JP2012205590A - 遺伝子発現を用いた疲労の判定方法 - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】被験体由来(ヒトなど)の生体試料(血液、細胞など)における、特定の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び/又は比較することを含む、疲労の程度を判定する方法。
【選択図】なし
Description
疲労の程度を判定する方法については公的な対策も推進されており、広く知られている公的対策の一つとしては、睡眠の時間や質、労働時間、疲労感や抑うつ感などの項目からなる簡易な自己判断方法(労働者の疲労蓄積度チェックリストなど)が挙げられる(非特許文献3)。しかし、国内外における多数の研究にもかかわらず、疲労感などの自覚症状によることなく、疲労の程度を客観的に判定することが可能な方法として、広く認められた方法は未だにない。
さらに、コルチゾール、副腎性ホルモン又はそれらの代謝物、クロモグラニンA、モノアミン類などを用いた判定方法などは精神機能に大きく影響されることが知られている。
複数のアミノ酸やTGF-βなどを用いた判定方法は、単にエネルギー代謝を反映している場合もあり、疲労の程度を客観的に判定していないと考えられる。
例えば、末梢白血球における複数の遺伝子の発現量を一度に比較する方法によって、運動疲労状態を評価する方法が報告されている(特許文献7)。
この方法においては、被験者に運動を負荷した後において、末梢白血球における複数の遺伝子(1クラスタあたり7個から20個の遺伝子よりなる6種のクラスター、計117個の遺伝子)を用いて、疲労を評価している。しかし、疲労感の程度に応じて発現変動する遺伝子であるが、パフォーマンスの低下などの程度に応じて発現変動する遺伝子ではなく、客観的に疲労の程度を評価できるとは限らない。さらには、個々の遺伝子の発現変動の程度は不明確であり、抗疲労効果を有する被験物質により発現変動が抑制される遺伝子についても不明瞭であり、各クラスターに含まれる7個から20個の全ての遺伝子を用いなければ、運動疲労状態を客観的に評価できるとは言えない。
この方法においては、ヒトに運動を負荷し、外から生体に加わった外力である運動(ストレス刺激ストレッサー)に対して、そのゆがみを元に戻そうとする反応を“運動を起因とするストレス状態”としている。そして、その前後における複数の遺伝子の発現量を解析することにより、運動を起因とするストレス状態を客観的に評価できるとしている。しかし、この方法においては、“運動による生体のゆがみを元に戻そうとする反応”であるストレスを評価しており、“生体のゆがみ”を評価していない。ましてや、運動負荷による疲労の程度を客観的に評価していない。
(2) 被験体に被験物質を投与し、被験体由来の生体試料における表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び/又は比較することを含む、被験物質の疲労に対する有効性を判定する方法。
(5) 生体試料が、血液である、(1)から(4)のいずれか1項に記載の方法。
(6) 生体試料が、細胞である、(1)から(4)のいずれか1項に記載の方法。
(7) 疲労が生理的疲労である、(1)から(6)のいずれか1項に記載の方法。
(8) 疲労が肉体疲労である、(1)から(7)のいずれか1項に記載の方法。
(10)表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現量の変動を分析及び/又は比較する、(1)から(9)のいずれか1項に記載の方法。
(11)表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子について、少なくとも2個以上の当該遺伝子のうち発現変動が異なる遺伝子の数を分析及び/又は比較する、(1)から(10)のいずれか1項に記載の方法。
(18) 被験体由来の生体試料における遺伝子の発現変動量又は発現変動率が、疲労の状態の対照体及び/又は非疲労の状態の健常対照体における当該遺伝子の発現変動量又は発現変動率のどちらに近いかに基づいて行われ、疲労の状態の対照体に近い場合に、被験体は疲労の状態であると判定することを特徴とする、(1)から(16)のいずれか1項に記載の方法。
(19)被験物質の疲労に対する有効性を判定するにおいて、被験物質の投与に伴って被験体由来の生体試料における遺伝子の発現変動が減弱又は消失している場合に、被験物質は疲労に対して有効であると判定することを特徴とする、(1)から(18)のいずれか1項に記載の方法。
これらにより、簡便かつ客観的に疲労の程度を判定でき、疲労を回復、改善又は予防し得る物質の疲労に対する有効性を判定でき、これらの物質を探索することも可能である。さらに、疲労の程度が未知である被験体の疲労の程度を客観的に判定することにより、疲労の状態と判定された被験体は、睡眠や休息の確保、栄養補給や摂取、さらには、医薬品投与を適切に行うことが可能となり、疲労の回復、改善及び予防が容易に可能となり、国民の健康維持・増進に大きく寄与することとなる。
<疲労>
本発明における疲労は、特に限定されないが、一般的な意味としては、例えば、身体作業あるいは精神作業などにより、身体あるいは精神に負荷を与えた際に生じる作業効率(パフォーマンス)が低下した状態を示す。この場合、疲労の程度とは作業効率の低下の程度(度合い)を意味する。
本発明において、判定の対象となる疲労は、好ましくは生理的疲労である。また、好ましくは末梢性の疲労(末梢性疲労)であり、肉体疲労、身体疲労、筋肉疲労、運動疲労などがさらに好ましい。また、身体作業により筋肉などの末梢組織が疲労することに起因する肉体疲労などが特に好ましい。
「病的疲労」とは慢性疲労症候群、悪性腫瘍、細菌又はウイルス感染、後天性免疫不全症候群、糖尿病、うつ病などの疾病に伴う疲労を示す。
「薬剤由来の疲労」とは、抗ガン剤、免疫抑制剤、向精神剤などの薬剤の使用によって引き起こされる疲労を示す。
「末梢性疲労」とは、脳が主体となって疲労を感じている中枢性疲労の状態でなく、脳以外の末梢組織に起因する疲労を示し、いわゆる身体疲労、肉体疲労、筋肉疲労などが挙げられる。また、身体に負荷を与える作業(身体作業)や精神に負荷を与える作業(精神作業)、不適切な生活習慣(睡眠や休息、栄養の不足など)による末梢組織に起因する疲労である。
ここで言う身体作業や精神作業には、産業活動における労働作業のみでなく、日常生活における作業や運動、走行、自転車こぎ、階段の昇降などの動作も含む。
従って、非疲労の状態とは、病的疲労又は薬剤由来の疲労を呈していない状態であり、精神あるいは身体などへの負荷が少なく、十分な睡眠や休息が確保されており、栄養摂取量を満たしており、さらに、日常的に適度な運動を行い、中枢性及び末梢性の疲労を呈していない状態を示す。
本発明においては、被験体由来の生体試料における、特定の遺伝子の発現変動を分析及び/又は比較する。
本発明における「被験体」とは、好ましくは、生体試料を採取することが可能なヒト又は非ヒト哺乳動物であり、ヒトであることが特に好ましい。
「非ヒト哺乳動物」とは、ヒトを除く哺乳綱の脊椎動物を意味し、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど)、霊長類(例えば、サルなど)、並びにイヌなど、薬剤の有効性を判定する際に汎用される動物が好ましく、上記の中でもマウス及びラットが特に好ましい。
生体試料としては、被験体より採取することが可能である血液、脳脊髄液、唾液、精液などの体液や細胞が挙げられるが、特に限定されない。これらの試料は、倫理的な問題が生じないように採血又はバイオプシーなどにより、被験体から分離されることが望ましい。好ましくは、生体試料は、血液であり、さらに好ましくは血球などの血液細胞である。
細胞としては、例えば、血液細胞、肝細胞、筋細胞、神経細胞、グリア細胞、骨髄細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、間質細胞、又はこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。細胞は、好ましくは、筋細胞、肝細胞、血液細胞、又はそれらの前駆細胞もしくは幹細胞であり、ヒト由来の細胞であることがより好ましい。
本発明の方法においては、被験体由来の生体試料における、表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び/又は比較する。
表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子又はそのホモログ遺伝子は、少なくともヒト又はマウスにて公知の遺伝子であり、その塩基配列又はポリペプチド配列は公知であり、当業者に利用可能な遺伝子である。
「ホモログ遺伝子」とは、表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる遺伝子と機能的に同等な遺伝子のことを言う。ホモログ遺伝子のいくつかは、HGNCやNCBIなどに登録されている遺伝子より、容易に塩基配列又はポリペプチド配列などの遺伝子情報を入手することができる。
通常、機能的に同等な遺伝子は、塩基配列又はポリペプチド配列において、高い相同性や同一性を有しており、少なくとも50%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上の相同性又は同一性を示す。機能的に同等な遺伝子は、塩基配列を基にした遺伝子増幅法などを利用して単離及び特定することも可能である。
ここで言う「その一部を含む遺伝子」とは、ハイブリダイズする際に十分な配列長を有するものであれば、その長さは特に限定されないが、好ましくは少なくとも10塩基以上であり、より好ましくは10塩基以上100塩基以下であり、さらに好ましくは10塩基以上50塩基以下である。また、塩基配列又はポリペプチド配列などによって特定される各遺伝子には、例えば、各塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とハイブリダイズする遺伝子が含まれる。
本発明による、(1)被験体の疲労の程度を判定する方法、(2)疲労を回復、改善又は予防し得る物質(被験物質)の疲労に対する有効性を判定する方法、(3)疲労を回復、改善又は予防し得る物質を探索する方法においては、表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より遺伝子リストを作成し、遺伝子リストより選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び/又は比較する。
表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より作成される遺伝子リストに含まれる遺伝子としては、例えば、疲労の状態の被験体における遺伝子の発現変動が、非疲労の状態の健常対照体の発現変動と比較して、著しく異なっている遺伝子である。
疲労の状態の対照体由来及び/又は非疲労の状態の健常対照体由来の生体試料における遺伝子の発現変動は、前もって測定して得られた発現変動でもよいし、被験体の特定の遺伝子の発現変動を解析する際に同時に得た発現変動でもよい。
「精神作業」としては、精神的な負担により作業効率が低下する動作であり、例えば、内田・クレペリン精神作業、視覚入力作業、単純作業の反復に伴う作業、高い緊張下での複雑作業などの作業が好ましく、処理時間の遅延、あるいは誤処理の数量の増加を引き起こす作業がより好ましい。
また、疲労の状態である被験体由来の生体試料を用いて、十分な休息や睡眠の確保、栄養の摂取による疲労回復の前後において、著しく発現が変動している遺伝子から選定してもよい。
本発明においては、上記した特定の遺伝子の発現変動を分析及び/又は比較する。遺伝子の発現変動の分析及び/又は比較は、当該遺伝子又は当該遺伝子産物の発現量、発現強度、又は発現頻度などを測定し、得られたデータを解析することによって行うことができる。
「転写産物」とは、各遺伝子から転写の過程を経て生じる遺伝子、通常、RNAを示し、好ましくはmRNAを示す。
「翻訳産物」とは、各遺伝子から転写、翻訳の過程を得て生じるタンパク質を示し、未修飾であっても翻訳後修飾されていてもよい。
「翻訳後修飾」としては、リン酸、糖、糖鎖、リン脂質、脂質などによる修飾が挙げられる。
「標識」としては酵素標識、放射性標識、蛍光標識などが挙げられる。また、ビオチン、リン酸、アミンなどにより修飾されていてもよい。
複数の遺伝子の翻訳産物などを測定する場合においては、担体にこれらの抗体を固定化した抗体アレイ・チップを用いることも可能である。
ここでいう「翻訳産物の活性」とは、キナーゼ活性、プロテアーゼ活性、サイトカイン活性などが挙げられる。他の方法として、公知の二次元電気泳動、LC/MS質量分析法、クロマトグラフィー、核磁気共鳴分光法、免疫沈降法、Enzyme―Linked Immuno Sorbent Assay(ELISA)法などの方法でもよく、特に限定されない。
遺伝子の発現変動を比較する場合には、予め発現量などの測定値を公知の方法によって補正することができる。補正により、独立した複数の生体試料における遺伝子の発現変動をより正確に比較することが可能となる。測定値の補正は、疲労の状態の有無において発現量などが大きく変動しない遺伝子、例えば、ハウスキーピング遺伝子の発現量などの測定値に基づいて、特定の遺伝子の発現量などの測定値を補正することにより行われる方法や、全測定値の平均値及び分散値を用いる標準化処理方法などがあり、その他にも公知の方法がある。
ハウスキーピング遺伝子としては、グリセルアルデヒド3−リン酸脱水素酵素(GAPDH)やβ−アクチン(ACTB)などを挙げることができる。
遺伝子の発現変動の比較は、例えば、(i)遺伝子の発現量及び/又は発現変動量の増減の比較や、遺伝子の発現量及び/又は発現変動量が増減している遺伝子数の比較、又は(ii)統計的処理に基づいて行われ、対となる複数の遺伝子の発現変動の特徴を比較することが挙げられる。
ここでの「生体試料(A)」及び/又は「生体試料(B)」とは、例えば、疲労の状態の対照体由来の生体試料及び/又は非疲労の状態の健常対照体由来の生体試料などを示す。
発現変動を比較する遺伝子が2個である場合、例えば、生体試料(B)に発現している遺伝子(x)及び遺伝子(y)の発現量などが、生体試料(A)に発現している遺伝子(x)及び遺伝子(y)の発現量などを比較して、それぞれの遺伝子の発現量などにおいて“増加”、“減少”又は“変動なし”と判断することができる。
また、それぞれの遺伝子の発現量などの平均値又は中央値を分析及び/又は比較することにより“増加”、“減少”又は“変動なし”と判断することができる。
また、遺伝子(x)及び遺伝子(y)の発現量が増減している遺伝子の数を比較し、全体としての発現挙動、発現量が変動している遺伝子の占める割合など、遺伝子の発現量の状態を判定できる情報、すなわち遺伝子の発現変動の特徴により判断することができる。
他にも、遺伝子(x)の発現量の増減に対する遺伝子(y)の発現量の増減を比較して判断することもできるし、発現量が増加している遺伝子の数及び発現量が減少している遺伝子の数を、それぞれ比較して判断することもできる。
本発明による疲労の程度の判定方法においては、被験体由来の生体試料における、表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び/又は比較することによって”疲労の程度”を判定する。
具体的には、生体試料における当該特定の遺伝子の発現量が非疲労の状態の健常対照体における発現量と比較して増加又は減少している場合に、疲労の状態であると判定し、その発現量の変動の程度を疲労の程度とすることができる。
発現変動量F=発現量(f)−発現量(a)
「発現変動率」とは、特定の遺伝子の発現変動量Fが、非疲労の状態の健常対照体由来の生体試料における発現量(a)に対する割合を示す(発現変動率F(%))。
発現変動率F(%)=[発現変動量F/発現量(a)]×100
また、被験体由来の生体試料における遺伝子の発現量(f)が、疲労状態の対照体における発現量(b)及び/又は非疲労の状態の健常対照体における発現量(a)のどちらに近いかに基づいて行われ、疲労状態の対照体に近い発現量の場合に、被験体は疲労の状態であると判定し、その発現変動量又は発現変動率を疲労の程度とすることができる。
また、被験体由来の生体試料における遺伝子の発現変動量F又は発現変動率F(%)が、疲労状態の対照体及び/又は非疲労の状態の健常対照体における発現変動量又は発現変動率のどちらに近いかに基づいて行われ、疲労状態の対照体における発現変動量B又は発現変動率B(%)に近い場合に、被験体は疲労の状態であると判定し、疲労状態の対照体における発現変動量又は発現変動率に対する割合を疲労の程度Fとすることができる。
疲労の程度F =[発現変動量F/発現変動量B]×100
及び/又は
疲労の程度F =[発現変動率F/発現変動率B]×100
(a)非疲労の状態の健常対照体由来の生体試料における遺伝子の発現量(a)を測定する工程、
(b)疲労を呈している被験体由来の生体試料における遺伝子の発現量(b)を測定する工程、
(c)疲労における発現量の差(発現変動量B=発現量(b)−発現量(a))を算出する工程、
(d)疲労における発現変動の比率(発現変動率B(%)=[発現変動量B/発現量(a)]×100(%))を算出する工程、
(e)発現変動量B及び/又発現変動率B(%)をそれぞれ“疲労の程度100”と変換する工程、及び、
(f)疲労の程度が未知の被験体由来の生体試料における発現量(f)と非疲労の状態の健常対照体における発現量(a)との差(発現変動量F=発現量(f)−発現量(a))及び/又は発現変動の比率(発現変動率F(%)=[発現変動量F/発現量(a)]×100(%))を算出し、次のいずれかの式より疲労の程度を判定する工程、及び、
式1: 疲労の程度 =[発現変動量F/発現変動量B]×100
式2: 疲労の程度 =[発現変動率F/発現変動率B]×100
(g)疲労の程度が、0に近似している場合に“非疲労の状態である”と判定し、100に近似している場合に“被験体は疲労の状態である”と判定する工程、
より、作成する方法がある。
さらには、例えば、“疲労の程度50”以上と判定された被験体においては休息の確保、栄養補給や摂取を適切に行うことを選択したり、“疲労の程度75”以上と判定された被験体においては医薬品投与を適切に行うことを選択することなどが可能となり、疲労の回復、改善及び予防が容易に可能となる。
疲労の程度を判定する基準となる発現変動量及び/又は発現変動率は、適宜増減することもできる。
本発明にかかる疲労の程度の判定方法は、血液などの生体試料における遺伝子の発現量を測定する工程と、生体試料における遺伝子の発現量の測定結果に応じて、発現変動量や発現変動率の算出による被験体の疲労の程度を判定する工程とを含むが、特に発現変動量や発現変動率の算出による被験体の疲労の程度を判定する工程に演算装置を利用することができる。
本発明によれば、被験体に被験物質を投与し、被験体由来の生体試料における表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び/又は比較し、被験物質を投与した被験体の疲労の程度の判定をすることによって、当該被験物質の疲労に対する有効性(効果)を判定することができる。
(i)疲労の状態である被験体に被験物質又はこれを含む製剤を投与し、投与後の当該被験体の生体試料における表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動量F又は発現変動率F(%)を解析する工程、
(ii)疲労の状態である被験体に被験物質又はこれを含む製剤を投与せず、当該被験体の生体試料における上記と同一の1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動量B又は発現変動率B(%)を解析する工程、
(iii)工程(i)における遺伝子の発現変動量F又は発現変動率F(%)が、工程(ii)における遺伝子の発現変動量B又は発現変動率B(%)などより減弱又は消失している場合に、被験物質又はこれを含む製剤を投与した被験体の疲労の程度が減弱又は消失していると判定する工程、及び
(iv)工程(iii)において、被験物質又はこれを含む製剤を投与した被験体の疲労の程度は減弱又は消失していると判定した場合に、被験物質又はこれを含む製剤は疲労に対して有効であると判定する工程、
を含む、被験物質の疲労に対する有効性を判定する方法。
ここで、工程(i)と工程(ii)における疲労状態の被験体は同一の個体であっても、別々の個体であってもよい。
具体的な態様を以下に示す。
(i)疲労の状態である被験体に被験物質又はこれを含む製剤を投与し、投与後の当該被験体の生体試料における、表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる2個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動量F又は発現変動率F(%)を解析する工程、
(ii)疲労の状態である被験体に被験物質又はこれを含む製剤を投与せず、当該被験体の生体試料における上記と同一の2個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動量B又は発現変動率B(%)を解析する工程、
(iii)工程(i)における発現変動率F(%)などが、工程(ii)におけるにおける発現変動率B(%)などより減弱又は消失している場合に、被験物質又はこれを含む製剤を投与した被験体の疲労の程度が減弱又は消失していると判定する工程、及び
(iv)工程(iii)において、被験物質又はこれを含む製剤を投与した被験体の疲労の程度は減弱又は消失していると判定した場合に、被験物質又はこれを含む製剤は疲労に対して有効であると判定する工程、
を含む、被験物質の疲労に対する有効性を判定する方法。
ここで、工程(i)と工程(ii)における疲労状態の被験体は同一の個体であっても、別々の個体であってもよい。
疲労に対する有効性を判定する基準となる疲労の程度は、適宜増減することもできる。
本発明においては、被験体に被験物質を投与し、被験体由来の生体試料における表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び/又は比較し、当該遺伝子の発現を変動させる物質を、疲労を回復、改善又は予防し得る候補物質として選択することによって、疲労を回復、改善又は予防し得る物質を探索することができる。
この方法によれば、疲労に対して有効である被験物質を投与した疲労状態の被験体由来の生体試料を用いて疲労の程度を判定した場合には、例えば、被験体は“疲労の程度75”以下、さらには、“疲労の程度50”以下の判定となりやすく、疲労を増悪させる被験物質を投与した疲労状態の被験体由来の生体試料を用いて疲労の程度を判定した場合には、被験体は“疲労の程度150”以上の判定となりやすい。
本発明によれば、表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び/又は比較するための疲労判定試薬又は疲労判定キットが提供される。本発明の疲労判定試薬又は疲労判定キットには、表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の遺伝子産物に特異的なプローブ又はプライマー、又は上記遺伝子の遺伝子産物に特異的な抗体が含まれている。本発明の疲労判定試薬又は疲労判定キットには、更に所望により、標識、標識二次抗体、担体、サンプル希釈液、酵素基質、反応停止液、標準物質、遺伝子の発現量、発現変動、発現変動量、発現変動率や特徴などから疲労の程度を判定するための資料などを含めてもよい。さらに必要に応じて、洗浄バッファー、保存剤、防腐剤などを加えることもできる。本発明の疲労判定試薬又は疲労判定キットに含まれるプライマー、プローブ、抗体などは、1種のみでもよいし、2種以上を組み合わせてもよい。これらは、固体でも液体でもよく、単一又複数の固相上に固定されているもの、例えば、マイクロタイタープレートのようなプレートに個別に分注された状態となっていてもよいし、アレイ・チップに固定された状態でもよい。
本発明においては、疲労の程度が未知の被験体由来の生体試料において、表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を解析することにより、被験体の疲労の程度を判定できる。従って、表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子、及びその遺伝子産物は、疲労のバイオマーカー(生物学的指標)として用いることができる。
(方法)
実験動物には、7から11週齢のBALB/c系マウス、オス(日本エスエルシー(株))を用いた。実験動物は入荷後、試験期間を通して標準飼料(オリエンタル酵母工業(株))及び滅菌水を自由に摂取させ、少なくとも1週間の馴化を行った。試験には、非疲労状態である健常マウスを16匹使用した。遺伝子リストの作成及び疲労の程度の判定方法の開発は、(1)走行運動の負荷、(2)採血、(3)mRNAの抽出、(4)遺伝子の発現量の解析、及び(5)遺伝子リストの作成、の工程よりなる。遺伝子リストは、アレイ・チップを用いた遺伝子の発現量の解析によって作製した。
実験群は、非走行運動負荷マウス(4匹)、走行運動負荷終了1時間後マウス(4匹)、走行運動負荷終了4時間後マウス(4匹)及び走行運動負荷終了翌日マウス(4匹)とし、非走行運動負荷マウス以外のマウスに走行運動を負荷した。走行運動の負荷は、マウス・ラット用トレッドミル走行装置(室町機械(株)又はバイオリサーチセンター(株))を用いて行った。走行運動の負荷条件は、傾斜角度10度、走行開始速度9メートル/分、漸増ステップ3メートル/4分とした。 走行時間は、疲労困憊の状態である、52分間とした。尚、走行訓練を3から4日間隔で4回実施し、疲労を惹起させる走行運動の負荷は最終走行訓練の3から4日後に実施した。走行訓練は全てのマウスに行った。
走行運動負荷したマウスからの採血は、走行運動負荷終了から1時間後、4時間後、翌日にイソフルランにより無痛状態とし、腹部大静脈より採血して安楽死させた。
血液には速やかに、Isogen−LS(ニッポンジーン社)を添加して溶解及び安定化した後に、液体窒素により凍結し、RNA抽出に供した。
非走行運動負荷マウスは運動負荷をすることなく、同様の処置により安楽死させ、同様の方法を行った。
溶解及び安定化された状態の血液サンプル2mlを用いて精製を行った。血液サンプル2mlに対し、クロロホルム400μlを加えて、十分ボルテックスし、遠心の後、水層800から1000μlをRNA粗抽出液として回収した。得られたRNA粗抽出液をRNeasy Mini kit中のColumnに流し入れ、RNAを吸着させた。洗浄後60μlのヌクレアーゼ不含水(nuclease−free water)に溶解させた。RNAを含むヌクレアーゼ不含水1μlを、ND−1000 Spectrophotometer(NanoDrop)を用いてRNAの定量及び純度指標による品質確認を行った。RNAを含むヌクレアーゼ不含水1μlを常法によりRNAを変性後、BioAnalyzer 2100 (Agilent)を用いて電気泳動し、分解度指標による品質確認を行った。その後、5μgの抽出したTotal RNAから、GLOBI NclearTM−Mouse/Rat Kit(Ambion社)を用いて、同キットの規定プロトコールに従って、血液中に大量に含まれるグロビンmRNAの除去処理を行い、30μlのKit付属Elution Bufferに溶解させた。RNAを含むKit付属Elution Buffer1μlを、ND―1000 spectrophotometer(NanoDrop)を用いてRNAの定量及び純度指標による品質確認を行った。RNAを含むKit付属Elution Buffer 1μlを常法によりRNAを変性後、BioAnalyzer 2100 (Agilent)を用いて電気泳動し、分解度指標による品質確認を行った。
Affymetrix社において作製されたゲノム上の既知、及び想定される28853個の遺伝子について25mer×770317個の対象と完全一致するオリゴヌクレオチド・プローブ(パーフェクトマッチプローブ)が搭載されたDNAマイクロアレイ(GeneChip(登録商標)Mouse Gene 1.0 ST Array)を用い、遺伝子発現量の解析を行った。
試験により選定した、疲労の程度の判定に用いる特定の遺伝子を次に示す。
走行運動負荷1時間後かつ4時間後において、原則として、35.0%以上増加又は25.9%以上減少し、翌日に発現変動が消失したマウスの遺伝子は146個であり、マウスの遺伝子リストを作成した。遺伝子リストは表2と同じである。
(方法)
表2に記載の遺伝子及び機能解析により選ばれる特定の遺伝子からなる遺伝子リストを作成し、疲労の程度が未知のマウス由来の末梢血液における遺伝子の発現変動量を分析及び比較し、“発現変動率”から“疲労の程度”を算出することによって、疲労の程度が未知の被験体(マウス)の疲労の程度を判定した。
疲労の程度を判定できる遺伝子リストの作成及び疲労の程度が未知の被験体における疲労の程度の判定は、(1)疲労困憊の状態である疲労動物モデル及び疲労の程度が未知の疲労動物モデルの作製、(2)動物からの血液の採取、(3)血液からの遺伝子産物(RNA)の抽出、(4)遺伝子産物の発現量の解析、(5)疲労の程度を判定できる資料(データベース)の作成、及び(6)疲労の程度が未知の疲労動物モデルの疲労の程度の判定、の工程よりなる。
実験群は、非走行運動負荷マウス(4匹)、走行運動負荷終了2時間後マウス(4匹)及び軽度走行運動負荷終了2時間後マウス(4匹)とし、非走行運動負荷マウス以外のマウスに走行運動を負荷した。
走行運動の負荷は、マウス・ラット用トレッドミル走行装置(バイオリサーチセンター(株))を用いて行い、走行運動の負荷条件は、傾斜角度10度、走行開始速度9メートル/分、漸増ステップ3メートル/4分とした。
走行運動負荷終了2時間後マウスの走行時間は、疲労困憊の状態までとした(52分間)。軽度走行運動負荷終了2時間後マウスの走行時間は20分間とした。
尚、走行訓練を3から4日間隔で4回実施し、疲労を惹起させる走行運動の負荷は最終走行訓練の3から4日後に実施した。走行訓練は全てのマウスに行った。
走行運動負荷終了2時間後マウス及び軽度走行運動負荷終了2時間後マウスは、それぞれ走行運動負荷の2時間後に深麻酔条件にて安楽死させ、腹部大静脈より血液を1ml採取し、ヌクレアーゼ不含水1mlを添加し、Isogen−LS(ニッポンジーン社)2mlを添加し、血液を溶解した。
非走行運動負荷マウスは走行運動負荷をすることなく安楽死させ、同様の方法を行った。
Isogen−LSからの溶解されたRNAの粗抽出は、同試薬のプロトコールに従って実施した。粗抽出されたRNAは、RNeasy Mini Kit(Qiagen社)を用いてカラム精製を行った。カラム精製後のTOTAL RNAに対して一旦定量とクオリティチェックを行った後、必要十分量のRNAから、血液に大量に含まれており、発現解析の妨げとなるグロビンmRNAの除去処理を行った後、再度、定量とクオリティチェックを実施し、問題のないことを確認した。グロビンmRNA除去処理にはGLOBI Nclear-Mouse/Rat (Ambion社)を用いた。さらに、NanoDrop 1000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific社)を使用しtotal RNAの濃度を測定する。その後Agilent RNA 6000 Nano Kit(Agilent Technologies社)を使用し、Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies社)で電気泳動を行いtotal RNAのRIN値を測定し、問題のないことを確認した。
逆転写反応液を調製し、GeneAmp PCR System 9700(Life Technologies社)を用いて、RNAの逆転写反応を行った。
次に、BioMark 96.96 ダイナミックアレイの機器及び試薬添付のプロトコルに従い、Sample inletsにSample mixを、Assay inletsにAssay mixをアプライし、BioMarkによりリアルタイムPCR反応を行った。PCR反応回数は最大35サイクルとした。測定の反復回数は3回とした。
上記試験において使用した42個の各遺伝子に対応するプライマーの配列は表4に示すとおりである(配列表の配列番号1から84)。
非走行運動負荷マウスにおける各遺伝子の発現量(a)及び走行運動負荷終了2時間後マウスの発現量(b)を算出し、各発現量の差(発現変動量B)、及びその比率(発現変動率B(%))を算出した。次に、発現変動量B及び又は発現変動率B(%)を “疲労の程度100”と設定した。
発現変動量B=発現量(b)−発現量(a)
発現変動率B(%)=[発現変動量B/発現量(a)]×100
発現変動量F=発現量(f)−発現量(a)
発現変動率F(%)=[発現変動量F/発現量(a)]×100
疲労の程度=[発現変動率F/発現変動率B]×100
表5に記載の遺伝子42個それぞれにおいて、走行運動負荷終了2時間後マウスの発現量を非走行運動負荷マウスにおける遺伝子の発現量と比較すると、30%以上の増加、又は―68%以下の減少が認められた。
Claims (20)
- 被験体由来の生体試料における、表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び/又は比較することを含む、疲労の程度を判定する方法。
- 被験体に被験物質を投与し、被験体由来の生体試料における表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び/又は比較することを含む、被験物質の疲労に対する有効性を判定する方法。
- 被験体に被験物質を投与し、被験体由来の生体試料における表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現変動を分析及び/又は比較し、当該遺伝子の発現を変動させる物質を、疲労を回復、改善又は予防し得る候補物質として選択することを含む、疲労を回復、改善又は予防し得る物質を探索する方法。
- 被験体が、ヒト又は非ヒト哺乳動物である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 生体試料が、血液である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 生体試料が、細胞である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 疲労が生理的疲労である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 疲労が肉体疲労である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 肉体疲労を引き起こすために被験体に対して筋運動を負荷させる工程をさらに含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現量の変動を分析及び/又は比較する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子について、少なくとも2個以上の当該遺伝子のうち発現変動が異なる遺伝子の数を分析及び/又は比較する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 表2に記載のNo.001〜No.112の遺伝子及び表3に記載のNo.001〜No.109の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現の増大を分析及び/又は比較し、及び/又は表2に記載のNo.113〜No.146の遺伝子及び表3に記載のNo.110〜No.148の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子の発現の減少を分析及び/又は比較する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子が、ARG2遺伝子、BLVRB遺伝子、BRP44遺伝子、C19orf59遺伝子、CCR1遺伝子、CCRL2遺伝子、CD33遺伝子、CHI3L1遺伝子、CLEC4D遺伝子、CLEC4E遺伝子、CSTA遺伝子、CXCR1遺伝子、CXCR2遺伝子、CXCR2P1遺伝子、EMR2遺伝子、EMR3遺伝子、EMR4P遺伝子、FPR1遺伝子、GPR109A遺伝子、GPR109B遺伝子、GZMA遺伝子、HMBS遺伝子、HP遺伝子、HPR遺伝子、IL1R2遺伝子、IRG1遺伝子、KLRAP1遺伝子、KLRK1遺伝子、MMP8遺伝子、OXER1遺伝子、P2RY13遺伝子、PLIN2遺伝子、RAB3IL1遺伝子、S100A8遺伝子、SLFN12遺伝子、SLFN12L遺伝子、SPATC1遺伝子、TARM1遺伝子、TAS2R60遺伝子、TMOD1遺伝子、TREM1遺伝子、TSPO2遺伝子、TSTD2遺伝子又はVTI1B遺伝子、又はそれらのホモログ遺伝子である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子が、ACE遺伝子、ACP1遺伝子、ACTA2遺伝子、ACTG2遺伝子、AFMID遺伝子、ALOX15遺伝子、ARG2遺伝子、ATP5L遺伝子、BLVRB遺伝子、BST1遺伝子、C5AR1遺伝子、CA2遺伝子、CBR1遺伝子、CCL5遺伝子、CCR1遺伝子、CCR3遺伝子、CD14遺伝子、CD33遺伝子、CHI3L1遺伝子、CXCR1遺伝子、CXCR2遺伝子、F8遺伝子、FPR1遺伝子、GZMA遺伝子、HDC遺伝子、HMBS遺伝子、HPR遺伝子、IFITM1遺伝子、IFNA1遺伝子、IFNA10遺伝子、IFNA13遺伝子、IFNA14遺伝子、IFNA16遺伝子、IFNA17遺伝子、IFNA2遺伝子、IFNA21遺伝子、IFNA4遺伝子、IFNA5遺伝子、IFNA6遺伝子、IFNA7遺伝子、IFNA8遺伝子、IL13RA1遺伝子、IL1B遺伝子、IL1R2遺伝子、IL2RB遺伝子、ISG15遺伝子、KLRB1遺伝子、KLRD1遺伝子、KLRK1遺伝子、MITF遺伝子、NCR1遺伝子、OAS3遺伝子、OR10A3遺伝子、OR10A6遺伝子、OR51V1遺伝子、P2RY13遺伝子、PIGY遺伝子、PPP1R3D遺伝子、RARS遺伝子、S1PR5遺伝子、SERPINB10遺伝子、SOCS3遺伝子、TAS2R60遺伝子、TK1遺伝子、UBE2F遺伝子、UPP1遺伝子、UROD遺伝子又はVTI1B遺伝子、又はそれらのホモログ遺伝子である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子が、ARG2遺伝子、BLVRB遺伝子、CCR1遺伝子、CD33遺伝子、CHI3L1遺伝子、CXCR1遺伝子、CXCR2遺伝子、FPR1遺伝子、GZMA遺伝子、HMBS遺伝子、HPR遺伝子、IL1R2遺伝子、KLRK1遺伝子、P2RY13遺伝子、TAS2R60遺伝子又はVTI1B遺伝子である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子が、ACTA2遺伝子、ACTG2遺伝子、PLIN2遺伝子、ARG2遺伝子、CD33遺伝子、CHI3L1遺伝子、CCR1遺伝子、FPR1遺伝子、HDC遺伝子、HMBS遺伝子、IL1B遺伝子、CXCR1遺伝子、CXCR2遺伝子、CXCR2P1遺伝子、MXD1遺伝子、MMP8遺伝子、PPP1R3D遺伝子、S100A8遺伝子、S100A9遺伝子、IL1R2遺伝子、IFITM1遺伝子、HCAR3(GPR109B)遺伝子、IFITM3遺伝子、IFITM2遺伝子、XPO7遺伝子、TREM1遺伝子、SLFN12遺伝子、RTP4遺伝子、PRAM1遺伝子、OXER1遺伝子、CLEC4D遺伝子、TAS2R60遺伝子、HCAR2(GPR109A)遺伝子、SLFN12L遺伝子、TARM1遺伝子、ALOX15遺伝子、GZMA遺伝子、CCL5遺伝子、NCR1遺伝子、KLRK1遺伝子、EMR2遺伝子、EMR3遺伝子、EMR4P遺伝子、ADAM8遺伝子、TCN2遺伝子、OLFM4遺伝子、GPR77遺伝子、STEAP4遺伝子、DGAT2遺伝子、HLA−DQB1遺伝子、HLA−DQB2遺伝子、KLRC4−KLRK1遺伝子又はHDAC9遺伝子である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 被験体由来の生体試料における遺伝子の発現量が、疲労の状態の対照体及び/又は非疲労の状態の健常対照体における当該遺伝子の発現量のどちらに近いかに基づいて行われ、疲労の状態の対照体に近い場合に、被験体は疲労の状態であると判定することを特徴とする、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 被験体由来の生体試料における遺伝子の発現変動量又は発現変動率が、疲労の状態の対照体及び/又は非疲労の状態の健常対照体における当該遺伝子の発現変動量又は発現変動率のどちらに近いかに基づいて行われ、疲労の状態の対照体に近い場合に、被験体は疲労の状態であると判定することを特徴とする、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 被験物質の疲労に対する有効性を判定するにおいて、被験物質の投与に伴って被験体由来の生体試料における遺伝子の発現変動が減弱又は消失している場合に、被験物質は疲労に対して有効であると判定することを特徴とする、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 表2、表3、表5又は表6に記載の遺伝子より選ばれる1個以上の遺伝子又はそのホモログ遺伝子に特異的なプローブ又はプライマー、又は上記遺伝子の遺伝子産物に特異的な抗体を含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法において上記遺伝子の発現変動を分析及び/又は比較するための疲労判定試薬又は疲労判定キット。
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