JPH03244400A - 癌評価方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、癌の一般化評価方法に関する。更に、詳細に
は、本発明は、腫瘍組織における遺伝子変化の程度を評
価する方法に関する。

以前の報告は、特異的な癌における特異的な対立遺伝子
（Ａｌｌｔｌｃ）の欠失に焦点をあてたものである。例
えば、染色体腕Ｂｑの欠失は網膜芽腫と関連している。

（カベニー　（Ｃｉｖｓｎｅｅ）他、Ｎａｔｕｒｅ。

Ｖｏｌ、３０Ｓ、　ｐ、７７９　（１９８３））　　こ
のような場合には、欠失は、ゲノムに存在すると無制御
な増殖を抑制する腫瘍抑制遺伝子を含んでいると考えら
れている。

特異的な癌に関連した特異的な遺伝子のこのような例に
対して、フローサイトメトリーや核型分析などの技術を
用いたより一般的な研究から、癌細胞において全体的な
染色体異常が起こっていることが示唆された。その中に
は、欠失、転座、および重複が含まれる。しかしながら
、全体の染色体異常を分子レベルで評価する方法はこれ
までこの分野では開発されていなかった。本分野では、
このような方法および腫瘍再発、腫瘍転移、および死亡
率の予後を与える分子的手段の必要がある。

本発明の目的は、腫瘍組織における遺伝子変化の程度を
評価する方法を与えることである。

本発明の別の目的は、核型分析にも、癌形成に関与して
いると、巴われる特異的な遺伝子の解析にも頼らない、
腫瘍組織における遺伝子変化の程度を評価する方法を与
えることである。

本発明のさらに別の目的は、一群の多型性対立遺伝子の
欠失を測定することによって腫瘍組織における遺伝子変
化の程度を評価する方法を与えることである。

本発明のさらに別の目的は、患者の予後を決定できるよ
うにする！こめにｌｌ瘍組織における遺伝子変化の程度
を評価する方法を与えることである。

本発明の別の目的は、腫瘍組織における遺伝子変化の程
度を評価するためのキットを与えることである。

上記の、およびその他の本発明の目的は、以下で述べる
一つ以上の態様によって与えられる。本発明は腫瘍組織
における遺伝子変化の程度を評価する方法を与えるもの
であり： 患者の腫瘍組織から第一のＤＮＡ試料を、また同じ患者
の非腫瘍組織に第二のＤＮＡ試料を単離すること； 一群の対立遺伝子の存在に関して第一および第二のＤ　
Ｎ　Ａ試料を試験すること； 患者がヘテロに持つ数群の中の対立遺伝子の、第二の試
料に対する第一の試料における欠失の百分率を決定する
ことであり、（この際に、患者がヘテロに持つ数群の対
立遺伝子の欠失の百分率が予後と関連した腫瘍組織中の
遺伝子変化の指標を与えるように、数群が充分な数の対
立遺伝子を有している）： の行程を含んでいる。

本発明の別の態様では、一群の対立遺伝子の存在が、該
第一および第二のＤＮＡ試料の、制限断片長多型性を検
出する一群の核酸プローブとのすザンハイプリダイゼー
ンヨンを行うことによって試験される。

本発明のさらに別の態様では、該第一と第二のＤＮＡ試
料における一連の対立遺伝子の存在が、制限断片長多型
性を含むＤＮＡ領域を包含するプライマーの組を用いて
該第一と第二のＤＮＡ試料の領域の増幅によって試験さ
れる。

本発明の望ましい態様では、欠失に関して試験される一
群の対立遺伝子は、ヒトゲノムの末端動原体性でない各
染色体腕に由来する少なくとも一つの対立遺伝子を含ん
でいる。

本発明のさらに別の態様では、ヒトの対立遺伝子に対す
る一群の核酸プローブを含むキットが与えられるもので
あり、数群は、患者がヘテロに有するプローブの数群に
よって検出される対立遺伝子の腫瘍組織における累積的
な欠失が腫瘍組織における遺伝子変化の程度の指標を与
えるのに充分な数の対立遺伝子を検出するものであり、
遺伝子変化の程度は予後に関連しており、該プローブは
制限断片長多型性を検出するものであるもの。

本発明のさらに別の態様では、ヒトＤＮＡに対する一群
の一本鎖核酸プライマーの組を含むキットが与えられる
。プライマーの組は制限断片長多型性を含む領域を包含
する。該プライマーの組の群は、患者がヘテロに持つプ
ライマーの組の数群によって包含される制限断片長多型
性対立遺伝子の、患者の＠癌組織における累積的な欠失
が、予後に関連する遺伝子変化の指標を与えるのに十分
な数のプライマーの組を含んでいる。

本発明は、正常な非腫瘍組織から分離され得る腫瘍組織
のすべての型に応用可能な一般的方法による技術を与え
、腫瘍過程の予後を示唆する要素を与える。本方法は、
いがなる特異的な疾患に生じるいかなる特異的な遺伝子
変化にも依存していない。

腫瘍細胞中の対立遺伝子の欠失が非常に共通的であるこ
とは、本発明で見いだされたことである。

試験された各冬型性マーカーの対立遺伝子の一つは、少
なくとも幾つかの腫瘍で欠失していることが見いだされ
た。幾つかの腫瘍ではその親の対立遺伝子の半分以上が
欠失していた。さらに、腫瘍組織における対立遺伝子の
欠失量は患者に関する予後的な価値があることが示され
た。患者が持っている可能性のある一次腫瘍の大きさと
段階にかかわらず、対立遺伝子欠失の百分率は腫瘍再発
および転移、またそれ（こよる死の予測を与えることが
できる。以上のようＩ：、腫瘍に於ける対立遺伝子欠失
の状態、いわゆる腫瘍対立遺伝子型の決定は、癌患者の
予後の分子的指標を与えるものである。

欠失よりは希であるか、対応する正常組織には存在しな
い新しいＤ　Ｎ　、Ａ断片が幾つかの腫瘍組織に見いだ
された。新しい断片はＶＮＴＲ型（多様な数のタンデム
反復配列；　　ｖｓｒｉａｂｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ
ｔｘｎｄｅｍ　ｒｔｐｅａｔｓ）の反復頻度を含んでし
゛た。

本発明の方法によって測定される遺伝子変化の程度は、
特異的な遺伝子または座位に依存しない非特異的な測定
である。したがって、多様な異なる対立遺伝子は、試験
の予後的な価値を変える事なく、本方法で試験する際に
用いられる群を含んでいる。しかしながら、累積的な（
すなわち百分率）対立遺伝子の欠失が、予後と関連する
腫瘍組織中の遺伝子変化の程度の指標を与えるようにす
るために、充分に多数の対立遺伝子が用いられなければ
ならない。望ましい対立遺伝子群には、ヒト染色体の組
の末端動原体ではない腕の各々の上の対立遺伝子が含ま
れる。（末端動原体性染色体の腕はゲノム中で数多く反
復しているリポソームＲＮＡの遺伝子を主に含んでいる
と考えられている。これらの配列の反復性は、単一コピ
ーの欠失の検出を困難にすると思われる。）別の対立遺
伝子群あるいは対立遺伝子の亜群も、望ましい対立遺伝
子群によって与えられるのと同様に、予後に関連する遺
伝子変化の程度の指標を与えられるのであれば、使用可
能である。

本発明の各プローブは、制限断片長多型性（ＲＦＬＰ）
を定義している。これは、このような対立遺伝子の存在
に関して正常なヒト集団をスクリーンするとした場合に
、５％以上の人がその対立遺伝子に対応する制限断片の
長さが異なってし・るというものである。本発明で用い
ることのできる特別な型のＲＦＬＰは、異なる数のタン
デム反復配列（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ
　ｊａｎｄｅｍ　ｒｃｐｅａｊｓ；　ＶＮＴＲ）に対応
するものである。

ヒトの対立遺伝子欠失を検出するためには、試験される
対立遺伝子が患者の正常組織の中で二つの異なる型で存
在しているこ七が望まれる。したがって、患者はその特
異的な対立遺伝子に関してヘテロである。これにより、
対立遺伝子欠失の解析が単純番こなり、信頼できるもの
となる。一般に、ヒトに存在する二つの対立遺伝子の単
一のコピーのみか癌形成の際の対立遺伝子欠失で失われ
る；それぞれの対立遺伝子に関して二つの明らかに寸法
の異なる断片が存在することにより、単一の対立遺伝子
の欠失の観察が、定量的ではなく定性的な測定となる。

すなわち、ヘテロな対立遺伝子の欠失を記録するために
は、特定のサイズの断片の消失を探せばよいことになる
。正常な組織では患者がその対立遺伝子に関してホモで
あれば、その対立遺伝子の単一のコピーの欠失により、
その対立遺伝子を含む制限断片の強度は約５０％の減少
を示すであろう。完全な消失は５０％の減少よりもはる
かに検出が容易である。

はとんどの末端動原体でない染色体の腕に対する制限断
片冬型型性を検出する核酸グローブは、米国メリーラン
ド州、ロンクビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションから入手可能である。これらは１９８８年
８月に出版されたＮＩＨヒトＤＮＡプローブおよびライ
ブラリー保存物目録（ｔｈｅ　　ＮＩＨＲｅｐｏｓｉｔ
ｏｒｙ　　ｏｆ　Ｈｕｍｉｎ　ＤＮＡＰｒｏｂｅｓ　ａ
ｎｄ　Ｌｉｂｒｘｒｉｅｓ）に記述されている。［ＭＣ
Ｔ１１２と呼ばれるプローブは、カタログでは染色体腕
９ｑにハイブリダイズすると登録されているが、９ｐに
ハイブリダイズするものである。別のグローブ、ＥＦＤ
７５は腕１０ｑにハイブリダイズするものであるが、第
１０染色体にハイブリダイズすると記述されている。染
色体腕８ｐに対するプローブはＮＩＨ保存物目録には登
録されていないが、二つの参考文献で示されている：ラ
コステーロイヤル（ＬａｃｏｓｔｅＲｏｙａｌ）他、Ｌ
＋ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　Ｖｏｌ、Ｉ６．
４４８４（１９８８）、およびウッド（Ｊｏｏｄ）他、
Ｃｙｔｏｇｅｎｅｉ　Ｃｅ１ｌＧｅｎｅｔ、、　Ｖｏｌ
、１２．　ＩＮ　（１９８６）。］制限断片長冬型性を
検出する他のプローブを得る方法は本分野で既に知られ
ている。ヒトゲノムの非末端動原体の染色体腕の各々に
ハイブリダイズするプローブの完全な組を用いて得られ
た統計的情報は、予後的に有用である。この完全な組の
他の面粗も有用な予後情報を得るためｌ二使用すること
ができる。他の面粗の使用が予後と関連する遺伝子変化
の程度の測定につながるか否かは、完全な対立遺伝子の
組の使用の際と同様に試験することができる。

結腸直腸癌の場合には、それぞれの腫瘍で見られた対立
遺伝子欠失のメジアン量は、試験したこれらの対立遺伝
子の約２０％である。メジアンよりも高い対立遺伝子欠
失を持つ患者は、メジアン以下の対立遺伝子欠失を持つ
ものよりも癌再発および死の危険性が顕著に高いことが
見いだされた。

他の対立遺伝子の組が予後を示唆する要素として適当で
あるかどうかは、結腸直腸癌患者の集団に関して、その
集合内で同程度の対立遺伝子欠失が見いだされること、
および対立遺伝子欠失の量が癌再発および死と関連づけ
られることを確認して試験するべきである。

他の型の癌に関して対立遺伝子欠失の特徴的なレベルを
見いだすために、同じ型の癌患者の集団の評価を行うべ
きである。集団中に５０Å以上の患者がいることが望ま
しい。多様な癌の型に対する対立遺伝子欠失の平均量は
型によって異なる可能性はあるが、すべてに対して同じ
傾向が見られるであろう。ある特別な癌に於ける対立遺
伝子欠失量が大きいことは、癌再発および死の危険が高
いことを示し、対立遺伝子欠失量が低いことは危険性が
低いことを示唆する。本発明の方法が有用である他の癌
の型には、肺癌、結腸癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、肝
臓癌、および胃癌が含まれる。

本発明の方法によれば、各患者から２種頭のＤＮＡ試料
が単離される。一つのＤＮＡ試料は腫瘍組織から単離さ
れ、第二の試料は非腫瘍組織から単離される。非腫瘍組
織は腫瘍組織と同じ型の組織から単離されたものでも、
異なる器官から単離されたものでも使用可能である。腫
瘍組織が一次腫瘍細胞を含んでいること、および、正常
細胞がＩＩ！！瘍組織から分離されることが望ましい。

癌細胞を非癌細胞から分離する方法は、本分野では既知
であり、いづれの方法を用いてもよい。例えば、パラフ
ィン切片およびクリオスタット切片からのＤＮＡ単離、
および２倍体細胞から異数体細胞を分離するフローサイ
トメトリーを用いることが可能である。ＤＮＡはプラス
チック中に保存された組織から単離することも可能であ
る。細胞サイズまたは密度に基づいた単離法も用いられ
る。組織か単離されれば、本分野で既知のいかなる方法
によっても組織からのＤＮＡの単離は可能である。

マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他、Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍｘｎｕａｌ、コールド・
スプリング・／＼バー研究所、１９８２に記述されてい
るように、組織は細かく刻むか、ホモジナイズし、得ら
れた細胞を酵素と界面活性剤の混合物を用いて溶解する
。

核酸は、フェノールおよびクロロホルム抽出、およびエ
タ、／−ル沈澱なとの標準的な技術を用いて抽出される
。

特別の対立遺伝子の欠失に関する試験は、以下に述べる
多数の方法によって行うことができる。

前述のように、対立遺伝子型欠失解析で用いられる対立
遺伝子は、患者がヘテロに持つものが望ましい。これは
、患者の非腫瘍組織から単離された第二のＤＮＡ試料を
試験し、制限断片長条型がある対立遺伝子に関する特異
的な核酸プローブに、ハイブリダイズする断片のサイズ
と数を記録することによって決定することができる。例
えば、ホモ２倍体であれば、制限断片長条型性プローブ
にハイブリダイズする断片がある制限酵素による切断で
一つしか生成しないのに対し、ヘテロ２倍体では同じグ
ローブにハイブリダイズする二つの異なるサイズの断片
がその酵素による切断によって生じる。ヘテロ２倍体性
を決定することは、本分野の技術では既知のものである
。

対立遺伝子の欠失は、腫瘍組織に対する正常組織に於け
る対立遺伝子に対応する断片のパターンを比較すること
ｔこより決定される。例えば、非腫瘍組織がある対立遺
伝子に対して二つの断片を有し、腫瘍組織が一つの断片
を有する場合には、つの欠失が数えられる。このような
対立遺伝子欠失数を患者がヘテロに持つ対立遺伝子の数
で割ると、ＦＡＬ　（対立遺伝子欠失指数；　　ｆｒｘ
ｃｔｉｏｎａｌａｌｌｃｌｉｃ　１ｏｓｓ）と呼ばれる
指標因子、すなわち対立遺伝子欠失百分率が得られる。

ＦＡＬは以下に示す表３１：示すように、癌の予後にお
いて有意な因子であることが既に示されている。ＦＡＬ
は、転移、癌再発、およびそれによる死の予測の指標を
与える。

対立遺伝子の欠失に関する試験の一つの手段は、それぞ
れ腫瘍組織および非腫瘍組織由来の第一および第二のＤ
ＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化すＳことによる。

制限エンドヌクレアーゼは本分野ではよく知られている
。これは特異的な配列でＤＮＡを切断するため、各ＤＮ
Ａ試料由来の分断されたＤＮＡ断片群を形成させるのに
使用される。各ＤＮＡ試料の制限断片は本分野における
既＃Ｊ＋、”）どの方法によっても分離することができ
る。

例えば、アガロースやポリアクリルアミドなどの電気泳
動ゲルマトリックスを用いて、断片をサイズなどの物理
的性質によって電気泳動的に分離することができる。制
限断片は上述のように制限断片長身型性を検出する核酸
プローブに７１イブリダイズさせることができる。ハイ
ブリダイゼーションの際に、少なくとも一本鎖のプロー
ブと一本鎖の対応する制限断片とを含むハイブリッド２
量体が形成される。液相法、固相法を含むさまざまなハ
イブリダイゼーション技術が本分野で知られている。一
つの特に有用な方法では、分離された断片を、電気泳動
ゲルマトリックスからナイロンや濾紙などの固体指示体
に、電気泳動ゲルマトリ・ンクス上で保持されている相
対的な位置を断片か維持するようにトランスファーする
ことを用いる。

ハイブリッド２量体は本分野で既知のいかなる方法によ
っても検出可能であり、例えば、核酸プローブが放射性
標識されている場合には、オートラジオグラフィーによ
って検出される。他の標識法および検出法も本分野では
知られており、本発明で使用可能である。

対立遺伝子欠失の存在を試験するもう一つの方法は、Ｐ
ＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応；　ｐｏｌｙ＋＊ｅｒ＊５
ｅｃｈｘｉｎ　　ｒｅｉｃｔｉｏｎ）として知られる技
術を用いることによる。この方法によれば、制限断片長
条型性を含む限られたＤＮＡ領域が増幅される。増幅は
、アニーリング、すなわち、通常ＤＮＡからなる１組の
一重鎖プライマーを患者由来の該第一および第二のＤＮ
Ａ試料にハイブリダイズさせることによって行われる。

プライマーの組は、染色体上で逆向きで、しかし収束す
るようにＤＮＡ合成をプライミングするように、ＤＮＡ
の逆の鎖にアニーリングさせる。プライマーの組は制限
断片長条型性を含むＤＮＡ領域を包含する。すなわち、
プライマーは制限断片長条型に隣接するＤＮＡにアニー
ルする。制限断片長条型を含む領域の増幅は、ＤＮＡポ
リメラーゼによって触媒されるＤＮＡ合成サイクルを反
復することによって行われる。

ＤＮＡポリメラーゼは、比較的熱に安定なＴａｑポリ、
メラーゼか望ましい。ＤＮＡ合成には、ＤＮＡ合成のた
めの化合物、すなわち、各４種のデオキシリボヌクレオ
チド３リン酸が必要である。ＤＮＡ合成の新しいサイク
ルを開始させるためには、プライマーをＤＮＡ鋳型、す
なわち第一および第二のＤＮＡ試料から分離しなければ
ならない；分離は、ＤＮＡＺ量体の融点以上の温度に加
熱することによって容易に行われる。合成の新しいサイ
クルを再開始させるｔ；めには、プライマーと鋳型ＤＮ
Ａを再アニーリングさせる。約ｌＯサイクル後、反応混
合液にさらにＤＮＡポリメラーゼを加えることが望まし
い。増幅産物は、プライマーが結合しているＤＮＡＺ量
体である。ＰＣＲ技術は、ここに参考として含める、米
国特許環４．６Ｎ、１９５号：第４，６８３，２０２号
：および第４．６Ｎ、１９４号各明細書に記述されてい
る。

プライマーの組に包含されている、増幅されたＤＮＡ領
域は、多数の方法によって検出可能である。例えば、増
幅されたＤＮＡ試料を電気泳動ゲルマトリックスで分離
し、分離されたＤＮＡをエチジウムブロマイドで染色す
ることができる。これらの技術は本分野では非常によく
知られている。

幾つかの場合では、増幅されたＤＮＡ領域内の冬型性配
列を認識する制限エンドヌクレアーゼで増幅されたＤＮ
Ａ試料を切断することが冬型性断片の生成に必要とされ
る。増幅されたＤＮＡは電気泳動ゲルマトリックスで分
離し、続いて、核酸プローブとのハイブリダイゼーショ
ンが行える固体支持体（ナイロンまたは濾紙）にトラン
スファーすｂことができる。核酸プローブは、プライマ
ーの組のどちらか一方、または包含されたＤＮＡ領域と
相同なものである。核酸プローブは本分野で既知のいか
なる方法によっても検出可能である。

通常は、放射性物質をプローブの標識に使用し、オート
ラジオグラフィーによって検出する。

ポリメラーゼ連鎖反応技術で用いられるプライマーは、
制限断片長条型性を検出するプローブを用いてデザイン
することかできる。プライマーは、ＤＮＡプローブまた
は、使用する際でもＲＦＬＰ対立遺伝子を含む領域を包
含できるようなほかの１分の末端を使用できる。制限断
片長条型性を含むことが分かっているＤＮＡを用いて、
ブライマー有用性を試験することができる。例えば、あ
る対立遺伝子に関してペテロであることがグローブによ
って示されている患者の正常組織由来のＤＮＡ試料をプ
ライマーの組の試験に使用できる。

プライマーの組が、ＤＮＡ試料の増幅によって二つ以上
の断片を生じさせるならば、そのプライマーの組は本発
明の方法で有用である。

核酸プローブ群、またはプライマーの組の群、あるいは
その双方を含むキットも本発明によって与えられる。キ
ットは腫瘍組織中の変化の程度の指標を与えるために十
分多数の対立遺伝子の累積的欠失が決定できるようにす
るために、充分多数のプローブまたはプライマーを含ん
でいる。その指標は予後と関連している。該キット中の
核酸は、溶液または凍結乾燥しｆ−、形で与えられる。

有効期間を最大にするために、核酸は無菌状態で、ヌク
レアーゼの混入がないようにすることが望ましい。

以下の実施例は本発明の範囲を制限することを意図した
ものではない。これらは単に本発明を実施するための具
体的で実際的な方法を示すために記述するものである。

実施例１ 本実施例は対立遺伝子欠失分析を行う場合の方法を示す
。

患者Ｓ　ｌ　４１　（ＩＩＩＩＩＡ）の正常組織（Ｎ）
および腫瘍組織（Ｃ）由来のＤＮＡを制限エンドヌクレ
アーゼ（ＴａｑｌおよびＭｓｐｌ）で切断し、断片を電
気泳動によって分離し、ナイロンフィルターにトランス
ファーした。フィルターを上述の放射性プローブととも
にインキュベートした。結果を第３Ａ図に示す。冬型性
制限断片のサイズを各断片の左側に示す。プローブＲＭ
７．４および（３７こ関しては、大きいほうの対立遺伝
子が腫瘍からは失われていた；プローブＥＦＤ６４，１
に関しては、小さいほうの対立遺伝子が失われていｊ；
。プローブの由来と説明は、以下の実施例２１こ示す。

実施例２ 本実施例は、５６の一次結腸直腸癌の対立遺伝子型解析
、および各染色体腕についての腫瘍群中の対立遺伝子欠
失量について示したものである。

ＤＮＡは、外科的に除去された５６の一次結腸直腸癌の
クリオスタット切片から精製し、同一の患者の正常な結
腸組織由来のＤＮＡと比較した。

ＲＦＬＰを検出するプローブを、各プローブで検出され
る二つの親の対立遺伝子が腫瘍細胞由来のＤＮＡで特異
的に失われているかどうかを決定するために使用した。

すべての非末端動原体性常染色体腕に関して調べた；末
端動原体の腕（Ｕｐ、目ｐ、　ＩｓＤ、　２１ｐ、およ
び２２ｐ）上に存在していることが知られている遺伝子
だけがリポソームのものであった。３９の各非末端動原
体性染色体腕に関して、二つの親の対立遺伝子が少なく
とも２０の患者の正常組織で区別され得る（すなわち、
含情報患者）ことを確認するために、充分なプローブを
用いた。

対立遺伝子型欠失の研究に用いたプローブを以下に列挙
する： 染色体１ｐ（３ａ含情報腫瘍）−プローブＹＮ２２：　
ｙ。

ナカムラ（Ｎａｋｘｍｕｒａ）他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６゜４７４７　（１９８ｇ）；
染色体ＩＱ（４７含情報腫瘍）−プローブＹＮＡ　Ｈ，
Ｙ、ナカムラとＲ，ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）、ＮｌＩｃ
１ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６．　（１９８Ｋ
）；染色体２ｐＣ２ｙ含情報腫瘍）−プローブＥＦＤ　
１２２：　Ｅ、　７ジモト他、Ｎ。

ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｓｓ、　Ｉｓ、１００７８
　（１９８７）；染色体２ｑ（４５含情報腫瘍）−プロ
ーブＹＮＥＩ　２４：　Ｙ、ナカムラ他、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ，ｅｓ、　Ｉｓ、１００７３　（１
９１１７）；染色体３ｐ（２５含情報腫瘍）−グローブ
ＥＦＤ目５：Ｅ、フジモト他、Ｎｕｃｌｃｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６．９３５７　（１９８８）；染色
体３ｑ（２６含情報腫瘍）−グローブＥＦＤ　６４．１
：　ｙ。

ナカムラ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、印
刷中；染色体４ｐ　（２３含情報腫瘍）−プローブＹＮ
２３２：　ｙ、ナカムラ他、Ｎｕｃｌｃｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅｓ、　１６．４１８６　（１９８ｇ）；染色体
４ｑ　（２０含情報引ｌ−プローブＫＴ　２１８：　ｓ
。

ハン７リース（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ）他、Ｈｕｍ、Ｇｅ
ｎｅｔ、　６８゜１４８　（＋９８４）、染色体ｓｐ　
（３１含情報腫瘍）−プローブＪＯＮ　３５　Ｅ−Ａお
よびＪＯ２０９Ｅ−Ｂ：　Ｊ、オーバーハウザー（Ｏｖ
ｅｒｈａｕｓｅｒ）、　Ｊ、マクマーハン（ＭｃＭａｈ
ｘｎ）およびＪ、ワスマス（Ｗａｓｍｕｈ）、　Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１５．１６１７　（１
９８７）、染色体Ｓｑ　（５５含情報腫瘍）−プローブ
２Ｎ−２０５，ＴＰＳＥ、　ＣＩＩＰＩＩ、　ＨＦ１２
−６５．１０５−１５３；　Ｍ、　　レバート（Ｌｅｐ
ｐｓｒｔ）他、５ｃｉｅｎｃｅ　２３８．１４１＋　（
１９８７）、染色体６ｐ　（３２含情報腫瘍）−プロー
ブＹＮ２　Ｈ２：　ｙ、ナカムラ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｓｓ、　１６．５７０１　（＋９１１８
）；染色体６ｑ　（３１含情報腫瘍）−プローブＪＣ２
３０：　ｙ、ナカムラ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅｓ。

１６．４フ４３　（１９８８）；染色体７ｐ　（２２含
情報腫瘍）−プローブＲＭ７．４：　Ｒ，メイヤーズ（
Ｍｙｅｒｓ）他、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、
　１６．３５９１　（１９８８）；染色体７ｑ　（５１
含情報１１１瘍）−プローブ１３：　Ｚ、　’７　ｔ　
ン（Ｗｏｅ）、　Ｌウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）、　Ａ
、Ｊ、ジェフェリーズ（Ｊｅｌｆｅｒｅｙｓ）、　Ｓ、
Ｌ、ティン（Ｔｈｅｉｎ）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅｓ。

目、４６０５　（１０８）；染色体８ｐ（Ｈ含情報腫瘍
）−プローブＮＦ−Ｌ：　Ｇ、ラコステーロイヤル（Ｌ
ａｃｏｓｔｅ４ｏｙｘｌ）、Ｍ、マシｘ−（ＭａＬｈｉ
Ｃｕ）、　Ｊ、Ｐ、ジュリエン（ＪｕｌｉＣｎ）。

Ｓ、ゴーティエ（Ｇｓｕｔｂｉｅｒ）、およびり、ゴブ
リュー（Ｇａｎｖｒｅａｕ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅｓ、Ｉ６．４１８４（１９８８）：　プロー
ブ５Ｗ５０：　Ｓ、ウッド（Ｗｏｏｄ）他、ＣｙｔｏＨ
ｎＣｔ。

Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｃｔ、　４２、＋１３　（１９８６）
；染色体８ｑ　（２６含情報腫瘍）−グローブＭＣＴＩ
Ｈ，２：　ｙ、ナカムラ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅｓ、　１６．３５９ｂ（１９８８）；　　染色
体９ｐ（２７含情報腫瘍）−プローブＭＣＴｌ１２：　
ＭＪｒ　−ルア　７　（Ｃ＆ｒｌｓｏｎ）他、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　　Ｉｓ、１０６目
（１９８７）；　　プローブＥＨＨ２２ｏ：　Ｍ、ボッ
ＣＨｏｆｆ）他、ｌＬ＋＋ｃｌｅ＋ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、　Ｉｓ、＋０６０６　（１９８７）、染色体９ｑ
　（３９含情報腫瘍）−プローブＥＦＤ１２６．３：　
ｙ、ナヵムラ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
、　Ｉｓ、＋０６０７　（１９Ｎ）；染色体１０ｐ（３
７含情報腫瘍）−プローブＴＢＱ　７：　Ｔ、ブラング
（Ｂｒａｇｇ）、　Ｙ、ナカムラ、ｃ、ジョーンズ（Ｊ
ｏｎｅｓ）およびＲ。

ホワイト（Ｗｈｉｊｅ）、　Ｎｕｃｌｓｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅｓ、印刷中（１１１８９）；染色体１１１ｑ　
（３７含情報腫瘍）−プσ−プＥＦＤ７５：　ｙ、ナカ
ムラ、Ｅ、７ジモトおよびＲ，ホワイト、Ｎｕｃｌｃｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、印刷中（＋９１１９）、染色
体１１９（３３含情報ＩＩｉ瘍）−プローブＥＪ：　Ｃ
，’ｙ−（ｓｈｉｈ）およびＲ，Ａ、ワインバーブ（Ｗ
ｅｉｎｂｅＢ）、　Ｃｅ１ｌ　２９，１６１（＋９８２
）、染色体＋１９（Ｈ含情報腫瘍）−プローブＭＣＴＩ
Ｈ，ｌ：　Ｍ、カールソン他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｃｓ、１６．３Ｎ　（Ｂｇ８）；染色体＋２９
（３９含情報腫瘍）−グローブＥＦＤ　３３．２：　Ｅ
、７ジモト、Ｌメイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）。

Ｙ、ナカムラ、Ｒ，ホワイト、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅｓ。

投稿中（１９８１１）；染色体＋２ｑ　（２４含情報腫
瘍）−プローブＹＮＨＩｓ：　ｙ、ナヵムラ他、Ｎｎｃ
ｌｓｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１６．７７Ｇ　（１０８）；染色体＋３ｑ　（４４含情
報腫瘍）−グローブＨ２４７：　ｙ、ナカムラ他、Ｎｕ
ｃ！ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

Ｉｓ、３１１９　（１９８ｇ）、染色体＋４ｑ　（５０
含情報腫瘍）−プローブＣＭＭ　１０１：　ｙ−ナヵム
ラ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６．
３ｇ＋　（１９８８）；染色体１ｓｑ　（２４含情報１
１プローブＴＨＨ５５：　Ｔ、ホルム（Ｈａ　１ｍ）他
、Ｎ＋＋ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１ｇ、３１
１７　（１９８８）、染色体１６９　（２７含情報腫瘍
）−プローブＥＫＤＭＡ　２：　Ｅ、つオル７（Ｗｏｌ
ｆｆ）他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１
６．９８８５　（１９Ｎ）；染色体＋６ｑ　（４２含情
報腫瘍）−プローブ７９−２−２３：　Ｌ、バフトン（
Ｂｕｆｆｏｎ）他、Ｈｕｍ、　Ｇｅｎ５ｔ、　７４．４
２５　（１９８６）；染色体じｐ（５６含情報腫瘍）−
プローブＹＮＺ　２２：　ｙ。

ナカムラ他％Ｎｎｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　
１６．５７０７　（＋９１１８）；　プローブＹＮＨ３
７，３：　ｙ、ナヵムラ他、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓ　Ｒｅｓ、　１６．７８２　（１９８８）；　プロー
ブＭＣＴ　３５．１：Ｍ、カールソン他、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６．７００（１９８８）
、染色体＋７ｑ　（４４含情報腫瘍）−プローブＩｌｌ
ｔｋｇ：　Ｐ、Ｄ、マー７（−ＣＭｒｒｒｐｂｙ）他、
Ｎ＋＋ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｔｓ、　１４．４３
ｇ＋　（１９Ｎ）；　　プローブＴＨ［ｌ　５９：　ｙ
、ナヵムラ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｓｓ、
　１６．３５９Ｂ　（＋９８Ｄ；染色体１１１ｐ　（２
７含情報腫５１り一プローブＢ７４：　Ｆ、モー−（Ｍ
ｏｒｌｅ）他、Ｃｙｔｏｇｅｎｃｔ、　Ｃｔｌｌ　Ｇｅ
ｎｅｔ、　３７．５４４（１９１１４）；染色体ｕｑ　
（５３含情報腫瘍）−プローブＯＳ４：１．二／ノヨー
他、Ｊｐｎ−Ｊ、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ；　３２１（
１９８７）、　　プローブ０ＬＶＩＩＡ［ｌ：　ｏ、デ
ラットレ（Ｄｅｌａｔｔｒｅ）他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　Ｉｓ、＋３４３　（１９８７）。

プローブ０ＬＶＩＩＥＩＯ：　Ｆ、マールヘンス（Ｍａ
ｒｌｈｅｎｓ）他、ＮｕｃｌＣｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、　Ｉｓ、１３４ｇ　（１９１１７）；　　プローブ
ＨＨＨ６４：　Ｋ、ヨ／オカ、Ｎ、ヨシ才力、Ｋ、ナヵ
ベップ、Ｙ、サカイ、　Ｎｕｃｌｓｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、　１４．３１７（１９８６）；　　プローブＥ
ＲＴ　２５：　Ｕ、ミュラー（Ｍｕｌｌｓｒ）他、Ｃｙ
＋ｏｇｅｎＣｔ、　Ｃｅ１ｌ　ＧＣｎｅｔ、　４６．１
６　（１９８７）；染色体１９１１　（４４含情報腫瘍
）−グローブＪＣ２３，１：　ｙ、ナヵムラ他、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６、Ｈ２９（１９
８８）；染色体１９Ｑ　（３７含情報腫瘍）−プローブ
ＲＢＩ−４：　ｃ、ジュリエ−（Ｊｕｌｉｔｒ）、　Ｅ
、ウォルフ、Ｙ、ナカムラ、およびＲ，ホワイト、Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、印刷中（１９８９）
；染色体２０ｐ　（４６含情報腫瘍）−プローブＣＭＭ
６：　ｙ、ナカムラ他、Ｎｕｃｌｃｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、　１６．５２２２　（１９１１８）：染色体２
０ｑ（２２含情報腫瘍）−プローブＭＳＩ−２７：　Ｄ
。

バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）、　Ｍ、シェープ７−　（５
ｃｂｘｆｅｒ）およびＲ，ホワイト、Ｃｅ１ｌ　３６．
１３１　（１！Ｎ４）；染色体２ＩＱ　（２７含情報腫
瘍）−グローブＭＣＴ　１５：　ｙ、ナカムラ他、Ｎｎ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６．９８８２　
（１９８ｇ）、染色体２２ｑ　（４１含情報腫瘍）−プ
ローブＥＦ２３１：　Ｋ、クラブチａ　（Ｋｒａｐｃｈ
ｏ）他、Ｎｕｃｌｔｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６
．５２２１　（１９８１１）；　プローブＡＥＢ２１：
　Ｃ，Ｍ、ルーピン（Ｒｕｂｉｎ）他、Ｎｕｃｌｅｉｃ
　ＡＣｉｄｓ　Ｒｅｓ、印刷中（１９８９）；　プロー
ブＥＷ７．２：　Ｔ、ブラッグ、Ｙ、ナカムラ、Ｅ、つ
オルレフ、Ｊ、−Ｍ、ラルール（ｌｌｌｏｕｅｌ）およ
びＲ，ホワイト、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
、印刷中（＋９１１９）。

対立遺伝子欠失は、制限断片長冬型性解析によって評価
し、その例を第３図に示した。正常な結腸粘膜と腫瘍組
織の組由来のＤＮＡを３つの制限酵素（Ｔａｑｌ、　Ｍ
ｓｐｌ、またはＢｉｎｄｌｌｌ）のうち１種で切断し、
各非末端動原体染色体腕由来のプローブで評価した。含
情報１１１４．すなわち、該染色体腕由来のひとつ以上
の対立遺伝子マーカーに関して正常組織由来のＤＮＡが
ヘテロなパターンを示すもののみを、対立遺伝子欠失頻
度の決定に使用した。

対立遺伝子欠失は、正常ＤＮＡに存在するＲＦＬＰ断片
が腫瘍細胞の少なくとも８０％で失われている場合に、
腫瘍ＤＮＡを精製したラジオスタット切片のオートラジ
オグラフと組織学的評価との比較によって評価して計算
した。

各染色体腕由来の対立遺伝子は、少なくとも幾つかの腫
瘍で欠失していた（第１図および表Ｉ参照）。しかし、
対立遺伝子欠失頻度は著しく異なり、二つの染色体腕（
１７ｐおよび１８ｑ）由来の対立遺伝子は７５％以上の
＠瘍で欠失しており、９個の腕（１ｑ、　４ｐ、　ｓｑ
、　６ｐ、　ｇｐ、　９ｑ、　＋８ｐ、　２２ｑ）由来
の対立遺伝子は２５から５０％の腫瘍で欠失し、残りの
２８の腕では７から２４％の腫瘍で欠失していた。

表１注 ａ　マーカーの参考文献は、実施例２に示す。

ｂ　、　”Ｖ”ハＶＮＴＲマーカーを示す、”ｓ”は制
限酵素部位冬型性マーカーを示す。

ｃ　　、　　Ｍ−Ｍｓｐｌ；　　Ｔ４ａｑｌ；　　［ｌ
・Ｈｉｏｄｌｌｌｄ、示唆された染色体腕に関するひと
つ以上のマーカーか情報を与えるものである腫瘍の数（
すなわち、対応する正常組織由来のＤＮＡかヘテロなパ
ターンを示すものの数）。

ｅ、含情報腫瘍のみをこの百分率の評価に用いた。

欠失は、本文で述へたように、これらかクローン性であ
る場合にのみ、ポジティブと計算した。

欠失を含む染色体のｐ腕とり腕の双方のマーカーに関し
て患者か情報を持つ（ヘテロである）対立遺伝子欠失は
１２７例あった。これらのうち６５％は二つの染色体腕
のうち一方にのみ対立遺伝子欠失か起こっていた。した
かって、本研究で観察された欠失の大部分は間隙欠失（
１ｎｌｅｒｓｔｉｔｉａｌ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、体細
胞分裂組み換え（ｍｉｔｏｔｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｔｉｏｎ）、あるいは遺伝子変換（ｇｅｎｅ　ｃｏｎｖ
ｅｒｓｉｏｎ）によって媒介される、染色体の部分的な
現象であり、完全な染色体の欠失ではないことを示して
いる。

実施例３ 本実施例は、各腫瘍の対立遺伝子欠失量を示すものであ
る。

我々は、腫瘍中の対立遺伝子欠失指数（ｆｒａｃｔｉｏ
ｐａｌ　ａｌｌｅｌｉｃ　１ｏｓｓ；　ＦＡＬ）を、対
立遺伝子欠失か観察された染色体腕の数を、患者の正常
細胞において対立遺伝子マーカーか情報を含む（ヘテロ
である）染色体腕の数で割ったものとして定義した。

調べた５６の腫瘍における平均ＦＡＬ値は０．２０であ
り、言い換えれは、評価可能な染色体腕のうち２０％か
ら対立遺伝子が欠失していた。１２の腫瘍においては、
評価可能な染色体腕の３分の１以上か対立遺伝子欠失を
起こしていた。（第２図および表２参照） 表２注 １．二人の患者（５１１９および５１４＋）は二つの独
立した腫瘍を持っていた。

ｂ、・正常組織由来のＤＮＡがひとつ以上の対立遺伝子
マーカーでヘテロであることが示されたが、双方の対立
遺伝子が腫瘍ＤＮＡに保持されている、染色体腕の数。

Ｃ１・本文中で定義した、対立遺伝子欠失分数。

実施例４ 本実施例は対立遺伝子欠失指数の予後的価値を示すもの
である。

患者を二つの集団に分離したニーつは平均ＦＡＬ値以下
を持つ腫瘍を有する患者（グループｌ、　ＦＡＬが０．
２以下）であり、もう一方は平均値より大きい値を持つ
腫瘍を有する患者（グループＩＩ）である。

双方のグループの患者を３８力月以上追跡調査した。

二つのグループの患者は、同様の性分布および年齢分布
であり、腫瘍の平均サイズおよび侵入の程度（デューク
スの分類）はほとんど同等であった。

通常、結腸直腸癌で起きる他の遺伝的変異（Ｒａｓ遺伝
子変異）の傾向は、 二つのグループで同等で あった。これらの相同性にもかかわらず、欠失がより多
い（ＦＡＬが高い）患者は明らかに他方のグループより
も癌再発の可能性が高かった（ｐ＜０．０１）。

表３参照。これらの患者はその癌により死ぬ可能性も明
らかに高かった（ｐ＜０．０１）。

表３　注 １．グループｌの患者は、表２に示した５６の腫瘍の対
立遺伝子欠失指数（ＦＡＬ）のメジアン値（０−２）以
下の腫瘍を有する患者である；グループＩＩの患者はＦ
ＡＬ値か０．２以上の腫瘍を有する患者である。

ｂ、単一の癌を有する表２由来のすべての患者を含む。

Ｃ０生き続けた患者の平均追跡期間を示している。

すべての患者を総合した（すなわち、まだ生きている患
者と死んだ患者の合計）平均追跡期間は、グループＩの
患者が３１力月、グループＩ＋の患者が１７．５力月で
あった。

一、デュークスの分類は、デュークスＡ型腫瘍（筋肉性
のものまでに制限される）を１．０；デュークスＢ型１
１１ｍ（筋肉性のもの全般）を２．０；　デュークスＣ
型腫瘍（局部リンパ節への転移）を３．０として計算し
　を二　。

ｅ、このグループにおけるＲＡＳ遺伝子変異は既に報告
されている。

ｆ、＠瘍か再発した一人の患者を除いては、すべての患
者で遠方転移が起きた。

ｇ、癌による死。さらにグループＩの６％、グループ１
１の１２％の患者は、癌再発の明確な証拠がないまま死
亡した。

ｈ、ステニープント（Ｓｔｕｄｓｎｔ）のＴテスト。

１、フィッシャー（Ｆｉｓｂｓｒ）の厳密性テスト。

手術時に疾患がそれほど進行していなかった（デューク
スの過程ＡまたはＢ）の患者群における対立遺伝子欠失
と臨床過程との間にも顕著な相関があった。ＦＡＬメジ
アン値以上の目のこのような患者のうち、１１人（７９
％）が手術後に癌の再発（常に遠方転移）が起きた。低
ＦＡＬ値のグループの１４人の過程ＡまたはＢの患者の
うち２人しか癌再発は起こらなかった（ｐ＜０．００１
．フィッシャーの厳密性テスト）。したがって、対立遺
伝子欠失の測定は、さらなる治療を受けることのできる
、他の点から見ると比較的望ましい予後を持つ患者を同
定する助けとなる可能性がある。

実施例５ 本実施例は、欠失以外の遺伝的変異が癌患者に生じ、本
発明の方法で検出可能であることを示している。

実施例１で述べた対立遺伝子型分析の５つの異なる場合
に、　正常組織由来のＤＮＡには観察されなかった新し
いバンドが、対応する腫瘍細胞由来のＤＮＡに見いださ
れた。どの場合にも、異なる染色体腕由来のプローブを
含んでおり、これら５つのプローブは全てＶＮＴＲ型の
ものであった（第３Ｂ図−第３Ｆ図参照）。

第３図パネルＡで示したように調製したサザンプロット
のオートラジオグラフを第３Ｂ図−第３Ｆ図に示す。そ
れぞれの正常（Ｎ）−癌（Ｃ）の組に対して、２種の異
なる酵素による消化の結果を示し、プローブを示しであ
る。Ｂ：患者Ｓ７；　Ｃ：患者５１９１；　Ｄ　：患者
５１５３；　Ｅ　：患者５９８；　Ｆ　：患者５１７５
゜主要な冬型性制限断片のサイズを各オドラジオグラフ
の左側に、腫瘍試料中の新しい断片を星印で示した。

腫瘍細胞を高率で含む腫瘍領域を単離し、これらの領域
の１２ミクロン厚のラジオスタット切片をＤＮＡ調製に
用いた。腫瘍に隣接した、全体的に正常な結腸粘膜を各
患者から採取し、コントロール（正常’）ＤＮＡの調製
に使用した。ＤＮＡ精製、制限エンドヌクレアーゼ消化
、電気泳動、サザントランスファー、およびＤＮＡハイ
ブリダイゼーションは既に報告されているように行った
（Ｎａｔｕｒｔ、　３１８；　３７７　（１９Ｎ）　８
よびＣｘｎｃｅｒ　Ｔｌｅｓｅａｒｃｂ、　４７、４８
０６　（１９８７））。

各腫瘍における新しいバンドのサイズは、用いた酵素に
かかわらず、同様な塩基対数で減少（膿瘍番号５９ｇ、
　５＋５３．およびＳ＋Ｈ）、あるいは増加（腫瘍番号
Ｓ７および５１７５）していた。ＶＮＴＲ配列を含むＤ
ＮＡ断片内のＶＮＴＲ変化の起きる割合は低い（調べた
２９００ＶＮＴＲ対立遺伝子の内、５対立遺伝子が変化
していた）にもかかわらず、我々の研究では、ＶＮＴＲ
配列以外の断片の組み換えは見いだされなかった（非Ｖ
ＮＴＲプローブで３１００対立遺伝子を試験した）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、解析によって検出された個々の染色体腕の対
立遺伝子欠失頻度をグラフで示している。 第２図は、個々の腫瘍で蓄積しｔ；対立遺伝子欠失を示
している。各腫瘍における対立遺伝子欠失指数は、対立
遺伝子欠失が観察された染色体腕の数を対立遺伝子マー
カーが情報を含む（すなわち、正常組織由来のＤＮＡが
ヘテロなパターンを示すもの）染色体腕の数で割ったも
のとして定義される。 第３図は、正常組織（Ｎ）と癌組織（Ｃ）由来のＤＮＡ
を比較する対立遺伝子解析の倒を示している。パネルＡ
、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、およびＦは、６人の異なる患者、５
１４１．５７．５１９１．５１５３．　Ｓ！Ｈ１および
５１７５をそれぞれ示している。用いた制限酵素および
放射性プローブは、各プロットの下に列挙しである。 （外４名〕 丈了立ｉｌｌム手、に夫ｔあるＩ−鳴 瞳 疼 麩 手続補正書（方式） ％式％ 事件の表示 平成２年特許願第６６７３９号 ２、発明の名称 癌評価方法 ３゜ 補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 住　　所 名　　称　　ザ・ションズ・ホプキンス・ユニパーシテ
ィ４゜

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、患者の腫瘍組織由来の第一のＤＮＡ試料および同一
   の患者の非腫瘍組織由来の第二のＤＮＡ試料を単離し； 一群の対立遺伝子の存在について第一のＤＮＡ試料と第
   二のＤＮＡ試料の試験を行い； 患者がヘテロに持つ該一群の対立遺伝子のうち、第二の
   試料と比較した場合の第一の試料の欠失の百分率を決定
   する；各行程からなりこの際に、患者がヘテロに持つ該
   群の中の対立遺伝子の百分率が患者の予後と関連した腫
   瘍組織中の遺伝子変化の程度の指標を与えるような充分
   な数の対立遺伝子を該群が有することを特徴とする、腫
   瘍組織中の遺伝子変化の程度を評価するための方法。 ２、決定された対立遺伝子の欠失の百分率に基づいた予
   後を与える行程をさらに含む、特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ３、一群の対立遺伝子が、ヒトゲノムの染色体の末端動
   原体でない各腕に由来する少なくとも一つの対立遺伝子
   を含んでいる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、腫瘍組織が、肺癌、結腸癌、胸癌、膀胱癌、前立腺
   癌、肝臓癌、および胃癌からなる群から選択された癌で
   ある、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、腫瘍組織が結腸直腸癌である特許請求の範囲第４項
   記載の方法。 ６、第一の試料ＤＮＡまたは第二の試料ＤＮＡがクリオ
   スタット切片作製によつて得られた組織から分離された
   ものである、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、第一の試料ＤＮＡまたは第二の試料ＤＮＡがパラフ
   ィンまたはプラスチック中に保存された組織から分離さ
   れたものである、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８、一群の対立遺伝子の存在を試験するための行程が： 第一および第二のＤＮＡ試料を制限エンドヌクレアーゼ
   で消化して第一および第二の制限断片群を作成し； 制限断片を該制限断片群のそれぞれに分離し；各該制限
   断片群中の制限断片を、制限断片長多型性対立遺伝子を
   検出する一群の核酸プローブにハイブリダイズさせ、プ
   ローブと制限断片からなるハイブリッド二量体を形成さ
   せ； 各制限断片群中のハイブリッド二量体を検出し、比較す
   る； 各行程によって行われる、特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ９、制限断片を電気泳動ゲルマトリックス上で分離し； 分離された断片を固体支持体に転移し； 核酸プローブを、固体支持体上の分離された断片にハイ
   ブリダイズするものである、 特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、核酸プローブを放射性標識し、 ハイブリッド分子をオートラジオグラフィーで検出する
   ものである、特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、核酸プローブが多様な数のタンデム反復配列にハ
   イブリダイズする、特許請求の範囲第８項記載の方法。 １２、一群の対立遺伝子の存在に関する試験の行程が： ー群の一本鎖プライマーの組を該第一および第二の試料
   ＤＮＡにアニールさせることであって、該組の各々のプ
   ライマーがＤＮＡの逆の鎖にアニールし、該プライマー
   の組の各々が制限断片長多型性を含むＤＮＡの領域を包
   含するものであること； 反復するＤＮＡ合成サイクルによって、プライマーの組
   に包含される該第一と第二のＤＮＡ試料中のＤＮＡ領域
   を増幅すること； 増幅されたプライマーの組によって包含されたＤＮＡ領
   域を検出し、該第一と第二の試料中の増幅された領域を
   比較すること； によって行われるものである、特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 １３、ＤＮＡの増幅された領域が、増幅されたＤＮＡ試
   料を電気泳動ゲルマトリックス上で分離し、エチジウム
   ブロマイドで染色することによって検出するものである
   、特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、ＤＮＡ試料の増幅された領域を電気泳動ゲルマト
   リックス上で分離し、分離された増幅されたＤＮＡ試料
   を固体支持体に転移し、プライマーの組の一方と相同性
   のある核酸プローブまたは包含されたＤＮＡ領域とハイ
   ブリダイズさせることによって、増幅されたＤＮＡ領域
   を検出するものである、特許請求の範囲第１２項記載の
   方法。 １５、核酸プローブが放射性標識されており、プローブ
   がオートラジオグラフィーによって検出されるものであ
   る、特許請求の範囲第１４項記載の方法。 １６、該群の該プライマーの組の少なくとも一つが、多
   様な数のタンデム反復配列に対するプローブにハイブリ
   ダイズするＤＮＡ領域を包含するものである、特許請求
   の配列に第１４項記載の方法。 １７、腫瘍組織中の遺伝子変化の程度を測定するための
   キットであって： ヒト対立遺伝子に対する核酸プローブの組を含むもので
   あり、患者がヘテロに持つ該プローブの組によって検出
   される、患者の腫瘍組織中の対立遺伝子の欠失の百分率
   が、腫瘍組織中の遺伝子変化の程度および予後に関連す
   る遺伝子変化の程度の測定値を与えるように、該組が充
   分に多数の対立遺伝子を検出するものであり、該プロー
   ブが制限断片長多型性を検出するものである、前記キッ
   ト。 １８、一つ以上のプローブが多様な数のタンデム反復配
   列を検出する、特許請求の範囲第１７項記載のキット。 １９、核酸プローブの該組が、ヒトゲノムの末端動原体
   性でない各腕由来の少なくとも一つの対立遺伝子に対す
   るプローブを含んでいるものである、特許請求の範囲第
   １７項記載のキット。 ２０、腫瘍組織中の遺伝子変化の程度を測定するための
   キットであって： ヒトＤＮＡに対する一本鎖核酸プライマーの組の群であ
   って、該組の各々のプライマーがＤＮＡの逆の鎖にアニ
   ールするものであり、プライマーの該組の各々が制限断
   片長多型性を含むＤＮＡ領域を包含しているもの；患者
   の腫瘍組織中の、患者がヘテロに持つプライマーの組の
   該群によって包含された制限断片長多型性対立遺伝子の
   欠失百分率が、予後と関連した遺伝子変化の指標を与え
   るように、充分な数のプライマーの組を含んでいるプラ
   イマーの群； を含んでいる前記キット。 ２１、一つ以上のプライマーの組が多様な数のタンデム
   反復配列を包含している、特許請求の範囲第２０項記載
   のキット。 ２２、一本鎖核酸プライマーの組の該群が、ヒトゲノム
   の末端動原体でない染色体の腕の各々由来の少なくとも
   一つのＤＮＡ領域を包含しているプライマーの組を含ん
   でいるものである、特許請求の範囲第２０項記載のキッ
   ト。