CN108315422A - 一种cltc-tfeb融合基因及其检测引物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CLTC‑TFEB融合基因及其检测引物和应用。一种CLTC‑TFEB融合基因，为CLTC的17号外显子与TFEB基因5号外显子之间发生基因融合而成。一种检测CLTC‑TFEB易位性肿瘤的PCR引物，由SEQ ID NO.1所示的CLTC‑E17‑F和SEQ ID NO.2所示的TFEB‑E5‑R组成。本发明所述的CLTC‑TFEB融合基因作为检测靶点在制备CLTC‑TFEB易位性肿瘤诊断试剂中的应用。本发明融合基因及其引物扩大了原引物组合的检测范围，应用于临床，可提高诊断该类肿瘤的检出率和准确率。

Description

一种CLTC-TFEB融合基因及其检测引物和应用

技术领域

本发明属于医学检验领域，涉及一种CLTC-TFEB融合基因及其检测引物和应用。

背景技术

2016年WHO对2004年肾细胞癌病理组织学分类进行了修改，新增了TFEB基因易位相关性肾癌(TFEB易位性肾癌)。TFEB基因位于6p21.1，是TFEB易位性肾癌的唯一驱动基因，其致病机理清晰明确：这类肿瘤均涉及位于6p21.1的TFEB基因同其它染色体易位及其所致形成融合基因，通过启动子变换从而高表达TFEB融合蛋白，而TFEB作为一个转录因子，通过与特异的DNA结构相结合，转录调控体内多种基因表达最终致病。目前WHO分类中仅纳入1种单一易位形式，即MALAT1-TFEB。然而近年来散在个案报道指出，TFEB易位性肾癌存在不同的易位伴侣和融合基因，包括KHDRBS2-TFEB,COL21A1-TFEB,CADM2-TFEB等。

TFEB易位性肿瘤是一罕见类型肿瘤，虽然其总体发病率很低，但该疾病以发病年龄轻为突出特征，因此造成极其沉重的家庭及社会负担。且研究表明，该肿瘤与肾脏常见肿瘤(透明细胞性肾细胞癌)无论从发病机制还是激活的信号通路上均存在显著差别，因而临床治疗指南亦对其治疗方案有所区分，TFEB易位性肿瘤的治疗靶点亟待进一步研究。因此，根据基因型来精确诊断此类肿瘤显得十分重要。

目前常用的诊断TFEB易位性肿瘤的检测方法主要包括免疫组织化学和荧光原位杂交。免疫组织化学检测细胞核TFEB融合蛋白直观、快捷、价格低，但其缺点是该方法容易受到多种因素影响，如组织固定时间、组织修复方式、抗体克隆号以及人为的判读因素等等，使得结果可能出现假阳性或假阴性。染色体荧光原位杂交(FISH)始于传统的细胞遗传学和DNA技术的结合，快速灵敏、特异性好，可以检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核型；还可以使用多种荧光标记，显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确。但这两种检测方法只能提示存在TFEB蛋白的高表达或TFEB基因的易位，均不能明确肿瘤中发生的具体易位改变。精确检测TFEB易位性肿瘤的易位伴侣和融合基因位点，不仅是患者预后预测的依据，也是未来靶向治疗的指导，因此，明确TFEB易位性肿瘤的基因易位位点，具有重要的临床意义。

目前高通量测序是唯一可以明确未知易位位点的检测手段，然而高通量测序费用高昂，检测周期长，检测平台稀缺，对样品质量要求高，不利于普及推广，对于大多数患者来说也不是首选检测手段。依赖以往经验，针对已知的融合位点设计特异性的PCR引物组合，对肿瘤组织中提取出的RNA逆转录之后进行PCR扩增并测序，检测融合基因具体易位位点，是最准确、便捷、经济的方法。因此，发现新的致病融合位点，进而设计PCR引物将有利于TFEB易位性肿瘤检测准确度的进一步提高。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种CLTC-TFEB融合基因。

本发明的另一目的是提供该CLTC-TFEB融合基因的检测引物。

本发明的又一目的是提供CLTC-TFEB融合基因及其引物的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种CLTC-TFEB融合基因，CLTC基因位于17q23.1(17号染色体，位置59619689-59696956，序列来自GeneBank，序列版本号GRCh38.p7)，共33个外显子；基因融合发生于CLTC的17号外显子与TFEB基因5号外显子之间。我们通过高通量测序方法检测未知融合对象的TFEB肿瘤患者的标本，发现所述的TFEB的新易位伴侣：CLTC-TFEB基因易位，这一位点国内外文献均未报道过，原有TFEB融合基因扩增引物也无法检测出这一融合基因，因此会导致漏诊。

本发明所述的CLTC-TFEB融合基因优选包含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

本发明所述的CLTC-TFEB融合基因作为检测靶点在制备CLTC-TFEB易位性肿瘤诊断试剂中的应用。

一种检测CLTC-TFEB易位性肿瘤的PCR引物，为检测本发明所述的CLTC-TFEB融合基因的PCR引物。所有能够检测本发明所述CLTC-TFEB基因易位的引物对均在本发明的保护范围内。

针对本发明找到的新的融合基因，我们在CLTC的17号外显子和TFEB的5号外显子内分别设计引物。遵循引物设计原则，引物最好在模板cDNA的保守区内设计，引物长度在15bp-30bp之间，引物GC含量在40％～60％之间，退火温度最好接近72℃，引物自身及引物之间不应存在互补序列，扩增条带单一特异。由于工作中经常需要在石蜡固定标本中开展工作，石蜡标本RNA碎裂严重，因此扩增产物不宜过长，需要控制在300bp以下。

经过多次调试和验证，最终设计的引物序列为：CLTC-E17-F：GCGTTGTTGGAAAGTATTGTG(SEQ IDNO.1)；TFEB-E5-R:TCTCGCTTCTGGGTCAGGT(SEQ ID NO.2)，理论扩增产物长202bp，扩增产物(融合基因)的全部序列如下：GCGTTGTTGGAAAGTATTGTGAGAAGAGAGATCCACATCTGGCCTGTGTTGCTTATGAACGTGGCCAATGTGATCTGGAACTTATTAATCTACCCCTGTCCAGCAGCCACCTGAATGTGTACAGCAGCGACCCCCAGGTCACAGCCTCCCTGGTGGGCGTCACCAGCAGCTCCTGCCCTGCGGACCTGACCCAGAAGCGAGA(SEQ ID NO.3)。经实验验证，引物可成功扩增出目的条带，条带单一、特异。

本发明所述的CLTC-TFEB融合基因的检测试剂在制备CLTC-TFEB易位性肿瘤诊断试剂中的应用。

优选，本发明所述的PCR引物在制备CLTC-TFEB易位性肿瘤诊断试剂中的应用。

一种CLTC-TFEB易位性肿瘤诊断试剂盒，包括本发明所述的PCR引物。

有益效果：

本发明针对高通量测序发现的新融合位点设计了特异性的PCR引物，扩大了原引物组合的检测范围，应用于临床，可提高诊断该类肿瘤的检出率和准确率。为诊断分型及分子靶向治疗提供依据。根据我们的实验结果，该引物组合诊断的特异性和敏感性均达到了100％，且操作对象只需要在石蜡包埋组织切片上进行，时间仅为三个工作日。采用本发明提供的探针组合进行检测CLTC-TFEB易位性肿瘤，不但方便、快速、可靠而且检出率高，可用于制备CLTC-TFEB易位性肿瘤诊断试剂盒，为CLTC-TFEB易位性肿瘤的快速准确的诊断提供了新的工具。

附图说明

图1：在已知CLTC-TFEB融合型肿瘤中应用本发明引物组合(CLTC-E17-F；TFEB-E5-R)进行验证，成功检出的CLTC-TFEB融合基因测序图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1针对明确诊断的病例进行验证：

对于高通量测序RNA-seq检测出CLTC exon17-TFEB exon5新融合位点的病例，使用我们设计的引物进行验证。

一、RNA的提取：

严格按照RNeasy FFPE Kit操作说明进行提取。①脱蜡：将收集好的玻片进行二甲苯脱蜡，再用无水乙醇漂洗，风干后用手术刀片刮下来装入1.5ml EP管中；②酶解：加入150μl消化液,再加入10μl蛋白酶K，混匀，56℃酶解15min,80℃15min，冰上冷却；③加入16μlDNDNA酶缓冲液,再加入10μl DNase I,混匀，室温静置15mimin,12000rpm离心15min，取上清；④加入320μl结合液液再加入720μl无水乙醇，混匀，分2次转移至吸附柱中，8000rpm离心1min，，弃废液；⑤洗涤：加入500μl洗涤液,8000rpm离心1min；重复洗涤一次，弃废液，将吸附柱转移到一个新的2ml收集管中，12000rpm离心5min；⑥洗脱：将吸附柱转移到1.5ml的EP管中，加入100μl的洗脱液，室温静置1min,12000rpm离心1min，将收集好的洗脱液(即DNA提取液)进行浓度和纯度测定，-80℃保存存待用。

二、逆转录PCR RT-PCR

采用试剂盒(K1622，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，MBI)对RNA进行逆转录，方法详见试剂盒说明。PCR扩增引物为本专利CLTC-TFEB融合基因引物组合CLTC-E17-F/TFEB-E5-R。反应体系包括：0.125μl TaKaRa Ex Taq^TM HS液，2.5μl 10×TaqBuffer(Mg²⁺plus)，2μl dNTP(均购自日本Takara公司)，引物浓度为20μmol/l，cDNA模版为100ng，无菌去离子水加至25μl。PCR扩增条件为94℃变性3min后，94℃30s、60℃30s、72℃1min，共35次循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用3％琼脂糖，电压100V，电泳，溴化乙啶染色后于紫外光下观察结果，并送测序。

结果：分别用本发明引物(CLTC-E17-F/TFEB-E5-R)PCR后可见单一特异的电泳条带，对扩增产物进行测序，得到CLTC exon17-TFEB exon5融合基因序列(图1)，证明本发明设计的引物组合可靠且敏感。

实施例2针对对照组病例进行检测

我们对30例诊断明确的对照组病例(包括10例透明细胞性肾细胞癌，5例乳头状肾细胞癌，5例嫌色细胞性肾细胞癌，5例TFE3易位相关性肾细胞癌和5例MALAT1-TFEB易位相关性肾癌，理论上均不存在CLTC-TFEB基因融合)使用本发明的引物组合进行检测，RNA提取、逆转录PCR和测序方法同上。

结果：使用本发明设计引物组合检测，未检测出CLTC-TFEB融合基因，证明本项目设计的引物特异性高。

评价：本发明引物组合是对原有TFEB易位性肾细胞癌融合基因引物的补充，扩展了TFEB易位性肾细胞癌融合基因的类型，增加了RT-PCR方法诊断该肿瘤的检出率。

序列表

<110> 南京鼓楼医院

<120> 一种CLTC-TFEB融合基因及其检测引物和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgttgttgg aaagtattgt g 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctcgcttct gggtcaggt 19

<210> 3

<211> 202

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgttgttgg aaagtattgt gagaagagag atccacatct ggcctgtgtt gcttatgaac 60

gtggccaatg tgatctggaa cttattaatc tacccctgtc cagcagccac ctgaatgtgt 120

acagcagcga cccccaggtc acagcctccc tggtgggcgt caccagcagc tcctgccctg 180

cggacctgac ccagaagcga ga 202

Claims (7)

1.一种CLTC-TFEB融合基因，其特征在于所述的融合基因为CLTC的17号外显子与TFEB基因5号外显子之间发生基因融合而成；所述的CLTC基因位于17号染色体，位置59619689-59696956，序列来自GeneBank，序列版本号GRCh38.p7，共33个外显子；所述的CLTC-TFEB融合基因包含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的CLTC-TFEB融合基因作为检测靶点在制备CLTC-TFEB易位性肿瘤诊断试剂中的应用。

3.一种检测CLTC-TFEB易位性肿瘤的PCR引物，其特征在于所述PCR引物为检测权利要求1所述的CLTC-TFEB融合基因的PCR引物。

4.根据权利要求3所述的检测CLTC-TFEB易位性肿瘤的PCR引物，其特征在于由SEQ IDNO.1所示的CLTC-E17-F和SEQ ID NO.2所示的TFEB-E5-R组成。

5.检测权利要求1所述的CLTC-TFEB融合基因的试剂在制备CLTC-TFEB易位性肿瘤诊断试剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于权利要求3或4所述的PCR引物在制备CLTC-TFEB易位性肿瘤诊断试剂中的应用。

7.一种CLTC-TFEB易位性肿瘤诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括权利要求3或4所述的PCR引物。