JP2019524122A - 染色体ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためのＤＮＡプローブ - Google Patents

Abstract

染色体異常の検出のためのキット、プローブ混合物およびプローブ。以下の、（ａ）非反復核酸配列を有する配列領域のゲノムセグメントを検査し、１以上の核酸配列を選択するステップ、（ｂ）非反復核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマー対を設計し合成するステップ（ここで、プライマーは、それぞれ、非反復核酸配列の鎖または相補鎖に相補的なオリゴヌクレオチド配列および、非相補的なユニバーサルリンカー配列を有する）、（ｃ）第１ＰＣＲを行い、核酸断片の第１混合物（プールＡ）を得るステップ、（ｄ）リンカーにハイブリダイズするプライマーを用いて混合物（プールＡ）のマルチプレックスＰＣＲを行い、染色体の発色または蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ／ＣＩＳＨ／ＩＳＨ）に適した、増幅された非反復核酸断片を有する混合物（プールＢ）を得るステップ、を含む方法によって得られる遺伝子プローブ。【選択図】図１

Description

本発明は、染色体異常の診断のための染色体ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためのプローブを作製する方法ならびにそれにより作製されるＤＮＡプローブおよびプローブ混合物に関する。

染色体異常は、しばしば腫瘍細胞で認められる。染色体異常は、特定のゲノム遺伝子座に対するプローブを用いて、Ｇ分染法またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）によって決定することができる。多重蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでは、ゲノムのいくつかの領域が異なる色で標識される。これらの領域は、疾患の遺伝子座および切断点からある距離を置いて位置する場合もあるため、複合染色体異常でさえも容易に診断することができる。いくつかの異常、例えば一定の白血病で認められるフィラデルフィア染色体は、特定の腫瘍でのみ認められる。特に胸部腫瘍での治療のタイプを示唆する異常もある。ここで、細胞表面受容体をコードする癌遺伝子ＥＲＢＢ２および、１７番染色体のセントロメア領域のＣＥＮ１７領域は臨床的意義がある。この場合、ＩＳＨは、腫瘍の攻撃性を評価する手段および、患者のためのより標的化された治療を提供する。非ホジキンリンパ腫のサブグループもまた、遺伝的変異によって識別することができる。

ＩＳＨプローブを作製するための従来の方法は、ＢＡＣクローン（細菌人工染色体）、ＹＡＣクローン、コスミドおよびフォスミドを用いる。これらは、長いゲノムＤＮＡ領域（５００キロベースまで）を含み、したがって、求める配列に加えて、反復配列、偽遺伝子およびパラロガス配列を含む。それらは、発色ＩＳＨまたは蛍光ＩＳＨにおける非特異的ハイブリダイゼーションおよびバックグラウンドの原因となり、それによって評価はより困難になり、しばしば不可能となる。特に、ＣＩＳＨ（発色ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）では、多くの場合高いバックグラウンドは避けられない。ＣＩＳＨプローブは、通例、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）プローブよりも短い。

反復配列によって生じるバックグラウンドを避けるために、ＢＡＣプローブの場合は、大過剰のいわゆるブロッキングＤＮＡ（例えばＣｏｔ−１ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、ｔＲＮＡなど）がしばしば添加される。しかしながら、反復配列からのシグナルは、なお完全には抑制できない。ゆえに、反復配列のＢＡＣクローンを「除去する（ｔｏ ｆｒｅｅ）」ための試みもしばしばなされる。非特許文献１；特許文献１および、図２における先行技術を参照のこと。ＢＡＣクローンをランダムに断片化し、その断片にリンカーを導入し、ＰＣＲで増幅する。過剰のＣｏｔ−１ＤＮＡの添加後に、ＤＮＡを溶解し、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ−デュプレックス特異的ヌクレアーゼ：ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いて６５℃で消化する。ヒト反復配列を「含まない（ｆｒｅｅ）」プローブまたはプローブ混合物が得られるまで、Ｃｏｔ−１ＤＮＡの存在下で増幅および消化ステップを数回繰り返す。他の方法でも反復配列の除去を達成することができる。非特許文献２；特許文献２、特許文献３；特許文献４を参照のこと。しかしながら、これらの方法はかなりの努力を必要とするばかりでなく、残念なことに決して完全であるとも、確実であるとも言えない。また、プラスミド中にプローブＤＮＡを単に確保することも可能ではない。

ＩＳＨプローブはＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）で作製することもできる。このＰＣＲは、ゲノム、特に反復配列を含まず、多くの場合、遺伝子またはドメインの一部のみをコードする領域について行われる。反復配列およびＡｌｕ配列は、ヒトゲノムおよびすべての染色体のいたるところで見ることができる。特許文献５は、コンピュータ支援による配列解析および、ＰＣＲによるゲノムプローブのアブイニシオ作製を開示している。非特許文献３を参照のこと。先行技術については、特許文献６；特許文献７；特許文献８；特許文献９；特許文献１０；特許文献１１；特許文献１２；特許文献１３；特許文献１４；特許文献１５；特許文献１６；特許文献１７；特許文献１８；特許文献１９；特許文献２０；特許文献２１；特許文献２２；および、特許文献２３に記載の方法もまた参照のこと。しかしながら、反復配列を含まないプローブの作製は相変わらず問題が多いままである。なぜなら、これらのタイプのプローブのカバレッジは、多くの場合長くないからである。しかしながら、臨床的意義のあるＩＳＨプローブには数メガベースが必要とされる。

その上また、プローブは、さらに、放射性基、発色基または蛍光基で標識されなければならない。標識は、ニックトランスレーション反応、ランダムプライミングまたは、標識ヌクレオチドを用いる直接ＰＣＲ標識および／または化学的結合によって酵素的に行うことができる。しかしながら、この増幅反応における標識は複雑である。このポリメラーゼ連鎖反応は、あらゆる標識、あらゆる蛍光色素およびあらゆる発色基について再確立されなければならないからである。このポリメラーゼ連鎖反応は、配列長、修飾の化学構造、標識とヌクレオチドとの間のリンカーの長さによっても異なるし、ポリメラーゼおよび、出発物質の状態によっても異なる。このように、先行技術には問題がある。

国際公開第２００７／０５３２４５号明細書 米国特許出願公開第２００４／０２９２９８号明細書 国際公開第２００４／０８３３８６号明細書 国際公開第０１／０６０１４号明細書 米国特許第８，４０７，０１３ Ｂ２号明細書 米国特許第６，１５０，１６０ Ａ号明細書 米国特許第６，８２８，０９７ Ｂ１号明細書 米国特許第７，０１４，９９７ Ｂ２号明細書 米国特許出願公開第２０００／３００２２０４ Ａ１号明細書 欧州特許出願公開第１１２７１６３号明細書 米国特許出願公開第２０００／３０１０８９４３ Ａ１号明細書 独国特許第６９０３２９２０号明細書 米国特許出願公開第２０００／３０１９４７１８ Ａ１号明細書 米国特許出願公開第２０００／４０１６１７７３ Ａ１号明細書 国際公開第２００４／０４０９７０５０号明細書 国際公開第２００４／０８３３８６号明細書 欧州特許出願公開第１２８５０９３号明細書 国際公開第２０１４／０３６５２５ Ａ１号明細書 国際公開第２０００／１８８０８９号明細書 欧州特許第２０６９５３７号明細書 欧州特許出願公開第１１２７１６３号明細書 欧州特許出願公開第１６６９９０２号明細書 独国特許出願公開第１０ ２０１０ ０２９ ８５５ Ａ１号明細書

Ｓｗｅｎｎｅｎｈｕｉｓ ＪＦ ｅｔ ａｌ， Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｅａｔ−ｆｒｅｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ， ２０１１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０１２， Ｖｏｌ． ４０， Ｎｏ． ３， ｅ２０， ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ１１２３ Ｃｒａｉｄ ＪＭ ｅｔ ａｌ， Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ＦＩＳＨ ｐｒｏｂｅｓ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥＴＩＣＳ （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｂｅｒｌｉｎ， ＤＥ） Ｖｏｌ． １００， ｐｐ． ４７２−４７６ Ｒｏｇａｎ ＰＫ ｅｔ ａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｐｙ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． （２００１） １１（６）： １０８６-１０９４

該問題は、請求項１に記載の方法ならびに請求項１３および１４に記載のプローブによって解決される。本方法および本プローブの有利な実施形態は、本従属請求項において見ることができ、本実施例に記載されている。

本方法は、より長いゲノム領域における、特定の配列を有するセグメントの配列の解析および特定の遺伝子座の特定の核酸配列の選択を含む、直接的または間接的に標識される核酸の作製、選択された特定の核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応のためのセンスおよびアンチセンスプライマー対の設計および合成（ここで、合成されたプライマーは、それぞれ、ストリンジェントな条件下でゲノムにハイブリダイズせず、任意に制限エンドヌクレアーゼのための切断配列を含むことができる、非特異的核酸配列の鎖または相補鎖に相補的な配列および、非相補的で一律のリンカー配列を含む）、センスおよびアンチセンスプライマー対でのいくつかの第１ポリメラーゼ連鎖反応（反応生成物を混合した後、公知の（非反復）配列を含む合成されたＰＣＲ断片の第１混合物（プールＡ）を得る）、非相補的リンカー配列にハイブリダイズするプライマーを用いた、合成されたＰＣＲ断片の混合物（プールＡ）のマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応および、個々でまたは混合物での染色体の発色または蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨまたはＦＩＳＨ）に適している、反復部分のない増幅され配列調整されたＰＣＲ断片を有する混合物（プールＢ）の入手、を含む。

一実施形態において、第１ポリメラーゼ連鎖反応後の混合物中に存在する合成された核酸断片は、サイズ選択的に解析され、次いで精製される。さらにまた、最終増幅ステップにおいて、修飾または標識ヌクレオチドを付加する（ＰＣＲ標識）のが有利である。最終増幅ステップにおいて、修飾ヌクレオチドを付加すれば、発色または蛍光基、好ましくはアミノアリルＮＴＰとの化学結合が可能なタイプにすることができる。

別の実施形態において、第１ポリメラーゼ連鎖反応から得られる核酸断片は、プラスミドにクローニングされる。このことは、リンカー配列に制限部位を導入して行うことができることは、当業者には明らかであろう。プラスミドの増幅後に、断片は、リンカーによって任意の量を生成させることができる。

プローブ断片はまた、ハイブリダイゼーションプローブ中／上にレポーター基を挿入または結合させる反応に供することもできる。挿入される標識は、放射性、発色性または蛍光性にすることができる。発色性基は、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニンなどのハプテンを含む。なぜなら、これらのハプテンは、公知の方法において、標識抗体との免疫反応で可視化することができるからである。さらなる発色性基には、呈色反応を触媒するペルオキシダーゼまたはラクターゼなどの酵素がある。適切な色素基との反応に供することができるアリルアミンなどの反応性基を有する修飾ヌクレオチドを用いることも可能である。

ステップ（ａ）において選択された非反復核酸配列は、本質的に同様な頻度で、複数の第１ポリメラーゼ連鎖反応で増幅されるように選択されることができるという利点を、開示された本方法は有する。ステップ（ａ）において、配列セグメントは、好ましくは、１００〜５，０００塩基対を有する非反復ＰＣＲ断片、好ましくは１００〜１，０００塩基対を有する非反復ＰＣＲ断片が得られるように選択される。４００〜６００塩基対を有する断片が特に好ましい。さらにまた、解析ステップにおいて選択される非反復核酸配列が、解析中のゲノム上で互いに近接しており、それによってｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいてより強い信号強度が得られれば有利である。

染色体異常を検出するために、異なる標識を有するいくつかのプローブがしばしば所望される。本開示は、したがって、異なる標識を有する多数のプローブの作製もまた含む。第１ステップにおいて選択された特定のヌクレオチド配列は、染色体における切断点領域に近接している場合に有利である。解析ステップにおいて選択された特定の配列が、切断点領域に隣接し、異なる標識を有する場合に、診断目的には特に有利であり、実用的である。なぜなら、それによって、染色体異常を直接的に診断することができるからである。異なるプローブ標識は、着色が最初は間色を生じ、異常の場合に、色の変化または２つの異なる色シグナルを観察することができるように隣接配列のために選択することもできる。逆のプロセスも行うこともできる。すなわち、異常が存在する場合、２つの異なる色のシグナルによって複合シグナルまたは融合シグナルを生じさせることができる。別の場合では、必要に応じて均衡型、不均衡型および相互転座の一部としての異常の場合増幅される、１つの領域からの配列または、この領域に隣接する配列を選択することも可能である。

プローブの標識は、好ましくは、発色分子、ポリメチン色素、チアゾールおよびオキサゾール色素、ヘキスト３３３４２（２′−（４−エトキシフェニル）−５−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２，５′−ビ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール三塩酸塩）、４′，６−ジアミジン−２−フェニルインドール、アレクサ４０５、アレクサ４８８、アレクサ５９４、アレクサ６３３；テキサスレッド、ローダミン；スルホン化および非スルホン化シアニン色素、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７；蛍光分子、フルオレセイン、５，６−カルボフルオレセイン、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）；化学発光分子、アクリジニウム；ＡＴＴＯ（登録商標）蛍光色素（Ａｔｔｏ−Ｔｅｃ社、ジーゲン、ドイツ）、ＰｒｏｍｏＦｌｕｏｒ（登録商標）色素（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社、ハイデルベルク、ドイツ）、ＭｏＢｉＴｅｃ（登録商標）色素（ＭｏＢｉＴｅｃ社、ゲッティンゲン、ドイツ）、ＤＹ（登録商標）色素（ＤＹＯＭＩＣＳ社、イェーナ、ドイツ）量子ドット；ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、２，４−ジニトロフェノール、アビジン；発色反応のための酵素、ペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼのグループから選択される。

一実施形態は、配列が反復配列、偽遺伝子またはパラロガス遺伝子を含まず、ヒトゲノム上で互いに隣接している複数のＰＣＲ断片を含む染色体異常を検出するためのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための標識プローブの提供に関する。さらなる実施形態は、特定の切断点領域に隣接する、標識の異なるいくつかのプローブを含む、特定の染色体異常のためのプローブ混合物または検出キットに関する。

本発明のさらなる利点、実施形態および利点は、実施例において、添付の図面を参照して説明される。

染色体ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）のための配列調整されたＰＣＲプローブを作製するためのステップを示す図である。 先行技術による、反復配列が減少したＩＳＨプローブを得るためのステップの概略図である。 ＤＡＰＩ（４‘，６−ジアミノフェノールインドール）での細胞核の対比染色および種々のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション後の試料の蛍光顕微鏡検査画像である。配列調整されたＩＳＨプローブをＰＣＲ反応（「１ステップ」）で標識した。左段：ＤＡＰＩによる細胞核の対比染色；右段：ＨＥＲ２、ＭＤＭ２、ＭＥＴおよびＦＧＦＲ１遺伝子またはセントロメアに対するプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。 ＤＡＰＩ（４‘，６−ジアミノフェノールインドール）での細胞核の対比染色および種々のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション後の試料の蛍光顕微鏡検査画像である。配列調整されたＩＳＨプローブをニックトランスレーションで標識した。左段：ＤＡＰＩによる細胞核の対比染色；右段：ＨＥＲ２、ＭＤＭ２、ＭＥＴおよびＦＧＦＲ１遺伝子またはセントロメアに対するプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。

配列調整されたＰＣＲプローブは、ゲノムＤＮＡから作製することができる。ヒトゲノムの全配列は公知であり、データベースから得ることができる。それがＦＩＳＨ／ＣＩＳＨプローブの設計の出発点である。ＢＡＣクローンまたは他のＤＮＡ担体（プラスミド、コスミド、フォスミド、ＹＡＣ）は、それらの担体および配列が利用可能な場合、それらから出発することもできる。ゲノムＤＮＡについて以下に述べることはすべて、他の担体を用いて実施することもできる。

図１を参照のこと。第１ステップ（ａ）において、データベースの配列を用いて、コンピュータ解析によって、ゲノム配列およびその領域の遺伝子構成を調査する。この場合は、このゲノム配列において、単純反復配列、Ａｌｕ配列および複合反復配列を有するすべての領域だけでなく、すべての偽遺伝子およびパラロガス部分も探索し同定する。これらの配列は、ＩＳＨプローブには適さない。ＮＣＢＩ（国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、ベセスダ、メリーランド州）またはＥＮＳＥＭＢＬ（欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）によって運用されている）および欧州分子生物学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＥＭＢＬ）、ハイデルベルク、ドイツ）は、公共ゲノムデータベースを提供しており、それらは、ＵＣＳＣゲノムブラウザ（カリフォルニア大学、サンタクルーズ、米国）によってアクセスすることもできる。従来の解析プログラムを用いて、任意の非特異的配列領域をさらに絞り込み、同定することができる。

遺伝子座に特異的であり、１回出現する配列のみがハイブリダイゼーションプローブに含まれる。染色体ハイブリダイゼーション中に他の遺伝子座にもハイブリダイズし、非特異的にバックグラウンドに寄与する配列は除く（ステップａ）。染色体に１回のみ出現する、このように調節されたゲノム配列について、次に、センスおよびアンチセンスプライマーのライブラリーと照合する（ｂ）。特異的プライマー配列および一律のリンカーを有する各プライマーを合成する。ＰＣＲおよびそれに続く増幅が、本質的に同様な長さのＤＮＡ断片をもたらすように、公知のゲノム配列に基づいて、センスおよびアンチセンスプライマーを計画し、選択する。ＰＣＲ後に、ゲノム上の遺伝子座が１００ＤＮＡ断片によってセクションごとに遺伝子座がカバーされるように、各ゲノム領域に、一般的には２００プライマーを設計し、合成する。第１増幅において、プライマーを用いて、個々のＰＣＲ反応で特定の断片を作製する。ステップ（ｄ）において、得られたＰＣＲ断片を純度およびサイズについてチェックし、混合またはプールする（プールＡ）。プール（プールＡ）の精製後、プールしたＰＣＲ−ＤＮＡ１０ｎｇを、第２増幅（ステップｅ）（リンカーは、この増幅におけるセンスおよびアンチセンスプライマーとして役立つ）の鋳型として用いる。Ａプールのすべての断片は同じリンカーおよび計画された同様なサイズを有するため、プールＡからのすべてのＰＣＲ断片は、この反応において同様な長さに増幅される（マルチプレックスＰＣＲ）。これによって、ＰＣＲ断片の混合プール（プールＢ）が得られる。

この最終反応において、標識ヌクレオチドが付加される場合（１ステップＰＣＲ標識）、標識されたＰＣＲ断片を有するプールＢが得られる。精製後、これらをｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いることができる。あるいは、混合ＰＣＲ断片を含むプールＢは、第２増幅後に、ニックトランスレーションによって標識することもできる。

ＦＩＳＨ／ＣＩＳＨにおいてロバストに遺伝子座を検出するために、プローブ設計のために、通例、１００〜１，０００キロベースのゲノム領域を調べることが必要である。このことは、組み合わせで実際のプローブをつくるために１〜１０マルチプレックスＰＣＲプローブが作製されることを意味する。それにより作製されるプローブは、作製の最初から反復エレメント、偽遺伝子またはパラログを含まない。任意の量のプローブを作製することができる。個々のＰＣＲ断片は本質的に同様なサイズであるか、またはそれらの長さが指定されているため、標識ヌクレオチドの直接挿入は、もはや非常に需要のない手順である。通常のマルチプレックスＰＣＲまたはリンカーＰＣＲにおいて、以下の（ａ）ニックトランスレーションなどの従来の酵素的方法によって、それに続く標識が行われる、非化学修飾または未修飾ｄＮＴＰ、（ｂ）リンカーＰＣＲにおいて、直接的に標識を行うことができる、蛍光色素（例えばＡｔｔｏ４８８もしくはＣｙ３）またはハプテン（例えばジゴキシゲニン、ジニトロフェノールもしくはビオチン）で標識されたｄＮＴＰ、を用いることができる。蛍光色素またはハプテンで標識されたｄＮＴＰの添加に関しては、それらが添加される比率を決定することが必要である。標識およびｄＮＴＰ（ｄＵＴＰ：蛍光標識ｄＮＴＰ）に応じて、この比率は、１：１〜１：２０である。またはアミノアリルｄＮＴＰなどの（ｃ）化学反応性ｄＮＴＰ。アミン反応性ＮＨＳエステル活性化（ＮＨＳ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）色素またはハプテン誘導体を用いる化学結合による合成後に標識を行うこともできる。反応性アミノアリルヌクレオチドまたはアミノアリルｄＮＴＰは、プローブタイプ（遺伝子プローブまたはセントロメアプローブ）に応じて、５：１〜１：５の比率で添加される。次いで、ＤＮＡプローブは、アミン反応性色素または蛍光色素を用いる反応によって、合成後に標識される。ＤＮＡプローブが蛍光色素またはハプテンによって直接的に標識されない場合、リンカー増幅後に標識が行われなければならない。

＜実施例１＞ＨＥＲ２遺伝子の遺伝子座プローブの作製
１．ＨＥＲ２遺伝子座プローブのインシリコ設計
１７番染色体上で、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）遺伝子プローブの設計のために、ＨＥＲ２遺伝子に関するゲノム領域ならびに長い５‘隣接領域および３‘隣接領域を選択した。ＨＥＲ２遺伝子プローブは、１７番染色体上で３９，３９５，６０５〜３９，７９９，５０６の部分をカバーしていた。このゲノム配列をＥｎｓｅｍｂｌ（ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）およびＮＣＢＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）データベースで解析し、プローブのために４つの適切な部分を同定した。第１ゲノム部分は、１７番染色体：３９，３９５，６０５〜３９，５６９，３６１であった。以下の説明は、この部分のみに言及している。ＨＥＲ２遺伝子座における他の３つのゲノム部分は、同様に処理した。

ゲノム部分３９，３９５，６０５〜３９，５６９，３６１におけるすべての反復エレメント、Ａｌｕ配列、偽遺伝子およびパラロガス配列部分は、従来の解析プログラムを用いて同定した。反復エレメント、偽遺伝子およびパラロガス配列は除外した。第１ゲノム部分に特異的な配列を、２５０〜８００塩基対を有する部分に分割した。２５０未満の塩基対の部分配列は考慮に入れなかった。この解析の後、４つの選択されたゲノム部分のそれぞれにおける標的ゲノム配列は、出発配列の４０〜６０パーセントのみを含んでいた。したがって、ゲノム出発配列の約半分は非特異的として不採用にした。

２．インシリコプライマー設計
２５０〜８００塩基対を有するゲノム断片について、特定の配列部分のためのセンスおよびアンチセンスプライマーを設計し、合成した。一方では、プライマーは、増幅されるゲノム配列に相補的であり、他方では、プライマーは、制限エンドヌクレアーゼのための切断部位を有するユニバーサルリンカー配列もまた含んでいた。センスおよびアンチセンスプライマーは、ゲノムのＰＣＲで得られる産物が同様な長さであるように設計した。望ましい断片長はおよそ５００塩基対であった。プライマー対がその特異性または機能性から必要とされるときのみこれから逸脱した。４つのゲノム部分のそれぞれについて、およそ２００プライマーを設計し、合成した。説明に添付されている表１は、１７番染色体上でのゲノム部分３９，３９５，６０５〜３９，５６９．３６１のためにこのように決定されたセンスおよびアンチセンスプライマーの典型的なリストを含む。

３．個々の断片の増幅
すべてのセンスおよびアンチセンスプライマー対について、５０μｌ溶液中でゲノム断片を増幅した。個々のＰＣＲ反応は、いずれの場合にも、５５℃の連結温度（プライマーアニーリング）、鎖伸長１５秒、３５サイクル超のハイスループット法（９６ウェル）で実施した。得られたＰＣＲ断片を、アガロースゲル上で純度およびサイズについてチェックした。配列が効果的に調節され、公知であるように、予想サイズの特定のバンドを有するＰＣＲ産物のみを用いた。

４．制限酵素による個々の断片の切断およびクローニング
ＰＣＲ産物は、通例、切断なしに担体プラスミドに平滑末端クローニングして入手した。ＰＣＲ産物によっては、切断後にプラスミドにクローニングしたものもある。配列の正しさについての随時のチェックは問題がなく、公知の方法で実施した。

５．個々の断片のプーリングおよび処理
およそ１００のＰＣＲ産物をプールし、処理してプライマー、タンパク質、遊離ヌクレオチドおよび塩を除去した。アガロースゲル電気泳動後に、混合物（プールＡ）の光度測定および光学解析を行った。

６．ユニバーサルリンカーによるプールの増幅（マルチプレックスＰＣＲ）および標識
高性能Ｔａｑポリメラーゼを用い、ユニバーサルリンカーによって、個々の断片（プールＡ）の混合物を直接に鋳型として用いて、高収量で第２増幅を行った（マルチプレックスＰＣＲ）。このマルチプレックスＰＣＲ／リンカーＰＣＲには、蛍光色素（例えばＡｔｔｏ４８８またはＣｙ３）で標識されたｄＮＴＰを用いた。標識されるｄＮＴＰに応じ、プローブのタイプ（遺伝子プローブまたはセントロメアプローブ）によって異なる試験される比率で、蛍光標識されたｄＮＴＰを添加した。比率は、種々のプローブを通じて、標識に応じて、５：１〜１：５であった。

７．標識されたＤＮＡプローブの精製
標識および増幅反応に続いて、沈殿およびクロマトグラフィーによって、標識されたマルチプレックスＰＣＲプローブの最終精製を行い、遊離ｄＮＴＰ、標識ヌクレオチド、センスおよびアンチセンスプライマーならびに酵素を除去した。これに続いて、アガロースゲル電気泳動によって、光度測定およびＦＩＳＨプローブへの蛍光の挿入率の決定ならびにプローブの最終チェックを行った。

８．ＤＮＡプローブのさらなる断片化
さらなる選択肢として、それらの長さが原因でＩＳＨにおいて多すぎるバックグラウンドが生じる場合、ＤＮＡプローブはさらに断片化される。一般に、ＩＳＨについては、２００〜３００塩基対の長さが好ましい。さらなる断片化は物理的に行われるが、酵素的にまたは化学的に行うこともできる。断片のサイズ分布は、アガロースゲル電気泳動によって解析した。

９．ＤＮＡプローブの完成
ＨＥＲ２遺伝子座プローブは４つの部分を含んでいた。前記のステップ１〜８は、第１部分に関するものであった。最終ＤＮＡプローブは４つの異なる調製物（４マルチプレックスＰＣＲプローブ）からなっていた。あるいは、これらの４つの個々の調製物は、ユニバーサルリンカー増幅後にともに混合され、標識され、精製されることもできるが、これは制御性が低い。遺伝子座、プローブタイプ（増幅プローブ、ブレイクアパートプローブ、融合プローブ）およびユーザー仕様書に応じて、ＤＮＡプローブ混合物は１〜１０調製物（マルチプレックスＰＣＲプローブ）からなる。

＜実施例２＞標識されたＰＣＲプローブを用いる染色体のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
バージョン１：ＤＮＡプローブを用いるＩＳＨは、例えば、ＤＧＨＯ（ドイツ血液学・腫瘍学学会：Ｇｅｒｍａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）の研究室ワーキンググループ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）の推奨に従って、組織または細胞についての標準法を用いて実施することができる。この場合、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、細胞培養物または組織の分裂間期細胞で行われる。いずれの場合にも、標的ＤＮＡは、試料スライドに固定された分裂間期細胞の核ＤＮＡである。ここで、プローブは、実施例１に記載されているように作製され、標識される。細胞核は、一般的には、蛍光色素ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で対比染色される。原則として、ＦＩＳＨは、以下の材料、末梢血（ＰＢ）、骨髄（ＫＭ）、パラフィン断片、腫瘍組織、サイトスピン調製物、羊水、メタノール氷酢酸で固定した細胞（中期）などで実施することができる。血液または骨髄などの他の患者試料は、フィコール分離後、メタノール／エタン酸（比率３：１）で固定され、ハイブリダイゼーションまで−２０℃で凍結される。羊水またはパラフィン断片には特別な前処理が必要である。

バージョン２：本実施例（図３および図４参照）において、パラフィン包埋された細胞株（細胞培養物）の細胞を標準法に従ってミクロトームで切断し、きれいにした試料スライド上に載せた。パラフィン包埋された細胞を、続いて、同じく標準法に従って処理した。キシレンおよびアルコールシリーズの一連の段階的な洗浄によって脱パラフィンを確実にした。前処理クエン酸緩衝液中、９５℃、ほんの数分で前処理を行った。続いて、細胞質からできる限り細胞核を除き、アクセス可能にするために、ペプシン溶液を用いて細胞の部分消化を行った。段階的アルコール洗浄での脱水後に、細胞上にプローブハイブリダイゼーション混合物をピペットで移し、カバーガラスおよびシーラントでシールした。細胞核およびハイブリダイゼーション試料を７５℃で１０分間変性させ、徐々に３７℃に冷却し、湿気のあるチャンバ中、３７℃で終夜（１６時間）ハイブリダイズさせた。カバーガラスを除去した後、３７℃で、リンス液で２回リンスした。ハイブリダイゼーションシグナルを評価し、適切なフィルターを備えた蛍光顕微鏡で記録した。図３および図４は、標識の異なるプローブ（ニックトランスレーションまたは１ステップＰＣＲ標識）での結果を示す。いずれの場合も、ハイブリダイゼーションシグナルは明確に視認でき、バックグラウンドハイブリダイゼーションは無視しうるものであった。

Claims (14)

1. 染色体またはＤＮＡ領域の検出および染色体異常の検出のための方法であって、
   ａ）より長いゲノム部分中に１回出現するいくつかの核酸配列を、配列を比較することによって選択するステップ、
   ｂ）前記数の前記選択された核酸配列に対するポリメラーゼ連鎖反応のためのセンスおよびアンチセンスプライマーを合成するステップ（ここで各プライマーは、前記選択された核酸配列の鎖または相補鎖に相補的な配列を有し、ストリンジェントな条件下で、前記ゲノム配列とハイブリダイズしない少なくとも１つの一律のオリゴヌクレオチド配列もまた有する）、
   ｃ）前記ゲノム部分に対する前記数のセンスおよびアンチセンスプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、公知のゲノム配列を含み、１回出現する合成された核酸断片を得るステップ、
   ｄ）前記プライマーの前記一律のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズするいくつかのプライマーを用いてステップｃ）の前記合成された核酸断片に対して第２ポリメラーゼ連鎖反応を行い、１回出現し、バックグラウンドが減少した染色体の発色ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用することができる増幅されたゲノム核酸断片を得るステップ、
   を含む方法で作製される、直接的または間接的に標識される核酸断片（ＤＮＡプローブ）を用いることを含むことを特徴とする方法。
2. ステップ（ｃ）における前記ポリメラーゼ連鎖反応後に得られるいくつかの前記合成された核酸断片が、前記第２ポリメラーゼ連鎖反応の前に、好ましくはそれらの精製の前に混合されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. ステップ（ｄ）において、前記核酸断片が、修飾または標識ヌクレオチド、蛍光または発色標識ヌクレオチド（ＮＴＰ）およびｄＮＴＰ、ハプテン標識ヌクレオチド、化学活性ヌクレオチド、アミノアリルヌクレオチドの使用によって標識されるかまたは活性化されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. ステップ（ｃ）における前記第１ポリメラーゼ連鎖反応後に得られる前記ゲノム核酸断片がプラスミドにクローニングされることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
5. ステップｄ）の後に続けて、前記ゲノム核酸断片にレポーター基を挿入するための、ニックトランスレーション、化学反応、免疫反応から選択される反応が行われることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. ステップ（ａ）において、前記ゲノム核酸配列が、同様なサイズの産物が作製されるように選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. ステップ（ａ）において選択された前記ゲノム核酸配列が、１００〜１，０００塩基対、最も好ましくは４００〜６００塩基対を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. ステップ（ａ）において選択された前記ゲノム核酸配列が、前記ゲノム上で互いに隣接していることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために、異なる標識を有するプローブが作製されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. ステップ（ａ）において選択された前記ゲノム核酸配列が、前記染色体の切断点領域に近接しているか、または前記領域に隣接していることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記ＤＮＡプローブの前記標識が、前記染色体のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、融合シグナルまたは修飾された融合シグナルを生成するように選択されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記標識が、発色分子、ポリメチン色素、チアゾールおよびオキサゾール色素、ヘキスト３３３４２（２′−（４−エトキシフェニル）−５−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２，５′−ビ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール三塩酸塩）、４′，６−ジアミジン−２−フェニルインドール、アレクサ４０５、アレクサ４８８、アレクサ５９４、アレクサ６３３；テキサスレッド、ローダミン；スルホン化および非スルホン化シアニン色素、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７；蛍光分子、フルオレセイン、５，６−カルボフルオレセイン、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）；化学発光分子、アクリジニウム；ＡＴＴＯ（登録商標）蛍光色素（Ａｔｔｏ−Ｔｅｃ社、ジーゲン、ドイツ）、ＰｒｏｍｏＦｌｕｏｒ（登録商標）色素（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社、ハイデルベルク、ドイツ）、ＭｏＢｉＴｅｃ（登録商標）色素（ＭｏＢｉＴｅｃ社、ゲッティンゲン、ドイツ）、ＤＹ（登録商標）色素（ＤＹＯＭＩＣＳ社、イェーナ、ドイツ）量子ドット；ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、２，４−ジニトロフェノール、アビジン；発色反応のための酵素、ペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼのグループから選択されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 染色体異常の検出のためのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためのプローブであって、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法を用いて作製されるいくつかの合成されたＰＣＲ断片を含むことを特徴とする、プローブ。
14. プローブ混合物または試験キットであって、染色体異常の検出のための、請求項１３に記載の標識の異なるいくつかのプローブを含むことを特徴とする、プローブ混合物または試験キット。

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