CN110564850A

CN110564850A - 一种ewsr1-tfeb融合基因及其检测引物和应用

Info

Publication number: CN110564850A
Application number: CN201910641043.0A
Authority: CN
Inventors: 饶秋; 夏秋媛; 叶胜兵; 李锐; 王璇; 魏雪
Original assignee: General Hospital Of Eastern War Zone Of Chinese People's Liberation Army
Current assignee: General Hospital Of Eastern War Zone Of Chinese People's Liberation Army
Priority date: 2019-07-16
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2019-12-13
Anticipated expiration: 2039-07-16
Also published as: CN110564850B

Abstract

本发明公开了一种EWSR1‑TFEB融合基因及其检测引物和应用。所述的融合基因包含SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。用于诊断EWSR1‑TFEB易位性肾细胞癌的引物组合物，为检测EWSR1‑TFEB基因易位的PCR引物；优选如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。EWSR1‑TFEB融合基因的引物在制备EWSR1‑TFEB易位性肾细胞癌诊断试剂中的应用。本发明克隆了一个TFEB的新易位伴侣，在TFEB易位性肾细胞癌中为首次报道。本发明针对高通量测序发现的新融合位点设计了特异性的PCR引物，扩大了原引物组合的检测范围，应用于临床，可提高诊断该类肿瘤的检出率和准确率。

Description

一种EWSR1-TFEB融合基因及其检测引物和应用

技术领域

本发明属于医学检验领域，涉及一种EWSR1-TFEB融合基因及其检测引物和应用。

背景技术

2016年WHO对2004年肾细胞癌病理组织学分类进行了修改，新增了TFEB基因易位相关性肾癌(TFEB易位性肾癌)。TFEB基因位于6p21.1，是TFEB易位性肾癌的唯一驱动基因，其致病机理清晰明确：这类肿瘤均涉及位于6p21.1的TFEB基因同其它染色体易位及其所致形成融合基因，通过启动子变换从而高表达TFEB融合蛋白，而TFEB作为一个转录因子，通过与特异的DNA结构相结合，转录调控体内多种基因表达最终致病。目前WHO分类中仅纳入1种单一易位形式，即MALAT1-TFEB。然而近年来散在个案报道指出，TFEB易位性肾癌存在不同的易位伴侣和融合基因，包括KHDRBS2-TFEB,COL21A1-TFEB,CADM2-TFEB等。

TFEB易位性肿瘤是一罕见类型肿瘤，虽然其总体发病率很低，但该疾病以发病年龄轻为突出特征，因此造成极其沉重的家庭及社会负担。且研究表明，该肿瘤与肾脏常见肿瘤(透明细胞性肾细胞癌)无论从发病机制还是激活的信号通路上均存在显著差别，因而临床治疗指南亦对其治疗方案有所区分，TFEB易位性肿瘤的治疗靶点亟待进一步研究。因此，根据基因型来精确诊断此类肿瘤显得十分重要。

目前常用的诊断TFEB易位性肿瘤的检测方法主要包括免疫组织化学和荧光原位杂交。免疫组织化学检测细胞核TFEB融合蛋白直观、快捷、价格低，但其缺点是该方法容易受到多种因素影响，如组织固定时间、组织修复方式、抗体克隆号以及人为的判读因素等等，使得结果可能出现假阳性或假阴性。染色体荧光原位杂交(FISH)始于传统的细胞遗传学和DNA技术的结合，快速灵敏、特异性好，可以检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核型；还可以使用多种荧光标记，显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确。但这两种检测方法只能提示存在TFEB蛋白的高表达或TFEB基因的易位，均不能明确肿瘤中发生的具体易位改变。精确检测TFEB易位性肿瘤的易位伴侣和融合基因位点，不仅是患者预后预测的依据，也是未来靶向治疗的指导，因此，明确TFEB易位性肿瘤的基因易位位点，具有重要的临床意义。

目前高通量测序是唯一可以明确未知易位位点的检测手段，然而高通量测序费用高昂，检测周期长，检测平台稀缺，对样品质量要求高，不利于普及推广，对于大多数患者来说也不是首选检测手段。依赖以往经验，针对已知的融合位点设计特异性的PCR引物组合，对肿瘤组织中提取出的RNA逆转录之后进行PCR扩增并测序，检测融合基因具体易位位点，是最准确、便捷、经济的方法。因此，发现新的致病融合位点，进而设计PCR引物将有利于TFEB易位性肿瘤检测准确度的进一步提高。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种TFEB的新易位伴侣。

本发明的另一目的是提供该新易位伴侣的检测引物。

本发明的又一目的是提供引物的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种TFEB的新易位伴侣，为EWSR1-TFEB基因易位，EWSR1基因位于22q12.2(22号染色体，位置29,663,998-29,696,515，序列来自GeneBank，序列版本号GRCh37/hg19)，共19个外显子；TFEB基因位于6p21.1(6号染色体，位置41,651,716-41,703,997，序列来自GeneBank，序列版本号GRCh37/hg19),共17个外显子。基因融合发生于EWSR1的6号外显子与TFEB基因5号外显子之间。我们通过高通量测序方法检测未知融合对象的TFEB肿瘤患者的标本，发现所述的TFEB的新易位伴侣：EWSR1-TFEB基因易位，包含SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列。EWSR1是许多软组织肿瘤中常见的发生易位的基因，但在本专利所述TFEB易位性肾细胞癌中，这一易位对象国内外尚未见报道。

本发明所述的EWSR1-TFEB融合基因(或称EWSR1-TFEB基因易位)的检测试剂在制备EWSR1-TFEB易位性肾细胞癌诊断试剂中的应用。

所述的EWSR1-TFEB融合基因的检测试剂为检测EWSR1-TFEB融合基因的引物组合物。所有能够检测本发明所述EWSR1-TFEB基因易位的引物对均在本发明的保护范围内；优选上游引物EWSR1-E6-F如SEQ ID NO.1所示，下游引物TFEB-E5-R如SEQ ID NO.2所示。

一种用于诊断EWSR1-TFEB易位性肾细胞癌的引物组合物，为检测本发明所述的EWSR1-TFEB基因易位的PCR引物；优选上游引物EWSR1-E6-F如SEQ ID NO.1所示，下游引物TFEB-E5-R如SEQ ID NO.2所示。

针对本发明找到的新的新易位伴侣，我们在EWSR1的6号外显子和TFEB的5号外显子内分别设计引物。遵循引物设计原则，引物最好在模板cDNA的保守区内设计，引物长度在15bp-30bp之间，引物GC含量在40％～60％之间，退火温度最好接近72℃，引物自身及引物之间不应存在互补序列，扩增条带单一特异。由于工作中经常需要在石蜡固定标本中开展工作，石蜡标本RNA碎裂严重，因此扩增产物不宜过长，需要控制在350bp以下。

经过多次调试和验证，最终设计的引物序列为：EWSR1-E6-F：TCTAGCACAGGGGGTTACAAC；(SEQ ID NO.1)；TFEB-E5-R:CTTTCTTCTGCCGCTCCTT(SEQ IDNO.2)，理论产物长度326bp，扩增产物(融合基因)的全部序列如下：TCTAGCACAGGGGGTTACAACCAGCCCAGCCTAGGATATGGACAGAGTAACTACAGTTATCCCCAGGTACCTGGGAGCTACCCCATGCAGCCAGTCACTGCACCTCCATCCTACCCTCCTACCAGCTACCCCTGTCCAGCAGCCACCTGAATGTGTACAGCAGCGACCCCCAGGTCACAGCCTCCCTGGTGGGCGTCACCAGCAGCTCCTGCCCTGCGGACCTGACCCAGAAGCGAGAGCTCACAGGTACTGCCGCTCCTCTCTCCTTCTCTTTTGGCCTCCAGATGCTGAGAGCAGGGCCCTGGCCAAGGAGCGGCAGAAGAAAG(SEQ ID NO.3)。

经实验验证，引物可成功扩增出目的条带，条带单一、特异(图1)。验证病例实际扩增产物长度269bp，融合基因序列如下:TCTAGCACAGGGGGTTACAACCAGCCCAGCCTAGGATATGGACAGAGTAACTACAGTTATCCCCAGGTCTACCCCTGTCCAGCAGCCACCTGAATGTGTACAGCAGCGACCCCCAGGTCACAGCCTCCCTGGTGGGCGTCACCAGCAGCTCCTGCCCTGCGGACCTGACCCAGAAGCGAGAGCTCACAGGTACTGCCGCTCCTCTCTCCTTCTCTTTTGGCCTCCAGATGCTGAGAGCAGGGCCCTGGCCAAGGAGCGGCAGAAGAAAG(SEQ ID NO.4)，该例肿瘤在EWSR1基因6号外显子末端发生了57bp的缺失，但使用本发明引物可扩增出融合基因序列，不影响检测结果。

本发明所述的引物组合物在制备EWSR1-TFEB易位性肾细胞癌诊断试剂中的应用。

一种EWSR1-TFEB易位性肾细胞癌诊断试剂盒，包含本发明所述的引物组合物。

有益效果：

本发明克隆了一个TFEB的新易位伴侣，为EWSR1-TFEB基因易位，在TFEB易位性肾细胞癌中为首次报道。本发明针对高通量测序发现的新融合位点设计了特异性的PCR引物，扩大了原引物组合的检测范围，应用于临床，可提高诊断该类肿瘤的检出率和准确率。为诊断分型及分子靶向治疗提供依据。根据我们的实验结果，该引物组合诊断的特异性和敏感性均达到了100％，且操作对象只需要在石蜡包埋组织切片上进行，时间仅为三个工作日。采用本发明提供的探针组合进行检测EWSR1-TFEB易位性肿瘤，不但方便、快速、可靠而且检出率高，可用于制备EWSR1-TFEB易位性肿瘤诊断试剂盒，为EWSR1-TFEB易位性肿瘤的快速准确的诊断提供了新的工具。

附图说明

图1：在已知EWSR1-TFEB融合型肿瘤中应用本发明引物组合(EWSR1-E6-F；TFEB-E5-R)进行验证，成功检出的EWSR1-TFEB融合基因测序图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1针对明确诊断的病例进行验证：

对于高通量测序RNA-seq检测出EWSR1exon6-TFEB exon5新融合位点的病例，使用我们设计的引物进行验证。

一、RNA的提取：

严格按照RNeasy FFPE Kit操作说明进行提取。①脱蜡：将收集好的玻片进行二甲苯脱蜡，再用无水乙醇漂洗，风干后用手术刀片刮下来装入1.5ml EP管中；②酶解：加入150μl消化液,再加入10μl蛋白酶K，混匀，56℃酶解15min,80℃15min，冰上冷却；③加入16μlDNDNA酶缓冲液,再加入10μl DNase I,混匀，室温静置15mimin,12000rpm离心15min，取上清；④加入320μl结合液液再加入720μl无水乙醇，混匀，分2次转移至吸附柱中，8000rpm离心1min，，弃废液；⑤洗涤：加入500μl洗涤液,8000rpm离心1min；重复洗涤一次，弃废液，将吸附柱转移到一个新的2ml收集管中，12000rpm离心5min；⑥洗脱：将吸附柱转移到1.5ml的EP管中，加入100μl的洗脱液，室温静置1min,12000rpm离心1min，将收集好的洗脱液(即DNA提取液)进行浓度和纯度测定，-80℃保存存待用。

二、逆转录PCR RT-PCR

采用试剂盒(K1622，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，MBI)对RNA进行逆转录，方法详见试剂盒说明。PCR扩增引物为本专利EWSR1-TFEB融合基因引物组合EWSR1-E17-F/TFEB-E5-R。反应体系包括：0.125μl TaKaRa Ex Taq^TM HS液，2.5μl 10×TaqBuffer(Mg²⁺plus)，2μl dNTP(均购自日本Takara公司)，引物浓度为20μmol/l，cDNA模版为100ng，无菌去离子水加至25μl。PCR扩增条件为94℃变性3min后，94℃ 30s、60℃ 30s、72℃1min，共35次循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用3％琼脂糖，电压100V，电泳，溴化乙啶染色后于紫外光下观察结果，并送测序。

结果：分别用本发明引物(EWSR1-E6-F/TFEB-E5-R)PCR后可见单一特异的约269bp的电泳条带，对扩增产物进行测序，得到EWSR1 exon6-TFEB exon5融合基因序列(图1)，证明本发明设计的引物组合可靠且敏感。

实施例2针对对照组病例进行检测

我们对30例诊断明确的对照组病例(包括10例透明细胞性肾细胞癌，5例乳头状肾细胞癌，5例嫌色细胞性肾细胞癌，5例TFE3易位相关性肾细胞癌和5例MALAT1-TFEB易位相关性肾癌，理论上均不存在EWSR1-TFEB基因融合)使用本发明的引物组合进行检测，RNA提取、逆转录PCR和测序方法同上。

结果：使用本发明设计引物组合检测，未检测出EWSR1-TFEB融合基因，证明本项目设计的引物特异性高。

评价：本发明引物组合是对原有TFEB易位性肾细胞癌融合基因引物的补充，扩展了TFEB易位性肾细胞癌融合基因的类型，增加了RT-PCR方法诊断该肿瘤的检出率。

序列表

<110> 中国人民解放军东部战区总医院

<120> 一种EWSR1-TFEB融合基因及其检测引物和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctttcttctg ccgctcctt 19

<210> 3

<211> 326

<212> DNA

<213> 人类(Hamo sapiens)

<400> 3

tctagcacag ggggttacaa ccagcccagc ctaggatatg gacagagtaa ctacagttat 60

ccccaggtac ctgggagcta ccccatgcag ccagtcactg cacctccatc ctaccctcct 120

accagctacc cctgtccagc agccacctga atgtgtacag cagcgacccc caggtcacag 180

cctccctggt gggcgtcacc agcagctcct gccctgcgga cctgacccag aagcgagagc 240

tcacaggtac tgccgctcct ctctccttct cttttggcct ccagatgctg agagcagggc 300

cctggccaag gagcggcaga agaaag 326

<210> 4

<211> 269

<212> DNA

<213> 人类(Hamo sapiens)

<400> 4

tctagcacag ggggttacaa ccagcccagc ctaggatatg gacagagtaa ctacagttat 60

ccccaggtct acccctgtcc agcagccacc tgaatgtgta cagcagcgac ccccaggtca 120

cagcctccct ggtgggcgtc accagcagct cctgccctgc ggacctgacc cagaagcgag 180

agctcacagg tactgccgct cctctctcct tctcttttgg cctccagatg ctgagagcag 240

ggccctggcc aaggagcggc agaagaaag 269

Claims

1.一种EWSR1-TFEB融合基因，其特征在于，所述的融合基因包含SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的EWSR1-TFEB融合基因的检测试剂在制备EWSR1-TFEB易位性肾细胞癌诊断试剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的EWSR1-TFEB融合基因的检测试剂为检测EWSR1-TFEB融合基因的引物组合物。

4.一种用于诊断EWSR1-TFEB易位性肾细胞癌的引物组合物，其特征在于所述的引物组合物为检测权利要求1所述的EWSR1-TFEB融合基因的引物对。

5.根据权利要求4所述的引物组合物，其特征在于上游引物EWSR1-E6-F如SEQ ID NO.1所示，下游引物TFEB-E5-R如SEQ ID NO.2所示。

6.权利要求4或5所述的引物组合物在制备EWSR1-TFEB易位性肾细胞癌诊断试剂中的应用。

7.一种EWSR1-TFEB易位性肾细胞癌诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒包含权利要求4或5所述的引物组合物。