ES2629979T3 - Métodos y composición para generar sondas de ADN de secuencia única, marcaje de sondas de ADN y el uso de estas sondas - Google Patents

Abstract

Un método para producir sondas de ácido nucleico complementarias a una secuencia diana, que comprende las etapas de: a. obtener polinucleótidos bicatenarios que se sabe que contienen secuencias diana complementarias y secuencias repetitivas; b. fragmentar dichos polinucleótidos bicatenarios en fragmentos; c. desnaturalizar dichos fragmentos en hebras individuales; d. hibridar dichas secuencias repetitivas para formar una mezcla de hebras dobles y hebras individuales; e. escindir las hebras dobles; y f. amplificar dichas hebras individuales donde dichas hebras individuales son complementarias a dichas secuencias diana.

Description

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DESCRIPCION

Metodos y composicion para generar sondas de ADN de secuencia unica, marcaje de sondas de ADN y el uso de estas sondas

Antecedentes de la invencion Campo de la invencion

La invencion se refiere, en lmeas generales, al campo de identificacion de secuencias de ADN, genes o cromosomas.

Generacion de sondas de ADN

El ADN genomico humano es una mezcla de secuencias unicas y secuencias repetitivas que estan presentes en multiples copias en todo el genoma. En algunas aplicaciones, son deseables sondas de hibridacion de acido nucleico para detectar secuencias repetitivas. Estas sondas han demostrado utilidad en los campos de diagnostico de celulas fetales, oncoIog^a y citogenetica. En otras aplicaciones, es deseable generar sondas de hibridacion que hibriden solamente con las secuencias unicas de interes en un cromosoma. La preparacion de sondas de secuencia unica se desbarata por la presencia de numerosas clases de secuencias repetitivas en todo el genoma del organismo (Hood et al., Molecular Biology of Eucar[gamma]otic Cells (Benjamin/Cummings Publishing Company, Menlo Park, CA 1975). La presencia de secuencias repetitivas en sondas de hibridacion reducira la especificidad de las sondas porque partes de la sonda se uniran a otras secuencias repetitivas encontradas fuera de la secuencia de interes. Por tanto, para asegurar la union de las sondas de hibridacion a una secuencia espedfica de interes, deben hacerse esfuerzos para asegurar que las secuencias repetitivas en la sonda no hibridan con el ADN diana fuera de la secuencia de interes.

Las recientes contribuciones han abordado esta cuestion inhibiendo la hibridacion de las secuencias repetitivas con el uso de acidos nucleicos de bloqueo no marcados (documento US 5.447.841 y documento US 6.596.479). El uso de acidos nucleicos de bloqueo en hibridaciones es caro, no evita completamente la hibridacion de las secuencias repetitivas y puede distorsionar los patrones de hibridacion genomicos (Newkirk et al., "Distortion of quantitative genomic and expression hybridization by Cot-1 DNA: mitigation of this effect," Nucleic Acids Res. Vol. 33 (22):e191 (2005)). Por tanto, son necesarios metodos que eviten la hibridacion de secuencias repetidas sin el uso de ADN de bloqueo para una hibridacion optima.

Un medio para conseguir esto es eliminar los fragmentos repetidos indeseados de las sondas de hibridacion antes de la hibridacion. Las tecnicas que implican la eliminacion de secuencias altamente repetitivas se han descrito previamente. Los absorbentes, como la hidroxiapatita, proporcionan un medio para eliminar secuencias altamente repetitivas del ADN extrafdo. La cromatograffa con hidroxiapatita fracciona el ADN basandose en las condiciones de re-asociacion de duplex, tales como la temperatura, concentracion salina u otras rigurosidades. Este procedimiento es laborioso y vaffa con diferentes secuencias. El ADN repetido tambien puede eliminarse por hibridacion con ADN inmovilizado (Brison et al., "General Methods for Cloning Amplified DNA by Differential Screening with Genomic Probes", Molecular and Cellular Biology, Vol. 2, pag. 578-587 (1982)). En todos estos procedimientos, la eliminacion ffsica de las secuencias repetitivas dependera de la estrictica optimizacion de las condiciones con variaciones inherentes basadas en la composicion de bases de la secuencia de ADN.

Se han descritos otros varios metodos para eliminar secuencias repetitivas de las sondas de hibridacion. Un metodo implica usar un agente de entrecruzamiento para entrecruzar secuencias repetitivas para evitar directamente la hibridacion de las secuencias repetitivas o para evitar la amplificacion de las secuencias repetidas en una reaccion de PCR. (Documento US 6.406.850). Otro metodo usa cromatograffa de afinidad asistida por PCR para eliminar repeticiones de las sondas de hibridacion (documento US 6.569.621). Estos dos metodos dependen del uso de ADN marcado para eliminar las secuencias repetidas, lo que hace que estos procesos sean complejos y diffciles de reproducir. Ademas, ambos metodos conllevan mucho tiempo, requiriendo multiples rondas de eliminacion de las repeticiones para producir sondas funcionales, adecuadas para su uso en hibridacion in situ fluorescente (FISH) u otras reacciones de hibridacion que requieran alta especificidad de diana.

El uso de nucleasas espedficas de duplex que escinden preferentemente moleculas de acido desoxirribonucleico bicatenario se ha descrito para aplicaciones de deteccion de variantes de secuencia tales como polimorfismos de un unico nucleotido (documento US 2005/0164216; documento US 6.541.204). La capacidad de la enzima de escindir preferentemente polinucleotidos duplex de acido nucleico perfectamente coincidentes en comparacion con los monocatenarios proporciona un medio para eliminar ADN bicatenario no diana de la mezcla de muestra.

La capacidad de estas nucleasas de digerir espedficamente la forma duplex de los polinucleotidos en la presente se descubrio que proporcionaba un beneficio sustancial en la fabricacion de sondas espedficas de diana unica que no requieren ADN de bloqueo, eliminando de ese modo los costes y el efecto interferente del ADN de bloqueo, y proporcionando un medio para una produccion rapida, eficaz y rentable de sondas de alta especificidad.

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La deteccion de secuencias espedficas en un genoma hace uso del hecho de que el ADN consiste en una helice de dos hebras de ADN y que esta doble hebra es muy estable cuando estas dos hebras son homologas. El ADN consiste en una estructura de fosfato-fosfato de azucar y por cada azucar puede estar presente una de cuatro bases nitrogenadas diferentes, citosina, guanina, timina o adenina. Las hebras homologas emparejan cada citosina con una guanina y cada timina con una adenina. Cuando se anade una secuencia homologa marcada a un genoma y el ADN se hace monocatenario, estas secuencias marcadas hibridaran, en las circunstancias correctas, con la secuencia homologa espedfica en el genoma. Para esta hibridacion in situ, estan disponibles varias sondas para diferentes fines y aplicaciones de deteccion.

Cromosomas completos/sondas tenidas (WCP)

La WCP incorpora material de ADN marcado, homologo a un cromosoma espedfico. El material se obtiene por clasificacion en flujo de cromosomas en metafase o por diseccion laser de una dispersion en metafase que se amplifica por PCR o una tecnica relacionada. Despues de marcarla y aplicarla a un nucleo preparado apropiadamente, tenira el cromosoma diana. Sin embargo, dichas sondas marcadas teniran ademas otros cromosomas que no son diana a causa de elementos de secuencia estructurales o repetitivos que estan compartidos entre algunos o todos los cromosomas. Por consiguiente, para tenir solamente esas secuencias originarias del cromosoma pretendido de interes, estos elementos repetitivos comunes habitualmente se inhiben por hibridacion con ADN de bloqueo u otros metodos que bloquean o eliminan las interacciones no espedficas.

Tambien se aplican multiples tintes de cromosomas a un unico nucleo. Las WCP se marcan por diferentes fluorocromos o con una combinacion de fluorocromos, sin proporcionar lfmite a la cantidad de WCP aplicadas en una unica hibridacion. Las WCP se usan principalmente para el cariotipado y para estudiar translocaciones de fragmentos grandes, regiones y subregiones de cromosomas que se observan mejor en una dispersion en metafase de un nucleo.

Sondas de centromeros

Las sondas de centromeros estan dirigidas a una secuencia de 171 pb que se produce en orden repetitivo en cada region centromerica de los cromosomas humanos. Todos los cromosomas tienen una secuencia ligeramente diferente y a causa de esto todos los cromosomas se detectan por separado cuando se usa la rigurosidad de hibridacion correcta. Solamente dos pares de cromosomas, 13 con 21 y l4 con 22, comparten la misma repeticion y no pueden detectarse independientemente. Generalmente, las sondas centromericas se producen a partir de plasmidos que contienen un inserto de una o unas pocas copias de la repeticion de 171 pb. Estas sondas son capaces de hibridar sin la adicion de ADN de bloqueo porque las secuencias de 171 pb no se producen fuera de las regiones de interes.

Sondas de telomeros

Los telomeros humanos consisten en una serie de cortas secuencias repetitivas (es decir, TTAGGG). Esto se repite varias veces en diferentes cantidades para cada cromosoma y edad de sujeto de ensayo individual. Esta secuencia repetitiva se usa como sonda que tenira todos los cromosomas, aunque cada cromosoma no se tenira igual de fuerte. Para detectar el extremo telomerico de los cromosomas, se usa principalmente un clon de cromosoma artificial bacteriano (BAC) sub-telomerico. Este clon de BAC contiene secuencias repetitivas que deben bloquearse o eliminarse durante o despues de la hibridacion.

Sondas de hibridacion genomica comparativa (CGH)

La CGH es un proceso que implica hibridar un genoma de ensayo con un genoma de referencia. El genoma de referencia puede adoptar la forma de una dispersion de cromosomas en metafase de un individuo sano o puede estar basada en una matriz usando secuencias de sondas que representan todo o parte de un genoma. Las sondas de micromatriz preparadas usando clones de BAC contienen secuencias repetitivas que deben bloquearse antes de la hibridacion. Sin embargo, el bloqueo tiene el potencial de causar una desviacion en los resultados cuando se comparan con sondas agotadas repetidas (Knol y Rogan, Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, N.° 22). Ademas, la etapa de bloqueo aumenta el coste de los ensayos de hibridacion. Si las secuencias de la sonda se reducen de secuencias repetitivas, la etapa de bloqueo del ADN genomico marcado no es necesaria, provocando una reduccion en el coste y la eliminacion de cualquier variacion.

Sondas espedficas de gen

Las sondas espedficas de gen se disenan para detectar una region del genoma que contiene un gen o un grupo de genes diana. Estas sondas se usan para detectar amplificaciones o deleciones de areas genomicas espedficas que se correlacionan con el nivel de expresion del gen espedfico de interes. La secuencia codificante del propio gen o genes no es suficientemente grande para generar una senal de deteccion para la sonda que sea visible usando microscopia de fluorescencia convencional. Por lo tanto, dichas sondas espedficas de gen no estan limitadas a solamente las secuencias genicas codificantes (exones), sino que tambien implican secuencias no codificantes

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(intrones), reguladoras u otras secuencias alrededor del gen. Como las secuencias grandes incluidas dentro de incluso un diseno de sonda espedfica de gen, a menudo sufren la inclusion indeseable de secuencias repetitivas indeseadas. Cuando dicho material despues se marca y se usa en hibridaciones o se usa en hibridaciones y despues se marca, las secuencias indeseadas deben bloquearse o eliminarse de la sonda para que sea capaz de detectar el area genica espedficamente.

Sondas de micromatriz

Similar a CGH, las sondas de micromatriz se fijan a un portador. En general, las tecnicas roboticas automatizadas se usan para depositar puntualmente productos de PCR de ADNc u oligonucleotidos sinteticos en un portaobjetos o una superficie fija similar. Ademas, existen tecnicas para sintetizar secuencias directamente en un portaobjetos (Affimetrix, Inc., Santa Clara). Los portaobjetos se hibridan con ADNc o ARN marcado en combinacion con diferentes ADNc o ARN marcados como controles.

Acoplamiento de moleculas indicadoras a sondas de ADN

Las sondas de ADN se visualizan por las moleculas indicadoras acopladas. Estas moleculas tienen que incorporarse o adherirse a la sonda de ADN. Un metodo utiliza una molecula indicadora, que tiene nucleotidos vinculados a reacciones enzimaticas. Los ejemplos incluyen la incorporacion por traslado de mella o una reaccion de cebado aleatorio. Ademas, un nucleotido acoplado a amina, construido de ese modo, se acopla posteriormente directa o indirectamente a moleculas indicadoras. El acoplamiento se hace por marcaje qrnmico del ADN. Un ejemplo es el acoplamiento de una molecula indicadora ligada a un grupo de platino que forma un enlace coordinador en la posicion N7 de guanina como se usa en el marcaje ULS (Kreatech Diagnostics, Amsterdam) y como se describe en los documentos US 5.580.990; US 5.714.327; US 5.985.566; US 6.133.038; US 6.248.531; US 6.338.943; US 6.406.850 y US 6.797.818. Las moleculas indicadoras pueden ser isotopos radiactivos, marcadores no isotopicos, digoxigenina, enzimas, biotina, avidina, estreptavidina, agentes luminiscentes tales como radioluminiscentes, quimioluminiscentes, bioluminiscentes y fotoluminiscentes (incluyendo fluorescentes y fosforescentes), colorantes, haptenos y similares.

Preparacion de muestras

Para ser capaces de detectar las sondas marcadas unidas a cromosomas en interfase, el nucleo debe mantener la morfologfa durante y despues de los procedimientos FISH. Usando la fijacion, las celulas o los nucleos se unen a una capa solida tal como un portaobjetos de microscopio. La fijacion antes, durante o despues de la union a la capa solida, proporciona referencia para su identificacion. Dependiendo del tipo de celula o tejido, los nucleos tienen que ser accesibles para el ADN de la sonda, habitualmente por pre-tratamiento con enzimas proteoltticas, calor, alcoholes, desnaturalizantes, soluciones de detergente o una combinacion de tratamientos. La sonda y el ADN nucleico se hacen monocatenarios por calor o por tratamiento con alcali y despues se dejan hibridar.

Uso de sondas de ADN

Micromatrices

Un uso comun de las micromatrices es determinar el perfil de expresion de ARN de un tejido sospechoso, tumor o microbio. Analizando el perfil de expresion de ARN, se propone un pronostico para el tratamiento y la supervivencia del paciente. El valor pronostico de las micromatrices de ARN para uso clmico aun tiene que determinarse. Otro uso comun de las micromatrices es CGH basada en matriz. Con esta tecnica, puede explorarse un genoma completo para amplificaciones y/o deleciones de regiones cromosomicas.

Microscopia

El analisis citogenetico en ensayo pre y postnatal se usa para determinar si un feto tiene o no una anomalfa citogenetica en una poblacion celular del feto. Las muestras se obtienen frecuentemente a traves de amniocentesis, realizada en mujeres embarazadas que se considera que tienen un riesgo aumentado de anomalfas citogeneticas. Por consiguiente, estas celulas se investigan para anomalfas citogeneticas. Se realiza el mismo tipo de investigaciones para confirmar las anomalfas citogeneticas o para investigar las anomalfas citogeneticas sospechosas en poblaciones celulares obtenidas despues del parto.

Evaluacion de celulas fetales en sangre materna

Durante el embarazo, las celulas fetales pueden entrar en la sangre materna, con aumentos en la cantidad de estas celulas fetales encontrados con embarazos traumaticos, con preeclamsia y anomalos. En evaluaciones rutinarias de hemorragias feto-maternas, el ensayo de Kleihauer-Betke frecuentemente usado se basa en la deteccion de globulos rojos que expresan hemoglobina fetal. Para la deteccion de anomalfas citogeneticas, se necesitan celulas nucleadas de la sangre materna. La frecuencia de estas celulas es considerablemente inferior y se estima que esta en el intervalo de 1 - 10 celulas fetales por ml de sangre materna. Los globulos rojos nucleados, las celulas

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trofoblasticas y la presencia de progenitores hematopoyeticos que son de origen fetal proporcionan una diana para el aislamiento y la hibridacion de sondas en la deteccion de anomalfas citogeneticas de forma prematura en los embarazos. Hasta la fecha, no esta disponible un metodo fiable y reproducible para identificar y evaluar la composicion citogenetica de estas celulas. Uno de los problemas principales con este analisis es la perdida de celulas fetales en diversas etapas durante todo el procedimiento, provocando informacion incoherente o poco concluyente.

Oncolog^a

FISH se usa para detectar diversos tipos de aberraciones cromosomicas como translocaciones, deleciones, amplificaciones, inversiones y duplicaciones. Estas aberraciones se detectan en todos los tipos de celulas y tejido. En leucemia, se afslan celulas de la sangre o de la medula osea para su posterior analisis FISH. En cancer de vejiga, se afslan celulas de la orina. Se obtienen celulas de tumores solidos por puncion o por escision del propio tumor. Ademas, las celulas que se liberan por los tumores solidos se afslan de la sangre y se analizan por FlSH. Lo ultimo da la oportunidad de controlar el tratamiento del tumor estrechamente para detectar un cambio cromosomico en el tumor. En algunos tipos de cancer, FISH proporciona un pronostico de progresion tumoral o predice la eficacia de la medicacion espedfica. Comercialmente, los ensayos FISH mas usados son el FISH de translocacion BCR-ABL en leucemia mielogena cronica y FISH de amplificacion genica de her2/neu en cancer de mama.

Celulas tumorales diseminadas

Los metodos para la caracterizacion no solamente de celulas tumorales, sino tambien de celulas infrecuentes, u otras entidades biologicas de muestras biologicas se han descrito previamente (documento US 6.365.362). Este metodo de dos fases requiere el enriquecimiento eficaz para asegurar la adquisicion de celulas diana mientras se elimina una cantidad sustancial de desechos y otras sustancias interferentes antes del analisis, lo que permite el examen celular por tecnicas de imagenes. El metodo combina elementos de enriquecimiento inmunomagnetico con citometna de flujo de multiples parametros, microscopia y analisis inmunocitoqmmico de una manera automatizada de forma exclusiva. El metodo de combinacion se usa para enriquecer y enumerar celulas epiteliales en muestras de sangre, proporcionando de este modo una herramienta para medir el cancer.

El metodo de dos fases tiene aplicaciones en el pronostico del cancer y en la supervivencia de pacientes con cancer metastasico (documento WO 04076643). Basandose en la presencia de celulas cancerosas en circulacion morfologicamente intactas en la sangre, este metodo es capaz de correlacionar la presencia de celulas cancerosas en circulacion de pacientes con cancer mama metastasico con el tiempo hasta la progresion de la enfermedad y la supervivencia. Mas espedficamente, la presencia de cinco (5) o mas celulas tumorales en circulacion por 7,5 mililitros proporciona un valor predictivo en el primer seguimiento, proporcionando de este modo un indicador pronostico prematuro de supervivencia del paciente.

La especificidad del ensayo descrito anteriormente aumenta con la cantidad de celulas detectadas y no es suficiente en casos en los que se detectan solamente unas pocas (generalmente menos de 5 celulas tumorales en circulacion). Una solucion a este problema es proporcionar informacion genetica detallada acerca de las celulas cancerosas sospechosas. Por consiguiente, un metodo que incorporana el enriquecimiento de una muestra de sangre con citometna de imagenes de multiples parametros y analisis genetico de multiples parametros en una celula cancerosa sospechosa individual proporcionana un perfil completo y un mecanismo de confirmacion para mejorar significativamente los procedimientos actuales para la seleccion de pacientes, la evaluacion de recidiva de la enfermedad o supervivencia global.

La hibridacion in situ fluorescente (FISH) se ha descrito como un modo unico de analisis en la deteccion de celulas infrecuentes despues del enriquecimiento como se describe en el documento WO 00/60119; Meng et al., PNAS 101 (25): 9393-9398 (2004); Fehm et al., Clin Can Res 8: 2073-2084 (2002) y se incorpora por referencia en este documento. Despues del enriquecimiento de celulas epiteliales, las celulas capturadas se exploran por metodos conocidos de hibridacion y toman imagenes en un portaobjetos de microscopio. A causa de las variaciones tecnicas inherentes y de la ausencia de confirmacion satisfactoria de la informacion genetica, el patron de hibridacion en solitario no proporciona un nivel de confianza clmica que sena necesario para el analisis sensible, como en la evaluacion de muestras con menos de 5 celulas diana. Ademas, este metodo para analisis FISH es diffcil de automatizar.

Los metodos basados en hibridacion de acoplamiento con inmunocitoqmmica en el analisis de celulas individuales se han descrito previamente (documento 6.524.798). La evaluacion fenotfpica y genotfpica simultanea de celulas individuales requiere que las caractensticas fenotfpicas permanezcan estables despues de las etapas de preparacion de hibridacion in situ y estan limitadas en la eleccion de marcadores detectables. Tfpicamente, los ensayos de hibridacion in situ convencionales requieren las siguientes etapas: (1) desnaturalizacion con calor o alcali; (2) una etapa opcional para reducir la union no espedfica; (3) hibridacion de una o mas sondas de acido nucleico con la secuencia de acido nucleico diana; (4) eliminacion de fragmentos de acido nucleico no unidos; y (5) deteccion de las sondas hibridadas. Los reactivos usados para completar una o mas de estas etapas (es decir, lavado con metanol) alteraran el reconocimiento de antfgenos en la posterior inmunocitoqmmica, causara pequenos

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desplazamientos en la posicion de las celulas diana o eliminara completamente las celulas diana, lo que introduce la posibilidad de una caracterizacion erronea de las celulas sospechosas.

Los conjuntos de sondas y metodos para el analisis FISH de multiples parametros se han descrito en cancer pulmonar (documento US 20030087248). Tambien se ha descrito una combinacion de 3 sondas que produce una sensibilidad de un 95 % para detectar cancer de vejiga en pacientes, veanse los documentos US 6.376.188; US 6.174.681. Estos metodos carecen de especificidad y de sensibilidad para evaluar pequenas cantidades de celulas diana y, por tanto, de una evaluacion de confirmacion para deteccion prematura del estado patologico. Tampoco proporcionan un medio para la automatizacion conveniente.

Sumario de la invencion

Generacion de sondas de ADN de repeticiones reducidas

La presente invencion proporciona un metodo para producir sondas de acido nucleico complementarias a una secuencia diana, de acuerdo con la reivindicacion 1.

El metodo de la invencion es capaz de eliminar secuencias repetitivas de ADN. Cualquier ADN bicatenario es una fuente adecuada en la aplicacion de los metodos de la presente invencion. Para obtener ADN monocatenario, desprovistos de secuencias repetitivas, en primer lugar, se prepara una biblioteca del genoma completo amplificado a partir del ADN fuente de acuerdo con procedimientos convencionales. La biblioteca obtenida consiste en fragmentos seleccionados aleatoriamente que vanan en tamano de aproximadamente 200 a 500 pares de bases. Cada fragmento consiste en ADN bicatenario, que tiene secuencias cebadoras de PCR en cada extremo de una secuencia diana. Generalmente, esta biblioteca es representativa del ADN fuente. Otros metodos que producen fragmentos modificados de ADN para permitir la amplificacion tambien se consideran en esta invencion sin lfmite al tamano de los fragmentos. Estos incluyen, aunque sin limitacion, reaccion en cadena de la polimerasa cebada con oligonucleotido degenerado (DOP PCR), drculos rodantes y metodos de amplificacion isotermica. Los fragmentos de ADN bicatenarios se desnaturalizan por calentamiento hasta 95 °C u otros medios para obtener fragmentos de ADN monocatenario. Los fragmentos de ADN monocatenario resultantes contienen secuencias repetitivas, secuencias unicas o una combinacion de secuencias unicas y repetitivas. Se anade un exceso de ADN Cot o de otro ADN restador apropiado que se una a secuencias repetitivas. La disminucion posterior de la temperatura provoca la formacion de aDn bicatenario para solamente aquellos fragmentos que contienen secuencias repetitivas. Se anade nucleasa espedfica de duplex (DSN) para permitir la digestion de ADN bicatenario. En una realizacion, la enzima de DSN se anade durante 2 horas a 65 °C. La composicion resultante contiene principalmente ADN monocatenario, que tiene solamente secuencias unicas y ADN digerido. La secuencia unica, ahora ADN monocatenario con cebadores de PCR en ambos extremos, se usa como molde para generar grandes cantidades de la secuencia unica para su uso en la produccion de sondas. Cuando los clones de BAC que contienen una secuencia unica deseada se usan como ADN fuente, el molde generado por este metodo contiene solamente esa secuencia unica. Cuando las secuencias de los lfmites son conocidas, este metodo es util en la obtencion de sondas que cubren los nucleotidos entre las secuencias del lfmite en el ADN genomico. Las secuencias de ADN de repeticiones reducidas producidas de acuerdo con la invencion funcionan como sondas de hibridacion sin el uso de un ADN de bloqueo en ninguna aplicacion apropiada que requiera deshabilitar o bloquear secuencias de ADN indeseadas.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: Representacion esquematica que representa la generacion de sondas de ADN de repeticiones reducidas a partir de ADN de partida de BAC. Se desnaturaliza una biblioteca de amplificacion del genoma completo fragmentado y se permite que vuelva a hibridar en presencia de ADN Cot en exceso. La digestion con DSN del ADN bicatenario produce una mezcla de la secuencia unica monocatenaria, disponible como molde para la produccion de las sondas.

Figura 2: Representacion esquematica que representa la escision de una secuencia de ADN espedfica a partir de una fuente de ADN y la produccion de clones de la misma. El ADN bicatenario de una fuente apropiada se desnaturaliza y se permite que la secuencia de ADN espedfica hibride. La digestion con DSN del ADN bicatenario seguida por separacion del ADN monocatenario por tamano provoca el aislamiento del ADN monocatenario deseado. Despues de la smtesis de la segunda hebra, el ADN deseado se clona en un vector apropiado para la produccion.

Figura 3: Comparacion usando sondas de repeticiones reducidas en analisis FISH. Se hibridaron globulos blancos con una sonda Her-2 que contema repeticiones y sin ADN de bloqueo. En ausencia de ADN de bloqueo, la sonda marca el nucleo completo despues de la hibridacion con regiones repetidas. El panel A muestra los globulos blancos hibridados con una sonda FISH de Her-2 que contiene repeticiones y sin ADN de bloqueo. El panel B muestra las mismas celulas despues del marcaje del nucleo con DAPI. El panel C muestra la superposicion de las dos senales y la ausencia de resolucion de Her-2. El panel D muestra el analisis FISH sobre globulos blancos usando una sonda de repeticiones reducidas de Her-2. Las flechas indican las localizaciones de la secuencia cromosomica unica para Her-2. El panel E muestra las mismas celulas despues de marcar el nucleo

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con DAPI. El panel F muestra la superposicion del panel D y E, que visualiza la localizacion del sitio Her-2 dentro del nucleo de la celula.

Figura 4: El panel A muestra una dispersion de cromosoma hibridado con una sonda libre de repeticiones marcada con PI 6 (CDKN2A) dirigida a 9p21 frecuentemente usada para caracterizar melanoma. Dos cromosomas muestran la presencia de 9p21 y se ilustran por las flechas. El panel B muestra una dispersion de cromosoma hibridado con sonda libre de repeticiones marcada con MLL dirigida a 11q23 usada para identificar un tipo espedfico de leucemia. Dos cromosomas muestran la presencia de 11 q23 como se ilustra por las flechas.

Descripcion detallada de la invencion

Generacion de sondas de ADN de repeticiones reducidas

El ADN contiene secuencias unicas, asf como repetitivas. Las secuencias repetitivas se producen por todos los cromosomas y tienen el potencial de impedir las reacciones de hibridacion, tal como con hibridacion in situ, estan dirigidas a regiones espedficas o secuencias unicas fuera de estas secuencias repetitivas. Para identificar la presencia, cantidad y localizacion de secuencias espedficas en cromosomas, genes o secuencias de ADN es importante que las sondas de hibridacion hibriden solamente en la localizacion de interes. La presencia de secuencias repetitivas en la mezcla de sondas de hibridacion reduce la especificidad de la union, lo que requiere metodos para eliminar las secuencias repetitivas de las sondas o evitar que las sondas hibriden con las secuencias repetitivas en la diana. Por ejemplo, el ADN Cot-1 se anade a menudo durante la hibridacion para evitar la union de las sondas a las secuencias repetitivas (documentos US 5.447.841 y US 6.596.479).

Contribuciones recientes han abordado esta cuestion deshabilitando las secuencias repetitivas. El uso de ADN Cot-1 depende de la capacidad del ADN Cot-1 de formar una estructura duplex con secuencias repetidas monocatenarias disponibles y, de ese modo, minimiza la interaccion de union no espedfica de esta parte de la secuencia con la secuencia diana unica. El bloqueo del ADN repetitivo, durante una etapa de hibridacion con la secuencia diana unica o antes como en la etapa previa a la asociacion, produce una mezcla que tiene segmentos repetitivos que forman estructuras duplex con su secuencia complementaria y una forma monocatenaria de la sonda diana, disponible para hibridacion con su segmento diana unico. Desafortunadamente, la presencia de este duplex en una amplificacion posterior o reaccion de marcaje afecta a la senal a traves de la introduccion de ruido no espedfico, especialmente en situaciones donde la senal es muy debil. Una alternativa al bloqueo de la secuencia repetitiva es eliminar los segmentos repetidos indeseados de la mezcla de reaccion.

La generacion de sondas de ADN de repeticiones reducidas de esta invencion se representa en la figura 1. Una realizacion de la presente invencion hace uso de nucleasas espedficas de duplex (DSN) que escinde preferentemente moleculas de acido desoxirribonucleico (documentos US 2005/0164216 y US 6.541.204). La capacidad de la enzima de escindir preferentemente polinucleotidos duplex de acido nucleico en comparacion con aDn monocatenario proporciona un medio para eliminar el ADN bicatenario que no es diana de la mezcla de muestra. La capacidad de estas nucleasas de digerir preferentemente la forma duplex de los polinucleotidos proporciona el uso potencial en la fabricacion de una sonda espedfica de diana unica, eliminando el efecto interferente del ADN de bloqueo y proporcionando un medio para su produccion rapida, eficaz y rentable.

El ADN de partida usado en la practica de esta invencion tfpicamente esta en forma de una o mas secuencias de ADN que contienen una multiplicidad de segmentos de ADN. La fuente inicial de material de partida individual en la produccion de la composicion de sondas se ha descrito en la produccion de sondas marcadas directas (documento US 6.569.626). De forma optima, la fuente del polinucleotido de partida se purifica de un tejido y se fragmenta en segmentos de 150 kb a 200 kb, usando cualquier tecnica conocida tal como, aunque sin limitacion, tratamiento enzimatico (enzimas de restriccion), polimerasa, digestion limitada con DNasa I, digestion con nucleasa limitada de la judfa mungo, sonicacion, corte de ADN y similares. Algunos de estos fragmentos segmentarios seran complementarios a al menos una parte de uno o mas segmentos de ADN en la secuencia diana unica particular. Los segmentos de ADN individuales se propagan por metodos habitualmente conocidos, tales como clonacion en una construccion plasmfdica y despues se transfectan en bacterias. Despues de propagar los fragmentos clonados, las colonias individuales que representan fragmentos aislados se identifican como que contienen al menos una parte de la secuencia de interes. La identificacion se consigue por tecnicas conocidas tales como hibridacion, PCR o busquedas en bases de datos establecidas de bibliotecas disponibles en el mercado. Cada colonia elegida se cultiva para obtener una construccion plasmfdica aislada que tiene un fragmento unico, al menos parcialmente complementario a un segmento de la secuencia diana en el cromosoma. Las secuencias diana ejemplares incluyen HER-2, IGF-I, MUC-I, EGFR y AR y pueden estar disponibles a traves de vendedores comerciales (es decir, clones de BAC). Una vez los fragmentos clonados de interes se han propagado y aislado, se reducen de sus secuencias polinucleotfdicas repetitivas. Usando amplificacion de gen completo (wGa), los fragmentos se amplifican como segmentos de 200 a 500 pb de las construcciones plasmfdicas aisladas. La DOP PCR disponible en el mercado se considera una realizacion para esta parte del procedimiento. El ADN Cot-1 se combina con la combinacion de biblioteca WGA despues de la amplificacion calentando primero hasta 95 °C para desnaturalizar el polinucleotido bicatenario en un estado monocatenario y despues enfriando hasta 65 °C para permitir una re-hibridacion selectiva de las secuencias repetidas. Las nucleasas espedficas de duplex (DSN) en condiciones de DSN optimizadas se

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anaden despues para escindir de forma preferente moleculas de acido desoxirribonucleico que contienen duplex de acido nucleico perfectamente coincidentes sin afectar al mismo tiempo a ningun segmento monocatenario restante. La escision selectiva de los acidos nucleicos duplex se consigue por digestion enzimatica de duplex de ADN-ADN y duplex de ADN-ARN. Las realizaciones espedficas de la presente invencion incluyen DSN aislada del cangrejo Kamchatka (documento US 10/845,366) o camaron (documento US 6.541.204), pero se considera cualquier eliminacion enzimatica de la estructura duplex en la presente invencion. El uso de nucleasas espedficas de endonucleasa hidroliza un enlace fosfodiester en la estructura de ADN duplex, proporcionando la ventaja de no ser espedfica de secuencia de nucleotidos y, por lo tanto, aplicable a la mayona de diana de interes. La digestion con DSN proporciona la eliminacion de una cantidad sustancial del duplex de acido nucleico para la posterior amplificacion del polinucleotido monocatenario restante. Una realizacion de la presente invencion es una digestion de 2 horas con dSn a 65 °C. La composicion resultante contiene ADN monocatenario, correspondiente a partes de la secuencia diana unica en el cromosoma, alguna cantidad de ADN bicatenario no digerido y pares de bases digeridas. Preferiblemente, el ADN no digerido se separa del ADN digerido y la DSN por centrifugacion (es decir, cromatograffa en columna de centrifugacion). La mezcla se usa inmediatamente o se almacena a 80 °C, antes o despues de la amplificacion de la composicion purificada para la posterior utilizacion, tal como marcaje y uso para hibridacion in situ. Despues de la amplificacion, la secuencia de sonda diana resultante se amplifica por PCR produciendo una secuencia de sonda diana de un 90 % a un 99 % pura, y denominada ADN de repeticiones reducidas.

El uso de DSN en el enriquecimiento y aislamiento de un polinucleotido monocatenario a partir de una doble hebra es aplicable en la produccion de cualquier polinucleotido monocatenario donde la separacion de la entidad monocatenaria de los contaminantes bicatenarios es deseable. Esto es particularmente relevante, aunque sin limitacion, en la produccion de sondas marcadas para la identificacion de genes o de cromosomas, el cariotipado o paneo de una combinacion de polinucleotidos monocatenarios y bicatenarios.

La produccion de las sondas resultantes se incorpora en la materia objeto plasmada en la presente invencion. El ADN de repeticiones reducidas, producido de acuerdo con la presente invencion, es util para hibridacion in situ, incluyendo FISH y todos los demas ensayos de hibridacion de acidos nucleicos. El requisito para la union competitiva se elimina usando las sondas de repeticiones reducidas producidas de acuerdo con esta invencion, provocando una especificidad aumentada de la reaccion y una reduccion en la cantidad de sondas necesarias para la union.

El metodo de nucleasa espedfica de duplex

Para preparar una sonda de hibridacion hacia una secuencia diana, se obtiene el ADN que contiene la secuencia de interes. Los metodos para obtener ADN que contiene secuencias de interes seran conocidos para los expertos en la materia e incluyen, sin limitacion, el aislamiento de ADN genomico de tejidos o de celulas, la clasificacion en flujo de los cromosomas y la exploracion de bibliotecas de fragmentos clonados de cromosomas por hibridacion, electronicamente o por PCR.

El ADN de partida usado en la practica de esta invencion se purifica de una fuente por cualquier metodo. Tfpicamente, el ADN de partida consiste en genomas, cromosomas, partes de cromosomas o fragmentos clonados de cromosomas. Los cromosomas clasificados en flujo y los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) que se sabe que contienen secuencias diana de genes relacionados con cancer hacen que la presente invencion sea particularmente aplicable. Las secuencias diana ejemplares incluyen HER-2, IGF-I, MYC, EGFR, y AR. Los clones de BAC que contienen estas secuencias estan disponibles a traves de vendedores comerciales.

Una vez que el ADN que contiene las secuencias de interes se ha identificado y obtenido, se reduce de las secuencias polinucleotfdicas repetitivas. Este proceso comienza fragmentando y preparando una biblioteca que contiene la secuencia de interes. Un metodo es el metodo de amplificacion de genoma completo (wGa) GenomePlex® (WGA) (GenomePlex® es una marca de Rubicon Genomics, Inc.) que escinde aleatoriamente los fragmentos clonados en fragmentos de 200-500 pb y une secuencias conectoras que despues pueden usarse para amplificar y volver a amplificar la biblioteca usando PCR. En este ejemplo, la biblioteca amplificada y fragmentada se considera el ADN fuente. Para eliminar las secuencias repetitivas, el ADN fuente se desnaturaliza hasta un estado monocatenario y despues se enfna en condiciones que permiten selectivamente que las secuencias repetitivas hibriden para formar moleculas bicatenarias y secuencias unicas que permanecen monocatenarias. Despues se anade una nucleasa espedfica de duplex (DSN) que escinde preferentemente los fragmentos repetitivos bicatenarios sin escindir las secuencias unicas monocatenarias. La mezcla resultante contiene ADN monocatenario, correspondiente a partes de la secuencia diana unica en el cromosoma, alguna cantidad de ADN bicatenario no digerido y pares de bases digeridas. Preferiblemente, el ADN no digerido se separa del ADN digerido y la DSN por cromatograffa en columna de centrifugacion, extraccion cron fenol y cloroformo o por algun otro metodo similar, pero no se requiere separacion. Despues, la biblioteca de repeticiones reducidas se usa como sonda de hibridacion o se vuelve a amplificar usando PCR para preparar cantidades mas grandes de ADN sonda. Despues de la amplificacion, la secuencia de sonda diana resultante es una secuencia de sonda diana de un 90 % a un 99 % pura, y denominada ADN de repeticiones reducidas.

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La fragmentacion de la biblioteca y los metodos de amplificacion descritos anteriormente no pretenden ser limitantes, sino que en su lugar sirven como ejemplo del modo de uso de un metodo de fragmentacion y amplificacion para preparar sondas de repeticiones reducidas. Existen numerosos metodos de fragmentacion y amplificacion de acidos nucleicos incluyendo PCR con conector-adaptador, DOP PCR, amplificacion por drculo rodante, amplificacion mediada por transcripcion y todos los demas metodos considerados en esta invencion. Se espera que sea necesaria alguna modificacion del metodo anterior para preparar ADN de repeticiones reducidas para adaptar los diferentes metodos de fragmentacion de bibliotecas y amplificacion y estas modificaciones tambien se incluyen en la presente invencion.

Una consideracion en esta invencion es el uso de una enzima que es capaz de escindir ADN bicatenario sin escindir ADN monocatenario. Las enzimas incluidas en esta invencion pueden escindir ADN bicatenario de cualquier manera, incluyendo lisis de la estructura de azucar-fosfato, eliminacion de una o ambas hebras en un duplex de ADN o eliminacion de bases nitrogenadas para formar sitios apurmicos/apirimidmicos. Los ejemplos no limitantes de estas enzimas incluyen endonucleasas, exonucleasas, enzimas de restriccion, enzimas de mellado, enzimas de reparacion de ADN, topoisomerasas, ADN girasas y enzimas implicadas en la recombinacion homologa. Las realizaciones espedficas de la presente invencion incluyen DSN aislada del cangrejo Kamchatka (documento US 10/845.366), camaron (documento US 6.541.204), Endonucleasa I de T7, y exonucleasa III de E. coli.

La concentracion de enzimas, el tiempo de digestion y las condiciones de tampon tales como concentracion salina y de iones magnesio son factores que puede afectar a la especificidad de la DSN hacia ADN bicatenario. La optimizacion de estas condiciones es necesaria para obtener una reduccion eficaz de las repeticiones.

La eficacia y la especificidad de la eliminacion de repeticiones en esta invencion dependen de las condiciones de reaccion usadas para desnaturalizar y re-hibridar, asf como de las condiciones presentes durante la digestion con la DSN. La desnaturalizacion se consigue por alcali o por calentamiento. El grado de re-hibridacion de ADN depende de la concentracion de ADN presente en las muestras y del tiempo permitido para la re-hibridacion. Para que se produzca una re-hibridacion selectiva de las secuencias repetitivas, las secuencias repetidas deben estar presentes en una concentracion mayor que las secuencias unicas. La relacion de secuencias repetidas a unicas dentro de un clon particular variara de una region a otra en todo el genoma. Para normalizar el proceso de reduccion entre regiones con cantidades variables de secuencias repetidas, se anade un exceso de ADN restador a la reaccion. La masa de ADN restador anadido vana dependiendo de la cantidad deseada de eliminacion de repeticiones y es preferiblemente 10-50 veces la masa del ADN fuente. La presente invencion considera que un restadores cualquier acido nucleico o analogo de acido nucleico que contiene secuencias suficientemente homologas en la secuencia de nucleotidos a las secuencias repetitivas para permitir la hibridacion entre las secuencias restadoras y una parte de las secuencias en el ADN fuente, haciendo que la secuencia restadora sea util. Una realizacion de la presente invencion incluye ADN Cot-1 como ADN restador que se usa para eliminar las secuencias repetitivas del ADN fuente.

La rigurosidad de la re-hibridacion es otro componente en la presente invencion. La concentracion salina y la temperatura son factores que determinan la rigurosidad de cualquier etapa de re-hibridacion. El grado de eliminacion de repeticiones se controla ajustando las condiciones de rigurosidad para esta etapa. El ajuste de las condiciones de rigurosidad para permitir algun grado de hibridacion entre las secuencias que no son 100 % homologas, mejora el grado de eliminacion de las repeticiones. Las concentraciones salinas vanan de 5 milimolar a 1000 milimolar de NaCl con temperaturas de hibridacion que vanan de 15 °C a 80 °C.

En una realizacion, el proceso de reduccion de repeticiones se realiza de modo que la re-hibridacion y la digestion con DSN se produzcan de forma secuencial. Por consiguiente, el ADN se desnaturaliza y se deja enfriar durante un periodo de tiempo en condiciones optimizadas para la hibridacion. Despues, las condiciones de reaccion se cambian a condiciones que optimizan la especificidad y la actividad de la digestion con DSN. En otra realizacion, la re- hibridacion y la digestion con DSN tienen lugar simultaneamente, en las mismas condiciones.

Tambien dentro del alcance de esta invencion, el ADN fuente o restador se trata con un agente, qmmico o ffsico, antes o durante la digestion enzimatica para alterar la especificidad de una enzima hacia las fracciones monocatenarias o bicatenarias dentro de la mezcla. Por ejemplo, se anade la protema RecA de E. coli a una mezcla de ADN monocatenario y bicatenario. Esta protema recubre el ADN monocatenario en la mezcla y protege el ADN monocatenario de la DNasa RecBC de E. coli permitiendo al mismo tiempo que el ADN bicatenario en la mezcla se digiera ("Escherichia coli RecA protein protects singles stranded DNA or Gapped Duplex DNA from degradation by RecBC DNase". Williams, JGK, Shibata, T. Radding, CM Journal of Biological Chemistry V246 n.° 14 pags. 75737582). Tambien es posible generar ADN fuente o restador usando nucleotidos modificados que alteran la especificidad de una enzima hacia las fracciones de ADN monocatenario o bicatenario.

El uso de DSN en el enriquecimiento y aislamiento de un polinucleotido monocatenario de la doble hebra es aplicable en la produccion de cualquier polinucleotido monocatenario donde la separacion de la entidad monocatenaria de los contaminantes bicatenarios es deseable. Esto incluye la eliminacion de cualquier secuencia indeseable de un ADN fuente. Estas secuencias indeseables incluyen, sin limitacion, secuencias repetitivas, secuencias unicas y secuencias de vector. Este metodo es particularmente relevante en la produccion de sondas

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marcadas para la identificacion de genes o de cromosomas, el cariotipado o el paneo de una combinacion de polinucleotidos monocatenarios y bicatenarios.

El metodo de union selectiva

Desnaturalizando el ADN fuente y permitiendo selectivamente que las secuencias repetitivas hibriden, se usa cualquier agente que se una preferentemente a una estructura de ADN monocatenaria o bicatenaria para eliminar las secuencias repetidas del ADN fuente. Los ejemplos de estos agentes incluyen, sin limitacion, polinucleotidos de ADN o de ARN, enzimas, anticuerpos, protemas de union a ADN, combinaciones de anticuerpos y agentes de union a ADN, y compuestos o moleculas naturales o sinteticas. Los agentes de union a ADN pueden ligarse directa o indirectamente a un soporte solido que permite la seleccion cromatografica positiva o negativa de secuencias unicas o repetitivas. Un ejemplo incluye la separacion de ADN monocatenario y bicatenario usando anticuerpos biotinilados contra ADN monocatenario o bicatenario. La poblacion deseada se separa usando partfculas paramagneticas recubiertas con estreptavidina. Como alternativa, un anticuerpo biotinilado contra un agente de union a ADN que se une preferentemente a ADN monocatenario o bicatenario se usa de la misma manera.

Otras enzimas espedficas de hebra sencilla o doble hebra

La presente invencion tambien puede incluir el uso de cualquier enzima que actue preferentemente sobre ADN monocatenario o bicatenario en la modificacion del ADN fuente o restador al facilitar la eliminacion de repeticiones. Un ejemplo no limitante es ligar selectivamente un conector de ADN a la poblacion de ADN bicatenario despues de la desnaturalizacion y re-hibridacion selectiva de las repeticiones. Este conector se hibrida a un oligonucleotido homologo unido a una partfcula magnetica (o paramagnetica) para eliminar las secuencias repetitivas. Un segundo ejemplo es usar una aDn/ARN monocatenario ligasa para circularizar selectivamente ADN monocatenario presente despues de la desnaturalizacion y re-hibridacion selectiva del ADN fuente. Los drculos resultantes despues se amplifican y enriquecen por amplificacion por drculo rodante.

Separacion espedfica de estructura de secuencias repetitivas

Ademas de los metodos de produccion de sondas espedficas y basandose en la separacion de ADN monocatenario del ADN bicatenario, la presente invencion considera cualquier metodo conocido en la tecnica por el cual se produce la separacion de secuencias repetidas de secuencias unicas con el establecimiento de alguna estructura de ADN detectable en las secuencias repetidas o en las secuencias unicas y esta estructura detectable se usa para separar una poblacion de la otra. Algunos ejemplos de estructuras de ADN detectable incluyen, sin limitacion, ADN de hebra triple o de hebra cuadruple, horquillas, franjas, solapas, ADN-Z, uniones de Holliday y otras estructuras formadas durante la recombinacion. Estas estructuras pueden producirse de forma natural dentro de las secuencias de interes o pueden inducirse por modificacion del acido nucleico fuente o del acido nucleico restador o ambos.

Digestion selectiva de secuencias repetidas

Otro metodo para eliminar las secuencias repetidas del ADN fuente es digerir una biblioteca de ADN fragmentado y amplificado con una enzima de restriccion cuya secuencia de reconocimiento se sabe que existe en las secuencias de ADN repetitivo. Cuando el ADN fuente digerido se vuelve a amplificar por PCR, la biblioteca restante se enriquecera para las secuencias unicas y se reducira de secuencias que contienen repeticiones.

Digestion y ligamiento selectivo

Otro metodo para preparar sondas de repeticiones reducidas es digerir el ADN diana con dos enzimas de restriccion para dejar diferentes salientes en la secuencia digerida. La primera enzima de restriccion es preferiblemente una enzima que corta dentro de las secuencias repetidas y la segunda es una enzima que no corta dentro de las secuencias repetidas. Despues de la digestion, los conectores se unen selectivamente a los extremos de las secuencias cortadas por la segunda enzima de restriccion. Estas secuencias conectoras despues se usan para amplificar por PCR una biblioteca, reducida de secuencias repetidas. El ADN de repeticiones reducidas resultante, tanto la composicion como la produccion, se incorporan en la presente invencion. El ADN de repeticiones reducidas, como se describe en la presente invencion, es util como sonda para cualquier tipo de ensayo de hibridacion donde se desea la union espedfica de las secuencias diana. Estas tecnicas incluyen, sin limitacion, ISH, FISH, CGH, cariotipado espectral, tincion de cromosomas, transferencia de Southern, transferencia de Northern y micromatrices. La produccion de sondas de hibridacion que solamente contienen secuencias unicas es una realizacion de la presente invencion. Por consiguiente, la necesidad de union competitiva se elimina, produciendo un aumento en la especificidad de la reaccion y reduciendo la cantidad de sondas necesarias para la union.

Uso de nucleasa espedfica de duplex para escindir ADN en una localizacion deseada

El uso de nucleasas espedficas de duplex tiene utilidad en la escision de secuencias espedficas del ADN. La figura 2 muestra una representacion esquematica de esta realizacion. El ADN monocatenario se obtiene de una fuente de ADN, que contiene la secuencia deseada. Los oligonucleotidos que identifican ambos extremos de la secuencia

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deseada se anaden y las nucleasas espedficas de duplex se introducen para cortar la sonda de ADN deseado del ADN fuente. Despues de separar la sonda de ADN deseada por exclusion por tamanos, se sintetiza el ADN de segunda hebra y se clona para proporcionar una fuente de sondas de ADN. Por tanto, las nucleasas espedficas de duplex se usan para escindir secuencias de ADN en regiones espedficas. Este metodo es muy util en la clonacion de fragmentos de interes que son demasiado grandes para amplificar por PCR y cuando los fragmentos carecen de sitios apropiados de enzimas de restriccion. Estos fragmentos entonces pueden usarse como sondas de hibridacion, secuenciarse o usarse para cualquier otro proposito. En la figura 2, se disenan dos oligonucleotidos para que hibriden con una o ambas hebras del ADN, y para que flanqueen la secuencia de interes. El ADN que contiene una secuencia de interes se desnaturaliza y se deja re-hibridar en presencia de un exceso de los oligonucleotidos flanqueantes. La digestion con una nucleasa espedfica de duplex corta selectivamente el ADN en el sitio donde se hibridan los oligonucleotidos. Las moleculas de ADN monocatenario restantes se fraccionan por tamano para obtener la secuencia de interes. La secuencia de interes se hace bicatenaria usando una ADN polimerasa y clona en un plasmido. Por tanto, se generan posibilidades para clonar o subclonar secuencias de interes a partir de polinucleotidos de ADN mas grandes. Un segundo ejemplo de escision espedfica de sitio es la recuperacion de fragmentos clonados de vectores plasmfdicos por digestion selectiva de los vectores. En un ejemplo, el plasmido que contiene el fragmento de ADN clonado se desnaturaliza y se deja re-hibridar en presencia de plasmido en exceso, que carece de ADN clonado. Ademas, una nucleasa espedfica de duplex escinde las secuencias plasmfdicas y deja el ADN clonado monocatenario intacto. El ADN monocatenario restante entonces se usa para cualquier aplicacion conocida en la tecnica incluyendo, aunque sin limitacion, secuenciacion o subclonacion.

Ejemplo 1 - Deteccion de cromosomas o partes de cromosomas usando sondas de ADN de repeticiones reducidas

Se selecciono el clon de BAC CTD-2019C10 para usarse como sonda para el gen Her-2 por seleccion electronica del genoma humano usando el software UCSC (
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hg- Gateway) y los clones se obtuvieron de Invitrogen (Carlsbad, CA). Se aislo el aDn de BAC usando el kit de construccion grande de Qiagen (Valencia, CA). Se preparo en el ADN fuente usando 10 nanogramos de BAC purificado y el kit de amplificacion de genoma total completo Genomeplex® (Sigma-Aldrich St. Louis, MO) de acuerdo con las directrices del fabricante. Se prepararon mezclas de reduccion que conteman 2 microgramos de ADN Cot-1, tampon de nucleasa espedfica de duplex 1x (Evrogen, Moscu, Rusia), NaCl 0,3 M y 66 nanogramos de ADN fuente. Las mezclas de reduccion se desnaturalizaron durante 5 minutos a 95 °C, se pusieron en hielo durante 10 segundos y se anadio 1 unidad de nucleasa espedfica de duplex (Evrogen, Moscu, Rusia). Las muestras se incubaron a 65 °C durante 90 minutos. Se purificaron 5 microlitros de la reaccion usando el kit de limpieza de PCR Genelute (Sigma-Aldrich St. Louis, MO) y el ADN purificado se eluyo en alfcuotas de 50 microlitros. Despues se volvieron a amplificar 15 microlitros de las muestras reducidas por PCR usando el kit de re-amplificacion de genoma completo (Sigma-Aldrich St. Louis, MO). Las reacciones de PCR se purificaron como se describe y se cuantificaron basandose en su A260. Se usaron 10 nanogramos de la primera mezcla de re-amplificacion como molde en usa segunda re-amplificacion, purificada como se describe. Este material se sonico hasta un peso molecular promedio de 200-500 pares de bases, se precipito en etanol y se resuspendio en H2O destilada. El ADN resultante se marco de forma fluorescente usando el kit de rojo/naranja brillante de platino Kreatech ULS (Kreatech, Amsterdam, Pafses Bajos). Para las comparaciones, tambien se prepararon sondas con repeticiones del ADN fuente que se uso en el proceso de reduccion.

Se prepararon globulos blancos estimulados con fitohemaglutinina para FISH por fijacion en metanol al 75 %, acido acetico al 25 % y se aplico puntualmente sobre portaobjetos usando tecnicas convencionales. Las sondas de repeticiones reducidas y las sondas de ADN fuente se hibridaron a 2 ng/pl con ADN de bloqueo Cot en un tampon de hibridacion que consistfa en formamida al 50 %, sulfato de dextrano al 10 % y SSC 1x. Los portaobjetos y la sonda se co-desnaturalizaron a 80 °C durante 3 minutos y se hibridaron durante una noche a 37 °C. Despues de la hibridacion, las muestras se lavaron durante 5 minutos a 50 °C en SSC 0,5x, SDS al 0,001 %. Las muestras se tineron con contraste en 0,5 pg/ml de DAPI durante 5 minutos y se montaron en glicerol al 50 %. Se adquirieron imagenes usando un microscopio fluorescente Leica DM-RXA (Leica Microsystems, Bannockburn, IL) equipado con filtros apropiados para rodamina y DAPI. Se adquirieron imagenes con una camara digital en blanco y negro Photometries SynSys (Photometries, Tucson, AZ). Las senales DAPI se potenciaron y se generaron imagenes superpuestas usando el software Leica FW 4000. Las imagenes de Her-2 estan sin editar y se capturaron usando configuraciones identicas de camara con propositos de comparacion. La figura 3 representa una comparacion de las imagenes. El panel A muestra que cuando el ADN fuente que contiene las repeticiones se usa como sonda de hibridacion, las sondas tinen el nucleo completo y no son visibles senales espedficas de Her-2. Cuando se usa ADN de repeticiones reducidas como sonda (panel D) son claramente detectables (flechas) senales espedficas que corresponden al gen Her-2.

Ejemplo 2 - Las sondas de ADN reducidas de secuencias repetidas de acuerdo con esta invencion mejoran la visualizacion de sondas de ADN marcadas de forma fluorescente en comparacion con sondas de ADN tradicionales que contienen repeticiones que se bloquean durante el procedimiento

La relacion de senal a ruido de las sondas marcadas de forma fluorescente se mejora significativamente cunado se emplean sondas de ADN de repeticiones reducidas obtenidas de acuerdo con la invencion. Para esta comparacion, se usaron sondas de ADN dirigidas a 9p21 y 11q23 como saben los expertos en la materia. Estas senales son problematicas porque son senales relativamente pequenas y diffciles de discernir. Las sondas se redujeron de

secuencias repetidas de acuerdo con la invencion y se uso una molecula indicadora fluorescente unida a un grupo de platino que forma un enlace coordinador en la posicion N7 de guanina para marcar de forma fluorescente las sondas (ULS labeling, Kreatech, Amsterdam). La figura 4 paneles A y B muestra una dispersion de cromosoma hibridado con la sonda 9p21 marcada con rodamina y 11q23 marcada con dGreen respectivamente. Pueden 5 discernirse senales claras de las sondas sin repeticiones con las sondas sin repeticiones como se indica por las flechas en las figuras. Por tanto, la visualizacion de la presencia de estas sondas es superior a la que se obtiene usando sondas que se obtienen a traves de metodos tradicionales. Esta mejora en la visualizacion proporciona un diagnostico diferencial mas preciso de melanoma (panal A, 9p21, Pl 6 (CDKN2A) de y leucemia (Panel B, 11q23, MLL).

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para producir sondas de acido nucleico complementarias a una secuencia diana, que comprende las etapas de:

   a. obtener polinucleotidos bicatenarios que se sabe que contienen secuencias diana complementarias y secuencias repetitivas;

   b. fragmentar dichos polinucleotidos bicatenarios en fragmentos;

   c. desnaturalizar dichos fragmentos en hebras individuales;

   d. hibridar dichas secuencias repetitivas para formar una mezcla de hebras dobles y hebras individuales;

   e. escindir las hebras dobles; y

   f. amplificar dichas hebras individuales donde dichas hebras individuales son complementarias a dichas secuencias diana.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende una etapa adicional de adicion de cebadores de PCR a dichos fragmentos de la etapa (b) antes de la desnaturalizacion de la etapa (c).
3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dichos fragmentos de la etapa (c) comprenden polinucleotidos seleccionados de un grupo que consiste en fragmentos clonados, fragmentos genomicos amplificados, fragmentos de ADNc y combinaciones de los mismos.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicha hibridacion a dichas secuencias repetitivas es con un competidor no espedfico de secuencias repetitivas seleccionadas de un grupo que consiste en ADN de esperma de salmon sonicado, ADN COT-1, ARNt de E. coli, ADN genomico total placentario, Alu clonado y combinaciones de los mismos.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la etapa de escision se realiza por digestion enzimatica espedfica de ADN bicatenario.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que dicha digestion enzimatica resulta de la actividad de una nucleasa espedfica de duplex seleccionada de un grupo que consiste en endonucleasas dependientes de cationes, endonucleasa dependiente de Ca y de Mg, nucleasas no espedficas de ADN/ARN y combinaciones de las mismas.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 6, en el que dicha endonucleasa dependiente de cationes es ADNasa K del cangrejo Kamchatka.
8. 8. El metodo de la reivindicacion 6, en el que dicha nucleasa no espedfica de ADN/ARN es ADNasa termoinestable del camaron Pandalus borealis.
9. 9. El metodo de la reivindicacion 1, en el que las hebras individuales amplificadas de la etapa (f) se fijan a un marcador que contiene un resto seleccionado de un grupo que consiste en isotopo radiactivo, enzimas, biotina, avidina, estreptavidina, digoxigenina, agente luminiscente, colorante, hapteno o combinaciones de los mismos.
10. 10. El metodo de la reivindicacion 9, en el que dicho agente luminiscente se selecciona de un grupo que consiste en radioluminiscente, quimioluminiscente, bioluminiscente, fotoluminiscente y combinaciones de los mismos.
11. 11. El metodo de la reivindicacion 1, en el que las hebras individuales amplificadas de la etapa (f) se fijan a un grupo fluoroforo.
12. 12. El metodo de la reivindicacion 11, en el que dicho grupo fluoroforo se fija a traves de un enlace seleccionado de un grupo que consiste en enlace covalente, enlace coordinador metalico, derivados de biotina y combinaciones de los mismos.
13. 13. El metodo de la reivindicacion 12, en el que dicho enlace coordinador metalico es enlace coordinador de platino.