CN114207144A - 用于保存dna甲基化的组合物和方法 - Google Patents

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S·D·马科维茨
H·莫伊诺瓦
D·乌尔特曼
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Abstract

本公开提供用于在一段时间内保存DNA甲基化模式的储存溶液的方法。本公开还提供使用储存于这种储存溶液中的甲基化DNA的方法。

Description

用于保存DNA甲基化的组合物和方法
相关申请
本申请要求2019年5月28日提交的美国临时专利申请号62/853,392的优先权权益，该申请特此通过参考以其全部结合。
资金
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的CA152756资助下在政府支持下完成的。政府对本发明享有一定权利。
背景
胞嘧啶甲基化通常被称为真核生物基因组DNA中的“第五个碱基”。DNA胞嘧啶甲基化的模式改变被认为是多种人类疾病状态(包括各种化生、肿瘤形成和癌症)的伴随物、生物标志物和有时的因果元素。然而，尽管DNA多核苷酸序列在室温下长时间保持稳定，但在室温下长时间储存时，甲基化模式更有可能偏离初始甲基化模式。因此，需要新的储存条件来长时间保存DNA甲基化模式。
公开概述
在一些实施方案中，本公开提供一种包含含有甲基化DNA序列的生物样品以及含有甲醇的储存溶液的组合物；其中甲基化DNA序列的甲基化模式得到保存。在一些实施方案中，甲基化模式保存至少2周。在一些实施方案中，在室温下保存甲基化模式。在一些实施方案中，与储存之前的生物样品中的甲基化模式相比较，储存溶液中生物样品的甲基化模式保存至少60%。在一些实施方案中，与储存之前的生物样品中的甲基化模式相比较，储存溶液中生物样品的甲基化模式保存至少65%。在一些实施方案中，与储存之前的生物样品中的甲基化模式相比较，储存溶液中生物样品的甲基化模式保存至少70%。在一些实施方案中，与储存之前的生物样品中的甲基化模式相比较，储存溶液中生物样品的甲基化模式保存至少75%。在一些实施方案中，与储存之前的生物样品中的甲基化模式相比较，储存溶液中生物样品的甲基化模式保存至少80%。在一些实施方案中，与储存之前的生物样品中的甲基化模式相比较，储存溶液中生物样品的甲基化模式保存至少85%。在一些实施方案中，与储存之前的生物样品中的甲基化模式相比较，储存溶液中生物样品的甲基化模式保存至少90%。在一些实施方案中，与储存之前的生物样品中的甲基化模式相比较，储存溶液中生物样品的甲基化模式保存至少95%。在一些实施方案中，样品为人类生物样品。在一些实施方案中，生物样品为来自以下任何一种的样品：胃肠道、呼吸消化道、呼吸道、泌尿生殖道或体液。在某些这种实施方案中，体液为以下的任何一种：血液、尿液、痰液、唾液、粪便、胆汁、胰液、鼻腔分泌物、眼泪、精液、阴道分泌物、脑脊液、胸膜液、腹膜液、胃液、心包液、汗液、淋巴液、囊液、胰腺囊液、滑液、关节液、月经液、子宫内膜冲洗液、乳房抽吸液或羊水。在一些实施方案中，生物样品为来自以下任何一种的样品：食道、胃、结肠、小肠、胰腺、肝脏、口腔、口咽、气管、支气管树、肺部或乳房。在一些实施方案中，生物样品为食道生物样品。在一些实施方案中，储存溶液包含100%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的10%-100%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的10%-95%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的10-90%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的15-90%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的20-90%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的25-90%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的30-90%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的30-85%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的30-80%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的35-80%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的35-75%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的35-70%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的40-70%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的40-65%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的40-60%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的40-55%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的45-55%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的50%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液基本上由100%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的10%-100%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的10%-95%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的10-90%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的15-90%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的20-90%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的25-90%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的30-90%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的30-85%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的30-80%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的35-80%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的35-75%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的35-70%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的40-70%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的40-65%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的40-60%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的40-55%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的45-55%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的50%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由100%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的10%-100%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的10%-95%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的10-90%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的15-90%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的20-90%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的25-90%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的30-90%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的30-85%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的30-80%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的35-80%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的35-75%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的35-70%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的40-70%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的40-65%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的40-60%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的40-55%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的45-55%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的50%甲醇组成。在一些实施方案中，甲醇不含或者以低于或等于0.001%的水平含过氧化物。在一些实施方案中，水通过蒸馏或超滤或反渗透来纯化。在一些实施方案中，水不含DNA酶和/或RNA酶活性。在一些实施方案中，甲基化DNA序列包含与波形蛋白、CCNA1、Up10、Up35-1、Up35-2、FER1L4、VAV3、DOCK10、ADCY1、BMP3、CD1D、ELMO1、ELOVL2、LRRC4、NDRG4、SFMBT2、ST8SIA1、TSPYL5、ZNF568、ZNF569、ZNF610、ZNF671、ZNF682、CDKN2A、DIO3和HUNK基因的任何核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的多核苷酸序列或其任何片段和/或互补物。在一些实施方案中，甲基化DNA序列包含与SEQ ID NO: 1-45中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的多核苷酸序列或其任何片段和/或互补物。在一些实施方案中，当在室温(23℃)下储存时，甲基化DNA模式在组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。在一些实施方案中，当在4℃下储存时，甲基化DNA模式在组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。在一些实施方案中，当在-30℃至50℃范围内的温度下储存时，甲基化DNA模式在组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、17天、3周、25天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。在一些实施方案中，当在-10℃至30℃范围内的温度下储存时，甲基化DNA模式在组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。
在一些实施方案中，本公开提供一种在生物样品中保存甲基化DNA分子的甲基化模式的方法，其包括用储存溶液处理生物样品，其中储存溶液包含甲醇。在一些实施方案中，在室温下保存甲基化模式。在一些实施方案中，甲基化模式保存至少两周。在一些实施方案中，与储存之前的生物样品中的甲基化模式相比较，储存溶液中生物样品的甲基化模式保存至少60%。在一些实施方案中，与储存之前的生物样品中的甲基化模式相比较，储存溶液中生物样品的甲基化模式保存至少65%。在一些实施方案中，与储存之前的生物样品中的甲基化模式相比较，储存溶液中生物样品的甲基化模式保存至少70%。在一些实施方案中，与储存之前的生物样品中的甲基化模式相比较，储存溶液中生物样品的甲基化模式保存至少75%。在一些实施方案中，与储存之前的生物样品中的甲基化模式相比较，储存溶液中生物样品的甲基化模式保存至少80%。在一些实施方案中，与储存之前的生物样品中的甲基化模式相比较，储存溶液中生物样品的甲基化模式保存至少85%。在一些实施方案中，与储存之前的生物样品中的甲基化模式相比较，储存溶液中生物样品的甲基化模式保存至少90%。在一些实施方案中，与储存之前的生物样品中的甲基化模式相比较，储存溶液中生物样品的甲基化模式保存至少95%。在一些实施方案中，生物样品储存于储存溶液中。在一些实施方案中，样品来自人体组织或体液。在一些实施方案中，样品来自以下的任何一种：胃肠道、呼吸消化道、呼吸道、泌尿生殖道或体液。在某些这种实施方案中，体液为以下的任何一种：血液、尿液、痰液、唾液、粪便、胆汁、胰液、鼻腔分泌物、眼泪、精液、阴道分泌物、脑脊液、胸膜液、腹膜液、胃液、心包液、汗液、淋巴液、囊液、胰腺囊液、滑液、关节液、月经液、子宫内膜冲洗液、乳房抽吸液或羊水。在一些实施方案中，样品来自以下的任何一种：食道、胃、结肠、小肠、胰腺、肝脏、口腔、口咽、气管、支气管树、肺部或乳房。在一些实施方案中，样品为食道样品。在一些实施方案中，储存溶液包含100%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的10%-100%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的10%-95%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的10-90%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的15-90%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的20-90%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的25-90%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的30-90%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的30-85%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的30-80%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的35-80%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的35-75%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的35-70%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的40-70%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的40-65%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的40-60%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的40-55%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的45-55%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含与水混合的50%甲醇。在一些实施方案中，储存溶液基本上由100%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的10%-100%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的10%-95%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的10-90%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的15-90%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的20-90%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的25-90%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的30-90%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的30-85%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的30-80%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的35-80%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的35-75%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的35-70%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的40-70%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的40-65%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的40-60%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的40-55%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的45-55%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由与水混合的50%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由100%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的10%-100%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的10%-95%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的10-90%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的15-90%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的20-90%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的25-90%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的30-90%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的30-85%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的30-80%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的35-80%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的35-75%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的35-70%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的40-70%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的40-65%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的40-60%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的40-55%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的45-55%甲醇组成。在一些实施方案中，储存溶液由与水混合的50%甲醇组成。在一些实施方案中，甲醇不含或者以低于或等于0.001%的水平含过氧化物。在一些实施方案中，水通过蒸馏或超滤或反渗透来纯化。在一些实施方案中，水不含DNA酶和/或RNA酶活性。在一些实施方案中，本公开提供保存生物样品的DNA甲基化模式的方法，其中生物样品用DNA/RNA Shield处理和/或储存于其中。在一些实施方案中，在波形蛋白基因的差异性甲基化结构域或CCNA1基因的差异性甲基化结构域内测定DNA甲基化的模式。在一些实施方案中，波形蛋白的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 1-5或对应于chr10:17,270,838-17,271,717的SEQ ID NO: 18中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列或其互补物和/或片段。在一些实施方案中，波形蛋白的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 1-5中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，CCNA1的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 6或7具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，在Up10、Up35-1和/或Up35-2核苷酸序列的差异性甲基化结构域内测定DNA甲基化的模式。在一些实施方案中，Up10的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 8-11中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，Up35-1的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 12-15中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，Up35-2的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 12-13和16-17中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，核苷酸序列、互补物或片段的长度为至少20个核苷酸。在一些实施方案中，在与包含同波形蛋白、CCNA1、FER1L4、VAV3、DOCK10、ADCY1、BMP3、CD1D、ELMO1、ELOVL2、LRRC4、NDRG4、SFMBT2、ST8SIA1、TSPYL5、ZNF568、ZNF569、ZNF610、ZNF671、ZNF682、CDKN2A、DIO3和/或HUNK基因的任何核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列或其任何片段和/或互补物的DNA分子相关的差异性甲基化结构域内测定DNA甲基化的模式。在一些实施方案中，差异性甲基化结构域与包含同由基因组坐标指定的任何核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段的DNA分子相关：
基因名称 染色体编号 DMR开始和结束位置(hg19) DMR2 DMR3 DMR4
ADCY1 7 45613877-45614572
BMP3 4 81952348-81952402 81031173-81031262
CD1D 1 158150797-158151205
CDKN2A 9 21974710-21974763 21975053-21975199
DIO3 14 102026104-102026204
DOCK10 2 225907226-225907322
ELMO1 7 37487755-37488477
ELOVL2 6 11044395-11044834
FER1L4 20 34189488-34189693 34189488-34189693
HUNK 21 33246580-33246650
LRRC4 7 127671993-127672310
NDRG4 16 58497395-58497451
SFMBT2 10 7452885- 7452956 7451771-7451869 7452029-7452452 7450242-7450831
ST8SIA1 12 22487528-22487620
TSPYL5 8 98289858-98290220
VAV3 1 108507608-108507679
ZNF568 19 37407197-37407284 37407197-37407365
ZNF569 19 37957760-37958046
ZNF610 19 52839503-52840013
ZNF671 19 58238810-58238955
ZNF682 19 20149796-20149923
在一些实施方案中，ADCY1的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 19具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，BMP3的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO:20或21具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，CD1D的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 22具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，CDKN2A的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 23或24具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，DIO3的差异性甲基化结构域包含与SEQ IDNO: 25具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，DOCK10的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 26具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，ELMO1的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 27具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，ELOV12的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 28具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，FER1L4的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 29具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，HUNK的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 30具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，LRRC4的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 31具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，NDRG4的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO:32具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，SFMBT2的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 33、34、35或36中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，ST8S1A1的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 37具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，TSPYL5的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 38具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，VAV3的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 39具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，ZNF568的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 40或41具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，ZNF569的差异性甲基化结构域包含与SEQID NO: 42具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，ZNF610的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 43具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，ZNF671的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 44具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，ZNF682的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO:45具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。在一些实施方案中，这种核苷酸序列、互补物或这种片段的长度为至少20个核苷酸。在一些实施方案中，DNA甲基化的模式通过包括用将胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的亚硫酸氢盐化合物处理DNA的步骤来测定。在一些实施方案中，当在室温(23℃)下储存时，甲基化DNA模式在组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。在一些实施方案中，当在4℃下储存时，甲基化DNA模式在组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。在一些实施方案中，在-30℃至50℃范围内的温度下，甲基化DNA模式在组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。在一些实施方案中，在-20℃至50℃范围内的温度下，甲基化DNA模式在组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。在一些实施方案中，在-10℃至30℃范围内的温度下，甲基化DNA模式在组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。
附图简述
图1A和1B：液体介质对DNA甲基化测定的影响的时间进程研究。保存条件显示于x轴上，而甲基读数分数显示于y轴上。“VIM”对应于波形蛋白。“4deg”意指在4℃下储存。“NBF”意指中性缓冲福尔马林。注：“shield”的时间点0与其他保存条件在不同的日期进行。
图2A和2B：液体介质对DNA甲基化测定的影响的时间进程研究。保存条件显示于x轴上，而甲基读数分数显示于y轴上。“VIM”对应于波形蛋白。“4deg”意指在4℃下储存。“NBF”意指中性缓冲福尔马林。
图3A和3B：液体介质对DNA甲基化测定的影响的剂量响应曲线。保存条件显示于x轴上，而甲基读数分数显示于y轴上。“VIM”对应于波形蛋白。“NBF”意指中性缓冲福尔马林。独立地制备每种混合物的生物学重复，并通过快速冷冻(表示为“冷冻(Exp0)”)处理沉淀的细胞。
图4A和4B：在不同缓冲液中跨时间温育的细胞中测试的DNA甲基化。保存条件和时间显示于x轴上，而甲基读数分数显示于y轴上。“VIM”对应于波形蛋白。
图5A和5B：第0天在不同缓冲液中温育的细胞中测试的DNA甲基化。保存条件和时间显示于x轴上，而甲基读数分数显示于y轴上。“VIM”对应于波形蛋白。
图6A和6B：在不同百分比甲醇的缓冲液中和不同温度下测试1%甲基化细胞的第21天样品。保存条件和时间显示于x轴上，而甲基读数分数显示于y轴上。“VIM”对应于波形蛋白。
图7A和7B：在不同百分比甲醇的缓冲液中和不同温度下测试未甲基化的细胞的第21天样品。保存条件和时间显示于x轴上，而甲基读数分数显示于y轴上。“VIM”对应于波形蛋白。
发明详述
一般来说，肿瘤形成可通过被称为染色体不稳定性、微卫星不稳定性和CpG岛甲基化表型(CIMP)的至少3种不同途径之一发展。尽管存在一些重叠，但这些途径倾向于表现出有些不同的生物学行为。通过了解肿瘤或化生发展的途径、涉及的靶基因以及遗传不稳定性的潜在机制，可以实施策略来检测和治疗不同类型的肿瘤形成或化生。
某些靶基因可能会因靶基因的5’侧翼或启动子区域中CpG岛的差异甲基化而沉默或失活。CpG岛为DNA序列中胞嘧啶-鸟苷残基的簇，突出存在于我们基因组中大约一半基因的5’侧翼区域或启动子区域中。本公开至少部分地基于这样的认识，即与其他溶液相比较，某些储存溶液出人意料地保存样品中的DNA甲基化模式。
A. 定义
为方便起见，在此收集了说明书、实施例和所附权利要求中采用的某些术语。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文所述的那些相似或等效的方法和材料，但合适的方法和材料在下文描述。材料、方法和实施例仅为说明性的，并非旨在进行限制。本文提及的所有出版物、专利和其他文件均通过参考以其全部结合。
本文描述的发明的每个实施方案可单独或者与本发明的一个或多个其它实施方案结合采用。
贯穿本说明书，词语“包含(comprise)”或变体比如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将理解为意指包括规定的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
冠词“一个(a)”和“一个(an)”在本文中用于指代冠词的一个或多于一个(即至少一个)语法对象。例如，“一个元素”意指一个元素或多于一个元素。
术语“大约”或“约”意指在如本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于该值如何测量或确定，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“大约”可意指在一个或多于一个标准差内。或者，“大约”可意指高于或低于给定值最多20%、最多15%、最多10%、最多5%或最多1%的范围。
术语“腺瘤”在本文中用于描述上皮组织的任何癌前肿瘤形成或良性肿瘤，例如胃肠道、胰腺和/或膀胱的癌前肿瘤形成。
本文中的术语“血液来源的级分”是指全血的一种或多种成分。全血包含液体部分(即血浆)和固体部分(即血细胞)。血液的液体和固体部分各自包含多种成分；例如血浆中的不同蛋白或固体部分中的不同细胞类型。这些成分中的一种或任何这些成分的混合物为血液来源的级分，只要这种级分缺少全血中发现的一种或多种成分。
术语“食道”旨在包括消化系统的上部，从口腔的后部跨越，向下穿过纵隔的后部，穿过隔膜并进入胃。
术语“食道癌”在本文中用于指代食道的任何癌性肿瘤形成。
如本文使用的，“巴雷特食道”是指食道下部细胞中的异常变化(化生)。巴雷特的特征为在食道中发现肠化生。
可使用本领域已知的任何方式来获得如本文所指的食道的“刷取”。在一些实施方案中，通过使食道与刷子、细胞刷、海绵、球囊或与接触食道并获得食道样品的任何其他装置或物质接触来获得刷取。
“细胞”、“宿主细胞”或“重组宿主细胞”为本文中可互换使用的术语。应当理解，这种术语不仅是指特定的受试细胞，而且是指这种细胞的后代或潜在后代。由于某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，因此这种后代实际上可能与亲代细胞不同，但仍包括在如本文使用的该术语的范围内。
术语“化合物”、“测试化合物”、“试剂”和“分子”在本文中可互换使用，并且意指包括但不限于肽、核酸、碳水化合物、有机小分子、天然产物提取物文库和任何其他分子(包括但不限于化学品、金属和有机金属化合物)。
术语“化合物转化的DNA”在本文中是指已用将DNA中未甲基化的C碱基转化为不同的核苷酸碱基的化合物处理或与之反应的DNA。例如，一种这样的化合物为亚硫酸氢钠，其将未甲基化的C转化为U。如果用亚硫酸氢钠处理含有转化敏感的胞嘧啶的DNA，则化合物转化的DNA将含有U来代替C。如果用亚硫酸氢钠处理的DNA仅含有甲基胞嘧啶，则化合物转化的DNA将不含尿嘧啶来代替甲基胞嘧啶。
如本文使用的，术语“去甲基化剂”是指在用试剂处理后恢复通过甲基化而沉默的靶基因的活性和/或基因表达的试剂。这种试剂的实例非限制性地包括5-氮杂胞苷和5-氮杂-2’-脱氧胞苷。
术语“检测”在本文中用于指代观察生物样品中的标志物或标志物变化(比如标志物的甲基化状态的变化)的任何过程，无论是否实际检测到标志物或者标志物的变化。在一些实施方案中，即使确定标志物不存在或低于灵敏度水平，探测样品的标志物或标志物变化的行为也为“检测”。检测可为定量、半定量或非定量观察。
术语“差异性甲基化核苷酸序列”或“差异性甲基化结构域”是指发现在癌组织或细胞系中甲基化但在正常组织或细胞系中未甲基化的基因组基因座/靶基因的区域，或者是指发现在癌组织或细胞系中甲基化程度低于正常组织或细胞系中甲基化程度的基因组基因座/靶基因的区域。
如本文使用的，术语“肿瘤形成”是指组织的异常生长。如本文使用的，术语“肿瘤形成”可用于指代癌性和非癌性肿瘤，以及巴雷特食道(其在本文中也可称为化生)和具有发育异常的巴雷特食道。在一些实施方案中，具有发育异常的巴雷特食道为具有高度发育异常的巴雷特食道。在一些实施方案中，具有发育异常的巴雷特食道为具有低度发育异常的巴雷特食道。在一些实施方案中，肿瘤形成为癌症(例如食道腺癌)。
“胃肠肿瘤形成”是指上下胃肠道的肿瘤形成。如本领域通常理解的，上胃肠道包括食道、胃和十二指肠；下胃肠道包括小肠的其余部分和整个大肠。
术语“健康的”、“正常的”和“非肿瘤的”在本文中可互换使用，是指没有(至少就检测限而言)疾病状况(比如肿瘤形成)的受试者或者特定细胞或组织。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性和同一性可各自通过比较可为了比较的目的而比对的每个序列中的位置来确定。当所比较序列中的等同位置被相同碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置具有同一性；当等同位点被相同或相似的氨基酸残基(例如空间和/或电子性质相似)占据时，则分子可被称为在该位置同源(相似)。措辞如同源性/相似性或同一性百分比是指所比较序列共享的位置处相同或相似氨基酸数量的函数。“无关”或“非同源的”序列与本发明的序列在一些实施方案中共享小于40%同一性，并且在特定实施方案中共享小于25%同一性。在比较两个序列时，残基(氨基酸或核酸)的缺失或额外残基的存在也会降低同一性和同源性/相似性。
术语“同源性”描述用于鉴定具有相似功能或基序的基因或蛋白的基于数学的序列相似性比较。本发明的核酸和蛋白序列可用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索以例如鉴定其他家族成员、相关序列或同源物。可使用Altschul等人(1990) J Mol. Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行这种搜索。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程序(得分=100，字长=12)进行，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可用XBLAST程序(得分=50，字长=3)进行，以获得与本发明蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的带空位比对，可如Altschul等人, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402中所述利用Gapped BLAST。在利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用相应程序(例如XBLAST和BLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
如本文使用的，“同一性”意指当将序列比对以最大化序列匹配，即考虑到空位和插入时，两个或更多个序列中相应位置处相同核苷酸或氨基酸残基的百分比。同一性可通过已知方法容易地计算，包括但不限于(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informaticsand Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993;Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M.,和Griffin, H. G.,eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje, G., Academic Press, 1987;和Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.和Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991;和Carillo, H.,和Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073, 1988)中描述的那些方法。确定同一性的方法被设计为提供测试序列之间的最大匹配。此外，确定同一性的方法已编入公开可获得的计算机程序中。确定两个序列之间同一性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux, J.等人, Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA (Altschul, S. F.等人, J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)和Altschul等人Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))。BLAST X程序可从NCBI和其他来源公开获得(BLAST Manual, Altschul, S.等人, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul,S.等人, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990))。众所周知的史密斯-沃特曼算法(SmithWaterman algorithm)也可用于确定同一性。
术语“包括”在本文中用于意指短语“包括但不限于”并且可与之互换使用。
如本文关于核酸(比如DNA或RNA)使用的术语“分离的”是指呈在自然界中不存在的形式的分子。此外，“分离的核酸”意指包括不是作为片段天然存在和不会以天然状态发现的核酸片段。
术语“甲基化特异性PCR”(“MSP”)在本文中是指其中进行化合物转化的模板序列的扩增的聚合酶链式反应。设计了两组引物用于MSP。每组引物包括正向引物和反向引物。在一些实施方案中，如果DNA内CpG二核苷酸中的C碱基被甲基化，则被称为甲基化特异性引物的一组引物将扩增化合物转化的模板序列。在一些实施方案中，如果DNA内CpG二核苷酸中的C碱基未甲基化，则被称为未甲基化特异性引物或未甲基化序列的引物等的另一组引物将扩增化合物转化的模板序列。
如本文使用的，术语“核酸”是指多核苷酸，比如脱氧核糖核酸(DNA)以及在适当情况下的核糖核酸(RNA)。该术语还应当理解为包括由核苷酸类似物制成的RNA或DNA的类似物作为等效物，以及当适用于所描述的实施方案时的单链(比如正义或反义)和双链多核苷酸。
当描述两个DNA区域之间的关系时，“可操作地连接”仅意指它们在功能上彼此相关。例如，如果启动子或其他转录调控序列控制编码序列的转录，则其与编码序列可操作地连接。
术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”并且可与之互换使用，除非上下文另外明确指明。
术语“蛋白”和“多肽”在本文中可互换使用。
“样品”包括为检测分子标志物或分子标志物的变化(比如甲基化状态)而获得或制备的任何材料，或者为检测分子标志物或分子标志物的变化的目的而与检测试剂或检测装置接触的任何材料。
如本文使用的，“获得样品”包括直接从受试者取回样品以测定，或直接从受试者取回样品以储存(例如在本文所述的任何储存溶液中)并在稍后时间测定。或者，可经第二方获得样品。即，样品可经例如运输从已经取回样品或以其他方式获得样品的另一个体获得。
“储存溶液”为在一段时间内保存DNA分子中甲基化模式的任何溶液。储存溶液在本文中也可被称为“保存剂”。
“受试者”为任何感兴趣的生物体，通常为哺乳动物受试者，比如小鼠，并且在特定实施方案中为人类受试者。
如本文使用的，术语“特异性地杂交”是指本发明的核酸探针/引物与靶序列或与其互补的序列或其天然存在的突变体的至少12、15、20、25、30、35、40、45、50或100个连续核苷酸杂交，使得其在一些实施方案中与除靶基因以外的细胞核酸(例如mRNA或基因组DNA)具有少于15%、少于10%或少于5%的背景杂交的能力。多种杂交条件可用于检测特异性杂交，并且严格性主要由杂交测定的洗涤阶段决定。通常高温和低盐浓度会产生高严格性，而低温和高盐浓度会产生低严格性。通过例如在50℃下以约2.0 x SSC洗涤实现低严格性杂交，和在50℃下用约0.2 x SSC实现高严格性。本文中提供对严格性的进一步描述。
当应用于多肽时，术语“基本序列同一性”意指两个肽序列在比如通过程序GAP或BESTFIT使用默认空位进行最佳比对时，共享至少90%序列同一性，在一些实施方案中为至少95%序列同一性，或者至少99%序列同一性或更多。在一些实施方案中，不相同的残基位置因保守性氨基酸取代而不同。例如，具有相似化学性质(比如电荷或极性)的氨基酸的取代不太可能影响蛋白的性质。实例包括谷氨酰胺取代天冬酰胺或谷氨酸取代天冬氨酸。
如本文使用的，术语“Up10”是指包含与SEQ ID NO: 8的序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列的核苷酸序列或其片段或反向互补物。如本文使用的，术语“Up10”还指包含与SEQ ID NO: 9的序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列的核苷酸序列或其片段或反向互补物。如本文使用的，术语“Up10”还指包含与SEQ ID NO: 10的序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列的核苷酸序列或其片段或反向互补物。如本文使用的，术语“Up10”还指包含与SEQ ID NO: 11的序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列的核苷酸序列或其片段或反向互补物。
如本文使用的，术语“Up35-1”是指包含与SEQ ID NO: 12的序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列的核苷酸序列或其片段或反向互补物。如本文使用的，术语“Up35-1”还指包含与SEQ ID NO: 13的序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列的核苷酸序列或其片段或反向互补物。如本文使用的，术语“Up35-1”还指包含与SEQ ID NO: 14的序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列的核苷酸序列或其片段或反向互补物。如本文使用的，术语“Up35-1”还指包含与SEQ ID NO: 15的序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列的核苷酸序列或其片段或反向互补物。
如本文使用的，术语“Up35-2”是指包含与SEQ ID NO: 12的序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列的核苷酸序列或其片段或反向互补物。如本文使用的，术语“Up35-2”还指包含与SEQ ID NO: 13的序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列的核苷酸序列或其片段或反向互补物。如本文使用的，术语“Up35-2”还指包含与SEQ ID NO: 16的序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列的核苷酸序列或其片段或反向互补物。如本文使用的，术语“Up35-2”还指包含与SEQ ID NO: 17的序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的序列的核苷酸序列或其片段或反向互补物。
B. 储存溶液
在一些实施方案中，本公开提供用于保存细胞样品中的DNA甲基化模式的储存溶液。
在一些实施方案中，溶液包含有机溶剂。在一些实施方案中，有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇或氯仿中的任何一种或其组合。在一些实施方案中，储存溶液包含甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含乙醇。在一些实施方案中，储存溶液包含异丙醇。在一些实施方案中，储存溶液包含氯仿。在一些实施方案中，储存溶液用水稀释。在一些实施方案中，储存溶液包含本文公开的任何一种有机溶剂和水。在一些实施方案中，储存溶液包含至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95 %或97%的有机溶剂。在一些实施方案中，储存溶液包含少于70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或3%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含95%的有机溶剂和5%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约90%的有机溶剂和约10%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约85%的有机溶剂和约15%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约80%的有机溶剂和约20%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约75%的有机溶剂和约25%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约70%的有机溶剂和约30%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约65%的有机溶剂和约35%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约60%的有机溶剂和约40%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约55%的有机溶剂和约45%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约50%的有机溶剂和约50%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约45%的有机溶剂和约55%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约40%的有机溶剂和约60%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约35%的有机溶剂和约65%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约30%的有机溶剂和约70%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约25%的有机溶剂和约75%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约20%的有机溶剂和约80%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约15%的有机溶剂和约85%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约10%的有机溶剂和约90%的水。在一些实施方案中，储存溶液基本上由95%的有机溶剂和5%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约90%的有机溶剂和约10%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约85%的有机溶剂和约15%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约80%的有机溶剂和约20%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约75%的有机溶剂和约25%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约70%的有机溶剂和30%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约65%的有机溶剂和约35%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约60%的有机溶剂和约40%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约55%的有机溶剂和约45%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约50%的有机溶剂和约50%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约45%的有机溶剂和约55%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约40%的有机溶剂和约60%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约35%的有机溶剂和约65%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约30%的有机溶剂和约70%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约25%的有机溶剂和约75%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约20%的有机溶剂和约80%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约15%的有机溶剂和约85%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约10%的有机溶剂和约90%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由95%的有机溶剂和5%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约90%的有机溶剂和约10%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约85%的有机溶剂和约15%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约80%的有机溶剂和约20%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约75%的有机溶剂和约25%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约70%的有机溶剂和30%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约65%的有机溶剂和约35%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约60%的有机溶剂和约40%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约55%的有机溶剂和约45%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约50%的有机溶剂和约50%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约45%的有机溶剂和约55%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约40%的有机溶剂和约60%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约35%的有机溶剂和约65%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约30%的有机溶剂和约70%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约25%的有机溶剂和约75%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约20%的有机溶剂和约80%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约15%的有机溶剂和约85%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约10%的有机溶剂和约90%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液包含10-90%的有机溶剂。在一些实施方案中，储存溶液包含20-80%的有机溶剂。在一些实施方案中，储存溶液包含25-75%的有机溶剂。在一些实施方案中，储存溶液包含30-70%的有机溶剂。在一些实施方案中，储存溶液包含35-65%的有机溶剂。在一些实施方案中，储存溶液包含40-60%的有机溶剂。在一些实施方案中，储存溶液包含45-55%的有机溶剂。
在一些实施方案中，储存溶液包含甲醇。在一些实施方案中，储存溶液为基于甲醇的缓冲液。在一些实施方案中，储存溶液包含100%甲醇。在一些实施方案中，甲醇不含过氧化物。在一些实施方案中，甲醇为不含过氧化物/测序甲醇(Fisher BioReagents)。在一些实施方案中，甲醇为超纯甲醇。在一些实施方案中，存储溶液包含甲醇和另一种液体的混合物。在一些实施方案中，另一种液体为水。在一些实施方案中，储存溶液包含至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或97%的甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含少于70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或3%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含95%的甲醇和5%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约90%的甲醇和约10%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约85%的甲醇和约15%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约80%的甲醇和约20%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约75%的甲醇和约25%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约70%的甲醇和30%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约65%的甲醇和约35%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约60%的甲醇和约40%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约55%的甲醇和约45%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约50%的甲醇和约50%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约45%的甲醇和约55%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约40%的甲醇和约60%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约35%的甲醇和约65%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约30%的甲醇和约70%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约25%的甲醇和约75%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约20%的甲醇和约80%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约15%的甲醇和约85%的水。在一些实施方案中，储存溶液包含约10%的甲醇和约90%的水。在一些实施方案中，储存溶液基本上由95%的甲醇和5%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约90%的甲醇和约10%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约85%的甲醇和约15%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约80%的甲醇和约20%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约75%的甲醇和约25%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约70%的甲醇和30%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约65%的甲醇和约35%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约60%的甲醇和约40%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约55%的甲醇和约45%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约50%的甲醇和约50%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约45%的甲醇和约55%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约40%的甲醇和约60%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约35%的甲醇和约65%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约30%的甲醇和约70%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约25%的甲醇和约75%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约20%的甲醇和约80%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约15%的甲醇和约85%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液基本上由约10%的甲醇和约90%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由95%的甲醇和5%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约90%的甲醇和约10%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约85%的甲醇和约15%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约80%的甲醇和约20%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约75%的甲醇和约25%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约70%的甲醇和30%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约65%的甲醇和约35%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约60%的甲醇和约40%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约55%的甲醇和约45%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约50%的甲醇和约50%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约45%的甲醇和约55%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约40%的甲醇和约60%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约35%的甲醇和约65%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约30%的甲醇和约70%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约25%的甲醇和约75%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约20%的甲醇和约80%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约15%的甲醇和约85%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液由约10%的甲醇和约90%的水组成。在一些实施方案中，储存溶液包含10-90%的甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含20-80%的甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含25-75%的甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含30-70%的甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含35-65%的甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含40-60%的甲醇。在一些实施方案中，储存溶液包含45-55%的甲醇。在一些实施方案中，水通过蒸馏纯化。在一些实施方案中，水通过超滤纯化。在一些实施方案中，水通过反渗透纯化。在一些实施方案中，水不含DNA酶和/或DNA酶活性。在一些实施方案中，水不含RNA酶和/或RNA酶活性。在一些实施方案中，水为UltraPureTM不含DNA酶/RNA酶蒸馏水(ThermoFischerInvitrogen)。
在一些实施方案中，储存溶液包含DNA/RNA Shield® (Zymo Research)。在一些实施方案中，储存溶液包含10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的DNA/RNAShield®。
在一些实施方案中，储存溶液包含去污剂。在一些实施方案中，储存溶液包含离液剂。在一些实施方案中，离液剂包含尿素。在一些实施方案中，离液剂为胍。
在一些实施方案中，储存溶液不含金属离子(例如钙、铁、镁或锌)。在一些实施方案中，储存溶液不含钙。在一些实施方案中，储存溶液不含镁。在一些实施方案中，储存溶液不含锌。在一些实施方案中，储存溶液不含铁。
在一些实施方案中，储存溶液处于中性pH下。在一些实施方案中，储存溶液不处于酸性pH下。在一些实施方案中，储存溶液处于5-9之间的pH下。在一些实施方案中，储存溶液具有大于5.5的pH。在一些实施方案中，储存溶液处于6-9之间的pH下。在一些实施方案中，储存溶液处于6-8之间的pH下。在一些实施方案中，储存溶液处于6.2和7.8之间的pH下。在一些实施方案中，储存溶液处于6.5和7.5之间的pH下。在一些实施方案中，储存溶液处于6.8和7.2之间的pH下。在一些实施方案中，pH为7.0。在一些实施方案中，储存溶液处于生理pH下。
在一些实施方案中，储存溶液不含过氧化物。在一些实施方案中，储存溶液包含少于0.1%、0.05%、0.01%、0.005%或0.001%的过氧化物。
在一些实施方案中，本文公开的任何储存溶液能够在室温(23℃)下将生物样品中靶DNA序列/靶基因中的甲基化模式保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。在一些实施方案中，本文公开的任何储存溶液能够在4℃下将生物样品中靶DNA序列/靶基因中的DNA甲基化模式保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。在一些实施方案中，本文公开的任何储存溶液能够在-10℃下将生物样品中靶DNA序列/靶基因中的DNA甲基化模式保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。
在一些实施方案中，本文公开的任何储存溶液保存从受试者获得的生物样品中靶DNA序列/靶基因中的DNA甲基化模式。在一些实施方案中，如果在生物样品中靶DNA序列/靶基因的至少75%、80%、85%、90%、95%或100%的拷贝在本文所述的任何储存溶液中一段时间(例如21天)之后与和参考靶DNA序列(例如参考差异性甲基化结构域)相关的甲基化模式相比较具有相同或几乎相同的甲基化模式，靶DNA序列/靶基因中的甲基化模式得到保存。在一些实施方案中，如果已经在储存溶液中储存一段时间(例如21天)的DNA分子中的靶序列具有与参考靶DNA序列(例如参考差异性甲基化结构域)的甲基化模式至少75%、80%、85%、90%、95%或100%相同的甲基化模式，则认为在储存溶液中储存一段时间的靶DNA序列/靶基因具有与参考靶DNA分子几乎相同的甲基化模式。在一些实施方案中，参考靶DNA分子或参考靶DNA序列为先前已针对参考细胞(例如健康对照细胞)确定甲基化模式的DNA分子/序列。在一些实施方案中，参考靶DNA分子或参考靶DNA序列为在从受试者分离样品之后确定样品中甲基化模式的DNA分子/序列。在一些实施方案中，在从受试者获得包含参考靶DNA序列的样品后将参考靶DNA序列储存超过1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、18小时或1天之前确定参考靶DNA序列的甲基化模式。在优选的实施方案中，参考靶DNA序列/分子来自与比较储存的靶DNA序列/分子的细胞类型相同的细胞类型(例如食道肿瘤细胞)。
在一些实施方案中，如果已知在参考DNA分子的参考差异性甲基化结构域中被甲基化的CpG的至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%在一段时间(例如21天)之后于储存的DNA分子的差异性甲基化结构域中被甲基化，则认为在储存溶液中储存的DNA分子中差异性甲基化结构域的甲基化模式被保存。在一些实施方案中，在本文公开的任何储存溶液中储存一段时间(例如21天)的样品中至少50%、60%、70%、80%、90%或100%的DNA分子具有保存的甲基化模式。
C. 靶基因
在一些实施方案中，本文描述的任何储存溶液可用于保存本文公开的任何靶基因的甲基化模式。如本文使用的，术语“靶基因”包括与特定基因相关的所有非编码和编码区，以及其互补物和/或其片段。例如，术语“靶基因”包含任何特定基因的编码序列上游的调控序列。在一些实施方案中，靶基因包含特定感兴趣的基因(例如波形蛋白或CCNA1)的启动子、阻遏子、增强子、沉默子、内含子和外显子。在特定实施方案中，靶基因包含靶基因的5’侧翼或启动子区域，因为CpG岛突出存在于我们基因组中大约一半基因的5’侧翼区域或启动子区域中。在一些实施方案中，靶基因的甲基化模式仅针对感兴趣的特定基因的片段，例如针对靶基因的5’侧翼或启动子区域的一部分而确定。在特定实施方案中，术语“靶基因”是指基因的差异性甲基化结构域。
在一些实施方案中，靶基因为波形蛋白、CCNA1、FER1L4、VAV3、DOCK10、ADCY1、BMP3、CD1D、ELMO1、ELOVL2、LRRC4、NDRG4、SFMBT2、ST8SIA1、TSPYL5、ZNF568、ZNF569、ZNF610、ZNF671、ZNF682、CDKN2A、DIO3、HUNK、Up35-1、Up35-2或Up10中的任何一种或多种，或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因可为这样的基因，其中差异甲基化可用于区分或检测组织化生或肿瘤形成，例如但不限于食道的化生或肿瘤形成。其他基因组基因座的差异性甲基化结构域(DMR)的实例如表1所示：
表1：
基因名称 染色体编号 DMR开始和结束位置(hg19) DMR2 DMR3 DMR4
ADCY1 7 45613877-45614572
BMP3 4 81952348-81952402 81031173-81031262
CD1D 1 158150797-158151205
CDKN2A 9 21974710-21974763 21975053-21975199
DIO3 14 102026104-102026204
DOCK10 2 225907226-225907322
ELMO1 7 37487755-37488477
ELOVL2 6 11044395-11044834
FER1L4 20 34189488-34189693 34189488-34189693
HUNK 21 33246580-33246650
LRRC4 7 127671993-127672310
NDRG4 16 58497395-58497451
SFMBT2 10 7452885-7452956 7451771-7451869 7452029-7452452 7450242-7450831
ST8SIA1 12 22487528-22487620
TSPYL5 8 98289858-98290220
VAV3 1 108507608-108507679
ZNF568 19 37407197-37407284 37407197-37407365
ZNF569 19 37957760-37958046
ZNF610 19 52839503-52840013
ZNF671 19 58238810-58238955
ZNF682 19 20149796-20149923
在一些实施方案中，靶基因包含与表1中公开的任何核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列或其任何片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含波形蛋白基因的至少一部分。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 1的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 2的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 3的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 4的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQID NO: 5的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 18的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含美国专利号9,580,754(该专利通过参考以其全部结合至本文中)中公开的波形蛋白核苷酸序列中任何一种的核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与对应于Hg19坐标: chr10: 17,270,838-17,271,347的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的波形蛋白核苷酸序列或其任何片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与对应于Hg19坐标: chr10: 17,270,838-17,271,717的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的波形蛋白核苷酸序列或其任何片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与对应于Hg19坐标: chr10: 17271442-17271547的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的波形蛋白核苷酸序列或其任何片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 5的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的波形蛋白核苷酸序列或其任何片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与对应于Hg19坐标chr13:37005805-37006194的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的CCNA1核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与对应于Hg19坐标chr13:37005856-37006031的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的CCNA1核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 6的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的CCNA1核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQID NO: 7的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的CCNA1核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 8的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的Up10核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 9的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的Up10核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 10的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的Up10核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 11的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的Up10核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 12的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的Up35-1核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO:13的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的Up35-1核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 14的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的Up35-1核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 15的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的Up35-1核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 12的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的Up35-2核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO:13的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的Up35-2核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 16的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的Up35-2核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 17的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的Up35-2核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 19的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ADCY1核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 20的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的BMP3核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 21的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的BMP3核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 22的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的CD1D核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 23的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的CDKN2A核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO:24的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的CDKN2A核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 25的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的DIO3核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 26的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的DOCK10核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 27的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ELMO1核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 28的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ELOVL2核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 29的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的FER1L4核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 30的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的HUNK核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 31的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的LRRC4核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 32的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的NDRG4核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 33的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的SFMBT2核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO:34的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的SFMBT2核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 35的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的SFMBT2核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 36的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的SFMBT2核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 37的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ST8S1A1核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 38的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的TSPYL5核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 39的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的VAV3核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 40的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ZNF568核苷酸序列或其片段和/或互补物。在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO:41的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ZNF568核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 42的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ZNF569核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 43的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ZNF610核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 44的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ZNF671核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，靶基因包含与SEQ ID NO: 45的核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的ZNF682核苷酸序列或其片段和/或互补物。
在一些实施方案中，本文公开的任何靶基因片段的长度为至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900或1000个核苷酸。在特定实施方案中，片段的长度为至少20个核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的任何靶基因片段的长度介于10-1000、介于10-500、介于10-250、介于10-200、介于10-150、介于10-100、介于10-50、介于10-25、介于10-20、介于25-50、介于50-75、介于25-100、介于50-100、介于50-150、介于100-200、介于50-250或介于100-250个核苷酸之间。
D. 生物样品
在一些实施方案中，本文所述的任何储存溶液用于储存本文公开的任何生物样品。样品可基本上为任何感兴趣的生物材料，例如取自受试者的细胞集合。例如，样品可为来自受试者的体液样品，来自受试者的组织样品，来自受试者的固体或半固体样品，源自受试者的材料的原代细胞培养物或组织培养物，来自细胞系的细胞，或者来自细胞或组织培养物的培养基或其他胞外材料，或异种移植物(意指来自第一受试者(例如人类)的已在第二受试者(例如免疫受损的小鼠)中培养的癌症样品)。如本文使用的，术语“样品”旨在涵盖直接从受试者获得的生物材料(其可被描述为初级样品)以及初级样品的任何操作形式或部分。样品也可通过使生物材料与外源性液体接触，导致产生含有所接触生物材料的某些部分的灌洗液来获得。此外，术语“样品”旨在涵盖已与一种或多种添加剂(比如保存剂、螯合剂、抗凝血因子等)混合之后的初级样品。在一些实施方案中，样品通过细胞刷取和/或球囊获得。在一些实施方案中，样品为从受试者的胃食管交界处获得。
在某些实施方案中，体液样品为血液样品。在这种情况下，术语“样品”不仅旨在包括如直接从患者获得的血液，而且还包括血液的级分，比如血浆、血清、细胞级分(比如血小板、红细胞和淋巴细胞)、蛋白制备物、核酸制备物等。在一些实施方案中，体液可源自胃，例如胃分泌物、酸反流或呕吐物。在其他实施方案中，体液可为由胰腺或膀胱分泌的流体。在其他实施方案中，体液可为唾液、唾沫或食道冲洗液。在某些实施方案中，组织样品为取自胃肠道粘膜的活检。在其他实施方案中，组织样品为来自例如受试者食道的刷取物。
在一些实施方案中，生物样品为来自以下任何一种的样品：胃肠道、呼吸消化道、呼吸道、泌尿生殖道或体液。在某些这种实施方案中，体液为以下的任何一种：血液、尿液、痰液、唾液、粪便、胆汁、胰液、鼻腔分泌物、眼泪、精液、阴道分泌物、脑脊液、胸膜液、腹膜液、胃液、心包液、汗液、淋巴液、囊液、胰腺囊液、滑液、关节液、月经液、子宫内膜冲洗液、乳房抽吸液或羊水。在一些实施方案中，生物样品为来自以下任何一种的样品：食道、胃、结肠、小肠、胰腺、肝脏、口腔、口咽、气管、支气管树、肺部或乳房。
在一些实施方案中，生物样品为来自受试者的细胞、组织或器官的至少一部分。在一些实施方案中，样品为来自胃肠道的组织样品。在一些实施方案中，样品为来自上胃肠道的组织样品。在一些实施方案中，样品为来自下胃肠道的组织。在一些实施方案中，样品为来自食道的细胞或组织样品。在一些实施方案中，样品为来自胃的细胞或组织样品。在一些实施方案中，样品为来自肠的细胞或组织样品。在一些实施方案中，样品为来自结肠的细胞或组织样品。
在一些实施方案中，样品包含以下细胞类型中任何一种或多种的细胞：膀胱、胰腺上皮、胰腺α、胰腺β、胰腺内皮、骨髓淋巴母细胞、骨髓B淋巴母细胞、骨髓巨噬细胞、骨髓成红血细胞、骨髓树突状、骨髓脂肪细胞、骨髓骨细胞、骨髓软骨细胞、早幼粒细胞、骨髓原巨核细胞、膀胱、脑B淋巴细胞、脑神经胶质、神经元、脑星形胶质细胞、神经外胚层、脑巨噬细胞、脑小神经胶质、脑上皮、心肌细胞、皮质神经元、脑成纤维细胞、乳腺上皮、结肠上皮、结肠B淋巴细胞、食道上皮、乳腺上皮、乳腺肌上皮、乳腺成纤维细胞、结肠肠细胞、子宫颈上皮、卵巢上皮、卵巢成纤维细胞、乳腺导管上皮、舌上皮、扁桃体树突状、扁桃体B淋巴细胞、外周血淋巴母细胞、外周血T淋巴母细胞、外周血皮肤T淋巴细胞、外周血自然杀伤、外周血B淋巴母细胞、外周血单核细胞、外周血成髓细胞、外周血单核母细胞、外周血早幼粒细胞、外周血巨噬细胞、外周血嗜碱性粒细胞、肝脏内皮、肝脏肥大细胞、肝脏上皮、肝脏B淋巴细胞、脾内皮、脾上皮、脾B淋巴细胞、肝脏肝细胞、肝脏亚历山大、肝脏成纤维细胞、肺上皮、支气管上皮、肺成纤维细胞、肺B淋巴细胞、肺雪旺(Schwann)、肺鳞状、肺巨噬细胞、肺成骨细胞、神经内分泌、肺泡、胃上皮和胃成纤维细胞。
在一些实施方案中，样品包含一种或多种肿瘤细胞。在一些实施方案中，样品包含一种或多种化生细胞。在一些实施方案中，样品包含一种或多种癌细胞。在一些实施方案中，样品包含一种或多种癌细胞，其中癌细胞与以下癌症中的任何一种或多种相关：急性成淋巴细胞性白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia) (ALL)、急性髓细胞性白血病(AcuteMyeloid Leukemia) (AML)、肾上腺皮质癌(Adrenocortical Carcinoma)、儿童肾上腺皮质癌(Childhood Adrenocortical Carcinoma)、艾滋病相关型癌症卡波西肉瘤(AIDS-Related Cancers Kaposi Sarcoma) (软组织肉瘤)、艾滋病相关型淋巴瘤(AIDS-RelatedLymphoma) (淋巴瘤)、原发性CNS淋巴瘤(Primary CNS Lymphoma) (淋巴瘤)、肛门癌(AnalCancer)、阑尾癌(Appendix Cancer)、胃肠道类癌瘤(Gastrointestinal CarcinoidTumors)、星形细胞瘤(Astrocytomas)、脑癌(brain cancer)、非典型畸胎瘤样/横纹肌样瘤(Atypical Teratoid/Rhabdoid Tumor)、皮肤癌、基底细胞癌(Basal Cell Carcinoma)、胆管癌(Bile Duct Cancer)、膀胱癌、儿童膀胱癌(Childhood Bladder Cancer)、骨癌(BoneCancer)、尤文肉瘤(Ewing Sarcoma)和骨肉瘤(Osteosarcoma)和恶性纤维组织细胞瘤(Malignant Fibrous Histiocytoma)、脑肿瘤、乳腺癌、支气管肿瘤(Bronchial Tumors)、伯基特淋巴瘤(Burkitt Lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphoma)、类癌瘤(Carcinoid Tumor)、贲门癌(cardiac cancer)、原发性CNS淋巴瘤、宫颈癌(CervicalCancer)、胆管癌(Cholangiocarcinoma)、胆管癌(Bile Duct Cancer)、脊索瘤(Chordoma)、慢性淋巴细胞白血病(Chronic Lymphocytic Leukemia) (CLL)、慢性粒细胞白血病(Chronic Myelogenous Leukemia) (CML)、慢性骨髓增殖性肿瘤(ChronicMyeloproliferative Neoplasms)、结肠癌、结直肠癌(Colorectal Cancer)、颅咽管瘤(Craniopharyngioma)、皮肤T细胞淋巴瘤(Cutaneous T-Cell Lymphoma)、导管原位癌(Ductal Carcinoma In Situ) (DCIS)、子宫内膜癌(Endometrial Cancer)、子宫癌(Uterine Cancer)、室管膜瘤(Ependymoma)、食道癌(Esophageal cancer)、嗅神经母细胞瘤(Esthesioneuroblastoma)、头颈癌(Head and Neck Cancer)、尤文肉瘤、骨癌、颅外生殖细胞瘤(Extracranial Germ Cell Tumor)、性腺外生殖细胞肿瘤(Extragonadal GermCell Tumor)、眼癌、儿童眼内黑色素瘤(Childhood Intraocular Melanoma)、眼内黑色素瘤(Intraocular Melanoma)、视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma)、输卵管癌(FallopianTube Cancer)、恶性骨纤维组织细胞瘤(Fibrous Histiocytoma of Bone, Malignant)和骨肉瘤(Osteosarcoma)、胆囊癌(Gallbladder Cancer)、胃癌、胃肠道类癌瘤、卵巢癌、睾丸癌、妊娠滋养细胞疾病(Gestational Trophoblastic Disease)、毛细胞白血病(HairyCell Leukemia)、头颈癌、心脏肿瘤、肝癌(Liver Cancer)、霍奇金淋巴瘤(HodgkinLymphoma)、下咽癌(Hypopharyngeal Cancer)、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤(Islet CellTumors)、胰腺神经内分泌肿瘤(Pancreatic Neuroendocrine Tumors)、卡波西肉瘤(Kaposi Sarcoma)、软组织肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhans CellHistiocytosis)、喉癌(Laryngeal Cancer)、白血病(Leukemia)、唇和口腔癌(Lip andOral Cavity Cancer)、肺癌(非小细胞和小细胞)、淋巴瘤、男性乳腺癌(Male BreastCancer)、骨的恶性纤维组织细胞瘤(Malignant Fibrous Histiocytoma of Bone)和骨肉瘤、黑色素瘤(Melanoma)、皮肤癌、默克尔细胞癌(Merkel Cell Carcinoma)、间皮瘤(Mesothelioma)、转移性癌症(Metastatic Cancer)、原发灶隐匿的转移性鳞状颈癌(Metastatic Squamous Neck Cancer with Occult Primary)、中线束癌伴NUT基因改变(Midline Tract Carcinoma With NUT Gene Changes)、口腔癌(Mouth Cancer)、多发性内分泌肿瘤综合征(Multiple Endocrine Neoplasia Syndromes)、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤(Multiple Myeloma/Plasma Cell Neoplasms)、蕈样真菌病(Mycosis Fungoides)、骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic Syndromes)、骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤(Myelodysplastic/Myeloproliferative Neoplasms)、慢性髓系白血病(MyelogenousLeukemia, Chronic) (CML)、急性髓细胞性白血病(Myeloid Leukemia, Acute) (AML)、骨髓增生性肿瘤(Myeloproliferative Neoplasms)、鼻腔和副鼻窦癌(Nasal Cavity andParanasal Sinus Cancer)、鼻咽癌(Nasopharyngeal Cancer)、神经母细胞瘤(Neuroblastoma)、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer)、口腔癌、唇和口腔癌及口咽癌(Oropharyngeal Cancer)、骨肉瘤和骨的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状瘤病(Papillomatosis)、副神经节瘤(Paraganglioma)、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌(Parathyroid Cancer)、阴茎癌(Penile Cancer)、咽癌(PharyngealCancer)、嗜铬细胞瘤(Pheochromocytoma)、垂体瘤(Pituitary Tumor)、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤(Pleuropulmonary Blastoma)、妊娠和乳腺癌(Pregnancy andBreast Cancer)、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性腹膜癌(Primary PeritonealCancer)、前列腺癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma)、唾液腺癌(Salivary Gland Cancer)、肉瘤、儿童横纹肌肉瘤(Childhood Rhabdomyosarcoma)、儿童血管瘤(Childhood Vascular Tumors)、尤文肉瘤、卡波西肉瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤(Uterine Sarcoma)、塞泽里综合征(Sézary Syndrome)、小细胞肺癌(Small CellLung Cancer)、小肠癌、软组织肉瘤、皮肤鳞状细胞癌(Squamous Cell Carcinoma of theSkin)、原发灶隐匿的鳞状颈癌、胃癌、T细胞淋巴瘤(T-Cell Lymphoma)、睾丸癌(Testicular Cancer)、喉癌(Throat Cancer)、鼻咽癌、口咽癌、下咽癌、胸腺瘤(Thymoma)和胸腺癌(Thymic Carcinoma)、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌(Transitional CellCancer of the Renal Pelvis and Ureter)、尿道癌(Urethral Cancer)、子宫癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌和/或维尔姆斯肿瘤(Wilms Tumor)。在特定实施方案中，样品包含一种或多种食道癌细胞。在一些实施方案中，样品包含一种或多种结肠癌细胞。在一些实施方案中，样品包含一种或多种巴雷特食道细胞。
在一些实施方案中，样品包含来自怀疑患有本文公开的任何肿瘤形成(例如食道腺癌)、本文公开的任何癌症或本文公开的任何化生(例如巴雷特食道)的受试者的细胞和/或组织。或者，受试者可能正在经受常规筛查并且可能不一定被怀疑患有这种化生或肿瘤形成。
在一些实施方案中，受试者为人类受试者。在其他实施方案中，受试者为非人类动物。
在某些实施方案中，有可能直接在生物体中检测本文所述的生物标志物(例如DNA甲基化或蛋白表达水平)而无需获得生物材料的单独部分。在这种情况下，术语“样品”旨在涵盖与检测过程中涉及的试剂或装置接触的那部分生物材料。
在某些实施方案中，从体液样品获得包含感兴趣的靶基因的DNA。体液的实例为血液、唾液、唾沫或食道冲洗液。也可使用其他体液。由于它们可易于从受试者获得并可用于筛查多种疾病，因此血液或血液来源的级分可能尤其有用。血液来源的级分可包括血液、血清、血浆或其他级分。例如，通过在室温下以800倍的重力将5 ml全血离心10分钟，可将细胞级分制备为“血沉棕黄层”(即富含白细胞的血液部分)。红细胞沉降速度最快，并作为离心管中最底部的级分存在。血沉棕黄层作为红细胞顶部的乳白色薄层存在。血液的血浆部分在血沉棕黄层上方形成一层。也可以多种其他方式从血液中分离出级分。一种方法为从离心中使用的梯度中取出一个或多个级分，以富集特定大小或密度的细胞。
在一些实施方案中，DNA为从样品中分离的。在一些实施方案中，术语“生物样品”或“样品”用于指代从受试者的细胞样品或组织样品或体液样品或粪便样品中分离的DNA。用于从这种样品中分离DNA的程序为本领域技术人员众所周知的。通常，这种DNA分离程序包括使用例如去污剂裂解样品中存在的任何细胞。细胞裂解之后，通常使用各种蛋白酶从DNA中去除蛋白。使用RNA酶去除RNA。然后通常用苯酚提取DNA，将其在酒精中沉淀并溶解于水溶液中。
E. 使用方法
在一些实施方案中，本公开提供在本文公开的任何生物样品中保存本文公开的任何靶基因(或其片段)中的DNA甲基化模式的方法。在一些实施方案中，方法包括将本文公开的任何生物样品给予本文所述的任何储存溶液。在一些实施方案中，方法包括使本文公开的任何生物样品与本文所述的任何储存溶液混合。在一些实施方案中，方法包括用本文所述的任何储存溶液处理本文公开的任何生物样品。在一些实施方案中，方法包括将本文公开的任何生物样品储存于本文所述的任何储存溶液中。在一些实施方案中，方法包括将样品在储存溶液中储存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。在一些实施方案中，方法包括在-30℃至50℃范围内的温度下将样品储存于储存溶液中。在一些实施方案中，方法包括在-20℃至40℃范围内的温度下将样品储存于储存溶液中。在一些实施方案中，方法包括在-10℃至30℃范围内的温度下将样品储存于储存溶液中。在一些实施方案中，方法包括在0℃至25℃范围内的温度下将样品储存于储存溶液中。在一些实施方案中，方法包括在4℃至25℃范围内的温度下将样品储存于储存溶液中。在一些实施方案中，方法包括在-10℃至10℃范围内的温度下将样品储存于储存溶液中。在一些实施方案中，方法包括在15℃至25℃范围内的温度下将样品储存于储存溶液中。在一些实施方案中，方法包括在室温下将样品储存于储存溶液中。在一些实施方案中，方法包括在23℃下将样品在储存溶液中储存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。在一些实施方案中，方法包括在40℃下将样品在储存溶液中储存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。在一些实施方案中，方法包括在50℃下将样品在储存溶液中储存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。在一些实施方案中，方法包括在4℃下将样品在储存溶液中储存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。在一些实施方案中，方法包括在-10℃下将样品在储存溶液中储存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。在一些实施方案中，方法包括在-30℃下将样品在储存溶液中储存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。在一些实施方案中，方法包括在-30℃至50℃范围内的温度下将样品在储存溶液中储存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。
在一些实施方案中，储存样品储存于容器中。在一些实施方案中，容器为小瓶。在一些实施方案中，容器由玻璃制成。在一些实施方案中，容器由塑料制成。在一些实施方案中，容器由聚丙烯制成。在一些实施方案中，容器由聚苯乙烯制成。在一些实施方案中，容器能够容纳至少5 ml、10 ml、15 ml、20 ml、25 ml、30 ml、35 ml、40 ml、50 ml、75 ml或100ml的体积。在一些实施方案中，容器为离心小瓶。在一些实施方案中，如果样品通过球囊收集(例如如果获得食道样品)，则离心小瓶能够完全覆盖球囊和样品(当添加至小瓶中时)。在一些实施方案中，如果样品通过球囊收集(例如如果获得食道样品)，则离心小瓶能够完全覆盖球囊(当60%-70%满时)和样品(当添加至小瓶中时)。在特定实施方案中，离心小瓶为自立式30 ml聚丙烯管(参见例如Evergreen Scientific)。
在一些实施方案中，本公开提供一种包含本文公开的任何容器和本文公开的任何储存溶液的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含使用容器和储存溶液的说明。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含用于从受试者获得样品的仪器(例如球囊)。在特定实施方案中，试剂盒包含含有50:50甲醇:水的储存溶液。在进一步的实施方案中，试剂盒包含含有50:50甲醇:水的储存溶液，并且试剂盒进一步包含为30 ml聚丙烯离心小瓶的容器。
在一些实施方案中，一旦将本文公开的任何样品添加至包含本文公开的任何储存溶液的本文公开的任何容器中，便然后将容器置于包装中。在一些实施方案中，包装为封皮或盒子。在一些实施方案中，盒子为纸板盒。在一些实施方案中，包装包含邮寄标签。在一些实施方案中，盒子被运送至另一个地点进行样品分析。
在一些实施方案中，储存于本文所述的任何储存溶液中的任何样品可用于本文公开的任何方法中。在一些实施方案中，包含甲基化DNA的样品可用于检测差异性甲基化核苷酸序列的测定。在某些实施方案中，本申请提供用于检测差异性甲基化核苷酸序列(例如波形蛋白和/或CCNA1)的测定。因此，在一些实施方案中，处于其甲基化状态的差异性甲基化核苷酸序列可用作用于使用本文描述的各种方法以及鉴于本申请的教导完全在技术人员的能力范围内的方法进行检测的靶标。
在某些方面，用于检测甲基化核苷酸序列(例如波形蛋白和/或CCNA1)的这种方法基于用将非甲基化的C而不是甲基化的C (即5mC)转化为不同核苷酸碱基的化合物处理基因组DNA。一种这样的化合物为亚硫酸氢钠(在本文中也简称为“亚硫酸氢盐”)，其将C而不是5mC转化为U。用于DNA的亚硫酸氢盐处理的方法为本领域已知的(Herman等人, 1996,Proc Natl Acad Sci USA, 93:9821-6; Herman和Baylin, 1998, Current Protocols inHuman Genetics, N. E. A. Dracopoli, ed., John Wiley & Sons, 2:10.6.1-10.6.10;美国专利号5,786,146)。例如，当用亚硫酸氢钠处理含有未甲基化的C核苷酸的DNA分子成为化合物转化的DNA时，该DNA的序列会发生变化(C→U)。在转化的核苷酸序列中检测到U表明存在未甲基化的C。
随后可以多种方式检测化合物转化的核苷酸序列中存在的不同核苷酸碱基(例如U)。在一个特定实施方案中，本公开提供一种通过使用“甲基化敏感的PCR”(MSP)来检测化合物转化的DNA序列中的U的方法(参见例如Herman等人, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:9821-9826; 美国专利号6,265,171; 美国专利号6,017,704; 美国专利号6,200,756)。在MSP中，如果DNA内CpG二核苷酸中的C碱基被甲基化，则一组引物(即包含正向和反向引物)会扩增化合物转化的模板序列。这组引物被称为“甲基化特异性引物”。如果5’侧翼序列内CpG二核苷酸中的C碱基未甲基化，则另一组引物会扩增化合物转化的模板序列。这组引物被称为“未甲基化特异性引物”。
在MSP中，反应使用来自受试者样品的化合物转化的DNA。在对甲基化DNA的测定中，使用甲基化特异性引物。在其中DNA靶序列的CpG二核苷酸内的C被甲基化的情况下，甲基化特异性引物会在存在聚合酶的情况下扩增化合物转化的模板序列，并会产生MSP产物。如果DNA靶序列的CpG二核苷酸内的C未甲基化，则甲基化特异性引物不会在存在聚合酶的情况下扩增化合物转化的模板序列，并且不会产生MSP产物。在一些实施方案中，本文公开的任何亚硫酸氢盐转化的甲基化序列被用作特定适应症的标志物。
在一些实施方案中，运行对照反应以检测未甲基化DNA也是有用的。该反应使用来自受试者样品的化合物转化的DNA，并且使用未甲基化特异性引物。在其中DNA靶序列的CpG二核苷酸内的C未甲基化的情况下，未甲基化特异性引物会在存在聚合酶的情况下扩增化合物转化的模板序列，并会产生MSP产物。如果DNA靶序列的CpG二核苷酸内的C被甲基化，则未甲基化特异性引物不会在存在聚合酶的情况下扩增化合物转化的模板序列，并且不会产生MSP产物。请注意，生物样品通常会含有用甲基化特异性引物产生信号的肿瘤细胞和用未甲基化特异性引物产生信号的正常细胞元件两者的混合物。未甲基化特异性信号通常用作对照反应，但在这种情况下并不意味着如源自使用甲基化特异性引物的反应的阳性信号所示那样不存在肿瘤形成。
MSP反应的引物源自化合物转化的模板序列。在本文中，“源自”意指选择引物的序列使得引物在MSP反应中扩增化合物转化的模板序列。每个引物包含长度为至少8个核苷酸的单链DNA片段。在一些实施方案中，引物的长度小于50个核苷酸，或者在一些实施方案中，长度为15-35个核苷酸。由于化合物转化的模板序列可为用亚硫酸氢钠处理的双链DNA的Watson链或Crick链，因此引物的序列取决于在MSP中选择Watson还是Crick化合物转化的模板序列进行扩增。可选择Watson或Crick链进行扩增。
在一些实施方案中，化合物转化的模板序列以及因此的MSP反应产物的长度在20-3000个核苷酸之间。在其他实施方案中，MSP反应产物的长度在20-200个核苷酸之间。在其他实施方案中，MSP反应产物的长度在20-100个核苷酸之间。在其他实施方案中，MSP反应产物的长度在30-200个核苷酸之间。在其他实施方案中，MSP反应产物的长度在50-1000个核苷酸之间。在其他实施方案中，MSP反应产物的长度在50-100个核苷酸之间。在其他实施方案中，MSP反应产物的长度在50-200个核苷酸之间。在其他实施方案中，MSP反应产物的长度在50-500个核苷酸之间。在其他实施方案中，MSP反应产物的长度在80-150个核苷酸之间。在一些实施方案中，MSP反应产物的长度为至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个核苷酸。在一些实施方案中，甲基化特异性引物产生与未甲基化特异性引物产生的MSP产物不同长度的MSP产物。
可使用多种方法来确定是否在反应测定中产生了MSP产物。确定反应中是否产生了MSP产物的一种方式为通过琼脂糖凝胶电泳分析一部分反应。例如，制备0.6-2.0%琼脂糖的水平琼脂糖凝胶，并将一部分MSP反应混合物通过琼脂糖凝胶进行电泳。电泳之后，将琼脂糖凝胶用溴化乙锭染色。在紫外光照射期间观察凝胶时可见MSP产物。通过与标准化大小标志物进行比较，确定MSP产物是否具有正确的预期大小。
可使用其他方法来确定是否在MSP反应中制备了产物。一种这样的方法被称为“实时PCR”。实时PCR利用包含荧光计(即测量荧光的仪器)的热循环仪(即提供发生PCR反应所需的温度变化的仪器)。实时PCR反应混合物还含有一种试剂，其掺入到产物中可以量化并且其量化指示模板中的该序列的拷贝数。一种这样的试剂为荧光染料，被称为SYBR GreenI (Molecular Probes, Inc.; Eugene, Oregon)，其优先结合双链DNA，并且其荧光通过结合双链DNA得到大大增强。当在存在SYBR Green I的情况下进行PCR反应时，产生的DNA产物结合SYBR Green I并发出荧光。荧光由荧光计检测和量化。这种技术对于量化PCR反应中产物的量特别有用。另外，可通过使用与产物杂交的多种探针(包括TaqMan探针和分子信标)在“实时PCR”中定量来自PCR反应的产物。定量可在绝对基础上进行，或者可相对于组成型甲基化DNA标准品，或者可相对于未甲基化DNA标准品。在一种情况下，可构建甲基化衍生产物与未甲基化衍生产物的比率。
根据本公开的用于检测DNA甲基化的方法不限于MSP，并且可涵盖用于检测DNA甲基化的任何测定。检测DNA甲基化的另一种实例方法为使用“甲基化敏感性”限制性核酸内切酶。这种方法包括用甲基化敏感性限制性核酸内切酶处理从受试者分离的基因组DNA，并然后使用限制性核酸内切酶处理的DNA作为PCR反应中的模板。在本文中，如果识别序列内的C碱基未甲基化，则甲基化敏感性限制性核酸内切酶识别并切割DNA内的特定序列。如果限制性核酸内切酶的识别序列内的C碱基被甲基化，则DNA不会被切割。这种甲基化敏感性限制性核酸内切酶的实例包括但不限于HpaII、SmaI、SacII、EagI、BstUI和BssHII。在该技术中，甲基化敏感性限制性核酸内切酶的识别序列位于模板DNA内，处于用于PCR反应的正向和反向引物之间的位置。在甲基化敏感性限制性核酸内切酶识别序列内的C碱基未甲基化的情况下，核酸内切酶会切割DNA模板，并且当DNA被用作PCR反应中的模板时不会形成PCR产物。在甲基化敏感性限制性核酸内切酶识别序列内的C碱基被甲基化的情况下，核酸内切酶不会切割DNA模板，并且当DNA被用作PCR反应中的模板时会形成PCR产物。因此，C碱基的甲基化可通过PCR产物的存在与否来确定(Kane等人, 1997, Cancer Res, 57:808-11)。在特定实施方案中，在该技术中不使用亚硫酸氢钠。
检测DNA甲基化的仍然另一种示例性方法被称为修饰的MSP，该方法利用以下引物，其经设计和选择，使得MSP反应的产物易于被限制性核酸内切酶消化，这取决于化合物转化的模板序列是否含有CpG二核苷酸或UpG二核苷酸。
用于检测DNA甲基化的仍然其他方法包括MS-SnuPE方法。该方法在引物延伸反应中使用化合物转化的DNA作为模板，其中使用的引物产生产物，这取决于化合物转化的模板是否含有CpG二核苷酸或UpG二核苷酸(参见例如Gonzalgo等人, 1997, Nucleic Acids Res., 25:2529-31)。
检测DNA甲基化的另一种示例性方法被称为COBRA (即联合亚硫酸氢盐限制性分析)。该方法已常规用于DNA甲基化检测，并且为本领域众所周知的(参见例如Xiong等人,1997, Nucleic Acids Res, 25:2532-4)。在该技术中，如果识别序列内的C碱基被甲基化，则甲基化敏感性限制性核酸内切酶识别并切割DNA内的特定序列。如果限制性核酸内切酶的识别序列内的C碱基未甲基化，则DNA将不会被切割。在一些实施方案中，方法利用甲基化敏感性限制性核酸内切酶。
检测DNA甲基化的另一种示例性方法需要使化合物转化的DNA与阵列杂交，所述阵列包括与源自甲基化模板的序列杂交的探针。
检测DNA甲基化的另一种示例性方法包括用结合甲基化DNA的抗体或用结合甲基化DNA的其他蛋白沉淀甲基化DNA，并然后检测沉淀中的DNA序列。DNA的检测可通过基于PCR的方法、通过与阵列杂交或通过本领域技术人员已知的其他方法完成。
检测DNA甲基化的另一种示例性方法为通过如对亚硫酸氢盐转化的DNA进行的定量等位基因特异性实时靶标和信号扩增(QuARTS) (参见例如Zou等人, 2012, Clin. Chem., 58:375-83)。
检测DNA甲基化的另一种示例性方法为通过单分子实时测序(SMRT)和基于纳米孔的DNA测序，其可直接检测通过甲基化修饰的DNA碱基(参见例如Beaulerier等人, Nat RevGenet, 2019, 20:157-172.)。在某些情况下，SMRT可在Pacific Biosciences (PacBio)制造的仪器上进行(参见例如https://www.pacb.com/smrt-science/smrt-sequencing/epigenetics/)。
检测甲基化DNA的另一种示例性方法为亚硫酸氢盐测序，其涉及使用扩增衍生自甲基化和未甲基化模板两者的转化的DNA的甲基化无关PCR引物扩增亚硫酸氢盐转化的DNA的靶区域。甲基化无关引物通常被设计为甲基化无关且亚硫酸氢盐特异，即仅扩增亚硫酸氢盐转化的靶DNA而不扩增非转化的靶序列。在一些实施方案中，扩增的DNA然后可通过下一代测序方法表征，所述方法允许在每个DNA序列读数内评价初始模板中的每个胞嘧啶碱基存在甲基化(保留胞嘧啶)或不存在甲基化(转化为胸苷)。初始模板中每个胞嘧啶碱基处的甲基化百分比可然后通过其中胞嘧啶被保存为胞嘧啶相对于转化为胸苷的DNA读数的百分比来计算。类似地，在感兴趣区域的甲基化百分比可通过确定在单个DNA读数中将该区域评价为甲基化或未甲基化的规则(即确定该区域中将该区域归类为“甲基化”的甲基化的截止值)，并然后确定其中该区域符合甲基化条件的DNA读数百分比来评价。
在某些实施方案中，本公开提供的方法涉及直接对由MSP反应产生的产物进行测序以确定化合物转化的模板序列是否含有CpG二核苷酸或UpG二核苷酸。分子生物学技术(比如直接对PCR产物进行测序)为本领域众所周知的。
在一些实施方案中，DNA的甲基化可测量为总DNA的百分比。高水平的甲基化可为1-100%甲基化，例如1%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%甲基化。低水平的甲基化可为0%-0.99%甲基化，例如0%、0.1%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%。至少一些正常组织(例如正常食道样品)可能没有任何可检测的甲基化。
在一些实施方案中，储存于本文公开的任何储存溶液中的甲基化DNA可编码例如可用作肿瘤抑制基因的多肽。因此，本申请进一步提供用于检测样品中这种多肽的方法。在一些实施方案中，本公开提供通过测定这种多肽以确定患者是否患有疾病状况的检测方法。进一步地，这种疾病状况的特征可为这种多肽的水平降低。在某些实施方案中，本公开提供通过检测这种多肽来确定患者是否可能患有癌症的方法。在进一步的实施方案中，本公开提供用于确定患者是否正在复发或确定患者的癌症是否对治疗有反应的方法。
任选地，这种方法涉及获得样品中蛋白的定量测量。鉴于本说明书，本领域的技术人员将认识到可用于检测和任选地定量蛋白存在的广泛范围的技术。在一些实施方案中，用抗体检测蛋白。在许多实施方案中，基于抗体的检测测定涉及使样品和抗体接触，使得抗体有机会与具有相应表位的蛋白结合。在许多实施方案中，基于抗体的检测测定一般还涉及用于检测抗体-表位复合物的存在，从而实现对具有相应表位的蛋白的存在的检测的系统。抗体可用于多种检测技术，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、Western印迹。也可采用用于鉴定蛋白的不依赖抗体的技术。例如质谱(特别是与液相色谱结合使用)可检测和量化样品中的大量蛋白。二维凝胶电泳也可用于鉴定蛋白，并可与质谱或其他检测技术(比如N-末端蛋白测序)结合使用。还可生成与感兴趣的蛋白具有特异性结合的RNA适体并将其用作检测试剂。通常应以与待采用的检测系统相符的方式制备样品。例如，待用于蛋白检测系统的样品通常应在不存在蛋白酶的情况下制备。同样地，待用于核酸检测系统的样品通常应在不存在核酸酶的情况下制备。在许多情况下，用于基于抗体的检测系统的样品不会进行大量的准备步骤。例如，可直接使用尿液，也可直接使用唾液和血液，尽管在某些实施方案中，血液被分离成级分(比如血浆和血清)。
在某些实施方案中，本公开的方法包括在储存于本文公开的任何储存溶液中的任何样品中检测表达的核酸(比如mRNA)的存在。任选地，方法涉及获得样品中表达的核酸的定量测量。鉴于本说明书，本领域的技术人员将认识到可用于检测和任选地定量核酸存在的广泛范围的技术。核酸检测系统通常涉及制备样品的纯化的核酸级分，并使样品进行直接检测测定或者进行扩增过程然后进行检测测定。例如，可通过聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶(RT)和偶联RT-PCR来实现扩增。核酸的检测通常通过用与感兴趣的核酸杂交的探针探测纯化的核酸级分来完成，并且在许多情况下，检测也涉及扩增。Northern印迹、斑点印迹、微阵列、定量PCR和定量RT-PCR均为用于检测样品中核酸的众所周知的方法。
在某些实施方案中，本公开提供与来自储存于本文公开的任何储存样品中的任何样品的任何核酸特异性地结合的核酸探针。在一些实施方案中，本公开提供与从来自储存于本文公开的任何储存样品中的任何样品的DNA (其可任选地用试剂比如亚硫酸氢盐预处理)扩增的核酸特异性地结合的核酸探针。这种探针可用例如荧光部分、放射性核素、酶或亲和标签(比如生物素部分)进行标记。例如，TaqMan®系统采用核酸探针，其以使得当探针在溶液中游离时荧光信号被淬灭，而当探针掺入到更大的核酸中时荧光信号变亮的方式被标记。
使用针对甲基化DNA (例如储存于本文所述的任何储存溶液中的甲基化DNA)或甲基化DNA的扩增子(或例如用亚硫酸氢盐预处理的DNA的扩增子)的单克隆抗体的免疫闪烁显像可用于检测和/或诊断癌症。例如，用锝99、铟111、碘125标记的针对甲基化靶基因(或其亚硫酸氢盐转化的扩增子)的单克隆抗体可有效地用于这种成像。如对技术人员显而易见的，要给予的放射性同位素的量取决于放射性同位素。本领域的普通技术人员可基于用作活性部分的给定放射性核素的比活度和能量而容易地配制待给予的显像剂的量。一般地给予0.1-100毫居里/剂显像剂，1-10毫居里或者通常2-5毫居里/剂显像剂。因此，包含与放射性部分缀合的靶向部分的可用作显像剂的本发明组合物，包含0.1-100毫居里，在一些实施方案中为1-10毫居里，在一些实施方案中为2-5毫居里，在一些实施实施中为1-5毫居里。
在一些实施方案中，本公开提供用于检测本文公开的任何靶基因或其片段或互补物的甲基化状态的装置。在一些实施方案中，本公开提供包含用于检测本文公开的靶基因或其片段或互补物的甲基化状态的组分的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含用于从受试者收集食道样品的可吞咽球囊。在一些实施方案中，试剂盒包含公布的美国申请2016/317132中公开的任何可吞咽球囊装置，所述申请以其全部结合至本文中。在一些实施方案中，本公开提供包含用于扩增本文所述的任何靶基因的引物和用于实施本文公开的任何方法的说明的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含亚硫酸氢盐。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含适合于从受试者收集样品的物品(例如刷子和/或球囊)。在一些实施方案中，本公开提供包含本文公开的任何治疗剂和用于实施本文公开的任何治疗方法的说明的试剂盒。
可使用多种测定形式，并且根据本公开，本文中未明确描述的那些测定形式仍被认为在本领域普通技术人员的能力范围内。测定形式可概略估算状况比如蛋白表达水平、核苷酸序列的甲基化状态、肿瘤抑制活性，并且可以许多不同形式产生。在许多实施方案中，本公开提供的测定包括无细胞系统和利用完整细胞的基于细胞的测定两者。
在一些实施方案中，本公开提供通过确定来自受试者的样品中的靶基因的甲基化程度是否高于参考靶基因来诊断受试者患有肿瘤形成(例如食道癌)或化生(例如巴雷特食道)的方法。在一些实施方案中，如果靶基因的甲基化程度与参考靶基因相比较高至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%，则确定受试者患有肿瘤形成或化生。在一些实施方案中，参考靶基因来自健康对照受试者。
在一些实施方案中，本公开提供用于选择受试者经受治疗或诊断程序(比如内窥镜检查)的方法。在一些实施方案中，本公开提供通过将受试者鉴定为处于具有食道化生(例如巴雷特食道)或肿瘤形成(例如食道癌)的增加风险下来选择受试者经受内窥镜检查的方法。
除诊断之外，对来自未知患有(例如上胃肠道的)化生或肿瘤形成的受试者的样品中标志物的测定可对受试者为预后的(即指示疾病的可能过程)。例如，具有发展上胃肠道化生或肿瘤形成的倾向的受试者可能具有甲基化的核苷酸序列。来自受试者的样品中甲基化靶基因(例如波形蛋白和/或CCNA1)的测定也可用于选择对例如受试者中上胃肠道的肿瘤形成或化生特别有效的一种或多种特定疗法，或者用于排除不太可能有效的疗法。
在来自已知患有或曾经患有癌症的受试者的样品中测定甲基化靶基因(例如波形蛋白和/或CCNA1)也是有用的。例如，本方法可用于鉴定疗法对某些受试者是否有效。一个或多个样品在治疗之前和之后取自同一受试者并储存于本文公开的任何储存溶液中，且测定靶基因的甲基化模式。靶基因在治疗之前采集的样品中被甲基化而治疗之后不存在(或处于较低水平)的发现可能表明治疗有效且无需改变。在其中治疗之前采集的样品和治疗之后采集的样品中靶基因被甲基化的那些情况下，可能期望改变治疗以增加受试者中癌症减少的可能性。因此，本方法可避免对实施用于确定患者对疗法的反应的更具侵入性程序的需要。
晚期癌症患者在治疗后癌症频繁地复发。在这种和其他情况下，本发明的测定可用于随着时间的推移监测与位于本文公开的任何靶基因中的基因沉默相关的癌症状态。在一些实施方案中，对于癌症正在进展的受试者，当采集第一样品时在一些或所有样品中可能没有DNA甲基化，并然后当采集第二样品时DNA甲基化出现于一个或多个样品中。在一些实施方案中，对于癌症正在消退的受试者，当采集第一样品时可能在一个或多个样品中存在DNA甲基化，并然后当采集第二样品时，在这些样品中的一些或所有中不存在DNA甲基化。
范例
现对本发明进行一般性描述，通过参考以下实施例将更易于理解，包括这些实施例仅用于说明本发明的某些方面和实施方案的目的，并且不旨在限制本发明。
实施例1
不同液体介质用于保存DNA甲基化模式的特性如通过亚硫酸氢盐测序在两个基因组区域测定的那样进行探究，这些区域已被证明在巴雷特食道和巴雷特相关肿瘤形成中显示差异甲基化，并分别映射到波形蛋白和CCNA1基因组区域(Moinova等人, Sciencetranslational medicine, 2018;10(424), PMCID: PMC5789768)。DNA甲基化百分比被评价为在波形蛋白差异性甲基化区域内10个CpG位点中的≥ 8个处显示胞嘧啶甲基化或在CCNA1差异性甲基化区域内21个CpG位点中的≥ 16个处显示胞嘧啶甲基化的单个DNA序列读数的百分比，如Moinova等人所述。为了开展这项研究，从对这两个基因组基因座处的异常甲基化先前表征为完全甲基化(H1975)或未甲基化(SKGT4)的两种癌细胞系制备细胞混合物。
将来自完全甲基化细胞系的1%细胞和来自未甲基化细胞系的99%细胞的主混合物沉淀，并通过以下方式处理不同的一式两份等分试样：
a) 在室温下添加100%甲醇(表示为“100% MeOH”)。选用不含过氧化物的甲醇溶液(Fisher, Cat# BP1105-4, 过氧化物≤ 0.001%)；
b) 在室温下添加50%甲醇和50%水的混合物(表示为“50% MeOH”)。选用不含过氧化物的甲醇溶液(Fisher, Cat# BP1105-4, 过氧化物≤ 0.001%)以及UltraPure不含DNA酶/RNA酶蒸馏水(Invitrogen, Cat# 10977-015)；
c) 在室温下添加商业细胞样品保存剂CytoLyt，其由甲醇、水以及镁盐、钠盐、钾盐、醋酸盐和氯化物组成(表示为“cytolyt”)；
d) 添加冷藏至4℃的商业细胞样品保存剂CytoLyt (表示为“cytolyt 4deg”)；
e) 快速冷冻(表示为“冷冻”)；
f) 添加中性缓冲福尔马林(表示为“NBF”)；
g) 在室温下添加商业细胞样品保存剂PreservCyt，其由甲醇、水、EDTA二钠盐和冰醋酸组成(表示为“preservecyt”)；或者
h) 在室温下添加DNA/RNA Shield，一种由Zymo Research商业生产的DNA/RNA稳定溶液(表示为“shield”)。
在DNA提取之前，将细胞在以上条件a)-h)下保持一段时间，所述一段时间包括：0时间、3天、7天、14天和21天(如图1A和1B中分别用表示为0、3、7、14、21的符号所示)。然后测定从细胞混合物中提取的DNA在波形蛋白差异性甲基化区域(VIM，如图1A所示)和CCNA1差异性甲基化区域(CCNA1，如图1B所示)内的胞嘧啶甲基化，如Moinova等人所述，测试来自每种亚硫酸氢盐转化的DNA的7个重复等分试样。另外，为用室温CytoLyt处理的细胞和用中性缓冲福尔马林处理的细胞制备一式两份等分试样，使用蛋白酶K过夜消化或用每天添加的新鲜蛋白酶K延长消化另外48小时处理进行DNA提取。用蛋白酶K延长消化处理的样品分别表示为“cytolyt更长的消化”和“NBF更长的消化”。
如图1A和1B所示，对于从冷冻细胞中提取的DNA，波形蛋白和CCNA1差异性甲基化区域两者的甲基化值在对保持于冷冻状态相同时间段的细胞进行的多项测定中高度可重现。对于保持于冷冻状态0-14天(对于波形蛋白基因相关甲基化)或0-21天(对于CCNA1基因相关甲基化)的细胞，这些值也跨时间地高度稳定且可重现。来自已用基于甲醇的缓冲液(100%甲醇或50%甲醇)处理和储存于其中的细胞的DNA，也显示出波形蛋白差异性甲基化区域中甲基化的高度可重现值，并且这些值在21天的时间过程中出人意料地甚至比来自冷冻储存的细胞的值更稳定。另外，来自已用基于甲醇的缓冲液(100%甲醇或50%甲醇)处理和储存于其中的细胞的DNA也显示出CCNA1差异性甲基化区域中甲基化的高度可重现值，在21天时间过程中出人意料地与从冷冻储存的细胞中获得的值高度相似。来自已用DNA/RNAShield处理和储存于其中的细胞的DNA也显示出波形蛋白和CCNA1差异性甲基化区域中甲基化的高度可重现值，在第3天到第21天时间过程中与从冷冻储存的细胞中获得的值高度相似。用DNA/RNA Shield处理的细胞的第0天时间点源自单独的细胞制备物，并且因此无法与研究中的任何其他数据点直接比较。
与来自冷冻细胞和来自用基于甲醇的缓冲液处理和储存于其中的细胞的DNA形成对比，来自用CytoLyt或PreservCyt处理的细胞的DNA在波形蛋白和CCNA1差异性甲基化区域两者上在21天时间过程中显示出所测量DNA甲基化值的明显的时间依赖性增加。约3倍的这种表观DNA甲基化随着时间的推移增加，还伴随着DNA甲基化值变异性的时间依赖性增加。如果细胞在4℃下用CytoLyt处理和储存于其中，则可防止在环境温度下用CytoLyt处理和储存于其中的细胞中观察到的DNA甲基化值的水平和变异性增加。用CytoLyt处理和储存于其中的细胞的DNA甲基化的测得水平在其中使用以蛋白酶K过夜相对于延长消化提取DNA的细胞之间未见差异。
此外，与来自冷冻细胞和来自用基于甲醇的缓冲液处理和储存于其中的细胞的DNA中的发现形成对比，用中性缓冲福尔马林处理和储存于其中的细胞的DNA甲基化水平在重复样品之间显示出很大差异，并且在使用以蛋白酶K过夜消化或延长消化提取DNA的细胞中均可见这种重现性缺乏。
因此，在基于甲醇的缓冲液(100%甲醇和50%甲醇)中或用DNA/RNA Shield处理和储存细胞，提供了随着时间的推移对DNA甲基化进行可重现测量的优越性，并使得可在环境温度下处理和储存细胞。
实施例2
在一项单独研究中，将来自未甲基化细胞系的细胞沉淀，并通过以下方式处理不同的一式两份等分试样：
a) 在室温下添加100%甲醇(表示为“100% MeOH”)。选用不含过氧化物的甲醇溶液(Fisher, Cat# BP1105-4, 过氧化物≤ 0.001%)；
b) 在室温下添加50%甲醇50%水的混合物(表示为“50% MeOH”)。选用不含过氧化物的甲醇溶液(Fisher, Cat# BP1105-4, 过氧化物≤ 0.001%)以及UltraPure不含DNA酶/RNA酶蒸馏水(Invitrogen, Cat# 10977-015)；
c) 在室温下添加商业细胞样品保存剂CytoLyt，其由甲醇、水以及镁盐、钠盐、钾盐、醋酸盐和氯化物组成(表示为“cytolyt”)；
d) 添加冷藏至4℃的商业细胞样品保存剂CytoLyt (表示为“cytolyt 4deg”)；
e) 快速冷冻(表示为“冷冻”)；
f) 添加中性缓冲福尔马林(表示为“NBF”)；
g) 在室温下添加商业细胞样品保存剂PreservCyt，其由甲醇、水、EDTA二钠盐和冰醋酸组成(表示为“preservecyt”)；或者
h) 在室温下添加DNA/RNA Shield，一种由Zymo Research商业生产的DNA/RNA稳定溶液(表示为“shield”)。
然后在DNA提取之前，将细胞在以上条件a)-h)下保持一段时间，所述一段时间包括：0时间、3天、7天、14天和21天(如图2A和2B中分别表示为0、3、7、14、21的符号所示)。然后测定从细胞混合物中提取的DNA在波形蛋白差异性甲基化区域(VIM，如图2A所示)和CCNA1差异性甲基化区域(CCNA1，如图2B所示)内的胞嘧啶甲基化，如上所述，测试来自每种亚硫酸氢盐转化的DNA的7个重复等分试样。另外，还对用室温CytoLyt处理的细胞和用中性缓冲福尔马林处理的细胞进行了一式两份实验，其中通过用每天添加的新鲜蛋白酶K将蛋白酶K消化延长另外48小时来延长DNA提取的过程。这些样品分别表示为“cytolyt更长的消化”和“NBF更长的消化”。
如图2A和2B所示，在室温下用CytoLyt处理的细胞和用中性缓冲福尔马林处理的细胞均在波形蛋白差异性甲基化区域内显示出表观DNA甲基化的乱真信号的时间依赖性发展。在用CytoLyt处理和储存于其中的细胞的DNA甲基化测量水平中检测到这种相同的异常信号，在用蛋白酶K过夜消化之后从所述细胞中提取DNA或在用蛋白酶K延长消化之后从所述细胞中提取DNA。相比之下，出人意料的是，在来自用室温的基于甲醇的缓冲液(100%甲醇或50%甲醇)处理和储存于其中的细胞或在用DNA/RNA Shield处理和储存于其中的细胞的DNA中未检测到乱真甲基化信号。
实施例3
在进一步的研究中，制备了一组来自完全甲基化细胞系和来自未甲基化细胞系的细胞的主混合物，以具有0%、0.25%、0.5%、1%、2%和4%的甲基化细胞代表。将细胞混合物沉淀，并通过以下方式处理来自每个条件的不同的一式两份等分试样：
a) 在室温下添加100%甲醇(表示为“100% MeOH”)。选用不含过氧化物的甲醇溶液(Fisher, Cat# BP1105-4, 过氧化物≤ 0.001%)；
b) 在室温下添加50%甲醇50%水的混合物(表示为“50% MeOH”)。选用不含过氧化物的甲醇溶液(Fisher, Cat# BP1105-4, 过氧化物≤ 0.001%)以及UltraPure不含DNA酶/RNA酶蒸馏水(Invitrogen, Cat# 10977-015)；
c) 在室温下添加商业细胞样品保存剂CytoLyt，其由甲醇、水以及镁盐、钠盐、钾盐、醋酸盐和氯化物组成(表示为“cytolyt”)；
d) 在室温下添加DNA/RNA Shield，一种由Zymo Research商业生产的DNA/RNA稳定溶液(表示为“shield”)。
沉淀并通过以下方式处理：
e) 快速冷冻(表示为“冷冻”)；
f) 添加中性缓冲福尔马林(表示为“NBF”)；或者
g) 在室温下添加商业细胞样品保存剂PreservCyt，其由甲醇、水、EDTA二钠盐和冰醋酸组成(表示为“preservcyt”)。
独立地制备每种混合物的生物学重复，并通过快速冷冻(表示为“冷冻(Exp0)”)处理沉淀的细胞。
在以上条件a)-g)下温育7天之后，从每个细胞混合物中提取DNA，并然后如图3A和3B所示测定波形蛋白差异性甲基化区域(VIM，如图3A所示)和CCNA1差异性甲基化区域(CCNA1，如图3B所示)内的胞嘧啶甲基化，如上所述，对来自每种亚硫酸氢盐转化的DNA的8个重复等分试样进行测试。
与冷冻细胞相比较，已用CytoLyt、PreservCyt或中性缓冲福尔马林处理和储存于其中的细胞显示出最大的甲基化值偏差，并且在样品重复之间也显示出DNA甲基化水平测量的最大的变异性。用基于甲醇的缓冲液(100%甲醇或50%甲醇)处理和储存于其中的细胞或用DNA/RNA Shield处理和储存于其中的细胞显示出DNA甲基化水平测量的最大可重现性和与冷冻细胞中DNA甲基化测量的最大一致性。注意到的一个离群值为在已用100%甲醇处理和储存于其中的含有4%甲基化细胞的混合物中测量的CCNA1差异性甲基化区域中观察到的甲基化水平增加。在波形蛋白差异性甲基化区域或含有0-2%之间甲基化细胞的任何其他混合物中未观察到这种行为。
实施例4
在进一步的研究中，比较了在不同保存剂缓冲液中于21天时间过程中温育的细胞中DNA甲基化标记的保存情况。使用在Vim和CCNA1基因座两者处完全未甲基化(0%甲基化)的细胞系(H1975)或使用与在Vim和CCNA1基因座两者处完全甲基化的第二细胞系(SKGT4)混合的未甲基化细胞系进行研究，甲基化细胞以0.25%、0.5%或1.0%的贡献混合。细胞混合物在室温下于包括以下的不同缓冲液中进行温育：50%甲醇50%水的混合物、CytoLyt (由甲醇、水以及镁盐、钠盐、钾盐、醋酸盐和氯化物组成；表示为“cytolyt”)或DNA/RNA Shield(由Zymo Research商业生产的DNA/RNA稳定溶液；表示为“shield”)。对于50%甲醇50%水的混合物，选用不含过氧化物的甲醇溶液(Fisher, Cat# BP1105-4, 过氧化物≤ 0.001%)以及UltraPure不含DNA酶/RNA酶蒸馏水(Invitrogen, Cat# 10977-015)。在1小时(指定为第0天)、7天或21天的时间过程中温育细胞。在每次温育结束时，将细胞沉淀并提取DNA。在进入到研究中1小时时，将比较组细胞直接从细胞培养基中沉淀出来，在-80℃下冷冻，并立即或在-80℃下7天之后或在-80℃下21天之后对DNA进行处理。然后按照如Moinova等人所述的程序，通过亚硫酸氢盐测序测定波形蛋白和CCNA1基因座处的DNA甲基化水平。每个条件由一式两份细胞样品代表，并且每个细胞样品在4个重复的亚硫酸氢盐测序测定中进行测试。图4A和4B显示出波形蛋白差异性甲基化区域(VIM，如图4A所示)和CCNA1差异性甲基化区域(CCNA1，如图4B所示)内每种条件的结果。在所有条件下的第0天，在来自0%甲基化样品的样品中未检测到Vim或CCNA1甲基化，并且在具有0.25%、0.5%和1%甲基化细胞混合物的样品中观察到甲基化水平逐渐增加。在21天时间过程中进行检查时，于CytoLyt中温育的样品在波形蛋白(Vim)和CCNA1基因座处显示出甲基化水平的明显的时间依赖性增加，从第0天到第7天再到第21天增加，并影响具有0.25%、0.5%或1%甲基化细胞系混合物的样品。在于50%甲醇缓冲液中温育的样品中，这种影响高度降低。在于DNA/RNA Shield中温育的样品或保持于-80℃的冷冻样品中，未观察到DNA甲基化随着时间推移的增加。即使在来自完全未甲基化细胞系的细胞中的Vim基因座处，在21天时也观察到通过在CytoLyt中温育产生的甲基化信号增加。
实施例5
在进一步的研究中，比较了在于一系列甲醇浓度的缓冲液中温育的细胞中DNA甲基化标记的保存情况。还比较了在于一系列不同温度的不同缓冲液中温育的细胞中DNA甲基化标记的保存情况。使用在Vim和CCNA1基因座处均完全未甲基化(0%甲基化)的细胞系或者使用与在Vim和CCNA1基因座处均完全甲基化的细胞系的1%贡献混合的未甲基化细胞系(1%)进行研究。将来自0%和1%组的细胞混合物在DNA/RNA Shield(一种由Zymo Research商业生产的DNA/RNA稳定溶液；表示为“shield”)中进行温育，或在含有以下的甲醇加水缓冲混合物中进行温育：40%甲醇、50%甲醇或60%甲醇。选用不含过氧化物的甲醇溶液(Fisher,Cat# BP1105-4, 过氧化物≤ 0.001%)以及UltraPure不含DNA酶/RNA酶蒸馏水(Invitrogen, Cat# 10977-015)。将样品在包括以下的一系列温度的每种缓冲混合物中温育1周：-20℃、4℃、室温、37℃和50℃。在每个以上温度下温育一周后，将所有样品在室温下进一步温育2周。在21天完整温育期结束时，将细胞沉淀并提取DNA。在DNA提取之前，将比较组样品(表示为第0天样品)在每种以上缓冲液中于室温下温育仅1小时。另一比较组样品(表示为冷冻样品)在进入到研究中1小时时直接从细胞培养基中沉淀出来，在-80℃下冷冻，并在-80℃下21天之后对DNA进行处理。然后按照如Moinova等人所述的程序，通过亚硫酸氢盐测序测定波形蛋白和CCNA1基因座处的DNA甲基化水平。每个条件由一式两份细胞样品代表(除甲醇缓冲液的4个重复样品之外)，并且每个细胞样品在6个重复的亚硫酸氢盐测序测定中进行测试。图5A和5B显示对在不同缓冲液组合物中在第0天样品中波形蛋白差异性甲基化区域(VIM，如图5A所示)和CCNA1差异性甲基化区域(CCNA1，如图5B所示)内的研究结果。对于未甲基化细胞系样品(其中甲基化值均接近基线值)和在1%输入甲基化细胞的混合物两者，在第0天，温育1小时之后，所有缓冲液组合物(40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、DNA/RNA Shield)在Vim和CCNA1基因座处显示出与冷冻样品基本上相同的甲基化值分布。图6A和6B显示对全部第21天样品(其中存在甲基化细胞的1%混合物)中波形蛋白差异性甲基化区域(VIM，如图6A所示)和CCNA1差异性甲基化区域(CCNA1，如图6B所示)内的甲基化值测定的研究结果。在甲醇加水混合物中温育的样品在40%、50%和60%的一系列甲醇浓度下表现几乎相同。此外，在所有甲醇加水缓冲液中，甲基化值在范围为-20℃至高达50℃的整个测试温度范围内均为稳定的。最后，图7A和7B显示对全部第21天样品(仅由未甲基化细胞组成)中波形蛋白差异性甲基化区域(VIM，如图7A所示)和CCNA1差异性甲基化区域(CCNA1，如图7B所示)内的甲基化值测定的研究结果。通常，这些样品中的甲基化低至不存在。
序列表
SEQ ID NO: 1-示例性波形蛋白核苷酸序列(对应于Hg19坐标：chr10:17,270,838-17,271,183)
tctgagggat tccttactct ttcctcttcc cgctcctttg cccgcgggtc tccccgcctg
accgcagccc cgaggccgcc gcgcacctcc tcccacgccc ctttggcgtg gtgccaccgg
acccctctgg ttcagtccca ggcggacccc cccctcaccg cgcgaccccg cctttttcag
caccccaggg tgagcccagc tcagactatc atccggaaag cccccaaaag tcccagccca
gcgctgaagt aacgggacca tgcccagtcc cacgccccgg agcaggaagg ctcgaggcgc
ccccacccca cccgcccacc ctccccgctt ctcgctaggt cccga
SEQ ID NO: 2-示例性波形蛋白核苷酸序列(对应于Hg19坐标：chr10: chr10:17,271,348-17,271,717)
ccctcgttcg cctcttctcc gggagccagt ccgcgccacc gccgccgccc aggccatcgc
caccctccgc agccatgtcc accaggtccg tgtcctcgtc ctcctaccgc aggatgttcg
gcggcccggg caccgcgagc cggccgagct ccagccggag ctacgtgact acgtccaccc
gcacctacag cctgggcagc gcgctgcgcc ccagcaccag ccgcagcctc tacgcctcgt
ccccgggcgg cgtgtatgcc acgcgctcct ctgccgtgcg cctgcggagc agcgtgcccg
gggtgcggct cctgcaggac tcggtggact tctcgctggc cgacgccatc aacaccgagt
tcaagaacac
SEQ ID NO: 3-示例性波形蛋白核苷酸序列
gcttcctgga gcagcagaat aagatcctgc tggccgagct cgagcagctc aagggccaag
gcaagtcgcg cctaggggac ctctacgagg aggagatgcg ggagctgcgc cggcaggtgg
accagctaac caacgacaaa gcccgcgtcg aggtggagcg cgacaacctg gccgaggaca
tcatgcgcct ccgggagaag taaggctgcg cccatgcaag tagctgggcc tcgggagggg
gctggaggga gaggggaacg cccccccggc ccccgcgaga gctgccacgc ccttggggat
gtggccgggg ggaggcctgc cagggagaca gcggagagcg gggctgtggc tgtggtggcg
cagccccgcc cagaacccag accttgcagt tcgcatttcc tcctctgtcc ccacacattg
cccaaggacg ct
SEQ ID NO: 4-示例性波形蛋白核苷酸序列(对应于Hg19坐标：chr10: chr10:17,270,838-17,271,347)
tctgagggat tccttactct ttcctcttcc cgctcctttg cccgcgggtc tccccgcctg
accgcagccc cgaggccgcc gcgcacctcc tcccacgccc ctttggcgtg gtgccaccgg
acccctctgg ttcagtccca ggcggacccc cccctcaccg cgcgaccccg cctttttcag
caccccaggg tgagcccagc tcagactatc atccggaaag cccccaaaag tcccagccca
gcgctgaagt aacgggacca tgcccagtcc cacgccccgg agcaggaagg ctcgaggcgc
ccccacccca cccgcccacc ctccccgctt ctcgctaggt cccgattggc tggggcgctc
cgcggctggg atggcagtgg gaggggaccc tctttcctaa cggggttata aaaacagcgc
cctcggcggg gtccagtcct ctgccactct cgctccgagg tccccgcgcc agagacgcag
ccgcgctccc accacccaca cccaccgcg
SEQ ID NO: 5-示例性波形蛋白核苷酸序列(对应于Hg19坐标：chr10:17271442-17271547)
CTCGTCCTCCTACCGCAGGATGTTCGGCGGCCCGGGCACCGCGAGCCGGCCGAGCTCCAGCCGGAGCTACGTGACTACGTCCACCCGCACCTACAGCCTGGGCAGC
SEQ ID NO: 6-示例性CCNA1核苷酸序列(对应于Hg19坐标：chr13:37005856-37006031)
GCGACTGCACTTGGGGCAGCCCCGCCGCGTCCCAGCCGCCTCCCGGCAGGAAGCGTAGGTGTGTGAGCCGACCCGGAGCGAGCCGCGCCCTCGGGCCAGCGTGGGCAGGGCGCCGCAGCCTGCGCAGCCCCGAGGACCCCGCGTCGCTCTCCCGAGCCAGGGTTCTCAGGAGCGGG
SEQ ID NO: 7-示例性CCNA1核苷酸序列(对应于Hg19坐标：chr13:37005805-37006194)
CGGGGCAGGCGCGGCCCGCAAGGACCCCCGCGATGGAGACGCAACACTGCCGCGACTGCACTTGGGGCAGCCCCGCCGCGTCCCAGCCGCCTCCCGGCAGGAAGCGTAGGTGTGTGAGCCGACCCGGAGCGAGCCGCGCCCTCGGGCCAGCGTGGGCAGGGCGCCGCAGCCTGCGCAGCCCCGAGGACCCCGCGTCGCTCTCCCGAGCCAGGGTTCTCAGGAGCGGGCCGCGCAGGAGACGTTAGAGGGGGTTGTTAGCGGCTGTTGGGAGAACGGGTCACGGAAACAGTCCCTTCCAAAGCCGGGGCCATCGTGGGGTGGGCGAGTCCGCCCTCCCAGGCCGGGGGCGCGGACCAGAGGGGACGTGTGCAGACGGCCGCGGTCAGCCCC
SEQ ID NO: 8-示例性Up10核苷酸序列
ccgtgactct ccctacctcc ccgactcccc aggcttctta cagtgacctc ttaccgtgcc
ccactccatg aatcgccaga gctattcgtc cctaaatttc aaaccttgcg caatgtccct
tcacagaccc ctccaggtat cacgcagccc cgagccccga gccccgcccc gggggcctca
tcccgcccct tcgcgtccgc ggctcgtttt cccccactga gcgcccagct cccgcagttt
ccccggccgt cgagcgccgt gggcggggct ccagggcggc ggcgcctcgc ggggagggtc
ctccgtgctg ggggcgaggc cacccgaggc agctccccgc ccgcccccaa ccccgccccg
ctctcggagc ctataaaggg aggcgacccg cggcccgccc ggctggcatc ccccagccgc
cgccagcccc gccgagggga gccagcgccg tctctgaggg gcgtccggcg ccggagccat
gaccctccgc cgactcagga agctgcagca gaaggaggag gcggcggcca ccccggaccc
cgccgcccgg actcccgact cggaagtcgc gcccgccgct ccggtcccga ccccgggacc
ccctgccgca gccgc
SEQ ID NO: 9-示例性Up10核苷酸序列
gcggctgcgg cagggggtcc cggggtcggg accggagcgg cgggcgcgac ttccgagtcg
ggagtccggg cggcggggtc cggggtggcc gccgcctcct ccttctgctg cagcttcctg
agtcggcgga gggtcatggc tccggcgccg gacgcccctc agagacggcg ctggctcccc
tcggcggggc tggcggcggc tgggggatgc cagccgggcg ggccgcgggt cgcctccctt
tataggctcc gagagcgggg cggggttggg ggcgggcggg gagctgcctc gggtggcctc
gcccccagca cggaggaccc tccccgcgag gcgccgccgc cctggagccc cgcccacggc
gctcgacggc cggggaaact gcgggagctg ggcgctcagt gggggaaaac gagccgcgga
cgcgaagggg cgggatgagg cccccggggc ggggctcggg gctcggggct gcgtgatacc
tggaggggtc tgtgaaggga cattgcgcaa ggtttgaaat ttagggacga atagctctgg
cgattcatgg agtggggcac ggtaagaggt cactgtaaga agcctgggga gtcggggagg
tagggagagt cacgg
SEQ ID NO: 10-示例性Up10核苷酸序列
aaaccttgcg caatgtccct tcacagaccc ctccaggtat cacgcagccc cgagccccga
gccccgcccc gggggcctca tcccgcccct tcgcgtccgc ggctcgtttt cccccactga
gcgcccagct cccgcagttt ccccggccgt cgagcgccgt gggcggggct ccagggcggc
ggcgcctcgc ggggagggtc ctccgtgctg ggggcgaggc cacccgaggc agctccccgc
ccgcccccaa ccccgccccg ctctcggagc ctataaaggg aggcgacc
SEQ ID NO: 11-示例性Up10核苷酸序列
ggtcgcctcc ctttataggc tccgagagcg gggcggggtt gggggcgggc ggggagctgc
ctcgggtggc ctcgccccca gcacggagga ccctccccgc gaggcgccgc cgccctggag
ccccgcccac ggcgctcgac ggccggggaa actgcgggag ctgggcgctc agtgggggaa
aacgagccgc ggacgcgaag gggcgggatg aggcccccgg ggcggggctc ggggctcggg
gctgcgtgat acctggaggg gtctgtgaag ggacattgcg caaggtt
SEQ ID NO: 12-示例性Up35-1/Up35-2核苷酸序列
tctggcccca tgctcagctc cgcggccatc gctgaagcga ggcgcagccg ccgctgccgc
ccgggaaact ttgcggccgg ccggagcgcg ccgagccaag cgcggggggg aagagcggag
aagagctggg gaggcgggga gcgagggcgc agcgggccgg ggccgccggc caagcctttg
tctggggacg cggcggcgcg ccggagagtc ccgaggctgc ctgcaccgcc ccagagctct
gggctgtgcc cgcgcaggga ccgggccggg tagagtcggg cggggtggag aggcaagcgg
agcgcgcggt ggggctgagg ggaggcgtgg ggcgagtgcc cgttgctcgc tctctagctc
tcttgctctt acgctctctc gctcgcagcc gctcgcagct cggcggtgca gctgtgctgg
atccggcggc gccgcagcct tttatcgcct cctgatgtca ctggggtgcg ggggcccggg
cggcccggtg cgcgggccaa tagctgcacg gcctccgcgg cccagcggcg cagggcgggg
cgcgcctgac agctcccccg ccccccgcgt cagctgactg gcggcccgag cggccccgga
gcggcggagg cctggcggag cgctggagcg gagtgggacg gccagcctgg gcccaccccc
gtaccctgca ggtcccggcc cacgcacgct cgcctggagt gcgcgcccca cctctaggcc
aaatcaccgc tttcccctcc tcgcgcactc tcctccctca gttccctttg caccccaccc
ccatcccgtg tcacccccaa ggaggctcag aatgagcgcc gggacaacgc ctcctgggcc
ctttgttccc aagcggcccc cgcccagtgg gcgacgctct gtgtgtcctc gcggcttctg
gccgtgtgtg tcgtgcgttc ctgtttctgg agatctgcgc gtatttgtat gttggggagg
gcgggctcga ggctccgaga gttgtgttca gacccaactc ttaacctcag gggacctttc
tcaggccaag cgagggcccc tcctggcggg tgcagtcgca gagccctgag gttcgactcc
actggccccg ccgctccccg cgttcacccc accgcacaat gttcacagtg aaggcgacgg
gaaaagcagc agcccaaagg ctctgaattc ctcttccccg ccacacgcac ggaatcctga
gcccccggag cctcggggcc gaggccggcc cgggacggtg ctccgagtag ctctccactg
ctggggagcc ggccctgttt ttgtttgaac gttttgtaac gattaagcag atcccggcgt
cagcccgccg cggagaggct caaacaggca taaagtgcga ccccaagtgg ccactgtgcg
caaaggcgcc gcgaccgccc ggcccacggc cggaaggctt ggacggcgcc tcgtacccag
ccaggtctcc cctacctggc ccaacccaag ccagcccaga acgcatacta tgtgtgcacc
agagcccagg acaggttccc ctcgagcgat gtacaggtc
SEQ ID NO: 13-示例性Up35-1/Up35-2核苷酸序列
gacctgtaca tcgctcgagg ggaacctgtc ctgggctctg gtgcacacat agtatgcgtt
ctgggctggc ttgggttggg ccaggtaggg gagacctggc tgggtacgag gcgccgtcca
agccttccgg ccgtgggccg ggcggtcgcg gcgcctttgc gcacagtggc cacttggggt
cgcactttat gcctgtttga gcctctccgc ggcgggctga cgccgggatc tgcttaatcg
ttacaaaacg ttcaaacaaa aacagggccg gctccccagc agtggagagc tactcggagc
accgtcccgg gccggcctcg gccccgaggc tccgggggct caggattccg tgcgtgtggc
ggggaagagg aattcagagc ctttgggctg ctgcttttcc cgtcgccttc actgtgaaca
ttgtgcggtg gggtgaacgc ggggagcggc ggggccagtg gagtcgaacc tcagggctct
gcgactgcac ccgccaggag gggccctcgc ttggcctgag aaaggtcccc tgaggttaag
agttgggtct gaacacaact ctcggagcct cgagcccgcc ctccccaaca tacaaatacg
cgcagatctc cagaaacagg aacgcacgac acacacggcc agaagccgcg aggacacaca
gagcgtcgcc cactgggcgg gggccgcttg ggaacaaagg gcccaggagg cgttgtcccg
gcgctcattc tgagcctcct tgggggtgac acgggatggg ggtggggtgc aaagggaact
gagggaggag agtgcgcgag gaggggaaag cggtgatttg gcctagaggt ggggcgcgca
ctccaggcga gcgtgcgtgg gccgggacct gcagggtacg ggggtgggcc caggctggcc
gtcccactcc gctccagcgc tccgccaggc ctccgccgct ccggggccgc tcgggccgcc
agtcagctga cgcggggggc gggggagctg tcaggcgcgc cccgccctgc gccgctgggc
cgcggaggcc gtgcagctat tggcccgcgc accgggccgc ccgggccccc gcaccccagt
gacatcagga ggcgataaaa ggctgcggcg ccgccggatc cagcacagct gcaccgccga
gctgcgagcg gctgcgagcg agagagcgta agagcaagag agctagagag cgagcaacgg
gcactcgccc cacgcctccc ctcagcccca ccgcgcgctc cgcttgcctc tccaccccgc
ccgactctac ccggcccggt ccctgcgcgg gcacagccca gagctctggg gcggtgcagg
cagcctcggg actctccggc gcgccgccgc gtccccagac aaaggcttgg ccggcggccc
cggcccgctg cgccctcgct ccccgcctcc ccagctcttc tccgctcttc ccccccgcgc
ttggctcggc gcgctccggc cggccgcaaa gtttcccggg cggcagcggc ggctgcgcct
cgcttcagcg atggccgcgg agctgagcat ggggccaga
SEQ ID NO: 14-示例性Up35-1核苷酸序列
cctgcaccgc cccagagctc tgggctgtgc ccgcgcaggg accgggccgg gtagagtcgg
gcggggtgga gaggcaagcg gagcgcgcgg tggggctgag gggaggcgtg gggcgagtgc
ccgttgctcg ctctctagct ctcttgctct tacgctctct cgctcgcagc cgctcgcagc
tcggcggtgc agctgtgctg gatccggcgg cgccgcagcc ttttatcgcc tcctgatgtc
actggggtgc gggg
SEQ ID NO: 15-示例性Up35-1核苷酸序列
ccccgcaccc cagtgacatc aggaggcgat aaaaggctgc ggcgccgccg gatccagcac
agctgcaccg ccgagctgcg agcggctgcg agcgagagag cgtaagagca agagagctag
agagcgagca acgggcactc gccccacgcc tcccctcagc cccaccgcgc gctccgcttg
cctctccacc ccgcccgact ctacccggcc cggtccctgc gcgggcacag cccagagctc
tggggcggtg cagg
SEQ ID NO: 16-示例性Up35-2核苷酸序列
gggaaaagca gcagcccaaa ggctctgaat tcctcttccc cgccacacgc acggaatcct
gagcccccgg agcctcgggg ccgaggccgg cccgggacgg tgctccgagt agctctccac
tgctggggag ccggccctgt ttttgtttga acgttttgta acgattaagc agatcccggc
gtcagcccgc cgcggagagg ctcaaacagg cataaagtgc
SEQ ID NO: 17-示例性Up35-2核苷酸序列
gcactttatg cctgtttgag cctctccgcg gcgggctgac gccgggatct gcttaatcgt
tacaaaacgt tcaaacaaaa acagggccgg ctccccagca gtggagagct actcggagca
ccgtcccggg ccggcctcgg ccccgaggct ccgggggctc aggattccgt gcgtgtggcg
gggaagagga attcagagcc tttgggctgc tgcttttccc
SEQ ID NO: 18-示例性波形蛋白核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr10:17270838-17271717)
TCTGAGGGATTCCTTACTCTTTCCTCTTCCCGCTCCTTTGCCCGCGGGTCTCCCCGCCTGACCGCAGCCCCGAGACCGCCGCGCACCTCCTCCCACGCCCCTTTGGCGTGGTGCCACCGGACCCCTCTGGTTCAGTCCCAGGCGGACCCCCCCCTCACCGCGCGACCCCGCCTTTTTCAGCACCCCAGGGTGAGCCCAGCTCAGACTATCATCCGGAAAGCCCCCAAAAGTCCCAGCCCAGCGCTGAAGTAACGGGACCATGCCCAGTCCCAGGCCCCGGAGCAGGAAGGCTCGAGGGCGCCCCCACCCCACCCGCCCACCCTCCCCGCTTCTCGCTAGGTCCCTATTGGCTGGCGCGCTCCGCGGCTGGGATGGCAGTGGGAGGGGACCCTCTTTCCTAACGGGGTTATAAAAACAGCGCCCTCGGCGGGGTCCAGTCCTCTGCCACTCTCGCTCCGAGGTCCCCGCGCCAGAGACGCAGCCGCGCTCCCACCACCCACACCCACCGCGCCCTCGTTCGCCTCTTCTCCGGGAGCCAGTCCGCGCCACCGCCGCCGCCCAGGCCATCGCCACCCTCCGCAGCCATGTCCACCAGGTCCGTGTCCTCGTCCTCCTACCGCAGGATGTTCGGCGGCCCGGGCACCGCGAGCCGGCCGAGCTCCAGCCGGAGCTACGTGACTACGTCCACCCGCACCTACAGCCTGGGCAGCGCGCTGCGCCCCAGCACCAGCCGCAGCCTCTACGCCTCGTCCCCGGGCGGCGTGTATGCCACGCGCTCCTCTGCCGTGCGCCTGCGGAGCAGCGTGCCCGGGGTGCGGCTCCTGCAGGACTCGGTGGACTTCTCGCTGGCCGACGCCATCAACACCGAGTTCAAGAACAC
SEQ ID NO: 19-示例性ADCY1核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr7:45613877-45614572)
CGGGGCTCGGCTGTCGCAGCGCGGTCGCCGCCGAGGACCACGGTCGGGGCGCGGGCGGGCTCCAGTGCGCAGGCGCGGCGGGCGGGAGGGGACGCGCTCCGGGCGCGCGCGCGGGGCAGCCGGCGCCCCAACTCCGCCCGCCCCGCGCCCCGCGCCCCGGCGCCTCGCCGCCCGCCGCCCGCCCGCCCCGGCGCCGCCGCCCGCGCCCCGGCGCCCCGGGCCGGCGAGGGGCGCGCCCGCGGCCGCGGCCGCTGCATGGCGCTGAGATGGCGGGGGCGCCGCGCGGCGGAGGCGGCGGCGGAGGCGGCGCGGGCGAGCCCGGGGGCGCCGAGCGGGCGGCCGGGACAAGCCGCCGGCGCGGGCTCCGGGCGTGCGACGAGGAGTTCGCTTGCCCAGAGCTGGAGGCGCTGTTCCGCGGCTACACGCTGCGGCTGGAGCAGGCGGCCACGCTGAAGGCGCTGGCCGTTCTCAGCCTGCTGGCGGGCGCGCTGGCGCTGGCCGAGCTGCTGGGCGCGCCGGGGCCCGCGCCCGGCCTGGCCAAGGGCTCACACCCGGTGCACTGCGTCCTCTTCCTGGCGCTGCTCGTGGTAACCAACGTCCGGTCCCTGCAGGTGCCCCAGCTGCAGCAGGTCGGCCAGCTGGCGCTGCTCTTCAGCCTCACCTTCGCGCTGCTCTGCTGTCCTTTCGCGCTGGGCG
SEQ ID NO: 20-示例性BMP3核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr4:81952348-81952402)
GTTCAACCCTCGGCTCCGCCGCCGGCTCCTTGCGCCTTCGGAGTGTCCCGCAGCG
SEQ ID NO: 21-示例性BMP3核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr4:81031173-81031262)
CTAAATAAATACACTTTCCTTTGTGTTCCCATATACTCCTTGTTCCCATGTCAACTATAACACATACGCTACCATTTTATAATTACTTAA
SEQ ID NO: 22-示例性CD1D核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr1:158150797-158151205)
CGGAAAGGGACGTGAGCTGAGCGGCGGGGGAGAAGAGTGCGCAGGTCAGAGGGCGGCGCGCAGCGGCGCTCCGCGAGGTCCCCACGCCGGGCGATATGGGGTGCCTGCTGTTTCTGCTGCTCTGGGCGCTCCTCCAGGCTTGGGGAAGCGCTGAAGGTGGGTGGAACGAGGGCGCTTGAGTGCACTCGCGGGAGGGCGGAGAGAGGGAGCTGGGTAGGGACGGGGAGGGCAACGCCTGATGGGGACTGGTGAGACCCGGGACGCACTGGCGCGATCTAGGTAGAAAACTCGCTGCTCCCTGGCTCCGGGGAGAGGCAGCGCGGCACAGAGTTCGCTGGCATCAGCCGCCTCCTGAAGCTCATCTCCTCTTGTTTCTTTCTTCCTTCTCTTTATGCTGGCTGCTCTCCCG
SEQ ID NO: 23-示例性CDKN2A核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr9:21974710-21974763)
GTTGGGCAGCGCCCCCGCCTCCAGCAGCGCCCGCACCTCCTCTACCCGACCCCG
SEQ ID NO: 24-示例性CDKN2A核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr9:21975053-21975199)
GAGCACTTAGCGAATGTGGCACCCCTGAAGTCGCCCCAGGTTGGGTCTCCCCCGGGGGCACCAGCCGGAAGCAGCCCTCGCCAGAGCCAGCGTTGGCAAGGAAGGAGGACTGGGCTCCTCCCCACCTGCCCCCCACACCGCCCTCCG
SEQ ID NO: 25-示例性DIO3核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr14:102026104-102026145)
GCCCGCGCTCTACCGAGCCCAGCCAGCTCCTACCTCGGCCCG
SEQ ID NO: 26-示例性DOCK10核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr2:225907226-225907322 5’填充=0 3’填充=0 链=+ 重复屏蔽=无)
GCAAGAGGCGGGTTTTTCTCTCTTGCACCCCCACTCTTCCCACCCCCTTCCCTCCTCTGAAGCTTCTCGAAGACTTTCCAAACTCTGCGCTCCCCCG
SEQ ID NO: 27-示例性ELMO1核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr7:37487755-37488477)
CGGGGGATTCCCTCCCATCCCCGAGTGCAGGAGAAGACGCCGAGTCTGAGCCGCAGCCGCTTCTCTAGCTCTATAGGAATCTTGACTCCAAGATCCCAGCCCCACATCCCCCGTCCCCAGTAACCCCGCGCCAGCGTCGCAACCCTCCCGCGCCCCCCCTCCCGCAGACCCTGGTCGAAATGTCTCGGCGGGCTCCCGGGCCCCGGGCCCTGCGCTTCATCCGCGGGCGCCGCACCTCCAGCGCCCCCTCCCTCCGCTCCCACTCCCACTCCCGCCATCCCCGGAGCTCAGACTTCCCCAACTGCAGAGCGCCCCGACGCGCCCGCAGCCCTCACCCTGCCGAGCGCGGCGGCCACCCCCGCCCGAGCCGCGGCGCCCCCAGGGAGGAAACAAAAGTGTCTCCGCGGCGCCCGGAGTCCCCCGGAGCAGGACGCCTCCTCCCGGCCCCAGTCCCGGCCCCCTCCCCTGCCGCGCCGAGGTCAGCGAGTCGGGGCGCGGCGCCAGCCCAGGAAACTTTACGAACCTGCTTGGGGTCGCAGGACAGCAGCGGCAAGGGTTCCCGGCGATCAGAGCTCCGGCGACCCGCCACCATTGAAGGGGAACTGGAGGCTCTGTCGCCCAGCGTGGGGCCGCGGCGGCGTGGGTGGCTCTGCCTCTATCCTGTGCCCATCCTCGCCCGCTCCCGCTCGCCCCAGCACACGCACTTACACTCTGGGTCGGCCG
SEQ ID NO: 28-示例性ELOVL2核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr6:11044395-11044834)
CGGTGCGTGGGTCCAGGAGAGAAAGAAAGCGCGGCGGTGTCGGTGGCGGCGCGCGGCCCCACTCACCATGATCCGCAGCGGCTGTGGCGCGGCGACCCGGGCGGGCGGCGATGCGCTGTCCAGGGTAGCCGGGTCCCTCTGCCCGGCGCTATCTCGGCGCCCGCGCCGGTTACCCCCACCCACACCCACGCCCGGCGCGCGCACACCCGCCCGCGCCTCCCCGCCCCCTCGGGCTCGCGCCGCCGCCGCGCGGCGCTCCGAGCCTCGGGGCCGTTTCGTCCCCGCCCCCTCTCCCACAGGGGCCTCGCCGGCCGCCGCGCCAGGAGGGCGCGCGGGGGAGGGGCGCAGGGCAAGTGAGGCGGCGCCCCCCGCCCCTGCGGCCTCGCGCGCCCCCTCCTGGGCGACCGACCTCGCCCTCGCGTCCGCGGCGTCCCCTGCCG
SEQ ID NO: 29-示例性FER1L4核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr20:34189488-34189693)
CGGCACGTGCGTAGCGAGTGCCGCGTCGACCAGGGGCGCGTCGTCCCGCAGCTGCAGGCGGAGGCTGCGCGTCAGCGGCGGGAAGAGCTCCACGAAGCTCAGCTGCTCGTTCCATTCGGGCGCCGCCGCCTCGGCGCTCACCGACGTCTCGCCCTGAAGGTGGCGTTAAAGACAGGAGAAGGGAGATCAGCGCGGAGTCGGGGCCG
SEQ ID NO: 30-示例性HUNK核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr21:33246580-33246650)
CGGCAGGGGCGGCGGATCCGTGGCGAGGCGGGAACCAGGGCTAGAGGAGGTGGGCTCTTATGTCGGGGGGC
SEQ ID NO: 31-示例性LRRC4核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr7:127671993-127672310)
CGGAGCCCAGGAACATAGTCCCCGCTGGCTAGCGGCGGCAGCAGCAGCAGCGGGGCCCCTGCGCGCGGCGCCCACCGTCTCCTCCTCGCGCCGGGCTCGCGGTGTTGCAGGCGGCAGCCACGCAGACTGCTCTCTCATCCTTTTGTCCTTCAGTCAGAACGTGAATGTACTGCTGACGCATACTGTTCTGGGAGAAGATTAGCGTGATGCAGTGCTCTTATGTATTAGCGCCGCTCCCCCTCCGTCGCCTGCCTCGCGGGGTTAACGCCGGCGCCTTCCAGCGCCGCGCCGGCCGGCGCCGCGCAGCCCCGCGCCTCC
SEQ ID NO: 32-示例性NDRG4核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr16:58497395-58497451)
CGGTCCCCGCTCGCCCTCCCGCCCGCCCACCGGGCACCCCAGCCGCGCAGAAGGCGG
SEQ ID NO: 33-示例性SFMBT2核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr10:7452885-7452956)
CGGCCTCGCTCGCTTGCTCGCTCGCCCGCCCTTGCCCGCTCGCTCCCCGCCCGCCGCCTCCCTCGCGCGCCC
SEQ ID NO: 34-示例性SFMBT2核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr10:7451771-7451869)
GCCATATTGAAACTGGCACGGTTTCTAAAGACTCCTTCCCCGCAGTTGTGGCGCTTCCAAGAAAACACGAGTACGGATCAGGCTCTGGATGAGTGTCCG
SEQ ID NO: 35-示例性SFMBT2核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr10:7452029-7452452)
GCACGCATATTAAAAAATAAACTCCAGAACCAGCTCAAGTCAGCAATTTTGAAAGGGGGTCGAATAAGAGGAGACAACCGGAAAGCCCCTAAGTGACAGGATATTACTTTAAAGAGAAAATAATGAACAAAAAGACCATCCTCGCTGGAGCACGCTCCAAAACTACTACTGCCAATTTTATTTCAGTTGCTCAGGCAAATGTTTCCAAGGGAGCGATTCCGAATGTCTGCACGATTTTTACCCCCATGCCGGTCTCCGATTCCCCGTCCTCACCATCTTTTTCTCCCACCCAAACCAAAAGAAAGGGGAGACCCCAGCGCGGAGGAGACGCGGGAGCGCGGGGTAGGTAGCAGCGGCGGCTGCGTCGCTAAAATGAGTGCAGAAACGAGGAAGGTGGGCGGCGGGAGGGGACAGGCTGCGCCCG
SEQ ID NO: 36-示例性SFMBT2核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr10:7450242-7450831)
CGGCGTGTCGCCATCGTTCAGCCTCGCTGCCCAGGTGGGAGGGGTCACCTGCCGCGGGGTCTCCAAGCCAGTGCCGCTTGCTCCCGGCCCCCACCCACTGACAGCACGGCGTCCGAGTGACCCTGTCTAGCCTCGTTCTGCGCTCCTGCAAACCACGTTGCTGCGCTAACTACAAACCTGGCCAACATGTCTTTGTAACCCTATCATTTAAAAACGCTTCCAGGCACCTGGCCGCTGCCAGATCAGGTTCGCGGGCCCGGAGGAGGTCCTCCCACCTGCCCCCGCCAGCCCCGGGGACCGTGCGCGGCCTCCGTGTGGCCCCCGCCCACGAGGTCCCTCGGGCAGGAACCGCCGCGCGACCTCTGTTCAGCGGCCGCGTCCTGGCCACGGGCGACCCCTGTCGGGAACCCTGTTCCCGGCTAAGCTGCGTTCCCGCATTCCGGTGGCTCTCACCCGAGCTCGCGTTTGCTGGCTTTCCCTCTGGCTCCTCTGCCTGACCCCGATTTTGTCTCCGAACTCCACTCCCAGATCCTCCCCGCCCTGGAACGCCGACCTTTCCCCCGCACTTCGCCGCCCACTCACATCCCCCG
SEQ ID NO: 37-示例性ST8SIA1核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr12:22487528-22487620)
CGGGAGAAGGCTCGGCTCCCTCCTAAACATGTGGCCCGTGGCGTCCCCTTGTCCCCTCCGAGCGATGCTCCTGCGCCCTTCGCCGCCTCCCGC
SEQ ID NO: 38-示例性TSPYL5核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr8:98289858-98290220)
CGGAGGAGCTGCGCGGACGCAGCGGCTTCCAGGCCACCCCACCCCGCGCCAGCCTGCACCTGTGCCGCCTGGGTGTCTTCCCCGAGACTCTGGTACTGTGAAGGGTCCGGGTCGCGCGGGGCGTCGTCCGGAGCAGGGCGGACTCGGGCTTTGGCGCGGCCTTTGCCCCGGTTTTTGGCGCGGGAGGACTTTCGACCCCGACTTCGGCCGCTCATGGTGGCGGCGGAGGCAGCTTCAAAGACACGCTGTGACCCTGCGGCTCCTGACGCCAGCTCTCGGTCGGGACCGAGCGGGTCTCTCCACGGCAACCGCCGACGTCACGAACGTACAACTGTACCGTCGCGAGAGGACGTGATGCGCCCG
SEQ ID NO: 39-示例性VAV3核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr1:108507608-108507679)
CGCGCGGGATCGAGGGAGCAGGAGCCGCGGCTGACGGGTCGCGGGCGCCGCGCTAGGCTCGGCTCCGGTCCC
SEQ ID NO: 40-示例性ZNF568核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr19:37407197-37407284)
CGGAAGTTGAGTGGGGCCGCGGGGCCTGCTGGGAGGTGTTGTCCTCGGAAACGTCGCTGGCGCGGAGGGATGGTTCGGCGCTTTAGGC
SEQ ID NO: 41-示例性ZNF568核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr19:37407197-37407365)
CGGAAGTTGAGTGGGGCCGCGGGGCCTGCTGGGAGGTGTTGTCCTCGGAAACGTCGCTGGCGCGGAGGGATGGTTCGGCGCTTTAGGCGTCTGTCACAGACCTATCTGCGGGTCGCCTTCACCCAGCATCTCAGAAACTGCGCGCGGGATGAACATTCGGGTGTTTCCG
SEQ ID NO: 42-示例性SNF569核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr19:37957760-37958046)
CGGGGCCACACTCAGCCAGACGAATGTCTGGCAAATGACAGTCACTTCACGCCAGACTCTCACAGTCCTTCACACGCCACTCCCACTGCCTCAGGGAACCACAAGCACAGGCATCGCCCCGCCCGGCGTCCTCCTCCAAAGATTGGGGCACCAGGACCGCGGGCCCCCACTCCCACCCAGCACAAAGAGTCCGGCGCTCAGAGCTAGCGGTTTCCCGAGGACTCACCACCAAGCCCGCGGACACAGGCCCCGATTCCACACTTAACGCTGCCAAAGTGGCAGAGCCG
SEQ ID NO: 43-示例性ZNF610核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr19:52839503-52840013)
CGGAAGCGGATCGCGTGGGTAGAAGGTCACACCGCAGCGCGTCAGTTTCCCTTTGTTTAGATTCAATCTGGGCTTCCCAGCTCCCCCGCGCTTCTGTACCCGGGATCTGAGAGTCAACACAGACCTTGAAATCCCCGCACCGCTCCCTCCACCCCGTGTAAATTCAGGCGTCTCCGTGAGAGTCCGGCGCTCGCTTCCCTGTGTGTTAAAATCGCTCGGCGACGGGTCCTGTCCCCGCTCGTTCTGCCTTGGGCCAGGTAAACACGGATTTTCGAGACTCCTTTCCGCTTAAAACTCTTTACTGACCCAACGTCCTGCCCCGCGCTTTTAAAAGTCCTTACCGCAAGGTGGATTCCCGCCCGGGGAGCCTCCCAACCTCGCCCCCGGCCCCTGAAGCGCAGCGCCGCAGCCCCAGTCCCGGCGGGGGAGGCCGCGTCCTGTACTGGGTCCTGGGACCCTTGAGACCCCACACTTCTAATAATTCAGCCCCACCCTTTTCCTCCTTGATCCG
SEQ ID NO: 44-示例性ZNF67核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr19:58238810-58238955)
CGGGAGCGGCAGGCGTCTCGATCGGGGACGCAGGCACTTCCGTCCCTGCAGAGCATCAGACGCGTCTCGGGACACTGGGGACAACATCTCCTCCGCGCTTTCCCAACACCTCCACCTGCGGCCCACACAAGCGTTACAGAACCCCG
ZNF682
SEQ ID NO: 45-示例性ZNF682核苷酸序列(对应于hg19_dna范围=chr19:20149796-20149923)
CGGGATCACAGCACTTCCCACGCACAAACCACACACGGGGTCTGGACTCTGCCCTGAGGACGCTTCCATTGTCCCCGCAGTCGGGGCAGACGCAAGAACGCGCGCGGCTCTTCCCAGGGTGGGCTCCG。

Claims (85)

1.一种组合物，其包含：
包含甲基化DNA序列的生物样品；和
包含甲醇的储存溶液；
其中所述甲基化DNA序列的甲基化模式得到保存。
2.权利要求1的组合物，其中所述甲基化模式保存至少2周。
3.权利要求1或2的组合物，其中在室温下保存所述甲基化模式。
4.权利要求1-3中任何一项的组合物，其中与储存之前的所述生物样品中的甲基化模式相比较，所述储存溶液中所述生物样品的甲基化模式保存至少65%。
5.权利要求1-4中任何一项的组合物，其中所述样品为人类生物样品。
6.权利要求1-5中任何一项的组合物，其中所述生物样品为来自以下任何一种的样品：胃肠道、呼吸消化道、呼吸道、泌尿生殖道或体液。
7.权利要求6的组合物，其中所述体液为以下的任何一种：血液、尿液、痰液、唾液、粪便、胆汁、胰液、鼻腔分泌物、眼泪、精液、阴道分泌物、脑脊液、胸膜液、腹膜液、胃液、心包液、汗液、淋巴液、囊液、胰腺囊液、滑液、关节液、月经液、子宫内膜冲洗液、乳房抽吸液或羊水。
8.权利要求1-5中任何一项的组合物，其中所述生物样品为来自以下任何一种的样品：食道、胃、结肠、小肠、胰腺、肝脏、口腔、口咽、气管、支气管树、肺部或乳房。
9.权利要求8的组合物，其中所述生物样品为食道生物样品。
10.权利要求1-9中任何一项的组合物，其中所述储存溶液包含100%甲醇。
11.权利要求1-9中任何一项的组合物，其中所述储存溶液包含与水混合的10%-100%甲醇。
12.权利要求1-9中任何一项的组合物，其中所述储存溶液包含与水混合的10-90%甲醇。
13.权利要求1-9中任何一项的组合物，其中所述储存溶液包含与水混合的20-90%甲醇。
14.权利要求1-9中任何一项的组合物，其中所述储存溶液包含与水混合的30-90%甲醇。
15.权利要求1-9中任何一项的组合物，其中所述储存溶液包含与水混合的30-80%甲醇。
16.权利要求1-9中任何一项的组合物，其中所述储存溶液包含与水混合的40-70%甲醇。
17.权利要求1-9中任何一项的组合物，其中所述储存溶液包含与水混合的40-60%甲醇。
18.权利要求10-17中任何一项的组合物，其中所述甲醇不含或者以低于或等于0.001%的水平含过氧化物。
19.权利要求11-18中任何一项的组合物，其中所述水通过蒸馏或超滤或反渗透来纯化。
20.权利要求11-19中任何一项的组合物，其中所述水不含DNA酶和/或RNA酶活性。
21.权利要求1-20中任何一项的组合物，其中所述甲基化DNA序列包含与波形蛋白、CCNA1、Up10、Up35-1、Up35-2、FER1L4、VAV3、DOCK10、ADCY1、BMP3、CD1D、ELMO1、ELOVL2、LRRC4、NDRG4、SFMBT2、ST8SIA1、TSPYL5、ZNF568、ZNF569、ZNF610、ZNF671、ZNF682、CDKN2A、DIO3和HUNK基因的任何核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的多核苷酸序列或其任何片段和/或互补物。
22.权利要求1-20中任何一项的组合物，其中所述甲基化DNA序列包含与SEQ ID NO:1-45中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的多核苷酸序列或其任何片段和/或互补物。
23.权利要求1-22中任何一项的组合物，其中当在室温(23℃)下储存时，所述甲基化DNA模式在所述组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。
24.权利要求1-22中任何一项的组合物，其中当在4℃下储存时，所述甲基化DNA模式在所述组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。
25.权利要求1-22中任何一项的组合物，其中当在-30℃至50℃范围内的温度下储存时，所述甲基化DNA模式在所述组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。
26.权利要求1-22中任何一项的组合物，其中当在-10℃至30℃范围内的温度下储存时，所述甲基化DNA模式在所述组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。
27.在生物样品中保存甲基化DNA分子的甲基化模式的方法，包括用储存溶液处理所述生物样品，其中所述储存溶液包含甲醇，和其中在室温下保存所述甲基化模式。
28.权利要求27的方法，其中所述甲基化模式保存至少两周。
29.权利要求27或28的方法，其中与储存之前的所述生物样品中的甲基化模式相比较，所述储存溶液中所述生物样品的甲基化模式保存至少65%。
30.权利要求27-29中任何一项的方法，其中所述生物样品储存于所述储存溶液中。
31.权利要求27-30中任何一项的方法，其中所述样品来自人体组织或体液。
32.权利要求27-31中任何一项的方法，其中所述生物样品为来自以下任何一种的样品：胃肠道、呼吸消化道、呼吸道、泌尿生殖道或体液。
33.权利要求32的方法，其中所述体液为以下的任何一种：血液、尿液、痰液、唾液、粪便、胆汁、胰液、鼻腔分泌物、眼泪、精液、阴道分泌物、脑脊液、胸膜液、腹膜液、胃液、心包液、汗液、淋巴液、囊液、胰腺囊液、滑液、关节液、月经液、子宫内膜冲洗液、乳房抽吸液或羊水。
34.权利要求27-31中任何一项的方法，其中所述生物样品为来自以下任何一种的样品：食道、胃、结肠、小肠、胰腺、肝脏、口腔、口咽、气管、支气管树、肺部或乳房。
35.权利要求34的方法，其中所述样品为食道样品。
36.权利要求27-35中任何一项的方法，其中所述储存溶液包含100%甲醇。
37.权利要求27-35中任何一项的方法，其中所述储存溶液包含与水混合的10%-100%甲醇。
38.权利要求27-35中任何一项的方法，其中所述储存溶液包含与水混合的10-90%甲醇。
39.权利要求27-35中任何一项的方法，其中所述储存溶液包含与水混合的20-90%甲醇。
40.权利要求27-35中任何一项的方法，其中所述储存溶液包含与水混合的30-90%甲醇。
41.权利要求27-35中任何一项的方法，其中所述储存溶液包含与水混合的30-80%甲醇。
42.权利要求27-35中任何一项的方法，其中所述储存溶液包含与水混合的40-70%甲醇。
43.权利要求27-35中任何一项的方法，其中所述储存溶液包含与水混合的40-60%甲醇。
44.权利要求27-43中任何一项的方法，其中所述甲醇不含或者以低于或等于0.001%的水平含过氧化物。
45.权利要求37-44中任何一项的方法，其中所述水通过蒸馏或超滤或反渗透来纯化。
46.权利要求37-44中任何一项的方法，其中所述水不含DNA酶和/或RNA酶活性。
47.权利要求27-46中任何一项的方法，其中在波形蛋白基因的差异性甲基化结构域或CCNA1基因的差异性甲基化结构域内测定所述DNA甲基化的模式。
48.权利要求47的方法，其中所述波形蛋白的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO:1-5或对应于chr10:17,270,838-17,271,717的SEQ ID NO: 18中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列或其互补物和/或片段。
49.权利要求47的方法，其中所述波形蛋白的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO:1-5中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
50.权利要求47的方法，其中所述CCNA1的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 6或7具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
51.权利要求27-46中任何一项的方法，其中在Up10、Up35-1和/或Up35-2核苷酸序列的差异性甲基化结构域内测定所述DNA甲基化的模式。
52.权利要求51的方法，其中所述Up10的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 8-11中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
53.权利要求51的方法，其中所述Up35-1的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO:12-15中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
54.权利要求51的方法，其中所述Up35-2的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO:12-13和16-17中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
55.权利要求38-54中任何一项的方法，其中所述核苷酸序列、所述互补物或所述片段的长度为至少20个核苷酸。
56.权利要求27-46中任何一项的方法，其中在与包含同波形蛋白、CCNA1、FER1L4、VAV3、DOCK10、ADCY1、BMP3、CD1D、ELMO1、ELOVL2、LRRC4、NDRG4、SFMBT2、ST8SIA1、TSPYL5、ZNF568、ZNF569、ZNF610、ZNF671、ZNF682、CDKN2A、DIO3和/或HUNK基因的任何核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列或其任何片段和/或互补物的DNA分子相关的差异性甲基化结构域内测定所述DNA甲基化的模式。
57.权利要求56的方法，其中所述差异性甲基化结构域与包含同由基因组坐标指定的任何核苷酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段的DNA分子相关：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
58.权利要求56的方法，其中所述ADCY1的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 19具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
59.权利要求56的方法，其中所述BMP3的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 20或21具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
60.权利要求56的方法，其中所述CD1D的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 22具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
61.权利要求56的方法，其中所述CDKN2A的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 23或24具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
62.权利要求56的方法，其中所述DIO3的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 25具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
63.权利要求56的方法，其中所述DOCK10的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 26具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
64.权利要求56的方法，其中所述ELMO1的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 27具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
65.权利要求56的方法，其中所述ELOV12的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 28具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
66.权利要求56的方法，其中所述FER1L4的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 29具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
67.权利要求56的方法，其中所述HUNK的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 30具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
68.权利要求56的方法，其中所述LRRC4的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 31具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
69.权利要求56的方法，其中所述NDRG4的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 32具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
70.权利要求56的方法，其中所述SFMBT2的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO:33、34、35或36中的任何一个具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
71.权利要求56的方法，其中所述ST8S1A1的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO:37具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
72.权利要求56的方法，其中所述TSPYL5的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 38具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
73.权利要求56的方法，其中所述VAV3的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 39具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
74.权利要求56的方法，其中所述ZNF568的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 40或41具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
75.权利要求56的方法，其中所述ZNF569的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 42具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
76.权利要求56的方法，其中所述ZNF610的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 43具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
77.权利要求56的方法，其中所述ZNF671的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 44具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
78.权利要求56的方法，其中所述ZNF682的差异性甲基化结构域包含与SEQ ID NO: 45具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列、其互补物或其片段。
79.权利要求57-78中任何一项的方法，其中所述核苷酸序列、互补物或所述片段的长度为至少20个核苷酸。
80.权利要求27-79中任何一项的方法，其中所述DNA甲基化的模式通过包括用将胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的亚硫酸氢盐化合物处理DNA的步骤来测定。
81.权利要求27-80中任何一项的方法，其中当在室温(23℃)下储存时，所述甲基化DNA模式在所述组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。
82.权利要求27-80中任何一项的方法，其中当在4℃下储存时，所述甲基化DNA模式在所述组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。
83.权利要求27-82中任何一项的方法，其中在-30℃至50℃范围内的温度下，甲基化DNA模式在所述组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。
84.权利要求27-82中任何一项的方法，其中在-10℃至30℃范围内的温度下，甲基化DNA模式在所述组合物中保存至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、两周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或2年。
85.保存生物样品的DNA甲基化模式的方法，其中所述生物样品用DNA/RNA Shield处理和/或储存于其中。
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