JP3152917B2 - 癌評価方法 - Google Patents

癌評価方法

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JP3152917B2
JP3152917B2 JP06673990A JP6673990A JP3152917B2 JP 3152917 B2 JP3152917 B2 JP 3152917B2 JP 06673990 A JP06673990 A JP 06673990A JP 6673990 A JP6673990 A JP 6673990A JP 3152917 B2 JP3152917 B2 JP 3152917B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、癌の一般化評価方法に関する。更に、詳細
には、本発明は、腫瘍組織における遺伝子変化の程度を
評価する方法に関する。
以前の報告は、特異的な癌における特異的な対立遺伝
子（Allele）の欠失に焦点をあてたものである。例え
ば、染色体腕13qの欠失は網膜芽腫と関連している。
（カベニー（Cavenee）他、Nature,Vol.305,p.779（198
3））このような場合には、欠失は、ゲノムに存在する
と無制御な増殖を抑制する腫瘍抑制遺伝子を含んでいる
と考えられている。
特異的な癌に関連した特異的な遺伝子のこのような例
に対して、フローサイトメトリーや核型分析などの技術
を用いたより一般的な研究から、癌細胞において全体的
な染色体異常が起こっていることが示唆された。その中
には、欠失、転座、および重複が含まれる。しかしなが
ら、全体の染色体異常を分子レベルで評価する方法はこ
れまでこの分野では開発されていなかった。本分野で
は、このような方法および腫瘍再発、腫瘍転移、および
死亡率の予後を与える分子的手段の必要がある。
本発明の目的は、腫瘍組織における遺伝子変化の程度
を評価する方法を与えることである。
本発明の別の目的は、核型分析にも、癌形成に関与し
ていると思われる特異的な遺伝子の解析にも頼らない、
腫瘍組織における遺伝子変化の程度を評価する方法を与
えることである。
本発明のさらに別の目的は、一群の多型性対立遺伝子
の欠失を測定することによって腫瘍組織における遺伝子
変化の程度を評価する方法を与えることである。
本発明のさらに別の目的は、患者の予後を決定できる
ようにするために腫瘍組織における遺伝子変化の程度を
評価する方法を与えることである。
本発明の別の目的は、腫瘍組織における遺伝子変化の
程度を評価するためのキットを与えることである。
上記の、およびその他の本発明の目的は、以下で述べ
る一つ以上の態様によって与えられる。本発明は腫瘍組
織における遺伝子変化の程度を評価する方法を与えるも
のであり： 患者の腫瘍組織から第一のDNA試料を、また同じ患者
の非腫瘍組織に第二のDNA試料を単離すること； 一群の対立遺伝子の存在に関して第一および第二のDN
A試料を試験すること； 患者がヘテロに持つ該群の中の対立遺伝子の、第二の
試料に対する第一の試料における欠失の百分率を決定す
ることであり、（この際に、患者がヘテロに持つ該群の
対立遺伝子の欠失の百分率が予後と関連した腫瘍組織中
の遺伝子変化の指標を与えるように、該群が充分な数の
対立遺伝子を有している）； の行程を含んでいる。
本発明の別の態様では、一群の対立遺伝子の存在が、
該第一および第二のDNA試料の、制限断片長多型性を検
出する一群の核酸プローブとのサザンハイブリダイゼー
ションを行うことによって試験される。
本発明のさらに別の態様では、該第一と第二のDNA試
料における一連の対立遺伝子の存在が、制限断片長多型
性を含むDNA領域を包含するプライマーの組を用いて該
第一と第二のDNA試料の領域の増幅によって試験され
る。
本発明の望ましい態様では、欠失に関して試験される
一群の対立遺伝子は、ヒトゲノムの末端動原体性でない
各染色体腕に由来する少なくとも一つの対立遺伝子を含
んでいる。
本発明のさらに別の態様では、ヒトの対立遺伝子に対
する一群の核酸プローブを含むキットが与えられるもの
であり、該群は、患者がヘテロに有するプローブの該群
によって検出される対立遺伝子の腫瘍組織における累積
的な欠失が腫瘍組織における遺伝子変化の程度の指標を
与えるのに充分な数の対立遺伝子を検出するものであ
り、遺伝子変化の程度は予後に関連しており、該プロー
ブは制限断片長多型性を検出するものであるもの。
本発明のさらに別の態様では、ヒトDNAに対する一群
の一本鎖核酸プライマーの組を含むキットが与えられ
る。プライマーの組は制限断片長多型性を含む領域を包
含する。該プライマーの組の群は、患者がヘテロに持つ
プライマーの組の該群によって包含される制限断片長多
型性対立遺伝子の、患者の腫瘍組織における累積的な欠
失が、予後に関連する遺伝子変化の指標を与えるのに十
分な数のプライマーの組を含んでいる。
本発明は、正常な非腫瘍組織から分離され得る腫瘍組
織のすべての型に応用可能な一般的方法による技術を与
え、腫瘍過程の予後を示唆する要素を与える。本方法
は、いかなる特異的な疾患に生じるいかなる特異的な遺
伝子変化にも依存していない。
腫瘍細胞中の対立遺伝子の欠失が非常に共通的である
ことは、本発明で見いだされたことである。試験された
各多型性マーカーの対立遺伝子の一つは、少なくとも幾
つかの腫瘍で欠失していることが見いだされた。幾つか
の腫瘍ではその親の対立遺伝子の半分以上が欠失してい
た。さらに、腫瘍組織における対立遺伝子の欠失量は患
者に関する予後的な価値があることが示された。患者が
持っている可能性のある一次腫瘍の大きさと段階にかか
わらず、対立遺伝子欠失の百分率は腫瘍再発および転
移、またそれによる死の予測を与えることができる。以
上のように、腫瘍に於ける対立遺伝子欠失の状態、いわ
ゆる腫瘍対立遺伝子型の決定は、癌患者の予後の分子的
指標を与えるものである。
欠失よりは希であるが、対応する正常組織には存在し
ない新しいDNA断片が幾つかの腫瘍組織に見いだされ
た。新しい断片はVNTR型（多様な数のタンデム反復配
列;variable number of tandem repeats）の反復頻度を
含んでいた。
本発明の方法によって測定される遺伝子変化の程度
は、特異的な遺伝子または座位に依存しない非特異的な
測定である。したがって、多様な異なる対立遺伝子は、
試験の予後的な価値を変える事なく、本方法で試験する
際に用いられる群を含んでいる。しかしながら、累積的
な（すなわち百分率）対立遺伝子の欠失が、予後と関連
する腫瘍組織中の遺伝子変化の程度の指標を与えるよう
にするために、充分に多数の対立遺伝子が用いられなけ
ればならない。望ましい対立遺伝子群には、ヒト染色体
の組の末端動原体ではない腕の各々の上の対立遺伝子が
含まれる。（末端動原体性染色体の腕はゲノム中で数多
く反復しているリボソームRNAの遺伝子を主に含んでい
ると考えられている。これらの配列の反復性は、単一コ
ピーの欠失の検出を困難にすると思われる。）別の対立
遺伝子群あるいは対立遺伝子の亜群も、望ましい対立遺
伝子群によって与えられるのと同様に、予後に関連する
遺伝子変化の程度の指標を与えられるのであれば、使用
可能である。
本発明の各プローブは、制限断片長多型性（RFLP）を
定義している。これは、このような対立遺伝子の存在に
関して正常なヒト集団をスクリーンするとした場合に、
５％以上の人がその対立遺伝子する制限断片の長さが異
なっているというものである。本発明で用いることので
きる特別な型のRFLPは、異なる数のタンデム反復配列
（variable number of tandem repeats;VNTR）に対応す
るものである。
ヒトの対立遺伝子欠失を検出するためには、試験され
る対立遺伝子が患者の正常組織の中で二つの異なる型で
存在していることが望まれる。したがって、患者はその
特異的な対立遺伝子に関してヘテロである。これによ
り、対立遺伝子欠失の解析が単純になり、信頼できるも
のとなる。一般に、ヒトに存在する二つの対立遺伝子の
単一のコピーのみが癌形成の際の対立遺伝子欠失で失わ
れる；それぞれの対立遺伝子に関して二つの明らかに寸
法の異なる断片が存在することにより、単一の対立遺伝
子の欠失の観察が、定量的ではなく定性的な測定とな
る。すなわち、ヘテロな対立遺伝子の欠失を記録するた
めには、特定のサイズの断片の消失を探せばよいことに
なる。正常な組織では患者がその対立遺伝子に関してホ
モであれば、その対立遺伝子の単一のコピーの欠失によ
り、その対立遺伝子を含む制限断片の強度は約50％の減
少を示すであろう。完全な消失は50％の減少よりもはる
かに検出が容易である。
ほとんどの末端動原体でない染色体の腕に対する制限
断片長多型性を検出する核酸プローブは、米国メリーラ
ンド州、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクションから入手可能である。これらは1988年８
月に出版されたNIHヒトDNAプローブおよびライブラリー
保存物目録（the NIH Repository of Human DNA Probes
and Libraries）に記述されている。［MCT 112と呼ば
れるプローブは、カタログでは染色体腕9qにハイブリダ
イズすると登録されているが、9pにハイブリダイズする
ものである。別のプローブ、EFD75は腕10qにハイブリダ
イズするものであるが、第10染色体にハイブリダイズす
ると記述されている。染色体腕8pに対するプローブはNI
H保存物目録には登録されていないが、二つの参考文献
で示されている；ラコステ−ロイヤル（Lacoste−Roya
l）他、Nucleic Acids Res.,Vol.16,4184（1988）；お
よびウッド（Wood）他、Cytogenet.Cell Genet.,Vol.4
2,113（1986）。］制限断片長多型性を検出する他のプ
ローブを得る方法は本分野で既に知られている。ヒトゲ
ノムの非末端動原体の染色体腕の各々にハイブリダイズ
するプローブの完全な組を用いて得られた統計的情報
は、予後的に有用である。この完全な組の他の亜組も有
用な予後情報を得るために使用することができる。他の
亜組の使用が予後と関連する遺伝子変化の程度の測定に
つながるか否かは、安全な対立遺伝子の組の使用の際と
同様に試験することができる。
結腸直腸癌の場合には、それぞれの腫瘍で見られた対
立遺伝子欠失のメジアン量は、試験したこれらの対立遺
伝子の約20％である。メジアンよりも高い対立遺伝子欠
失を持つ患者は、メジアン以下の対立遺伝子欠失を持つ
ものよりも癌再発および死の危険性が顕著に高いことが
見いだされた。他の対立遺伝子の組が予後を示唆する要
素として適当であるかどうかは、結腸直腸癌患者の集団
に関して、その集合内で同程度の対立遺伝子欠失が見い
だされること、および対立遺伝子欠失の量が癌再発およ
び死と関連づけられることを確認して試験するべきであ
る。
他の型の癌に関して対立遺伝子欠失の特徴的なレベル
を見いだすために、同じ型の癌患者の集団の評価を行う
べきである。集団中に50人以上の患者がいることが望ま
しい。多様な癌の型に対する対立遺伝子欠失の平均量は
型によって異なる可能性はあるが、すべてに対して同じ
傾向が見られるであろう。ある特別な癌に於ける対立遺
伝子欠失量が大きいことは、癌再発および死の危険が高
いことを示し、対立遺伝子欠失量が低いことは危険性が
低いことを示唆する。本発明の方法が有用である他の癌
の型には、肺癌、結腸癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、肝
臓癌、および胃癌が含まれる。
本発明の方法によれば、各患者から２種類のDNA試料
が単離される。一つのDNA試料は腫瘍組織から単離さ
れ、第二の試料は非腫瘍組織から単離される。非腫瘍組
織は腫瘍組織と同じ型の組織から単離されたものでも、
異なる器官から単離されたものでも使用可能である。腫
瘍組織が一次腫瘍細胞を含んでいること、および、正常
細胞が腫瘍組織から分離されることが望ましい。癌細胞
を非癌細胞から分離する方法は、本分野では既知であ
り、いづれの方法を用いてもよい。例えば、パラフィン
切片およいクリオスタット切片からのDNA単離、および
２倍体細胞から異数体細胞を分離するフローサイトメト
リーを用いることが可能である。DNAはプラスチック中
に保存された組織から単離することも可能である。細胞
サイズまたは密度に基づいた単離法も用いられる。組織
が単離されれば、本分野で既知のいかなる方法によって
も組織からのDNAの単離は可能である。マニアティス（M
aniatis）他、Molecular Cloning,a laboratory manua
l、コールド・スプリング・ハーバー研究所、1982に記
述されているように、組織は細かく刻むか、ホモジナイ
ズし、得られた細胞を酵素と界面活性剤の混合物を用い
て溶解する。核酸は、フェノールおよびクロロホルム抽
出、およびエタノール沈澱などの標準的な技術を用いて
抽出される。
特別の対立遺伝子の欠失に関する試験は、以下に述べ
る多数の方法によって行うことができる。前述のよう
に、対立遺伝子型欠失解析で用いられる対立遺伝子は、
患者がヘテロに持つものが望ましい。これは、患者の非
腫瘍組織から単離された第二のDNA試料を試験し、制限
断片長多型がある対立遺伝子に関する特異的な核酸プロ
ーブに、ハイブリダイズする断片のサイズと数を記録す
ることによって決定することができる。例えば、ホモ２
倍体であれば、制限断片長多型性プローブにハイブリダ
イズする断片がある制限酵素による切断で一つしか生成
しないのに対し、ヘテロ２倍体では同じプローブにハイ
ブリダイズする二つの異なるサイズの断片がその酵素に
よる切断によって生じる。ヘテロ２倍体性を決定するこ
とは、本分野の技術では既知のものである。
対立遺伝子の欠失は、腫瘍組織に対する正常組織に於
ける対立遺伝子に対応する断片のパターンを比較するこ
とにより決定される。例えば、非腫瘍組織がある対立遺
伝子に対して二つの断片を有し、腫瘍組織が一つの断片
を有する場合には、一つの欠失が数えられる。このよう
な対立遺伝子欠失数を患者がヘテロに持つ対立遺伝子の
数で割ると、FAL（対立遺伝子欠失指数;fractional all
elic loss）と呼ばれる指標因子、すなわち対立遺伝子
欠失百分率が得られる。FALは以下に示す表３に示すよ
うに、癌の予後において有意な因子であることが既に示
されている。FALは、転移、癌再発、およびそれによる
死の予測の指標を与える。
対立遺伝子の欠失に関する試験の一つの手段は、それ
ぞれ腫瘍組織および非腫瘍組織由来の第一および第二の
DNAを制限エンドヌクレアーゼで消化することによる。
制限エンドヌクレアーゼは本分野ではよく知られてい
る。これは特異的な配列でDNAを切断するため、各DNA試
料由来の分断されたDNA断片群を形成させるのに使用さ
れる。各DNA試料の制限断片は本分野における既知のど
の方法によっても分離することができる。例えば、アガ
ロースやポリアクリルアミドなどの電気泳動ゲルマトリ
ックスを用いて、断片をサイズなどの物理的性質によっ
て電気泳動的に分離することができる。制限断片は上述
のように制限断片長多型性を検出する核酸プローブにハ
イブリダイズさせることができる。ハイブリダイゼーシ
ョンの際に、少なくとも一本鎖のプローブと一本鎖の対
応する制限断片とを含むハイブリッド２量体が形成され
る。液相法、固相法を含むさまざまなハイブリダイゼー
ション技術が本分野で知られている。一つの特に有用な
方法では、分離された断片を、電気泳動ゲルマトリック
スからナイロンや濾紙などの固体指示体に、電気泳動ゲ
ルマトリックス上で保持されている相対的な位置を断片
が維持するようにトランスファーすることを用いる。ハ
イブリッド２量体は本分野で既知のいかなる方法によっ
ても検出可能であり、例えば、核酸プローブが放射性標
識されている場合には、オートラジオグラフィーによっ
て検出される。他の標識法および検出法も分野では知ら
れており、本発明で使用可能である。
対立遺伝子欠失の存在を試験するもう一つの方法は、
PCR（ポリメラーゼ連鎖反応;polymerase chain reactio
n）として知られる技術を用いることによる。この方法
によれば、制限断片長多型性を含む限られたDNA領域が
増幅される。増幅は、アニーリング、すなわち、通常DN
Aからなる１組の一本鎖プライマーを患者由来の該第一
および第二のDNA試料にハイブリダイズさせることによ
って行われる。プライマーの組は、染色体上で逆向き
で、しかし収束するようにDNA合成をプライミングする
ように、DNAの逆の鎖にアニーリングさせる。プライマ
ーの組は制限断片長多型性を含むDNA領域を包含する。
すなわち、プライマーは制限断片長多型に隣接するDNA
にアニールする。制限断片長多型を含む領域の増幅は、
DNAポリメラーゼによって触媒されるDNA合成サイクルを
反復することによって行われる。DNAポリメラーゼは、
比較的熱に安定なTaqポリメラーゼが望ましい。DNA合成
には、DNA合成のための化合物、すなわち、各４種のデ
オキシリボヌクレオチド３リン酸が必要である。DNA合
成の新しいサイクルを開始させるためには、プライマー
をDNA鋳型、すなわち第一および第二のDNA試料から分離
しなければならない；分離は、DNA2量体の融点以上の温
度に加熱することによって容易に行われる。合成の新し
いサイクルを再開始させるためには、プライマーと鋳型
DNAを再アニーリングさせる。約10サイクル後、反応混
合液にさらにDNAポリメラーゼを加えることが望まし
い。増幅産物は、プライマーが結合しているDNA2量体で
ある。PCR技術は、ここに参考として含める、米国特許
第4,682,195号；第4,683,202号；および第4,683,194号
各明細書に記述されている。
プライマーの組に包含されている、増幅されたDNA領
域は、多数の方法によって検出可能である。例えば、増
幅されたDNA試料を電気泳動ゲルマトリックスで分離
し、分離されたDNAをエチジウムブロマイドで染色する
ことができる。これらの技術は本分野では非常によく知
られている。幾つかの場合では、増幅されたDNA領域内
の多型性配列を認識する制限エンドヌクレアーゼで増幅
されたDNA試料を切断することが多型性断片の生成に必
要とされる。増幅されたDNAは電気泳動ゲルマトリック
スで分離し、続いて、核酸プローブとのハイブリダイゼ
ーションが行える固体支持体（ナイロンまたは濾紙）に
トランスファーすることができる。核酸プローブは、プ
ライマーの組のどちらか一方、または包含されたDNA領
域と相同なものである。核酸プローブは本分野で既知の
いかなる方法によっても検出可能である。通常は、放射
性物質をプローブの標識に使用し、オートラジオグラフ
ィーによって検出する。
ポリメラーゼ連鎖反応技術で用いられるプライマー
は、制限断片長多型性を検出するプローブを用いてデザ
インすることができる。プライマーは、DNAプローブま
たは、使用する際でもRFLP対立遺伝子を含む領域を包含
できるようなほかの部分の末端を使用できる。制限断片
長多型性を含むことが分かっているDNAを用いて、プラ
イマーの有用性を試験することができる。例えば、ある
対立遺伝子に関してヘテロであることがプローブによっ
て示されている患者の正常組織由来のDNA試料をプライ
マーの組の試験に使用できる。プライマーの組が、DNA
試料の増幅によって二つ以上の断片を生じさせるなら
ば、そのプライマーの組は本発明の方法で有用である。
核酸プローブ群、またはプライマーの組の群、あるい
はその双方を含むキットも本発明によって与えられる。
キットは腫瘍組織中の変化の程度の指標を与えるために
十分多数の対立遺伝子の累積的欠失が決定できるように
するために、充分多数のプローブまたはプライマーを含
んでいる。その指標は予後と関連している。該キット中
の核酸は、溶液または凍結乾燥した形で与えられる。有
効期間を最大にするために、核酸は無菌状態で、ヌクレ
アーゼの混入がないようにすることが望ましい。
以下の実施例は本発明の範囲を制限することを意図し
たものではない。これらは単に本発明を実施するための
具体的で実際的な方法を示すために記述するものであ
る。
実施例１ 本実施例は対立遺伝子欠失分析を行う場合の方法を示
す。
患者S141（腫瘍Ａ）の正常組織（Ｎ）および腫瘍組織
（Ｃ）由来のDNAを制限エンドヌクレアーゼ（Taq Iおよ
びMsp I）で切断し、断片を電気泳動によって分離し、
ナイロンフィルターにトランスファーした。フィルター
を上述の放射性プローブとともにインキュベートした。
結果を第3A図に示す。多型性制限断片のサイズを各断片
の左側に示す。プローブRM7.4およびg3に関しては、大
きいほうの対立遺伝子が腫瘍からは失われていた；プロ
ーブEFD64,1に関しては、小さいほうの対立遺伝子が失
われていた。プローブの由来と説明は、以下の実施例２
に示す。
実施例２ 本実施例は、56の一次結腸直腸癌の対立遺伝子型解
析、および各染色体腕についての腫瘍群中の対立遺伝子
欠失量について示したものである。
DNAは、外科的に除去された56の一次結腸直腸癌のク
リオスタット切片から精製し、同一の患者の正常な結腸
組織由来のDNAと比較した。RFLPを検出するプローブ
を、各プローブで検出される二つの親の対立遺伝子が腫
瘍細胞由来のDNAで特異的に失われているかどうかを決
定するために使用した。すべての非末端動原体性常染色
体腕に関して調べた；末端動原体の腕（13p.14p,15p,21
p,および22p）上に存在していることが知られている遺
伝子だけがリポソームのものであった。39の各非末端動
原体性染色体腕に関して、二つの親の対立遺伝子が少な
くとも20の患者の正常組織で区別され得る（すなわち、
含情報患者）ことを確認するために、充分なプローブを
用いた。
対立遺伝子型欠失の研究に用いたプローブを以下に列
挙する： 染色体1p（36含情報腫瘍）−プローブYNZ 2:Y.ナカム
ラ（Nakamura）他、Nucleic Acids Res.16,4747（198
8）；染色体1q（47含情報腫瘍）−プローブYNA 13;Y.ナ
カムラとR.ホワイト（White）、Nucleic Acids Res.16,
（1988）；染色体2p（27含情報腫瘍）−プローブEFD 12
2:E.フジモト他、Nacleic Acids Res.15、10078（198
7）；染色体2q（45含情報腫瘍）−プローブYNH 24:Y.ナ
カムラ他、Nucleic Acids Res.15、10073（1987）；染
色体3p（25含情報腫瘍）−プローブEFD 145:E.フジモト
他、Nucleic Acids Res.16、9357（1988）；染色体3q
（26含情報腫瘍）−プローブEFD 64.1:Y.ナカムラ他、N
ucleic Acids Res.印刷中；染色体4p（23含情報腫瘍）
−プローブYNZ 32:Y.ナカムラ他、Nucleic Acids Res.1
6、4186（1988）；染色体4q（20含情報腫瘍）−プロー
ブKT 218:S.ハンフリーズ（Humpbries）他、Hum.Genet.
68,148（1984）；染色体5p（31含情報腫瘍）−プローブ
JON 35 E−ＡおよびJO209 E−B:J.オーバーハウザー（O
verhauser）,J.マクマーハン（McMahan）およびJ.ワス
マス（Wasmuth）,Nucleic Acids Res.15、4617（198
7）；染色体5q（55含情報腫瘍）−プローブ213−205,TP
5E,C11P11,HF12−65,105−153;M.レパート（Leppert）
他、Science 238、1411（1987）；染色体6p（32含情報
腫瘍）−プローブYNZ 132:Y.ナカムラ他、Nucleic Acid
s Res.16、5708（1988）；染色体6q（31含情報腫瘍）−
プローブJCZ 30:Y.ナカムラ他、Nucleic Acids Res.1
6、4743（1988）；染色体7p（22含情報腫瘍）−プロー
ブRM7.4:R.メイヤーズ（Myers）他、Nucleic Acids Re
s.16,3591（1988）；染色体7q（51含情報腫瘍）−ロー
ブg3:Z.ウォン（Wong）,V.ウィルソン（Wilson）,A.J.
ジェフェリーズ（Jeffereys）,S.L.テイン（Thein）,Nu
cleic Acids Res.14、4605（1988）；染色体8p（22含情
報腫瘍）−プローブNF−L:G.ラコステ−ロイヤル（Laco
ste−Royal）、M.マシュー（Mathieu）,J.P.ジュリエン
（Julien）,S.ゴーティエ（Gauthiers），およびD.ゴブ
リュー（Ganvrean）,Nucleic Acids Res.16、4184（198
8）；プローブSW50:S.ウッド（Wood）他、Cytogenet.Ce
ll Genet.42、113（1986）；染色体8q（26含情報腫瘍）
−プローブMCT128.2:Y.ナカムラ他、Nucleic Acids Re
s.16、3590（1988）；染色体9p（27含情報腫瘍）−プロ
ーブMCT112:M.カールソン（Carlson）他、Nucleic Acid
s Res.15、10614（1987）；プローブHHH220:M.ホフ（Ho
ff）他、Nucleic Acids Res.15、10606（1987）；染色
体9q（39含情報腫瘍）−プローブEFD126.3:Y.ナカムラ
他、Nucleic Acids Res.15、10607（1987）；染色体10p
（37含情報腫瘍）−プローブTBQ 7:T.ブラッグ（Brag
g）,Y.ナカムラ、C.ジョーンズ（Jones）およびR.ホワ
イト（White）、Nucleic Acids Res.印刷中（1989）；
染色体10q（37含情報腫瘍）−プローブEFD 75:Y.ナカム
ラ、E.フジモトおよびR.ホワイト、Nucleic Acids Res.
印刷中（1989）；染色体11p（33含情報腫瘍）−プロー
ブEJ:C.シー（shih）およびR.A.ワインバーグ（Weinber
g）,Cell 29,161（1982）；染色体11q（28含情報腫瘍）
−プローブMCT128.1:M.カールソン他、Nucleic Acids R
es.16、378（1988）；染色体12p（39含情報腫瘍）−プ
ローブEFD 33.2:E.フジモト、R.メイヤーズ（Myers）,
Y.ナカムラ、R.ホワイト、Nucleic Acids Res.投稿中
（1988）；染色体12q（24含情報腫瘍）−プローブYNH 1
5:Y.ナカムラ他、Nucleic Acids Res.16、770（198
8）；染色体13q（44含情報腫瘍）−プローブMHZ 47:Y.
ナカムラ他、Nucleic Acids Res.16、3119（1988）；染
色体14q（50含情報腫瘍）−プローブCMM 101:Y.ナカム
ラ他、Nucleic Acids Res.16、381（1988）；染色体15q
（24含情報腫瘍）−プローブTHH 55:T.ホルム（Holm）
他、Nucleic Acids Res.16、3117（1988）；染色体16p
（27含情報腫瘍）−プローブEKDMA 2:E.ウォルフ（Wolf
f）他、Nucleic Acids Res.16、9885（1988）；染色体1
6q（42含情報腫瘍）−プローブ79−２−23:L.バフトン
（Bufton）他、Hum.Genet.74,425（1986）；染色体17p
（56含情報腫瘍）−プローブYNZ 22:Y.ナカムラ他、Nuc
leic Acids Res.16、5707（1988）；プローブYNH 37.3:
Y.ナカムラ他、Nucleic Acids Res.16,782（1988）；プ
ローブMCT 35.1:M.カールソン他、Nucleic Acids Res.1
6、700（1988）；染色体17q（44含情報腫瘍）−プロー
ブHtk9:P.D.マーフィー（Murphy）他、Nucleic Acids R
es.14、4381（1986）；プローブTHH 59:Y.ナカムラ他、
Nucleic Acids Res.16、3598（1988）；染色体18p（27
含情報腫瘍）−プローブB74:F.モーレ（Morle）他、Cyt
ogenet.Cell Genet.37,544（1984）；染色体18q（53含
情報腫瘍）−プローブOS−4:I.ニシショー他、Jpn.J.Hu
m.Genet.32 1（1987）；プローブOLVIIA8:O.デラットレ
（Delattre）他、Nucleic Acids Res.15、1343（198
7）；プローブOLVIIE10:F.マールヘンス（Marlhens）
他、Nucleic Acids Res.15、1348（1987）；プローブHH
H64:K.ヨシオカ、N.ヨシオカ、K.ナカベップ、Y.サカ
イ、Nucleic Acids Res.14,3147（1986）；プローブERT
25:U.ミュラー（Muller）他、Cytogenet.Cell Genet.4
6,16（1987）；染色体19p（44含情報腫瘍）−プローブJ
CZ 3.1:Y.ナカムラ他、Nucleic Acids Res.16、1229（1
988）；染色体19q（37含情報腫瘍）−プローブRB1−4:
C.ジュリエー（Julier）,E.ウォルフ、Y.ナカムラ、お
よびR.ホワイト、Nucleic Acids Res.印刷中（1989）；
染色体20p（46含情報腫瘍）−プローブCMM6:Y.ナカムラ
他、Nucleic Acids Res.16、5222（1988）；染色体20q
（22含情報腫瘍）−プローブMS1−27:D.バーカー（Bark
er）,M.シェーファー（Schafer）およびR.ホワイト、Ce
ll 36,131（1984）；染色体21q（27含情報腫瘍）−プロ
ーブMCT 15:Y.ナカムラ他、Nucleic Acids Res.16、988
2（1988）；染色体22q（41含情報腫瘍）−プローブEFZ
31:K.クラプチョ（Krapcho）他、Nucleic Acids Res.1
6、5221（1988）；プローブAEB2.3:C.M.ルービン（Rubi
n）他、Nucleic Acids Res.印刷中（1989）；プローブE
W7.2:T.ブラッグ、Y.ナカムラ、E.ウォルフ、J.−M.ラ
ルール（Lalouel）およびR.ホワイト、Nucleic Acids R
es.印刷中（1989）。
対立遺伝子欠失は、制限断片長多型性解析によって評
価し、その例を第３図に示した。正常な結腸粘膜と腫瘍
組織の組由来のDNAを３つの制限酵素（Taq I,Msp I,ま
たはHind III）のうち１種で切断し、各非末端動原体染
色体腕由来のプローブで評価した。含情報腫瘍、すなわ
ち、該染色体腕由来のひとつ以上の対立遺伝子マーカー
に関して正常組織由来のDNAがヘテロなパターンを示す
もののみを、対立遺伝子欠失頻度の決定に使用した。対
立遺伝子欠失は、正常DNAに存在するRFLP断片が腫瘍細
胞の少なくとも80％で失われている場合に、腫瘍DNAを
精製したクリオスタット切片のオートラジオグラフと組
織学的評価との比較によって評価して計算した。
各染色体腕由来の対立遺伝子は、少なくとも幾つかの
腫瘍で欠失していた（第１図および表Ｉ参照）。しか
し、対立遺伝子欠失頻度は著しく異なり、二つの染色体
腕（17pおよび18q）由来の対立遺伝子は75％以上の腫瘍
で欠失しており、９個の腕（1q,4p,5q,6p,8p,9q,18p,22
q）由来の対立遺伝子は25から50％の腫瘍で欠失し、残
りの28の腕では７から24％の腫瘍で欠失していた。
表１ 注 a.マーカーの参考文献は、実施例２に示す。
b.“V"はVNTRマーカーを示す；“S"は制限酵素部位多型
性マーカーを示す。
c.M＝Msp I;T＝Taq I;H＝Hind III d.示唆された染色体腕に関するひとつ以上のマーカーが
情報を与えるものである腫瘍の数（すなわち、対応する
正常組織由来のDNAがヘテロなパターンを示すものの
数）。
e.含情報腫瘍のみをこの百分率の評価に用いた。欠失
は、本文で述べたように、これらがクローン性である場
合にのみ、ポジティブと計算した。
欠失を含む染色体のｐ腕とｑ腕の双方のマーカーに関
して患者が情報を持つ（ヘテロである）対立遺伝子欠失
は127例あった。これらのうち65％は二つの染色体腕の
うち一方にのみ対立遺伝子欠失が起こっていた。したが
って、本研究で観察された欠失の大部分は間隙欠失（in
terstitial deletion）、体細胞分裂組み換え（mitotic
recombination）、あるいは遺伝子変換（gene convers
ion）によって媒介される、染色体の部分的な現象であ
り、完全な染色体の欠失ではないことを示している。
実施例３ 本実施例は、各腫瘍の対立遺伝子欠失量を示すもので
ある。
我々は、腫瘍中の対立遺伝子欠失指数（fractional a
llelic loss;FAL）を、対立遺伝子欠失が観察された染
色体腕の数を、患者の正常細胞において対立遺伝子マー
カーが情報を含む（ヘテロである）染色体腕の数で割っ
たものとして定義した。調べた56の腫瘍における平均FA
L値は0.20であり、言い換えれば、評価可能な染色体腕
のうち20％から対立遺伝子が欠失していた。12の腫瘍に
おいては、評価可能な染色体腕の３分の１以上が対立遺
伝子欠失を起こしていた。（第２図および表２参照） 表２ 注 a.二人の患者（S1119およびS141）は二つの独立した腫
瘍を持っていた。
b.＝正常組織由来のDNAがひとつ以上の対立遺伝子マー
カーでヘテロであることが示されたが、双方の対立遺伝
子が腫瘍DNAに保持されている、染色体腕の数。
c.＝本文中で定義した、対立遺伝子欠失分数。
実施例４ 本実施例は対立遺伝子欠失指数の予後的価値を示すも
のである。
患者を二つの集団に分離した：一つは平均FAL値以下
を持つ腫瘍を有する患者（グループＩ、FALが0.2以下）
であり、もう一方は平均値より大きい値を持つ腫瘍を有
する患者（グループII）である。双方のグループの患者
を38カ月以上追跡調査した。二つのグループの患者は、
同様の性分布および年齢分布であり、腫瘍の平均サイズ
および侵入の程度（デュークスの分類）はほとんど同等
であった。通常、結腸直腸癌で起きる他の遺伝的変異
（Ras遺伝子変異）の傾向は、二つのグループで同等で
あった。これらの相同性にもかかわらず、欠失がより多
い（FALが高い）患者は明らかに他方のグループよりも
癌再発の可能性が高かった（ｐ＜0.01）。表３参照。こ
れらの患者はその癌により死ぬ可能性も明らかに高かっ
た（ｐ＜0.01）。
表３ 注 a.グループ１の患者は、表２に示した56の腫瘍の対立遺
伝子欠失指数（FAL）のメジアン値（0.2）以下の腫瘍を
有する患者である；グループIIの患者はFAL値が0.2以上
の腫瘍を有する患者である。
b.単一の癌を有する表２由来のすべての患者を含む。
c.生き続けた患者の平均追跡期間を示している。すべて
の患者を総合した（すなわち、まだ生きている患者と死
んだ患者の合計）平均追跡期間は、グループＩの患者が
31カ月、グループIIの患者が17.5カ月であった。
d.デュークスの分類は、デュークスＡ型腫瘍（筋肉性の
ものまでに制限される）を1.0;デュークスＢ型腫瘍（筋
肉性のもの全般）を2.0;デュークスＣ型腫瘍（局部リン
パ節への転移）を3.0として計算した。
e.このグループにおけるRAS遺伝子変異は既に報告され
ている。
f.腫瘍が再発した一人の患者を除いては、すべての患者
で遠方転移が起きた。
g.癌による死。さらにグループＩの６％、グループIIの
12％の患者は、癌再発の明確な証拠がないまま死亡し
た。
h.ステューデント（Student）のＴテスト。
i.フィッシャー（Fisher）の厳密性テスト。
手術時に疾患がそれほど進行していなかった（デュー
クスの過程ＡまたはＢ）の患者群における対立遺伝子欠
失と臨床過程との間にも顕著な相関があった。FALメジ
アン値以上の14のこのような患者のうち、11人（79％）
が手術後に癌の再発（常に遠方転移）が起きた。低FAL
値のグループの14人の過程ＡまたはＢの患者のうち２人
しか癌再発は起こらなかった（ｐ＜0.001,フィッシャー
の厳密性テスト）。したがって、対立遺伝子欠失の測定
は、さらなる治療を受けることのできる、他の点から見
ると比較的望ましい予後を持つ患者を同定する助けとな
る可能性がある。
実施例５ 本実施例は、欠失以外の遺伝的変異が癌患者に生じ、
本発明の方法で検出可能であることを示している。
実施例１で述べた対立遺伝子型分析の５つの異なる場
合に、正常組織由来のDNAには観察されなかった新しい
バンドが、対応する腫瘍細胞由来のDNAに見いだされ
た。どの場合にも、異なる染色体腕由来のプローブを含
んでおり、これら５つのプローブは全てVNTR型のもので
あった（第3B図−第3F図参照）。
第３図パネルＡで示したように調製したサザンブロッ
トのオートラジオグラフを第3B図−第3F図に示す。それ
ぞれの正常（Ｎ）−癌（Ｃ）の組に対して、２種の異な
る酵素による消化の結果を示し、プローブを示してあ
る。B:患者S7;C:患者S191;D:患者S153;E:患者S98;F:患
者S175。主要な多型性制限断片のサイズを各オートラジ
オグラフの左側に、腫瘍試料中の新しい断片を星印で示
した。
腫瘍細胞を高率で含む腫瘍領域を単離し、これらの領
域の12ミクロン厚のクリオスタット切片をDNA調製に用
いた。腫瘍に隣接した、全体的に正常な結腸粘膜を各患
者から採取し、コントロール（正常）DNAの調製に使用
した。DNA精製、制限エンドヌクレアーゼ消化、電気泳
動、サザントランスファー、およびDNAハイブリダイゼ
ーションは既に報告されているように行った（Naturu,3
18;377（1985）およびCancer Research,47;4806（198
7））。
各腫瘍における新しいバンドのサイズは、用いた酵素
にかからず、同様な塩基対数で減少（腫瘍番号S98,S15
3,およびS191）、あるいは増加（腫瘍番号S7およびS17
5）していた。VNTR配列を含むDNA断片内のVNTR変化の起
きる割合は低い（調べた2900VNTR対立遺伝子の内、５対
立遺伝子が変化していた）にもかかわらず、我々の研究
では、VNTR配列以外の断片の組み換えは見いだされなか
った（非VNTRプローブで3100対立遺伝子を試験した）。
【図面の簡単な説明】
第１図は、解析によって検出された個々の染色体腕の対
立遺伝子欠失頻度をグラフで示している。 第２図は、個々の腫瘍で蓄積した対立遺伝子欠失を示し
ている。各腫瘍における対立遺伝子欠失指数は、対立遺
伝子欠失が観察された染色体腕の数を対立遺伝子マーカ
ーが情報を含む（すなわち、正常組織由来のDNAがヘテ
ロなパターンを示すもの）染色体腕の数で割ったものと
して定義される。 第３図は、正常組織（Ｎ）と癌組織（Ｃ）由来のDNAを
比較する対立遺伝子解析の例を示している。パネルA,B,
C,D,E,およびＦは、６人の異なる患者、S141,S7,S191,S
153,S98、およびS175をそれぞれ示している。用いた制
限酵素および放射性プローブは、各ブロットの下に列挙
してある。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/12 - 15/28 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (22)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一群の対立遺伝子の存在について患者の腫
    瘍組織から単離された第一のDNA試料および同一の患者
    の非腫瘍組織から単離された第二のDNA試料の試験を行
    い； 患者がヘテロに持つ該一群の対立遺伝子のうち、第二の
    試料と比較した場合の第一の試料の欠失の百分率を決定
    する；各工程からなり、 この際に、患者がヘテロに持つ該群の中の対立遺伝子の
    百分率が、腫瘍組織中の遺伝子変化の程度についての、
    患者の予後と関連した指標を与えるような、十分な数の
    対立遺伝子を該群が有するように予め決定されているこ
    とを特徴とする、腫瘍組織中の遺伝子変化の程度を評価
    するための方法。
  2. 【請求項２】決定された対立遺伝子の欠失の百分率に基
    づいた予後を与える工程をさらに含む、特許請求の範囲
    第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】一群の対立遺伝子が、ヒトゲノムの染色体
    の末端動原体でない各腕に由来する少なくとも一つの対
    立遺伝子を含んでいる、特許請求の範囲第１項記載の方
    法。
  4. 【請求項４】腫瘍組織が、肺癌、結腸癌、乳癌、膀胱
    癌、前立腺癌、肝臓癌、および胃癌からなる群から選択
    された癌である、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  5. 【請求項５】腫瘍組織が結腸直腸癌である、特許請求の
    範囲第４項記載の方法。
  6. 【請求項６】第一の試料DNAまたは第二の試料DNAがクリ
    オスタット切片作製によって得られた組織から分離され
    たものである、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  7. 【請求項７】第一の試料DNAまたは第二の試料DNAがパラ
    フィンまたはプラスチック中に保存された組織から分離
    されたものである、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  8. 【請求項８】一群の対立遺伝子の存在を試験するための
    工程が： 第一および第二のDNA試料を制限エンドヌクレアーゼで
    消化して第一および第二の制限断片群を作成し； 制限断片を該制限断片群のそれぞれに分離し； 各該制限断片群中の制限断片を、制限断片長多型性対立
    遺伝子を検出する一群の核酸プローブにハイブリダイズ
    させ、プローブと制限断片からなるハイブリッド二量体
    を形成させ； 各制限断片群中のハイブリッド二量体を検出し、比較す
    る； 各工程によって行われる、特許請求の範囲第１項記載の
    方法。
  9. 【請求項９】制限断片を電気泳動ゲルマトリックス上で
    分離し； 分離された断片を固体支持体に転移し； 核酸プローブを、固体支持体上の分離された断片にハイ
    ブリダイズするものである、 特許請求の範囲第８項記載の方法。
  10. 【請求項１０】核酸プローブを放射性標識し、ハイブリ
    ッド分子をオートラジオグラフィーで検出するものであ
    る、特許請求の範囲第９項記載の方法。
  11. 【請求項１１】核酸プローブが多様な数のタンデム反復
    配列にハイブリダイズする、特許請求の範囲第８項記載
    の方法。
  12. 【請求項１２】一群の対立遺伝子の存在に関する試験の
    工程が： 一群の一本鎖プライマーの組を該第一および第二の試料
    DNAにアニールさせることであって、該組の各々のプラ
    イマーがDNAの逆の鎖にアニールし、該プライマーの組
    の各々が制限断片長多型性を含むDNAの領域を包含する
    ものであること； 反復するDNA合成サイクルによって、プライマーの組に
    包含される該第一と第二のDNA試料中のDNA領域を増幅す
    ること； プライマーの組によって包含された増幅されたDNA領域
    を検出し、該第一と第二の試料中の増幅された領域を比
    較すること； によって行われるものである、特許請求の範囲第１項記
    載の方法。
  13. 【請求項１３】DNAの増幅された領域が、増幅されたDNA
    試料を電気泳動ゲルマトリックス上で分離し、エチジウ
    ムブロマイドで染色することによって検出するものであ
    る、特許請求の範囲第12項記載の方法。
  14. 【請求項１４】増幅されたDNA試料を電気泳動ゲルマト
    リックス上で分離し、分離された増幅されたDNA試料を
    固体支持体に転移し、プライマーの組の一方と相同性の
    ある核酸プローブまたは包含されたDNA領域とハイブリ
    ダイズさせることによって、増幅されたDNA領域を検出
    するものである、特許請求の範囲第12項記載の方法。
  15. 【請求項１５】核酸プローブが放射性標識されており、
    プローブがオートラジオグラフィーによって検出される
    ものである、特許請求の範囲第14項記載の方法。
  16. 【請求項１６】該群の該プライマーの組の少なくとも一
    つが、多様な数のタンデム反復配列に対するプローブに
    ハイブリダイズするDNA領域を包含するものである、特
    許請求の範囲第14項記載の方法。
  17. 【請求項１７】腫瘍組織中の遺伝子変化の程度を測定す
    るためのキットであって： ヒト対立遺伝子に対する核酸プローブの群を含むもので
    あり、該プローブの群は、患者がヘテロに持つ該プロー
    ブの群によって検出される、患者の腫瘍組織中の対立遺
    伝子の欠失の百分率が、腫瘍組織中の予後に関連するよ
    うに予め決定された遺伝子変化の程度の指標を与えるよ
    うに、該群が十分に多数の対立遺伝子を検出するように
    予め決定されたものであり、該プローブが制限断片長多
    型性を検出するものである、前記キット。
  18. 【請求項１８】一つ以上のプローブが多様なタンデム反
    復配列を検出する、特許請求の範囲第17項記載のキッ
    ト。
  19. 【請求項１９】核酸プローブの該群が、ヒトゲノムの末
    端動原体性でない各腕由来の少なくとも一つの対立遺伝
    子に対するプローブを含んでいるものである、特許請求
    の範囲第17項記載のキット。
  20. 【請求項２０】腫瘍組織中の遺伝子変化の程度を測定す
    るためのキットであって： ヒトDNAに対する一本鎖核酸プライマーの組の群であっ
    て、該組の各々のプライマーがDNAの逆の鎖にアニール
    するものであり、プライマーの該組の各々が制限断片長
    多型性を含むDNA領域を包含しているものであり；患者
    の腫瘍組織中の、患者がヘテロに持つプライマーの組の
    該群によって包含された制限断片長多型性対立遺伝子の
    欠失百分率が、予後と関連するように予め決定された遺
    伝子変化の指標を与えるように、十分な数のプライマー
    の組を含むように予め決定されたプライマーの群； を含んでいる前記キット。
  21. 【請求項２１】一つ以上のプライマーの組が多様な数の
    タンデム反復配列を包含している、特許請求の範囲第20
    項記載のキット。
  22. 【請求項２２】一本鎖核酸プライマーの組の該群が、ヒ
    トゲノムの末端動原体でない染色体の腕の各々由来の少
    なくとも一つのDNA領域を包含しているプライマーの組
    を含んでいるものである、特許請求の範囲第20項記載の
    キット。
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