin embargo, es importante clasificar
cada linfoma dentro del subtipo al que pertenece para poder dar al
paciente el tratamiento adecuado, ya que cada tipo de linfoma tiene
un tratamiento distinto. Así, por ejemplo, en el caso del LEZM no
se debe aplicar quimioterapia, siendo el tratamiento más adecuado
la extirpación del órgano afectado, generalmente el bazo, por lo
que es muy importante diagnosticarlo correctamente. En el momento
actual el diagnóstico de los LNH y la diferenciación entre cada uno
de ellos se basa en las características morfológicas,
inmunohistoquímicas y moleculares, siendo las alteraciones
genéticas en general, y las traslocaciones específicas en
particular, una de las características que más está ayudando para
distinguir unos linfomas de otros. La mayoría de los LNH se
caracterizan por la presencia de traslocaciones específicas, que
sirven para su diagnóstico. Sin embargo, los LEZM carecen de un
marcador molecular conocido pues, a diferencia de otros diversos
linfomas, no se ha identificado en ellos una traslocación que les
sea característica, lo que dificulta su diagnóstico. Si bien los
análisis citogenéticos muestran que en este tipo de tumores pueden
detectarse pérdidas en las que están involucrados los cromosomas 1,
3, 7 y 8 (Dierlamm J, Pittaluga S, Wlodarska I, Stull M, Thomas J,
Boogaerts M, Michaux L, Driessen A, Mecucci C, Cassiman JJ:
"Marginal zone B-cell lymphomas of different sites
share similar cytogenetic and morphologic features",
Blood 1996, 87: 299-307; Sole F, Woessner S,
Florensa L, Espinet B, Mollejo M, Martín P, Piris MA: "Frecuent
involvement of chromosomes 1, 3, 7 y 8 in splenic marginal
B-cell lymphoma", Br J Haematol 1997; 98:
446-449), no se había encontrado hasta ahora una
alteración que fuera característica de los LEZM y permitiera la
identificación de una alta proporción de los pacientes que la
padecen. Los cambios cromosómicos en 3q, por ejemplo, se han
detectado en varios tipos de LNH, siendo del 52% la incidencia
global de ganancias en el cromosoma 3 observada en los linfomas de
la zona marginal. Algunos estudios de citogenética convencional
pusieron de manifiesto que una de las alteraciones más frecuentes en
los LEZM eran las pérdidas en el brazo largo del cromosoma 7
(del(7q)), lo que podía sugerir que la del(7q) está
asociada con los LEZM (Brynes RK, Almaguer PD, Leathery KE,
McCourty A, Aubert DA, Medeiros LJ, Nathwani BN: "Numerical
cytogenetic abnormalaties of chromosomes 3, 7, and 12 in marginal
B-cell lymphoma", Mod Pathol 1996, 9:
995-1000; Wotherspoon AC, Finn TM, Isaacson PG:
"Trisomy 3 in low-grade B-cell
lymphomas of mucosa-associated lymphoid tissues",
Blood 1995, 85: 2000-2004; Dierlamm J,
Michaux L, Wlodarska 1, Pittaluga S, Zeller W, Stull M, Criel A,
Thomas J, Boogaerts M, Delaere P, Cassiman JJ, De
Wolf-Peeters C, Mecucci C, Van den Berghe H:
"Trisomy 3 in marginal zone B-cell lymphoma: a
study based on cytogenetic analysis and fluorescence in situ
hybridization", Br J Haematol 1996, 93:
242-249; Hernández JM, Mecucci C, Criel A, Meeus P,
Michaux I, Van Hoof A, Verhoef G, Louwagie A, Scheiff JM, Michaux
JL: "Cytogenetic analysis of B-cell chronic
lymphoid leukemias classified according to morfologic and
inmunophenotypic (FAB) criteria", Leukemia 1995, 9:
2140-2146). Hasta ahora, sin embargo, se estimaba
que las deleciones en el brazo largo del cromosoma 7 no se
presentaban en más de un 25% de los pacientes aquejados de LEZM
(Franco V, Florensa AM, Llanito: "Splenic marginal zone
lymphoma", Blood 2003; 101:2464-2472), por
lo que no se consideraba que el desarrollo de métodos diagnósticos
basados en su detección pudiera tener interés, al permitir
identificar sólo una proporción poco significativa del total de
pacientes aquejados de LEZM.
Recientemente, estudios de pérdida de
heterocigosidad demostraron que la presencia de pérdida alélica en
LEZM (40%) es mayor que la observada en otros síndromes
linfoproliferativos de células-B. El microsatélite
más frecuentemente delecionado fue D7S487 (Mateo M, Mollejo M,
Villuendas R, Algara P, Sánchez-Beato M, Martínez
P, Piris MA: "7q32-7q33 allelic loss is a frecuent
finding in splenic marginal zone lymphoma", Am J Pathol
1999, 154: 1583-1589). Los estudios de Hibridación
Genómica Comparada (CGH) realizados por el grupo de los inventores
confirmaron que hay distintas regiones implicadas en estos linfomas,
tales como 5q, 7q 9q, 12q y 20q (Hernández J.M., García J.L.,
Gutiérrez N.C., Mollejo M., Martínez-Climent J.A.,
Flores T., González M.B., Piris M.A., & San Miguel J.F.:
"Novel Genetics Imbalances in B-Cell Splenic
Marginal Lymphomas Revealed by Comparative Genomic Hybridization
and Cytogenetics", American Journal of Pathology, Vol.
185, No 5, May 2005) encontrando, además, que existe una
correlación entre las pérdidas de material genómico y el
acortamiento del período de supervivencia. Como suele suceder con
las pérdidas de material genómico implicadas en procesos tumorales,
las deleciones mencionadas se presentan sólo en uno de los
cromosomas, lo que parece estar relacionado con el hecho de que la
pérdida del mismo fragmento en ambas copias del cromosoma hace
inviables a las células.
La región 7q31-q36 en particular
corresponde a una zona que parece estar:, estrechamente relacionada
con LEZM y en la que se encuentra a menudo deleciones en los
pacientes aquejados de esta enfermedad. Se trata, sin embargo, de
una zona muy amplia del genoma, en la que no se han encontraron
genes candidatos (Algara P, Mateo MS, Sánchez-Beato
M, et al.: "Deletion of the IgV(H) somatic mutations
in splenic marginal zone lymphoma defines a group of unmutated
cases with frecuent 7q deletion and adverse clinical course",
Blood 2002, 99: 1299-1304; Ocio EM, Hernández
JM, Mateo G, Sánchez ML, González MB, Vidriales B, Gutiérrez NC,
Orfao A, San Miguel JF: "Inmunophenotypic and Cytogenetic
Comparison of Waldeström's Macrogolunemia with Splenic Marginal
Zone Lymphoma", Clinical Lymphoma 2005, 4:
241-245). Además, la técnica utilizada más
habitualmente para realizar los estudios de los cambios producidos
en los cromosomas asociados con LEZM ha sido la hibridación genómica
comparada (CGH, de sus siglas en inglés Comparative Genomic
Hybridization) (Kallioniemi Anne, Olli-P.
Kallioniemi, Damir Sudar et al., "Comparative Genomic
Hybridization for Molecular Cytogenetic Analysis of Solid
Tumors", Science 258: 818-821 (1992)),
metodología que permite la determinación de ganancias y pérdidas en
el número de copias entre dos muestras de ADN, mediante una
hibridación competitiva de ADN normal y del ADN tumoral en estudio
(cada uno de ellos marcados con un fluorocromo diferente) sobre
metafases de individuos normales, evaluando después si existen
zonas en las que se produzca un aumento de la señal correspondiente
al flurocromo con el que se haya marcado el ADN tumoral (lo que se
considera indicativo de ganancias) o disminuciones de dicha señal,
aumentando la señal correspondiente al otro fluorocromo (lo que se
considera indicativo de pérdidas). A pesar de haber sido de gran
utilidad en el conocimiento de las alteraciones genómicas en los
procesos tumorales y en especial en los linfomas, (para cuyo
conocimiento, clasificación y pronóstico ha sido de gran valor), se
trata de una técnica que tiene una capacidad de resolución
limitada: por un parte, los cambios que impliquen deleciones de
segmentos inferiores a 7 megabases no son detectables (Bentz M,
Plesch A, Stilgenbauer S, Dohner H, Lichter P: "Minimal sizes of
deletions detected by comparative genomic hybridization",
Genes Chromosomes Cancer 1998; 21:172-175);
por otra parte, la determinación de los puntos exactos del
cromosoma entre los cuales se inserta la amplificación o que
suponen los límites de la deleción es difícil, por lo que la
amplitud del fragmento del cromosoma 7 cuya deleción se produce en
la zona de 7q31-q33 ha sido difícil de precisar, ya
que la región mínima delecionada es demasiado extensa como para
poder ser analizada con una sonda de hibridación "in
situ", lo que provocó que, inicialmente, se considerara que
su extensión era superior a la que realmente tiene y que sus
límites podrían encontrarse en regiones más próximas al centrómero
(Hernández J.M., García J.L., Gutiérrez N.C., Mollejo M.,
Martínez-Climent J.A., Flores T., González M.B.,
Piris M.A., & San Miguel J.F.: "Novel Genetics Imbalances in
B-Cell Splenic Marginal Lymphomas Revealed by
Comparative Genomic Hybridization and Cytogenetics", American
Journal of Pathology, Vol. 185, No 5, May 2005).
Posteriormente, los estudios de FISH (hibridación in situ
fluorescente, del inglés fluorescent in situ
hybridization) combinados con los de pérdida de heterocigosidad
(LOH) han situado esta alteración en la banda 7q31 (Sole F, Woessner
S, Florensa L, Espinet B, Mollejo M, Martín P, Piris MA:
"Frecuent involvement of chromosomes 1, 3, 7 y 8 in splenic
marginal B-cell lymphoma", Br J Haematol
1997; 98: 446-449; Algara P, Mateo MS,
Sánchez-Beato M, et al.: "Deletion of the
IgV(H) somatic mutations in splenic marginal zone lymphoma
defines a group of unmutated cases with frecuent 7q deletion and
adverse clinical course", Blood 2002, 99:
1299-1304; Sole F, Salido M, Espinet B, García JL,
Martinez-Climent JA, Granada I, Hernández JM, Benet
I, Piris MA, Mollejo M, Martínez P, Vallespi T, Domingo A, Serrano
S, Woessner S, Florensa L: "Splenic Marginal Zone
B-Cell Lymphomas: two cytogenetics subtypes, one
with gain of 3q and the other with loss of 7q",
Haematologica 2001, 86: 71-77; Oscier DG,
Gardiner A, Mould S: "Structural anormalities of chromosome 7q in
chronic lymphoproliferative disorders", Cancer Genet
Cytogenet 1996, 92: 24-27; Hernández JM,
Schoemmarkers EF, Dal Clin P, Michaux L, Van de Ven WJ, Van de
Berghe H: "Molecular delineation of the commonly deleted segment
in mature B-cell lymphoid neoplasias with deletion
of 7q", Genes Chromosomes Cancer 1997; 18:
147-150), aunque esta región no es la única
implicada dentro de este cromosoma, ya que también se han descrito
casos excepcionales de LEZM con reordenamiento del gen CDK6 situado
en la banda 7q21 (Corcoran MM, Mould SJ, Orchard JA, Ibbotson RE,
Chapman RM, Boright AP, Platt C, Tsui LC, Scherer SW, Oscier DG:
"Disregulation of cyclin dependent kinase 6 expression in splenic
marginal zone lymphoma through , chromosome 7q traslocations",
Oncogene 1999, 18: 6271-6277). Sin embargo,
la prevalencia de reordenamientos CDK6 en los LEZM es anecdótica
dado que sólo se han descrito en casos aislados de enfermos con
este linfoma.
Las pérdidas del brazo largo del cromosoma 7
son, por lo tanto, una de las alteraciones que se han detectado
hasta ahora en los estudios realizados sobre LEZM. Sin embargo,
todos los estudios relativos a esta región se han centrado en un
número escaso de enfermos, lo que ha impedido determinar si la
frecuencia de aparición de cada una esas alteraciones era o no
significativa para ser de utilidad en el diagnóstico de LEZM y ha
hecho difícil acotar la región perdida en cada caso de manera
suficiente como para tener seguridad de detectarla utilizando
sondas de tamaño adecuado como para ser utilizadas en las técnicas
habituales que se manejan para el diagnóstico clínico. Esta
situación ha motivado que, a diferencia del resto de linfomas para
los que se dispone de marcadores moleculares útiles para su
diagnóstico, en los LEZM se carezca de sondas que puedan usarse con
fines diagnósticos.
Por lo tanto, aunque se tenía información sobre
distintas alteraciones cromosómicas que aparecían con frecuencia
asociadas a LEZM, no se había encontrado todavía ninguna alteración
asociada con LEZM que fuera característica de este proceso tumoral
y que, además, se encontrara con suficiente frecuencia entre la
población afectada de LEZM como para garantizar el diagnóstico de
una proporción significativa de pacientes mediante su detección.
Además, la utilización de la hibridación genómica comparada como
técnica habitual para la identificación de ganancias y pérdidas de
secuencias de ADN en los tumores con bajo índice proliferativo no
permite precisar la extensión de las regiones ganadas o pérdidas,
lo que ha dificultado el diseño de sondas específicas, diseñadas
para determinar la presencia de alteraciones asociadas con LEZM y
su diferenciación de otros LNH, que pudieran integrarse en sistemas
diseñados para el diagnóstico diferencial de enfermedades
tumorales, como pueden ser los denominados "chips" o
"arrays" de diagnóstico, conjuntos de sondas dispuestas de
forma ordenada sobre un soporte físico que permiten el diagnóstico
diferencial de enfermedades a partir de la señal generada tras
ensayos de hibridación entre dichas sondas y el ADN del individuo
en estudio.
Por ello, el grupo de los inventores decidió
recurrir a una técnica diferente a la CGH, la de los arrays
genómicos, también llamados CGH-arrays o arrays de
CGH, que fueron usados inicialmente para identificar alteraciones
en regiones específicas de cromosomas asociados con enfermedades.
El array de CGH es un método para identificar alteraciones en el
número de copias, pero no está diseñado para detectar
traslocaciones recíprocas (Andersen CL,
Gruszka-Westwood AM, Atkinson S, Matutes E,
Catovsky D, Pedersen RK, Pedersen BB, Pulczynski S, Hokland P,
Jacobsen E, Koch J: "Recurrent genomic imbalances in
B-cell splenic marginal-zone
lymphoma revealed by comparative genomics hybridization",
Cancer Genet Cytogenet 2005; 156: 122-128;
Jonathan J. Davies, Ian M. Wilson & Wan L. Lam: "Array CGH
technologies and their applications to cancer genomes",
Chromosome Research 13: 237-248, 2005). Se
trata de una técnica que combina la tecnología de los microarrays
con la CGH, en la que la hibridación se realiza reemplazando las
metafases de los cromosomas por segmentos de ADN mapeados, cuyo
conjunto representa todos los cromosomas o brazos de cromosomas,
divididos en fragmentos clonados en cromosomas artificiales de
levadura (YAC), cromosomas artificiales de bacteria (BAC),
cromosomas artificiales basados en el genoma del bacteriófago P1
(PAC), cósmidos u otros vectores de clonación, y que se disponen
ordenados en un soporte sólido, generalmente un portaobjetos. De
esta manera, aumenta el nivel de resolución, que deja de ser
cromosómico (distancias medidas en megabases) pasando en el caso de
los BAC a poder ser medido en kilobases. Las ventajas de esta
metodología son la mayor resolución y la posibilidad de realizar un
mapeo directo del clon o clones que se encuentran involucrados en el
cambio genómico.
Los análisis de alta resolución de genomas
tumorales son necesarios para descubrir los genes involucrados en
las enfermedades. El array de CGH tiene la capacidad de redefinir
alteraciones de regiones consenso conocidas. Esto es importante,
porque permite investigar de cerca las áreas pequeñas del genoma.
Los análisis de alta resolución tienen una gran probabilidad de
detectar nuevas alteraciones que pueden ser importantes para la
enfermedad, pero que pueden no ser detectadas por técnicas de baja
resolución. Sin embargo, el mayor obstáculo que limita la
posibilidad del establecimiento de esta técnica para la
investigación en laboratorios, es la incapacidad de manejar las
cantidades enormes de datos que se generan. Por esta misma razón,
los arrays de alta resolución no pueden ser utilizados todavía para
uso clínico. Sin embargo, las regiones descubiertas con estos
arrays sí que pueden usarse, en combinación con técnicas que puedan
utilizarse de forma rutinaria en laboratorios clínicos, para
diagnosticar enfermedades, como pueden ser los arrays pequeños de
diagnóstico, compuesto por un número reducido de sondas que, por lo
general, permite discriminar entre enfermedades relacionadas, lo
que permite que el poder del array de CGH sea combinado con su
fácil uso (Jonathan J. Davies, Ian M. Wilson & Wan L. Lam:
"Array CGH technologies and their applications to cancer
genomes", Chromosome Research 13:
237-248, 2005). Sin embargo, tal como se ha
comentado, en el caso de LEZM no se había definido todavía una
sonda que permitiera identificar la ausencia o presencia de una
alteración no asociada con ninguna otra enfermedad, pero que sí se
detectara en un número significativo de pacientes de LEZM y que
posibilitara el diagnostico de esta enfermedad mediante técnicas
que puedan usarse en laboratorios clínicos de forma rutinaria. La
presente invención proporciona una sonda que cumple dichas
características.
Un aspecto de la invención se refiere al uso
como sonda de la secuencia correspondiente al inserto de ADN humano
del BAC RP11-44M6 (SEQ ID NO:1) para el diagnóstico
del linfoma esplénico de la zona marginal (LEZM). En una realización
de este aspecto de la invención, el fragmento se utiliza como sonda
en combinación con al menos una sonda adicional. En un caso
particular de esta realización de la invención, al menos una sonda
adicional corresponde a un fragmento cuya secuencia está
comprendida en la de la región 7q32-7q33. En este
caso, se prefiere especialmente que al menos una sonda adicional se
seleccione de entre los insertos de los clones
RP11-36B6, RP11-329I5 y
RP11-193I17, es decir, de entre las secuencias
representadas por SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4,
respectivamente.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
método de diagnóstico in vitro de LEZM en un ser humano que
comprende las etapas de:
- a)
- obtener una muestra de tejido o de células separadas, procedentes de un tejido infiltrado con células de linfoma, fijadas sobre un portaobjetos y listas para llevar a cabo una hibridación in situ sobre ellas;
- b)
- realizar una hibridación in situ sobre el portaobjetos, en presencia de ADN humano competidor, utilizando como sonda ADN correspondiente a la secuencia del inserto del BAC RP11-44M6 acoplado a una sustancia que permite su detección y utilizando opcionalmente como una segunda sonda cuya secuencia está comprendida en la región 7q32-7q33 del cromosoma 7 humano también acoplada a una sustancia que permite su detección, sustancia que es distinta de la sustancia a la que está acoplada la primera sonda y que da lugar a una señal diferenciable de la correspondiente a dicha sustancia;
- c)
- identificar el tumor del que se tomó la muestra como linfoma esplénico de la zona marginal si en cada célula se observa una única señal correspondiente a la sustancia acoplada a la primera sonda y/o, en el caso de haberse utilizado también la segunda sonda opcional, una única señal correspondiente a la sustancia acoplada a la segunda sonda, e identificar el tumor como clasificable en otro tipo de cáncer si en cada célula se observan dos señales correspondientes a la sustancia acoplada a la primera sonda que, en el caso de haberse utilizado también la segunda sonda opcional, deberán ir acompañadas por dos señales correspondientes a la segunda sonda.
En una realización preferida del método
diagnóstico de la invención, la segunda sonda opcional se elige
entre el ADN correspondiente al inserto de los clones
RP11-36B6 (SEQ ID NO:2), RP11-329I5
(SEQ ID NO:3) y RP11-193I17 (SEQ ID NO:4).
Independientemente de las sondas específicas elegidas, se prefiere
muy especialmente que tanto la primera como la segunda sonda
opcional estén marcadas con un marcador fluorescente, para que la
hibridación in situ sea del tipo conocido como FISH
(hibridación in situ fluorescente).
En cuanto a la muestra de partida sobre la cual
se realiza la hibridación in situ, son realizaciones
posibles del método diagnóstico de la invención tanto aquellas en
las que el material fijado sobre el portabjetos es una sección de
tejido tomada de un tumor "sólido" (por ejemplo, de bazo o
ganglios linfáticos), previamente incluida en parafina, como
aquellas procedentes en las que el material fijado en el
portaobjetos son células tratadas mediante las técnicas conocidas
como "citogenética convencional", es decir, células separadas,
procedentes de una suspensión celular obtenida tras el cultivo de
una muestra de tejido infiltrado (sólido o líquido) extraído del
paciente, suspensión compuesta por células cuya división,
opcionalmente, ha sido parada en metafase (aunque son válidos
también los núcleos en interfase) y que se fijan al portaobjetos
mediante fijadores habituales en las técnicas citogenéticas tales
como mezclas de metanol:acético o etanol.
Un aspecto más de la invención se refiere a un
kit de diagnóstico que comprende una sonda que corresponde a la
secuencia del inserto de ADN del cromosoma 7 humano presente en el
BAC RP11-44M6 (SEQ ID NO:1) acoplada a una sustancia
que permite su detección y, opcionalmente, en el mismo recipiente o
en un recipiente separado, una segunda sonda, acoplada a una
segunda sustancia que permite su detección y su diferenciación de
la primera sustancia. Cuando está presente, se prefiere que la
segunda sonda corresponda a un fragmento de la región
7q32-7q33 humana. Se prefiere especialmente que la
secuencia de la segunda sonda adicional corresponda a la de un BAC
que contenga un inserto correspondiente a dicha región que se
selecciona entre las secuencia de los insertos de los clones
RP11-36B6 (SEQ ID NO:2), RP11-329I5
(SEQ ID NO:3) y RP11-193I17 (SEQ ID NO:4).
La Figura 1 se reproduce una tabla en la que se
representan los resultados obtenidos con el ADN procedente de
clones de bacterias que contienen BACs con insertos
correspondientes a regiones del cromosoma 7 humano en experimentos
de CGH-arrays en los que dichos insertos estaban
depositados de forma ordenada sobre un portaobjetos y eran
hibridados con el ADN de individuos que padecían LEZM compitiendo
con el ADN de un control sano. En la primera columna de la tabla
aparece un código de identificación para cada uno de los clones
analizados, que están ordenados de acuerdo con la posición del
cromosoma 7 a la que corresponden, es decir, el primer clon sería
el que correspondería a la región más próxima al extremo del brazo
corto del cromosoma, mientras que el último clon correspondería a
la región más próxima al extremo del brazo largo del cromosoma; los
datos del clon al que corresponde dicho código de identificación
(nombre del clon, código de identificación en el array, código de
acceso en EMBL, región del cromosoma 7 a la que se une y los
marcadores o dominios relacionados con dicha región del cromosoma)
pueden encontrarse en la Tabla 1 que aparece en el Ejemplo 1. Cada
fila, por tanto, representa un clon, mientras que cada columna, a
partir de la segunda, corresponde a un paciente diferente. El
sombreado de cada celda representa el resultado obtenido para cada
clon tras la hibridación del array con el ADN del paciente
correspondiente: las celdas sin ningún sombreado representan clones
para los cuales no se detectaron cambios; las celdas sombreadas en
tono oscuro continuo representan clones perdidos; las celdas con
sombreado interrumpido por rayas verticales blancas representan
clones ganados; las celdas con sombreado interrumpido por rayas
inclinadas más oscuras representan clones en los que la hibridación
no fue correcta o en los que los resultados correspondientes a cada
una de las tres muestras del clon depositadas sobre el array
resultaron discordantes. La Fig. 1a corresponde a los resultados
obtenidos con los pacientes 1 a 34 y los clones identificados como
C1 a C97 (CTB-164D18 a RP11-575G 1);
la Fig. 1b corresponde a los resultados obtenidos con los pacientes
35 a 68 y los mismos clones, C1 a C97; la Fig. 1c corresponde a los
resultados obtenidos con los pacientes 1 a 34 y los clones
identificados como C98 a C193 (RP4-784G16 a
CTB-3K23); la Fig. 1d corresponde a los resultados
obtenidos con los pacientes 35 a 68 y los clones C98 a C193
(RP4-784G16 a CTB-3K23). Las celdas
identificativas de los clones preferidos para ser utilizados como
sondas, C120 (RP11-44M6) y C154
(RP11-36B6), C155 (RP11-329I5) y
C156 (RP11-193I17) aparecen con caracteres blancos
sobre fondo oscuro.
La Figura 2 corresponde a un ensayo de
hibridación in situ realizado utilizando el método
diagnóstico de la invención, sobre una muestra tomada del enfermo
21, utilizando como sondas tanto el inserto del clon
RP11-4M6, marcado con el marcador "Spectrum
green" (que da lugar a una señal de color verde), como el inserto
del clon RP11-193I17 marcado con el marcador
"Spectrum Orange" (que da lugar a una señal de color
rojo/anaranjado). En ambas células se observa que sólo existe una
señal de color verde por célula (puntos señalados con flechas
horizontales, de color blanco), observándose dos señales de color
rojo en cada una de las células (puntos señalados con flechas
verticales, con relleno negro), lo que indica que existe una pérdida
de material genómico en la región 7q22, no detectándose pérdida de
material genómico en la región de 7q32-7q33.
Tal como se ha comentado, en la presente
invención se describe la asociación entre los LEZM y las deleciones
en una región del cromosoma 7, la región
7q22.1-7q22.2, región que, como tal, no había sido
asociada hasta ahora con esta enfermedad ni con ningún otro tipo de
cáncer y cuyo tamaño, aproximadamente 1.600 kb, claramente inferior
al tamaño mínimo detectable en ensayos de hibridación genómica
comparada (7 Mb), había impedido que los estudios basados en dicha
técnica de la CGH pudieran establecer asociaciones entre los LEZM y
las pérdidas de fragmentos cromosómicos cuyos límites estén
comprendidos en dicha región. En los experimentos que se describen
más adelante en la presente memoria se demuestra que la utilización
como sonda de un fragmento comprendido en dicha región,
correspondiente al inserto del BAC del clon denominado
RP11-44M6 (inserto que representa un fragmento de la
banda 7q22.11 del genoma humano y que tiene la secuencia que se
representa en SEQ ID NO:1), permite la identificación de la
existencia de deleciones en la región indicada en más del 60%
(63,24%) de los pacientes de LEZM incluidos en el ensayo. De esta
manera, la utilización como sonda de dicho fragmento permitiría el
diagnóstico de más de la mitad de los enfermos de LEZM, aportando
así una solución a la cuestión pendiente de proporcionar a los
médicos tanto un marcador molecular con el que diagnosticar un
número significativo de enfermos de LEZM como una sonda con la que
detectar la presencia o ausencia de la deleción propuesta como tal
marcador molecular mediante técnicas utilizables en la práctica
clínica, facilitándoles así la aplicación del correcto diagnóstico
a los pacientes aquejados de linfomas.
Además, el mismo estudio permitió ratificar la
asociación entre LEZM y pérdidas de material genómico en una región
más distal, que anteriormente ya había sido asociada con esta
enfermedad: 7q32-7q33. En el 31% de los enfermos
analizados se apreciaron pérdidas en esta región detectables por al
menos dos sondas contiguas. Cuando se comparan los enfermos en los
que se detectan pérdidas en la región 7q22.1-7q22.2,
se observa que en un 44% del total de enfermos las pérdidas en la
región 7q22.1-7q22.2 se presentan de forma aislada,
sin que existan pérdidas detectables en la región
7q32-7q33; esto es así en casi el 70% de los
pacientes con pérdidas en dicha región. En cuanto a esta segunda
región, 7q32-7q33, en el 9% de los enfermos las
pérdidas en esta región se presentan de forma aislada, sin que se
observen pérdidas en la región 7q22.1-7q22.2. Por
lo tanto, no sólo son dos y no una sola las regiones en las que se
observan deleciones asociadas a LEZM en el brazo largo del cromosoma
7 sino que, además, parece existir una cierta tendencia a que la
existencia de una excluya la presencia de la otra. Sin embargo, un
ensayo en el que se utilizaran como sondas ambos fragmentos
permitiría detectar el 72% de los enfermos con LEZM, enfermos que,
además, se habrían identificado por presentar pérdidas en el
material genético lo que, como se ha comentado antes, parece tener
una relación con un peor pronóstico en cuanto al período de
supervivencia.
Por ello, la presente invención proporciona el
uso como sonda de la secuencia correspondiente al inserto de ADN
humano del BAC RP11-44M6 (SEQ ID NO:1) para el
diagnóstico del linfoma esplénico de la zona marginal (LEZM). Dicha
sonda puede utilizarse sola o, preferiblemente, en combinación con
al menos una sonda adicional. Como sonda adicional, se tiene
preferencia por aquellas cuya secuencia está comprendida en la
región 7q32-7q33, especialmente por aquellas cuya
secuencia se corresponda con las del inserto de un BAC seleccionado
de entre RP11-36B6 (SEQ ID NO:2),
RP11-329I5 (SEQ ID NO:3) y
RP11-193I17 (SEQ ID NO:4).
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "sonda" hace referencia a una secuencia de ADN que se
utiliza para detectar y/o cuantificar secuencias complementarias
presentes en una muestra mediante la realización de un ensayo de
hibridación y la posterior detección de la existencia o no de
moléculas unidas a dicha sonda y, opcionalmente, la determinación
de la cantidad de dichas moléculas unidas a la sonda. Por tanto, el
concepto de "sonda" lleva implícito el marcaje de una de las
secuencias de ADN con una sustancia que permite su detección; sin
embargo, tal como se utiliza en la invención, no es necesariamente
sobre la secuencia considerada como "sonda" sobre la cual debe
efectuarse el marcaje, sino que puede ser la secuencia
complementaria que se desea detectar y o cuantificar la que se una a
la sustancia que permite su detección, procediendo a efectuar dicha
detección y/o cuantificación tras el ensayo de hibridación. Además,
dependiendo de la técnica concreta de la que forme parte el ensayo
de hibridación o del procedimiento de marcaje, en el momento de
realizarse la hibridación entre la sonda y la muestra de ADN que se
desea analizar, la secuencia que se utiliza como sonda puede
constituir una molécula como tal o puede utilizarse en forma de
varias moléculas de ADN diferentes, la secuencia de cada una de las
cuales es un fragmento de la secuencia que se desea utilizar como
sonda. Así, por ejemplo, en el caso de que la sonda se marque
mediante el procedimiento de "traslado de la muesca"
("nick translation"), la sonda marcada que se utiliza en
el ensayo de hibridación no consiste en moléculas de ADN todas
ellas de una misma secuencia, sino en moléculas de unos 300 pb de
longitud, cuya secuencia está comprendida en la secuencia que se
desea utilizar como sonda, en las que ha quedado incorporada la
sustancia que se va a utilizar como marcador para la detección y/o
cuantificación.
Por todo ello, están comprendidos dentro del
alcance de la invención tanto el uso en el que la sonda o sondas
utilizadas para el diagnóstico del LEZM se encuentren depositadas
sobre un soporte sólido formando parte del array como uso en el que
son células de seres humanos las que están depositadas sobre un
soporte sólido y se utilizan en un ensayo de hibridación con una
composición líquida que comprende la sonda o sondas utilizadas para
el diagnóstico de LEZM.
Otro aspecto de la invención lo constituyen los
métodos para el diagnóstico de LEZM basados en el uso como sonda de
la secuencia anteriormente citada, la correspondiente al inserto
del BAC RP11-44M6 (SEQ ID NO:1), sonda que se hace
hibridar sobre muestras de células procedentes de tejidos
infiltrados o sobre muestras de los propios tejidos y que se
utiliza bien sola u, opcionalmente, junto con al menos una segunda
sonda opcional. La segunda sonda opcional, preferiblemente, se elige
entre aquellas cuya secuencia se corresponde con la de fragmentos
comprendidos en la región 7q32-7q33 del cromosoma 7
humano. Se tiene especial preferencia para la elección de la
segunda sonda opcional por aquellas sondas cuya secuencia se
corresponda con las del inserto de un BAC seleccionado de entre
RP11-36B6 (SEQ ID NO:2), RP11-329I5
(SEQ ID NO:3) y RP11-193I17 (SEQ ID NO:4). Para
poder efectuar el método de diagnóstico de la invención, es
necesario que cada una de las sondas utilizadas esté marcada con
una sustancia diferente que permita su detección, de manera que
pueda observarse si, en cada célula, pueden detectarse dos señales
por cada una de las sondas utilizadas o sólo una.
El método diagnóstico de la invención, se basa
en el hecho de que cada célula humana posee dos copias del
cromosoma 7 (al igual que de cualquiera de los restantes cromosomas
no sexuales) por lo que, en ausencia de deleciones en la región
7q22.1 detectables por la sonda correspondiente al inserto del BAC
RP11-44M6, deberían observarse dos señales
correspondientes a la sustancia acoplada a dicha sonda, una por cada
uno de los cromosomas 7 de la célula. Igual argumento puede
utilizarse para la sonda opcional elegida por lo que, si se utiliza
adicionalmente esa segunda sonda, deberán observarse cuatro señales
en cada una de las células provenientes de tumores no
identificables como LEZM por el método de la invención, dos por cada
una de las sondas. Puesto que las deleciones en el cromosoma 7 se
producen sólo en uno de los cromosomas de la pareja, deberá
observarse siempre al menos una señal por cada una de las sondas
utilizadas, sirviendo dicha señal como control positivo del proceso,
no siendo necesario realizar simultáneamente la hibridación con
células tomadas de un individuo sano o, al menos, del que se sepa
que no padece LEZM, aunque el método de la invención es compatible
con la inclusión de dicho control positivo. Así, están comprendidos
también dentro del alcance de la invención tanto los métodos en los
que la hibridación se lleva a cabo con al menos tres sondas, siendo
la tercera sonda opcional una sonda complementaria a una zona del
genoma que no haya sido asociada con LEZM. Una posible realización
del método de la invención en la que se incluyera un control
positivo consistiría en realizar la hibridación incluyendo una
tercera sonda, complementaria a la región del centrómero del
cromosoma 7, como método de control numérico y de control de
calidad.
En cuanto a las sustancias que permiten la
detección de las sondas unidas al ADN de las células, se prefieren
aquellas sustancias que den lugar a la emisión de fluorescencia,
bien porque se trate de sustancias que sean ellas mismas fluoróforos
per se (Cy3, Cy5, rodamina, fluoresceína) o bien porque la
presencia de las sustancias unidas a las sondas se detecta gracias
a la interacción con las mismas de moléculas que son detectables
per se mediante la medida de la fluorescencia que emiten o
porque catalizan la transformación de una sustancia en otra
fácilmente medible. Este último es el caso, por ejemplo, de la
biotina y la digoxigenina, que pueden ser unidas a las sondas antes
de la hibridación y cuya posterior presencia puede cuantificarse,
por ejemplo, gracias a anticuerpos dirigidos contra las mismas que
están unidos a una enzima que cataliza la transformación de un
reactivo incoloro en otra molécula distinta coloreada. Por
simplicidad, se prefiere que las sustancias unidas a las sondas sean
fluoróforos per se en las condiciones adecuadas, cada uno de
los cuales emita en una longitud de onda diferente, claramente
diferenciable. Así, por ejemplo, a una de las sondas podría ser
"marcada" (es decir, unir a ella una sustancia que permita su
detección) con rodamina, que da lugar a la emisión de luz
anaranjada, mientras la otra podría ser marcada con fluoresceína o
su derivado isotiocianato (FITC), que dan lugar a la emisión de luz
verde. Otro par posible para obtener señales de doble color
perfectamente distinguibles es el par Cy5 (rojo)/Cy3 (verde).
También puede utilizarse como marcador alguna de los reactivos para
marcaje fluorescente de la línea Vysis de laboratorios Abbot, como
pueden ser Spectrum Green (verde), Spectrum Orange (anaranjado) o
Spectrum Red (rojo). En aquellos casos en los que se utilice una
tercera sonda, como puede ser, por ejemplo, aquellos en los que la
tercera sonda se incluya como control positivo de la hibridación,
la terna de sustancias fluorescentes utilizadas para marcar cada una
de las sondas podrían ser, por ejemplo, FITC (fluorescencia verde:
excitación a 494/500 nm, emisión a 517/525 nm), TexRed/Cy3.5
(fluorescencia roja: excitación a 590/581 nm, emisión a 612/596 nm)
y DEAC (dietilaminocurmarina, que da lugar a fluorescencia azul
turquesa: excitación a 426 nm, emisión a 480 nm).
En cuanto a la muestra de tejido o de células
separadas sobre la cual se lleva a cabo la hibridación, deben
proceder de un tejido infiltrado por un linfoma que se sospeche que
puede ser un linfoma esplénico de la zona marginal. Tal como se
comentó previamente, los tumores que se clasifican como linfoma
esplénico de la zona marginal (LEZM) pueden afectar a cualquier
órgano, aunque los más comunes son el bazo y los ganglios
linfáticos. Cuando se desea clasificar un tumor que afecte a uno de
estos órganos, la realización del método de la invención implica
que previamente se ha tomado una muestra del tumor del que se desee
saber si puede o no identificarse como un linfoma esplénico de la
zona marginal, muestra que se habrá tomado mediante un método
adecuado, conocido por el experto en la técnica, en las condiciones
más asépticas posibles. En el caso concreto de bazo y ganglios
linfáticos, no es posible tomar biopsias de los mismos; es
necesario proceder a la extirpación total de dichos órganos, bazo
(esplenectomía) o ganglios linfáticos (linfadenectomía), cuando
están afectados por tumores. El método de la invención se lleva a
cabo sobre muestras tomadas de los tumores extirpados, para
identificar el tipo de linfoma de que se trata y poder decidir el
tratamiento adecuado que debe administrársele al paciente. En el
caso de las muestras tomadas de bazo o ganglios linfáticos
afectados por tumores, es posible realizar el ensayo de hibridación
in situ sobre secciones de tejidos previamente incluidas en
parafina. La inclusión en parafina de muestras de tejidos y la
fijación de las mismas a portaobjetos es una metodología
ampliamente conocida entre los expertos en la técnica y su uso en
ensayos de hibridación in situ para el análisis de muestras
de linfomas es también conocido, especialmente para FISH (Remstein
ED, Kurtin PJ, Buno I, Bailey RJ, Proffitt J, Wyatt WA et
al. Diagnostic utility of fluorescence in situ
hybridization in mantle-cell lymphoma. Br J
Haematol 2000; 110: 856-62 ; Li JY,
Gaillard F, Moreau A, Harousseau JL, Laboisse C, Milpied N et
al. Detection of translocation t(11;14)(q13;q32) in
mantle cell lymphoma by fluorescence in situ hybridization.
Am J Pathol 1999; 154: 1449-52). Las
secciones incluidas en parafina, pueden ser hibridadas directamente
siempre que sus cortes sean lo suficientemente finos como para que
no exista una superposición de capas celulares. En esas condiciones
serían muestras de tejidos listas para llevar a cabo una hibridación
in situ sobre ellas.
Puede encontrarse información complementaria
sobre los parámetros que influyen sobre la calidad de los ensayos
FISH llevados a cabo sobre estas muestras y las posibles opciones
para llevar a cabo la desparafinación, la digestión con proteasas y
la desnaturalización en la página web de la Universidad de Yale,
concretamente en el apartado de la guía sobre FISH dedicado a la
realización de FISH sobre tejidos incluidos en parafina
(http://info.med.yale.edu/genetics/ward/
tavi/fi20.html). Aunque en dicha página se indica que el espesor de las secciones más adecuado para hibridaciones de ADN sería de 10 \mum, los inventores consideran preferible la utilización de secciones de 2-3 \mum para llevar a cabo el método de diagnóstico de la invención.
tavi/fi20.html). Aunque en dicha página se indica que el espesor de las secciones más adecuado para hibridaciones de ADN sería de 10 \mum, los inventores consideran preferible la utilización de secciones de 2-3 \mum para llevar a cabo el método de diagnóstico de la invención.
Además de proceder al análisis de los tumores de
bazo o ganglios linfático partiendo de secciones de tejido fijadas
sobre portaobjetos, es posible también analizarlos mediante el
método diagnóstico de la invención sobre portaobjetos en los que
están fijadas células separadas, procedentes de una muestra tomada
del tumor, disgregada y tratada según las técnicas citogenéticas
convencionales, que básicamente consisten en el cultivo de las
células para que se dividan y poder para su mitosis en metafase, la
toma de muestras de la suspensión celular resultante, su depósito
sobre un portaobjetos y la fijación de las células a dicho soporte
mediante fijadores habituales en las técnicas citogenéticas tales
como mezclas de metanol:acético o etanol. Las preparaciones sobre
portaobjetos obtenidas tras la aplicación de esta técnica se
consideran muestras listas para llevar a cabo una hibridación in
situ sobre ellas en lo que se refiere a muestras de células
separadas. Un protocolo pormenorizado de aplicación de este tipo de
técnicas puede encontrarse en el Ejemplo 2 de la presente memoria,
en el que las células, cuya mitosis había sido previamente
interrumpida mediante el uso de colcemida, se fijaron al
portaobjetos utilizando metanol:ácido acético 3:1. También puede
encontrarse información sobre esta técnica y los factores que
determinan que las células fijadas sobre un portaobjetos resulten
adecuadas para hibridaciones in situ de tipo FISH en la
página web de la Universidad de Yale, concretamente en los distintos
apartados que componen la "guía FISH"
(http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/FISHguide.html). Se
prefiere la utilización de portaobjetos con células que han sido
tratadas mediante la técnica citogenética convencional cuando las
muestras extraídas del paciente que se analicen no consistan en
"tumores sólidos", sino que se trate de "muestras
líquidas" o "suspensiones de células", como es el caso de
los aspirados de médula ósea o las muestras de
sangre.
sangre.
No es infrecuente que los tumores ganglionares
infiltren la médula ósea, de donde pueden también pasar a la
sangre. Estas manifestaciones de los linfomas a nivel periférico se
conocen como "linfomas leucemizados". Debido a la existencia de
este tipo de linfomas, además de partir de muestras de tumores
"sólidos" (linfomas), el método diagnóstico de la invención
puede llevarse a cabo partiendo de muestras de aspirados de médula
ósea o de muestras de sangre tomadas al individuo. En el caso de
las muestras de sangre, antes de utilizarla hay que comprobar
previamente que realmente existen células de linfoma circulando. La
manera más sencilla de realizar esta comprobación es tomar una
muestra de sangre del enfermo, teñirla y observar si hay linfocitos
de morfología anómala, generalmente de aspecto "velludo" o
"piloso", lo que es un indicio de la presencia de un linfoma
en el individuo. La confirmación de que estas células proceden de
un linfoma debería ser un estudio fenotípico, en el que se
compruebe que los linfocitos expresan antígenos específicos
tumorales, realizando, por ejemplo, un análisis de citometría de
flujo en el que se compruebe cuántos linfocitos son clonales.
Comprobada la existencia de linfocitos clonales en la muestra de
sangre, la muestra de sangre total puede ser utilizada directamente
para llevar a cabo el método de la invención, sembrándolas y
cultivándolas. Otra posibilidad es centrifugar previamente la
sangre total sometiéndola a un gradiente de densidad, para separar
las células mononucleares antes de sembrarlas y cultivarlas, pero
se prefiere no recurrir a esta segunda opción, porque los cultivos
celulares deben realizarse con muestras recogidas y procesadas de
la manera más aséptica posible y cada etapa de procesamiento de la
muestra supone un riesgo de contaminación.
En cuanto a las muestras de aspirado de médula
ósea, las mismas constituyen una especie de "tejido líquido",
similar a la sangre, por lo que su manejo es similar al de las
muestras de sangre.
Para localizar alteraciones cromosómicas no
detectadas hasta ahora por las técnicas de CGH, se preparó un array
en el que se dispusieron muestras del ADN humano contenido en los
insertos de BACs y PACs correspondientes a distintos clones, de
manera que se quedaran cubiertos los cromosomas 1, 3, 7, 8, 18 y 19
mediante segmentos de aproximadamente 300 kb espaciados 1 Mb. Este
array se utilizó para estudiar las posibles alteraciones que
pudieran presentarse en estos cromosomas en pacientes afectados de
LEZM mediante la técnica de los CGH-arrays.
La ventaja de realizar experimentos de
CGH-arrays utilizando arrays construidos con BACs
es que, posteriormente, es posible utilizar los insertos de esos
mismos BACs como sondas en estudios de confirmación tipo FISH, pues
tiene en tamaño óptimo para ser visualizados mediante dicha técnica
tras su marcaje con un fluoróforo.
Para la fabricación del array se seleccionaron
3500 clones de la librería genómica 1 Mb clone set ,
cedida por el Instituto Wellcome Trust Sanger
(Cambridge, Inglaterra). Dicha librería genómica contiene BACs y
PACs procedentes de otras distintas librerías genómicas,
seleccionados de manera que abarquen la totalidad de los cromosomas
humanos, mediante clones localizados a intervalos de aproximadamente
1 Mb a lo largo del genoma completo. Pueden obtenerse detalles
sobre los clones en la base de datos www.ensembl.org.
Para el presente estudio se analizaron los
cromosomas 1, 3, 7, 8, 18 y 19, construyendo un array con los
clones de la librería genómica correspondientes a los cromosomas
mencionados. En la Tabla 1 se indica información respecto a los
clones correspondientes al cromosoma 7 utilizados en la
construcción del array, incluyendo el nombre del clon, el código de
identificación del mismo en el array, el código de acceso que
permite consultar datos sobre el clon en la base de datos de EMBL
(http://www.ebi.ac.uk/embl/), la banda cromosómica en la que se
localiza el inserto del clon y los marcadores o dominios que
flanquean el inserto (indicados separados por puntos suspensivos,
...) o que están contenidos en el mismo (indicados separados por
líneas oblicuas, //). Se han omitido los clones que dan lugar a
señales no sólo en el cromosoma 7, sino en más de un cromosoma, por
considerar que esa característica los excluye de ser una
herramienta válida para el diagnóstico. Los clones junto a cuyo
nombre se ha añadido el superíndice "P" son de tipo PAC. Los
clones preferidos para usar su inserto como sonda aparecen
recuadrados con trazo más grueso.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los insertos de ADN humano de los clones se
aislaron tras el cultivo bacteriano, con su correspondiente
antibiótico (kanamicina o cloranfenicol), a 37ºC y en agitación
durante toda la noche. El ADN de cada clon se preparó a partir de
cultivos de 2,5 ml de cada clon utilizando el kit R.E.A.L. prep. 96
BioRobot de Qiagen, siguiendo las instrucciones del fabricante,
utilizando el protocolo optimizado para BACs.
Tras la extracción, a cada ADN se le realizaron
tres DOP-PCR (Fiegler H, Carr P, Douglas E.J,
Burford D.C, Hunt S, Smith J, Vetrie D, Gorman P, Tomlinson I.P.M,
& Carter N.P: "DNA Microarrays for Comparative Genomic
Hybridization Based on DOP-PCR Amplification of BAC
and PAC Clones", Genes, Chromosomes & Cancer 36:
361-374 (2003)) para asegurar la eficiente
amplificación del ADN humano inserto en el clon y que no haya
contaminación del ADN de Escherichia coli.
La amplificación del ADN inserto en cada clon se
llevó a cabo siguiendo el siguiente procedimiento:
1. Tratar durante 1 hora con UV H_{2}O miliQ,
tampón TAPS, W-1 y las puntas de pipeta previamente
a la preparación de las mezclas de reacción.
El tampón TAPS se preparó previamente mezclando
0,608 g de TAPS (ácido
N-tris(hidroximetil)metil-3-amino-propanosulfónico)
(Sigma Aldrich), 9,3 ml de H_{2}O miliQ, 0,220 g de
(NH_{4})SO_{4} y 250 \mul de MgCl_{2} 1 M, ajustando
el pH a 9,3 con KOH y completando con H_{2}O miliQ hasta un
volumen de 9,6 ml. Este tampón se esteriliza mediante luz UV, se
divide en alícuotas de 960 \mul/tubo y se almacena a -20ºC. Antes
de utilizarlo, han de añadirse al tubo correspondiente 31,68 \mul
de BSA (albúmina de suero bovino) al 5% (Sigma) y 6,72 \mul de
\beta-mercaptoetanol.
La solución de W-1 (éter de
polioxietileno W-1) (Sigma Aldrich) se preparó
previamente mezclando 1 g de W-1 en 100 ml de
H_{2}O.
2. Preparar la siguiente mezcla de reacción en
placas de 96 pocillos:
| Tampón TAPS | 5,5 \mul | |
| Cebador DOP (20 \muM) (Sigma Genosys) | 1,5 \mul | |
| dNTP (2,5 mM cada uno) (Amersham) | 4,4 \mul | |
| W-1 (1%) | 2,75 \mul | |
| Taq DNA polimerasa (5 U/\mul) (Promega) | 0,55 \mul | |
| ADN molde (1 ng/\mul) | 3 \mul | |
| \hskip3cm Volumen final | 55 \mul |
El cebador DOP será distinto según la reacción
de amplificación: DOP1 (SEQ ID NO:5), DOP2 (SEQ ID NO:6) o DOP3
(SEQ ID NO:7). Se realizan tres reacciones de amplificación
distintas, cada una de ellas con un cebador diferente seleccionado
entre DOP1, DOP2 y DOP3. En las secuencias correspondientes,
representadas por SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7,
respectivamente, puede observarse un fragmento de las mismas
compuesto por una sucesión de "N", debido a que, en realidad,
las alícuotas de cada uno de los cebadores utilizadas no contenía
una única secuencia oligonucleotídica, sino una mezcla de las
diferentes secuencias posibles que resultan de sustituir "N"
por uno de los posibles nucleótidos A, G, C y T. Lo que permite la
obtención de todas las secuencias posible para su longitud. La razón
de utilizar estos cebadores degenerados es que permiten la
amplificación completa del inserto de ADN genómico ya que permiten
la unión del cebador en más de un lugar.
3. Amplificar siguiendo el siguiente programa,
en el que las comillas simples tras un número indican minutos y las
comillas dobles segundos: 3' a 94ºC; 10 ciclos de 1'30'' a 94ºC,
2'30'' a 30ºC, subida hasta 72ºC aumentando 0,1ºC/segundo y 3' a
72ºC; 30 ciclos de 1' a 94ºC, 1'30'' a 60ºC (62ºC si el cebador es
DOP2), 21' a 72ºC; 8' a 72ºC y bajar a 12ºC.
4. Mantener las placas a 4ºC.
5. Comprobar que se ha producido correctamente
la amplificación sometiendo a electroforesis una alícuota de 5
\mul en un gel de agarosa al 2,5%. Debe observarse una mezcla de
bandas diferenciadas y un fondo en forma de cola difusa
(smear) en la zona de tamaños de 200 pb a 2 kb.
6. Guardar a -20ºC hasta el momento de
precipitar el ADN.
- 1.
- Añadir a cada pocillo 5 \mul de AcONa 3M pH 5,2 y 150 \mul de EtOH 100% frío. Invertir varias veces
- 2.
- Mantener a -80ºC entre 15 y 30 min
- 3.
- Centrifugar a 3700 rpm, a 4ºC, 60 min
- 4.
- Voltear para eliminar el sobrenadante
- 5.
- Añadir 150 \mul de EtOH frío al 70%. Vórtex
- 6.
- Centrifugar a 3700 rpm, a 4ºC, 30 min
- 7.
- Voltear para eliminar el sobrenadante
- 8.
- Mantener a 65ºC en estufa hasta que los pellets estén secos
- 9.
- Resuspender en 13,4 \mul de DMSO 50%
- 10.
- Mantener a 4ºC durante toda la noche.
- 11.
- Comprobar en gel de agarosa
- 12.
- Guardar a -20ºC
Para obtener el array, se cultivaron los clones
bacterianos elegidos, se extrajo el ADN de los mismos, se produjo
su amplificación mediante DOP-PCR según se ha
indicado, se precipitaron los productos de PCR y se mezclaron los
productos de las tres diferentes amplificaciones (con DOP1, DOP2 o
DOP3) llevadas a cabo con el ADN extraído de cada clon, de manera
que cada muestra de ADN depositada en un punto del portaobjeto
correspondiera a la mezcla de los tres productos de amplificación
diferentes.
De cada mezcla de tres productos de
amplificación correspondiente a un clon se depositó por triplicado
sobre un portaobjetos de aminosilano (U1traGAPS, Corning),
consiguiendo así un CGH-Array de aproximadamente
3500 sondas, cuya resolución es de 1 Mb.
En el array se han depositado aproximadamente
3500 BAC/PAC que contienen insertos del genoma humano, que al estar
por triplicado corresponden en tomo a 10500 spots. Además se han
utilizado como controles internos 5 BACs que corresponden a
Drosophila melanogaster, F1y32N02, F1yP35P22, F1y39C21,
F1y45C08 y F1y47P08, y un cósmido de Schizosaccharomyces
pombe, c1782 (cuya secuencia puede consultarse en la base de
datos de EMBL mediante el código AL121765). Además han sido
depositados 50 spots con DMSO (control negativo) y 45 puntos que
contienen una mezcla de ADN genómico de distintos individuos sanos.
Con todo lo cual hay aproximadamente 10752 spots por array.
Se estudiaron un total de 68 pacientes
diagnosticados de linfoma esplénico de la zona marginal (LEZM) de
acuerdo con los criterios propuestos por la Organización Mundial de
la Salud (Isaacson PG, Piris MA, Catovski D, et al. Splenic
marginal zone lymphoma. In Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman
JW. Eds.: "Tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. WHO
classification of tumors", Lyon, Francia. IARC Press; 2001:
135-137). La mayor parte de las muestras procedían
del bazo (44 casos) mientras que eran de sangre en los 24 casos
restantes. Como control se usó una mezcla de ADN de varios
controles sanos. Los ADNs de los pacientes y del control, empleados
para el análisis de las muestras, se extrajeron mediante el
protocolo estandarizado de extracción con
fenol-cloroformo (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T
(eds): "Molecular cloning: A laboratory manual", Cold Spring
Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).
El ADN genómico extraído tanto de los pacientes
seleccionados como del control sano se preparó para la hibridación
con el array. Para ello, se sometió primero a una fragmentación
mediante la digestión con la endonucleasa de restricción DpnII,
incubando 2 \mug del ADN correspondiente con 1,2 \mul de DpnII y
3 \mul del tampón correspondiente en un total de 35 \mul
durante 2 horas a 37ºC, tras lo cual se procedió a la inactivación
de la enzima manteniendo la mezcla de reacción 20 minutos a
65ºC.
El tubo con el ADN digerido se mantuvo entonces
1 minuto en hielo y se purificó siguiendo el siguiente
procedimiento:
- 1.
- Añadir a la mezcla de digestión:
- 140 \mul TE 1X pH 8
- 175 \mul de fenol (87,5 \mul)/cloroformo (87,5 \mul)
- Vórtex unos segundos.
- 2.
- Centrifugar 5 minutos a 11.000 rpm.
- 3.
- Pasar el sobrenadante a un eppendorf nuevo y añadir:
- 17.5 \mul de acetato sódico 3.0 M pH 5.2
- 440 \mul de etanol 100% a -20ºC
- 4.
- Incubar 30 minutos a -80ºC
- 5.
- Centrifugar 20 minutos a 4ºC. a 13.200 rpm
- 6.
- Retirar el sobrenadante con pipeta con cuidado de no eliminar el pellet.
- 7.
- Añadir 500 \mul de etanol 70%. (-20ºC).
- 8.
- Centrifugar 5 minutos a 4ºC a 13.200 rpm
- 9.
- Eliminar el sobrenadante con pipeta.
- 10.
- Secar al aire 5 minutos
- 11.
- Resuspender 41 \mul de agua destilada.
- 12.
- Comprobar la integridad del ADN en un gel de agarosa al 1,6%.
Las muestras de ADN genómico (pacientes y
controles) digerido y purificado se marcaron mediante la técnica de
Random-Prime con el Kit de Marcaje Bioprimer
Labelling Kit (Invitrogen). El protocolo de Marcaje de Invitrogen
mediante Random primer está optimizado para comenzar con 2
\mug de ADN genómico. Sin embargo, en el caso de tener una menor
concentración de ADN se puede eliminar la digestión del ADN o
reducir el tiempo de digestión con la enzima. Por otro lado se puede
aumentar el tiempo de reacción de la incorporación de nucleótidos,
pudiéndose obtener una calidad optima de marcaje dejando la
reacción de Random Prime durante toda una noche.
En este caso, para el marcaje se utilizaron dos
fluorocromos diferentes, Cy3 para los controles y Cy5 para las
muestras a testar. Brevemente, las muestras conteniendo 2 \mug de
ADN genómico se mezclaron con 23,5 \mul del random primer
presente en el kit, manteniendo la mezcla 5 minutos a 95ºC, tras lo
cual se pasó a hielo y se añadieron 6 \mul de CTP mix, 3,5 \mul
del fluoróforo (Cy3 dCTP en el caso del control y Cy5 dCTP en el
caso de las muestras de los pacientes) y 1,2 \mul de
Exo-Klenow. Tras mezclar, se incubó 2 horas a 37ºC,
se paró la reacción con 6 \mul de tampón de parada (Stop
buffer) y se dejó en hielo hasta el momento de purificación del
ADN marcado.
La purificación se produjo siguiendo los
siguientes pasos:
- 1.
- Añadir:
- 67 \mul de TE 1X pH 8
- 400 \mul del buffer A
- 2.
- Vortex
- 3.
- Pasar a las columnas.
- 4.
- Centrifugar 1 minutos a 10900 r.p.m. a Tª ambiente.
- 5.
- Descargar el filtrado
- 6.
- Añadir:
- i.600 \mul de buffer B a la columna
- 7.
- Centrifugar 1 minuto a Tª ambiente 10.900 r.p.m.
- 8.
- Descargar y añadir 200 \mul de buffer B.
- 9.
- Centrifugar 1 minuto a Tª ambiente 10.900 r.p.m
- 10.
- Descargar.
- 11.
- Añadir 75 \mul de H_{2}O e incubar 1 minuto a Tª ambiente
- 12.
- Centrifugar 1 minuto a 10900 r.p.m.
Posteriormente se midió la incorporación de los
nucleótidos marcados en el espectrofotómetro, mediante los
siguientes cálculos:
- -
- Cantidad de ADN en microgramos (\mug).
- (A_{260}-A_{320}) x 50 x Volumen sonda (en ml) = \mug de ADN) tiene que ser > de 2,8 \mug)
- -
- Cantidad de nucleótido incorporado:
- [Cy3]_{pmoles} = (A_{550} - A_{650})/0,15 x (volumen de sonda en \mul)
- [Cy5]_{pmoles} (A_{650} - A_{750})/0,25 x (volumen de sonda en \mul)
- El total tiene que ser > de 100 pmoles.
- -
- Ratios:
- Cy3 = (A_{260} x 150.000)/(A_{550} x 6.600)
- Cy5 = (A_{260} x 250.000)/(A_{650} x 6.600)
- Estos valores deben estar en 40-80.
Para la hibridación sobre el array, se mezclaron
las muestras de ADN marcado junto con ADN competidor humano
Cot-1 (Life Technologies), se mezclaron con
solución de hibridación y se realizó la hibridación en el aparato
para el procesamiento automatizado de arrays GeneTAC (Microgen).
Los detalles de proceso fueron los siguientes:
Los portaobjetos se incubaron durante 60 minutos
a 42ºC en agitación con una solución que contenía formamida al 25%
(preparada con 25 ml de SSC 20X, 25 ml de formamida, 1 ml de SDS al
10%, 250 \mul de BSA(50 mg/ml) y 49 ml de H_{2}O), se
lavaron primero durante 5 minutos en SSC 0,1 X en agitación, luego
se lavaron 2 veces durante 1 minuto con H_{2}O destilada en
agitación y se centrifugaron a 2500 rpm durante 5 minutos.
- 1.
- Mezclar las muestras de ADN marcadas (Cy3, Cy5) con el Cot-1:
- Cy5: toda la muestra marcada: 70 \mul
- Cy3: \mul según los pmoles (Se debe tener un incorporación de pmoles similar a los que se obtenga en la reacción de incorporación de Cy5).
- Cot-1: 100 \mul de una solución de 1 \mug/\mul
- 2.
- Añadir el 10% del volumen total de la mezcla anterior de acetato sódico (3M, pH 5,2).
- 3.
- Añadir 2,5 volúmenes de etanol 100% (-20ºC) y mezclar
- 4.
- 30 minutos a -80ºC.
- 5.
- Centrifugar 15 min. a 13.200 r.p.m. a 4ºC.
- 6.
- Decantar; añadir 500 \mul de etanol al 80% frío (-20ºC).
- 7.
- Centrifugar 5 min. a 13.200 r.p.m. a 4ºC.
- 8.
- Decantar y dejar secar.
- 9.
- Añadir 4,5 \mul de ARN de levadura (100 \mug/\mul)(Invitrogen) y 140 \mul de tampón de hibridación (previamente caliente a 70ºC): 50% formamida, 10% dextransulfano, SSC 2X, Tris 10 mM pH 7,6, SDS al 2,7% en agua.
- 10.
- Incubar 2 minutos a 70ºC.
- 11.
- Incubar 1 hora a 37ºC. (Empezar el pretratamiento de los portas)
- 12.
- 10 minutos a 70ºC.
- 13.
- Incubar 1 hora a 37ºC.
- 14.
- Centrifugar 5 minutos a 13.200 r.p.m.
- 15.
- Resuspender en 140 \mul de tampón de hibridación.
La hibridación del array con esta mezcla de
hibridación tuvo lugar durante 48 horas a 42ºC en el GeneTAC.
Se llevaron a cabo primero con solución I
(formamida al 50%, SSC 2X, Tween-20 0,1% v/v) y
luego con solución II (PBS 1x con 0,05% v/v de Tween 20).
Una vez concluido el proceso de hibridación, el
array fue escaneado por el escáner GenePix 4000B (Axon Instrument)
y las imágenes fueron analizadas con el GenePix 4.0. La intensidad
de la fluorescencia de cada punto fue calculada después de la
sustracción del ruido de fondo.
La normalización del array se realizó eliminando
los clones que el GenePix considera como no encontrados, además de
los controles negativos como son: el cósmido c1782 de S.
pombe y DMSO 50%; y haciendo que la media de todo el array sea
igual a 1.
Para validar el array se realizaron una serie de
hibridaciones hombre vs mujer normal y además marcando el
ADN empleado como control en las hibridaciones con las muestras a
testar con los distintos fluorocromos, para eliminar los clones que
en estas hibridaciones se encuentran alterados porque se
considerarán que no se ven afectados por la enfermedad a
analizar.
Del análisis del array genómico se excluyen
aquellos puntos que tienen una desviación estándar mayor o igual a
0,3, por lo que todos los clones con un valor inferior a 0,3 serán
válidos para el análisis.
Para determinar que un clon está alterado se
calcula el promedio de los valores de los logaritmos de los ratios
de la señal correspondiente al Cy5 (ADN tumoral extraído del
paciente) frente a la correspondiente al Cy3 (ADN del control) de
cada triplicado del clon. Si este valor es superior a +0,3 del
promedio de los logaritmos de los ratios, esto indicará que la
cantidad de ADN tumoral hibridado es mayor que la cantidad de ADN
control y se considera que el clon está "ganado", es decir, que
en el ADN tumoral existe ganancia de la zona a la que corresponde
al fragmento de ADN humano insertado en el clon correspondiente. Si
este valor es inferior a -0,3 del promedio de los ratios, esto
indicará que la cantidad de ADN tumoral hibridado es menor que la
cantidad que la cantidad de ADN normal y se considera que el clon
está perdido, es decir, que en el ADN tumoral hay una deleción que
afecta a la región del fragmento de ADN humano insertado en el clon
correspondiente. Y si se encuentra entre +0,3 y -0,3 significa que
el clon no está alterado, es decir que la cantidad de ADN tumoral es
similar a la de ADN control. La representación gráfica se realiza
con el valor del promedio de los log_{2} de los ratios de cada
clon frente a la posición en el genoma de dichos clones.
En la Fig. 1 se muestra una representación de
los datos obtenidos con cada uno de los BACs del cromosoma 7. En la
misma, tal como se explicó previamente, las celdas sombreadas en
tono oscuro continuo representan clones perdidos en el ADN del
paciente correspondiente, las celdas con sombreado interrumpido por
rayas verticales blancas representan clones ganados, mientras que
las celdas con sombreado interrumpido por rayas inclinadas más
oscuras representan clones en los que la hibridación no fue
correcta o en los que los resultados correspondientes a cada una de
las tres muestras del clon depositadas sobre el array resultaron
discordantes.
En dicha Figura puede observarse como el inserto
de clon denominado RP11-44M6, que tiene el código
de identificación bA44M6, permite la identificación de la
existencia de deleciones en la región indicada en más del 60%
(63,24%) de los pacientes de LEZM incluidos en el ensayo.
Además, el mismo estudio permitió ratificar la
asociación entre LEZM y pérdidas de material genómico en una región
más distal, que anteriormente ya había sido asociada con esta
enfermedad: 7q32-7q33. En el 31% de los enfermos
analizados se apreciaron pérdidas en esta región que podían
detectarse por la pérdida de señal de al menos dos sondas
contiguas. Cuando se comparan los enfermos en los que se detectan
pérdidas en la región 7q22.1-7q22.2, se observa que
en un 44% del total de enfermos las pérdidas en la región
7q22.1-7q22.2 se presentan de forma aislada, sin que
existan pérdidas detectables en la región
7q32-7q33; esto es así en casi el 70% de los
pacientes con pérdidas en dicha región. En cuanto a esta segunda
región, 7q32-7q33, en el 9% de los enfermos las
pérdidas en esta región se presentan de forma aislada, sin que se
observen pérdidas en la región 7q22.1-7q22.2. Por lo
tanto, no sólo son dos y no una sola las regiones en las que se
observan deleciones asociadas a LEZM en el brazo largo del
cromosoma 7 sino que, además, parece existir una cierta tendencia a
que la existencia de una excluya la presencia de la otra. Sin
embargo, un ensayo en el que se utilizaran como sondas ambos
fragmentos permitiría detectar el 72% de los enfermos con LEZM,
enfermos que, además, se habrían identificado por presentar pérdidas
en el material genético lo que, como se ha comentado antes, parece
tener una relación con un peor pronóstico en cuanto al período de
supervivencia.
Para comprobar la validez del uso de las sondas
propuestas para la detección de LEZM en ensayos de hibridación
in situ, se realizó una segunda prueba, en este caso de
hibridación in situ fluorescente (FISH), en la que se
utilizaron células procedentes de material tumoral previamente
extirpado (bazo o ganglio) o aspirado (médula ósea), células que,
tras ser cultivadas, se depositaron sobre un portaobjetos y se
hibridaron con ADN de los clones RP11-44M6 y
RP11-193I17, marcados cada uno de ellos con un
fluoróforo diferente: Spectrum Green (que da lugar a una señal de
color verde), en el caso de RP11-44M6, y Spectrum
Orange (que da lugar a una señal de color anaranjado/rojizo), en el
caso de RP11-193I17. Los resultados obtenidos
permitieron comprobar la validez del método de la invención como
método para el diagnóstico de LEZM.
Las secuencias de los insertos de los clones
RP11-44M6 (SEQ ID NO:1) y
RP11-193I17 (SEQ ID NO:4), así como las de los
clones RP11-36B6 (SEQ ID NO:2) y
RP11-329I5 (SEQ ID NO:3), que se muestran en el
"Listado de secuencias" son las secuencias accesibles en la
base de datos de EMBL (tras la introducción del correspondiente
código de acceso que aparece en la Tabla I) a fecha de 23 de
Noviembre de 2006, fecha en la que la construcción del genoma humano
reflejada en dicha base de datos era la construcción 88, dada a
conocer en septiembre de 2006.
Se utilizó el ADN de cada uno de los clones
obtenido a partir de cultivos de 2,5 ml de cada clon utilizando el
kit R.E.A.L. prep. 96 BioRobot de Qiagen, siguiendo las
instrucciones del fabricante, utilizando el protocolo optimizado
para BACs, según se mencionó en el Ejemplo 1, que permite el
aislamiento de los BACs contenidos en las bacterias.
Las sondas se marcaron mediante el procedimiento
de "traslado de la muesca" (nick translation),
utilizando Spectrum Green para marcar el ADN correspondiente al clon
RP11-44M6 y Spectrum Orange para marcar el ADN
correspondiente al clon RP11-193I17. Para ello se
utilizó el siguiente procedimiento:
1. Agregar en un tubo "eppendorf" y en frío
los siguientes reactivos (las enzimas deben añadirse en último
lugar):
| ADN (BAC completo, RP11-44M6 o RP11-193I17) | 1 \mug | |
| 10 X tampón de la reacción NT | ||
| \hskip0.7cm (Tris-HCl 0,5 M pH 8,0, MgCl_{2} 50 mM, 0,5 mg/ml BSA) | 5 \muL | |
| \beta-mercaptoetanol 0,1 M | 5 \muL | |
| Mezcla de dNTPs 10X (cada uno 0,5 mM salvo dTTP: 0,12 mM) | ||
| (Roche) | 5 \muL | |
| Spectrum Green-dUTP (0,5 mM)/Spectrum Orange-11-dUTP (0,125 mM) | ||
| (Abbot Laboratories) | 2 \muL | |
| ADNasa (3 \mug/ml)(Sigma) | 2 \muL | |
| ADN polimerasa I (10 U/\mul)(Promega) | 5 \muL | |
| H_{2}O bidestilada (ajustar hasta 50 \muL) |
2. Mezclar bien y centrifugar suavemente.
3. Incubar en baño a 15ºC durante 30
minutos.
4. Colocar el tubo de la reacción en hielo hasta
que se haya comprobado el tamaño de la sonda.
5. Comprobar la longitud de la sonda mediante la
electroforesis en un gel de agarosa: cargar el gel con 7 \muL de
la mezcla de la reacción (teñida con el tampón de carga) así como
con el marcador de 1 Kb y dejar correr durante 30 minutos a 100
voltios. Observar el ADN bajo iluminación ultravioleta y obtener una
fotografía.
6. Si el tamaño de la sonda es el deseado, en
torno a 300 pb, inactivar la ADNasa: añadir 2 \muL de EDTA 0,5 M
(concentración final de 10 mM) y 1 \muL de SDS al 10%
(concentración final de 0,1%) a la mezcla de la reacción y calentar
durante 10 minutos a 68ºC.
El resultado del proceso es la obtención de la
sonda marcada a una concentración aproximada de 20 ng/\mul. A
continuación se puede utilizar en la hibridación o almacenar a
-20ºC.
Se analizaron un total de 12 enfermos en los que
previamente se había diagnosticado LEZM de acuerdo con los mismos
criterios propuestos por la Organización Mundial de la Salud a los
que se hizo referencia en el Ejemplo 1.8 de ellos habían sido
incluidos en el estudio de CGH-arrays descrito en el
Ejemplo 1 (los pacientes referidos como los casos 4, 11, 18, 21,
22, 23, 63 y 68 en dicho Ejemplo 1) y en otros 4 no se obtuvo
suficiente ADN como para realizar estudios de CGH arrays, por lo
que no se habían incluidos en el Ejemplo 1.
Se parte de una suspensión de células
procedentes de tumores previamente extraídos o aspirados a cada uno
de los pacientes, suspensión que se obtiene tras cultivar las
células de acuerdo con los procedimientos estandarizados en el
laboratorio de los inventores (Hernández JM, González MB, Granada
I, Gutiérrez NC, Chillón C, Ramos F, Ribera JM, González M, Feliu
E, San Miguel JF: "Detection of inv(16) and t(16;16)
by FISH in acute myeloid leukemia M4Eo", Haematologica
2000; 85: 481-485). Brevemente, se tomaron muestras
de los tumores extraídos de los pacientes, que se recogieron en
condiciones de máxima esterilidad y se procesaron en un tiempo
inferior a 24 horas. Los tubos utilizados para la recogida y el
transporte de las muestras estaban exentos de EDTA, porque inhibe
el crecimiento de las células.
1. Preparación de la muestra:
- 1.a
- En el caso de las muestras de aspirados de médula ósea, se realiza un recuento celular de la muestra extraída en tubos de heparina sódica, para calcular la cantidad de muestra necesaria, teniendo en cuenta que se deben cultivar aproximadamente 2 millones de células por ml de medio de cultivo.
- 1.b
- Las muestras obtenidas de ganglio o de bazo se disgregaron con bisturí y pinzas en condiciones de máxima esterilidad, para obtener un botón celular lo más homogéneo posible, tal como ha sido descrito por Hernández et al (Hernández J.M., García J.L., Gutiérrez N.C., Mollejo M., Martínez-Climent J.A., Flores T., González M.B., Piris M.A., & San Miguel J.F. Novel Genetics Imbalances in B-Cell Splenic Marginal Lymphomas Revealed by Comparative Genomic Hybridization and Cytogenetics. American Journal of Pathology, Vol. 185, No 5, May 2005).
2. Incubar las células en 10 mL de medio de
cultivo (RPMI 1640, Invitrogen) en frascos estériles en una estufa
de CO_{2} al 5% a 37ºC durante 24 horas sin estimulante.
3. Trascurrido el tiempo de incubación,
interrumpir el ciclo celular con 0,1 mL de Colcemid (Sigma)
(concentración final: 0,1 \mug/mL) durante 50 minutos a 37ºC.
4. Transferir el producto del cultivo a un tubo
cónico y centrifugar a 1200 r.p.m. durante 10 minutos. Decantar el
sobrenadante y resuspender el sedimento obtenido.
5. Añadir suavemente la solución hipotónica (KCl
0,0075 M) precalentada a 37ºC e incubar durante 20 minutos en
estufa a 37ºC.
6. Centrifugar a 1200 r.p.m. durante 10 minutos.
Decantar el sobrenadante.
7. Añadir el fijador Carnoy (metanol:ácido
acético 3:1) gota a gota. Centrifugar.
8. Decantar, resuspender el sedimento nuevamente
con fijador y volver a centrifugar al menos otras dos veces, para
obtener un botón celular limpio. Conservar a -20ºC.
1. Colocar en un tubo "eppendorf" 100 ng de
sonda y 20 \muL de ADN Cot1 (enriquecido con ADN altamente
repetitivo) que actuará como competidor evitando que la sonda
hibride en las regiones cromosómicas que poseen secuencias altamente
repetitivas (regiones pericentroméricas).
2. Precipitar la sonda añadiendo 1,5 \muL de
acetato sódico 3 M y 50 \muL de etanol al 100% a -20ºC. Mezclar
bien e incubar a -80ºC durante 30 minutos.
3. Centrifugar a 12.000 r.p.m. durante 10
minutos a 4ºC.
4. Decantar el sobrenadante. Añadir 100 \muL
de etanol al 80% y centrifugar a 12.000 r.p.m. durante 10 minutos.
Eliminar el sobrenadante y dejar secar.
4. Resuspender el ADN con 7 \muL del tampón de
hibridación y agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
5. Desnaturalizar el ADN a 75ºC 5 minutos,
incubar en hielo otros 5 minutos y realizar el preanillado de la
sonda en baño a 37ºC durante 45 minutos.
6. Agregar 7 \muL de la sonda desnaturalizada
y preanillada sobre el portaobjetos.
7. Cubrir con un cubreobjetos y sellar con
pegamento.
Para proceder a la hibridación, las
preparaciones se introdujeron en una cámara húmeda y se incubaron
con tampón de hibridación (formamida al 60%, dextransulfato al 2%,
SSC 0,01X) durante 24 horas a 37ºC.
Terminada la hibridación, se eliminó suavemente
el pegamento y los cubreobjetos de las preparaciones. En primer
lugar, se introdujeron en un recipiente que contenía formamida al
60%/SSC 2X pH 7,0 a 42ºC, realizando cuatro lavados de 5 minutos
cada uno. A continuación se realizaron tres lavados de 5 minutos en
una solución de SSC 0,1X a 60ºC. Por último, se realizó un lavado
de 5 minutos a temperatura ambiente en 4T (SSC 4X,
Tween-20 0,05% v/v).
La contratinción de las células, adicional a la
realizada al poner en contacto las preparaciones con las sondas
previamente marcadas con los fluoróforos, se realizó con DAPI
(4,6-diamidino-2-fenilindol),
introduciendo el portaobjetos en un recipiente que contenía una
solución de DAPI, durante 2 minutos en agitación y a temperatura
ambiente.
A continuación, se agregaron 20 \mul de
"VECTASHIELD" (Laboratorios Vector) para mantener la
fluorescencia, y se cubrió con un cubreobjetos. Las preparaciones se
mantuvieron a 4ºC y protegidas de la luz hasta el momento de
realizar la adquisición y análisis digital de las imágenes.
Los portaobjetos se observaron en un microscopio
epifluoresecente con rueda de filtros (DAPI, FTC, TRITC). Las
imágenes se procesaron con el sistema de análisis de imagen
CYTOVISION (Applied Imaging).
Tal como se explicó previamente, debido a que la
región cromosómica con la que hibrida cada una de las sondas está
duplicada en cada una de las células, si dicha zona no está
delecionada, debe observarse en la célula dos señales con el color
correspondiente al fluoróforo con el que se haya marcado dicha
sonda. Por tanto, en las células procedentes de pacientes que
presenten tumores no clasificables como linfoma esplénico de la
zona marginal deben apreciarse 4 señales, dos correspondientes a la
sonda RP11-44M6 (que en este caso serán de color
verde), y otras dos correspondientes a la sonda
RP11-193I17 (que en este caso serán de color
anaranjado/rojizo). Las muestras se clasificarán como procedentes
de un linfoma esplénico de la zona marginal (LEZM) cuando se
observe una única señal del color correspondiente a al menos una de
las sondas, es decir, según los fluoróforos utilizados en este caso
específico, se diagnosticará que el tumor es una linfoma esplénico
de la zona marginal tanto si la célula presenta una única señal de
verde (lo que indica pérdida de la zona con la que hibrida el
inserto del clon RP11-44M6 en uno de los cromosomas)
y dos señales de color anaranjado/rojizo, como si la célula
presenta una única señal de color anaranjado/rojizo (lo que indica
pérdida de la zona con la que hibrida el inserto del clon
RP11-193I17) y dos señales de color verde, o también
si la célula presenta una única señal de color verde y una única
señal de color anaranjado/rojizo (lo que indica pérdida tanto de la
zona con la que hibrida el inserto del clon
RP11-44M6 como pérdida de la zona con la que
hibrida el inserto del clon RP11-193I17).
En los 4 enfermos en los que no se realizaron
estudios de CGH arrays se observó pérdida del clon
RP11-44M6 en 3 de ellos, de los cuales en 1 se
observaba también pérdida del clon RP11-193I17. De
los 8 casos analizados también por CGH arrays se observó que en los
enfermos número 4, 11 y 63 había pérdida de ambos clones, mientras
que en los casos números 18, 21, 22 y 23 se observaba sólo pérdida
del clon RP11-44M6. El caso 68 no presentaba
pérdida de ninguno de los dos clones analizados por hibridación
"in situ". Los hallazgos encontrados en la FISH
confirmaron los observados en el ensayos de
CGH-array del Ejemplo 1 en los enfermos
analizados.
La Figura 2 corresponde a un ensayo de
hibridación in situ realizado utilizando el método
diagnóstico de la invención, sobre una muestra tomada del enfermo
21, utilizando como sondas tanto el inserto del clon
RP11-4M6, marcado con el marcador "Spectrum
green" (que da lugar a una señal de color verde), como el inserto
del clon RP11-193I17 marcado con el marcador
"Spectrum Orange" (que da lugar a una señal de color
rojo/anaranjado). En ambas células se observa que sólo existe una
señal de color verde por célula (puntos señalados con flechas
horizontales, de color blanco), observándose dos señales de color
rojo en cada una de las células (puntos señalados con flechas
verticales, con relleno negro), lo que indica que existe una pérdida
de material genómico en la región 7q22, no detectándose pérdida de
material genómico en la región de 7q32-7q33,
resultado que confirma los obtenidos para este mismo paciente en el
experimento del CGH-array descrito en el Ejemplo
1.
Por tanto, el sistema propuesto es válido para
el diagnóstico de LEZM mediante la utilización de las sondas
propuestas marcadas con alguna sustancia que permita su detección,
preferentemente fluoróforos diferentes, cada uno de los cuales emite
el longitudes de onda diferentes, que dan lugar a la observación de
colores diferentes.
<110> FUNDACIÓN DE INVESTIGACIÓN DEL
CÁNCER
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> USO DE SONDAS PARA EL DIAGNÓSTICO
DEL LINFOMA ESPLÉNICO DE LA ZONA MARGINAL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P-100528
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 113687
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(113687)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Inserto del BAC
RP11-44M6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 192768
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(192768)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Inserto del BAC
RP11-36B6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 194523
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(194523)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Inserto del BAC
RP11-329I5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 176209
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(176209)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Inserto del BAC
RP11-193I17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador DOP1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador degenerado: N puede ser A,
T, G o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgactcgag nnnnnnctag aa
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador DOP2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador degenerado: N puede ser A,
T, G o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgactcgag nnnnnntagg ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador DOP3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador degenerado: N puede ser A,
T, G o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgactcgag nnnnnnttct ag
\hfill22
Claims (26)
1. Uso de la secuencia representada por SEQ ID
NO:1 como sonda para el diagnóstico del linfoma esplénico de la
zona marginal (LEZM) en seres humanos.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que la
sonda de SEQ ID NO:1 se utiliza para el diagnóstico del linfoma
esplénico de la zona marginal en seres humanos en combinación con
al menos una sonda adicional.
3. Uso según la reivindicación 2, en el que la
secuencia de al menos una sonda adicional está comprendida en la
región 7q32-7q33 del cromosoma 7 humano.
4. Uso según la reivindicación 3, en el que la
secuencia de al menos una sonda adicional está comprendida en un
fragmento de la región 7q32-7q33 del cromosoma 7
humano que se selecciona entre las secuencias representadas por SEQ
ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4.
5. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la sonda o sondas utilizadas para
el diagnóstico del linfoma esplénico de la zona marginal se
encuentran depositadas sobre un soporte sólido formando parte de un
array.
6. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la sonda o sondas utilizadas para
el diagnóstico del linfoma esplénico de la zona marginal se
utilizan formando parte de una composición líquida que se utiliza en
un ensayo de hibridación con el genoma de células de seres humanos
depositadas sobre un soporte sólido.
7. Un método de diagnóstico in vitro de
LEZM en un ser humano que comprende las etapas de:
- a)
- obtener una muestra de tejido o de células separadas, procedentes de un tejido infiltrado con células de linfoma, fijadas sobre un portaobjetos y listas para llevar a cabo una hibridación in situ sobre ellas;
- b)
- realizar una hibridación in situ sobre el portaobjetos, en presencia de ADN humano competidor, utilizando como sonda ADN correspondiente a la secuencia del inserto del BAC RP11-44M6 (SEQ ID NO:1) acoplado a una sustancia que permite su detección y utilizando opcionalmente como una segunda sonda cuya secuencia está comprendida en la región 7q32-7q33 del cromosoma 7 humano también acoplada a una sustancia que permite su detección, sustancia que es distinta de la sustancia a la que está acoplada la primera sonda y que da lugar a una señal diferenciable de la correspondiente a dicha sustancia;
- c)
- identificar el tumor del que se tomó la muestra como linfoma esplénico de la zona marginal si en cada célula se observa una única señal correspondiente a la sustancia acoplada a la primera sonda y/o, en el caso de haberse utilizado también la segunda sonda opcional, una única señal correspondiente a la sustancia acoplada a la segunda sonda, e identificar el tumor como clasificable en otro tipo de cáncer si en cada célula se observan dos señales correspondientes a la sustancia acoplada a la primera sonda que, en el caso de haberse utilizado también la segunda sonda opcional, deberán ir acompañadas por dos señales correspondientes a la segunda sonda.
8. Método según la reivindicación 7, en el que
la segunda sonda opcional se selecciona entre los insertos de los
BACs RP11-36B6 (SEQ ID NO:2),
RP11-329I5 (SEQ ID NO:3) y
RP11-193I17 (SEQ ID NO:4).
9. Método según la reivindicación 8, en el que
la segunda sonda opcional corresponde al inserto del BAC
RP11-193I17 (SEQ ID NO:4).
10. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, en el que tanto la sustancia acoplada a la
primera sonda como la sustancia acoplada a la segunda sonda
opcional dan lugar a la emisión de fluorescencia.
11. Método según la reivindicación 10, en el que
tanto la sustancia acoplada a la primera sonda como la sustancia
acoplada a la segunda sonda son fluoróforos unidos covalentemente a
la sonda correspondiente.
12. Método según la reivindicación 11, en el que
el fluoróforo unido covalentemente a una de las sondas es Cy3 y el
fluoróforo unido covalentemente a la otra sonda es Cy5.
13. Método según la reivindicación 11, en el que
el fluoróforo unido covalentemente a una de las sondas es rodamina
y el fluoróforo unido covalentemente a la otra sonda es
fluoresceína.
14. Método según la reivindicación 11, en el que
los fluoróforos unidos a cada una de las sondas se seleccionan del
grupo de Spectrum Green, Spectrum Orange y Spectrum Red.
15. Método según la reivindicación 14, en el que
el fluoróforo unido covalentemente a una de las sondas es Spectrum
Green y el fluoróforo unido covalentemente a la otra sonda es
Spectrum Orange.
16. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 15, en el que la muestra fijada sobre un
portaobjetos sobre la cual se lleva a cabo la hibridación in
situ es una sección de tejido tomada de un tumor de bazo o de
ganglios linfáticos.
17. Método según la reivindicación 16, en el que
la sección de tejido tiene un espesor de 2-3
\mum.
18. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 15, en el que la muestra fijada sobre un
portaobjetos sobre la cual se lleva a cabo la hibridación in
situ se compone de células separadas procedentes de una muestra
de tejido infiltrado extraída previamente del paciente y que han
sido sometida a los procesos característicos de la citogenética
convencional.
19. Método según la reivindicación 18, en el que
las células proceden de un tumor de bazo, un tumor de ganglios
linfáticos, un aspirado de médula ósea o de una muestra de sangre
total.
20. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 19, en el que se incluye al menos una tercera
sonda opcional, complementaria a una región no asociada con
LEZM.
21. Método según la reivindicación 21, en el que
la tercer sonda opcional es complementaria a la región del
centrómero del cromosoma 7.
22. Un kit de diagnóstico que comprende una
primera sonda que corresponde a la secuencia del inserto del BAC
RP11-44M6 (SEQ ID NO:1) acoplada a una sustancia
que permite su detección y, opcionalmente, en el mismo recipiente o
en un recipiente separado, una segunda sonda, acoplada a una
segunda sustancia que permite su detección y su diferenciación de
la primera sustancia, sonda que corresponde a la secuencia de un
fragmento de la región 7q32-7q33.
23. Kit de diagnóstico según la reivindicación
22, en el que la sonda que corresponde a la secuencia de un
fragmento de la región 7q32-7q33 se selecciona entre
los insertos de los BACs RP11-36B6 (SEQ ID NO:2),
RP11-329I5 (SEQ ID NO:3) y
RP11-193I17 (SEQ ID NO:4).
24. Kit de diagnóstico según la reivindicación
23, en el que la segunda sonda opcional corresponde al inserto del
BAC RP11-193I17 (SEQ ID NO:4).
25. Kit de diagnóstico según una cualquiera de
las reivindicaciones 22 a 24, en el que tanto la sustancia acoplada
a la primera sonda como la sustancia acoplada a la segunda sonda
opcional son fluoróforos.
26. Kit de diagnóstico según la reivindicación
25, en el que la primera sonda está unida covalentemente al
fluoróforo Spectrum Green y la segunda sonda está unida
covalentemente al fluoróforo Spectrum Orange.
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|---|---|---|---|
| ES200700241A ES2284408B1 (es) | 2007-01-30 | 2007-01-30 | Uso de sondas para el diagnostico del linfoma esplenico de la zona marginal. |
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|---|---|---|---|
| ES200700241A ES2284408B1 (es) | 2007-01-30 | 2007-01-30 | Uso de sondas para el diagnostico del linfoma esplenico de la zona marginal. |
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| ES2284408A1 ES2284408A1 (es) | 2007-11-01 |
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|---|---|---|---|---|
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2007
- 2007-01-30 ES ES200700241A patent/ES2284408B1/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (6)
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|---|
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| Publication number | Publication date |
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