CN109022466B - 一种acta2-mitf融合基因及其检测引物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种ACTA2‑MITF融合基因及其检测引物和应用。ACTA2‑MITF基因融合发生于ACTA2的2号外显子与MITF基因3号外显子之间;ACTA2基因位于ACTA2基因位于10q23.31,所述的融合基因包含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。检测ACTA2‑MITF易位性肿瘤的PCR引物,由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2组成。ACTA2‑MITF融合基因的检测试剂在制备ACTA2‑MITF易位性肿瘤诊断试剂中的应用。本发明针对高通量测序发现的新融合基因设计了特异性的PCR引物,扩大了原有检测手段的检测范围,应用于临床,可提高诊断MiT家族易位性肾细胞癌的检出率和准确率。
Description
技术领域
本发明属于医学检验领域,涉及一种ACTA2-MITF融合基因及其检测引物和应用。
背景技术
小眼畸形转录因子家族(microphthalmia-associated transcription factorfamily,MiT)包括了小眼畸形转录因子(MiTF)、TFE3、TFEB和TFEC基因。
目前已经发现了Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾细胞癌和t(6;11)(p21;q12)易位/TFEB基因融合相关性肾细胞癌,这两类肿瘤已被2016版新版WHO肾脏肿瘤病理收录,并且一并归入MiT家族易位性肾细胞癌中。近期本研究团队利用高通量测序技术成功诊断出一例PRCC-MITF易位性肾细胞癌,这也填补了MiT家族易位性肾细胞中MiTF易位类型的空白。目前MITF易位性肾癌包括PRCC-MITF和CLTC-MITF两种基因易位模式。TFEC基因易位的肿瘤在世界范围内暂无文献报道。
MiT家族易位性肾细胞癌致病机理清晰明确,MiT家族成员基因(TFE3/TFEB)的易位是其关键致病因素:这类肿瘤均涉及MiT家族成员基因同其它染色体易位及其所致形成融合基因,通过启动子变换从而高表达TFE3/TFEB融合蛋白,而TFE3/TFEB作为一个转录因子,通过与特异的DNA结构相结合,转录调控体内多种基因表达最终致病。目前至少有10种不同的易位伴侣和融合基因被报道,包括ASPL-TFE3、PRCC-TFE3、SFPQ-TFE3、NONO-TFE3、CLTC-TFE3、LUC7L3-TFE3、KHSRP-TFE3、PARP14-TFE3、DVL2-TFE3、RBM10-TFE3和MALAT1-TFEB等,每例肿瘤内仅存在单一的易位形式。
此外,越来越多的TFE3相关的间叶源性肿瘤被报道,如伴有TFE3基因重排的血管周上皮样细胞肿瘤(perivascular epithelioid cell tumor,PEComa),该肿瘤与不伴有TFE3基因重排的PEComa相比具有更加侵袭性的生物学行为,患者多出现肿瘤复发、转移或死亡。研究发现SFPQ-TFE3融合基因是其最常见的融合基因,偶尔也可见其他融合基因,如NONO-TFE3、DVL2-TFE3及MED15-TFE3。
有证据表明哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路在多种MiT基因相关性肿瘤中被激活。MiT基因家族接受mTOR信号通路的调控。随着肿瘤个体化及靶向治疗时代的到来,针对mTOR等基因靶向治疗成为MiT基因家族易位相关性肿瘤患者新的选择。因此,精确诊断此类肿瘤显得十分重要。
本发明科研团队通过高通量测序技术,在一例形态学符合血管周上皮样细胞肿瘤(PEComa)特征的病例中检测出ACTA2-MITF融合基因,该融合基因型为首次发现,国内外均无报道,且这是国际首次发现MITF基因易位相关性PEComa。
目前高通量测序是唯一可以明确未知易位位点的检测手段,然而高通量测序费用高昂,检测周期长,检测平台稀缺,对样品质量要求高,不利于普及推广,对于大多数患者来说也不是首选检测手段。依赖以往经验,针对已知的融合位点设计特异性的PCR引物组合,对肿瘤组织中提取出的RNA逆转录之后进行PCR扩增并测序,检测融合基因具体易位位点,是最准确、便捷、经济的方法。因此,发现新的致病融合位点,进而设计PCR引物将有利于MiT基因家族易位相关的PEComa检测准确度的进一步提高。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足,提供一种MITF的新易位伴侣:ACTA2-MITF融合基因。
本发明的另一目的是提供该ACTA2-MITF融合基因的检测引物。
本发明的又一目的是提供引物的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现:
一种ACTA2-MITF融合基因,为MITF的新易位伴侣,基因融合发生于ACTA2的2号外显子与MITF基因3号外显子之间;ACTA2基因位于10q23.31(10号染色体,位置88935074-88991397,序列来自GeneBank,序列版本号GRCh38.p12),共10个外显子;所述的新融合基因优选包含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
我们通过高通量测序方法检测未知融合基因的PEComa肿瘤患者的标本,发现所述的MITF的新基因易位。本发明ACTA2-MITF基因易位,这一位点国内外文献均未报道过,原有MITF融合基因扩增引物也无法检测出这一融合基因,因此会导致漏诊。
本发明所述的ACTA2-MITF融合基因的检测试剂在制备ACTA2-MITF易位性肿瘤诊断试剂中的应用。
所述的ACTA2-MITF融合基因的检测试剂优选检测ACTA2-MITF融合基因的特异性引物。
所述的检测ACTA2-MITF融合基因的特异性引物进一步优选为:ACTA2-E2-F2:SEQID NO.1;MITF-E3-R4:SEQ ID NO.2。
一种检测ACTA2-MITF易位性肿瘤的PCR引物,为检测本发明所述的ACTA2-MITF融合基因的PCR引物。所有能够检测本发明所述ACTA2-MITF融合基因的引物对均在本发明的保护范围内。
针对本发明找到的新的融合基因,我们在ACTA2的2号外显子和MITF的3号外显子内分别设计引物。遵循引物设计原则,引物最好在模板cDNA的保守区内设计,引物长度在15bp-30bp之间,引物GC含量在40%~60%之间,退火温度最好接近72℃,引物自身及引物之间不应存在互补序列,扩增条带单一特异。由于工作中经常需要在石蜡固定标本中开展工作,石蜡标本RNA碎裂严重,因此扩增产物不宜过长,需要控制在300bp以下。
经过多次调试和验证,最终设计的引物序列为:ACTA2-E2-F2:GCTATGTGTGAAGAAGAGGAC(SEQ ID NO.1);MITF-E3-R4:AAGTGGTAGAAAGGTACTGCT(SEQ IDNO.2),理论扩增产物长217bp,扩增产物(融合基因)的全部序列如下:GCTATGTGTGAAGAAGAGGACAGCACTGCCTTGGTGTGTGACAATGGCTCTGGGCTCTGTAAGGCCGGCTTTGCTGGGGACGATGCTCCCAGGGCTGTTTTCCCATCCATTGTGGGACGTCCCAGACATCAGGTGCAGACCCACCTCGAAAACCCCACCAAGTACCACATACAGCAAGCCCAACGGCAGCAGGTAAAGCAGTACCTTTCTACCACTT(SEQ ID NO.3)。经实验验证,该引物可成功扩增出目的条带,条带单一、特异。
一种ACTA2-MITF易位性肿瘤诊断试剂盒,包括本发明所述的PCR引物。
有益效果:
本发明针对高通量测序发现的新融合基因设计了特异性的PCR引物,扩大了原有检测手段的检测范围,应用于临床,可提高诊断MiT家族易位性肾细胞癌的检出率和准确率。为诊断分型及分子靶向治疗提供依据。根据我们的实验结果,该引物组合诊断的特异性和敏感性均达到了100%,且操作对象只需要在石蜡包埋组织切片上进行,时间仅为三个工作日。采用本发明提供的引物组合进行检测PRCC-MITF易位性肿瘤,不但方便、快速、可靠而且检出率高,可用于制备ACTA2-MITF易位性肿瘤诊断试剂盒,为ACTA2-MITF易位性肿瘤的快速准确的诊断提供了新的工具。
附图说明
图1:在已知ACTA2-MITF融合型肿瘤中应用本发明引物组合(ACTA2-E2-F;MITF-E3-R)进行验证,成功检出的ACTA2-MITF融合基因测序图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1针对明确诊断的病例进行验证:
本发明团队通过高通量测序技术,在一例形态学符合血管周上皮样细胞肿瘤特征的病例中检测出ACTA2-MITF融合基因,发现该基因由ACTA2外显子2和MITF外显子3融合形成。对于这例高通量测序RNA-seq检测出ACTA2exon2-MITF exon3新融合基因的病例,使用我们设计的引物对该病例的石蜡包埋组织切片进行PCR RT-PCR验证。
一、RNA的提取:
严格按照RNeasy FFPE Kit操作说明进行提取。①脱蜡:将收集好的玻片进行二甲苯脱蜡,再用无水乙醇漂洗,风干后用手术刀片刮下来装入1.5ml EP管中;②酶解:加入150μl消化液,再加入10μl蛋白酶K,混匀,56℃酶解15min,80℃15min,冰上冷却;③加入16μlDNDNA酶缓冲液,再加入10μl DNase I,混匀,室温静置15mimin,12000rpm离心15min,取上清;④加入320μl结合液液再加入720μl无水乙醇,混匀,分2次转移至吸附柱中,8000rpm离心1min,,弃废液;⑤洗涤:加入500μl洗涤液,8000rpm离心1min;重复洗涤一次,弃废液,将吸附柱转移到一个新的2ml收集管中,12000rpm离心5min;⑥洗脱:将吸附柱转移到1.5ml的EP管中,加入100μl的洗脱液,室温静置1min,12000rpm离心1min,将收集好的洗脱液(即DNA提取液)进行浓度和纯度测定,-80℃保存存待用。
二、逆转录PCR RT-PCR
采用试剂盒(K1622,RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit,MBI)对RNA进行逆转录,方法详见试剂盒说明。PCR扩增引物为本专利PRCC-MITF融合基因引物组合:ACTA2-E2-F2:GCTATGTGTGAAGAAGAGGAC(SEQ ID NO.1);MITF-E3-R4:AAGTGGTAGAAAGGTACTGCT(SEQ ID NO.2)。反应体系包括:0.125μl TaKaRa Ex TaqTM HS液,2.5μl 10×Taq Buffer(Mg2+plus),2μl dNTP(均购自日本Takara公司),引物浓度为20μmol/l,cDNA模版为100ng,无菌去离子水加至25μl。PCR扩增条件为94℃变性3min后,94℃30s、60℃30s、72℃1min,共35次循环,最后72℃延伸5min。PCR产物用3%琼脂糖,电压100V,电泳,溴化乙啶染色后于紫外光下观察结果,并送测序。
结果:使用本发明引物PCR后可见单一特异的电泳条带,对扩增产物进行测序,得到ACTA2 exon2-MITF exon3融合基因序列(图1),证明本项目设计的引物组合可靠且敏感。
实施例2针对对照组病例进行检测
我们对30例诊断明确的对照组病例(包括10例透明细胞性肾细胞癌,5例乳头状肾细胞癌,5例嫌色细胞性肾细胞癌,5例TFE3易位相关性肾细胞癌和5例TFEB易位相关性肾癌,理论上均不存在MITF基因易位)使用本发明的引物组合进行检测,RNA提取、逆转录PCR和测序方法同上。
结果:使用本发明设计引物组合检测,未检测出ACTA2-MITF融合基因,证明本项目设计的引物特异性高。
评价:本发明引物组合是对原有MiT基因家族易位相关性肿瘤融合基因引物的补充,扩展了MiT基因家族易位相关性肿瘤融合基因的类型,增加了RT-PCR方法诊断该肿瘤的检出率。
序列表
<110> 中国人民解放军南京军区南京总医院
<120> 一种ACTA2-MITF融合基因及其检测引物和应用
<140> 201811081488X
<141> 2018-09-17
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctatgtgtg aagaagagga c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagtggtaga aaggtactgc t 21
<210> 3
<211> 217
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctatgtgtg aagaagagga cagcactgcc ttggtgtgtg acaatggctc tgggctctgt 60
aaggccggct ttgctgggga cgatgctccc agggctgttt tcccatccat tgtgggacgt 120
cccagacatc aggtgcagac ccacctcgaa aaccccacca agtaccacat acagcaagcc 180
caacggcagc aggtaaagca gtacctttct accactt 217
Claims (3)
1.ACTA2-MITF融合基因的检测试剂在制备ACTA2-MITF易位性血管周上皮样细胞肿瘤诊断试剂中的应用;所述的融合基因包含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列;所述的ACTA2-MITF融合基因的检测试剂为检测ACTA2-MITF融合基因的特异性引物;所述的检测ACTA2-MITF融合基因的特异性引物为:ACTA2-E2-F2: SEQ ID NO.1;MITF-E3-R4:SEQ ID NO.2。
2.一种检测ACTA2-MITF易位性肿瘤的PCR引物,其特征在于所述的PCR引物为检测权利要求1所述的ACTA2-MITF融合基因的PCR引物;检测ACTA2-MITF易位性肿瘤的PCR引物为:ACTA2-E2-F2: SEQ ID NO.1;MITF-E3-R4:SEQ ID NO.2。
3.一种ACTA2-MITF易位性血管周上皮样细胞肿瘤诊断试剂盒,其特征在于包括权利要求2所述的PCR引物。
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