KR101501125B1

KR101501125B1 - 비만 진단용 조성물

Info

Publication number: KR101501125B1
Application number: KR1020130043459A
Authority: KR
Inventors: 최명숙; 권은영
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2013-04-19
Filing date: 2013-04-19
Publication date: 2015-03-11
Also published as: KR20140125553A

Abstract

본 발명은 AW544981 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비만 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 비만 진단용 키트, 및 비만 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 AW544981 유전자는 정상군 (대조군)에 비해 비만 유도군에서 발현이 현저하게 증가하며, 비만 치료 시 발현이 감소하는 특징을 가지고 있어, 이를 이용하여 비만 진단에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

비만 진단용 조성물 {Composition for diagnosing obesity}

본 발명은 AW544981 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비만 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 비만 진단용 키트, 및 비만 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

최근 들어 도시화된 생활환경과 과도한 영양섭취 등으로 비만 인구가 빠른 속도로 확산되고 있으며, 비만은 단순한 외형적인 문제뿐만 아니라 인슐린저항성, 제2형 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 간경변 등과 같은 대사증후군 발병률 증가와도 관련이 있는 것으로 알려져 있어 사회적으로 큰 문제가 되고 있다. 2010년 세계보건기구 (world health organiztion, WHO)에 따르면 과체중 성인 인구는 전세계적으로 약 16 억명, 비만인은 4 억명으로 집계되었으며, 매년 260 만명이 비만과 과체중으로 사망하고 있다고 보고하였다. 또한 2015년에는 전세계인구 23 억명이 과체중, 7 억명이 비만이 될 것으로 전망하였다. 우리나라의 경우에도 비만유병인구가 연간 평균 40 만 명 정도씩 늘어나고 있는 실정이며, 보건복지부와 질병관리본부의 2010년도 국민건강영양조사 자료를 분석한 결과, 우리나라 19세 이상 성인 비만율 (BMI≥25 kg/m²)은 1998년 26.0%에서 이후 계속 증가하여 2010년에는 30.8% (남자 36.3%, 여자 24.8%) 수준으로 나타났으며, 정상체중인 사람에 비해 비만인 사람에게서 고혈압, 당뇨병, 이상지질혈증이 동반될 위험이 2배 이상 높게 나타났다 (고혈압 2.5배, 당뇨병 2배, 고콜레스테롤혈증 2.3배, 고중성지질혈증 2.4배). 비만으로 인한 고혈압, 당뇨병 등 대사증후군 환자 수 증가에 따른 건강보험 진료비도 꾸준히 증가하여 2010년 기준으로 주요 만성질환 치료 진료비는 전체 건강보험 진료비의 31% (국민건강보험공단, 2010)를 차지하면서, 한국뿐만 아니라 전 세계는 비만과의 전쟁을 선포하고 있는 실정이다.

비만이란 체내에 지방이 과다하게 축적된 상태를 의미하며, 한 가지 원인으로 발생하는 질병이 아니라 유전적 및 환경적 요인에 의해 복합적으로 발생한다. Bouchard 등 (1990)은 체중증가의 개인차와 유전자형간의 상관성이 있는지 여부를 조사하였다. 일란성 쌍생아들을 대상으로 한 연구결과에서, 과식에 대한 체중과 체지방 변화 양상에 대한 개인차는 유전적 요인으로 인해 발생한다는 것을 밝혔다. Levine 등 (2005)은 비운동성 열발산 (non-excercise activity thermogenesis)이 체중조절 프로그램에서 나타나는 개인차에 대한 주요한 요인임을 제시하였으며, 인간의 비만관련 표현형 중 약 40~70% 정도가 유전적인 결과로 나타난다고 보고된 바 있다 (Comuzzie, 1998). 따라서, 비만을 빠르고 정확하게 진단할 수 있는 유전자 마커의 발굴이 매우 중요하다.

이에 본 발명자들은 비만을 진단할 수 있는 유전자 마커를 개발하기 위한 연구를 계속한 결과, 체중이 증가된 비만 모델에서 특이적으로 발현이 증가되는 AW544981 유전자를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 AW544981 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비만 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 비만 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 생물학적 시료로부터 AW544981 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 비만 발생 위험을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, (a) AW544981 유전자가 도입된 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 세포에 AW544981 유전자의 발현 증가 또는 억제 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 처리된 세포와 대조구에서 AW544981 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계;를 포함하는 비만 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 AW544981 (NM_145986.1) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비만 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 비만 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 생물학적 시료로부터 AW544981 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 비만 발생 위험을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) AW544981 유전자가 도입된 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 세포에 AW544981 유전자의 발현 증가 또는 억제 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 처리된 세포와 대조구에서 AW544981 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계;를 포함하는 비만 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 AW544981 유전자는 정상군 (대조군)에 비해 비만 유도군에서 발현이 현저하게 증가하며, 비만 치료 시 발현이 감소하는 특징을 가지고 있어, 이를 이용하여 비만 진단에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 실험 기간 동안 각 마우스의 체중 변화를 나타낸 도이다 (비만 유도군 및 정상군 간의 통계적 유의성; ^*p<0.05, ^**p<0.01, ^***p<0.001. 비만 유도군 및 실험군 간의 통계적 유의성, ^&p<0.05, ^&&p<0.01, ^&&&p<0.001.).
도 2는 정상군, 비만 유도군 및 루테올린을 섭취한 군의 간 조직을 나타낸 도이다.
도 3은 정상군, 비만 유도군 및 루테올린을 섭취한 군의 지방 조직을 나타낸 도이다.

이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 AW544981 (NM_145986.1) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비만 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, "진단"은 병리 상태를 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 비만의 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서 mRNA 수준을 측정하는 제제는 AW544981 유전자의 mRNA에 상보적인 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브를 포함한다.

본 발명에서 "프라이머 (primer)"란 적절한 완충용액 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.

본 발명에서 “프로브”란, mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중가닥DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.

본 발명에서 AW544981 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적인 항체를 포함한다.

본 발명에서 “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기 다클론 항체는 상기 유전자의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법((hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2 개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 진단 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다

예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소(예를 들면, Taq polymerase), dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl₂를 함유할 수 있다. 이외에 PCR산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR키트는, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량구조 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 마커 유전자가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이 형태일 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함하며, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 상기 ELISA 키트는 “항원-항체 복합체”를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소(예:항체와 접합) 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

본 발명에서 "항원-항체 복합체"란 AW544981 유전자가 코딩하는 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 mRNA 발현 수준은 중합효소반응(PCR), 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 등의 방법을 통해 측정할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 단백질 발현 수준은 AW544981 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합 반응을 이용하여, 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip) 등의 방법을 통해 측정할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 방법들을 통하여, 생물학적 시료에서, AW544981 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 정상군 (대조군)에서의 mRNA 또는 단백질 발현 수준과 비교함으로써, 정상군 (대조군)에 비해 AW544981 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준이 현저하게 증가하면 비만인 것으로 비만 여부를 진단할 수 있으며, 비만 발생 위험을 예측할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 정상군 (대조군)에 비해 비만 유도군에서 AW544981 유전자의 발현이 현저하게 증가하였으며, 비만 치료 물질을 처리한 군에서는 AW544981 유전자의 발현이 유의하게 감소하였다. 따라서 AW544981 유전자의 발현 조절 확인을 통해 비만 치료제를 스크리닝할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 비만 동물 모델 디자인

4주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 실험에 사용하였으며, 1주일간의 적응 기간을 거친 후, 난괴법 (randomized complete block design)에 의해 정상식이를 급여한 군 (정상군; n=10)군, 고지방식이 (20% fat, 1% cholesterol)를 보충한 군 (비만 유도군; n=13)군 및 HFD에 비만 치료 물질인 루테올린을 함께 투여한 군 (실험군; 0.005%, n=13)으로 나누어 총 16주간 실험하였다. 동물 사육실의 환경은 항온 (25 ± 2℃), 항습 (50 ± 5%) 그리고 6시부터 18시까지의 암/명 사이클로 일정한 조건을 유지하였고, 식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였고 (ad libitum), 식이는 4℃에서 냉장 보관하였다. 체중은 1주일 간격으로 측정하였다. 실험 종료 후, 12시간 절식한 후 에테르 흡입을 통해 가벼운 1차 마취를 시켰고 케타민을 근육 주사하여 2차 마취를 시킨 후, 복부 하대 정맥 (inferior vena cava)으로부터 공복 혈액을 채취하였다. 실험동물의 간 및 지방 조직을 분리한 후, PBS (phosphate buffered saline) 용액에 수 차례 헹군 후 표면의 수분을 제거하여 무게를 측정하였고, 액체질소에 급냉시켜 시료 분석 시까지 -70℃에서 보관하였다. 또한 간 및 지방 조직 일부는 현미경 분석을 위해 10% 포름알데히드 용액에 고정시켰다.

실시예 2. 체중 변화 분석

실험 기간 동안 마우스의 평균 체중 변화를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 전체 실험기간 동안 비만 유도군의 체중은 정상군에 비해 유의적으로 높게 나타나 비만이 성공적으로 유도됨을 확인하였다. 또한, 루테올린을 함께 섭취한 실험군은 실험식이 급여 12주째부터 비만 유도군에 비해 체중이 낮게 나타나, 체중 감소 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 3. 간 조직 및 지방 조직의 형태학적 분석

조직의 형태학적 관찰을 위해, 간 조직 및 지방 조직을 10% 포름알데히드 용액에 24시간 고정한 다음, 같은 용액으로 2회 교환하고, 2배수 에탄올로 탈수하여 파라핀에 포매하였다. 이후, poly-L-lysine으로 처리된 5 μm 두께의 조직절편을 제작한 다음, 공지된 방법에 따라 H&E (hematoxylin-eosin) 염색한 후, 광학현미경으로 200 배율에서 관찰하였다. 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 간 조직을 관찰한 결과, 비만 유도군은 간 조직의 간문맥 (portal vein)을 중심으로 많은 지방구 (lipid droplet) 축적을 보였으며, 지방구의 크기가 큰 것으로 나타났고, 루테올린을 섭취한 실험군은 비만 유도군에 비해 지방구 크기와 수가 감소된 것으로 나타났다.

또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 지방 조직을 관찰한 결과, 정상군에 비해 비만 유도군의 지방세포 크기가 큰 것으로 관찰되었으며, 루테올린을 섭취한 실험군은 비만 유도군에 비해 지방세포의 크기가 작은 것으로 관찰되었다.

실시예 4. 유전자 발현 분석

4-1. 총 RNA의 분리

간 조직 0.1 g 당 1 mL의 TRIzol (Invitrogen, Grand Island, NY)을 첨가하고, tissue lyzer (QIAGEN, germany)를 이용하여 균질화 시킨 후 3,250×g, 4℃에서 10분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 취해 클로로포름 200 μL를 첨가한 후, 3,250×g, 4℃에서 20분간 원심 분리하였으며, 다시 상층액을 취하여 동량의 이소프로판올을 첨가한 후, 10분간 3,000×g, 4℃에서 원심 분리하여 얻은 RNA 펠렛을 수득하였다. RNA 펠렛을 75% 에탄올로 2회 세척하고 건조한 후 DEPC(diethyl pyrocarbonate)가 처리된 물에 녹였다. 수득된 총 RNA를 0.5~10 μg/μL 농도까지 희석하여, 분석 시까지 -70℃에 보관하였다. 동일한 방법으로 지방 조직에서 총 RNA를 분리하였다.

4-2. 마이크로어레이 실험

4-2-1. RNA QC 및 총 cRNA 합성

RNA 합성 및 정제 과정은 Illumina Total Prep RNA Amplification Kit(Ambion, Austin, TX)를 사용하여 제조사가 제시한 방법을 통해 biotin labeled cRNA를 산출하였다. 보다 구체적으로, First strand cDNA 합성은 500 ng의 상기 실시예 3-1에서 수득한 RNA에 T7 oligo(dT) 프라이머를 사용하여 역전사 (reverse transcription) 과정을 거쳐 수득하였으며, second strand cDNA 합성은 DNA 폴리머라아제와 RNase H의 반응으로 단일가닥(single-strand) cDNA를 이중 가닥(double-strand) cDNA로 변환하여 생성하였다. in vitro transcription cRNA 합성 단계를 거쳐 biotin-NTP로 표지화된 cRNA를 수득하였으며, 이를 ND-1000 분광 측정기 (NanoDrop, Wilmington, DE)로 정량하였다.

4-2-2. 전체 유전자 발현 마이크로어레이 실험 Whole-Genome Gene Expression Microarray Experiment

마이크로어레이 실험은 Whole-genome gene expression with IntelliHyb Seal System (Illumina, Inc., San Diego, USA)을 이용하여 제조사가 제시한 방법에 따라 실시하였다. 750 ng의 상기 실시예 3-2-1에서 수득한 표지화된 cRNA 시료를 MouseWG-6 V2 Expression Beadchip에 혼성화하여 16~18시간 동안 58°C 항온기에서 반응시켰다. 어레이 신호의 검출은 비드 어레이 매뉴얼에 따라 Amersham fluorolink streptavidin-Cy3 (GE Healthcare Bio-Sciences, Little Chalfont, UK)을 사용하여 수행되었다.

4-2-3. 스캔 및 추출 이미지 데이터 (Extract Image Data) 도출

비드칩 스캔은 Illumina BeadArray Reader Confocal Scanner를 사용하여 제조사가 제시한 방법으로 진행하였으며, 스캐너로 도출된 비드칩 이미지는 Illumina BeadStudio Software를 사용하여 Gene Expression Module로 raw data를 분석하였다 (Illumina BeadStudio v3.1.3 (Gene Expression Module v3.3.8)).

4-2-4. 마이크로어레이의 표준화

Illumina Mouse WG-6 V2 Expression Bead Chip 분석을 위해 표준화 과정을 거쳤다. 표준화 방법으로는 유전자의 수가 충분히 많이 존재하기 때문에 유전자의 발현 분포가 모든 시표 (time-series)에서 거의 동일하다는 가정 하에, 분석의 편의성을 위해 유전자의 분포를 표준화의 지표로 사용하는 비모수적 방법인 사분위수 표준화 (Quantile Normalization)를 사용하였다.

4-3. 마이크로어레이의 결과 및 체중과의 상관관계 분석

비만 관련 유전자를 분석하기 위하여, Biocondoctor R 프로그램을 이용하여 정상군 및 비만 유도군 및 루테올린을 섭취한 실험군의 간 조직 및 지방 조직의 마이크로어레이 결과를 통해 확인된 각 유전자 발현값과 체중의 상관관계를 분석하였다. 두 조직에서 모두 p값 <0.001 수준에서 체중과의 상관성을 나타내는 유전자를 선별하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

TargetID	Symbol (liver)	Liver			Adipose tissue			Symbol (adipose tissue)
TargetID	Symbol (liver)	C.C.	HFD/ND FC	LU/HFD FC	C.C.	HFD/ND FC	LU/HFD FC	Symbol (adipose tissue)
ILMN_2763245	Cxcl1	0.761	4.49	-1.25	0.966	2.83	-1.80	Prc1
ILMN_1221503	Ccnd1	0.855	2.80	-1.19	0.955	2.70	-1.73	Lgmn
ILMN_2776850	Gas7	0.805	2.44	1.12	0.938	2.62	-1.42	AW544981
ILMN_1252076	Lyz2	0.806	2.28	-1.14	0.933	2.32	-1.83	Lyz2
ILMN_2686975	Fam129b	0.914	2.23	-1.20	0.949	2.14	-1.56	Mcm5
ILMN_2718217	Tubb6	0.837	2.16	-1.13	0.912	2.01	-1.65	Clec4a3
ILMN_2733356	Endod1	0.847	2.09	-1.19	0.876	2.00	-1.08	Cyp2c70
ILMN_2757125	Prc1	0.767	2.06	-1.47	0.869	1.94	-1.85	Gas7
ILMN_1227579	Acot11	0.882	1.94	-1.11	0.935	1.92	-1.24	Fabp3
ILMN_3059326	Sparc	0.867	1.90	-1.42	0.903	1.87	-1.43	P2ry14
ILMN_1219200	P2ry14	0.902	1.85	-1.46	0.917	1.81	-1.41	Fam129b
ILMN_2631423	H2-Ab1	0.800	1.84	-1.12	0.853	1.76	-1.50	F2r
ILMN_1231138	E2f1	0.940	1.80	-1.26	0.956	1.75	-1.33	Ehd4
ILMN_2759499	AW544981	0.831	1.78	-1.02	0.885	1.74	-1.49	Tubb6
ILMN_1245514	Cyp2c70	0.788	1.75	-1.03	0.899	1.70	-1.29	Cxcl1
ILMN_2896768	Cbr3	0.883	1.75	-1.19	0.912	1.69	-1.21	Col4a2
ILMN_2887630	Fabp3	0.778	1.74	-1.38	0.844	1.68	-1.63	Arhgdib
ILMN_2822579	Col4a2	0.863	1.70	-1.19	0.872	1.66	-1.03	E2f1
ILMN_2597868	Lgmn	0.797	1.64	-1.22	0.928	1.63	-1.22	Endod1
ILMN_2742849	Mcm5	0.832	1.58	-1.19	0.933	1.62	-1.13	Scamp5
ILMN_2740852	F2r	0.909	1.58	-1.18	0.919	1.60	-1.34	Pip4k2a
ILMN_1222036	Paqr7	0.848	1.58	-1.24	0.819	1.60	-1.09	Ephx1
ILMN_1224768	Ehd4	0.851	1.52	-1.05	0.928	1.58	-1.11	Ccnd1
ILMN_2827072	Slc13a4	0.864	1.51	-1.44	0.905	1.57	-1.24	Acot11
ILMN_2717439	Pip4k2a	0.789	1.51	-1.05	0.875	1.52	-1.29	Hcls1
ILMN_2417863	Tnip1	0.805	1.50	-1.03	0.846	1.51	-1.05	Paqr7
ILMN_2612206	Cdc20	0.765	1.50	-1.28	0.780	1.50	-1.60	H2-Ab1
ILMN_2789948	Arhgdib	0.883	1.50	-1.31	0.834	1.50	-1.31	Sparc
ILMN_2652482	Dfna5h	0.802	1.46	-1.00	0.967	1.48	-1.24	Cdc20
ILMN_2685516	Hcls1	0.776	1.45	-1.02	0.763	1.48	-1.06	Dfna5h
ILMN_1250907	Mcm2	0.904	1.44	-1.21	0.821	1.47	-1.04	Slc13a4
ILMN_1242246	Scamp5	0.819	1.42	-1.02	0.897	1.47	-1.26	Mcm2
ILMN_2664224	Ephx1	0.936	1.42	-1.08	0.931	1.44	-1.06	2310005E10Rik
ILMN_2733753	2310005E10Rik	0.786	1.42	-0.99	0.931	1.44	-1.18	Tnip1
ILMN_2606921	Klb	-0.798	-1.42	1.09	-0.827	-1.47	1.21	3110043O21Rik
ILMN_1213026	9630058J23Rik	-0.773	-1.44	1.03	-0.834	-1.51	1.04	Dapk1
ILMN_2438727	3110043O21Rik	-0.778	-1.45	1.03	-0.812	-1.54	1.12	9630058J23Rik
ILMN_2619697	B3gnt9	-0.824	-1.47	1.11	-0.810	-1.56	1.18	Irs2
ILMN_2777986	Pck1	-0.875	-1.49	1.09	-0.957	-1.58	1.15	B3gnt9
ILMN_3155915	Dapk1	-0.832	-1.51	1.16	-0.893	-1.69	1.28	Klb
ILMN_3144164	Irs2	-0.881	-2.46	1.75	-0.942	-2.39	1.65	Pck1

(C.C.; correlation Coefficient, HFD/ND FC; High-fat diet/Normal diet Fold Change, LU/HFD FC; Luteolin/High-fat diet Fold Change)

표 1에 나타낸 바와 같이, 아직까지 그 기능이 완전히 알려져 있지 않은 AW544981 유전자는 체중과 강한 양의 상관관계를 나타내고 있어, 비만 유도군에서 크게 증가함을 확인하였다. 또한, 비만 치료 효과를 보이는 루테올린을 섭취한 군에서는 AW544981 유전자의 발현이 간 조직 및 지방 조직에서 감소함을 확인하였으며, 특히 비만을 가장 잘 반영하는 지방 조직에서 그 발현수준이 크게 감소함을 확인하였다.

이상의 실험 결과를 통하여, AW544981 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하여 비만을 진단할 수 있으며, 상기 유전자의 발현을 조절하는 물질을 확인함으로써 비만 치료제를 스크리닝할 수 있음을 확인하였다.

Claims

AW544981 (NCBI 접근(accession) 번호 : NM_145986.1) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비만 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적인 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 비만 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는, 비만 진단용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 비만 진단용 키트.
생물학적 시료로부터 AW544981 (NCBI 접근(accession) 번호 : NM_145986.1)의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 비만 발생 위험을 예측하기 위한 정보제공방법.
제 5항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 비만 발생 위험을 예측하기 위한 정보제공방법.
제 5항에 있어서, 상기 mRNA발현 수준은 중합효소반응(PCR), 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 비만 발생 위험을 예측하기 위한 정보제공방법.
제 5항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준은 AW544981 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합 반응을 통해, 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 비만 발생 위험을 예측하기 위한 정보제공방법.
(a) AW544981 (NCBI 접근(accession) 번호 : NM_145986.1) 유전자가 도입된 세포를 배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 세포에 AW544981 유전자의 발현 증가 또는 억제 후보 물질을 처리하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 처리된 세포와 대조구에서 AW544981 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계;를 포함하는 비만 치료제의 스크리닝 방법.