CN109355388B - 一种鉴定宫颈癌遗传易感性的检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定宫颈癌遗传易感性的检测试剂盒，属于分子生物学与生物医药技术领域。所述检测试剂盒中含有基于DUT基因单核苷酸多态性设计的特异性引物，DUT基因中的两个位点的单核苷酸多态性与宫颈癌易感性密切相关，即核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列的第2318位和第9533位均存在单核苷酸多态性，分别为A>G和C>T。利用PCR技术可以有效检测DUT基因中的单核苷酸多态性，进而鉴别宫颈癌易感性，这对于宫颈癌高危人群的筛选和易感个体的检测，对宫颈癌这个复杂性疾病进行早期预防、早期诊断和个性化防治具有重要的现实意义。

Description

一种鉴定宫颈癌遗传易感性的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物医药技术领域，具体涉及一种鉴定宫颈癌遗传易感性的分子标记及其应用。

背景技术

宫颈癌发病率位居全世界妇女恶性肿瘤的第四位，在我国，宫颈癌已经成为女性最常见的癌症，死亡率高达30.5/100000，同时发病率也在不断上升。高危人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)感染是其发病的主要致病源。

然而流行病学调查发现，实际上有约80％的妇女在其一生中都曾经感染过HPV病毒，有的甚至反复被不同类型的HPV感染，但其实只有一小部分最终进展为浸润性宫颈癌。家系研究表明，宫颈癌发病除了HPV病毒对宫颈上皮细胞的攻击外与个体的遗传背景密切相关，具有显著的遗传性，不同遗传背景的个体对HPV攻击后的致病性存在明显的不同，这种由于遗传背景不同导致的肿瘤易感性不同在宫颈癌致病过程中起着重要和关键的作用。

根据临床和流行病学研究发现，宫颈癌的发病从HPV感染到恶性肿瘤的发生周期长达十年以上，这期间还有漫长的癌前病变阶段，这就为我们对其进行早期诊断、早期预防、早期治疗提供了宝贵的时间窗口，可以明显提高宫颈癌患者的治疗效果和预后，甚至可以做到防止宫颈上皮细胞在遭受HPV攻击后恶性转变，从而防止宫颈癌的发生。因此探讨宫颈癌发生发展的分子机制，探寻用于鉴定宫颈癌遗传易感人群的分子标记，对于预测宫颈癌易感人群并且早期进行医学干预和个体化治疗具有重要的现实应用价值。

目前已经发现了一些宫颈癌的易感基因和遗传变异可能引起基因组的不稳定，最终导致癌基因和抑癌基因的表达和功能改变，但这只能解释一小部分宫颈癌的遗传易感性。因此，需要更为全面和精确的对基因组变异和分子标记进行研究，更好的理解宫颈癌的遗传易感性。

为维护人类基因组在生育和细胞分裂过程中遗传物质的完整性和稳定性，人类基因组有一套强大的DNA修复系统，以应对环境攻击、复制错误和累积遗传学错误。主要包括了五种DNA修复途径，包括碱基切除修复(BER)、错配修复、核苷酸切除修复、直接逆转和重组修复，共有100多个基因参与其中，如果这些基因本身的表达和功能发生了改变，那么对基因组的稳定性将产生根本性的改变，导致各种疾病的发生，尤其是肿瘤的发生。

dUTPase(DUT)催化脱氧尿苷三磷酸(dUTP)水解成dUMP和焦磷酸盐，从而去除并修复DNA复制过程中产生的错误碱基，使得基因组DNA保持正确和稳定。有文献报道DUT功能的改变和肿瘤的发生密切相关，但迄今为止还没有报道DUT基因单核苷酸多态性(SNP)与肿瘤的易感性相关，在宫颈癌中更是没有研究报道。因此，本领域急需进一步找寻宫颈癌易感性相关遗传学分子标记，开发检测宫颈癌高危人群和易感个体的方法、试剂盒和检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴别发现宫颈癌致病易感性的分子标记，并基于此开发出用于检测宫颈癌易感性的试剂盒和检测方法，为宫颈癌易感人群的发现并为宫颈癌患者的早期诊断、预防和治疗的个体化提供检测方法。

为达到上述目的，本发明采取如下技术方案：

本发明针对大量候选基因的SNP位点在宫颈癌大样本量临床标本中进行了基因型检测和统计分析，首次发现了DUT基因的两个SNP位点和宫颈癌致病易感性密切相关，具体为：核苷酸序列如SEQ ID NO.1(NG_029497)中DUT基因序列的第2318位(rs3784619)和第9533位(rs11637235)存在单核苷酸多态性，分别为A>G和C>T碱基间的转换，均与宫颈鳞状细胞癌的发病存在统计学相关性，而且这种相关性在其癌前病变(CIN III)中已经表现出来，基因型为2318GG纯合子和9533TT纯合子的个体罹患CIN III和宫颈鳞状细胞癌的易感性明显增加，因此DUT基因的这两个SNP位点可以作为宫颈癌致病易感性检测和早期诊断的遗传分子标记。

因此，本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的遗传学分子标记作为检测靶点在制备用于鉴定宫颈癌遗传学易感性的检测试剂盒中的应用，所述遗传学分子标记的第2318位存在单核苷酸多态性：A>G，即该序列的第2318位的碱基包括碱基A和碱基G两种情况，当碱基为A时，表现为正常的DUT基因遗传状态，当碱基为G时，表现为异常或者错误的DUT基因遗传状态；

或者所述遗传学分子标记的第9533位存在单核苷酸多态性：C>T，该序列的第9533位的碱基包括碱基C和碱基T两种情况，当碱基为C时，表现为正常的DUT基因遗传状态，当碱基为T时，表现为异常或者错误的DUT基因遗传状态。

作为上述分子标记的应用，本发明提供了两种用于鉴别宫颈癌致病易感性的试剂盒，分别基于DUT基因的两个SNP位点设计对应的PCR扩增引物对。

一种鉴定宫颈癌遗传学易感性的检测试剂盒，包括：用于检测核苷酸序列如SEQID NO.1所示的遗传学分子标记中第2318位的SNP位点的特异性引物。

针对该SNP位点的单核苷酸多态性，本发明设计合成了两条特异性上游引物和一条特异性下游引物，每一条特异性上游引物分别对应相应的碱基A和碱基G，分别和下游引物配对后作特异性PCR扩增，扩增产物长度244bp，根据配对引物扩增的PCR特异性阳性条带情况判断基因型是纯合子(AA或者GG)还是杂合子(AG)。

为提高PCR扩增的特异性，在设计上游引物时把上游引物的3’端倒数第二个碱基设计为与互补链相同的碱基，而不是互补的碱基，这能完全避免非特异性PCR条带的出现，保证特异性的检测结果。

具体地，所述PCR扩增上下游引物序列为：

上游引物1:5'-ATCTCCAGGGGCCGTTCAGA-3'(SEQ ID NO.2)；

上游引物2:5'-ATCTCCAGGGGCCGTTCAGG-3'(SEQ ID NO.3)；

下游引物1:5'-TAAGCTTTACTGTGTGCCA-3'(SEQ ID NO.4)；

所述试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶和dNTP混合液。各组分间的数量关系为常规PCR扩增时的比例，对所属专业领域内的技术人员是常规知识。

为避免假阴性的出现，试剂盒中还设计并人工合成了阳性对照Ⅰ和阳性对照Ⅱ，当阳性对照无扩增产物时，说明为假阴性，实验需要重复。所述阳性对照Ⅰ序列如SEQ ID NO.5所示的基因碱基片段；所述阳性对照Ⅱ含序列如SEQ ID NO.6所示的基因碱基片段。

PCR反应体系组成：共30μL体积，内含：50ng基因组DNA,1.0U Taq DNA聚合酶，0.2mM dNTP，上下游引物各5.0pmol。PCR产物长度为244bp。

PCR扩增条件：94℃5min，(94℃30s，56.5℃30s，72℃45s)×35cycles，72℃10min，10℃保温。

另一种鉴定宫颈癌遗传学易感性的检测试剂盒，包括：用于检测核苷酸序列如SEQID NO.1所示的遗传学分子标记中第9533位的SNP位点的特异性引物。

针对该SNP位点的单核苷酸多态性，本发明设计合成了两条特异性上游引物和一条特异性下游引物，每一条特异性上游引物分别对应相应的碱基C和碱基T序列，分别和下游引物配对作特异性PCR扩增，扩增产物长度为310bp，根据配对引物扩增的PCR特异性阳性条带情况判断基因型是纯合子(CC或者TT)还是杂合子(CT)。

具体地，所述PCR上下游引物序列为：

上游引物3:5'-AACCTTTAAAACCCAAAAC-3'(SEQ ID NO.7)；

上游引物4:5'-AACCTTTAAAACCCAAAAT-3'(SEQ ID NO.8)；

下游引物2:5'-GGAATACTAGAGGTGTAAGA-3'(SEQ ID NO.9)。

所述试剂盒中还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶和dNTP混合液。

为避免假阴性的出现，试剂盒中还设计和人工合成了阳性对照Ⅲ和阳性对照Ⅳ序列，当阳性对照无扩增产物时，说明为假阴性，实验需要重复。所述阳性对照Ⅲ序列如SEQID NO.10所示的基因碱基片段；所述阳性对照Ⅳ含序列如SEQ ID NO.11所示的基因碱基片段。

PCR反应体系组成：共30μL体积，内含：50ng基因组DNA,1.0U Taq DNA聚合酶，0.2mM dNTP，上下游引物各5.0pmol。PCR产物长度为310bp。

PCR扩增条件：94℃5min，(94℃30s，57℃30s，72℃45s)×35cycles，72℃10min，10℃保温。

为应用上述试剂盒，本发明还提供了一种检测外周血样本中是否存在DUT基因的单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：

(1)提取外周血样本中的基因组DNA，作为模板，并用DUT基因特异性上下游引物进行PCR扩增，得到特异性PCR扩增产物，针对rs3784619的特异性引物为两对，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；针对rs11637235的特异性引物为两对，其核苷酸序列分别SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9；

(2)用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，根据电泳结果判断扩增产物是否存在相应位点的单核苷酸多态性，两个位点分别为2318A>G和9533C>T，突变位置编号是基于SEQ ID NO.1(NG_029497)的序列，进而确定外周血样本的DUT基因相应位点是否存在单核苷酸多态性的改变。

应用本发明提供的试剂盒对宫颈癌遗传易感性个体进行罹患风险检测和诊断时，与正常的DUT基因碱基进行比对，如存在不同，即存在单核苷酸多态性：2318A>G或者9533C>T的转换，则说明该个体罹患宫颈癌的风险明显高于正常人群。

本发明具备的有益效果：

本发明利用DUT基因的两个特定位点rs3784619(A>G)和rs11637235(C>T)的单核苷酸多态性均与宫颈癌易感性密切相关的结论，由此开发出用于鉴别宫颈癌致病易感性的两个检测试剂盒，每个试剂盒中设计并合成了针对DUT基因相应SNP位点单核苷酸多态性的两对特异性引物，利用PCR扩增技术能够有效检测DUT基因中的单核苷酸多态性，该方法检测简捷、特异性高、假阳性和假阴性低、而且价格低廉、无需特殊设备，方便在各级临床医院推广，这对于宫颈癌易感个体的检测和高危人群的筛选，对宫颈癌进行及早预防诊断和个性化防治具有重要意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。以下的实施例中采用的方法目的是更好地理解本发明，但并不限于本发明。

如无特殊说明，实施例中涉及的实验方法均为常规方法，所用的实验材料均为常规试剂公司购买。

实施例1.DUT基因单核苷酸多态性检测和宫颈癌易感性的关联分析

1.1研究对象

随机选取宫颈鳞状细胞癌患者400例，以及宫颈癌癌前病变CIN III病例400例，选取病例时间为2004年6月到2008年12月，来源自浙江大学医学院附属妇产科医院经病理明确诊断的病例，同时选择1200例正常体检的女性志愿者作为正常对照，正常对照入选标准为无病理细胞学病变、无子宫内膜异位症、无妇科肿瘤和无其他实体肿瘤或免疫性疾病。所有病例和正常对照均为汉族居民。所有受试人员均按照浙江大学医学院妇科医院伦理委员会要求征得同意，所有的研究方法均遵循了批准的指导方针和条例。

抽取患者和正常志愿者外周抗凝血2ml左右，于-80℃冷冻保存待用。

1.2外周血细胞基因组DNA抽提

选用上海生工生物工程有限公司的外周血抽提试剂盒对150μL的外周血细胞进行基因组DNA的抽提和纯化，实验步骤按照试剂盒的要求进行，所有基因组DNA样品溶解在去离子水中并冷冻保存直至进行后续PCR检测。

1.3特异性引物序列、PCR反应液组成和PCR反应条件

从GenBank库下载DUT基因的碱基序列(NG_029497)，针对该基因中存在的单核苷酸多态性rs3784619，rs11637235用在线引物设计软件Primer-BLAST设计引物。

根据我们自己的设计原则对上游引物3’端倒数第二位的碱基进行修改，改为与互补链相同的碱基，进一步提高检测的特异性，从而最终确定我们自己设计的上下游引物，具体引物序列见表1。

表1.DUT单核苷酸多态性检测用上下游引物和产物长度

PCR反应体系组成：共30μL体积，内含：50ng基因组DNA，1.0UTaq DNA聚合酶，0.2mMdNTP，上下游引物各5.0pmol。

第2318位点的PCR扩增条件：94℃5min，(94℃30s，56.5℃30s,72℃45s)×35cycles，72℃10min，10℃保温。PCR产物长度为244bp。

第9533位点的PCR扩增条件：94℃5min，(94℃30s，57℃30s,72℃45s)×35cycles，72℃10min，10℃保温。PCR产物长度为310bp。

PCR产物观察：1.5％琼脂糖凝胶对10μLPCR产物进行电泳分离，50V电压电泳20min，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察阳性条带。根据不同引物组成的PCR阳性条带分析DUT基因片段SEQ ID NO.1中第2318位点和第9533位点(位置编号基于SEQ ID NO.1)的碱基情况。

经分析我们发现在受试样本中存在2318A>G和9533C>T这样的单核苷酸多态性，分别表现为AA、GG纯合子、AG杂合子和CC、TT纯合子、CT杂合子。

1.4DUT基因单核苷酸多态性基因型和宫颈癌的关联分析

健康对照组作为参考组进行分析。对DUT基因单核苷酸多态性的基因型分布与罹患宫颈鳞状细胞癌风险进行相关性评估，通过二元logistic回归分析得到比值比(Oddsratio,OR)、95％置信区间(confidence interval,CI)和P值。所有统计值均为双侧检验，统计显著性水平设为P小于等于0.05。所有统计分析均采用SPSS18.0软件(SPSSInc.Chicago,USA)。

a、结果发现SEQ ID NO.1(NG_029497,rs3784619)中的2318A>G和宫颈鳞状细胞癌的发病存在显著相关性，并且这种相关性在其癌前病变CIN III期间已经有所表现，2318GG纯合子明显提高了个体罹患CIN III和宫颈鳞状细胞癌的风险，OR值分别达到了2.29(1.60-3.27)和3.15(2.24-4.41)；2318G等位基因频率风险值OR分别达到了1.39(1.17-1.65)和1.64(1.38-1.94)，明显高于对照组，具体数据见表2和表3。

表2.DUT(rs3784619)基因变异关联分析及罹患CIN III的风险

表3.DUT(rs3784619)基因变异关联分析及罹患宫颈鳞状细胞癌的风险

b、同样我们也发现SEQ ID NO.1(NG_029497,rs11637235)中的9533C>T单核苷酸多态性和宫颈鳞状细胞癌的发病存在显著相关性，并且在其癌前病变CIN III也已经有所表现，9533TT纯合子明显提高了个体罹患CIN III和宫颈鳞状细胞癌的风险，OR值分别达到了2.05(1.49-2.82)和3.15(2.32-4.29)；9533T等位基因频率风险值OR分别达到了1.41(1.19-1.66)和1.82(1.54-2.14)，明显高于对照组，具体数据见表4和表5。

表4.DUT(rs11637235)基因变异关联分析及罹患CIN III的风险

表5.DUT(rs11637235)基因变异关联分析及罹患宫颈鳞状细胞癌的风险

实施例2.DUT基因单核苷酸多态性和宫颈癌易感性检测试剂盒

1、基于实施例1的结果，我们发现DUT基因(SEQ ID NO.1)中存在的两个单核苷酸多态性位点2318A>G和9533C>T的碱基变异均与宫颈鳞状细胞癌以及其癌前病变CIN III的发病显著相关，因此我们设计了基于DUT基因单核苷酸多态性的特异性引物对患者的外周血DNA模板进行检测的试剂盒Ⅰ和试剂盒Ⅱ。

2、制备专用试剂盒(100tests)，具体试剂组成见表6和表7，如下：

表6.DUT基因SNP位点(rs3784619)检测试剂盒Ⅰ试剂成分组成

试剂名称(浓度)	试剂盒总量
		10×PCR Buffer(Mg<sup>2+</sup>25mM)	500μL
dNTP Mixture(各2.5mM)	2000μL
		Taq DNA polymerase(5U/μL)	40μL
上游引物1(SEQ ID NO.2)(100pmol)	100μL
		上游引物2(SEQ ID NO.3)(100pmol)	100μL
下游引物1(SEQ ID NO.4)(100pmol)	100μL
		阳性对照Ⅰ(SEQ ID NO.5)	10μL
阳性对照Ⅱ(SEQ ID NO.6)	10μL

表7.DUT基因SNP位点(rs11637235)检测试剂盒Ⅱ试剂成分组成

试剂名称(浓度)	试剂盒总量
		10×PCR Buffer(Mg<sup>2+</sup>25mM)	500μL
dNTP Mixture(各2.5mM)	2000μL
		Taq DNA polymerase(5U/μL)	40μL
上游引物3(SEQ ID NO.7)(100pmol)	100μL
		上游引物4(SEQ ID NO.8)(100pmol)	100μL
下游引物2(SEQ ID NO.9)(100pmol)	100μL
		阳性对照Ⅲ(SEQ ID NO.10)	10μL
阳性对照Ⅳ(SEQ ID NO.11)	10μL

3、DNA模板制备：抽取受试者外周血抗凝血2mL，采用常规酚氯仿抽提法，或者第三方外周血DNA抽提试剂盒，抽提得到的基因组DNA溶解于三蒸水，低温保存待集中标本检测时使用。

4、单个检测PCR试剂配方，具体见表8。

表8

10×PCR Buffer(Mg<sup>2+</sup>25mM)	3.0μL
		dNTP Mixture(各2.5mM)	10μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL)	0.2μL
		上游引物(100pmol)	1μL
下游引物(100pmol)	1
		DNA模板	0.1μL
Total Volume	三蒸水补充至总体积30μL

5、PCR扩增反应条件：

试剂盒Ⅰ(第2318位点)的PCR扩增条件：94℃5min，(94℃30s，56.5℃30s,72℃45s)×35cycles，72℃10min，10℃保温。PCR产物长度为244bp。

试剂盒Ⅱ(第9533位点)第9533位点的PCR扩增条件：94℃5min，(94℃30s，57℃30s,72℃45s)×35cycles，72℃10min，10℃保温。PCR产物长度为310bp。

6、PCR产物观察：

1.5％琼脂糖凝胶对10μLPCR产物进行电泳分离，50V电压电泳20min，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察阳性条带。根据不同引物组成的PCR阳性条带分析DUT基因片段SEQID NO.1中第2318位点和第9533位点(位置编号基于SEQ ID NO.1)的碱基情况。

与正常的DUT基因进行碱基比对，存在差异即表明该个体罹患宫颈癌的风险明显高于正常人群。所述差异即存在单核苷酸多态性：2318A>G或者9533C>T。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种鉴定宫颈癌遗传易感性的检测试剂盒

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11950

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<220>

<221> variation

<222> (2318)..(2318)

<223> n is a or g

<220>

<221> variation

<222> (9533)..(9533)

<223> n is c or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (2318)..(2318)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (9533)..(9533)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 1

gtcatgttcc caggacgggc gcgtcttcag ggtggaagcc tggcgcacgt ccggaggtgc 60

cgaggaccca accagcccaa actctggggg aaatgactcc cctctgccct cgccccgcgc 120

tctgctacca tttccttacg tctctgcttc gctcagcgat gcaaaacgcg cgaggcgcac 180

ggcagagggc cgaagccgcg gtactctccg ggccaggccc gcccctcggc cgcgccgcgc 240

agcacgggat tccccggccg ctgtccagcg ctggccgcct gagccaaggc tgccgcggag 300

ccagtacagt cggggccgct ggctggaagg gcgagcttcc taaggcgggg ggaagcccgg 360

cgccggggcc gggtaggaaa ggcgggggag gggctccggc cgtctggaag gaatccacgc 420

ggcttgaggc tgtgggggaa gtagggtggc gagcggtcct tctgcgcgcg gggggcgggg 480

ggggtggggt ggtccattag ggtcccctgg cgagggggcg gctttctagt gtgtgagggc 540

gacgccctag aagctcccct tcaaagttgg ccccacgcgc tgaatgtgga aagttgactg 600

ggacccagta gtttcccatc ccaaacctgc tttccgagaa gggcttcaaa cccaaaatgt 660

gaatcccgcc tcccctctca gccagaactg tggactcgtc ccggggaggg gcggtgggtg 720

gggcggggct ggcgggaaat ttcggttttg gcgcgctccc tgcggcgacg ctcatcgtgc 780

gctctcctct tcccccggtg gtctcctcgc tcgccttctg gctctgccat gccctgctct 840

gaagagacac ccgccatttc acccagtaag cgggcccggc ctgcggaggt gggcggcatg 900

cagctccgct ttgcccggct ctccgagcac gccacggccc ccacccgggg ctccgcgcgc 960

gccgcgggct acgacctgta caggtgagcg gggacctgcc ggcgaggagg ctgggaaggg 1020

ccggccgtcc gctgccacag ctagaaacag tcaccggaga gatcacagga acacactagc 1080

tataaatagg atttctgcct ttttcgtgtt taaaatttta gctttcatct ttggcataaa 1140

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atgatataat tttttatccc gaattttggg cttttttttt ttcatctgac tactgtgccc 1680

agttcttaga accattaagg taggagaaaa gtaatgctga gagggaagga gattttatac 1740

taaatcccaa gcattgggat ttattttaaa gtatctcaga taattcaaac atgagaacta 1800

ttagtctaag cacaggagaa gagaaagtag tgcctgatga tagcaacaga aaaaaaagga 1860

aaaggaaagt aggtatggac aattgtagct ggaaaaacta cagtctctta attttgatga 1920

ataaaagtag agtgatatag tttgactaga cctttccaaa gtatattttg gagcactttc 1980

ttgagtccta ggggagtcct tgatttaaga taccttaagt agactcctaa taaacacagg 2040

tgactttctg tatactgaaa ttgacatgga aataatggat cagcaataaa ttagggctta 2100

actgtttaaa gagggatttc agtgaaagaa ggggtagtac tgctttacca gagttaatta 2160

aggtctccaa agtaaacttc cggttctgct cattgtaaaa tctcttaaat ttctacccag 2220

gagagggcca cagtaatatc aagagtagca gcatttgcta tgtggacttt agaggaattc 2280

tgttcctaag caaggtccat ctccaggggc cgttcacngt gatcagctgt ctccctcagc 2340

caggaaattc atagcctaag cttggtaaac taccaagccc tgcctgacag atacaacaca 2400

gttctttatc tcttattttg tccacccgtt tttctccttt ccttctgcat attttcccta 2460

atcacacaga tcattgtgag aataaaatgg gttaatatat gtaaaccaat tagaactgtt 2520

cctggcacac agtaaaggct taatcaatga tagctagtat tattagtagt atttggcctt 2580

ttttctttgt tctttcttca tttttttcct tttcaaacta tggttgtaaa gcatccacct 2640

tttgaaagtt tgcctttctg ccctttcacg ctgataagta cctcagtttc caataaactt 2700

ttgttcaggg gcaaacattt acaatgttga catctcttca caccaccaaa aatattcatg 2760

gagaattatt ttatctaaag ctgtcttttt aataataaaa tagccacctc taccttcttc 2820

ataaactttt aagatgaatt ggtaattcat catagcaagg ttgattttag aaactaaagt 2880

tgcattaatt cattaaatac actgaaagta attttgtatg cttggtcaca aagaaaatat 2940

aaaaacaatt ttataaatag atttgcagtt attttctttc aatattttct tagtgcctat 3000

gattacacaa taccacctat ggagaaagct gttgtgaaaa cggacattca gatagcgctc 3060

ccttctgggt gttatggaag agtgggtaag tcatttaaga aacaggtaac tatttgtcaa 3120

gttctccttt gtgatagatt cttcatgttt catttggggt aataagcagg caatattgct 3180

tgggctgtgt cctaaaagaa gcaccatttg tgatagcaaa tgcactcttt gaaaggcttt 3240

atttacatct ctgctttgcc tctttttgac ccttttattt ttctccttcc tcactggagc 3300

ttttaggctc acactggcct agaaggctgt tctcagaaca tggcatttta tattatgaga 3360

gtaaaacttc tgacctgttg gtcccagaat gtgtaagcct acttaacctt ttcttgtttg 3420

gccatggggt tagggtaagg gatactcttc agtgttgtag aggcactggg aggagctagg 3480

acaaaatgga gtacacgtca acaggtttga tttttctgga gcggatcagt tgttaccaga 3540

cagttctttg caagagcgta agttcttttt gactaacttc agagtaaaca taaaggaggc 3600

aatggagctg tgacgccctc ctccagggaa aggagctaga ctggcactat attattagcc 3660

atgagtgagg aaactgccag tacttcagcc cttaaaagat aacaagatgg gctctcatct 3720

catctcttga gcatcattga ctccattttt tagaattttt tcaggggaag gggcaggaga 3780

tggagtgaaa taaaggttag tacagaaaga ggcagcatta ttgacaaagt gcctgattta 3840

aattattcta aaataaaatg ctggaagtta ggataattaa ttataggcct gatgcttgag 3900

tctgcaataa taaggtgtaa ccttagcttt ttattttttt cattttttag gattaaaaag 3960

tatactagca ttgaatcatt gagacttagt ttttggcatt tttacttaac tgatattagc 4020

ccatttatct tactctggtt catgtgtttc ctacaggcat gtcttttggc atctgaatca 4080

tgaatagtgg ggtcccaagt tgtaggctat ggtctgctac tatttggtta ggtttgtttc 4140

cctctccctt cctcttcctt tcccttccca tctgcattgt acatgttgtg gtgtcccatc 4200

ttaaaaccaa agtcttcttc ctcagtagtg tgttcctgct ggccatactt ctctttcttc 4260

ccctttgagg cttaacttct tgaaagagca gcctacagtt gttcccgctt gctcaccttt 4320

cagctcattc tagcagtcct tctcccctgt ctgcagcacc acaaattctg actgaagtca 4380

catgggagtg gtttaagtta gttttgaatt aaaaccttgt ggaatttttc taaactagtc 4440

tttccaactt tggtaatgca gtatgatgaa tatatattct ttaattcaaa accatgtgct 4500

aaagttaaga tgaagatata gatattatag gtgaagagaa tgacatgctt aaattgcatc 4560

agttatctct gatatagccc ttccccctta aaataaccaa tgtctccttt tttgtttttt 4620

agctccacgg tcaggcttgg ctgcaaaaca ctttattgat gtaggaggta atatatttcc 4680

ttttttattc tgtaaatgtt tgcaagtatt tactttgtct ttaaaaggta atattcaaat 4740

gacagatttt atttttaaga aaagaaaatg attagaggaa agcttgttat aataggagga 4800

aaagctttgt ggttatttta agtaattata ttttgtttaa ctactaactt aatttttaaa 4860

ataatgatta cctaattaat aatgacagat ttaatgatat aataattaag taattattta 4920

agcaacaaaa gttctagaaa acacaggtct atcttgtaag aattttcttc ataagagagc 4980

tatctgtctt tagcaaaatt taagaagaaa atctttccct gaagtcagga gagaaaacac 5040

ttttctctaa atttgttaag acagtcctct gtgttacctg tttcccttat aataaagcct 5100

ttctcatgtt tgtctcaaag ttaaccctac ctcatgtggt acctttcatg aagaaccctc 5160

agtgtcctct gctaactact cttgatacag agctactcct cttattgtaa ggaaatttct 5220

actttcctga tgtggtttcc ttgtttcagg tccgctccaa ctgggattca gaccccactt 5280

atgtggtcct tacatactga ccctttatcc catcagtagt gaatctttca cttaacaaga 5340

taccttggcc cccacataag taggtgtgct agatctcctc ctccacccgt ttttacagag 5400

ctgctttatg gaggcttgtt aacagatcag gaaaactggc ttagaaatga gcccacatgg 5460

atatgtggta aaaactggag tctctgtgtg attccagcct ccttgttctt tccactgcaa 5520

ttaattgtgg agattaccct gctgcatccc cctcaccaac taaacacgtc cagaattagc 5580

tcacttttat gtgccactgc aagggctaac taagcactta atgaaacctg gctatcctag 5640

acctgcccct tagtctaaca tttggtgggt gtggtgtctc tccatagtgt caccaggtgg 5700

tgctgtggga caagacagga ccccaaaagt acacccttta gggactaaag gggagctgag 5760

ttttacatag cagggtggac attgacagcc cactcttggg ttgaggattc cttgggctct 5820

gtaagttatg cccgatgttc aaaaatgctt ttacaaggtc aactgtggtc attttgggac 5880

agtaacttaa ggatataaat aattgtatat attttcaatg aagtttcaaa tgattgttca 5940

aggaacggga gctttggaat aacaactgga tgtaggtccc agctctgtca ttaactagtt 6000

attacttaac ctttctgagc ctgtttcctc attttacaat ggaaattagt gtgcctgcct 6060

ctagaggtag gaggattaaa tgataatgtg tatgaaatac ctaatatagt acttggcaca 6120

tattagattc tgtgagatat aatttctgtc cttagggact tcacagattg tttttatgtg 6180

gaaacttttt cttttattcg actttgttac taatttttgc tctgtttaaa acaactttct 6240

ggaaaaaaat tcatgtaaaa gaatggaaag ttagtttgcc tagtggttgg tatggtgtta 6300

ttcataaaat cacattgtgg tgtgttcttg gatgcagaga atcttaacaa tctcccttag 6360

gcacaagttt atcatagttg gcaacagttt ttatttctga agagagatgt tgttagaaat 6420

cccaggctct aaataagggt caaagggaaa agttgagcat tcaggattct gttcagaatt 6480

cacatctggt aggtgtggat agtttttcac taaaaaaggt ttccaacaaa tgacatgcca 6540

aactcttgac acagtaaaac ttttgcctga agtcagttaa tcactctgcc agttccaatg 6600

catgattttt ccagtgataa cttcaagtta ctttctgctt tctctgagga gaaatatccc 6660

tgatacttat atcctgtagg cagagaaggc ttttcttgga ggtcgaatgg caattgggtg 6720

gtaaatgaat ttggaactac tgaaattttt ataccgtcaa cattcatgca aaaaaaaaaa 6780

ctattgaggg cctttttttc tgccatacat ttgaattgac ttcaaacttc ttaatttctt 6840

ttagtcactt aaaggttttt cacattttcg tggcccaagc ataaagatca cctatctgca 6900

ggattcaaga cacccaatca tttgagtagt tctgatagga ctgctttaca gatacgttag 6960

cagaggcctt tcaaaaaggg agtgtttttg tatgttagaa gatactataa agccaacaag 7020

caaatatttg caacttatat gaaaaagaac aaatgagaaa aaaacataca caaaatatag 7080

acaaggacat gcaaatgtcc aacaaatggg aggaaaaaaa tccagcctca ctagtcatca 7140

gggaatgaaa agtaaggcaa tgagatagcc attttgtact catcatattg gccagaatgt 7200

aagagattgt tgccatcaaa tattggcaag gattttggaa atgggcattc tcaaatattg 7260

ctgatggaag tttgagtggc tacacctttt ttgcaaccta tttgatgaaa ataaaaagca 7320

ttcatataca aggatatact taaagggctg cttcatttat tatagcaaaa tgtaaaagca 7380

gcctgtgtct gatattatgc aagagaatag ttacatagaa acaatggtac aggttgggcg 7440

ttgtggctca tgcctgtaat cccagcactt tgggaggctg agacaggcag attgcttgag 7500

cccaggagtt tgaggcttat ttgagcaaca tagggatact ttctctctac aagaaataca 7560

aaaattagcc aggtgtggtg gtgcctttgt acctggaggc tgaggtggga gaatcacttg 7620

aggttgaggc tatagtgagt tgtgatcata ccactatact cctgcctggg ctataagagt 7680

gagaccctgc caaaaaaaga aagagaagga gagagagaac ccatatttcc atatcttgta 7740

tctaaaaaga atggctaaca tttacatata ttaatctcaa aggataaaaa gaaaaaaata 7800

aagtagtatg taagatatat ttctgtaaca ttagctatct cagggagggt aagagaatat 7860

tataagcttt tactttatat gtatttgtat tgttttagtt atttaaaaat ttttgaataa 7920

agtagaaaca atagttcaga agtcagtcca tgtctttctc taactcattc aagatagatg 7980

aattattagc ttgtacctca aaatctccca gcatggaagt tctctagcct actgtggcca 8040

ttttttctag catggaacaa catgctatgt tgagggattt cttcattaaa tctaatttaa 8100

attgtccctg cagtcaaaat tttttccata tagataatat ggaaaacagc tggtttcatc 8160

tttatatcaa attttttcat aaatattaag gtgtaaatta atggtcaact gacggtggag 8220

aaataaagca gggtttggta ttggaattgg tcaagttcaa taatggattg tttccttcag 8280

gcccgacagg agatgaactg cctttgctgc ttttctgccc agttttatac tcactcttct 8340

cgtaaaagtg ttgcatcagg aaccttttaa gaagtgctta aattcagatt cacttgtccc 8400

tagtaattca ttcataaagc acaggggttc atttaaacgt atgttgtaat ccattcggaa 8460

aatctaaaat gttgtttttg ctgaatattt ttccccgtgg tggacctaag ggtttgcttt 8520

tttcccccca ttatatgaga aaattgaaag gatatgctta ggaattaccc ttgttcttaa 8580

aaaatggggg gtgggtatgc tttggggttt ttttgtctgt tttctcagct ttcaaataat 8640

gaggagtatg ggcaaatagc attactgccc attgagctga acacaggatt atttttattt 8700

ccatattttt tccttcatca gggcttttgt ttggggtaga gtattaataa caagtaagat 8760

gtgacatgga gctgtcttca gttagattca cgtgagtctt atccagcctt tcacaaactg 8820

aggagaaaga attaacgtgt atagcaggaa attgggggtg ggaggaggaa ggggagtgac 8880

tgctaataag gtaggggatt tttggaggga gggtaatgta aatgtgctat aattgactgt 8940

gacgatagtt ggccaactct gatacactat gaactgtgga attgtaacac ttcaaatgga 9000

taaattgtat gctttgtgaa ttatttatca atataaaaaa atgaaaaggc ccggtgcacc 9060

tgtattatct gtgcttgtgc ttatggaaat attttaaatt attggctcaa agataaatgc 9120

tagcaagtct ggtaagtata actctctggg ctatgtcagg gacctggctc aagtctcccc 9180

tgcaaagatc ttctccccct gtgttcataa tcttaaacaa gtattaatta cacaaaaaaa 9240

gttgtactca tgaagcctat gtgctacagt cttctgagaa accatgctct aagaaaggat 9300

ggtggttcag attaaaagga gaggaagatt atgaactgaa aaatacagct tcatttttag 9360

tgtaaaaatg gaatattcta atatttgcaa gactgctgct taacaatgtc agcgttgatt 9420

tactccactg cagagcttta ggctttttga catttttatt tatgactcaa tcgtatttca 9480

atctgggtat tagcgggaag ctgataccag gaaaaacctt taaaacccaa atngtaattt 9540

tctcctagtc tttttggcaa gtgtgccgtg ggtagacagt aggttggaga tggccattgc 9600

tactgccagc ttaaaatagg aaatggtcgc catttgataa agagtgacag gttggaaaat 9660

taggacctgt tttctaaatt tttatttgta ttttagtaat gtcatttctt ggttttgagg 9720

ctttacatag taccagggca agattcactt attcaattgt aagaatacaa atctcagagc 9780

tacatgataa tgattttgag ataatcttac acctctagta ttccaatagc aaaaattgag 9840

ataatattac ttttcttttc tctagctggt gtcatagatg aagattatag aggaaatgtt 9900

ggtgttgtac tgtttaattt tggcaaagaa aagtttgaag gtatgttaaa tatatacatt 9960

cacataattt tagtgaattt tcagagtcat gtatgtgtaa attaatattg actcctttaa 10020

ttctcattga ataagacagg atatggcgaa tgtgtcagta acgtcagtaa taaactattc 10080

tttctttgaa gtcaaaaaag gtgatcgaat tgcacagctc atttgcgaac ggatttttta 10140

tccagaaata gaagaagttc aagtaagtat tacaaaggaa gatacagaat aagtaatata 10200

acatcttaag tgaagaaata tatataatct tgagaattta atatgctgtt tgtaactaaa 10260

tagtatatat gactaaactt attttaagca aatttaaaat actagtttta gaatttcttt 10320

aaatgttttt catgtagcta ttatgtagta ttactttgga taataagtta tttaaacata 10380

ctgtgaactt ctaatatttt attagaattt tttaaagtta tccagtattc taatttatgg 10440

agctttttag aatttaattt tctttctgta atctcccttt tgaaaagatg atatagcaag 10500

agtagaattc tggctgtatt tttcttagga gctggagagg aaaactgaaa gaggctctta 10560

aaaaaaactg tgaagcttac tacctttcta tctttcaggc cttggatgac accgaaaggg 10620

gttcaggagg ttttggttcc actggaaaga attaaaattt atgccaagaa cagaaaacaa 10680

gaagtcatac ctttttctta aaaaaaaaaa aaaagttttt gcttcaagtg ttttggtgtt 10740

ttgcacttct gtaaacttac tagctttacc ttctaaaagt actgcatttt ttactttttt 10800

ttatgatcaa ggaaaagatc attaaaaaaa aacacaaaga agtttttctt tgtgtttgga 10860

tcaaaaagaa actttgtttt tccgcaattg aaggttgtat gtaaatctgc tttgtggtga 10920

cctgatgtaa acagtgtctt cttaaaatca aatgtaaatc aattacagat taaaaaaaaa 10980

agcctgtatt taactcatat gatctccctt cagcaactta ttttgcttta attgctttaa 11040

atcttaagca atatttttta ttcagtaaac aaattctttc acaaggtaca aaatcttgca 11100

taagctgaac taaaataaaa atgaaaagga gagattaaag gtattccttg ttcttccctt 11160

ctcttcacta gtctaaaaac ttctttttaa tcttaagatt ctttgtgatg agggtgagaa 11220

aaagaatcct cagtttattt ttccactatt aatctttctt ttgataaatc ctctattgac 11280

tgggtagagg tatgtttgtg aaagacatgt aacttgggga tttgttactt taggtttgtt 11340

cccttgaatt tcatctcatc aggcaaattg tactagttgt agttacgagt tttccctcag 11400

tgaagtagca ataggctgta atcaagaaaa tatgccattt atagagataa gataaatgaa 11460

ataatacttc agccaccagg tttttctgtc tcacatacat aagcagcatt tcattgcaga 11520

tatgggactg attctgtggc ttaccttgat taacatcttt tggaagtttt gctagtgtgc 11580

tttcctttct ttactatgtt tctcagattc ctttgtatca gggttttggg tgtcacttag 11640

gttttgtcca tcagattctg tgagacacca ggcatcgttt tgaggatgtg ggttatacac 11700

atggagtgct tctggaacta tcagcccact tgaccaccca gtttgtggaa gcacaggcaa 11760

gagtgttctt ttctggtgat tctccaggcc atttaatacc ctgcaatgta attgtccctc 11820

tgtggctcac atttcattag tgagccatga aatcaactca gtgggacata gccagcattt 11880

ttgcatacca ggttgggcta taaaatattt ctgttgtcaa taaattttaa atgttttcct 11940

gctaaactaa 11950

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atctccaggg gccgttcaga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atctccaggg gccgttcagg 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taagctttac tgtgtgcca 19

<210> 5

<211> 244

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atctccaggg gccgttcaca gtgatcagct gtctccctca gccaggaaat tcatagccta 60

agcttggtaa actaccaagc cctgcctgac agatacaaca cagttcttta tctcttattt 120

tgtccacccg tttttctcct ttccttctgc atattttccc taatcacaca gatcattgtg 180

agaataaaat gggttaatat atgtaaacca attagaactg ttcctggcac acagtaaagg 240

ctta 244

<210> 6

<211> 244

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atctccaggg gccgttcacg gtgatcagct gtctccctca gccaggaaat tcatagccta 60

agcttggtaa actaccaagc cctgcctgac agatacaaca cagttcttta tctcttattt 120

tgtccacccg tttttctcct ttccttctgc atattttccc taatcacaca gatcattgtg 180

agaataaaat gggttaatat atgtaaacca attagaactg ttcctggcac acagtaaagg 240

ctta 244

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aacctttaaa acccaaaac 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aacctttaaa acccaaaat 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggaatactag aggtgtaaga 20

<210> 10

<211> 310

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aacctttaaa acccaaatcg taattttctc ctagtctttt tggcaagtgt gccgtgggta 60

gacagtaggt tggagatggc cattgctact gccagcttaa aataggaaat ggtcgccatt 120

tgataaagag tgacaggttg gaaaattagg acctgttttc taaattttta tttgtatttt 180

agtaatgtca tttcttggtt ttgaggcttt acatagtacc agggcaagat tcacttattc 240

aattgtaaga atacaaatct cagagctaca tgataatgat tttgagataa tcttacacct 300

ctagtattcc 310

<210> 11

<211> 310

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aacctttaaa acccaaattg taattttctc ctagtctttt tggcaagtgt gccgtgggta 60

gacagtaggt tggagatggc cattgctact gccagcttaa aataggaaat ggtcgccatt 120

tgataaagag tgacaggttg gaaaattagg acctgttttc taaattttta tttgtatttt 180

agtaatgtca tttcttggtt ttgaggcttt acatagtacc agggcaagat tcacttattc 240

aattgtaaga atacaaatct cagagctaca tgataatgat tttgagataa tcttacacct 300

ctagtattcc 310

Claims (9)

1.单核苷酸多态性位点作为检测靶点在制备用于鉴定宫颈鳞状细胞癌或宫颈癌癌前病变CIN III遗传易感性的检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述单核苷酸多态性位点为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第2318位或者第9533位，其中第2318位存在A>G的多态性，第9533位存在C>T的多态性。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒中包括：用于检测如SEQ IDNO.1所示核苷酸序列中第2318位的单核苷酸多态性位点的特异性引物对。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述特异性引物对为两对，其中一个引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，另一个引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括dNTP混合液、Taq DNA聚合酶和PCR缓冲液。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括阳性对照Ⅰ和阳性对照Ⅱ，所述阳性对照Ⅰ含有核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的基因片段；所述阳性对照Ⅱ含有核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的基因片段。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒中包括：用于检测如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列中第9533位的SNP位点的特异性引物对。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述特异性引物对为两对，其中一个引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，另一个引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括dNTP混合液、Taq DNA聚合酶和PCR缓冲液。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括阳性对照Ⅲ和阳性对照Ⅳ，所述阳性对照Ⅲ含有核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的基因片段；所述阳性对照Ⅳ含有核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的基因片段。