KR101594735B1

KR101594735B1 - 비만 조기진단용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101594735B1
Application number: KR1020150114345A
Authority: KR
Inventors: 최명숙; 정운주; 류리
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2015-08-13
Filing date: 2015-08-13
Publication date: 2016-02-17
Also published as: WO2017026692A1

Abstract

본 발명은 비만 조기진단용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 경도비만군에서만 발현이 감소하는 Lpar5 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비만 조기진단용 조성물, 조기진단을 위한 정보제공방법, 및 대사증후군 치료 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 Lpar5 유전자는 체질량지수를 기준으로 분류한 정상군과 비교하여 대사증후군을 보유한 경도비만군에서 발현이 유의하게 감소되어 있으며, 테로카판 강화 콩잎주정추출물 복용시 Lpar5 유전자의 발현증가에 따라 대사증후군이 개선됨을 확인하였다. 따라서 Lpar5 유전자는 대사증후군을 포함하는 비만 관련 합병증의 예방 또는 치료를 위한 조기진단, 약물반응 진단, 비만 관련 합병증 치료 타겟, 및 치료 물질 개발 스크리닝을 위한 바이오마커로써 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

비만 조기진단용 조성물 및 이의 용도{Composition for early diagnosis of obesity and uses thereof}

본 발명은 비만 조기진단용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 경도비만군에서만 발현이 감소하는 Lpar5 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비만 조기진단용 조성물, 조기진단을 위한 정보제공방법, 및 대사증후군 치료 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.

최근 정신 및 사회적 요인을 포함한 유전, 질병, 약물 등의 다양한 원인에 의해 전 세계적으로 비만 인구가 점점 증가하고 있는 추세이며, 이에 따라 비만으로 인해 유발되는 관련 합병증 환자들도 증가하고 있다. 2010년 세계 보건기구(WHO)에 따르면, 과체중 성인 인구는 전 세계적으로 약 16억 명, 비만인은 약 4억 명으로 집계되었으며, 매년 260만 명이 비만과 과체중으로 사망한다고 보고되었다. 국내의 경우 2013년도 통계청 자료에 따르면 성인 비만 유병률은 2012년 기준 32.8%로 전년도에 비해 증가했다고 보고된 바 있다. 이처럼 비만은 생명을 위협하고 삶의 질을 떨어뜨리는 하나의 질병으로써 전 세계적으로 비만의 예방 및 치료에 대한 관심과 그 중요성이 커지고 있다.

비만은 그 자체의 위험성보다 비만으로 인해 유발될 수 있는 여러 합병증 때문에 그 심각성이 더욱 크게 인식되고 있다. 비만은 고혈압, 고지혈증, 당뇨병 등의 대사증후군, 지방간, 관절 이상, 및 암 발병 위험을 증가시킨다고 알려져 있다. 2010년 세계보건기구에서 발표한 바에 따르면, 정상 체중인 사람에 비해 비만인 사람에게서 고혈압, 당뇨병, 이상지질혈증이 동반될 위험이 2배 이상(고혈압 2.5배, 당뇨병 2배, 고콜레스테롤혈증 2.3배, 고중성지질혈증 2.4배) 높게 나타났다.

이상지질혈증은 비만으로 인한 혈중 지질 변화로써 중성지방(triglyceride; TG) 증가, 유리지방산(free fatty acid; FFA) 증가, HDL-콜레스테롤 감소 및 고밀도지질단백질(high density lipoprotein; HDL) 기능장애, LDL-콜레스테롤 증가 및 정상, 식후 고지혈증과 죽상경화성잔여 지단백(atherogenic remnant lipoprotein) 축적, 간에서의 아포지질단백 B(apolipoprotein B, Apo B) 과잉 생성 등이 나타난다. 비만에 의한 이상지질혈증은 인슐린 저항성에서 기인하는 것으로 이러한 지질변화는 심혈관계 질환의 위험성을 증가시킨다.

대사증후군은 비만, 혈압상승, 이상지질혈증, 혈당 상승 등의 질환이 함께 동반되어 나타나는 대사적 이상상태로, 그 기전이 확실히 정립되어 있지 않다. 대사증후군은 생활습관 개선을 통해 발병을 늦추거나 예방할 수 있다고 알려져 있으나, 발병하면 제2형 당뇨병, 심혈관질환, 암(유방암, 대장암 등) 등의 발생 위험을 증가시켜 수명을 단축시키고 사망률 증가를 가져올 수 있으며, 삶의 질을 저하시키므로 예방이 중요하다. 따라서 비만으로 인한 대사증후군 및 관련 합병증의 예방을 위해서는 무엇보다 비만을 조기진단함으로써 관련 질병들의 발병위험을 낮추는 것이 중요하다.

이에, 본 발명자들은 경도비만군에서만 Lpar5 유전자의 발현이 감소되어 있음을 확인하여 비만 조기진단용 바이오마커로써 Lpar5 유전자를 발굴하였다.

본 발명자들은 비만과 관련 합병증의 조기진단을 위한 유전자 마커를 발굴하기 위해 연구한 결과, 체질량지수에 따라 분류된 정상군에 비하여 경도비만군에서 Lpar5 유전자의 발현이 감소되어 있고, 비만과 이상지질혈증을 포함하는 대사증후군을 보유한 경도비만군에 콩잎주정추출물을 복용시킨 결과 대사증후군 개선과 함께 Lpar5 유전자의 발현이 증가함을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 Lpar5 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비만 조기진단용 조성물 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 Lpar5 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 비만 조기진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 Lpar5 유전자를 이용하여 대사증후군 치료 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Lpar5 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비만 조기진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 비만 조기진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 Lpar5 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 비만 조기진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 mRNA의 발현수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), RNA 염기서열분석(RNA sequencing), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 단백질 발현수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 대사증후군 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

(a) Lpar5 유전자를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;

(b) 상기 세포에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(c) 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 Lpar5 유전자의 발현을 증가시키는 시험물질을 대사증후군 치료 물질로 선정하는 단계.

본 발명의 일 구현예로, 상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 Lpar5 유전자는 체질량지수를 기준으로 분류한 정상군과 비교하여 대사증후군을 보유한 경도비만군에서 발현이 유의하게 감소되어 있으며, 테로카판 강화 콩잎주정추출물 복용시 Lpar5 유전자의 발현증가에 따라 대사증후군이 개선됨을 확인하였다. 따라서 Lpar5 유전자는 대사증후군을 포함하는 비만 관련 합병증의 예방 또는 치료를 위한 조기진단, 약물반응 진단, 비만 관련 합병증 치료 타겟, 및 치료 물질 개발 스크리닝을 위한 바이오마커로써 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 한국남성 지원자들을 체질량지수(BMI)에 따라 분류하고 말초혈액단핵세포에서 발현이 변화하는 유전자를 발굴하기 위한 개략적인 실험디자인을 그림으로 도시한 것이다.
도 2는 정상대조군(Normal)과 비만군(Obese A 및 Obese B)의 혈중 지질 함량을 측정하여 나타낸 결과이다.
도 3은 정상대조군(Normal)과 비만군(Obese A 및 Obese B)의 말초혈액단핵세포에서 유전자 전사체의 발현을 분석한 결과, Lpar5 유전자가 경도비만군에서만 유의하게 발현이 감소되어있음을 보여주는 결과이다.
도 4는 과체중, 비만을 포함한 대사증후군을 보유한 한국인 성인 남녀를 대상으로 테로카판 강화 콩잎주정추출물에 의한 혈중 지질함량 및 말초혈액단핵세포의 전사체 분석을 위한 개략적인 실험디자인을 그림으로 도시한 것이다.
도 5는 테로카판 강화 콩잎주정추출물을 12주 동안 복용한 후 혈중 지질 및 포도당 함량을 측정한 결과이다.
도 6은 테로카판 강화 콩잎주정추출물을 12주 동안 복용한 후 말초혈액단핵세포의 Lpar5 유전자의 발현이 증가하였음을 보여주는 결과이다.

본 발명자들은 비만과 관련 합병증의 조기진단을 위한 유전자 마커를 발굴하기 위해 연구한 결과, 정상군과 비교하여 경도비만군에서만 발현이 유의하게 감소된 유전자를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 Lpar5(NCBI 접근(accession) 번호: HQ995529) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비만 조기진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조기진단 대상 질병인 “비만(obesity)”은 대사 장애로 인하여 체내에 지방세포가 증식 분화하고 이로 인하여 지방이 과잉으로 축적된 상태를 의미하며, 이상지질혈증을 동반하는 대사증후군을 포함하여 관련 합병증을 유발할 수 있다. 에너지 흡수량이 소비량에 비해 상대적으로 증가하는 경우, 지방세포의 수와 부피가 증가되는 과정을 거쳐 결과적으로 지방조직의 질량이 증가된다. 본 발명에서 비만은 체질량지수(BMI) 25 ㎏/m² 이상을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “진단”이란 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 합병증의 유무, 및 예후 등이다. 본 발명에서 진단은 비만의 발병 여부 및 비만 수준 등을 판단하는 것이며, 조기진단은 병이 발병한지 얼마 되지 않았을 때 진단하는 것을 의미하고 본 발명에서는 체질량지수 25 이상 27.5 ㎏/m²의 경도비만 수준에서 비만으로 판정되는 것을 포함한다.

본 발명의 일실시예에서는, 한국인 성인남성 지원자들을 체질량지수에 따라 정상군, 경도비만군, 및 중등도비만군으로 분류하고 이들의 혈중 지질함량을 측정하여 분석하였으며, 혈액에서 분리한 말초혈액단핵세포(PBMC)로부터 RNA를 추출하여 마이크로어레이를 통해 유전자 전사체 프로파일을 비교 분석하였다. 그 결과 중등도비만군뿐 만 아니라 경도비만군에서도 이상지질혈증이 나타남을 알 수 있었으며(실시예 2 참조), 전사체 프로파일 분석을 통해 경도비만군에서만 Lpar5 유전자가 유의하게 감소되어있음을 확인하였다(실시예 3 참조).

상기 Lpar5 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어, “프라이머(primer)”란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “프로브(probe)”란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.

상기 Lpar5 유전자의 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어, “항체”란 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 단클론(monoclonal) 항체 및 다클론(polyclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다. 단클론항체는 하이브리도마 세포를 이용한 방법, 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 상기 과정에 필요한 기술은 당업계에 잘 알려져 있어 용이하게 실시할 수 있다. 다클론항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 비만 조기진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 진단 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.

예컨대, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl₂를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량구조 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 마커 유전자가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이 형태일 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함하며, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 상기 ELISA 키트는 “항원-항체 복합체”를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소, 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “항원-항체 복합체”란 유전자가 코딩하는 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미한다. 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미세입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 피검체 유래의 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨 등을 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 혈액일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 혈액 내 말초혈액단핵세포일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

상기 mRNA의 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), RNA 염기서열분석(RNA sequencing), 마이크로어레이(microarray), 또는 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단백질 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 또는 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 "비만의 조기진단을 위한 정보제공방법"은 진단을 위한 예비적 단계로써 비만의 조기진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 Lpar5 유전자를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 상기 세포에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 Lpar5 유전자의 발현을 증가시키는 시험물질을 대사증후군 치료 물질로 선정하는 단계를 포함하는, 대사증후군 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 실시예에서는, 과체중, 비만, 및 이상지질혈증을 포함하는 대사증후군을 보유한 한국인 성인남녀 지원자들을 정상군, 테로카판 강화 소재군으로 분류하고 상기 테로카판 강화 소재군에 콩잎주정추출물을 복용시킨 결과 이상지질혈증이 개선됨을 관찰하였으며(실시예 4-1 참조), 혈중 지질함량을 분석한 결과 Lpar5 유전자 mRNA의 발현이 증가함을 확인하였다(실시예 4-2 참조).

따라서 상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 천연물 추출물일 수 있으며, 예컨대, 테로카판 강화 콩잎주정추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 세포는 상기 유전자를 발현할 수 있는 세포라면 그 종류에 제한 없이 당업자가 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 실험 디자인

한국인 성인 남성을 대상으로 혈중 지질농도를 측정하고 혈액 내 말초혈액단핵세포의 유전자 전사체를 비교 분석함으로써 비만도에 따라 발현이 변화하는 유전자들을 발굴하기 위하여, 도 1에 나타낸 바와 같이 지원자를 모집하여 실험을 디자인하고 진행하였다.

구체적으로, 20~59세 연령대의 남성 지원자들을 대상으로 1차 스크리닝을 통해 총 37명의 대상자를 선정하였으며, 도 1에 나타낸 바와 같이, 체질량지수(body mass index; BMI)를 기준으로 3그룹 즉, 체질량지수가 18.5 이상 23 미만(18.5≤BMI<23 kg/m², n=11)인 지원자를 정상대조군(Normal), 체질량지수가 25 이상 27.5 미만(25≤BMI<27.5 kg/m², n=14)인 지원자를 경도비만군(Obese A), 체질량지수가 27.5 이상 30 미만(27.5≤BMI<30 kg/m², n=12)인 지원자를 중증도비만군(Obese B)으로 분류하였다.

1-2. 혈중 지질 수준 측정 및 분석

상기 실시예 1-1에서 분류한 그룹의 지원자들로부터 12시간의 공복 상태에서 혈액을 채취하여 헤파린이 코팅된 튜브에 담고 1,000 × g로 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 혈장을 분리한 후 혈장에 포함된 지질, 아포지질단백질, 포도당, 인슐린, 콜레스테롤, 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 양을 측정하였다. 혈중 트리글리세리드(triglycerides), 총 콜레스테롤(total cholesterol), HDL-콜레스테롤(high density lipoprotein cholesterol), 및 포도당 함량은 Asan Pharm에서 공급된 키트를 사용하여 측정하였으며, 유리 지방산(free fatty acids) 함량은 Wako Chemicals사의 키트를 이용하여 측정하였다. 또한, 아포지질단백질 A1(apo A1)과 아포지질단백질 B(apo B) 함량은 효소키트(enzymatic kits)를 사용하여 측정하였다.

총 콜레스테롤에 대한 HDL 콜레스테롤의 비율(HDL-cholesterol to total cholesterol ratio; HTR)은 하기에 나타낸 수학식 1에 따라 계산하였다.

[수학식 1]

HTR = (HDL-콜레스테롤/총 콜레스테롤) × 100.

동맥경화지수(Atherogenic index; AI)는 하기에 나타낸 수학식 2에 따라 계산하였다.

[수학식 2]

AI = (총 콜레스테롤 - HDL-콜레스테롤)/HDL-콜레스테롤

또한, 인슐린저항성 항상성 지수(Homeostatic index of insulin resistance ;HOMA-IR)는 하기에 나타낸 수학식 3에 따라 계산하였다.

[수학식 3]

HOMA-IR = 공복상태 포도당 농도(fasting glucose) [mmol/L] × 공복상태 인슐린 농도(fasting insulin) [μU/mL])/22.51

1-3. PBMCs 분리 및 RNA 추출

상기 실시예 1-1에서 분류한 정상대조군(Normal), 경도비만군(Obese A), 및 중등도비만군(Obese B)의 지원자들 중 18명(Normal=4, Obese A=7, 및 Obese B= 7)을 무작위로 선정하고 이들로부터 혈액을 채취하여 헤파린이 코팅된 튜브에 담은 후 Ficoll-Paque 시약(GE Healthcare)을 이용한 밀도구배 침전법(density gradient sedimentation)을 통해 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMCs)를 분리하였다. 이후 분리된 PBMC에 TRIzol(Invitrogen)을 처리하고 제조사의 프로토콜에 준하여 PBMC로부터 total RNA를 추출하였다. 추출된 RNA의 순도와 농도는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)를 사용하여 측정하였다.

1-4. 마이크로어레이 ( microarray )

상기 실시예 1-2의 방법에 따라 각 그룹 지원자들의 PBMC로부터 추출한 RNA를 이용하여 마이크로어레이를 실시함으로써 PBMC 유전자 전사체 분석을 수행하였다.

구체적으로, 상기 추출된 RNA에 대하여 Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit(Ambion)를 사용하여 RNA를 증폭시키고 정제하여 biotinylated cRNA를 얻었다. 지원자(샘플) 당 biotinylated cRNA 750 ng을 58℃에서 16-18시간 동안 Illumina HumanHT-12 v4 Expression BeadChips에 혼성화시켰다. Amersham Cy3-스트렙타비딘(GE Healthcare)을 사용하여 어레이 시그널을 검출하였고, BeadChips은 Illumina BeadArray Reader를 사용하여 스캔하였다. 이후 Illumina BeadStudio software를 사용하여 raw data를 얻었으며, 표준화(normalization) 과정을 거친 후 단순선형회귀분석법을 이용하여 PBMC에서 유의하게 발현이 변화된 유전자(a false-discovery rate of <5%, p value of <0.05, 및 fold change of >1.3)를 추출하였다.

실시예 2. 혈중 지질함량 분석

체질량지수에 따라 분류된 정상대조군(Normal), 경도비만군(Obese A), 및 중등도비만군(Obese B)의 혈중 지질함량을 분석하기 위하여, 상기 실시예 1-2의 방법에 따라 각 그룹의 지원자들로부터 채취한 혈액으로부터 혈중 지질, 아포지질단백질, 포도당, 인슐린, 콜레스테롤, 및 TNF-α의 농도를 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, Normal군에 비하여 Obese A와 Obese B군에서 혈중 유리지방산(FFA), 중성지방(TG), 및 총콜레스테롤(TC) 양이 증가하였고, HDL-콜레스테롤 양이 감소하였다. 상기 측정값들을 이용해 실시예 1-2의 수학식 1 및 수학식 2에 따라 총콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤의 비율(HTR)과 동맥경화지수(AI)를 측정한 결과 Obese A와 Obese B 모두에서 총콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤의 비율은 감소하였고, 동맥경화지수는 현저히 증가한 것을 확인하였다. 또한, 아포지질단백질 A1(apolipoprotein A1; Apo A1)에 대한 아포지질단백질 B(apolipoprotein B; Apo B)의 비율 또한 증가한 것을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 중등도비만군뿐 만 아니라 경도비만군에서도 이상지질혈증이 나타남을 알 수 있었다.

실시예 3. 비만군에서 발현이 변화된 유전자 확인

정상대조군(Normal)에 비하여 비만군(Obese A 및 Obese B)에서 발현이 변화한 유전자를 검출하기 위하여, 실시예 1-1의 방법에 따라 분류된 각 그룹의 지원자에서 실시예 1-2의 방법으로 PBMC를 분리하여 이로부터 RNA를 추출하고, 실시예 1-3의 방법에 따라 마이크로어레이를 수행한 후 도출된 데이터를 표준화하고 분석하였다.

분석 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, Normal군과 비교하여 Obese A군에서 Lpar5 유전자의 발현이 유의하게 감소한 것을 확인하였다. 그러나 Lpar5 유전자는 Obese A군에서만 발현이 감소하였을 뿐 Obese B 군에서는 발현의 유의적인 차이가 나타나지 않았다.

상기 결과를 통해, 정상대조군에 비해 경도비만군에서만 발현이 감소되어 있는 Lpar5 유전자를 발굴하였다.

실시예 4. Lpar5 유전자 발현변화에 따른 대사증후군 개선 확인

상기 실시예 2 및 3의 결과를 바탕으로, 경도비만군에 테로카판 강화 콩잎주정추출물을 복용시킨 후 혈중 지질농도 및 경도비만군에서 발현이 유의하게 감소된 Lpar5 유전자 발현량 변화를 분석하고자 하였다.

이를 위해, 도 4에 나타낸 바와 같이, 35-65세 연령의 체질량지수가 25 이상 27 미만의 과체중, 비만, 및 이상지질혈증을 포함하는 대사증후군을 보유한 성인남녀(25≤BMI<27 ㎏/m², n=49)를 대상으로 하여 대조군과 테로카판 강화 소재군으로 분류하고, 테로카판 강화 소재군에는 12주 동안 콩잎주정추출물을 복용하도록 하였다.

4-1. 혈중 지질함량 감소 확인

대사증후군을 보유한 성인남녀에게 12주 동안 콩잎주정추출물을 복용시킨 후 실시예 1-2의 방법에 따라 혈액을 채취하여 혈중 지질농도를 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 대조군(placebo)과 비교하여 콩잎주정추출물을 복용한 군(PT)에서 혈중 유리지방산(FFA), TNF-α, 포도당(glucose) 양이 감소하였고, 상기 실시예 1-2의 수학식 3에 따라 계산한 인슐린저항성 항상성 지수(HOMA-IR) 또한 감소하였다. 반면 혈중 HDL-콜레스테롤 양은 증가한 것을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 콩잎주정추출물 복용에 의해 대사증후군이 개선되었음을 알 수 있었다.

4-2. Lpar5 유전자 발현 증가 확인

실시예 4-1의 결과를 바탕으로, 콩잎주정추출물 복용에 의해 대사증후군이 개선된 경도비만군에서 실시예 1-3의 방법에 따라 혈액 내 말초혈액단핵세포로부터 RNA를 추출한 후 mRNA 시퀀싱(sequencing)을 수행하여 유전자 발현패턴을 분석하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 콩잎주정추출물을 복용한 경우 Lpar5 유전자 mRNA의 발현이 복용 전에 비하여 1.5배 이상 높게 증가한 것을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 콩잎주정추출물 복용을 통한 대사증후군 개선이 Lpar5 유전자의 발현증가에 의한 것임을 알 수 있었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

Lpar5(NCBI 접근(accession) 번호: HQ995529) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제, 및 혈중 HDL-콜레스테롤 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 경도 비만 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 1 항의 조성물을 포함하는, 경도 비만 진단용 키트.
피검체 유래의 생물학적 시료에서, Lpar5(NCBI 접근(accession) 번호: HQ995529) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계, 및 혈중 HDL-콜레스테롤 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 경도 비만 진단을 위한 정보제공방법.
제 5 항에 있어서,
상기 mRNA의 발현수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), RNA 염기서열분석(RNA sequencing), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
제 5 항에 있어서,
상기 단백질 발현수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
하기의 단계를 포함하는, 대사증후군 치료 물질의 스크리닝 방법:
(a) Lpar5(NCBI 접근(accession) 번호: HQ995529) 유전자를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 세포에서 상기 유전자의 발현 수준 및 혈중 HDL-콜레스테롤 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 Lpar5 유전자의 발현 및 혈중 HDL-콜레스테롤 수준을 증가시키는 시험물질을 대사증후군 치료 물질로 선정하는 단계.
제 8 항에 있어서,
상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.