JP2002526087A

JP2002526087A - 単一の細胞のｄｎａ増幅

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Publication number: JP2002526087A
Application number: JP2000574289A
Authority: JP
Inventors: クライン，クリストフ; シュミット−キトゥラー，オレッグ
Original assignee: マイクロメットアーゲー
Priority date: 1998-09-18
Filing date: 1999-09-17
Publication date: 2002-08-20
Anticipated expiration: 2019-09-17
Also published as: DK1109938T3; IL141749A; CA2343359C; DE69900949D1; EP1109938A1; JP4475488B2; ATE213783T1; EP1109938B1; IL141749A0; AU6192199A; CA2343359A1; NO20011316L; NO20011316D0; US6673541B1; WO2000017390A1; AU755499B2; ES2172353T3; DE69900949T2

Abstract

(57)【要約】本発明は，ＤＮＡを増幅する新規な方法に関する。該方法は，ＤＮＡまたは単一の細胞の全ゲノム，染色体またはそのフラグメントの増幅に特に有用である。該方法の，比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）分析，蛍光インシトゥーハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析，一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）分析，ＤＮＡ配列分析，“ヘテロ接合性喪失”（ＬＯＨ）分析，フィンガープリント分析および／または制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）分析等の，医療，法医学，診断または科学的目的のためのＤＮＡ分析における使用もまた記載される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は，ＤＮＡを増幅する新規な方法に関する。該方法は，ＤＮＡまたは単
一の細胞の全ゲノム，染色体またはそのフラグメントの増幅に特に有用である。
さらに本発明は，該方法の，比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）分析
，蛍光インシトゥーハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析，ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）分析，一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）分析，ＤＮ
Ａ配列分析，“ヘテロ接合性喪失”（ＬＯＨ）分析，フィンガープリント分析お
よび／または制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）分析等の，医療，法医学，診
断または科学的目的のためのＤＮＡ分析における用途に関する。

【０００２】本明細書の全体を通して，いくつかの文献が引用されている。本明細書に引用
される各文献（製造元の仕様書，指示などを含む）は，本明細書の一部としてこ
こに引用されるが，引用される文献のいずれかが本発明に対する先行技術である
と認めるものではない。

【０００３】ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は，ＤＮＡを増幅するための非常に強力なイ
ンビトロの方法であり，これは１９８５年に最初に導入された（Ｓａｉｋｉ（１
９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０，１３５０−１３５４）。ＰＣＲは，熱変性
，プライマーのアニーリングおよびポリメラーゼ伸長の繰り返しにより，１つの
標的ＤＮＡ分子を容易に検出しうる量に増幅することができる。

【０００４】最初はＰＣＲは標的ＤＮＡ中の単一の遺伝子座を増幅するために適用されたが
，多数の遺伝子座を同時に増幅するのに用いられることが増えてきている。この
ＤＮＡの一般的増幅のためにしばしば用いられるプライマーは，ゲノム中の反復
配列に基づくものであり，このプライマーにより適当に配置された反復間のセグ
メントを増幅することができる。散在反復配列（ＩｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄＲ
ｅｐｅｔｉｔｉｖｅＳｅｑｕｅｎｃｅ）ＰＣＲ（ＩＲＳ−ＰＣＲ）は，ヒト染
色体特異的および領域特異的ライブラリを作成するために用いられている（Ｎｅ
ｌｓｏｎ（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６
，６６８６−６６９０）。ヒトにおいては，最も多い反復のファミリーはＡｌｕ
ファミリーであり，半数体ゲノム中に９００，０００要素が含まれ，したがって
，平均間隔は３−４ｋｂであると見積もられている（Ｈｗｕ（１９８６），Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３，３８７５−３８７９）。し
かし，ＩＲＳ−ＰＣＲの主な短所は，ＡｌｕまたはＬ１等の反復配列がゲノム全
体にわたって均一に分布していないことである。例えば，Ａｌｕ要素は，ヒト染
色体の明縞（ｌｉｇｈｔｂａｎｄ）に優先的に見いだされる。したがって，そ
のようなＰＣＲ法によってこれらの領域に対するバイアスが得られ，一方，他の
領域はより少なく表され，したがって増幅されないかまたは検出可能なレベル以
下でしか増幅が得られない。さらに，この技術は，多量の反復ファミリーが同定
されている種においてのみ適用可能であり，ショウジョウバエ，およびあまりよ
く特徴決定されていない動物および植物などの他の種については，この方法を適
用することができない。

【０００５】ＩＳＲ−ＰＣＲを用いるよりも一般的な増幅は，“縮重オリゴヌクレオチドプ
ライムＰＣＲ”（ＤＯＰ−ＰＣＲ）を用いることにより行うことができ，これは
種に依存しないという追加の利点を有する（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ（１９９２），Ｇ
ｅｎｏｍｉｃｓ１３，７１８−７２５）。ＤＯＰ−ＰＣＲは，ＰＣＲプロトコ
ルの最初の低温アニーリングサイクルの間に，用いられる部分的に縮重したオリ
ゴヌクレオチドの３’末端により特定される短い配列からプライミングが行われ
るという原理に基づく。これらの短い配列は頻繁に生ずるため，標的ＤＮＡの増
幅は多数の位置で同時に進行する。

【０００６】ＤＯＰ−ＰＣＲは，純粋かつ十分な量の所望のＤＮＡ，例えば，フロー・ソー
ト染色体，微小切開染色体縞または単離された酵母人口染色体（ＹＡＣｓ）を得
ることができるのであれば，高レベルの単一コピー配列を含有するライブラリを
生成するために適用することができる。しかし，ＤＯＰ−ＰＣＲは，単一の細胞
のＤＮＡ含有物の十分かつ均一な増幅を提供することができそうにない（Ｋｕｕ
ｋａｓｊａｒｖｉ（１９９７），Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ＆Ｃａｎ
ｃｅｒ１８，９４−１０１）。

【０００７】ＰＣＲの感度は，単一の細胞中の特定の標的ＤＮＡの分析を可能とする（Ｌｉ
（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ３３５，４１４−４１７）。これは，初期胚から
の単一の細胞を用いる移植前の遺伝的疾病診断（Ｈａｎｄｙｓｉｄｅ（１９８９
），Ｌａｎｃｅｔ１，３４７−３４９），および単一の精子（Ｃｕｉ（１９８
９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６，９３８９−９３
９３），または卵母細胞（Ｃｕｉ（１９９２），Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１３，７１
３−７１７）を用いる遺伝的組換え分析の開発につながった。しかし，これらの
すべての場合において，単一の細胞は，所定の標的配列について１回しか分析す
ることができず，任意の１つの細胞の遺伝子型を独立して確認することは不可能
である。

【０００８】 “プライマー伸長前増幅”（ＰＥＰ）と称される方法は，単一の細胞中に存在
するＤＮＡ配列の多コピーを作成することにより，この問題を回避することに向
けられている。ＰＥＰは，１５塩基の完全に縮重したオリゴヌクレオチドのラン
ダム混合物をプライマーとして用い，このことにより，ランダムに分配された部
位からのＤＮＡ配列の増幅を行う。単一のヒト半数体細胞中のゲノム配列の約７
８％を３０回以上コピーしうると見積もられている（Ｚｈａｎｇ（１９９２），
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，５８４７−５８５１）
。しかし，これまでのところ，単一の細胞の全ゲノムの完全かつ均一な増幅は，
ＰＥＰ等の方法を用いては証明されていない。

【０００９】代表相違分析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ
ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＲＤＡ）と称される方法は，正常ゲノムと腫瘍ゲノムとの
対の間の相違を発見する，サブトラクトＤＮＡハイブリダイゼーション技術であ
る（Ｌｉｓｉｔｓｙｎ（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９，９４６−９５１
）。ＲＤＡに必要なＤＮＡの示されている最少量は３ｎｇであり，これは約１ｘ
１０³個の細胞に相当する。しかし，ＲＤＡによってはゲノム配列の７０％しか
再現性をもって増幅することができない（Ｌｕｃｉｔｏ（１９９８），Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５，４４８７−４４９２）。したが
って，代表相違分析による単一の細胞の全ゲノムの均一かつ完全な増幅は不可能
である。

【００１０】したがって，上述の先行技術を考慮して，ゲノムＤＮＡ，特に単一の細胞から
のゲノムＤＮＡの，実質的に均一な，好ましくは完全な増幅を可能とする方法が
求められている。

【００１１】すなわち，技術的課題は，上述の要求を満たし，上述の欠点を排除する手段お
よび方法を提供することである。

【００１２】この技術的課題は，本発明により特徴づけられる態様を提供することにより解
決される。

【００１３】すなわち，本発明は，以下の各工程を含む，ＤＮＡを増幅する方法に関する：（ａ）ＤＮＡを含むサンプルを提供し；（ｂ）増幅すべきＤＮＡを，類似する長さのＤＮＡフラグメントを得るのに適
当な条件下で制限エンドヌクレアーゼで消化し，ここで，前記制限エンドヌクレ
アーゼは，前記ＤＮＡフラグメント上に，オーバーハングの末端ヌクレオチドが
リン酸化されている５'オーバーハング，またはオーバーハングの末端ヌクレオ
チドが水酸化されている３'オーバーハングを提供することができ；（ｃ）少なくとも１つのプライマーを前記ＤＮＡフラグメントにアニーリン
グさせ，ここで（ｃａ）（ｃａａ）同時にまたは続いて，第１のプライマーを表すオリゴ
ヌクレオチドを工程（ｂ）の前記ＤＮＡフラグメントの前記５'オーバーハング
にハイブリダイズさせ，かつ，第２のプライマーを表すオリゴヌクレオチドを前
記第１のプライマーにより生成した３'オーバーハングにハイブリダイズさせ，
ここで，前記第１のプライマーおよび第２のプライマーは異なる長さのものであ
り；（ｃａｂ）前記第２のプライマーを前記５'オーバーハングにラ
イゲートさせ；そして（ｃａｃ）前記第１のプライマーを前記ＤＮＡフラグメントから
除去し；または（ｃｂ）（ｃｂａ）同時にまたは続いて，５'末端のヌクレオチドがリン
酸化されている第１のプライマーを表すオリゴヌクレオチドを工程（ｂ）の前記
ＤＮＡフラグメントの前記５'オーバーハングにハイブリダイズさせ，かつ第２
のプライマーを表すオリゴヌクレオチドを前記第１のプライマーにハイブリダイ
ズさせ；そして（ｃｂｂ）前記第１のプライマーおよび第２のプライマーを前記
ＤＮＡフラグメントにライゲートさせ；または（ｃｃ）（ｃｃａ）前記プライマーを表すオリゴヌクレオチドを前記３'
オーバーハングにハイブリダイズさせて，５'オーバーハングを生成させ；そし
て（ｃｃｂ）前記プライマーを，前記ＤＮＡフラグメントの凹型５
'末端にライゲートさせ；または（ｃｄ）前記プライマーを表すオリゴヌクレオチドを前記５’オーバーハン
グにライゲートさせ；（ｄ）生成した５'オーバーハングをフィルインし；そして（ｅ）前記ＤＮＡフラグメントを，工程（ｃ）の前記プライマーの相補鎖とハ
イブリダイズしうるプライマーで増幅する。

【００１４】本発明にしたがって用いる場合，“類似する長さのＤＮＡフラグメント”との
用語は，統計学的レベルにおいて同等の長さのサイズを有するフラグメントを意
味する。同等の長さのＤＮＡフラグメントとは，例えば，５０±５ｂｐまたは４
ｋｂｐ±０．４ｋｂｐのフラグメントである。好適に生成されるＤＮＡフラグメ
ントの長さの範囲は，約５０ｂｐと約４ｋｂｐとの間であることが有利である。
より長いまたは短いＤＮＡフラグメントも用いることができるが，これらは上で
規定されたフラグメントより少ない程度で増幅されるかまたは表される。好まし
くは，ＤＮＡフラグメントは≦３ｋｂｐのサイズを有し，より好ましくは前記Ｄ
ＮＡフラグメントは約１０００ｂｐの平均長を有し，特に好ましいものは約２０
０−４００ｂｐのフラグメントである。

【００１５】本明細書において用いる場合，“５’オーバーハング”との用語は，例えば制
限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡのスタガー切断により提供される５’リン酸
基を意味し，ＤＮＡの５’末端での一本鎖オーバーハングを表す。

【００１６】本明細書において用いる場合，“プライマー”との用語は，オリゴヌクレオチ
ドを表し，精製された制限消化生成物などの天然に生ずるものであっても，合成
により製造されたものでもよい。プライマーは，本発明の方法における最大の効
率のためには好ましくは一本鎖であり，好ましくはオリゴデオキシリボヌクレオ
チドである。本発明の方法において用いる前に，前記プライマーを精製すること
は，一般に認識されている。そのような精製工程は，ＨＰＬＣ（高速液体クロマ
トグラフィー）またはＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を含み，当
業者には知られている。

【００１７】本明細書において用いる場合，“制限エンドヌクレアーゼ”との用語は，二本
鎖ＤＮＡを特定のヌクレオチド配列においてまたはその近くで切断しうる細菌の
酵素を表す。

【００１８】本明細書において用いる場合，“フィルイン”との用語は，３’ヒドロキシル
末端において開始され，相補鎖のフィルインを行うＤＮＡ合成反応を表す。この
ＤＮＡ合成反応は，好ましくは，ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰお
よびｄＴＴＰ）の存在下で行う。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ，例えばＴａｑポ
リメラーゼが一般に用いられ，当業者にはよく知られている。

【００１９】本発明にしたがう，“ハイブリダイズする”との用語は，２つのポリヌクレオ
チド鎖が相補的ヌクレオチドの間の水素結合により対を形成することを表す。こ
のハイブリダイゼーションには，プライマーが前記５’オーバーハングに直接隣
接してハイブリダイズするハイブリダイゼーション，ならびに，プライマーと前
記ＤＮＡフラグメントの凸型（ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ）または凹型（ｒｅｃｅｄ
ｉｎｇ）末端との間にギャップが生成するハイブリダイゼーションが含まれる。
例を挙げると，前記第２のプライマーとＤＮＡフラグメントの５’末端との間に
ギャップが形成される場合，このギャップはＴａｑポリメラーゼ等のＤＮＡポリ
メラーゼによりフィルインされるため，アニーリングおよびハイブリダイゼーシ
ョン工程の前または間に前記Ｔａｑポリメラーゼを加える態様において，本発明
の方法を便利に実施することができる。

【００２０】本発明の方法において用いられる，プライマーを表すオリゴヌクレオチドは，
特に，コンピュータに基づく配列分析および実験室マニュアル（例えばＳａｍｂ
ｒｏｏｋ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ；ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，２^nd Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕ
ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｕｒ，ＮＹ（１９８９））により表される，当該技術分野における技術水準にし
たがって，同定し，取得し，試験することができる。

【００２１】さらに，本発明の方法の上述の工程のための条件の設定は，当業者の技術の範
囲内であり，例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ（上記引用文献）または本
明細書の実施例に記載されたプロトコルにしたがって決定することができる。本
発明にしたがって用いることができる，より広い範囲のハイブリダイゼーション
条件のさらなる例は，とりわけ，Ａｕｓｕｂｅｌ，"ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔ
ｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ"，ＧｒｅｅｎＰｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓ
ｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），またはＨｉｇｇｉｎｓａｎｄＨａｍ
ｅｓ（Ｅｄｓ）"Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ａ
ｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ"ＩＲＬＰｒｅｓｓＯｘｆｏｒｄ
，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤＣ，（１９８５）に記載されている。

【００２２】上述の引用から，ＤＮＡを増幅する以下の方法のオプションが好ましく，該方
法は，以下の工程を含む：（ａ）ＤＮＡを含むサンプルを提供し；（ｂ）増幅すべきＤＮＡを，類似する長さのＤＮＡフラグメントを得るのに適
した条件下で，制限エンドヌクレアーゼで消化し，ここで，前記制限エンドヌク
レアーゼは，前記ＤＮＡフラグメント上に，オーバーハングの末端ヌクレオチド
がリン酸化されている５'オーバーハング，またはオーバーハングの末端ヌクレ
オチドが水酸化されている３'オーバーハングを提供することができ；（ｃ）少なくとも１つのプライマーを前記ＤＮＡフラグメントにアニーリング
させ，ここで（ｃａ）（ｃａａ）同時にまたは続いて，第１のプライマーを表すオリゴ
ヌクレオチドを工程（ｂ）の前記ＤＮＡフラグメントの前記５'オーバーハング
にハイブリダイズさせ，かつ，第２のプライマーを表すオリゴヌクレオチドを前
記第１のプライマーにより生成した３'オーバーハングにハイブリダイズさせ，
ここで，前記第１のプライマーおよび第２のプライマーは異なる長さのものであ
り；（ｃａｂ）前記第２のプライマーを前記５'オーバーハングにラ
イゲートさせ；そして（ｃａｃ）前記第１のプライマーを前記ＤＮＡフラグメントから
除去し；（ｄ）生成した５'オーバーハングをフィルインし；そして（ｅ）前記ＤＮＡフラグメントを工程（ｃ）の前記プライマーの相補鎖にハイ
ブリダイズしうるプライマーで増幅する。

【００２３】２つのプライマーを続いてハイブリダイズさせる場合，第１のプライマーはハ
イブリダイゼーション後に５’オーバーハングを形成し，これに第２のプライマ
ーが続いてハイブリダイズする。

【００２４】本発明は，実施例２および３に示されるように，上述の工程の組み合わせによ
り実質的に均一かつ完全なＤＮＡの増幅が可能であるという驚くべき知見に基づ
く。詳細には，本発明の方法は，以下のように例示される。

【００２５】増幅すべきＤＮＡサンプルは，単一の細胞，例えば，骨髄小孔細胞，末梢血か
らの単一（腫瘍状）細胞，臍静脈血液またはリンパ節からの単一の細胞を単離し
，これをプロテイナーゼで消化することにより得ることができる。プロテイナー
ゼ活性を不活性化した後，前記サンプルＤＮＡを，ＭｓｅＩ等の４ヌクレオチド
認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼで消化して，約２００−４００ｂｐの
類似する長さのＤＮＡフラグメントを得ることができる。

【００２６】第１のプライマーおよび第２のプライマーのアニーリングおよびハイブリダイ
ゼーションは，配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含むプライマー，およ
び配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含むより長い第２のプライマーを加
えることにより行うことができる。前記第１のプライマーは，前記プライマーの
最後の３’ヌクレオチドがジデオキシ（ｄｄ）−ヌクレオチドであるように，さ
らに修飾することができる。以下のライゲーション反応におけるプライマーの最
終濃度は５μＭであった。本発明において用いられるプライマーと増幅すべきＤ
ＮＡとの間の比率は，３Ｍｉｏ：１の範囲であり，より好ましくは前記比率は３
００，０００：１の範囲であり，最も好ましくは前記比率は３０，０００：１の
範囲であった。さらに，前記プライマーは，これらを前記ＤＮＡサンプルに加え
る前に，互いにプレハイブリダイズさせることができる。

【００２７】アニーリング反応は，前記制限酵素の不活性化をも行う温度，すなわち６８℃
で開始した。前記第２のプライマーを前記ＤＮＡフラグメントにライゲーション
させ，これに対し，前記第１のプライマーはライゲーションさせなかった。これ
は，ライゲーションに必要な５’リン酸が利用可能ではなかったためである。し
たがって，反応温度を，そのようなライゲーション反応を実施することができる
温度，すなわち１５°Ｃまでゆっくり低下させた。ライゲーションは，ＡＴＰお
よびＴ４−ＤＮＡ−リガーゼを前記プライマーおよびＤＮＡフラグメントに加え
ることにより行った。ライゲーション後，温度を，前記プライマーが前記ＤＮＡ
フラグメントから解離するより高い温度（例えば約６８°Ｃ）に変化させること
を含む変性工程により，前記第１のプライマーを前記ＤＮＡフラグメントから除
去した。前記第１のプライマーは前記ＤＮＡフラグメントにライゲートしたまま
であった。

【００２８】得られた前記ＤＮＡフラグメント上の５’リン酸伸長を，実施例に示すように
，ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下で適当
な条件下でＤＮＡポリメラーゼ（この場合はＴａｑおよびＰｗｏポリメラーゼ）
を加えることによりフィルインした。

【００２９】次に，実施例２および３に詳細に記載されるように，前記第２のプライマーを
濃度１μＭで用いて，得られた混合物をＰＣＲ増幅した。

【００３０】次に，実施例３に記載されるように，増幅生成物をさらに分析した。

【００３１】本発明の方法は，従来技術の方法において挙行しなければならない特別の用心
深い処置には実質的に依存しない。例えば，本発明の方法を用いる場合，所望の
ＤＮＡを増幅前に抽出または精製することは必要ない（これはＤＮＡの喪失につ
ながりうる）。

【００３２】すなわち，ＤＮＡ増幅についての上述の方法とは異なり，本発明の方法は，異
なるアダプターにライゲーションした選択配列をさらに使用するために便利かつ
最適な増幅条件下で実施することができる。

【００３３】本発明の方法は，抽出されていないＤＮＡサンプルからのものであっても，単
一の細胞の全ゲノムの増幅を初めて可能としたものである。このことにより，例
えば，個々の単離された播種性腫瘍細胞のゲノム分析が可能となり，比較ゲノム
ハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を単一の細胞に適用することが可能となる。
したがって，本発明の方法は，例えば，単一の細胞において，転移可能性を有す
る播種性腫瘍細胞の播種および異所性成長を促進するかもしれない個々の遺伝的
変化を同定する手段を提供する。そのような単一の播種性細胞のゲノムプロファ
イルは，ある種のクローン性遺伝子型が播種的事象に関連しているか否かに関す
る有用な情報を提供することができる。

【００３４】さらに，本発明の方法は，ＣＧＨを個々の細胞に再現性をもって適用すること
を初めて可能とした。これに対し，“全ゲノム増幅”用の他のプロトコル，例え
ばＰＥＰ，ＤＯＰ−ＰＣＲおよびＡｌｕ−ＰＣＲは，試験ＤＮＡの起源が単一の
細胞，単一染色体またはそれらの一部である場合，ＣＧＨにより均質の染色パタ
ーンを与えない。個々の単一の細胞に対するＣＧＨのこの再現性のある適用は，
とりわけ，ＤＯＰおよびＰＥＰ技術においてこれまでに用いられてきたオリゴヌ
クレオチドのプライマー結合部位の複雑さを劇的に減少させる非縮重プライマー
を用いるという事実により説明することができる。以前は多数であったこれらの
異なる部位は，同等に多数の異なる特定のＰＣＲ条件を必要とし，これは同じ反
応の間に行うことは不可能である。さらに，本発明の増幅方法は，ゲノム中の反
復配列（ＩＲＳ−ＰＣＲ等）に依存しないため，そのような反復配列がより少な
い頻度で存在するか，または存在しない種からの単一の細胞のゲノムＤＮＡを，
信頼性をもって増幅することが可能である。

【００３５】本発明の方法の好ましい態様においては，増幅されるＤＮＡは，単一の細胞の
ゲノムまたは染色体またはそのフラグメントである。驚くべきことに，本発明の
方法は，播種性腫瘍細胞，リンパ節から得られた細胞，末梢血細胞，骨髄吸引物
からの細胞，腫瘍生検からの細胞，微小切開組織から得られた細胞などの，単一
の細胞の分析に特に有用であることが見いだされた。後述の実施例に示されるよ
うに，本発明の方法はまた，単一の細胞が興味深いかもしれない遺伝的情報を含
むことがまれである場合に，その任意の単一の細胞（またはその染色体もしくは
フラグメント）のゲノムの分析に有用である。まれである前記単一の細胞は，と
りわけ，上述した細胞，または母体の静脈血液中の胚／胎児細胞等でありうる。
本発明の方法は，複雑な（細胞）集団中の遺伝的変種のクローン的進化事象，と
りわけ末梢血，骨髄等から単離される単一のマイクロ転移性細胞のクローン的進
化の評価に特に有用である。

【００３６】単一の二倍体細胞のＤＮＡ含有量は，わずか６−７ｐｇである。従来のＤＮＡ
増幅方法，例えばＤＯＰ−ＰＣＲにおいては，全ＤＮＡの有効な増幅には，少な
くとも２５ｐｇのＤＮＡ（４個の二倍体細胞に相当）が必要である。しかし，実
施例３，４，５および６に示されるように，本発明の方法は，単一の細胞の全ゲ
ノムを信頼性をもって増幅し分析する手段を提供する。

【００３７】本発明の方法の別の好ましい態様においては，前記ＤＮＡは，１コピーの二本
鎖ＤＮＡ配列の形で存在する。

【００３８】本発明の方法の別の好ましい態様においては，前記ＤＮＡフラグメントの数的
多量性は本質的に維持される。本発明にしたがって見いだされてきたように，本
発明の方法は，ゲノム配列を再現性をもって増幅することができる。通常は８０
％，好ましくは９０％以上，より好ましくは９５％以上，最も好ましくは９９％
またはそれ以上のゲノム配列を本発明の方法により増幅することができ，実施例
４において示されるように，これらのゲノム配列のそれぞれについて，増幅生成
物の量は，それらのゲノム中におけるコピー数に実質的に対応する。したがって
，本発明の方法を用いると，前記ＤＮＡ増幅の前と後でゲノム配列間の比率が同
じに維持されるように，所定のサンプルのＤＮＡを増幅することが可能である。
上述したように，ＲＤＡ（Ｌｕｃｉｔｏ（１９９８），ＰＮＡＳＵＳＡ９５
，４４８７−４４９２）等の方法は，ゲノム配列の７０％しか増幅されないよう
な増幅を提供する。先行技術方法により増幅されたＤＮＡフラグメントがその相
対的な数的多量性を維持しているか否かは疑わしい。

【００３９】本発明の方法の別の好ましい態様においては，前記方法は，工程（ａ）の前に
，ＤＮＡを含む前記サンプルをプロテイナーゼで消化する工程（ａ'）を含み，
かつ，工程（ｂ'）における蛋白質消化の後，プロテイナーゼを不活性化する。
好ましくは，前記プロテイナーゼは熱不安定性である。したがって，前記プロテ
イナーゼは，工程（ｂ'）において熱不活性化することができる。本発明の方法
の好ましい態様においては，前記プロテイナーゼはプロテイナーゼＫである。

【００４０】本発明の方法のさらに別の好ましい態様においては，前記制限エンドヌクレア
ーゼはその制限部位中にシトシン／グアニンを含まない。ゲノムのシトシンおよ
びグアニン残基はメチル化される可能性があり，これが制限酵素による酵素的切
断を減少させうることが，当該技術分野においてよく知られている。

【００４１】本発明の方法の特に好ましい態様においては，前記制限エンドヌクレアーゼは
，４つの規定された塩基を有するモチーフを認識する。そのようなエンドヌクレ
アーゼは，その認識部位に４つの特徴的なヌクレオチドを有する酵素（例えばＭ
ｓｅＩ），ならびに追加の不定（ｗｏｂｂｌｅ）塩基が制限部位中に存在する酵
素（例えばＡｐｏＩ）を含む。好ましくは，前記制限エンドヌクレアーゼはコン
センサス配列ＴＴＡＡを認識する。

【００４２】本発明の方法の最も好ましい態様においては，前記制限エンドヌクレアーゼは
ＭｓｅＩまたはそのイソシゾマーである。前記制限酵素を使用することの利便性
は実施例２において示される。

【００４３】第１のプライマーは第２のプライマーより長くてもよいが，さらに別の好まし
い態様においては，本発明は，工程（ｃａａ）において前記第２のプライマーが
前記第１のプライマーより長いことを特徴とする，上述の方法に関する。実施例
において示されるように，適切な長さの差は８−１２ｂｐである。

【００４４】本発明の方法の別の好ましい態様においては，実施例２において示されるよう
に，工程（ｃａａ）における前記第２のプライマーのアニーリング温度は，前記
第１のプライマーの前記第２のプライマーおよび前記５'オーバーハングへのハ
イブリダイズ温度より高い。

【００４５】本発明の方法の特に好ましい態様においては，工程（ｃａａ）において，前記
第１のプライマーは１１または１２ヌクレオチドを含み，前記第２のプライマー
は２１ヌクレオチドを含む。

【００４６】本発明の方法にしたがって，工程（ｃａａ）または工程（ｃｂａ）において，
前記第１のプライマーは前記第２のプライマーに少なくとも部分的に相補的であ
ることが理解される。特に好ましい態様においては，前記第１のプライマーおよ
び前記第２のプライマーは，パリンドローム配列を含む。

【００４７】本発明の方法のさらに別の好ましい態様においては，前記第１のプライマーお
よび前記第２のプライマーの配列は非縮重である。上述するように，当業者に知
られる他の方法，例えばＤＯＰ−ＰＣＲ（Ｔｅｌｅｎｉａｓ（１９９２），Ｇｅ
ｎｏｍｉｃｓ１３，７１８−７２５）は，縮重オリゴヌクレオチドまたは部分
的に縮重したプライマーの使用に基づく。そのような縮重プライマーは，自己ア
ニーリングして，それ自身が標的配列に結合することを（互いに）阻害し，増幅
効率が減少するという高い危険を伴う。

【００４８】さらにより好ましい態様においては，工程（ｃａａ）において用いられる前記
第１のプライマーは配列番号２に示される配列を有し，および／または工程（ｃ
ａａ）において用いられる前記第２のプライマーは配列番号１に示される配列を
有する。

【００４９】本発明の方法の別の好ましい態様においては，上述の方法の工程（ｃａａ）に
おける第１のプライマーの最後の３'ヌクレオチドは，前記プライマーがポリメ
ラーゼ活性（例えばＴａｑポリメラーゼ活性）により伸長されないように修飾さ
れている。当業者には，そのような修飾およびそのような修飾オリゴヌクレオチ
ドを製造する方法はよく知られている。これらの修飾の１つは，上述の工程（ｃ
ａａ）における第１のプライマーの３'末端にｄｄ−ヌクレオチドを付加するこ
とでありうる。

【００５０】別の好ましい態様においては，本発明の方法の前記第１のプライマーおよび前
記第２のプライマーを，前記ＤＮＡフラグメントとは別に互いにハイブリダイズ
させ，これらが互いにハイブリダイズした後に前記ＤＮＡフラグメントに加える
。ハイブリダイズしたプライマーを前記ＤＮＡフラグメントに加えることは，工
程（ｃａ）または工程（ｃｂ）の前に行う。そのようなプライマーのプレハイブ
リダイゼーションにより，とりわけ，前記ＤＮＡフラグメントへのハイブリダイ
ゼーション効率がより高くなり，染色体ＤＮＡへの干渉を回避することができる
。

【００５１】本発明の方法の別の好ましい態様においては，単一の細胞の本質的に全核ゲノ
ムが増幅される。

【００５２】本発明の方法により，通常は８０％，好ましくは９０％以上，より好ましくは
９５％以上，最も好ましくは９９％またはそれ以上の，全核ゲノムを増幅するこ
とができる。

【００５３】本発明の方法の特に好ましい態様においては，前記単一の細胞は化学的に固定
された細胞である。細胞または組織を化学的に固定する１つの方法はホルマリン
である。他の方法も当業者にはよく知られている。

【００５４】本明細書に記載される本発明の方法は，異なる起源のＤＮＡ，例えば凍結切片
および／または冷凍切片および／またはパラフィン包埋，ホルマリン固定標本か
ら単離した固形腫瘍ＤＮＡに適用することができる。数十年間，これらの組織切
片は，主として組織病理学診断のために保存されていた。単一の細胞または組織
病理学組織からの限定された量の細胞を含む小サンプルを，特定の遺伝的変化に
ついてスクリーニングし，同じ組織の明確に異なる組織病理学的特徴を示す他の
領域と，または対照の目的で見かけ上正常な組織の領域と比較することができる
。保管されている組織材料からの腫瘍ゲノム中のコピー数配列変化の包括的なス
クリーニングは，固体腫瘍における細胞遺伝学的変化に関する知識を著しく増加
させることができるであろう。これらの細胞遺伝学データを，組織学および組織
化学的結果および臨床的追跡データと直接比較することが可能となる。

【００５５】さらに，本発明の方法は，微小切開および／またはレーザー微小切開（例えば
，レーザーマイクロビームマイクロ切開，好ましくは，レーザー圧カタパルトと
組み合わせたもの）の材料，とりわけ，本明細書の実施例に示されるような，凍
結切片からの材料に由来する，単一の細胞のＤＮＡの増幅に用いることができる
。

【００５６】本発明の方法のさらに好ましい態様においては，工程（ａ）−（ｅ）は，１つ
の反応容器中で実施される。このことにより，起こりうるテンプレートの喪失を
回避することができ，さらに，コンタミネーションを伴うかもしれず，面倒な，
反応容器の追加の開閉を回避することができるという利点を有する。

【００５７】当業者には明らかなように，本発明の方法および／または本発明の方法により
得られる増幅されたＤＮＡフラグメントは，診断アッセイにおいて，および研究
道具として特に有用である。前記増幅されたＤＮＡフラグメントは，とりわけ，
標的ＤＮＡがわずかの量でしか入手できない領域および分野，例えば法医学調査
（とりわけ，ＤＮＡフィンガープリンティング），古生物学および／または古考
古学において有用である。さらに，本発明の方法および／または該方法により得
られる増幅されたＤＮＡフラグメントは，ヒトおよび動物の胚の移植前診断にお
いて特に有用である。前記方法および／または前記増幅されたＤＮＡフラグメン
トは，さらに，とりわけ，チップ技術と組み合わせて，サンプル，例えば食品ま
たは血液サンプルまたは液体サンプル中の夾雑生物のＤＮＡを同定するアッセイ
に用いることができる。さらに，本発明の方法および／または前記方法により得
られる増幅されたＤＮＡフラグメントは，医薬組成物または診断溶液中の夾雑Ｄ
ＮＡの検出に有用であろう。

【００５８】したがって，本発明は，さらに，上述の方法により得られる増幅されたＤＮＡ
フラグメントの，ＤＮＡ分析の方法および技術における使用に関する。そのよう
な方法および技術は，出生前診断，法医学，病原性分析または生物学的／生化学
的研究において日常的に用いられており，当業者には知られている。

【００５９】本発明の方法の使用の特に好ましい態様においては，ＤＮＡ分析の方法は，比
較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）−，代表相違分析（ＲＤＡ）−，分
析的ＰＣＲ−，制限酵素長多型分析（ＲＦＬＰ）−，一本鎖コンフォメーション
多型分析（ＳＳＣＰ）−，ＤＮＡ配列−，“ヘテロ接合性喪失”（ＬＯＨ）−，
フィンガープリント−および／またはＦＩＳＨ−分析である。

【００６０】コピー数，構造および遺伝子の発現およびＤＮＡ配列の変化をゲノム全体にわ
たってスクリーニングする種々の技術が利用可能となる。これらには，分子細胞
遺伝学技術（例えば，比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）および多色
蛍光インシトゥーハイブリダイゼーション（Ｍ−ＦＩＳＨ）），ならびに分子遺
伝学技術（例えば，代表相違分析（ＲＤＡ），ディファレンシャルディスプレイ
，遺伝子発現の連続的分析（ＳＡＧＥ）およびマイクロアレイ技術）が含まれる
。ＣＧＨは，全ゲノムの包括的分析を可能とした最初の分子細胞遺伝学の道具で
あった（Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ（１９９２），Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８，８１
８−８２１）。ＣＧＨは，ＤＮＡ配列のコピー数変化のスクリーニングを可能と
し，ＤＮＡ標本中で獲得されたまたは喪失された染色体領域のマップを提供する
。ＤＮＡのコピー数変化は癌の病原性に重要であるため，ＣＧＨのほとんどの用
途は癌研究におけるものである。

【００６１】改変したインシトゥーハイブリダイゼーションに基づくＣＧＨにおいては，異
なるように標識された試験（緑）および参照（赤）ＤＮＡを，正常中期スプレッ
ドに共ハイブリダイズさせる。中期染色体上では，試験ゲノムと参照ゲノムとの
間のコピー数の相違は，緑：赤の蛍光強度の相違として見られる。試験ＤＮＡに
おけるＤＮＡ獲得および増幅は，増加した蛍光比を有する染色体領域として見ら
れ，喪失および欠失により比は減少する。

【００６２】ＣＧＨの癌研究に対する重要な貢献は，癌遺伝子の推定上の位置を，特にＤＮ
Ａ増幅を生じている染色体部位において，正確に示してきたことである。ある癌
においては，ＣＧＨにより，多数の部分領域染色体獲得およびＤＮＡ増幅が発見
されている。オンコジンおよび薬剤耐性遺伝子はＤＮＡ増幅により上方制御され
ることが知られているため，癌におけるＤＮＡ増幅部位は癌の進行において重要
な役割を有する新規遺伝子の位置を正確に示すことができると推測されている。
腫瘍の進行は，局所的な，ゆっくり成長する腫瘍が，侵襲性，転移性および難治
性の癌へとしだいに遷移することを包含すると考えられている。この進行は，重
要な遺伝子に影響を及ぼす遺伝的変化の段階的累積により引き起こされると考え
られている。ＣＧＨは，クローン性遺伝的変化のゲノムスケールの情報を提供す
ることにより，腫瘍進行プロセスの生物学基礎の分析において非常に有用である
。同じ患者から異なる進行段階で採取した２つの癌標本を分析することができる
。例えば，原発性腫瘍においては見られないが，その転移物には生じている遺伝
的変化は，転移性進行に重要な役割を有する遺伝的変化および遺伝子の位置を正
確に示すための情報を与えることができるであろう。

【００６３】転移性再発は，個々の腫瘍細胞の初期の播種により引き起こされ，これらは原
発性腫瘍が診断され外科的に除去される前に，その原発部位を離れて循環中に入
る。これらの細胞の大部分は，免疫系により排除されるかまたはアポトーシスを
生じるが，一部は循環中の危険を逃れて生存し，第２の部位で組織に侵入し，数
年間休眠状態を保った後，最終的に成長して転移となる。この転移形成の初期段
階（最小の後遺症）は，腫瘍細胞が少なくかつ分散しているときは，癌の"アキ
レスの踵"であり，臨床的転移を予防する新規な治療方法の開発のための有望な
標的である。

【００６４】したがって，個々の腫瘍細胞をＣＧＨ等の方法によりスクリーニングするため
には，そのような細胞の全ゲノムを均一かつ正確に増幅することが望ましい。し
たがって，上述の方法は，個々の腫瘍細胞をＣＧＨによりスクリーニングするの
に特に有用であり，したがって，例えば新生物疾患またはそのような疾患に罹患
していると疑われる患者の早期診断を可能とする。“新生物疾患”との用語は，
単一の細胞における悪性形質転換の開始から，進行した癌疾病（遠位固形転移を
含む）までの全スペクトルを意味することが意図されている。

【００６５】ＣＧＨおよびＤＯＰ−ＰＣＲに基づいて，これまでのところ再現性のある増幅
に必要な標的ＤＮＡの最小量は５０ｐｇであり，これは８個の二倍体細胞に相当
する（Ｓｐｅｉｃｈｅｒ（１９９３），Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１，１
９０７−１９１４）。より少ない量のゲノムＤＮＡは，再現性をもって増幅する
ことができなかった。本発明の方法を用いて，１回の試験に必要なＤＮＡの量を
さらに減少させることが可能である。

【００６６】本発明の方法は，例えば続いてＣＧＨにおいて用いるための均一に増幅された
ＤＮＡを提供するのみならず，サンプルがわずかの量のＤＮＡしか含まないよう
な別の技術および方法のために，最少量のＤＮＡであっても，信頼性のある均一
な増幅を可能とする。例えば，法医学科学においては，最近数年間にＤＮＡタイ
ピング方法はますます重要になってきている（Ｌｅｅ（１９９４），Ａｍ．Ｊ．
ＦｏｒｅｎｓｉｃＭｅｄ．Ｐａｔｈｏｌ．１５，２６９−２８２）。ＰＣＲお
よびＲＦＬＰ分析（フィンガープリント分析とも称される）は，精子，血液痕跡
または個々の細胞等に見いだされるわずかの量の入手可能なＤＮＡを用いて実施
される。

【００６７】本発明の方法の別の重要な用途は，母体血液中の胚または胎児細胞を用いる出
生前診断である。妊婦の母体血液から濃縮された胚細胞または胎児細胞を染色体
異常の出生前診断に使用することが可能であるということは，羊水穿刺または絨
毛膜絨毛サンプリング等の現在の方法に代わる非侵襲的代替法を求める者にとっ
て長い間望まれていたゴールであった。新規な疾病遺伝子の位置決定および同定
により，単一遺伝子疾患または染色体異常等のリスクについての，胎児における
変異分析または連関研究が可能となる。本発明の方法は，移植前の遺伝的疾患の
診断または母体血液から単離された胎児細胞の診断のための方法の正確性ならび
に適用可能性を改良し，このことにより単一の細胞のレベルで分析を行うことが
可能となり，したがって，あらかじめ細胞を濃縮する必要性を回避することがで
きる。実施例に示されるように，本発明の方法は，母体血液，とりわけ臍帯血か
ら単離された単一の胎児細胞または胚細胞からのＤＮＡの信頼しうる増幅を提供
する。

【００６８】さらに本発明は，少なくとも１つのプライマーおよび／または上で定義した第
１のプライマーおよび／または第２のプライマーを含むキットに関する。好適に
は，本発明のキットはさらに，前記プライマーに加えて，プロテイナーゼ，制限
酵素，ＤＮＡリガーゼ（例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ），ＤＮＡポリメラーゼ（例
えばＴａｑポリメラーゼ），Ｐｗｏポリメラーゼ，および／またはＴｈｅｒｍｏ
Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ，ならびに反応緩衝液および／または保存溶液を任意に含ん
でいてもよい。さらに，本発明のキットの一部をバイアル中に個別に包装しても
よく，容器または多容器ユニット中に組み合わせて包装してもよい。実施例にお
いて有用なように示されているように，プロテイナーゼＫ消化，４塩基切断制限
エンドヌクレアーゼおよび上で定義したプライマーは，本発明の方法に適切であ
る。すなわち，本発明のキットは，好ましくは，プロテイナーゼＫ，４塩基切断
制限エンドヌクレアーゼ（例えばＭｓｅＩ），Ｔａｑおよび／またはＰｗｏポリ
メラーゼ），上で定義したプライマーおよび／またはＴ４リガーゼを含む。本発
明のキットは，本発明の方法を実施するために有利に用いることができ，とりわ
け，上で参照した種々の用途，例えば診断キット中でまたは研究道具として用い
ることができる。さらに，本発明のキットは，科学的目的および／または診断目
的に適した検出手段を含んでいてもよい。キットの製造は，好ましくは，当業者
に知られる標準的方法にしたがう。

【００６９】さらに，本発明は，上で定義した第１のプライマーおよび／または第２のプラ
イマーの，本発明の方法を実施するためのキットの製造における使用に関する。

【００７０】本明細書および特許請求の範囲の全体を通して，分脈によりそうではないこと
が示されない限り，"含む"との用語，および"含んでいる"等のその変形は，記載
される整数もしくは工程，または整数もしくは工程の群が含まれるが，その他の
整数もしくは工程，または整数もしくは工程の群が含まれないことを意味するも
のと理解されるであろう。

【００７１】図面の簡単な説明図１．ダウン症候群の患者の末梢血リンパ球のＣＧＨプロファイル。有意であ
ると考えられるためには，黒い中線からの偏差は右（染色体獲得）または左（染
色体喪失）の点線を横切らなければならない。黒い水平バーは，異質染色質ＤＮ
Ａが優勢であるために分析から除いた領域を示す。染色体２１（ブロックされた
異質染色質の領域を除く）は完全に増幅されたことが見いだされたが，他の染色
体はすべて正常なプロファイルを示した。中線からの偏差は，右（染色体獲得）
または左（染色体喪失）を横切らなければならない。

【００７２】図２．ＭＣＦ−７細胞株からおよび同じ細胞株の単一の細胞から，ＰＣＲ増幅
後に調製した１μｇのニックトランスレーションしたＤＮＡを用いる慣用的なＣ
ＧＨ実験のＣＧＨプロファイルの比較。両方の実験について，単一の細胞と細胞
株との間の差異を比較するために，染色体２，３，８，１９および２０が示され
ている。単一の細胞のプロファイルは上部パネルに示され，細胞株のプロファイ
ルは下部パネルに示されている。染色体記号の右側のバーは，試験ＤＮＡの染色
体獲得を示し，左側のバーは染色体喪失を示す。染色体１０は，いずれのサンプ
ルにおいても変化は認められなかった１つの例である。中線からの偏差は，右（
染色体獲得）または左（染色体喪失）を横切らなければならない。

【００７３】図３．ＹＡＣクローンを有するＭＣＦ−７細胞の，２ｐ２５（赤）および２ｑ
３１（緑）についての２色間期ＦＩＳＨ。右上の細胞においては，２ｐ領域につ
いては３つのシグナルを同定することができるが，２ｑについては２つしか同定
することができない。他の細胞は，２ｐおよび２ｑプローブの両方について２つ
のシグナルを示す。

【００７４】図４．乳癌患者の骨髄からの単一の播種性腫瘍細胞の単離。免疫染色の後，細
胞懸濁物をピペットでスライド上に置き免疫蛍光細胞について調べた（Ａ）。（
Ｂ）は，明るい細胞質染色および周りの細胞がバックグラウンド蛍光を示さない
ことを示す。次に，細胞をガラスキャピラリーにより吸引し（Ｃ），新たなスラ
イドに移した。全可視野には他の細胞が含まれていなかったため，蛍光細胞以外
の細胞は移さなかった。ここから，細胞を取り出して増幅管に移した。（Ｄ）は
，細胞の染色体の変化を示す。

【００７５】図５．ＣＵＰ症候群を有する患者の４つの単一腫瘍細胞（Ｔ＃１−Ｔ＃４）お
よび１つの正常細胞のＣＧＨプロファイル。同一および相違する所見を比較する
ために，染色体２，５，７および１５を選択した。染色体２，５および１５上の
喪失はすべての腫瘍細胞に共通していたが，染色体７の喪失はＴ＃２についての
み見いだされた。他のプロファイルにおけるものと同様に，染色体喪失は染色体
記号の左側の垂直バーで示される。

【００７６】図６．（Ａ）ＡＰＣ遺伝子にリンクしたＤ５Ｓ３４６座におけるジヌクレオチ
ド反復多型を用いるＬＯＨ分析（上部），およびＡＰＣ遺伝子のエクソン１５中
のＡｌｗ２１Ｉ部位のＰＣＲ−ＲＦＬＰ（下部）。最初の実験においては，４つ
の腫瘍細胞のすべてが１つのアレルの喪失を示し，一方，単一の対照細胞は，＃
２を除き，２つのアレルを含んでいた。ＡＰＣのＰＣＲ−ＲＦＬＰ実験において
は，１つの対照細胞（＃３）を除くすべての細胞が２つのアレルを有しており，
一方，腫瘍細胞は未切断フラグメントのみを含有していた。腫瘍細胞＃４のフラ
グメントは増幅されなかった（−，負対照；Ｍ１０，１０ｂｐラダー；Ｍ５０，
５０ｂｐラダー；Ｍ，アガロースゲル電気泳動用のマーカー）。

【００７７】（Ｂ）コドン２１５において見いだされる変異の配列。単一の対照細胞は，ｎ
ｔ６４３にＡを有する野生型配列を含んでおり（上部の２つの配列），一方，腫
瘍細胞はこの位置で変異しており，Ａ→Ｇ変異を示した（下部の２つの配列）。
８個の細胞のうち４個の配列が示されている。

【００７８】図７．腫瘍抑制遺伝子ｐ５３のエクソン６のＳＳＣＰ分析。３つの正常細胞お
よび３つの腫瘍細胞，ならびに転移物からの生検について，ＳＳＣＰ分析を行っ
た。単一の正常細胞のＰＣＲ産物は，腫瘍細胞のものとは異なる位置に移動した
。すべての腫瘍細胞中で点突然変異は容易である。興味深いことに，腫瘍細胞に
加えて正常間質性または浸潤性細胞を明らかに含む生検サンプルにおいては，両
方のバンドを認めることができる。

【００７９】図８．新生男児の臍帯から単離された単一のリンパ球のＣＧＨプロファイル。
細胞は，妊娠中の母体の末梢血中の胎児からの細胞を検出するためにしばしば用
いられるマーカーである，胎児ヘモグロビンに対する抗体を用いて染色した。女
性ＤＮＡはＣＧＨ実験において対照ＤＮＡとして働く。次に，ハイブリダイゼー
ションの質を，この実験の設計の結果として，Ｘ染色体の“喪失”およびＹ染色
体の“獲得”を示すことにより評価することができる。示されるように，性別を
判定することに成功し，すべての常染色体は正常なプロファイルを示した。

【００８０】図９．フィンガープリント分析のための単一の細胞中の多型の同定。マイクロ
サテライトＰＣＲにおいては，バンドのサイズは多型に対応する。したがって，
多型の同定には，この方法によりサイズが変化しないことが必要である。ここで
は，１２個の単一の細胞に由来するジヌクレオチドマイクロサテライトマーカー
（Ｄ５Ｓ１９７５）のＰＣＲ産物が，数千個の細胞のＤＮＡから生成したバンド
（＋）の次に示される。個々の細胞から増幅されたマーカーの２つのアレルおよ
び正対照は，同じサイズに移動した。ヘテロ接合性の喪失は観察されなかった。

【００８１】図１０．（Ａ）：マイクロマニピュレーションによる，アルカリホスファター
ゼを用いるＢＣＩＰ／ＮＢＴ染色細胞の単離。（Ｂ）：実施例１５に記載される
ように，ｍａｂＡ４５Ｂ／Ｂ３で免疫細胞化学的に染色した２４個の連続的
に単離した細胞のサイトケラチン１９（ＣＫ１９）のゲノム配列のＰＣＲ分析。
免疫蛍光標識と比較して，感度の喪失は観察されず，ＣＫ１９ＰＣＲにより例
示される全ゲノム増幅は，すべての細胞において成功した。（Ｃ）：図１０Ｂの
細胞番号４のＣＧＨプロファイル。ゲノム中に種々の異常が存在する。

【００８２】本発明を以下の生物学的例を参照して説明する。これらの例は，単なる例示で
あり，本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。

【００８３】実施例１：ＤＮＡの消化比較研究において，４塩基モチーフを認識するいくつかの制限酵素について，
これらが本発明の方法に適当な０．２−２ｋｂの長さのＤＮＡフラグメントを生
成することができるか否かについて試験した。４塩基が等分に分布し，消化が完
全であるという前提で，２５６ｂｐ（４⁴）の平均長を有するフラグメントが予
測された。５種類の酵素を試験した：ＴａｑＩ（ＴＣＧＡ），Ｃｓｐ６Ｉ（ＧＴ
ＡＣ），ＭｓｐＩ（ＣＣＧＧ），ＡｃｉＩ（ＣＣＧＣ，ＧＣＧＧ）およびＭｓｅ
Ｉ（ＴＴＡＡ）。その認識部位中にＣ／Ｇを含まない酵素であるＭｓｅＩのみが
，１００−１５００ｂｐの長さの範囲に見られるスメアーを生成し，したがって
，これをプロトコルにおいて用いた。

【００８４】実施例２：単一の細胞のＤＮＡの増幅テンプレートの喪失を回避するため，すべての調製工程は１つの管の中で行っ
た。ＤＮＡ単離，制限酵素消化，プライマーライゲーションおよびＰＣＲ増幅に
ついては，すべての緩衝液および条件は，最も高い信頼性および再現性を補償す
るよう，最適の能力に調節した。一般に，高濃度のプロテイナーゼＫ，ＭｓｅＩ
，Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよびＴａｑポリメラーゼが最高の結果を与えた。

【００８５】１μｌのｐｉｃｋ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．３，７５ｍ
ＭＫＣｌ，３ｍＭＭｇＣｌ₂，１３７ｍＭＮａＣｌ）中の単一の細胞（例
えば，末梢血リンパ球または骨髄支質細胞）を，２μｌのプロテイナーゼＫ消化
緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．５），１０ｍＭ酢酸マグネシウム
，５０ｍＭ酢酸カリウム（０．２μｌのＰｈａｒｍａｃｉａＯｎｅ−Ｐｈｏｒ
−Ａｌｌ−Ｂｕｆｆｅｒ−Ｐｌｕｓ），０．６７％ＴＷＥＥＮ（Ｓｉｇｍａ），
０．６７％Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ），０．６７ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ
）に加え，加熱蓋を有するＰＣＲ機器中で，４２℃で１０時間インキュベートし
た。プロテイナーゼＫを，８０℃で１０分間不活性化した。プロテイナーゼＫを
不活性化した後，ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ消化は，５μｌ中で，０．２
μｌのＯｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ−Ｂｕｆｆｅｒ−Ｐｌｕｓ，０．５μｌＭｓ
ｅＩ（１０Ｕ；ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）および１．３μｌ
Ｈ₂Ｏを加えることにより，３７℃で３時間行った。プライマーのアニーリング
は，各０．５μｌ（１００μＭ保存溶液，Ｍｅｔａｂｉｏｎ）の，ＭｓｅＬｉｇ
２１プライマー（配列番号１，（５’−ＡＧＴＧＧＧＡＴＴＣＣＧＣＡＴＧＣＴ
ＡＧＴ−３’）で示される）およびＭｓｅＬｉｇ１２プライマー（配列番号２，
（５’−ＴＡＡＣＴＡＧＣＡＴＧＣ−３’）で示される），０．５μｌのＯｎｅ
−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ−Ｂｕｆｆｅｒおよび１．５μｌのＨ₂Ｏを加えて，ＰＣＲ
反応中のプライマーの最終濃度を１μＭとして行った。アニーリングは，６５°
Ｃの温度で開始し（ライゲーションの前に制限酵素を不活性化することにも役立
つ），１℃／分の勾配で１５℃まで低下させた。１５℃において，１μｌのＡＴ
Ｐ（１０ｍＭ）および１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を加え，プライマーとＤＮＡフラグメントを一夜ライゲ
ーションさせた。

【００８６】一次ＰＣＲ増幅のためには，３μｌのＰＣＲ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＥｘｐａｎｄＬｏｎｇＴｅｍｐｌａｔｅ，緩衝液１），
２μｌのｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）および３５μｌのＨ₂Ｏからなる４０μｌを，
１０μｌの反応容量に加えた。ＰＣＲプログラムは，６８°Ｃで４分間の変性工
程から開始し，ＭｓｅＬｉｇ−１２オリゴヌクレオチドを除去し，１μｌ（３．
５Ｕ）のＴａｑおよびＰｗｏポリメラーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈ
ｅｉｍ，ＥｘｐａｎｄＬｏｎｇＴｅｍｐｌａｔｅ）のＤＮＡポリメラーゼ混
合物を加え，３分間インキュベーションしてフィルイン反応を行った。Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒを，９４°Ｃ（４０秒間），５７°Ｃ（３
０秒間），６８°Ｃ（１分１５秒間）を１４サイクル；９４°Ｃ（４０秒間），
５７°Ｃ（３０秒間），６８°Ｃ（１分４５秒間）を３４サイクル；および９４
°Ｃ（４０秒間），５７°Ｃ（３０秒間），６８°Ｃ（５分間）の最終サイクル
となるようプログラムした。

【００８７】プライマーの選択に関しては，ＨＰＬＣ精製およびアニーリング／ライゲーシ
ョン反応における高濃度（５μＭ）が，成功の必須要件であった。これらの条件
下における，消化した単一の細胞のＤＮＡの増幅により，１μｇの高分子量ＤＮ
Ａの完全消化と類似するサイズのスメアーが得られた。

【００８８】実施例３：末梢血リンパ球からの増幅したＤＮＡを用いるＣＧＨ単一の非固定およびパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定末梢血リンパ球から
単離したＤＮＡを実施例２に記載されるように増幅し，１μｇのニックトランス
レーションした非増幅胎盤ＤＮＡと競合的にハイブリダイズさせた。標識は，Ｔ
ｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅをｄＴＴＰ／ｂｉｏ−ｄＵＴＰの比率７／１と組
み合わせたときに最も効率的であった。再増幅は，３０μｌ中で，０．５μｌ
ＬｉｇＭｓｅ−２１プライマー（１００μＭ），１μｌｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，
ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，各１０ｍＭ，８．６ｍＭｄＴＴＰ）および１．３μｌビ
オチン−１６−ｄＵＴＰ（１ｍＭ，ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）
，１ＸＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ緩衝液中の１３ＵのＴｈｅｒｍｏＳｅｑ
ｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢ）および０．５μｌの１次ＰＣＲを用いて実施した。温度
を，９４°Ｃ（１分間），６５°Ｃ（３０秒間），７２°Ｃ（２分間）を１サイ
クル；９４°Ｃ（４０秒間），６５°Ｃ（３０秒間），７２°Ｃ（１分３０秒間
）を１４サイクル；９４°Ｃ（４０秒間），６５°Ｃ（３０秒間），７２°Ｃ（
２分間）を９サイクル，および追加の最終伸長工程を７２°Ｃで５分間に設定し
て，全体で２５サイクルをプログラムした。２μｇの再増幅標識ＤＮＡを用いる
前に，ＭｓｅＩ消化によりプライマーを除去した。対照ＤＮＡ，ならびにＭＣＦ
−７細胞株ＤＮＡのニックトランスレーション，中期スプレッドの調製およびハ
イブリダイゼーションは，Ｓｐｅｉｃｈｅｒ（１９９３），Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎｅｔ２，１９０７−１４に公表されているように実施した。画像はＳｅｎ
ｓｙｓＣＣＤカメラを備えたＬｅｉｃａＤＭＸＡ−ＲＦ８顕微鏡（Ｐｈｏｔ
ｏｍｅｔｒｉｘ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）で捕捉した。試験ＤＮＡと対照ＤＮＡの
比率の定量的評価は，ｄｕＭａｎｏｉｒ（１９９５），Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ
１９，２７−４１にしたがい，ＬｅｉｃａソフトウエアパッケージＱ−ＣＧＨを
用いて行った。各実験において，プログラムの要件を満たす７−１２の中期スプ
レッドを評価した。実験の間，プロファイルはより平滑になり，ＰＣＲ増幅し標
識した対照ＤＮＡをニックトランスレーションした染色体の代わりに用いたとき
，結果には変化がなかった（図１：ＰＣＲ標識対照ＤＮＡ，および図２：０．５
μｇニックトランスレーションした対照ＤＮＡを比較されたい）。０．５μｇの
対照ＤＮＡを，単一の細胞について記載したように修飾し，増幅し，ジゴキシゲ
ニン−ＵＴＰ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を用いる再増幅反応
において標識した。より平滑なＣＧＨプロファイルは，おそらくは，これらの条
件下で，２つのＤＮＡサンプルについて，反復配列についてのフラグメントサイ
ズおよびブロッキング効率が同一であることを反映しているのであろう。

【００８９】７回の独立した単一細胞実験において，得られたＣＧＨプロファイルは（ＣＧ
Ｈは，Ｓｐｅｉｃｈｅｒ（１９９３），Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．２，１９０７
−１９１４）により記載されたように行った），中線からの有意な偏差として検
出しうる，ＰＣＲに関連した染色体獲得または喪失を示さなかった。実際，分析
したすべての場合において，ドナーの性別を確認することができた。ＰＦＡ固定
は，実験の結果に影響を及ぼさなかった。

【００９０】実施例４：ダウン症候群の患者における染色体変化の検出単一細胞分析により既知の染色体変化を検出しうるか否かを判定するために，
ダウン症候群の患者の血液サンプルからの単一のリンパ球のＤＮＡ，およびその
ＤＮＡを単離し，実施例２に記載のように増幅した。ＣＧＨプロファイルは，１
つの検出しうる異常として染色体２１の獲得を示した（図１）。

【００９１】実施例５：単一のＭＣＦ−７細胞における染色体変化の検出ＭＣＦ−７乳癌細胞株（ＡＴＣＣＨＴＢ−２２）からの単一の細胞，および
ＭＣＦ−７細胞から直接単離した１μｇの増幅されていないＤＮＡの比率プロフ
ァイルを比較することにより，より複雑な数値変化の検出を検証した（図２およ
び表１）。単一細胞ＣＧＨにおいて検出された染色体２ｐの追加の獲得は，ＰＣ
Ｒアルチファクトによるものではなく，ＣＥＰＨ−ＹＡＣｓ６９５ｈ７および９
６３ｄ１１プローブを用いて行った２色間期ＦＩＳＨ（ＦＩＳＨ分析はＬｅｎｇ
ａｕｅｒ（１９９２），ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５２，２５９０−６に記載のよ
うに行い，それぞれ２ｐ２５および２ｑ３１にマップされた）においても認めら
れた。

【００９２】表２にまとめられているように，評価したすべての細胞の１６％は２ｐについ
て３つのシグナルを示したが，２ｑについては２つしか示さなかった（図３）。
細胞集団の１６％にしか存在しない数的多量性は，プールされたＤＮＡから作成
したＣＧＨプロファイルを変化させないが（ｄｕＭａｎｏｉｒ（１９９５），
上掲），この小さい方のサブクローンからの単一の細胞を用いてＣＧＨを行えば
，明確に見ることができるようになるであろう。

【００９３】表１．ＭＣＦ−７および同じ細胞株の単一の細胞において見いだされる変化の
比較ＭＣＦ−７において見いだされる変化のほとんどは，単一の細胞においても検出
することができる。細胞株または単一細胞のいずれかにおいて異なる変化は下線
で示されている。

【００９４】

【表１】

【００９５】表２．乳癌細胞株ＭＣＦ−７からの細胞および正常リンパ球についての間期細胞
遺伝学の結果それぞれの場合について，１００個の核を評価した。

【００９６】

【表２】

【００９７】実施例６：原発性乳癌の患者からの単一の腫瘍細胞のＣＧＨ分析非常にまれな骨髄中の個々の腫瘍細胞を，モノクローナルサイトケラチン抗体
Ａ４５Ｂ／Ｂ３（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）を用いる間接免疫蛍光により，骨髄吸引物
において同定した。Ａ４５Ｂ／Ｂ３により認識されるサイトケラチンのエピトー
プは，サイトケラチン８，１８およびヘテロダイマー８／１８および８／１９に
マッピングされている（Ｓｔｉｇｂｒａｎｄ（１９９８），ＴｕｍｏｒＢｉｏ
ｌ．１９，１３２−５２）。

【００９８】骨髄サンプルの吸引および単核細胞の単離は，記載されたように実施した（Ｐ
ａｎｔｅｌ（１９９６），Ｌａｎｃｅｔ３４７，６４９−６５３）。細胞をＰ
ＢＳ中で洗浄し，０．２％ＰＦＡ中で５分間固定した。５％ＡＢ−血清を用いる
非特異的結合のブロッキング，ならびに２％ペプトン／ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ
Ａ４５−Ｂ／３（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）とのインキュベート（各１０分間）を，０
．０５％サポニン（Ｓｉｇｍａ）の存在下で実施して，細胞を透過性にした。細
胞を２％ペプトン／ＰＢＳ中で洗浄した後，検出のため，抗原抗体複合体を，Ｐ
Ｅコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）とともにインキ
ュベートした（１０分間）。

【００９９】すべての単一の細胞は，細胞懸濁物からマイクロマニピュレーションにより単
離した。骨髄細胞を２５０，０００細胞／０．８ｃｍ²の密度で，容量２００μ
ｌ中で，顕微鏡スライド上に播種した。単一の蛍光細胞を直径約３０μｍのガラ
スピペット中に吸引し，新たなスライドに移した。単一の細胞のみが移されたこ
とを確認した後，この細胞を最後に１μｌのピック緩衝液中に取り出し，ＰＣＲ
反応管中に入れた。

【０１００】国際分類にしたがってｐＴ３，ｐＮ１，ｐＭ０，ｐＧ３と段階づけられた，遠
位転移の形跡を有しない原発性乳癌と診断された患者の骨盤骨からの骨髄吸引物
において，非染色骨髄細胞の中に検出された単一の免疫蛍光標識細胞をマイクロ
マニピュレーションにより取り出し，追加の細胞が不注意で吸引されていないこ
とを可視的に確認するため，新たなスライドに移した（図４Ａ−Ｃ）。このスラ
イドから細胞を取り出して最終反応管に移した。図４Ｄは，この細胞においてＣ
ＧＨ分析により見いだされた染色体獲得および喪失を示し，これは，乳癌につい
て先に報告されている染色体不均衡と一致した。例えば，８ｑおよび１７ｑで観
察された増幅は，３つの最も一般的な獲得のうちの２つであり，８ｐおよび１３
ｑの喪失もまた乳癌において頻繁に生ずることが知られている（Ｆｏｒｏｚａｎ
（１９９７），ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ１３，４０５−９）。

【０１０１】実施例７：ＣＵＰ症候群の患者からの腫瘍細胞のＣＧＨ分析実施例６と同じ方法を，４つの個々のサイトケラチン陽性腫瘍細胞，および原
発病巣が不明の癌（ＣＵＰ症候群）の患者の骨髄から単離された４つの非染色対
照細胞（この患者は最初に肝転移を示した）に適用した。４つの腫瘍細胞のＣＧ
Ｈ分析の所見は，図５および表３にまとめられており，ゲノム変化の非常に一致
したパターンを示した（表３）。特に，いわゆるコンセンサス欠失領域−３ｐ，
５ｑ，１０ｑ，１３ｑ，および１７ｐ−の明確な喪失は，サイトケラチン陽性細
胞が小細胞肺癌由来であることを示唆した（Ｒｉｅｄ（１９９４），Ｃａｎｃｅ
ｒＲｅｓ５４，１８０１−６）。特徴的な肺病巣の臨床画像および転移の組
織病理学試験により，"小細胞から中間細胞−最も有望には上皮−腫瘍"であるこ
とが診断され，したがって，ＣＧＨに基づく疑いが確証された。

【０１０２】表３．ＣＵＰ症候群の患者の骨髄から単離された４つの個々のサイトケラチン
陽性細胞のＣＧＨの結果のまとめいくつかの中線からの偏差は有意に達しなかったが，それぞれの遺伝子座におい
て対照細胞と比較して有意な変化を有する他の腫瘍細胞に対するプロファイルと
非常に類似していた。これらはかっこ内に示される。１つの細胞に独特の変化は
下線で示される。

【０１０３】

【表３】

【０１０４】実施例８：ヘテロ接合性喪失の分析上皮腫瘍においてヘテロ接合性の喪失および変異を検出するために，ＣＵＰ症
候群の患者からの４つすべての腫瘍細胞（実施例７を参照）および４つの非染色
骨髄細胞の増幅ＤＮＡを，ヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）および変異の存在につい
て調べた。単一の細胞におけるＬＯＨの検出には，２つのアレルＤＮＡ鎖を切断
し，アダプターにライゲーションし，ほぼ同一の様式で増幅することが必要であ
る。５ｑ２１上のＡＰＣ腫瘍抑制遺伝子のＬＯＨ分析については，遺伝子の４０
ｋｂ下流に位置するジヌクレオチド反復多型Ｄ５Ｓ３４６およびエクソン１５中
に位置する多型Ａｌｗ２１Ｉ部位を用いた（Ｇｒｏｄｅｎ（１９９１），Ｃｅｌ
ｌ６６，５８９−６００）。１６ｑ２２上のＥ−カドヘリン遺伝子に密接にリ
ンクしているＤ１６Ｓ３０１９マーカー（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ（１９９８），Ｎａ
ｔｕｒｅ３９２，４０２−５）を適用して，Ｅ−カドヘリンのＬＯＨを評価し
た。それぞれの染色体のＣＧＨの結果はすでに５ｑおよび１６ｑからの染色体物
質の喪失を示唆していたため，各対照細胞からの２つのアレルおよび各腫瘍細胞
からの１つのアレルの増幅により，３つのマーカーのそれぞれについて１２のフ
ラグメント（正常細胞について４ｘ２，および腫瘍細胞について４ｘ１）が得ら
れ，合計して３６個の独立して増幅されたフラグメントが得られると計算された
。図６ＡにおいてＡＰＣについて示されているように，いずれのアレルも，分析
した２つのマーカーのそれぞれについて，４つの対照細胞の３つから増幅するこ
とができた。一次ＰＣＲ産物をＨ₂Ｏで１：５に希釈した。この希釈物１μｌを
特異的ＰＣＲにおいて用いた。この特異的ＰＣＲは，標準的プライマー条件下で
，Ｄ１６Ｓ３０１９座，Ｄ５Ｓ３４６座，ＡＰＣＰＣＲ−ＲＦＬＰおよびｐ５
３遺伝子のエクソン２−９の配列で実施した（Ｆｕｔｅｒａｌ（１９９１），Ｎ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９，６９７７）。マイクロサテライト分
析のゲル条件は，Ｌｉｔｔ（１９９３），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１５，
２８０−４に記載されるように実施し，ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎとのインキュベー
ションにより発色させ，蛍光イメージングを行った。ＡＰＣＰＣＲ−ＲＦＬＰ
の分析は，５μｌのＰＣＲ産物を容量３０μｌ中で，１５ＵのＡｌｗ２１Ｉ（Ｍ
ＢＩＦｅｒｍｅｎｔａｓ）で３時間消化することにより行った。結果は，臭化
エチジウム染色アガロースゲルで可視化した。

【０１０５】対照細胞＃２および＃３において見いだされた喪失は第２のマーカーについて
は見られなかったが，すべての腫瘍細胞は両方の実験においてＬＯＨを示した。
Ｅ−カドヘリンについても類似の結果が得られた。すべての対照細胞は，情報を
与え，２つのアレルを示したが，４つの腫瘍細胞はすべて１つのアレルを喪失し
ていた。合計して，３６個の予測されたフラグメントのうち３３個が増幅され検
出された。これらのデータは，この方法の相当の信頼性を示すのみならず，予想
される喪失を追加のマーカーにより制御する必要があることを示す（図６Ａ）。

【０１０６】ＰＣＲの初期サイクルの間のＴａｑポリメラーゼエラーを回避するために，Ｔ
ａｑポリメラーゼと校正（ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ）酵素であるＰｗｏポリメ
ラーゼとの混合物を用いた。４つすべての腫瘍細胞のＣＧＨプロファイルが１７
ｐの喪失を示したため，ｐ５３腫瘍抑制遺伝子の残りのアレルが変異により不活
性化されているか否かを調べた。ｐ５３は，ヒト癌において最も一般的に変異し
ている腫瘍抑制遺伝子であり，この変異は肺癌腫の約５０％で生ずる（Ｇｒｅｅ
ｎｂｌａｔｔ（１９９４），ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５４，４８５５−７８）。
大部分の変異がコアドメイン中に位置するため，エクソン４−９を配列決定のた
めに増幅した。すべてのエクソンの増幅が成功したことから，一次ＰＣＲの条件
は，はるかに小さいフラグメントも存在するが，１３７４ｂｐ程度の長い生成物
を生ずるのに十分に強いものであることが証明された。これらのエクソン中には
ＭｓｅＩ部位が含まれておらず，このことは，増幅の成功の必要条件である。ｐ
５３遺伝子領域中のＭｓｅＩ切断部位のマップは，４つのエクソン含有フラグメ
ントを予測した：１つは，エクソン２，３および４を含む１３７４ｂｐ，第２は
エクソン５および６を含む１０３２ｂｐ，第３はエクソン７を含む７２２ｂｐフ
ラグメント，および第４はエクソン８および９を含む５５８ｂｐである。４つす
べての腫瘍細胞の配列決定は，ｐ５３のコドン２１５においてセリンからグリシ
ンへの変化をもたらすＡ→Ｇ変異を示し，これはこれまでにいくつかのヒト癌に
おいて記載されている（Ｈａｉｎａｕｔ（１９９８），ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉ
ｄｓＲｅｓ．２６，２０５−１３）。４つの正常骨髄細胞は，ｐ５３のコドン
２１５において野生型配列を含んでおり（図６Ｂ），Ｔａｑポリメラーゼエラー
がＡ→Ｇ変異の原因であることは事実上排除される。腫瘍細胞および対照細胞Ｄ
ＮＡのエクソンにおいては野生型配列からの他の変化は見いだされず，このこと
は，Ｔａｑポリメラーゼにより誘導される変異は，適用した条件下ではむしろま
れであることを示す。

【０１０７】実施例９：直接配列決定およびＳＳＣＰによるＤＮＡ配列分析ｐ５３のコドン２１５における前記Ａ→Ｇ変異の検出の後，前記点突然変異を
一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）により検出することが可能であるか
否かについて試験した。一本鎖コンフォメーション多型は，異なる配列の一本鎖
ＤＮＡ鎖が非変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動の間に異なる移動度を示
すという原理に基づく。この方法の戦略は，遺伝子の目的とするセグメントをＰ
ＣＲにより増幅し，次に，変性ＤＮＡの移動度を既知の配列の対照セグメントの
移動度と比較することである。配列中の単一の点突然変異はゲルにおける移動挙
動をすでに変化させており，この方法は，ＤＮＡのセグメント中の変異の存在の
検出に非常に適している。非変性条件下で，一本鎖ＤＮＡは折り畳まれた構造を
示し，これは本質的に分子内相互作用により，したがって配列により決定される
。ＤＮＡ配列中に変異的変化が生ずることにより，折り畳まれた構造が変化する
。すなわち，ＳＳＣＰ分析においては，変異した配列の検出は，ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動において変化した移動度により判定される。この方法は，分析
すべき各フラグメントについて感度を調節しなければならない。重要な変数は，
フラグメントの長さ（理想的には１２０−３５０ｂｐ），および流すゲルの温度
である。ＳＳＣＰは，いったん確立されれば，高価かつ煩雑な配列決定をするこ
となく，多数のプローブを同時にスクリーニングできるという利点を有する。し
かし，変異を特定するためには，変化した移動挙動を有するフラグメントを続い
て配列決定すべきである。

【０１０８】この実験においては，ＣＵＰ症候群の患者からの３つの単一のサイトケラチン
陰性細胞およびすでに配列決定した癌細胞の移動挙動を比較した。図７に示され
るように，すべてのサイトケラチン陽性細胞において変異を見いだすことができ
たが，正常細胞は変化した移動度を示さなかった。

【０１０９】実施例１０：レーザー微小切開単一細胞のＣＧＨ多くの臨床サンプルの分析には，目的とする細胞を周囲組織から単離すること
が必要である。この方法がレーザー支援マイクロ切開の設定においても働くか否
かを試験した。より進歩した技術の１つにおいては，レーザーマイクロビームマ
イクロ切開（ＬＭＭ）をレーザー圧捕捉（ＬＰＣ）と組み合わせる。細胞を切り
出し，続いて管中に捕捉する。混同を生ずる変種の導入を回避するため，そのよ
うな切開された正常リンパ球の核サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎｓ）を調製し
，次にＬＭＭおよびＬＰＣにより単一の細胞を単離した。ＤＮＡ調製およびＣＧ
Ｈは，実施例１−３に記載のように実施し，結果は予測されたとおりであった。
正常細胞についてはプロファイルは正常であり，この方法が，懸濁物から単離さ
れた細胞と同様に，微小切開した単一の細胞に適用可能であることが示された。

【０１１０】実施例１１：リンパ節からの単一の播種性腫瘍細胞の単離リンパ性転移は，腫瘍細胞が播種するための非常に重要な方法であり，しばし
ば患者の予後を決定する。種々の研究において，免疫組織化学／免疫細胞化学に
より検出しうる播種性腫瘍細胞は，患者の結果を予測することが示されてきた。
これらの細胞の遺伝的変化はこれまでのところよく特徴決定されていない。リン
パ節からの細胞懸濁物を調製し，本発明の適用について試験した。細胞懸濁物は
，ＢｉｏｒａｄからのＭｅｄｉ−Ｍａｃｈｉｎｅを用いて，製造元の指示にした
がって調製した。腫瘍細胞は，ＥｐＣＡＭエピトープを認識し，リンパ節におい
てサイトケラチン抗体よりもむしろ特異的であることが示されている，Ｄａｋｏ
からのｍａｂＢｅｒ−ＥＰ４で染色することにより検出した。染色した細胞を単
離し，単一の細胞のＤＮＡを上述のように調製した。次に，ＣＧＨを実施した。
正常な非染色細胞は正常なプロファイルを示し，腫瘍細胞においては，種々の異
常を検出することができた。

【０１１１】実施例１２：末梢血からの単一の循環腫瘍細胞の単離骨髄およびリンパ節から単離された播種性腫瘍細胞の分析と同様に，悪性腫瘍
疾病を有する患者の末梢血の細胞を調べた。癌腫患者の末梢血細胞を，サイトケ
ラチン抗体Ａ４５Ｂ／Ｂ３を用いて，および黒色腫患者の末梢血細胞をヒト黒色
腫関連コンドロイチンサルフェートプロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に対するｍａ
ｂ９．２．２７（Ｒ．Ｒｅｉｓｆｅｌｄ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＵＳＡより）を
用いて，スクリーニングした。Ｂ−ＣＬＬ患者の血液を，ＣＤ２４に対する抗体
（ＣｙｍｂｕｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＢＬ４７８からの抗体）を用
いてスクリーニングした。この方法は，骨髄およびリンパ節から単離した細胞を
用いた場合と同様に働いた。

【０１１２】実施例１３：単一のＨｂ−Ｆ陽性細胞の単離および特性決定妊娠中および分娩後２７年間までの母体の静脈血液中の，小児からの細胞の培
養物を１つの研究に示されたように検出することができる（Ｂｉａｎｃｈｉ（１
９９６），Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ９３，７０５−７０９）。妊娠中，これらの
細胞は，母体および子供に危険のない出生前診断に有用でありうる。母体中の持
続性のマイクロキメラ現象（ｍｉｃｒｏｃｈｉｍｅｒｉｓｍ）は，女性において
自己免疫疾病の罹患率が高いことと関連づけられてきた。これらの胎児細胞を検
出する１つの方法は，赤芽球を検出するために胎児ヘモグロビン（Ｈｂ−Ｆ）に
対する抗体を用いることである。この抗体（Ｈｂ−Ｆに対するマウスｍａｂ：Ｃ
ｏｌｔａｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＨＦＨ００）は，新生児臍帯血中で赤芽球を検出
するために用られた。単一の細胞を単離し，本発明の方法を記載されたように適
用した。ＣＧＨプロファイルはすべての染色体について正常であった。図８に示
されるように，男児は健康であった。

【０１１３】実施例１４：単一の細胞のフィンガープリントゲノム中に１つのみ存在する配列の増幅の信頼性は，多数の実験において，９
０％であることが示された。これは，ヘテロ接合性の喪失の分析にとっては重要
な値である。しかし，フィンガープリント分析のためには，配列が信頼性をもっ
て増幅されることのみならず，多型を同定することができることが重要である。
このことを試験するために，３０００個の細胞を用いるＰＣＲ反応から得られた
バンドのサイズを，単一の細胞から得られたものと比較した。マイクロサテライ
ト分析の既知の限界内で，バンドは陽性対照と比較して変化した移動挙動を示さ
ないことが検出された。このことは図９に示される。したがって，単一の細胞か
ら多型バンドを同定することができ，フィンガープリントを得ることができる。

【０１１４】実施例１５：日常実験および診断方法のための酵素的に染色した単一の細胞の単
離多くの診断および日常実験用途のためには，免疫蛍光を回避することが有利で
ある。日常実験の光学顕微鏡を含む実験のために細胞を調製する方法を試験した
。第１の実験においては，ＤＮＡに損傷を与えることなく，アルカリホスファタ
ーゼを用いるいずれの酵素染色反応を適用しうるかを試験した。市販のいくつか
のアルカリホスファターゼの基質，例えば，ニュフクシン（Ｎｅｕｆｕｃｈｓｉ
ｎ）およびＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｂｉｏｒａｄ）の種々の調製物を試験した。ＢＣ
ＩＰ／ＮＢＴで染色された単一の細胞のみが増幅に成功した。次の工程において
は，日常実験のスライドから無傷の細胞を単離した。これを行うためには，ＰＢ
Ｓ中の細胞を特別の正に帯電したスライド（Ｍｅｎｚｅｌ）上にピペットで置い
た。これらはここで３０分以内に接着する。ＰＢＳを廃棄し，スライドを風乾す
る。この処理の後，日常実験の染色方法，例えばＢＣＩＰ／ＮＢＴ発色を用いる
ＡＰＡＡＰ技術（アルカリホスファターゼ−抗−アルカリホスファターゼ技術）
を適用することができる。非イオン性界面活性剤をＰＢＳに加えると，後に染色
細胞の単離のためのマイクロマニピュレーションの間に接着力を回避することが
助けられる。これらの実験の結果は，図１０に示される。

【０１１５】すべてのＣＧＨ−，ＬＯＨ−およびＳＳＣＰ−実験，すなわち，サイトケラチ
ン抗体，Ｂｅｒ−ＥＰ４および抗−Ｈｂ−Ｆで染色した，末梢血からの正常細胞
，骨髄，血液およびリンパ節からの腫瘍細胞を用いる実験もまた，本発明の方法
を用いて実施し，同等に優れた結果が得られた。

【０１１６】実施例１６：種々の起源の単一の細胞への本発明の方法の適用まとめると，本発明の方法は，細胞が由来する組織の起源，細胞集団または環境
中のまれな細胞を検出するために用いられる抗体，および／または標識の選択（
蛍光染料または酵素的に活性化された基質，例えばＢＣＩＰ／ＮＢＴ）にかかわ
らずに働くということができる（表４を参照）。

【０１１７】表４．種々の組織および診断設定からの個々の細胞に対する単一細胞ＰＣＲの適
用

【表４】ＢＭ＝骨髄；ＬＮ＝リンパ節

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ダウン症候群の患者の末梢血リンパ球のＣＧＨプロファイル。

【図２】ＭＣＦ−７細胞株からおよび同じ細胞株の単一の細胞から，ＰＣ
Ｒ増幅後に調製した１μｇのニックトランスレーションしたＤＮＡを用いる慣用
的なＣＧＨ実験のＣＧＨプロファイルの比較。

【図３】ＹＡＣクローンを有するＭＣＦ−７細胞の，２ｐ２５（赤）およ
び２ｑ３１（緑）についての２色間期ＦＩＳＨ。

【図４】乳癌患者の骨髄からの単一の播種性腫瘍細胞の単離。

【図５】ＣＵＰ症候群を有する患者の４つの単一腫瘍細胞（Ｔ＃１−Ｔ＃
４）および１つの正常細胞のＣＧＨプロファイル。

【図６】ＡＰＣ遺伝子にリンクしたＤ５Ｓ３４６座におけるジヌクレオチ
ド反復多型を用いるＬＯＨ分析（上部），およびＡＰＣ遺伝子のエクソン１５中
のＡｌｗ２１Ｉ部位のＰＣＲ−ＲＦＬＰ（下部），ならびにコドン２１５におい
て見いだされる変異の配列。

【図７】腫瘍抑制遺伝子ｐ５３のエクソン６のＳＳＣＰ分析。

【図８】新生男児の臍帯から単離された単一のリンパ球のＣＧＨプロファ
イル。

【図９】フィンガープリント分析のための単一の細胞中の多型の同定。

【図１０】マイクロマニピュレーションによる，アルカリホスファターゼ
を用いるＢＣＩＰ／ＮＢＴ染色細胞の単離，および実施例１５に記載されるよう
に，ｍａｂＡ４５Ｂ／Ｂ３で免疫細胞化学的に染色した２４個の連続的に単
離した細胞のサイトケラチン１９（ＣＫ１９）のゲノム配列のＰＣＲ分析。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１１月６日（２０００．１１．６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１３】すなわち，本発明は，以下の各工程を含む，ＤＮＡを増幅する方法に関する：（ａ）ＤＮＡを含むサンプルを提供し；（ｂ）増幅すべきＤＮＡを，類似する長さのＤＮＡフラグメントを得るのに適
当な条件下で制限エンドヌクレアーゼで消化し，ここで，前記制限エンドヌクレ
アーゼは，前記ＤＮＡフラグメント上に，オーバーハングの末端ヌクレオチドが
リン酸化されている５'オーバーハング，またはオーバーハングの末端ヌクレオ
チドが水酸化されている３'オーバーハングを提供することができ；（ｃ）少なくとも１つのプライマーを前記ＤＮＡフラグメントにアニーリン
グさせ，ここで（ｃａ）（ｃａａ）同時にまたは続いて，第１のプライマーを表すオリゴ
ヌクレオチドを工程（ｂ）の前記ＤＮＡフラグメントの前記５'オーバーハング
にハイブリダイズさせ，かつ，第２のプライマーを表すオリゴヌクレオチドを前
記第１のプライマーにより生成した３'オーバーハングにハイブリダイズさせ，
ここで，前記第１のプライマーおよび第２のプライマーは異なる長さのものであ
り；（ｃａｂ）前記第２のプライマーを前記５'オーバーハングにラ
イゲートさせ；そして（ｃａｃ）前記第１のプライマーを前記ＤＮＡフラグメントから
除去し；または（ｃｂ）（ｃｂａ）同時にまたは続いて，５'末端のヌクレオチドがリン
酸化されている第１のプライマーを表すオリゴヌクレオチドを工程（ｂ）の前記
ＤＮＡフラグメントの前記５'オーバーハングにハイブリダイズさせ，かつ第２
のプライマーを表すオリゴヌクレオチドを前記第１のプライマーにハイブリダイ
ズさせ；そして（ｃｂｂ）前記第１のプライマーおよび第２のプライマーを前記
ＤＮＡフラグメントにライゲートさせ；または（ｃｃ）（ｃｃａ）前記プライマーを表すオリゴヌクレオチドを前記３'
オーバーハングにハイブリダイズさせて，５'オーバーハングを生成させ；そし
て（ｃｃｂ）前記プライマーを，前記ＤＮＡフラグメントの凹型５
'末端にライゲートさせ；（ｄ）生成した５'オーバーハングをフィルインし；そして（ｅ）前記ＤＮＡフラグメントを，工程（ｃ）の前記プライマーの相補鎖とハ
イブリダイズしうるプライマーで増幅する。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２５】増幅すべきＤＮＡサンプルは，単一の細胞，例えば，骨髄支質細胞，末梢血か
らの単一（腫瘍状）細胞，臍静脈血液またはリンパ節からの単一の細胞を単離し
，これをプロテイナーゼで消化することにより得ることができる。プロテイナー
ゼ活性を不活性化した後，前記サンプルＤＮＡを，ＭｓｅＩ等の４ヌクレオチド
認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼで消化して，約２００−４００ｂｐの
類似する長さのＤＮＡフラグメントを得ることができる。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２７】アニーリング反応は，前記制限酵素の不活性化をも行う温度，すなわち６８℃
で開始した。前記第２のプライマーを前記ＤＮＡフラグメントにライゲーション
させ，これに対し，前記第１のプライマーはライゲーションさせなかった。これ
は，ライゲーションに必要な５’リン酸が利用可能ではなかったためである。し
たがって，反応温度を，そのようなライゲーション反応を実施することができる
温度，すなわち１５°Ｃまでゆっくり低下させた。ライゲーションは，ＡＴＰお
よびＴ４−ＤＮＡ−リガーゼを前記プライマーおよびＤＮＡフラグメントに加え
ることにより行った。ライゲーション後，温度を，前記プライマーが前記ＤＮＡ
フラグメントから解離するより高い温度（例えば約６８°Ｃ）に変化させること
を含む変性工程により，前記第１のプライマーを前記ＤＮＡフラグメントから除
去した。前記第２のプライマーは前記ＤＮＡフラグメントにライゲートしたまま
であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA44 CA03 HA09 HA14 4B063 QA01 QA12 QA19 QQ02 QQ43 QQ60 QR16 QR32 QR40 QR42 QR56 QR62 QR72 QS03 QS25 QS34 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＤＮＡを増幅する方法であって，（ａ）ＤＮＡを含むサンプルを提供し；（ｂ）増幅すべきＤＮＡを，類似する長さのＤＮＡフラグメントを得るのに適
当な条件下で制限エンドヌクレアーゼで消化し，ここで，前記制限エンドヌクレ
アーゼは，前記ＤＮＡフラグメント上に，オーバーハングの末端ヌクレオチドが
リン酸化されている５'オーバーハング，またはオーバーハングの末端ヌクレオ
チドが水酸化されている３'オーバーハングを提供することができ；（ｃ）少なくとも１つのプライマーを前記ＤＮＡフラグメントにアニーリン
グさせ，ここで（ｃａ）（ｃａａ）同時にまたは続いて，第１のプライマーを表すオリゴ
ヌクレオチドを工程（ｂ）の前記ＤＮＡフラグメントの前記５'オーバーハング
にハイブリダイズさせ，かつ，第２のプライマーを表すオリゴヌクレオチドを前
記第１のプライマーにより生成した３'オーバーハングにハイブリダイズさせ，
ここで，前記第１のプライマーおよび第２のプライマーは異なる長さのものであ
り；（ｃａｂ）前記第２のプライマーを前記５'オーバーハングにラ
イゲートさせ；そして（ｃａｃ）前記第１のプライマーを前記ＤＮＡフラグメントから
除去し；または（ｃｂ）（ｃｂａ）同時にまたは続いて，５'末端のヌクレオチドがリン
酸化されている第１のプライマーを表すオリゴヌクレオチドを工程（ｂ）の前記
ＤＮＡフラグメントの前記５'オーバーハングにハイブリダイズさせ，かつ第２
のプライマーを表すオリゴヌクレオチドを前記第１のプライマーにハイブリダイ
ズさせ；そして（ｃｂｂ）前記第１のプライマーおよび第２のプライマーを前記
ＤＮＡフラグメントにライゲートさせ；または（ｃｃ）（ｃｃａ）前記プライマーを表すオリゴヌクレオチドを，５'オ
ーバーハングが生成するように前記３'オーバーハングにハイブリダイズさせ；
そして（ｃｃｂ）前記プライマーを，前記ＤＮＡフラグメントの凹型５
'末端にライゲートさせ；または（ｃｄ）前記プライマーを表すオリゴヌクレオチドを前記５’オーバーハン
グにライゲートさせ；（ｄ）生成した５'オーバーハングをフィルインし；そして（ｅ）前記ＤＮＡフラグメントを，工程（ｃ）の前記プライマーの相補鎖とハ
イブリダイズしうるプライマーで増幅するの各工程を含む方法。
【請求項２】前記ＤＮＡが，単一の細胞または染色体またはそのフラグメ
ントのゲノムである，請求項１記載の方法。
【請求項３】前記単一の細胞が，播種性腫瘍細胞，末梢血細胞，骨髄吸引
物からの細胞，腫瘍生検からの細胞，臍帯血から得られた細胞，リンパ節から得
られた細胞および／または微小切開組織から得られた細胞である，請求項２記載
の方法。
【請求項４】前記ＤＮＡが１コピーの二本鎖ＤＮＡ配列として存在する，
請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】前記ＤＮＡフラグメントの数的多量性が本質的に維持される
，請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】前記方法が，工程（ａ）の前に，ＤＮＡを含む前記サンプル
をプロテイナーゼで消化する工程（ａ'）を含み，かつ工程（ｂ'）における蛋白
質消化の後にプロテイナーゼが不活性化される，請求項１−５のいずれかに記載
の方法。
【請求項７】前記プロテイナーゼが熱不安定性である，請求項６記載の方
法。
【請求項８】前記プロテイナーゼがプロテイナーゼＫである，請求項６ま
たは７記載の方法。
【請求項９】前記プロテイナーゼが工程（ｂ'）において熱不活性化され
る，請求項６−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】前記ＤＮＡフラグメントが≦３ｋｂｐのサイズを有する，
請求項１−９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】前記ＤＮＡフラグメントが約２００−４００ｂｐの平均長
を有する，請求項１−１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】前記制限エンドヌクレアーゼがその制限部位中にシトシン
／グアニンを含まない，請求項１−１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】前記制限エンドヌクレアーゼが４つの規定された塩基を有
するモチーフを認識する，請求項１−１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】前記制限エンドヌクレアーゼがコンセンサス配列ＴＴＡＡ
を認識する，請求項１−１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】前記制限エンドヌクレアーゼがＭｓｅＩまたはそのイソシ
ゾマーである，請求項１−１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】工程（ｃａａ）において，前記第２のプライマーが前記第
１のプライマーより長い，請求項１−１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】工程（ｃａａ）において，前記第２のプライマーのアニー
リング温度が，前記第１のプライマーの前記第２のプライマーおよび前記５'オ
ーバーハングへのハイブリダイズ温度より高い，請求項１６記載の方法。
【請求項１８】工程（ｃａａ）において，前記第１のプライマーが１１ま
たは１２ヌクレオチドを含み，前記第２のプライマーが２１ヌクレオチドを含む
，請求項１−１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】工程（ｃａａ）または工程（ｃｂａ）において，前記第１
のプライマーが前記第２のプライマーに少なくとも部分的に相補的である，請求
項１−１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーの配列
が非縮重である，請求項１−１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】工程（ｃａａ）において用いられる前記第１のプライマー
が配列番号２に示される配列を有し，および／または工程（ｃａａ）において用
いられる前記第２のプライマーが配列番号１に示される配列を有する，請求項１
−２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーが，Ｄ
ＮＡフラグメントとは別に互いにハイブリダイズされ，工程（ｃａ）または工程
（ｃｂ）の前に前記ＤＮＡフラグメントに加えられる，請求項１−２１のいずれ
かに記載の方法。
【請求項２３】工程（ｃａａ）における第１のプライマーの最後の３'ヌ
クレオチドがｄｄ−ヌクレオチドである，請求項１−２２のいずれかに記載の方
法。
【請求項２４】前記単一の細胞の本質的に全部の核ゲノムが増幅される，
請求項２−２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】前記単一の細胞が化学的に固定された細胞である，請求項
２−２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】工程（ａ）−（ｅ）が１つの反応容器中で実施される，請
求項１−２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】請求項１−２６のいずれかに記載の方法により得られる増
幅されたＤＮＡフラグメントの，ＤＮＡ分析のための方法における使用。
【請求項２８】ＤＮＡ分析のための方法が，比較ゲノムハイブリダイゼー
ション（ＣＧＨ），代表相違分析（ＲＤＡ），分析的ＰＣＲ，制限フラグメント
長多型（ＲＦＬＰ）分析，一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）分析，Ｄ
ＮＡ配列分析，“ヘテロ接合性喪失”（ＬＯＨ），フィンガープリント分析およ
び／またはＦＩＳＨ分析である，請求項２７記載の使用。
【請求項２９】請求項１，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２ま
たは２３のいずれかにおいて定義される第１のプライマーおよび／または第２の
プライマーを含むキット。
【請求項３０】請求項１，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２ま
たは２３のいずれかにおいて定義される第１のプライマーおよび／または第２の
プライマーの，請求項１−２６のいずれかに記載の方法のためのキットの製造に
おける使用。